Screening y Confirmación
Forense / Toxicológica
por masa exacta con
LC/QTOF y Librerias
Forensics/ Toxicology
Jaume C. Morales
MS Product Specialist
Agilent Technologies Spain
Octubre 2011
MAD/BCN
Agenda
• La técnica LC-QTOF-MS para laboratorios forenses :
– ¿Porqué un QTOF?
– ¿Cómo funciona?
• Modelo Único de Agilent
– Solución de retos y Método Innovador
• Resultados y ejemplos
• Resumen
Forensics/ Toxicology
La técnica QTOF para laboratorios forenses
¿Porqué necesito un QTOF ?
Técnica englobada dentro del análisis de compuestos orgánicos
de baja volatilidad
Que permite :
• Screening No dirigido. Full Spectra.
• Análisis Retrospectivo
• Identificación de metabolitos desconocidos
• Información espectral, espectros MS/MS
• Eliminar falsos positivos
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La técnica QTOF para laboratorios forenses
¿Cómo funciona un QTOF ?
Pulser Detector
1. Disparo de iones cada 100 microsegundos
2. Medida en el detector cada nanosegundo
3. 100.000 data points en cada transient (disparo)
4. Suma 2000 – 10000 transients en cada espectro
5. Produce espectros con una excelente estadistica
20 µsec – m/z 118
46 µsec - m/z 622
90 µsec - m/z 2421
TUBO DE VUELO
Medida de tiempo
convertida a m/z
Arquitectura LC/MS de Agilent
Más de 25 años en LC/MS y
fuentes atmosféricas,
Patentes como JetStream
Geometría Ortogonal,
iFunnel, Liderando
Sensibilidad y Robustez en
el mercado
Rough Pump
Octopole 1
Turbo 1
Turbo 1
Turbo 1
Quad Mass Filter (Q1)
Collision Cell
Lens 1 and 2
Quad Mass Filter (Q3)
10KV Detector
Ion Pulser
Turbo 2
Octopole 1
DC Quad
Rough Pump
Turbo 1
Turbo 1
Turbo 1
Quad Mass Filter (Q1)
Collision Cell Lens 1 and 2
Octopole 2
Rough Pump
Octopole 1
Turbo 1
Turbo 1
Turbo 1
Quad Mass Filter (Q1)
Lens 1 and 2 10KV
Detector
Celda de Colisión con aceleración
Axial para análisis MS/MS de alta
velocidad 6500 Q-TOF
6400QQQ
6100 Series SQ
Arquitectura LC/MS de Agilent
modos MS y MS/MS
Ion Pulser
Turbo 2
Octopole 1
DC Quad
Rough Pump
Turbo 1
Turbo 1
Turbo 1
Quad Mass Filter (Q1)
Collision Cell Lens 1 and 2
Octopole 2
Tiapride 0.8 ppm
Modo MS Modo MS/MS
Innovación
Tecnológica
Dual-stage
ion mirror
(resolution)
Ion Beam Compression
Technology (resolution +
mass accuracy)
Orthogonal spray
source (signal-to-noise)
Ion acceleration in hexapole
collision cell (faster MS/MS spectra)
Longer flight tube
(resolution)
INVAR flight tube
(mass accuracy)
ADC (dynamic range)
4 GHz electronics
(resolution, mass
accuracy, sensitivity,
dynamic range)
Instrumentación
El Modelo Único de Agilent LC-QTOF-MS en modo Auto-MS/MS
Un método favorable a la identificación de drogas en el análisis toxicológico sistemático
El Total Ion Chromatogram
contine toda la información de la muestra
MS
MSMS
MS MS MS
MS
Espectros MSMS
de masa exacta
Espectros MS
de masa exacta
Identif. Formula
Busc. Base Datos
Busc. Metabolitos
Identif. Estructural
Busc. Librerias
Quantificación
El Modelo Único de Agilent – Ejemplo de Método
LC-QTOF-MS en modo Auto-MS/MS Un método favorable a la identificación de drogas en el análisis toxicológico sistemático
Preparación de muestra
Muestras de pelo : limpiar el pelo, cortar en trozos de 1-2 mm, 20 mg extracción 2 x 18h con tampón. Inyección de 5 uL.
Muestras de sangre : Precipitación de Proteína con ACN e inyección de 5uL.
Muestras de orina : dilución 1:5 e inyección de 5uL.
Medición
LC Agilent 1200
Poroshell 120 EC-18 (2.1x100 mm 2.7um)
Temperatura 50ºC
Canal A : Ac.NH4 10mM (pH 6.8)
Canal B : Metanol
Gradiente : 0 min. 10%B, lineal hasta 50%B
en 8 min., lineal hasta 100%B en 20 min. Y
mantener 4 min. 3 min de re-equilibrado.
Total 24 min. Flujo 0.4 mL/min.
QTOF-MS Agilent 6530A
Acquisition Mode : Auto MS/MS (positive)
•3 Precursores (data dependent)
•Exclusión activa durante 0.1 min.
•Formula Energía Colisión CE = 6V / 100 m/z + 4V
Velocidad de escaneo : 4Hz (MS), 4Hz (MSMS)
Tiempo por ciclo : 1.1 s
El Modelo Único de Agilent
Retos
• MS/TOF es potente por su masa exacta, pero revela todavía demasiados falsos positivos
• La matriz puede influenciar en la exactitud de masa y por tanto en la calidad de la identificación
Soluciones
• El tiempo de retención puede ayudar a distinguir entre isómeros.
• El cálculo Isotópico es una parámetro adicional para la identificación por MS.
• Librería “Broecker,Herre & Pragst” de espectros MS/MS en masa exacta para análisis forense y toxicológico.
Esquema Innovador
• Adquisición de datos MS/MS en modo “data-dependent”.
• Procesos para analizar datos exactos tanto en MS como MS/MS.
• Combinación de resultados de búsqueda :
• Masa exacta en base de datos MS
• Fórmula propuesta
• Espectro MS/MS en librería espectral
El Modelo Único de Agilent
Retos
• MS/TOF es potente por su masa exacta, pero revela todavía demasiados falsos positivos
• La matriz puede influenciar en la exactitud de masa y por tanto en la calidad de la identificación
Soluciones
• El tiempo de retención puede ayudar a distinguir entre isómeros.
• El cálculo Isotópico es una parámetro adicional para la identificación por MS.
• Librería “Broecker,Herre & Pragst” de espectros MS/MS en masa exacta para análisis forense y toxicológico.
Esquema Innovador
• Adquisición de datos MS/MS en modo “data-dependent”.
• Procesos para analizar datos exactos tanto en MS como MS/MS.
• Combinación de resultados de búsqueda :
• Masa exacta en base de datos MS
• Fórmula propuesta
• Espectro MS/MS en librería espectral
Nuevos Enfoques para el Análisis
Toxicológico Sistemático por LC-TOF
LC-TOF proporciona más información específica de la sustancia debido a la mayor exactitud de masa.
• I. Ojanperä et al. (2004 - 2010) LC-TOF screening in urine, hair, meconium and vitreous humor.
• T. N. Decaestecker et al. (2004) First semi-quantitative screening procedure with LC-QTOF-MS.
• A. Polettini et al. (2008, 2010) Toxicological data base with 50,500 entries, metabolomics approach.
• H. K. Lee et al. (2009) LC-TOF screening in urine.
• S. Toennes (2010) LC-TOF, application in blood, urine and hair.
Esta ventaja ha sido demostrada
por varios trabajos de investigación
de diferentes grupos. p.e.
Structural diversity, example: M = 149 Included atoms: Molecular formulas C, H, N, O, S, P, F, Cl, Br: 120 C, H, N, O, S, P: 38 C, H, N, O: 27
Formula
No. Isomers
(MOLGEN)
Number
Beilstein
number
NIST Exist
Accurate
mass M M+1 M+2 M+3
C3H3NO6 41580 0 0 NO 148,996038 100 3,89 1,29 0,05
C2H3N3O5 152977 0 0 NO 149,007271 100 3,51 1,08 0,04
C7H3NO3 11449751 3 0 YES 149,011293 100 8,1 0,9 0,06
CH3N5O4 99306 0 0 NO 149,018504 100 3,13 0,86 0,03
C6H3N3O2 50459744 2 0 YES 149,022526 100 7,72 0,67 0,04
C11H3N 53109027 0 0 YES 149,026548 100 12,31 0,69 0,02
C4H7NO5 202072 10 0 NO 149,032421 100 4,99 1,13 0,05
C5H3N5O 39760215 5 0 YES 149,033759 100 7,34 0,44 0,02
C3H7N3O4 822099 2 0 NO 149,043654 100 4,61 0,91 0,04
C4H3N7 6505400 0 0 YES 149,044992 100 6,96 0,21 0
C8H7NO2 48687255 265 13 YES 149,047676 100 9,2 0,79 0,05
C2H7N5O3 633408 0 0 NO 149,054887 100 4,23 0,69 0,03
C7H7N3O 166085562 222 7 YES 149,058909 100 8,82 0,55 0,03
CH7N7O2 121630 0 0 NO 149,066120 100 3,85 0,47 0,02
C5H11NO4 121350 52 0 YES 149,068805 100 6,09 0,98 0,05
C6H7N5 77737459 129 10 YES 149,070142 100 8,44 0,32 0,01
C4H11N3O3 473871 1 0 YES 149,080038 100 5,71 0,75 0,04
C9H11NO 25 895 621 724 45 YES 149,084060 100 10,31 0,68 0,03
C3H11N5O2 355574 0 0 NO 149,091271 100 5,33 0,53 0,02
C8H11N3 49755227 182 5 YES 149,095293 100 9,93 0,44 0,01
C2H11N7O 67609 0 0 NO 149,102504 100 4,95 0,31 0,01
C6H15NO3 13539 23 2 YES 149,105188 100 7,2 0,84 0,05
CH11N9 2766 0 0 NO 149,113737 100 4,57 0,09 0
C5H15N3O2 44621 0 0 YES 149,116421 100 6,82 0,61 0,03
C10H15N 2569697 558 40 YES 149,120443 100 11,41 0,59 0,02
C4H15N5O 26983 0 0 NO 149,127654 100 6,44 0,39 0,02
Number of isomers according to MOLGEN (Molecular structure generation; http://molgen.de)
2 ppm = 0,0003
Examples of structural isomers of cathinone (www.chemspider.com, 829 hits) Altogether 25 895 621 structural isomers possible Stereoisomers not included
C9H11NO
El Modelo Único de Agilent
Retos
• MS/TOF es potente por su masa exacta, pero revela todavía demasiados falsos positivos
• La matriz puede influenciar en la exactitud de masa y por tanto en la calidad de la identificación
Soluciones
• El tiempo de retención puede ayudar a distinguir entre isómeros.
• El cálculo Isotópico es una parámetro adicional para la identificación por MS.
• Librería “Broecker,Herre & Pragst” de espectros MS/MS en masa exacta para análisis forense y toxicológico.
Esquema Innovador
• Adquisición de datos MS/MS en modo “data-dependent”.
• Procesos para analizar datos exactos tanto en MS como MS/MS.
• Combinación de resultados de búsqueda :
• Masa exacta en base de datos MS
• Fórmula propuesta
• Espectro MS/MS en librería espectral
Influencia de la Matriz (4GHz high res mode)
Amfetamina-d3 como ejemplo, Muestra de orina diluida 1:5 y filtrada
Columna corta análisis 1.6 minutos
Método largo análisis 3 minutos
Método corto S/N 245:1
Método largo S/N 600:1
Column type: 2.1 × 50 mm, 2.7 µm Poroshell 120, EC-C18,
Column type: 2.1 × 150 mm, 2.7 µm Poroshell 120, EC-C18
Influencia de la Matriz (4GHz high res mode)
Amfetamina-d3 como ejemplo (Spectros)
Full specta Método Corto
Amphetamine-d3
Full specta Método Largo
Mayor sensibilidad de la matriz que puede deteriorar
la calidad del espectro adquirido
El Modelo Único de Agilent
Retos
• MS/TOF es potente por su masa exacta, pero revela todavía demasiados falsos positivos
• La matriz puede influenciar en la exactitud de masa y por tanto en la calidad de la identificación
Soluciones
• El tiempo de retención puede ayudar a distinguir entre isómeros.
• El cálculo Isotópico es una parámetro adicional para la identificación por MS.
• Librería “Broecker,Herre & Pragst” de espectros MS/MS en masa exacta para análisis forense y toxicológico.
Esquema Innovador
• Adquisición de datos MS/MS en modo “data-dependent”.
• Procesos para analizar datos exactos tanto en MS como MS/MS.
• Combinación de resultados de búsqueda :
• Masa exacta en base de datos MS
• Fórmula propuesta
• Espectro MS/MS en librería espectral
Identificacíón de dos drogas de Diseño,
dos compuestos Isobáricos MDMA y Methedron
Las muestras se han analizado por un método LC-MS en
modo MS. Volumen Inyección : 5 µL
Disolvente de inyección : Agua /Acetonitrilo 95/5 + 0.1 % ácido
Fórmico
Columna : 2.1 × 50 mm, 1.8 µm Eclipse Plus C18
Preparación de muestra de
orina :
50 µL orine diluida (1:5) con
200 µL agua
2ª dilución 10:1 usando el
disolvente de inyección
Compuestos: Muestras
U-DDLO
Baja concentración relativa
U-Ddhi
Alta concentración relativa
O
ONH
CH3
CH3
Name = MDMA
Molecular Formula = C11
H15
NO2
LogP (ACD) = 1.81CAS-No = 69610-10-2Monoisotopic Mass = 193.110279 DaNominal Mass = 193 DaAverage Mass = 193.2423 Da[M+H]+ = 194.117555 Da[M-H]- = 192.103002 Da
CH3
O
NHCH3
O
CH3
Name = Methedron
Molecular Formula = C11
H15
NO2
LogP (ACD) = 1.47CAS-No = 530-54-1Monoisotopic Mass = 193.110279 Da[M+H]+ = 194.117555 Da
Identificacíón de dos drogas de Diseño, Resultados
Muestra: U-DDhi
Inj-Vol: 2 µL
Espectros de ambos compuestos
Los compuestos Isobáricos
pueden separarse.
Información adicional como
valores de logP pueden
ayudar. El compuesto con
menor valor eluye antes.
CH3
O
NHCH3
O
CH3
Name = Methedron
Molecular Formula = C11
H15
NO2
LogP (ACD) = 1.47CAS-No = 530-54-1Monoisotopic Mass = 193.110279 Da[M+H]+ = 194.117555 Da
O
ONH
CH3
CH3
Name = MDMA
Molecular Formula = C11
H15
NO2
LogP (ACD) = 1.81CAS-No = 69610-10-2Monoisotopic Mass = 193.110279 DaNominal Mass = 193 DaAverage Mass = 193.2423 Da[M+H]+ = 194.117555 Da[M-H]- = 192.103002 Da
Identificacíón de dos drogas de Diseño, Resultados
El Retention time match
esparte del calculo del
Score y ayuda a
identificar compuestos
Isobáricos en MS1
Full spectrum for both compounds
Muestra: U-DDhi
Inj-Vol: 2 µL
El Modelo Único de Agilent
Retos
• MS/TOF es potente por su masa exacta, pero revela todavía demasiados falsos positivos
• La matriz puede influenciar en la exactitud de masa y por tanto en la calidad de la identificación
Soluciones
• El tiempo de retención puede ayudar a distinguir entre isómeros.
• El cálculo Isotópico es una parámetro adicional para la identificación por MS.
• Librería “Broecker,Herre & Pragst” de espectros MS/MS en masa exacta para análisis forense y toxicológico.
Esquema Innovador
• Adquisición de datos MS/MS en modo “data-dependent”.
• Procesos para analizar datos exactos tanto en MS como MS/MS.
• Combinación de resultados de búsqueda :
• Masa exacta en base de datos MS
• Fórmula propuesta
• Espectro MS/MS en librería espectral
El Modelo Único de Agilent
Retos
• MS/TOF es potente por su masa exacta, pero revela todavía demasiados falsos positivos
• La matriz puede influenciar en la exactitud de masa y por tanto en la calidad de la identificación
Soluciones
• El tiempo de retención puede ayudar a distinguir entre isómeros.
• El cálculo Isotópico es una parámetro adicional para la identificación por MS.
• Librería “Broecker,Herre & Pragst” de espectros MS/MS en masa exacta para análisis forense y toxicológico.
Esquema Innovador
• Adquisición de datos MS/MS en modo “data-dependent”.
• Procesos para analizar datos exactos tanto en MS como MS/MS.
• Combinación de resultados de búsqueda :
• Masa exacta en base de datos MS
• Fórmula propuesta
• Espectro MS/MS en librería espectral
¿Dónde puede utilizarse la Librería?
La Base de Datos y Librería están orientadas a análisis Forense y Toxicologico:
• Laboratorios Forenses
• Hospitales
• Universidades
SIN EMBARGO, pueden también utilizarse en análisis Alimentario y MedioAmbiental !!!
Se están
preparando
nuevas librerías
para pesticidas,
BioToxinas etc…
Database & Library of toxic compounds “Broecker, Herre & Pragst PCDL (Personal Compound Database & Library)”
Contiene todo tipo de tóxicos:
Drogas de abuso Medicamentos Pesticidas
Alcaloides Agentes Tóxicos Otros venenos
Patrones Deuterados
- Database, más de 7300 sustancias: Información textual de los compuestos como nombre, NºCAS,
fórmula y estructura molecular, masa mono-isotópica neutra, distribución isotópica, tiempo de
retención (opcional).
- CID MS/MS spectral library, más de 2600 sustancias: 3 espectros por compuesto a diferentes
energías de colisión.
Espectros MS/MS generados a energías CID de 10, 20 y 40 V
- Limpiados por substracción de background.
- Controlados por estructura plausible.
- Revisados
Database & Library of toxic compounds “Broecker, Herre & Pragst PCDL (Personal Compound Database & Library)”
Contiene todo tipo de tóxicos:
Drogas de abuso Medicamentos Pesticidas
Alcaloides Agentes Tóxicos Otros venenos
Patrones Deuterados
- Database, más de 7300 sustancias: Información textual de los compuestos como nombre, NºCAS,
fórmula y estructura molecular, masa mono-isotópica neutra, distribución isotópica, tiempo de
retención (opcional).
- CID MS/MS spectral library, más de 2600 sustancias: 3 espectros por compuesto a diferentes
energías de colisión.
20 eV
10 eV
40 eV
NHO
OH
OCH3 CH3
CH3Metoprolol
El Modelo Único de Agilent
Retos
• MS/TOF es potente por su masa exacta, pero revela todavía demasiados falsos positivos
• La matriz puede influenciar en la exactitud de masa y por tanto en la calidad de la identificación
Soluciones
• El tiempo de retención puede ayudar a distinguir entre isómeros.
• El cálculo Isotópico es una parámetro adicional para la identificación por MS.
• Librería “Broecker,Herre & Pragst” de espectros MS/MS en masa exacta para análisis forense y toxicológico.
Esquema Innovador
• Adquisición de datos MS/MS en modo “data-dependent”.
• Procesos para analizar datos exactos tanto en MS como MS/MS.
• Combinación de resultados de búsqueda :
• Masa exacta en base de datos MS
• Fórmula propuesta
• Espectro MS/MS en librería espectral
El Modelo Único de Agilent Modo Auto-MS/MS
“DATA DEPENDENT MODE”
MS
MSMS
MS MS MS
MS
Compuestos
Seleccionados
para MSMS
Espectro MS
Espectros MSMS
•La nueva versión ACQ B.04 añade aún más confianza en la
adquisición de datos MS/MS
• Óptima para detección de UltraTrazas de compuestos en matrices
complejas
• Adquisición de espectros
MS/MS de calidad
Adquisición de datos MS/MS en modo “data-
dependent”
El Modelo Único de Agilent
Retos
• MS/TOF es potente por su masa exacta, pero revela todavía demasiados falsos positivos
• La matriz puede influenciar en la exactitud de masa y por tanto en la calidad de la identificación
Soluciones
• El tiempo de retención puede ayudar a distinguir entre isómeros.
• El cálculo Isotópico es una parámetro adicional para la identificación por MS.
• Librería “Broecker,Herre & Pragst” de espectros MS/MS en masa exacta para análisis forense y toxicológico.
Esquema Innovador
• Adquisición de datos MS/MS en modo “data-dependent”.
• Procesos para analizar datos exactos tanto en MS como MS/MS.
• Combinación de resultados de búsqueda :
• Masa exacta en base de datos MS
• Fórmula propuesta
• Espectro MS/MS en librería espectral
Find by Formula
Información de la Fórmula del compuesto
o Base de Datos
Informació Iónica
Cromatograma EIC según información
Espectro extraido del pico integrado
Cálculo del Perfil Isotópico
Molecular Feature Extraction (MFE)
Algoritmo de búsqueda de compuestos
El cromatograma se procesa a través de un algoritmo propio de Agilent de búsqueda de compuestos
• Encuentra picos cromatográficos
– Encuentra todas las formas ionicas relacionadas
– Incluye aductos como Na+ or K+
– Incluye isotopos ([M+H]+, [M+H+1]+,…
– Incluye los diferentes estados de carga
– Comprueba si hay di/trimeros
– Crea un cromatograma (ECC)
• Suma la señal de todos los iones en un sólo valor (Feature)
• Proceso Totalmente Automatizado
• Crea un “compounds file” exportable
Find by Auto MS/MS or Targeted MS/MS
Find by Auto MS/MS o Targeted
MS/MS extrae
automáticamente la
información de MS y MS/MS,
alinea los espectros y muestra
los espectros correspondientes
a un compuesto determinado.
Los datos pueden utilizarse
para el calculo empírico de la
Fórmula tanto en MS como
MS/MS.
Además la información puede
utilizarse tanto para buscar por
masa exacta en Base de Datos
MS o bien comparar especros
MS/MS en librerías
espectrales de masa exacta
MS/MS
El Modelo Único de Agilent
Retos
• MS/TOF es potente por su masa exacta, pero revela todavía demasiados falsos positivos
• La matriz puede influenciar en la exactitud de masa y por tanto en la calidad de la identificación
Soluciones
• El tiempo de retención puede ayudar a distinguir entre isómeros.
• El cálculo Isotópico es una parámetro adicional para la identificación por MS.
• Librería “Broecker,Herre & Pragst” de espectros MS/MS en masa exacta para análisis forense y toxicológico.
Esquema Innovador
• Adquisición de datos MS/MS en modo “data-dependent”.
• Procesos para analizar datos exactos tanto en MS como MS/MS.
• Combinación de resultados de búsqueda :
• Masa exacta en base de datos MS
• Fórmula propuesta
• Espectro MS/MS en librería espectral
Combinación de resultados
Busqueda de
compuestos
MFE / FBF
Relaciona los espectros
MSMS con los
compuestos encontrados
Datos adquiridos en modo “ms/ms data dependent”
Extracción de
espectros
MSMS
Lista Combinada de Compuestos
DB
Scores
MFG
Scores
Ponderación de resultados
Búsqueda en Database Busqueda en Librería Cálculo de Formula
Library
Scores
MS Level MS/MS Level
Combinación de Algoritmos ID - INNOVADOR
Mayor seguridad en la Identificación
• Nueva y única extracción combinada “Find by MFE with MS/MS spectral
extraction” para la búsqueda automática en librerias MS/MS con multiples CE
• Puntuación combinada + visión de resultados de : Base de Datos, Espectros
MS/MS y Fórmula (MFG)
• Solapamiento de Distribución Isotópica de los
tres resultados : MFG, Find by Formula y DB
• Mayor reducción de falsos positivos y falsos
negativos con MFE
Ejemplos del Modelo Único
• Combinando información de datos ms y msms
• Utilizando librerias msms para identificar compuestos
• Combinación y Ponderación de los resultados
• Ejemplos :
– Caso real en laboratorio forense en Linköping
• Muy alta concentración de Tramadol; baja concentracion del isomero
– Caso real 353-10, hombre de 43 años, análisis en sangre
• Hallado muerto en el suelo de su casa
• Diabético
• No tomaba medicamentos pero fumador empedernido y alcohólico.
Caso real 1
Laboratorio forense en Linköping
Sample prep blood sample
250 µL blood precipitated
with 500 µL solvent
Aliquot of 100µL evaporated
before shipment
Reconstuted in injection
solvent
2nd dilution 10:1 using
injection solvent
Samples have been analyzed with LC-Method 1 in MS-
Mode. Injection volumes between1 µL and 5 µL. Further
injections in AutoMSMS mode and targeted MSMS
mode using compounds from R-Case
Injection solvent: Water/Acetonitril 95/5 + 0.1 % formic acid
Sample prep urine sample
50 µL urine shipped as
sample
Diluted (1:5) by adding 200
µL water
2nd dilution 10:1 using
injection solvent
Lista de analitos
encontrados en Sangre
Presencia de dos Isobáricos
Name Mass
Amitriptylin 278.1903
Nortriptylin 264.1747
Venlafaxine 278.2115
O-desmethyl-venlafaxine 264.1958
Mirtazapine 266.1652
Desmethyl-mitrazapine 252.1495
Propiomazine 341.1682
Dihydro-propiomazine 343.1839
Levomepromazine 329.1682
Desmethyl-levomepromazine 315.1526
Tramadol 264.1958
O-desmethyl-tramadol 250.1802
Mass = monoisotopic mass [M+H]+ ion
Data courtesy of
Martin Josefsson, Arne Eklund, Markus Roman RMW National Board of Forensic Medicine
Linköping, Sweden
Combinación de resultados – 1er paso
Compuesto 1 Compuesto 2 Adquisición MS/MS
(y MS)
Extracción
MS (MFE)
Combinación de resultados –extracción espectros
Espectro MS
Espectro MS/MS
A los compuestos encontrados por MFE se les
extrae ambos espectros
Combinación de resultados
Ambos Isobáricos han sido detectados con excelente exactitud PERO
¿cual es cual si no hay Info de Rt?
Combinación de resultados – comparación de
Espectros en Librería
Lib-search result details
Rojo. Espectro desconocido ; Negro. Espectro en librería
Combinación de resultados – comparación de
Espectros en Librería
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Rojo. Espectro desconocido ; Negro. Espectro en librería
Combinación de resultados – comparación de
Espectros en Librería
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Rojo. Espectro desconocido ; Negro. Espectro en librería
MFG
C16H25NO2
M = 263.1885
5 x10
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0.55
0.6
0.65
0.7
0.75
0.8
0.85
0.9
0.95
1
1.05
1.1
1.15
1.2
1.25
Cpd 246: O-Desmethylvenlafaxine (Desvenlafaxine): +ESI MFE Spectrum ( …
264.1961 (M+H)+
265.1994 (M+H)+
266.2023 (M+H)+
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
264 264.5 265 265.5 266 266.5
Combinación de resultados – comparación de
Espectros en Librería
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Rojo. Espectro desconocido ; Negro. Espectro en librería
5 x10
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0.55
0.6
0.65
0.7
0.75
0.8
0.85
0.9
0.95
1
1.05
1.1
1.15
1.2
1.25
Cpd 246: O-Desmethylvenlafaxine (Desvenlafaxine): +ESI MFE Spectrum ( …
264.1961 (M+H)+
265.1994 (M+H)+
266.2023 (M+H)+
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
264 264.5 265 265.5 266 266.5
Masa
Exacta
Data Base
CH3 N
CH3
OH OH
C16H25NO2
5 x10
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0.55
0.6
0.65
0.7
0.75
0.8
0.85
0.9
0.95
1
1.05
1.1
1.15
1.2
1.25
Cpd 246: O-Desmethylvenlafaxine (Desvenlafaxine): +ESI MFE Spectrum ( …
264.1961 (M+H)+
265.1994 (M+H)+
266.2023 (M+H)+
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
264 264.5 265 265.5 266 266.5
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Espectros en Librería
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Rojo. Espectro desconocido ; Negro. Espectro en librería C16H25NO2
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Rojo. Espectro desconocido ; Negro. Espectro en librería C16H25NO2
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Espectros en Librería
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Rojo. Espectro desconocido ; Negro. Espectro en librería C16H25NO2
Filtrado para reanálisis de sospechosos
Busqueda de
compuestos
MFE / FBF
Relaciona los espectros
MSMS con los
compuestos
encontrados
Datos adquiridos en modo “ms/ms data dependent”
Extracción de
espectros
MSMS
Lista Combinada de Compuestos
DB
Scores
MFG
Scores
Ponderación de resultados
Búsqueda en
Database Busqueda en Librería Cálculo de Formula
Library
Scores
MS Level MS/MS Level
Reanálisis en modo dirigido (target)
Filtrado y exportación de sospechosos
Caso real 2
Case 353-10
Data courtesy of
Sebastian Broecker and Fritz Pragst Institute of Legal Medicine, University Hospital Charité
Turmstraße 21, Building N, 10559 Berlin, Germany
•Hombre de 43 años, análisis en sangre
•Hallado muerto en el suelo de su casa
•Diabético
•No tomaba medicamentos pero fumador empedernido y alcohólico
Adquisición Auto MS/MS
Caso real 2
Case 353-10
Molecular Feature Extraction (MFE):
- Agrupamieto de las diferentes especies iónicas
([M+H]+, [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+])
- Adición del espectro MS/MS
A cada “Compuesto”!
Data courtesy of
Sebastian Broecker and Fritz Pragst Institute of Legal Medicine, University Hospital Charité
Turmstraße 21, Building N, 10559 Berlin, Germany
Case 353-10
C16H19NO4
[M+Na]+
[M+H]+
C17H21NO4
[M+H]+
C11H12N2S
[M+H]+
- Benzoylecgonine?
- Roletamide?
- Norcocaine?
- ???
- Dexamisole?
- Tetramisole?
- ???
- Cocaine?
- Fenoterol?
- Hydromorphinol?
- Scopolamine?
- ???
• Búsqueda en Base de Datos de masa exacta
– La masa exacta y la distribución isotópica permiten el cáculo de la fórmula
– PERO los isómeros NO pueden distinguirse
Case 353-10 • Búsqueda en librería espectral MSMS
– Los espectros MSMS contienen información estructural
– Se identifican los Isomeros
- Benzoylecgonine!
- Roletamide?
- Norcocaine?
- Cocaine!
- Fenoterol?
- Hydromorphinol?
- Scopolamine?
- Dexamisole?
- Tetramisole! Measured
Comparison
Library
Measured
Comparison
Library
- Benzoylecgonine?
- Roletamide?
- Norcocaine?
- Cocaine?
- Fenoterol?
- Hydromorphinol?
- Scopolamine?
- Dexamisole?
- Tetramisole?
Unica Puntuación Combinada
Cálculo y visualización automática
Ponderación personalizada
La tabla de compuestos muestra la
identificación con mayor puntuación
Unica Puntuación Combinada
Cálculo y visualización automática
Ponderación personalizada
Al expandir se muestran los
detalles del cálculo
FBF Muestra de sangre (sin diluir)
Casi coeluido:
Desmethyl-
tramadol a 8.95
min
Identificado:
Tramadol a 8.91min
FBF Muestra de sangre (sin diluir)
Identificado:
Mirtazapine a 9.42 min Identificado:
Desmethyl-mirtazapine a
9.21min
FBF Muestra de sangre (sin diluir) Últimos picos
Identificado:
Propiomazine a
12.43 min
Identificado:
Nor-triptyline a 12.28
min
Identificado:
Amitriptyline a
12.45 min
FBF Muestra de sangre (sin diluir)
Cpd Name File RT Mass Mass (Tgt) Diff (Tgt, ppm) Algorithm Formula (Tgt) Score (Tgt) Formula (DB) Score (DB) Formula (MFG) Score (MFG) Ions Height
1 O-desmethyl-tramadolUrine_Case_01_MS_01.d 7.42 249.1731 249.1729 0.8 Find By Formula C15H23NO2 99.38 C15 H23 N O2 99.42 C15 H23 N O2 99.11 4 24690578
2 O-desmethyl-venlafaxinUrine_Case_01_MS_01.d 8.3 263.1886 263.1885 0.46 Find By Formula C16H25NO2 99.67 C16 H25 N O2 99.74 C16 H25 N O2 99.74 4 15343658
3 TramadolUrine_Case_01_MS_01.d 8.88 263.1886 263.1885 0.15 Find By Formula C16H25NO2 96.77 C16 H25 N O2 96.86 C16 H25 N O2 99.53 4 72546992
4 N-desmethyl-tramadolUrine_Case_01_MS_01.d 8.97 249.173 249.1729 0.33 Find By Formula C15H23NO2 99 C15 H23 N O2 99.1 C15 H23 N O2 99.06 6 44246842
5 O-desmethyl-mirtazapineUrine_Case_01_MS_01.d 9.21 251.1426 251.1422 1.35 Find By Formula C16H17N3 99.63 C16 H17 N3 99.66 C16 H17 N3 99.47 4 1557700
6 MirtazapineUrine_Case_01_MS_01.d 9.41 265.1579 265.1579 -0.15 Find By Formula C17H19N3 83.23 C17 H19 N3 83.44 C17 H19 N3 99.03 4 8416951
7 VenlafaxineUrine_Case_01_MS_01.d 10.04 277.2044 277.2042 0.64 Find By Formula C17H27NO2 99.28 C17 H27 N O2 98.77 C17 H27 N O2 99.05 4 35180866
8 DihydropropiomazineUrine_Case_01_MS_01.d 11.86 342.1768 342.1766 0.51 Find By Formula C20H26N2OS 97.27 C20 H26 N2 O S 97.29 C20 H26 N2 O S 96.6 3 70620
9 Nor-triptylineUrine_Case_01_MS_01.d 12.28 263.1679 263.1674 1.83 Find By Formula C19H21N 96.49 C19 H21 N 96.06 C19 H21 N 96.14 4 1859867
10 Desmethyl-levopromazineUrine_Case_01_MS_01.d 12.34 314.1454 314.1453 0.42 Find By Formula C18H22N2OS 99.26 C18 H22 N2 O S 98.82 C18 H22 N2 O S 98.96 5 514900
11 PropiomazineUrine_Case_01_MS_01.d 12.43 340.1608 340.1609 -0.3 Find By Formula C20H24N2OS 92.58 C20 H24 N2 O S 92.72 C20 H24 N2 O S 92.02 4 51111
12 AmitriptylineUrine_Case_01_MS_01.d 12.46 277.1833 277.183 0.91 Find By Formula C20H23N 99.22 C20 H23 N 99.33 C20 H23 N 99.04 4 3417338
13 LevomepromazineUrine_Case_01_MS_01.d 12.5 328.1613 328.1609 1 Find By Formula C19H24N2OS 98.95 C19 H24 N2 O S 98.97 C19 H24 N2 O S 98.67 5 1304323
Fórmulas empíricas y puntuación
de los diferentes cálculos
Resumen y conclusiones
• La librería de espectros MSMS ofrece un enfoque único en la identificación
y confirmación de desconocidos y sus metabolitos
• La nueva versión de MassHunter ofrece un nuevo nivel de automatización
y rendimiento
• La última versión de la Librería ofrece aprox. 2740 entradas de espectros
entre más de 7300 compuestos
• Enfasis en los principales metabolitos en la nueva revisión de la librería
• La excelente resolución y exactitud de masa son la base de una buena
puntuación combinada
C L E A R LY B E T T E R M S S O L U T I O N S
Mass Spectrometry
Technology
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Jaume C. Morales
Especialista de Producto MS
Agilent Technologies Spain
901.11.68.90
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