UICC HPV and Cervical Cancer Curriculum Chapter 2.d. Screening and diagnosis - HPV analysis and typingProf. Suzanne Garland, MD; Prof. Sepehr Tabrizi
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HPV andCERVICALCANCERCURRICULUM
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01 Capítulo 2.d.
Detección y diagnóstico -- análisis y tipificación del VPH
Prof. Suzanne Garland MDDirectora de Investigación Microbiólogica, Jefe de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas The Royal Women's HospitalMelbourne, Australia
Associate Prof. Sepehr TabriziInvestigador Principal, Departamento de MicrobiologíaThe Royal Women's HospitalMelbourne, Australia
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02 Partículas similares al virus (VLPs)
• Ánalogos no infecciosos de un virus patógeno
• VLP-L1 se ensambla in vitro en cápsides vacías o ‘VLPs’
• La producción de VLP no es estandarizada
- Sistemas de expresión diferentes, métodos de preparación, métodos de control de calidad
- Formatos de identificación varían (directa e indirecta)
- No hay estándar de oro para establecer el umbral de resultado positivo
- Pocas comparaciones entre laboratorios
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03 Partículas similares al virus (VLPs)
• VLPs pueden ser analizadas mediante técnicas de microscopía electrónica
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04 Detección de anticuerpos VPH
• Anticuerpos
- Su presencia representa una infección en el pasado o presente
- Se puede generar contra las proteínas del VPH tempranas (early/E) o tardías (late/L)
- Presencia de anticuerpos neutralizantes L1 correlacionan con protección antiviral iniciada por la vacuna
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05 Detección de anticuerpos VPH
• Se han desarollado diversos métodos de análisis para detectar anticuerpos en el suero/mucosa:
- Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA): mide las inmunoglobinas (Ig) en su totalidad, tanto neutralizantes como no neutralizantes.
- Ensayos de unión competitiva, por ejemplo, el ensayo competitivo Luminex (cLIA): mide las Ig neutralizantes a un epítopo solamente, pero todas las diferentes clases de Ig
- Ensayo pseudovirión: mide el total de Ig neutralizantes, de todas las subclases
- Western blot
- Radio-inmunoprecipitación
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06 Detección de AND del VPH en el tejido por microscopio
• Inmunohistoquímica (antígeno especifico de grupo)
• Citología Pap: detecta células precancerosas
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07 Técnicas de detección molecular de ADN del VPH
Métodos de amplificación
• Amplificación de la señal
- Captura de híbridos/Hybrid Capture (HC2)
• Amplificación del objetivo
- Reacción en cadena de la polimerasa – PCR de ADN del VPH
- ARNm del VPH
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08 Análisis Hybrid Capture 2 • Prueba actualmente aprobada por la FDA
- 1995 formato de tubo; 1999 formato micro-placa
• Diseñado para trabajar con una muestra de células cervicales exfoliadas
• Kit recomendado incluye cepillo y medio de transporte de la muestra
- Recoge células endo- y exocervicales
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09 Análisis Hybrid Capture 2• Sensibilidad de 5000 genomes/muestra
• Mezcla de bajo riesgo
- VPH tipo 6, 11, 42, 43, 44
• Mezcla de tipo de alto riesgo
- VPH tipo 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 and 68
• Los resultados no son específicos del tipo
• No hay control de número de entrada de las células
• Buena comparación entra laboratorios
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10 Reacción en cadena de polimerasa• Muy sensible; cerca de 1-10 copias /100,000 células
• Permite realizar pruebas de diferentes tipos de muestras
• Permite el análisis de muestras de archivo con AND de baja calidad
• Ensayos de consenso: objetivo general: región L1
- Conservado
- Primers varían:MY09/MY11SPF1/SPF2PGMY09/PGMY11 GP5+/GP6+
- Sistemas de detección:ELISAdot blot
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11 Diferentes metodologías de PCR
• Test AMPLICOR ® HPV
• Test LINEAR ARRAY® HPV
• Test genotipo INNO-LiPA ®
- Genotipado de VPH en tejido preparado en parafina
- Las secciones de tejido pueden ser muy viejas y están sujetas a la degradación del ADN (incluso durante la extracción)
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12 Diferentes metodologías de PCR
• Formato de Chip de ADN de VPH
• HPV Microarray
• Citometría de flujo
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13 Otras metodologías para detectar los tipos de VPH
• Luminex’s xMAP® Technology
• Norchip - HPV Proofer
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14 Limitaciones y Desafíos
• Ensayos de diversa gama
• Diferente sensibilidad y especificidad
• Falta de controles fácilmente disponibles, la garantía de calidad y el control de calidad
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15 Uso práctio de los métodos de prueba de ADN del VPH
Clínico
• Tamizaje
• Triage de las pruebas de Papanicolau equívocas
• Sequimiento de displasia post-tratamiento
Epidemiología
• Vigilancia en zonas geográficas- Prevalencia de VPH- Prevalencia de genotipo de VPH
Vacuna
• Antes y después de la implementación de un programa de vacunación- Estudios de eficacidad de la vacuna - Diferent regiones del mundo
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Gracias
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