INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de
agua y alimentos
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICO BIOLÓGICAS
P R E S E N T A: Q.B.P. TERCERO ALBURO JOSE JULIO
MÉXICO, D.F. DICIEMBRE 2008
Agradecimientos:
A Dios:
Por permitirme continuar por este camino en compañía de gente valiosa.
A mis abuelitos:
Por cuidarme siempre.
A mi Mamá y Maru:
Por que aún en los momentos más difíciles hemos estado juntos.
A mi Tía Titi Ricardo, Toño y Joana:
Por su cariño, y apoyo invaluables.
A la Maestra Elsa, al Doctor Carlos y al Doctor Francisco:
Por confiar en mi desde siempre, por la oportunidad de ser parte de su equipo,
por las oportunidades brindadas y por su cariño.
A Liz y Alex:
Por estar a mi lado, alentarme a seguir adelante a pesar de lo malo y brindarme
su cariño.
A Iván:
Por su amistad, por enseñarme el valor del trabajo y por aprender juntos.
A Claudia, Marcela, Chayo, Andrés, Viri, Diana, Laura, Claudia y a todos
aquellos que por alguna circunstancia halla olvidado mencionar:
Gracias por sus consejos, amistad y el tiempo compartido.
A mis sinodales:
Por sus consejos y el tomarse el tiempo para revisar este trabajo.
I
Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Microbiología Sanitaria del Departamento de
Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional,
bajo la dirección de la M en C Elsa Irma Quiñones Ramírez con el financiamiento clave SIP
20080926 y en el Laboratorio de Inocuidad Alimentaria del Departamento de Biotecnología de la
Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa a cargo del Dr. Carlos Vázquez Salinas y bajo
la co-dirección del Dr. Francisco José Fernández Perrino.
.
II
JURADO
M. en C. Elsa Irma Quiñones Ramírez
Dr. Francisco José Fernández Perrino
Dr. Carlos Vázquez Salinas
Dra. Ethel A. García Latorre
Dra. Silvia Giono Cerezo
Dr. Cesar H. Hernández Rodríguez
III
Índice general III Índice de Cuadros V Índice de figuras Abreviaturas
VI VII
Resumen Abstract
VIII IX
I. Introducción 1 I.1 Antecedentes 1 I.2 Historia 2 I.3 Características del microorganismo 3 I.4 Hábitat y distribución 4 I.5 Epidemiología 5 I.6 Patogénesis 5 I.7 Factores de virulencia 6 I.7.1 Hemolisinas 6 I.7.2 Proteasas 7 I.7.3 Factores de adherencia 7 I.7.4 Mecanismos de adquisición del hierro 8 I.7.5 Enterotoxinas 9 I.7.6 Elementos genéticos móviles 9 I.7.6.1 Isla de patogenicidad de Vibrio I (VPI-1) 10
I.7.6.2 El bacteriófago CTX 11
I.7.7 Cápsula 12 I.7.8 toxR 13 Justificación
15 Hipótesis
15 Objetivos 16 Esquema general de trabajo
17 II. Metodología 18 II.1 Obtención del DNA genómico 18 II.2 Amplificación de los genes vmhA, ctxA, zot, tcpA, toxT, toxT, iuT y wza mediante la técnica de PCR.
18
II.3 Purificación de productos de PCR a partir de geles de agarosa 19 II.4 Análisis bioinformática 19 II.5 Presencia de hemolisina 19 II.5.1 Prueba fenotípica 19 II.5.2 Prueba genotípica 19
II.6 Amplificación de los genes del fago CTX 20
II.7 Amplificación de los genes de la VPI1 21
II.8 Amplificación del gen tox R 21
II.9 Presencia de sideróforos 22
II.9.1 Prueba fenotípica 22
ÍNDICE GENERAL
IV
II.9.2 Prueba genotípica 22
II.10 Presencia de cápsula 22
II.10.1 Prueba fenotípica Tinción de cápsula 23
II.10.2 Prueba genotípica 23
II.11 Evaluación del efecto citotóxico del filtrado libre de células de V. mimicus
24
II.11.1 Obtención del filtrado 24
II.11.2 Obtención de un abasto de células CHO 24
II.11.3 Efecto de los filtrados de V. mimicus 25
II.12 Ensayo de adherencia en la línea celular HEp-2 25
II.12.1 Preparación de los cultivos 26
II.12.2 Preparación de la monocapa de células HEp-2 y ensayo . de adherencia
26
III. Resultados 27 III.1 Hemolisina y vmhA 27
III.2 Presencia de la VPI-1 y del bacteriófago CTX 28
III.3 toxR 30 III.4 Búsqueda de sideróforos 31 III.5 Cápsula 32 III.6 Efecto de los filtrados libres de células sobre la línea celular CHO 36 III.7 Adherencia en la línea celular HEp-2 38 IV. Discusión 41 V. Conclusiones 49 VI. Bibliografía 50 VII. Anexos 56
V
Páginas Cuadro 1. Lugares en donde se ha reportado la presencia de V. mimicus 4
Cuadro 2 Cepas testigo usadas en este trabajo 18
Cuadro 3 Condiciones de amplificación para vmhA 20
Cuadro 4 Condiciones de amplificación para los genes del fago CTX 20
Cuadro 5 Condiciones de de los genes de la VPI1 21
Cuadro 6 Condiciones de amplificación para toxR 22
Cuadro 7 Condiciones de amplificación para el operón de aerobactina 23
Cuadro 8 Condiciones de amplificación para del gen wza 24
Cuadro 9 Ensayo de citotoxicidad sobre la línea celular CHO 37 Cuadro 10 Genotipos y fenotipos mostrados las cepas de V. mimicus 40
ÍNDICE DE CUADROS
VI
Páginas Figura 1. Estructura química de los Sideróforos producidos por el género Vibrio 8 Figura 2. Organización del cluster de aerobactina en V. mimicus 9 Figura 3. Organización de la VPI-1 10
Figura 4. Organización del bacteriófago CTX 11
Figura 5. Papel de la proteína Wza en la translocación del polisacárido cápsular 13 Figura 6. Procesos que controla la proteína ToxR en V .mimicus 14 Figura 7. Diagrama general de trabajo 17
Figura 8. - hemólisis en agar sangre 27
Figura 9. Electroferograma del producto amplificado del gen vmhA 27 Figura 10. Confirmación del tamaño del amplificado para el gen vmhA 28 Figura 11. Búsqueda de la VPI1 29
Figura 12 Búsqueda del fago CTX 30
Figura 13. Electroferograma del producto amplificado del gen toxR 31 Figura 14. Producción de Sideróforo tipo hidroxamato en agar CAS 31 Figura 15. Electroferograma del producto amplificado del operón de aerobactina 32 Figura 16. Presencia de cápsula en cepas de V. mimicus por medio de la tinción de Rojo Congo
32
Figura 17. Electroferograma de los productos amplificados para el gen wza 33 Figura 18 Electroferograma del gradiente de temperatura para el gen wza hecho con el ADN de V. mimicus ATCC 33653
33
Figura 19 Análisis BLAST de la secuencia de 500 pb amplificada por V. mimicus. 34 Figura 20 Análisis BLAST de la secuencia de 800 pb amplificada por V. mimicus.
34
Figura 21 Análisis BLAST de la secuencia de 800 pb amplificada por V. cholerae. 35 Figura 22 Análisis BLAST de la secuencia de 500 pb amplificada por V. vulnificus ATCC 29307
35
Figuras 23 Ensayo de citotoxicidad sobre la línea celular CHO 38 Figura 24 Determinación del tiempo adecuado para el ensayo de adherencia 38 Figura 25 Adherencia de V. mimicus a las células HEp-2. 39 Figura 26 Localización de los iniciadores en los genes wza y 16S RNA de V. mimicus y V. cholerae
45
ÍNDICE DE FIGURAS
VII
ABREVIATURAS VPI-1 Isla de patogenicidad de Vibrio 1
CTX Bacteriófago filamentoso que en su genoma tiene los genes para la toxina del cólera
CT Toxina del cólera (por sus siglas en ingles cholera toxin)
TCP Pili co regulado con la toxina (por sus siglas en ingles toxin corregulated pilus)
HEp-2 Células de carcinoma laríngeo humano.
CHO Células epiteliales de ovario de hámster chino
OMS Organización mundial de la salud
FAO Organización de las naciones unidas para la agricultura y alimentación (por sus siglas en
ingles Food and Agriculture Organization of the United Nations)
OPS Organización panamericana de la salud
CAS Cromo Azurol S
ETA Enfermedad transmitida por alimentos
ºC Grado centígrado
pH Potencial de iones H+
UFC Unidad formadora de colonia
Kda Kilodalton
% G-C Proporción de Guanina y Citocina en el DNA
DNA Acido Desoxiribonucléico
Seg segundo
μl microlitro
pb pares de bases
BLAST Herramienta de búsqueda de alineamiento básico local (por sus siglas en ingles Basic
Local Alignment Search Tool)
NCBI Centro nacional de información biotecnológica (por sus siglas en ingles National Center
of Biotechnology Information)
dNTP`s Desoxinucleótidos fosfato
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislados de agua y alimentos
II
RESUMEN
Vibrio mimicus es una bacteria de hábitat acuático que se ha aislado de costas, estuarios, ríos, lagos y lagunas de agua dulce y salada de las zonas templadas o cálidas. Se encuentra formando parte de la microbiota del zooplancton, en crustáceos y moluscos que se alimentan por filtración. Los alimentos involucrados en su transmisión al humano son ostras, huevos de tortuga, camarón y pescado, que se consumen crudos o poco cocidos, causando casos de gastroenteritis y diarreas severas tipo cólera. Dentro del género Vibrio, V. mimicus y V. cholerae son las especies que están filogenéticamente más relacionadas, compartiendo múltiples características fenotípicas y genotípicas. En la actualidad se desconoce el mecanismo de patogenicidad de V. mimicus, sin embargo, se han descrito algunos factores asociados a la virulencia, como hemolisinas, hemaglutininas, proteasas, sideróforos, enterotoxinas y la presencia de la VPI1 y
del fago CTX , necesarios para causar un cuadro similar al cólera. Por ello, en el presente trabajo se consideró de interés estudiar la presencia de algunos factores potencialmente involucrados en la virulencia de V. mimicus en cepas ambientales aisladas de agua, pescados y ostiones capturados en las costas del Golfo de México,. Se trabajó con 20 cepas de V. mimicus aisladas de la laguna de Pueblo Viejo Veracruz: 6 provenientes de agua, 5 de pescado y 9 de ostión. Se utilizaron eritrocitos de carnero y conejo para determinar la actividad hemolítica, el medio CAS para la detección de sideróforos y la tinción con rojo congo para la observación de la presencia de cápsula. Se hizo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se analizó la
presencia de los genes para la hemolisina (vmhA), fago CTX (ctxA y zot), VPI1 (tcpA y tox), parte del operón de aerobactina (iutA ,Inc. iucD), cápsula (wza) y un gen regulador, (toxR). Se observó, asimismo, la capacidad citotóxica sobre la línea celular CHO y la adherencia sobre
células HEp-2. El 100% de las cepas estudiadas resultaron ser -hemólíticas y poseen el gen de la hemolisina vmhA, confirmando su identidad como V. mimicus, no encontrándose en ellas el
fago CTX ni la VPI-1.Todas las cepas tienen el gen toxR. El 40% de las cepas producen sideróforos de tipo hidroxamato en medio CAS y todas amplificaron los genes del operón de aerobactina. Por vez primera se describió en V. mimicus la presencia de cápsula en las cepas, corroborándose al amplificar el gen homólogo al wza. El 75% de las cepas presentaron efecto citopático a las 3 horas de exposición al filtrado, observándose destrucción de la monocapa a las 6 horas de exposición al sobrenadante filtrado. Los filtrados mostraron títulos desde 1:3 hasta 1:81. Se encontró que todas las cepas presentaron adherencia a la línea celular HEp-2, con un patrón de tipo agregativo. En el presente estudio se demostró que las cepas de V. mimicus aisladas de alimentos poseen la capacidad de producir factores asociados a la virulencia. En México no existen estudios sobre aislados de V. mimicus que provengan de productos de la pesca, por lo que nuestros datos son una contribución para describir el modelo de patogénesis de este microorganismo.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislados de agua y alimentos
III
ABSTRACT
Vibrio mimicus is a bacterium inhabiting aquatic environments; it has been isolated from fresh and salt water shores, estuaries, rivers, lakes, and lagoons in temperate and warm climates, It is found as part of the microbiota of zooplankton, in crustacea and molluscs that feed through filtration. Its transmission to humans occurs through food, like oyters, turttle eggs, shrimp, and fish that are consumed raw or barely cooked, causing gastroenteritis and severe cholera-type diarrhea. Among the Vibrio genus, V. mimicus and V. cholerae are the most phylogenetically related species, sharing multiple phenotypic and genotypic characteristics. The pathogenicity mechanism of V. mimicus is still unknown; however, some factors associated to virulence have been described, such as hemolysins, hemagglutinins, proteases, siderophores, enterotoxins, and
the presence of VPI1 and of the CTX phage, which are necessary to cause similar symptoms to those of cholera. Based on this, the present work was aimed at studying the presence of some factors involved in the virulence of V. mimicus in environmental strains isolated from water, fish, and oysters in the coast line of the Gulf of Mexico. We worked with 20 V. mimicus strains isolated from the Pueblo Viejo lagoon in the state of Veracruz, Mexico; six isolates from water, five from fish, and nine from oysters. We used sheep and rabbit erythrocytes to determine hemolytic activity, CAS medium to detect siderophores, and Congo red staining to determine the presence of the capsule. In addition, we used polymerase chain reaction (PCR) to analyze the presence of
genes encoding for hemolysin (vmhA), phage CTX (ctxA and zot), VPI1 (tcpA and tox), part of the aerobactin operon (iutA ,Inc. iucD), capsule (wza), and of a regulator gene (toxR). Likewise, we observed the cytotoxic capacity on the CHO cell line and the adherence on Hep-2 cells. Hundred percent of the studied strains were -hemolytic and possessed the hemolysin vmhA
gene, confirming their identity as V. mimicus, neither phage CTX nor VPI-1 were found. All strains had the gene toxR. Forty percent of the strains produced hydroxamate-type siderophores in the CAS medium, and all amplified the aerobactin operon gene. The presence of a capsule in V. mimicus is described for the first time, and was confirmed by amplifying the homologous gene to wza. Seventy-five percent of the strains presented a cytopathic effect at 3 hours of exposition to the filtrate, observing destruction of the monolayer at 6 hours of exposure to the filtered supernatant. Filtrates showed titers from 1:3 to 1:81. All strains presented adherence to the HEP-2 cell line, with an aggregating pattern. It was also demonstrated that the V. mimicus strains isolated from food possess the capacity to produce factors associated to virulence. In Mexico, there are no studies on V. mimicus isolates originating from fish products; therefore, these data are an important contribution to characterize the pathogenesis of this microorganism.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislados de agua y alimentos
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
1
I INTRODUCCIÓN
I.1 ANTECEDENTES
Los problemas de inocuidad de los alimentos son considerados en la actualidad como un
problema de salud pública. Los gobiernos del mundo están intensificando esfuerzos para
aumentar la seguridad alimentaria, ya que según datos de la OMS en el año 2005 murieron en el
mundo alrededor de 1.8 millones de personas debido a enfermedades diarreicas transmitidas por
alimentos y agua. Se estima que las pérdidas económicas que generan los alimentos
contaminados por algún patógeno ascienden a 35,000 millones de dólares USA al año tan sólo
en los EUA (OMS, 2007). Un factor que agrava estos problemas es la apertura del comercio
internacional de alimentos, lo que favorece la propagación de microorganismos en poco tiempo,
en forma adicional a la mayor movilización de personas y productos (Bertullo y Pollak, 2001).
Los productos del mar, como peces, moluscos y crustáceos, entre otros, son de gran importancia
para el ser humano, tanto como fuente de alimento (en el 2002 hubo una producción mundial
cercana a las 96,029,000 toneladas), como por razones económicas (ganancias en el 2002 por
valor de 548,933,000 dólares USA) (SAGARPA, 2003). En países como China y Japón, que son
los mayores consumidores a nivel mundial (SAGARPA, 2003), este tipo de alimentos son
fundamentales en su dieta. Existen factores que condicionan esta situación, destacando los
sociales (condiciones de vida, distribución de la población), los económicos (distribución de la
riqueza social, acceso a este tipo de productos) y los culturales (cualidades de los alimentos,
preferencia por ciertos sabores) (Barradas et al., 1993). En nuestro país, los productos de la
pesca no forman parte de la dieta básica de la población, excepto en las zonas costeras. Aún
así, su consumo ascendió a 922,000 toneladas en 2002 y supusieron ganancias por un valor de
777,000 dólares, USA (SAGARPA, 2003). Es importante señalar que México es exportador de
este tipo de mercancías.
La explotación, conservación y consumo adecuados de los productos de la pesca son de vital
importancia para evitar la transmisión de enfermedades, como las infecciones (salmonelosis,
disentería y cólera, por ejemplo) e intoxicaciones (botulismo y marea roja, por ejemplo)
(González, 1983). En la actualidad, los riesgos asociados al consumo de alimentos marinos se
han visto en aumento en países desarrollados y en vías de desarrollo, a pesar de los avances en
los procesos tecnológicos (Tantillo et al., 2004).
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
2
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA`s) son especialmente importantes por sus
altas tasas de morbilidad y mortalidad entre los grupos más vulnerables de la población, y
porque representan una proporción muy alta del costo de la atención médica y de las
hospitalizaciones (OPS, 1991). En nuestro país han ocurrido varios brotes de ETA`s
relacionados con productos de la pesca, que corresponden al 2.8% del total de ETA`s (Barradas
et al., 1993). Oficialmente, no se han reportado casos de cólera desde 2001 (DGE, 2008).
Los géneros bacterianos más importantes que se encuentran en los productos de la pesca son:
Pseudomonas spp., Alteromonas spp., Vibrio spp., Moraxella spp., Klebsiella spp., Acinetobacter
spp., Flavobacterium spp., Micrococcus spp., Bacillus spp., Salmonella spp., Corynebacterium
spp., Escherichia spp. y Clostridium spp., entre otras (González, 1983; Quiñones et al., 2000).
Las bacterias del género Vibrio son las más abundantes de este grupo y la mayoría de estas
bacterias son fácilmente cultivables en los laboratorios, siendo algunas especies patógenos para
los humanos y organismos marinos vertebrados e invertebrados (Okada et al., 2005; Zhang y
Austin 2005).
Las especies del género Vibrio que están principalmente relacionadas con enfermedades en
humanos, y cuya transmisión se da generalmente por agua y alimentos, son Vibrio cholerae
(agente causal del cólera), Vibrio parahaemolyticus (que causa gastroenteritis, infección de
heridas y septicemia), Vibrio vulnificus (causante de infección necrosante severa en heridas y
septicemia invasiva fulminante) y Vibrio mimicus (causa gastroenteritis) (Vora et al., 2005).
I. 2 HISTORIA
Desde 1854, con los trabajos de Pacini y en 1883 con los de Koch se inició el estudio del género
Vibrio. La primera especie del género que se describió fue V. cholerae, el agente etiológico del
cólera. El serotipo O1 ha causado 7 pandemias y actualmente se predice que la octava será
debida al serotipo O139 (Faruque y Albert, 1998; Janda y Powers, 1998; Thompson y Lida,
2004).
Las cepas de V. cholerae con características bioquímicas atípicas se designaban antiguamente
como V. cholerae lisina descarboxilasa negativo o V. cholerae sacarosa negativo, entre otras. En
1981, Davis y colaboradores estudiaron cepas representativas de estos biogrupos, utilizando
técnicas de hibridación de DNA entre cepas de V. cholerae típicas y atípicas y realizando análisis
fenotípicos extensos, lo que les llevó a concluir que la mayoría de las cepas atípicas
correspondían a V. cholerae, pero que el biogrupo sacarosa negativo formaba un grupo definido
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
3
y aparte, por lo que se propuso una nueva especie denominada V. mimicus. El nombre de esta
bacteria hace alusión a que “imita” o es muy “semejante” a V. cholerae (Davis et al., 1981).
I. 3 CARACTERÍSTICAS DEL MICROORGANISMO
V. mimicus y V. cholerae comparten múltiples características fenotípicas y genotípicas, como son
habitar en agua dulce, aglutinar con un mismo anticuerpo monoclonal dirigido contra el flagelo
(Simonson y Siebeling, 1988), tener dos cromosomas (Okada et al., 2005), e incluso tener
capacidad de transferirse información genética entre ellos (Boyd et al., 2000a). En estudios
recientes, se ha comprobado que estas dos especies son las más relacionadas entre sí dentro
del género, desde el punto de vista filogenético (Thompson y Lida, 2004), formando un grupo
separado de las demás especies del género.
En cuanto a su taxonomía, a este microorganismo se le ubica según el Manual Bergey´s 2ª
edición de la siguiente forma:
DOMINIO: Bacteria
PHYLUM : Proteobacteria
SECCION: Gammaproteobacteria
CLASE: Zymobacteria
ORDEN : Vibrionales
FAMILIA : Vibrionaceae
GENERO : Vibrio
ESPECIE: mimicus
Vibrio mimicus es un bacilo curvo Gram negativo, aunque bajo condiciones de estrés puede ser
pleomórfico (Janda et al., 1988); es catalasa y oxidasa positivo y móvil por un flagelo polar. Es un
microorganismo halotolerante, crece en intervalos de cloruro de sodio de 0 a 3%, y en presencia
de iones Na+ se estimula su crecimiento (Wong y Chen, 1994).
Su temperatura óptima de crecimiento es de 37°C siendo su máxima de 45°C. Es capaz de
sobrevivir a la congelación (hasta -30°C), y se ha aislado de alimentos congelados (Wong y
Chen, 1992). También se ha descrito su capacidad para crecer a temperaturas de refrigeración,
desde 4 hasta 10°C (Wong y Chen, 1994). El intervalo de pH en el cual se desarrolla es de 5 a
11.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
4
I.4 HÁBITAT Y DISTRIBUCIÓN
Vibrio mimicus es de hábitat acuático; se ha aislado de costas, estuarios, ríos, lagos y lagunas
de agua dulce y salada, de las zonas templadas o cálidas. Las poblaciones de este
microorganismo no se mantienen constantes a lo largo de todo el año, debido a que factores
ambientales como el pH, la salinidad y la temperatura afectan a su desarrollo. Se ha reportado
que en verano aumenta la concentración de estos microorganismos, debido a que el calor
promueve su proliferación; en cambio, las poblaciones disminuyen en invierno (cuando
disminuye la temperatura de la columna de agua) (Chowdhury y Yamanaca, 1989; Vieira et al.,
2001). Se ha observado que bajo condiciones no favorables estas bacterias pasan a un estado
de disminución de la actividad respiratoria llamado “viable no cultivable”, y por ello no pueden ser
detectados con métodos convencionales (Okada et al., 2005).
Cuadro 1. Lugares en donde se ha reportado la presencia de V. mimicus
PAIS REFERENCIA
ASIA
Japón Chowdhury y Yamanaca, 1989; Alam et al., 1996; Miyoshi et al., 1997; Shinoda y Nakagawa, 2004
Taiwán Wong y Chen., 1993
China Chowdhury y Yamanaca, 1989
India Davis et al., 1981; Chowdhury y Yamanaca, 1989; Albert et al., 1992
OCEANÍA
Nueva Zelanda Davis et al., 1981
Filipinas Davis et al., 1981
Australia Wong et al., 1995; Payne et al., 2004
ÁFRICA
Egipto Davis et al., 1981
Senegal Schandevyl et al., 1984
EUROPA
España Pérez et al., 2001
Francia Hervio-Heath et al., 2002
Italia Baffone et al., 2001
Rumania Janda y Powers., 1988
AMÉRICA
Perú Cabezas et al., 2005
Brasil Vieira et al., 2001
Cuba Leyva et al., 1996
Ecuador Vandenberghe et al., 1999
Costa Rica Acuña et al., 1999; Campos et al., 1996
México Davis et al., 1981; Vandenberghe et al., 1999
Estados Unidos Davis et al., 1981; Marano et al., 2000
Canadá Davis et al., 1981
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
5
I.5 EPIDEMIOLOGÍA
V. mimicus es reconocido como un patógeno emergente humano, aunque también tiene
importancia a nivel económico porque es patógeno también para crustáceos y algunos peces de
importancia económica (Shandera et al., 1983; Wong et al., 1995; Miyoshi et al., 1997;
Vandenberghe et al., 1999).
A partir de que en 1981 se identificó identificara V. mimicus como una especie distinta a V.
cholerae, comenzaron los reportes sobre la posible patogenicidad de la misma. Uno de los
primeros reportes es de Bangladesh, en 1981, en el cual V. mimicus se vio involucrado en dos
casos de otitis, uno en una persona de 39 años y el otro en un niño, ambos causados por la
exposición al agua de mar. En otro reporte se presentaron 17 casos de gastroenteritis en adultos
que habían consumido ostiones crudos, así, como infección en heridas expuestas al agua de
mar (Davis et al., 1981).
Con el paso del tiempo, se han reportado más casos en otras partes del mundo. En 1991, por
ejemplo, durante la epidemia de cólera en América Latina (la séptima pandemia), se describieron
casos de diarrea aguda debidos a la presencia de V. mimicus en Costa Rica (Campos et al.,
1996) Albert y col. (1992) informaron de casos de diarrea severa y de un caso de bacteriemia en
un niño, causado por V. mimicus. En la parte norte de Brasil se reportaron casos de diarrea tipo
cólera, identificando cepas atípicas de V. cholerae sacarosa negativo, que se confirmaron
posteriormente como V. mimicus (Vieira et al., 2001).
El 12 de febrero de 2005, después de una fiesta de carnavales en Cuncashca, (provincia de
Carhuaz, en Perú), se produjo un brote de diarrea aguda que afectó a 32 personas, de las cuales
31 eran mayores de 5 años y sólo un menor de 5 años. En todos ellos se determinó a V. mimicus
como el agente causal (Cabezas et al., 2005). En México hay reportes de su presencia (Davis et
al., 1981), sin embargo no se tienen datos de algún caso clínico, probablemente debido a que
este microorganismo no se busca rutinariamente.
I.6 PATOGENESIS
V. mimicus es capaz de causar varios cuadros clínicos, como son gastroenteritis, otitis, infección
de heridas, diarrea tipo cólera, disentería y, en muy raras ocasiones, septicemia. La dosis
infectiva aún se desconoce, pero se ha considerado que puede ser similar a la de Vibrio cholerae
(104 a 109 UFC), debido a la estrecha relación entre ambos (Reidl y Klose, 2002).
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
6
El periodo de incubación puede variar de persona a persona, desde unas cuantas horas después
de ingerir el alimento hasta tres a cuatro días, dependiendo del inóculo con el que se haya tenido
contacto y del estado inmune de la persona.
I.7 FACTORES DE VIRULENCIA
En la actualidad se desconoce el mecanismo de patogenicidad de Vibrio mimicus, sin embargo,
se han descrito algunos factores de virulencia, como hemolisinas, hemaglutininas, proteasas,
sideróforos y enterotoxinas (Chowdhury y Yamanaca, 1991; Bi et al., 2001; Moon et al., 2004;
Shinoda y Nakagawa, 2004).
I.7.1 HEMOLISINAS
El factor de virulencia más estudiado de este microorganismo es una hemolisina, conocida como
VMH (hemolisina de Vibrio mimicus). Esta hemolisina es una proteína termolábil, de
aproximadamente 66 kDa, que en su forma activa tiene un 81.6% de identidad con la HlyA de V.
cholerae. La VMH se considera especie específica, y se encuentra presente en las cepas
ambientales y en las aisladas a partir de casos clínicos (Shinoda y Nakagawa, 2004). Wei y
colaboradores en 2008 demuestran que la amplificación de este gen correlaciona con otras
técnicas con fines de identificación, como perfiles de ácidos grasos y la comparación de
secuencias de los genes 16S DNAr, oriC, pyrH, recA y rpoA.
La VMH es capaz de formar poros de 2.8 a 3.5 nm de diámetro sobre la superficie de las células
del huésped. También induce la producción de AMP en los enterocitos y activa un canal de iones
de Cl- (CFTR), lo que provoca el desbalance de electrolitos y genera diarrea (Bi et al., 2001; Li et
al., 2005).
Se ha descrito otra hemolisina, ésta termoestable, denominada Vm-TDH (hemolisina directa
termoestable de Vibrio mimicus). Esta segunda termolisina es un dímero, con subunidades de 21
KDa, y está relacionada con la TDH de V. parahaemolyticus. La Vm-TDH le da la capacidad al
microorganismo de producir diarrea tipo disentería. V. mimicus adquiere este gen por
transferencia horizontal de DNA, ya que el gen de la TDH se encuentra en un transposón (Terai
et al., 1991). A diferencia de la VMH que se encuentra en todos los aislados de esta bacteria,
ésta hemolisina se encuentra distribuida en el 10% de las cepas de origen clínico y se reporta su
presencia en el 1% de las cepas ambientales (Shinoda y Nakagawa, 2004).
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
7
En 2000 se reportó la presencia de una tercera hemolisina, la HLX de aproximadamente 11 KDa,
en V. cholerae O1 y V. mimicus. Su contribución a la virulencia de la bacteria, sin embargo, se
desconoce (Shi et al., 2000; Zhang y Austin, 2005)
Se ha descrito también que la lecitinasa A PHL de V. mimicus tiene un efecto citotoxico sobre la
línea celular CHSE-214 (Lee et al., 2002). Su actividad es similar a la VHH de V. harvey y a la
TLH de V. parahaemolyticus (Zhang y Austin, 2005).
I.7.2 PROTEASAS
Se ha descrito en V. mimicus la presencia de diversos tipos de proteasas. Una de ellas, con
actividad de hemaglutinina (Vm-HA/proteasa) (Alam et al., 1997) y la denominada VMP (proteasa
de Vibrio mimicus), es capaz de cambiar la permeabilidad en los vasos sanguíneos, generar
edema y causar la acumulación de fluido en asa ligada de conejo. Requiere iones de Ca++ para
su actividad y se sugiere que puede ser un factor importante para la patogenicidad (Chowdhury
et al., 1991).
En 2005 se describió la VMC (colagenasa de V. mimicus), proteasa con actividad de colagenasa,
que se une al colágeno por su extremo carboxilo y se considera que está relacionada con
infecciones extraintestinales y con patogenicidad en peces (Lee et al., 2005).
I.7.3 FACTORES DE ADHERENCIA
Se sugiere que los microorganismos patógenos deben ser capaces de adherirse y colonizar
superficies bióticas y abióticas para poder sobrevivir en diversos ambientes (Kirn et al., 2005).
Para muchas bacterias enteropatógenas, la capacidad de adherirse a la mucosa intestinal es el
primer paso en la colonización y un prerrequisito para causar diarrea. Esta interacción está
mediada por macromoléculas llamadas colectivamente adhesinas (Bag et al., 2008).
En Vibrio mimicus se han caracterizado 3 hemaglutininas (un tipo de adhesina), que están
relacionadas con la adherencia a la mucosa intestinal: el lipopolisacárido (Vm-LPSHA), una
proteína de membrana externa termoestable (Vm-OMPHA) de 39 KDa y una proteasa (Vm-
HA/proteasa). Estas moléculas interaccionan eficientemente con las glicoproteínas de la
superficie de los enterocitos (Alam et al., 1997).
La Vm-HA/proteasa tiene un doble papel: ayuda a la unión de la bacteria con la célula del
huésped y tiene como sustrato a la Vm-OMPHA. Tras una proteólisis limitada la capacidad de la
bacteria para adherirse a las células aumenta en gran medida. Se especula con que la
interacción de la bacteria con las células blanco es multifactorial, lo que indica que otras
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
8
moléculas o estructuras (como pueden ser el flagelo, o algún tipo de fimbria) pueden estar
involucrados en el proceso de adhesión (Alam et al., 2006).
I.7.4 MECANISMOS DE ADQUISICIÓN DE HIERRO
Se ha descrito que para algunos integrantes del género Vibrio el hierro es un factor determinante
en la virulencia. Por ello, los microorganismos requieren de mecanismos de captación de hierro
eficientes. Los sideróforos son moléculas de bajo peso molecular que tienen una alta afinidad por
el hierro y pueden extraerlo de complejos minerales o de proteínas acarreadoras, como la
lactoferrina y la ferritina (Litwin y Calderwood, 1993). En el género Vibrio se producen por lo
general sideróforos de tipo catecolato, como la vibriobactina (Figura. 1). Sin embargo, en V.
mimicus se ha descrito la presencia del sideróforo aerobactina (Okujo y Yamamoto, 1994)
(Figura. 1) como sideróforo principal, que está más relacionado con las enterobacterias (Moon et
al., 2004). La estructura química de la aerobactina es de tipo hidroxamato y se ha considerado
como un factor importante (y en algunos casos fundamental) para la virulencia de Shigella
flexneri, S. boydii, Klebsiella pneumonie, algunos serotipos de Salmonella spp, y varias cepas
invasivas de Escherichia coli. (Schmidt y Hensel, 2004).
A
Figura 1 Estructura química de los Sideróforos producidos por algunas bacterias del género Vibrio. A . Sideróforo
producido por V. mimicus. B. Sideróforo producido por V. cholerae.
Moon y colaboradores en 2004 demostraron que en V. mimicus los genes para la síntesis y
funcionamiento de la aerobactina son cromosomales, ya que no existe evidencia que indique que
provengan de algún tipo de transferencia horizontal (al no haber secuencias de inserción, o
integrasas, flanqueando el operón de aerobactina). Además, los genes necesarios para el
transporte del sideróforo se encuentran organizados en otro operón,, contiguo al de la
aerobactina. Esta organización es única, ya que en las enterobacterias estos genes se
A B
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
9
encuentran en elementos móviles como plásmidos, islas de patogenicidad, transposones o
fagos.
Figura 2 Organización del cluster de aerobactina en V. mimicus
Fuente: Modificado de Moon et al., 2004
Se encontró además que V. mimicus tiene un segundo mecanismo para la captación de hierro: el
complejo ferricromo. Para ello dispone de otro juego de genes homólogos, exclusivo para el
transporte de este complejo, al igual que ocurre en Vibrio cholerae (Moon et al., 2004)
I.7.5 ENTEROTOXINAS
V. mimicus es capaz de producir una enterotoxina termoestable (Vm-ST) y una enterotoxina
termolábil (Vm-LT), las cuales están relacionadas con la gastroenteritis, y una toxina tipo cólera
(CT), semejante en estructura a la producida por Vibrio cholerae (Spira y Fedorka-Cray, 1984;
Shi et al., 2000) y que es la causante del cuadro clínico de cólera.
I.7.6 ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVILES
En 1984 Spira y Fedorka-Cray encontraron que algunas cepas de V. mimicus producían una
toxina fisicoquímica, biológica, funcional e inmunológicamente indistinguible de la CT sintetizada
por V. cholerae, por lo que se sospechaba que probablemente era la misma toxina. Años
después, Acuña y colaboradores en 1999 informaron de la presencia de cepas de V. mimicus
con capacidad toxigénica e involucradas en casos de diarrea tipo cólera, encontrando los genes
de la toxina colérica en el genoma de éstas. Casi al mismo tiempo, se demostró que las cepas
toxigénicas de V. mimicus (al igual que las de V. cholerae) requieren de dos elementos genéticos
para ser toxigénicas: un bacteriófago filamentoso llamado CTX y la isla de patogenicidad de
Vibrio 1 (VPI1) (Faruque et al., 1999; Boyd et al., 2000a). En los últimos años se han
caracterizado cepas de V. mimicus que tienen la VPI 1 y el fago CTX integrados en su genoma
(Islam et al., 2005). Se han descrito también cepas que tienen el elemento CTX integrado en
su genoma, y que son capaces de expresarlo, pero no contienen el elemento VPI. Esto indica
TRANSPORTE BIOSÍNTESIS RECEPTOR
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
10
que existen otros mecanismos para adquirir el CTX así como para su regulación (Lazar y
Waldor, 1998).
I.7.6.1 ISLA DE PATOGENICIDAD DE Vibrio 1 (VPI-1)
La VPI1 tiene un tamaño aproximadamente de 40 kb, un %G-C distinto al de V. cholerae y se
inserta cerca del gen ssrA (que es muy similar a un gen de RNAt) por medio de secuencias att
(Schinidt y Hensel, 2004). Tiene muchos marcos de lectura abierta (ORFs) con similitud con
bacteriófagos, por lo que Karaolis en 1999 propuso que en realidad la isla se trata de un
bacteriófago (al que llamó VPI , aunque este tema sigue siendo de gran controversia ya que la
forma en que se transmite horizontalmente la VPI es desconocida. Dentro de este elemento se
encuentra un grupo de genes necesarios para la síntesis y regulación del TCP (pili corregulado
con la toxina), un pili de tipo IV que funciona como factor de colonización y como receptor del
fago CTX Karaolis et al.,1999 Este pili es un polímero de la proteína TcpA, la cual podría
ser parte de la cápside del fago VPI . Se sabe que el TCP favorece la colonización del intestino,
por las interacciones bacteria-bacteria durante la formación de la microcolonia (Reidi y Klose
2002). La isla tiene además otros loci que son co-regulados por proteínas codificadas en la isla,
así como algunas otras codificadas en el cromosoma de la bacteria (toxT, por ejemplo, que es un
regulador transmembranal que esta encargado directamente de activar la transcripción de los
genes del pili o los genes ctxAB del fago CTX así como con genes que están relacionados
con la colonización del intestino (Figura. 3) (Karaolis et al., 1999, Schinidt y Hensel, 2004).
.
Figura 3 Organización de la VPI-1
Fuente: Karaolis et al.,1999
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
11
I.7.6.2 EL BACTERIOFAGO CTX
Se ha demostrado que la generación de cepas toxigénicas de V. cholerae O1 y O139 a partir de
cepas no toxigénicas se debe a la presencia de un bacteriófago filamentoso que contiene en su
genoma los genes de la toxina colérica (Waldor y Mekalanos, 1996; Faruque y Mekalanos,
2003). El fago CTX lleva en su genoma el operón ctxAB, que corresponde a la toxina colérica
responsable de la diarrea severa.
En 2000 se describió que el fago CTX puede infectar tanto a V. cholerae como a V. mimicus
(Boyd et al., 2000a)
El fago tiene un tamaño de aproximadamente 6.9 kb y está organizado en dos dominios
funcionales:
a) la región del núcleo, en donde se encuentran los genes necesarios para la morfogénesis,
como algunas proteínas de cápside (Psh, Cep, OrfU y Ace) y proteínas que ensamblan el virus
(Zot). A algunas de estas proteínas, además de ser fundamentales para el virus, se les ha dado
un papel como enterotoxinas, como es el caso de la toxina accesoria a la colérica y la toxina de
la zónula ocludens (codificadas en los genes ace y zot, respectivamente).
b) la región RS2, que contiene genes para la replicación (rstA), integración (rstB) y regulación
(rstR) del virus y dos regiones intergénicas llamadas ig-1 e ig-2 (Figura. 4) (Boyd et al., 2000b).
Figura 4. Organización del bacteriófago CTX
Fuente: Boyd et al., 2000 B
Los genes ctxAB tienen un contenido de %G-C distinto al resto del fago, lo cual indica que se
adquirieron recientemente durante la evolución del fago. Esto explica, en parte, la presencia de
cepas de V. cholerae y V. mimicus que contienen el gen zot pero son negativas para ctxAB
(Boyd et al., 2000b; Faruque et al., 2001). Este virus se encuentra integrado por lo general en el
genoma de su hospedero, por medio de sitios attRS, aunque también se ha detectado la forma
replicativa, que incluso produce más toxina que cuando el fago está integrado en el cromosoma.
(Boyd et al., 2000b).
NÚCLEO
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
12
I.7.7 CÁPSULA
Las células bacterianas tienen la capacidad de secretar una gran variedad de moléculas,
incluyendo polisacáridos muy complejos y proteínas. Algunas de estas moléculas son requeridas
para la viabilidad de la célula, mientras que otras son usadas para la interacción con el ambiente.
Los polisacáridos pueden ser secretados por la célula en dos formas: polisacáridos que se
vierten al ambiente próximo a la célula (exopolisacárido para la formación de biopeliculas) y
polisacáridos asociados a la célula (cápsulas y lipopolisacárido) (Drummelsmith y Whitfield,
2000).
Dentro de la familia Vibrionaceae se han encontrado estos dos tipos de polisacáridos, que a la
fecha no han sido descritos para V. mimicus. La cápsula juega un papel critico en las
interacciones entre la bacteria y su ambiente más inmediato. Así, se sabe que en algunos
patógenos de este género (como V. vulnificus, V. parahaemolyticus y V. cholerae O139) la
cápsula es importante para la virulencia (Wright et al., 2001; Nesper et al., 2002; Whitfield, 2006).
La cápsula es una estructura que envuelve la superficie de la bacteria, compuesta por
polisacáridos de alto peso molecular que están firmemente anclados a la superficie celular; está
demostrado que esta estructura es un factor de virulencia, ofreciendo protección contra la
respuesta inmune del hospedero (opsonización, fagocitosis y acción lítica del complemento)
(Whitfield, 2006).
El proceso por el cual V. mimicus se sintetiza y exporta este polisacárido se desconoce; en V.
cholerae y V. vulnificus se ha descrito el locus de biosíntesis de cápsula, que es homólogo al de
las especies de E. coli, del grupo 1, encontrándose altamente conservados tanto en secuencia
como en función (Livanis et al., 2006).
El proceso de síntesis de la cápsula es muy complejo e involucra a varias proteínas. Una de las
más importantes es la lipoproteína Wza, miembro de la familia de proteínas auxiliares de
membrana externa (secretinas), que tiene una estructura octamérica con simetría de tetrámero.
Su forma tridimensional es de “tipo hongo” y en su interior forma un canal de aproximadamente
40 Å de diámetro, por donde transloca el polisacarido capsular hacia la superficie de la bacteria.
Esta proteina es esencial para el ensamble del polisacarido capsular y requiere acoplarse a la
proteína Wzc para su funcionamiento, ya que se sabe que el proceso de biosíntesis está
sincronizado con el de translocación (Figura, 5) (Drummelsmith y Whitfield 2000; Beis et al,.
2004; Whitfield 2006; Collins y Derrick, 2007).
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
13
Figura 5 Papel de la proteína Wza en la translocación del polisacárido capsular.
Fuente: Collins y Derrick 2007
I.7.8 ToxR
En respuesta a los cambios en el ambiente, los microorganismos responden expresando o
reprimiendo genes dependiendo del estimulo (temperatura, pH, u osmolaridad). En V. mimicus y
V. cholerae se ha descrito que la mayoría de los genes asociados con la virulencia están
regulados por la proteína ToxR, el regulón de esta proteína comprende la expresión aproximada
de 20 genes (Skorupski y Taylor, 1997). ToxR es un activador transcripcional del tipo del sistema
de 2 componentes: la proteína se divide en 3 dominios, uno transmembranal para anclarse a la
membrana de la célula, otro que sirve como sensor de las condiciones del espacio periplásmico
y uno más que es citoplásmico y que tiene la capacidad de unirse al DNA. Se sabe que para su
funcionamiento esta proteína debe ser un dímero, pudiéndose dimerizar con ella misma o con
otros activadores transcripcionales como son ToxS, ToxT o TcpP (Skorupski y Taylor, 1997;
Osorio et al., 2000). Un aspecto interesante de esta proteína (Figura. 6) es que controla la
expresión de genes presentes en elementos móviles, tanto de la VPI-1 (formación del pili TCP)
como del fago CTX ,(se puede unir directamente al promotor de ctxAB).
Peptidoglicana
Membrana
externa
Membrana
interna
Peptidoglicana
Membrana
externa
Membrana
interna
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
14
Bilis
Citoplasma
Es probable que regule también la expresión de la hemolisina vhmA y de algunas proteínas de
membrana externa que están relacionadas con la resistencia a la bilis, con la modulación de la
adherencia y con la regulación de la movilidad del flagelo. Por ello, se le considera el regulador
maestro de la virulencia (Provenzano et al., 2000).
Figura 6 Procesos que controla la proteína ToxR en V .mimicus
Fuente: Modificado de Skorupski y Taylor 1997
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
15
JUSTIFICACIÓN
Vibrio mimicus ha sido involucrado en diversas etiologías, principalmente las causadas por
consumo de alimentos, y son pocos los estudios sobre sus factores de patogenicidad. Por ello se
consideró de interés estudiar en cepas ambientales aisladas de agua, pescados y ostiones
capturados en las costas del Golfo de México, la presencia de algunos factores involucrados en
su virulencia.
HIPÓTESIS
Si las cepas de Vibrio mimicus aisladas de alimentos presentan características asociadas con la
virulencia entonces probablemente sean patógenas y pudieran en un momento dado producir un
padecimiento en las personas que consuman los alimentos o estén en contacto con agua
contaminada.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
16
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar por medio de pruebas fenotípicas, técnicas de biología molecular y biología celular la
presencia de factores de virulencia en cepas de Vibrio mimicus
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Determinar por medio de pruebas fenotípicas y genotípicas la presencia de una
hemolisina.
2. Evidenciar mediante la técnica de PCR la presencia de algunos marcadores y elementos
genéticos móviles relacionados con la virulencia.
3. Estimar si V. mimicus es capaz de sintetizar sideróforos.
4. Observar si V. mimicus presenta cápsula.
5. Llevar a cabo ensayos de citotoxicidad en la línea celular CHO.
6. Evaluar si las cepas de V. mimicus tienen capacidad adherente en la línea celular HEp-2
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
17
Figura 7. Diagrama general de trabajo
BBiioollooggííaa cceelluullaarr
AAddhheerreenncciiaa
eenn HHEEpp--22 EEffeeccttoo
cciittoottóóxxiiccoo
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BBiioollooggííaa mmoolleeccuullaarr
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BBúússqquueeddaa YY ddiisseeññoo
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EEnn llaa lliitteerraattuurraa
AAmmpplliiffiiccaacciióónn ppoorr PPCCRR
Pruebas fenotípicas
CCeeppaass ddee VV.. mmiimmiiccuuss
DDIIAAGGRRAAMMAA GGEENNEERRAALL
DDEE TTRRAABBAAJJOO
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
18
II METODOLOGÍA
Se trabajó con 20 cepas de Vibrio mimicus aisladas de la laguna de Pueblo Viejo, Veracruz: 6 de muestras de agua, 5 de pescado y 9 de ostión.
Cuadro 2. Cepas testigo usadas en este trabajo
Cepa Características
Vibrio mimicus ATCC 33653 vmhA+, iutA+,vm toxR+,CTX -,VPI1-.
Vibrio vulnificus ATCC 29307 vvhA+, vvtoxR+, pilA+, viuB+,wza+
Vibrio cholerae O1 Ogawa CLBM-ENCB hly+, vctoxR+, CTX +,VPI1+.
Vibrio cholerae O1 Inaba CLBM-ENCB hly+, vctoxR+, CTX +,VPI1+.
Vibrio cholerae No O1-noO139 CECT 557 hly+, vctoxR+, CTX -,VPI1+.
Escherichia coli ATCC 25922 No adherente
CLBM-ENCB = Colección del Laboratorio de Bacteriología Médica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.
II.1 Obtención de DNA genómico
Las cepas se sembraron en caldo Luria Bertani y se incubaron a 37°C durante 24 horas. Para
obtener el DNA se empleó el sistema Wizard® Genomic DNA Purification, de la casa
comercial PROMEGA, usando el protocolo indicado por el proveedor.
II.2 Amplificación de los genes vmhA, ctxA, zot, tcpA, toxT, toxR, iuT y wza mediante la
técnica de PCR.
Se preparó la mezcla de reacción con: 34.95 l de agua destilada estéril, 5 l de regulador 10×
(200 mM Tris-HCl pH 8.4 y 500 mM KCl), 2.5 l de MgCl2 50mM, 0.25 l de la mezcla de dNTP
(10 mM), 2.5 l de cada iniciador (1 nM), 0.3 l de Taq polimerasa (5 U/ l) y 2 l de la solución
que contiene el DNA (aproximadamente 100 ng). Eel volumen total de la mezcla de reacción fue
de 50 l. Las reacciones se hicieron en un termociclador Hybaid® Omn-E. Las condiciones de
los ciclos tiempos y temperaturas utilizados para cada gen serán descritos posteriormente.
Posteriormente se prepararon geles de agarosa al 1.5% (p/v) para los genes vmhA, ctxA, tcpA,
toxT y toxR y al 1% (p/v) para los genes zot, uitA y wza, Se mezclaron 4 l del producto de PCR
con 1.5 l del regulador de carga [azul de bromofenol (0.25%), sacarosa (40%) y xileno cianol
(0.25%)] y 9 l de agua. Las electroforesis se desarrollaron utilizando regulador Tris-Acido
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
19
acético glacial-EDTA (TAE),. mediante la aplicación de 121 V durante una hora. Como
referencia, se empleó un marcador de talla molecular de 100 pb (Invitrogen®).
La tinción de los geles se hizo con una solución de bromuro de etidio a una concentración final
de 0.5 g/ml. Los geles se observaron en un transiluminador Gel Doc 2000 (Bio Rad®) que
emite luz a una longitud de onda de 302 nm y permitió obtener la imagen digital en el software
Quality One (BioRad®).
II.3 Purificación de productos de PCR a partir de geles de agarosa
Para la purificación previa al análisis de secuencia para verificar la identidad de las bandas
amplificadas para el gen wza se usó el sistema QIAquick PCR Purification Kit, de la casa
comercial QIAgen®.
II.4 Análisis bioinformático
Se hizo con el paquete DNASTAR® versión 7.1 de Lasergene, el programa Seaview 4.32 y
usando las aplicaciones GenBank y la herramienta BLAST del sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
II.5 Presencia de hemolisina
II.5.1 Prueba fenotípica (García y Landgraf, 1998)
Como testigo positivo se usó la cepa V. mimicus ATCC 33653
1. Se cultivó cada una de las cepas en caldo TSC de 18-24 horas a 37°C
2. Se sembraron en agar sangre con eritrocitos de carnero y de conejo
3. Se incubaron durante 24 horas a 37°C
4. Se observó el halo de hemólisis, parcial o total
II.5.2 Prueba genotípica
Como testigo positivo se usó la cepa V. mimicus ATCC 33653, y como testigo negativo las cepas
V. cholerae O1 serotipo Ogawa y V. cholerae O1 serotipo Inaba (de la colección del Laboratorio
de Bacteriología Medica de la ENCB).
Se hizo una revisión bibliográfica y se utilizaron los iniciadores descritos por Shi et al., 2000.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
20
Cuadro 3. Condiciones de amplificación para vmhA
Secuencia blanco Iniciadores Referencia
vmhA F- 5´GGTAGYCATCAGTCTCATCACG -3´
R-5´TCRTSTCCCAATACTTCACCG-3´
Modificados de
Shi, et al., 2000
Desnaturalización inicial 94°C/ 60 seg
Desnaturalización
Alineamiento
Extensión
94°C/ 45 seg
58.5°C/ 45 seg
72°C/ 45 seg
Número de ciclos 30
Tamaño del fragmento 389 pb
II.6 Amplificación de los genes del fago CTX
Se hizo la revisión bibliográfica correspondiente, eligiéndose los marcadores ctxA y zot que se
encuentran el bacteriófago. Como testigos positivos se usaron las cepas V. cholerae O1 serotipo
Ogawa y V. cholerae O1 serotipo Inaba, que se sabe que tienen el bacteriófago integrado en su
genoma, y como testigo negativos las cepas V. mimicus ATCC 33653 y V. cholerae No O1 CECT
557.
Cuadro 4. Condiciones de amplificación para los genes del fago CTX
Secuencia blanco Iniciadores Referencia
ctxA F- 5´ CTCAGACGGGATTTGTTAGGCACG-3´
R-5´TCTATCTCTGTAGCCCCTATTACG -3´
Shinoda y Nakagawa, 2004
zot F- 5´ TCGCTTAACGATGGCGCGT-3´
R-5´AACCCCGTTTCACTTCTACC -3´
Singh, et al., 2002
ctxA zot
Desnaturalización inicial 94°C/ 4 min 94°C/ 3 min
Desnaturalización
Alineamiento
Extensión
94°C/ 60 seg
55°C/ 30 seg
72°C/ 30 seg
94°C/ 60 seg
60°C/ 45 seg
72°C/ 45 seg
Número de ciclos 30 32
Tamaño del fragmento 301 pb 947 pb
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
21
II.7 Amplificación de los genes de la VPI1
Se hizo la revisión bibliográfica correspondiente, basada en los genes tcpA y toxT, genes que se
encuentran en la VPI1. Como testigo positivo se usaron las cepas V. cholerae O1 serotipo
Ogawa, V. cholerae O1 serotipo Inaba y V. cholerae No O1 CECT 557 que se sabe tienen la
VPI1 en su genoma. Como testigo negativo se utilizó la cepa V. mimicus ATCC 33653.
Cuadro 5. Condiciones de amplificación para los genes de la VPI1
II.8 Amplificación del gen toxR
Para amplificar este gen se buscaron los iniciadores que están descritos para V. mimicus. Como
testigo positivo se usó la cepa V. mimicus ATCC 33653 y como testigo negativo las cepas V.
cholerae O1 serotipo Ogawa, V. cholerae O1 serotipo Inaba y V. vulnificus ATCC 29307.
Secuencia blanco Iniciadores Referencia
tcpA F- 5´ GAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACAC-3´
R-5´GAAAGGACCTTCTTTCACGTTG -3´
Islam et al,. 2005
toxT F- 5´ TTGCTTGGTTAGTTATCAGAT-3´
R-5´TTGCAAACCCAGACTGATAT -3´
Shinoda y Nakagawa, 2004
tcpA toxT
Desnaturalización inicial 94°C/ 5 min 94°C/ 5 min
Desnaturalización
Alineamiento
Extensión
94°C/ 45 seg
57.5°C/ 40 seg
72°C/ 40 seg
94°C/ 45 seg
51.5°C/ 45 seg
72°C/ 45 seg
Número de ciclos 30 30
Tamaño del fragmento 472 pb 581 pb
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
22
Cuadro 6. Condiciones de amplificación para toxR
Secuencia blanco Iniciadores Referencia
toxR F- 5´ACAACAGCGACTCCTCAGAA -3´
R-5´ACACACAGTTCTATCGAGGG -3´
Shinoda y Nakagawa, 2004
Desnaturalización inicial 94°C/ 5 min
Desnaturalización
Alineamiento
Extensión
94°C/ 45 seg
51.5°C/ 45 seg
72°C/ 45 seg
Número de ciclos 30
Tamaño del fragmento 221 pb
II.9 Presencia de sideróforos
II.9.1 Prueba fenotípica
El agar CAS (Schwyn y Neilands, 1987) está diseñado para inducir la producción de sideróforos,
porque el medio no contiene hierro disponible para los microorganismos. Todos los ingredientes
y materiales fueron desferrados por métodos químicos. La única fuente de hierro del medio está
asociada al colorante Cromo-Azurol S; por ello, si el microorganismo produce sideróforos éstos
captarán el hierro del colorante y se producirá un viraje en el color de medio.
Como testigo positivo se usó la cepa V. mimicus ATCC 33653 y V. vulnificus ATCC 29307
Se cultivaron las cepas de V. mimicus en caldo nutritivo durante 18-24 horas a 37°C
1. Se sembraron en el agar CAS
2. Se incubaron durante 24 horas a 37°C
Interpretación: Los microorganismos productores de sideróforos estarán rodeados de un halo
amarillo-anaranjado, dependiendo del tipo de sideróforo producido.
II.9.2 Prueba genotípica
Se ha descrito que V. mimicus produce aerobactina como sideróforo, por lo que se diseñaron los
iniciadores de acuerdo a la secuencia del GenBank para poner en evidencia parte de los genes
requeridos para la síntesis y transporte de la aerobactina: iucC, iucD y iutA. (Figura. 2). Como
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
23
testigo positivo se uso la cepa V. mimicus ATCC 33653 y como testigo negativo las cepas V.
cholerae O1 serotipo Ogawa, y V. vulnificus ATCC 29307.
Cuadro 7. Condiciones de amplificación para el operón de aerobactina
Secuencia blanco Iniciadores Referencia
iut F- 5`AACCGCTACCAAATGACCCCAGAT -3´
R-5´CAAAACCGGCGACAGAACCTACTT -3´
Este estudio
Desnaturalización inicial 94°C/ 5 min
snaturalización
Alineamiento
Extensión
94°C/ 60 seg
62°C/ 60 seg
72°C/ 75seg
Número de ciclos 33
Tamaño del fragmento 1573 pb
II.10 Presencia de cápsula
II.10.1 Prueba fenotípica Tinción de cápsula (Clarck, 1973)
1. Se sembraron placas con gelosa glicerol y un 2% (p/v) de NaCl y se incubaron a 37°C
durante 24 horas.
2. Pasado el tiempo de incubación se hizo un frotis y se tiñó por la técnica de Rojo Congo.
3. Se observó al objetivo de inmersión
Interpretación: la prueba es positiva cuando hay halos sin color alrededor de los bacilos teñidos
de rojo en un fondo del mismo color
II.10.2 Prueba genotípica
Hasta el momento no existe reporte alguno de la presencia de capsula en V. mimicus, por lo que
se diseñaron los iniciadores a partir de las secuencias de los genes wza de V. cholerae y V.
vulnificus. Como testigo positivo se usaron las cepas de V. cholerae O1 serotipo Ogawa y V.
vulnificus ATCC 29307.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
24
Cuadro 8 Condiciones de amplificación para del gen wza
Secuencia blanco Iniciadores Referencia
wza F- 5`ATTTGGGATCCACCCAGAGCTGACCA -3´
R-5´ACTTCGCCCATTACAAACACTTTTT -3´
Este estudio
Desnaturalización inicial 94°C/ 5 min
Desnaturalización
Alineamiento
Extensión
94°C/ 60 seg
62°C/ 45 seg
72°C/ 40 seg
Número de ciclos 30
Tamaño del fragmento 514 pb
II.11 Evaluación del efecto citotóxico del filtrado libre de células de V. mimicus (Elliot et
al., 1995, Baffone et al., 2001)
Como testigo positivo se utilizaron las cepas de Vibrio cholerae O1 Serotipo Ogawa e Inaba, y como testigo negativo caldo AKI.
II.11.1 Obtención del filtrado
1. Se sembró cada una de las cepas de V. mimicus en caldo AKI, se incubó durante 18
horas con agitación (200 rpm) a 37°C.
2. Se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos.
3. Se esterilizó por filtración utilizando una membrana de 0.22 m de diámetro de poro.
4. El filtrado se conservó en congelación a -70°C hasta su uso.
II.11.2 Obtención de un abasto de células CHO
1. A partir de un vial que contiene células CHO (células de ovario de hámster chino) se
obtuvo una monocapa confluente después de crecerlas en medio F12 con suero fetal
bovino (SFB) al 10%, incubado a 35°C con un 5% de CO2.
2. Pasado el tiempo de incubación, se eliminó el suero y el medio y se adicionaron 2
mililitros de solución de tripsina-verseno al 0.05% para lavar la células.
3. Posteriormente, se adicionó un mililitro más de solución de tripsina-verseno al 0.05% y
se incubó durante 5 minutos a 35ºC, disgregándose a continuación la monocapa.
4. Se agregaron 9 mL del medio F12 al 10% de SFB.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
25
5. Posteriormente se transfirieron 3 mL de la suspensión de células a dos botellas para
cultivo y se completó el volumen con 5 mL de medio F12 al 10% de SFB y se incubó a
35°C durante 24-48 horas hasta obtener una confluencia de 100%.
II.11.3 Efecto de los filtrados de V. mimicus
1. Se colocaron 200 l de suspensión de células CHO en medio F12 al 15 % de SFB a
cada uno de los 96 pozos de una placa de cultivo. Las placas se Incubaron a 37°C con
un 5% de CO2, hasta lograr la confluencia.
2. Transcurrido el tiempo de incubación, se eliminó el medio y se lavó tres veces con
regulador salino de fosfatos (PBS) estéril.
3. Se agregaron por pozo 100 L de las diluciones 1:1, 1:3, 1:9, 1:27, 1:81, 1:253, 1:729 y
1:2187 del filtrado (inciso V.XI.I) en medio F12 y se incubó a 35°C con un 5% de CO2,
por triplicado.
4. Se observó al microscopio invertido cada 60 minutos hasta observar alteraciones en la
morfología del 50% de las células de la monocapa.
5. Paralelamente, en otra placa de 96 pozos con células CHO confluentes, se agregaron
por pozo 100 L de las mismas diluciones (por triplicado). En cuanto apareció el cambio
en la morfología de las células se retiró el contenido del pozo y se hizo un lavado con
PBS estéril, adicionándose 100 l de medio F12 para observar si la alteración era
reversible.
6. Terminado el tiempo de incubación, se eliminó el medio y se lavó tres veces con PBS
estéril, se fijó con metanol absoluto e inmediatamente se lavó tres veces más con PBS.
7. Finalmente se tiñó con colorante de Giemsa cubriendo los pozos durante 20 minutos, se
lavó con agua destilada hasta no observar de colorante en el enjuague y se observó al
microscopio invertido.
El efecto citopático y citotóxico se consideró positivo cuando >50% de las células presentaron
destrucción o alteración de su morfología (Baffone et al., 2001).
II.12 Ensayo de adherencia en la línea celular HEp-2 (Cravioto et al., 1979, Gander y
Larocco, 1989, Baffone et al., 2001)
Como testigo positivo se utilizó la cepa Vibrio mimicus ATCC 33653 y como testigo negativo
E. coli ATCC 25922.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
26
II.12.1 Preparación de los cultivos
1. Se sembró una asada de cada cepa en tubos con 3 mL de caldo triptona con manosa al
1% y se incubó a 37°C/ 18 horas
2. Se centrifugó a 2500 rpm/ 20 min/ 4°C.
3. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el botón en 1 mL de PBS estéril.
II.12.2 Preparación de la monocapa de células HEp-2 y ensayo de adherencia
1. Se prepararon microplacas de 24 pozos al 100% de confluencia de células HEp-2
(cáncer laringeo humano), crecidas sobre un cubreobjetos estéril. Se lavaron 3 veces
con PBS estéril.
2. Se colocaron en cada pozo 975 L de medio MEM + 25 L de la suspensión bacteriana.
Se incubaron a 37°C con 5 % de CO2 durante 1.5 horas (para determinar este tiempo se
hizo una cinética previa).
3. Se eliminó el medio con una pipeta Pasteur y se lavó 3 veces con PBS estéril.
4. Las células se fijaron con metanol durante 1 minuto y se lavaron 3 veces con PBS
estéril.
5. A continuación se tiñeron con Giemsa durante 20 minutos y se lavaron los pozos con
agua destilada hasta que el agua de enjuague no tuviera colorante.
6. Se desmontaron los cubre objetos y se deshidrataron, colocándose 1 min. en acetona, 1
min. en acetona-xilol (1:1) y 1 min. en xilol.
7. Se montaron las preparaciones en portaobjetos y se sellaron con una gota de resina de
Permount.
8. Se observó al microscopio con en el objetivo de inmersión (100x).
Sí al menos el 40% de las células tenían bacterias adheridas, la cepa se considera
adherente (Baffone et al ,.2001),
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
27
III RESULTADOS
En las cepas estudiadas se encontraron varios fenotipos y genotipos (hemolisinas, sideróforos,
cápsula, genes de regulación de la virulencia, citotoxicidad y adherencia), factores que pueden
estar involucrados en la patogénesis de este microorganismo (Cuadro 10).
III.1 Hemolisina y vmhA
La presencia de hemolisinas se demostró en el 100% (20/20) de las cepas, a través de la
hemólisis de eritrocitos de carnero y conejo en gelosa sangre (Figura. 8), en donde se observó
actividad hemolìtica del tipo .
Figura 8. - hemólisis en agar sangre. A. Eritrocitos de carnero. B Eritrocitos de conejo
Se amplificó el gen de la hemolisina vmhA, obteniéndose un fragmento de 389 pb en todas las
cepas estudiadas (Figura. 9).
Figura 9. Electroferograma del producto amplificado del gen vmhA. M= marcador de talla molecular 100pb, 1 V.
mimicus ATCC, 2-17 V. mimicus, O= V. cholerae O1 Ogawa, I= V. cholerae O1 Inaba
MM 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 1144 1155 1166 1177 OO II MM
338899 ppbb
330000 ppbb
A B
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
28
La literatura indicaba que estos iniciadores amplifican un producto de 289 pb. Al hacer la
reacción de PCR se encontró un fragmento cercano a las 400 pb. Se descargó de las bases de
datos la secuencia del gen vmhA y se buscó en qué posición del gen se alineaban los
iniciadores, encontrandose que los iniciadores abracan desde la posición 2110 hasta la 2499 y
que el tamaño esperable del amplificado era realmente de 389 pb y no el indicado en la
literatura.
Figura 10. Confirmación del tamaño del amplificado para el gen vmhA
La amplificación de este gen permitió demostrar la presencia del gen que codifica para la
hemolisina VMH en las cepas, característica que se usa como rasgo distintivo para la
identificación a nivel molecular de Vibrio mimicus.
III.2 Presencia de la VPI-1 y del bacteriófago CTX
Se ajustaron las reacciones hasta condiciones óptimas y se encontró que en ninguna de las
cepas se amplificaron productos correspondientes a los genes toxT y tcpA, presentes en la VPI-1
(corresponden a un regulador transcripcional y a la proteína estructural del pili TCP,
respectivamente) ni a los genes ctxA y zot presentes en el bacteriófago CTX (en este caso
corresponden respectivamente a la subunidad A de la toxina del cólera y a una proteína
implicada en el ensamble del virus, a la que también se le han atribuido propiedades citotóxicas)
(Figuras 11 y 12). Si se observó amplificación en esas condiciones en los controles positivos
utilizados.
389 pb
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
29
MM 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 1144 1155 1166 1177 1188 1199 2200 NNoo OO II VVmm MM
500 pb
Figura 11 Búsqueda de la VPI1. A Electroferograma del producto amplificado del gen toxT. B. Electroferograma del
producto amplificado del gen tcpA. M= marcador de talla molecular 100pb, Vm V. mimicus ATCC, 1-20 V. mimicus,
O= V. cholerae O1 Ogawa, I= V. cholerae O1 Inaba, No= Vo cholerae No O1 CECT 557
MM 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 1144 1155 1166 1177 1188 1199 2200 VVmm NNoo OO II MM
600 pb
581 pb
A
47
2
B
452pb
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
30
Figura 12 Búsqueda del fago CTX A. Electroferograma del producto amplificado del gen ctxA B. Electroferograma
del producto amplificado del gen zot. M= marcador de talla molecular 100pb, Vm V. mimicus ATCC 1-20 V.
mimicus, O= V. cholerae O1 Ogawa, I= V. cholerae O1 Inaba, No= Vo cholerae No O1 CECT 557*
III.3 toxR
Este gen implicado en la regulación se encontró en el 100% (20/20) de las cepas estudiadas. El
tamaño del fragmento amplificado fue de 221 pb (Figura. 13).
MM 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 1144 1155 1166 1177 1188 1199 2200 VVmm OO II NNoo MM
900 pb
947 pb
B
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Vm No O I M
301 pb
300 pb
A
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
31
Figura 13 Electroferograma del producto amplificado del gen toxR M= marcador de talla molecular 100pb, Vm V.
mimicus ATCC 1-20 V. mimicus, O= V. cholerae O1 Ogawa, I= V. cholerae O1 Inaba Vv= V.vulnificus ATCC
III.4 Búsqueda de sideróforos
En esta prueba, el 40% (8/20) de las cepas fueron capaces de producir sideróforos del tipo
hidroxamato, lo cual se observa por el cambio de color (amarillo) en el medio CAS (Figura. 14).
Figura 14 Producción de Sideróforo tipo hidroxamato en agar CAS
Posteriormente, se busco en ´la base de datos GenBank la secuencia reportada del operón de
aerobactina de V. mimicus y se diseñaron iniciadores específicos para amplificar parte de los
genes iucC, ,iucD e iutA, implicados en la síntesis y transporte de este sideróforo (Figura. 2). Se
buscaron las condiciones óptimas de amplificación y se encontró que el producto esperado, de
aproximadamente 1500 pares de bases amplifico en el 100% (20/20) de las cepas (Figura, 15).
MM 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 1144 1155 1166 1177 1188 1199 2200 VVmm OO II VVvv MM
220000 ppbb
221 pb
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
32
Figura 15 Electroferograma del producto amplificado del operón de aerobactina. M= marcador de talla molecular
100pb, Vm V. mimicus ATCC 1-20 V. mimicus, O= V. cholerae O1 Ogawa, Vv= V.vulnificus ATCC
III.5 Cápsula
Al realizarse la tinción negativa con Rojo Congo se evidenció la presencia de la cápsula en el
100% (20/20) de las cepas. Las bacterias que tienen cápsula se observaron con una zona clara
sobre un fondo teñido de rojo (Figura. 16).
Figura 16 Presencia de cápsula en cepas de V. mimicus por medio de la tinción de Rojo Congo
Al no estar descrita la presencia de los genes que participan en la síntesis de la cápsula en V.
mimicus, se buscaron secuencias que codifican para el gen wza (que es importante en el
ensamblaje de esta estructura en algunos miembros de la familia Vibrionaceae). Se obtuvieron
las secuencias correspondientes a este gen de V. cholerae y de V. vulnificus, con el objeto de
diseñar iniciadores para PCR. El producto amplificado que se esperaba era de 514 pb.
MM 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 1144 1155 1166 1177 1188 1199 2200 VVmm OO VVvv MM
1573 pb
1500 pb
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
33
Al realizar la PCR se encontró que la cepa testigo de V. vulnificus ATCC 29307 amplificó un
fragmento de aproximadamente 500 pb, las cepas de V. cholerae O1 serotipo Ogawa e Inaba un
fragmento de aproximadamente 800 pb, la cepa de V. mimicus ATCC 33653 y las cepas de
trabajo tanto el fragmento de 500 pb como el de 800 pb (Figura. 17).
Figura 17 Electroferograma de los productos amplificados para el gen wza
Para tratar de eliminar el producto no esperado (800 pb) se hizo una PCR en gradiente de
temperatura con el DNA de V. mimicus ATCC 33653, utilizando desde 52.1 hasta 70ºC. Se
encontró que el producto de 800 pb amplificaba en todas las temperaturas analizadas (Figura.
18).
Figura 18 Electroferograma del gradiente de temperatura para el gen wza hecho con el DNA de V. mimicus ATCC
33653
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Vm Vv Vc
800 pb
500 pb
514 pb
800 pb
62.1 63.3 64.2 65.2 66.362.1 63.3 64.2 65.2 66.3
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
34
Se decidió secuenciar los dos productos de PCR, tanto el de 800 como el de 500 pb, obtenidos a
partir de las cepas testigo.
Tras obtener las secuencias de los productos de PCR, se llevó a cabo un análisis bioinformático
que reveló que el producto de 500 pb amplificado para V. mimicus ATCC 33653 tiene alta
similitud con un gen relacionado con la síntesis del polisacárido capsular de V. cholerae, el
resultado que se perseguía al principio del experimento (Figura 19).
Figura 19 Análisis BLAST de la secuencia de 500pb amplificada por V. mimicus.
El producto de 800 pb amplificado para V. mimicus ATCC 33653 tiene alta similitud con una
región que sintetiza el polisacárido capsular de V. cholerae, aunque los resultados más
frecuentes de similitud se dieron con el gen 16S RNA de V. cholerae y V. mimicus (Figura. 20).
Figura 20 Análisis BLAST de la secuencia correspondiente al fragmento de 800 pb amplificado para V. mimicus.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
35
El producto de 800 pb amplificado por V. cholerae CLBM-ENCB dio la mayor similitud con el gen
para el RNA 16S de este mismo organismo y el de V. mimicus (Figura. 21)
Figura 21. Análisis BLAST de la secuencia correspondiente al fragmento de 800 pb amplificado para V. cholerae.
El fragmento de 500 pb amplificado para la cepa testigo V. vulnificus ATCC 29307 tiene la
máxima similitud con la región que codifica para la síntesis del polisacárido capsular de esta
especie (Figura. 22).
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
36
Figura 22 Análisis BLAST de la secuencia correspondiente al fragmento de 500 pb amplificado para r V. vulnificus
ATCC 29307
Después de los análisis, se encontró que el 100% de las cepas de V. mimicus tienen un gen
homólogo al wza, que está relacionado con la expresión de la cápsula.
III.6 Efecto de los filtrados libres de células sobre la línea celular CHO
El 75% (15/20) de los filtrados de las cepas de V. mimicus presentaron efecto citopático a las 3
horas y destrucción de la monocapa a las 6 horas. (Figura. 23). El 25% (5/20) restante sólo
presentó efecto citopático a las 6 horas, caracterizado por el redondeo de las células.
Se evaluó si el efecto observado sobre las células era reversible, encontrándose que aún
después de cambiar el medio e incubar 3 horas, las células seguían presentando alteraciones.
Los títulos de la citotoxicidad de los filtrados variaron desde 1:3 hasta 1:81, mostrando el 25%
(5/20) un título de 1:81, el 50% (10/20) de ellas un título de 1:27, el 10% (2/20) de 1:9 y el 15%
(3/20) de 1:3 (Cuadro 9).
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
37
Cuadro 9 Resultados del ensayo de citotoxicidad
Cepa Origen Fenotipo sobre la línea CHO a las 6 horas de exposición
Dilución máxima donde se observó efecto a las 6
horas de exposición
1 Agua Destrucción 1 : 27
2 Agua Destrucción 1 : 27
3 Ostión Destrucción 1 : 27
4 Ostión Destrucción 1 : 27
5 Pescado Destrucción 1 : 27
6 Pescado Efecto citopático 1 : 9
7 Pescado Efecto citopático 1 : 3
8 Agua Destrucción 1 : 81
9 Agua Destrucción 1 : 81
10 Agua Destrucción 1 : 81
11 Agua Efecto citopático 1 : 3
12 Pescado Efecto citopático 1 : 3
13 Ostión Destrucción 1 : 27
14 Ostión Destrucción 1 : 81
15 Ostión Destrucción 1 : 81
16 Ostión Efecto citopático 1 : 9
17 Pescado Destrucción 1 : 27
18 Ostión Destrucción 1 : 27
19 Ostión Destrucción 1 : 27
20 Ostión Destrucción 1 : 27
V. mimicus ATCC 33653 Destrucción 1 : 27
V. cholerae serotipo Ogawa
ENCB Destrucción 1 : 27
V. cholerae serotipo Inaba
ENCB Destrucción 1 : 27
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
38
Figuras 23 Ensayo de citotoxicidad sobre la línea celular CHO. A. Testigo de células CHO. B. Testigo positivo con filtrado de V. cholerae O1 serotipo Ogawa. C. Efecto citopático causado por los filtrados de V. mimicus a las 3 horas de exposición. D. Destrucción de la monocapa de células causada por los filtrados de V. mimicus a las 6 horas de exposición.
III.7 Adherencia en la línea celular HEp-2
En el ensayo de adherencia, se hizo una cinética para encontrar el tiempo de interacción célula-
bacteria, debido a que al hacer el ensayo a las 3 horas de interacción como indica la literatura las
bacterias destruían la monocapa. El tiempo ideal que se encontró fue de 90 minutos (Figura. 24).
A B
C D
D
C B A
F E
Figura 24 Determinación del tiempo adecuado para el ensayo de adherencia A. 0 minutos. B. 30 mininutos.C. 60 minutos. D. 90 minutos. E. 120 minutos. F. 150 minutos.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
39
El 100% (20/20) de las cepas fueron adherentes en la línea celular HEp-2, observándose un
patrón de adherencia agregativo (Figura. 25).
Figura 25 Adherencia de V. mimicus a las células HEp-2. A. Testigo de células HEp-2. B. Patrón de adherencia
mostrado por las cepas de V. mimicus.
Los resultados indican que las cepas 3, 7, 17 y 19 presentaron las mismas características que la
cepa de referencia V. mimicus ATCC 33653 (patógena para los humanos). Sin embargo, las 16
cepas restantes, que no presentaron el mismo comportamiento que la cepa testigo, tienen
marcadores de virulencia que se han relacionado con la patogenicidad de V. mimicus,
independientemente del origen de las cepas (Cuadro 10).
A B
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
40
Cuadro 10 Genotipos y fenotipos mostrados por las distintas cepas de V. mimicus
Cepa Origen -hemólisis vmhA CAS Aerobactina CTX VPI-1 toxR Cápsula wza Citotoxicidad Título del filtrado
Adherencia
Vm ATCC + + + + - - + + + D 1 : 27 +
1 A + + - + - - + + + D 1 : 27 +
2 A + + - + - - + + + D 1 : 27 +
3 O + + + + - - + + + D 1 : 27 +
4 O + + - + - - + + + D 1 : 27 +
5 P + + + + - - + + + E 1 : 9 +
6 P + + + + - - + + + E 1 : 3 +
7 P + + + + - - + + + D 1 : 81 +
8 A + + - + - - + + + D 1 : 81 +
9 A + + - + - - + + + D 1 : 81 +
10 A + + + + - - + + + E 1 : 3 +
11 A + + - + - - + + + E 1 : 3 +
12 P + + - + - - + + + D 1 : 27 +
13 O + + - + - - + + + D 1 : 81 +
14 O + + - + - - + + + D 1 : 81 +
15 O + + + + - - + + + E 1 : 9 +
16 O + + - + - - + + + D 1 : 27 +
17 P + + + + - - + + + D 1 : 27 +
18 O + + - + - - + + + D 1 : 27 +
19 O + + + + - - + + + D 1 : 27 +
20 O + - + - - + + + D 1 : 27 + A=agua, O=ostión, P=pescado, += positivo, -=negativo, D=destrucción de la monocapa a las 6 horas de exposición y E= efecto de arredondamiento de las células a las 6 horas de exposición
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
41
IV DISCUSIÓN
La presencia de factores de virulencia en V. mimicus es un hecho reconocido, aún cuando se
desconoce el mecanismo de patogenicidad de esta bacteria.
El gen vmhA codifica para una hemolisina, y ya se ha mencionado que se encuentra presente en
todas las cepas de V. mimicus por lo que se esperaría un fenotipo hemolítico. Este dato se
corroboró, en forma de -hemólisis sobre eritrocitos de carnero y conejo (Figura. 8). Para la
amplificación del gen vmhA se usaron los iniciadores y condiciones de reacción reportadas por
Shi y colaboradores en 2000. El producto amplificado esperado debía ser de 289 pb, utilizando
una temperatura de hibridación de 55ºC. Al realizar la reacción de PCR en esas condicones se
obtenían bandas inespecíficas, lo que llevó a probar una temperatura de alineamiento superior,
58.5ºC, encontrándose que el amplificado era de aproximadamente 400 pb, mayor de lo
esperado por los datos previos de la literatura. Se buscó el sitio de hibridación de los iniciadores
dentro de la secuencia del gen vmhA que se encuentra en la base de datos GenBank,
encontrándose que el tamaño del amplificado es realmente de 389 pb, lo que coincide con
nuestros resultados (Figura 10). En un estudio realiado en 2008, se identificaron 68 cepas
aisladas de varios brotes utilizando el sistema API 20E (Biomerieux), señalando los resultados
que la identidad de algunas de ellas era V. mimicus. Al hacer pruebas de perfiles de ácidos
grasos, hibridación DNA-DNA, y analizar las secuencias del oriC y de los genes DNAr 16S, pyrH,
recA, rpoA, hlyA, y vmhA para corroborar la especie, se encontró que en realidad se trataba de
cepas de V. cholerae con características bioquímicas atípicas. Ninguna de ellas amplificó el gen
vmhA, salvo los controles positivos de V. mimicus, correlacionándose la presencia del gen vmhA
con V. mimicus (Wei et al., 2008). Otros autores han mencionado que el gen vmhA es descriptivo
para la identificación de V. mimicus (Shi et al., 2000; Shinoda et al., 2004). Al haber amplificado
todas nuestras cepas este gen se confirmó molecularmente su identidad como V. mimicus.
La hemolisina VMH es considerada un factor de virulencia (Bi et al., 2001, Shi et al,. 2000,
Shinoda et al,.2004, Zhang y Austin 2005). Esta proteína tiene actividad de hemolisina/citolisina y
forma poros en la membrana de las células. Estos poros son permeables al agua y a iones
pequeños como Na+ y K+ e induce cambios en la polaridad; la despolarizacion activa canales
para otros iones presentes en la célula, causando la perdida de liquido y diarrea (Li et al., 2005),
por ello se le considera una toxina (Takahashi et al., 2006).
Debido a la similitud que hay entre V. mimicus y V. cholerae se decidió investigar la presencia de
la toxina del cólera, la cual se encuentra codificada en el bacteriófago filamentoso CTX que
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
42
únicamente infecta a V. cholerae O1, O139 y a V. mimicus, cuando la bacteria contiene en su
genoma la VPI-1 (Boyd et al,. 2000a).
No existe un estudio que indique las funciones o ventajas que confiere a V. mimicus la presencia
del fago y la isla, salvo la capacidad de ser toxigénicas y causar un cuadro clínico similar al
cólera (Campos et al,. 1996). La ausencia de estos dos elementos genéticos en las cepas de
estudio (0/20) (Cuadro 10) coincide con lo reportado por Shinoda y colaboradores en 2004,
quienes indican que la presencia del fago en cepas V. mimicusde origen ambiental es menor al
1%. Aún y cuando la frecuencia es baja, existen informes de casos de cólera provocados por
cepas toxigénicas de V. mimicus (Campos et al., 1996; Acuña et al., 1999). Se desconoce la
frecuencia con que se presenta la VPI-1 en V. mimicus, así como la razón por la cual V. cholerae
es capaz de generar brotes epidémicos y V. mimicus no (incluso más si se considera que ambas
bacterias dependen de los mismos mecanismos para llegar a ser toxigénicas). Las cepas de V.
mimicus que presentan estos dos elementos se han aislado en zonas en donde el cólera es
endémico, por ejemplo de la Cuenca del Río Ganges en la India, en Japón y en la costa del
Golfo de México. Existen datos de cepas de V. mimicus provenientes de estas regiones en los
cuales la VPI1 está incompleta, no tienen el gen que codifica para la proteína estructural del pili
TCP (tcpA) o no tienen el gen regulador toxT (motivo por el cual se decidió buscar ambos genes
en las cepas de V. mimicus) (Bi et al,.2001; Shinoda et al., 2004). En cuanto al fago CTX , Boyd
y colaboradores (2000b) reportaron que hay bacteriófagos incompletos que sólo tienen el gen zot
(esencial para el ensamble de la cápside viral) pero no presentan el operón ctxAB (toxina
colérica).
Se sabe que los principales factores de virulencia de V. cholerae son adquiridos de fuentes
exógenas. Sin embargo, los donadores de este material genético siguen siendo desconocidos,
aunque se considera que V. mimicus podría tener un papel importante en la evolución de las
cepas toxigénicas de V. cholerae (Faruque y Mekalanos, 2003; Jermyn y Boyd, 2005).
En el 100% de las cepas estudiadas se amplificó el gen toxR (Figura. 13). Nuestros datos
concuerdan con lo descrito por Shinoda en 2004 y por Provenzano y colaboradores en 2000,
quienes indicaron que este gen está presente en todas las especies del género Vibrio. Este gen
codifica para una proteína transmembranal que regula muchas de las funciones de virulencia en
V. mimicus y V. cholerae. Su presencia faculta a V. mimicus para regular tanto funciones de
virulencia propias como para cambiar el patrón de expresión de proteínas de membrana externa
ante estímulos del ambiente, favoreciendo la colonización del intestino, la expresión de la
hemolisina y la movilidad del flagelo (Skorupski y Taylor, 1997). Regula, además, las funciones
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
43
de virulencia.obtenidas a través de un evento de transferencia horizontal y es capaz de regular
los genes presentes en la isla de patogenicidad y del fago, de modo que las cepas que no tienen
la isla pero sí el fago pueden ser toxigénicas debido a que ToxR se puede unir directamente al
promotor del operón ctxAB (Islam et al., 2005).
El 40% (8/20) de las cepas fueron capaces de producir sideróforos de tipo hidroxamato (Figura.
14), datos que concuerdan con lo reportado por Okujo y Yamamoto en 1994 quienes indicaron
que el sideróforo producido por V. mimicus es la aerobactina. No todas las cepas fueron capaces
de producir sideróforos: una posible explicación pudiera ser la toxicidad de algunos de los
componentes del medio, pues se ha demostrado que el medio CAS puede inhibir el crecimiento
de algunos microorganismos (Pérez-Miranda et al., 2007), o bien deberse a defectos en la
expresión o mutaciones en algún gen implicado en la ruta de biosíntesis de aerobactina
Se diseñaron iniciadores de acuerdo a la secuencia del operón de aerobactina de V. mimicus,
amplificándose parte de los genes iucC e iucD relacionados con la síntesis, así como parte del
gen iutA, implicado en el transporte del complejo ferri-sideroforo desde el exterior hacia el interior
de la bacteria (Figura. 2). Al hacer la reacción de PCR se encontró que todas las cepas (20/20)
tienen los genes iucC.,iucD y iutA (Figura 15). Estos datos coinciden con lo reportado por Moon y
colaboradores en 2004, los cuales estudiaron 6 cepas de V. mimicus (3 de origen clínico y 3 de
origen ambiental) que contenían el operón de aerobactina. Las 20 cepas de V. mimicus de este
estudio (que son ambientales) también los poseen, lo cual apoya la teoría que sostienen estos
autores acerca de una localización cromosomal de estos genes y una amplia distribución entre
las cepas de esta especie.
El papel de los sideróforos como factores de virulencia es muy controvertido, en otras bacterias
como Klebsiella pneumoniae, Shigella spp. y Escherichia. coli invasivas, las bacterias pierden su
patogenicidad al perder el operón de aerobactina. Esto indicaría que los mecanismos de
captación de hierro son un factor clave durante el proceso de infección del hospedero, lo que
haría de los sideróforos un posible blanco para el diseño de nuevos medicamentos (Schmidt y
Hensel, 2004).
La presencia de cápsula es un factor de virulencia que no estaba reportado para V. mimicus,
aunque en el presente trabajo se evidenció en el 100% de las cepas estudiadas (20/20), por
medio de la técnica de tinción con Rojo Congo (Figura. 16). Del mismo modo, la expresión
fenotípica se corroboró con evidencia genética. Para ello se eligió el gen wza, fundamental para
la construcción de la cápsula. Este gen codifica para una proteína que tiene como función
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
44
translocar el polisacárido capsular desde el espacio periplásmico hacia el exterior, a través de la
membrana externa (Wright et al., 2001).
Para diseñar los iniciadores se hizo una búsqueda bibliográfica, encontrándose que nunca se ha
hecho referencia a esta estructura en V. mimicus y no existen secuencias depositadas en las
bases de datos. Por ello, los iniciadores se diseñaron a partir de regiones conservadas de las
secuencias de V. cholerae y V. vulnificus, microorganismos filogenéticamente cercanos en los
que se ha reportado la presencia de la cápsula. Al hacer la reacción de PCR se encontró que
todas las cepas de V. mimicus (incluida la cepa de referencia ATCC 33653) amplifican 2
productos, uno de aproximadamente 800 pb (que también se obtiene en la amplificación de las
cepas testigo de V. cholerae) y otro, mas pequeño, de aproximadamente 500 pb (que también es
amplificado en la cepa testigo de V. vulnificus) (Figura. 17).
Teóricamente, el producto de 500 pb corresponde al gen wza que se obtuvo en todas las cepas
de V. mimicus. Para eliminar la banda de 800 pb se hizo una reacción de PCR en gradiente de
temperatura para la etapa de hibridación de los iniciadores, sin embargo el producto de 800 pb
no desaparece en ninguna de las condiciones probadas (Figura. 18) por lo que se decidió
secuenciar los fragmentos obtenidos.
Tras obtener las secuencias y hacer un analisis BLAST, la secuencia del producto de 500 pb
amplificado por V. mimicus mostró similitud con una región del cromosoma de V. cholerae
relacionada con la síntesis del polisacárido capsular (Figura. 19), lo que indica que todas las
cepas de V. mimicus analizadas tienen en su genoma un gen homólogo al wza. Lo mismo ocurre
con el amplificado de 500 pb de V. vulnificus, el cual tiene similitud con una región involucrada en
la síntesis de la cápsula (Figura. 22). Todos los datos que da el análisis BLAST están referidos a
regiones en los cromosomas, debido a que los genomas de V. cholerae y V. vulnificus no están
anotados completamente.
El amplificado de 800 pb de V. mimicus presentó similitud con la misma región del fragmento de
500 pb, con una identidad del 83%, pero también la mostró con el gen para el RNA 16S de V.
cholerae y V. mimicus, con una identidad de 81% (Figura. 20), lo que probablemente indique que
este amplificado se trata de una quimera o un producto inespecífico de la PCR.
Al analizarse la secuencia del fragmento de 800 pb de V. cholerae se encontró similitud del 95%
y 94% con los genes para el RNAr 16S de V. cholerae y V. mimicus, respectivamente, lo que
indica que los iniciadores probablemente estén hibridando con una región de dicho gen en
ambas especies (Figura. 21). Cuando se diseñaron los iniciadores, el análisis BLAST no reveló
que tuvieran similitud con alguna región de los genes ribosomales, por lo que se compararon las
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
45
secuencias de los genes wza de V. cholerae y V. vulnificus (con las que se diseñaron los
iniciadores) con las secuencias de los genes 16S RNA de V. mimicus y V. cholerae. Los
resultados arrojaron que:
1) Los genes para el RNAr 16S de V. mimicus y V. cholerae son casi idénticos,
2) Los genes wza de V. cholerae y V. vulnificus, tienen similitud entre si, pero además también
presentan una región semejante a la de los genes para el RNAr 16S y
3) Los iniciadores hibridaron en esa zona de similitud, lo que justifica la existencia de bandas
adicionales de 800 pb además de las esperadas de 500 pb (Figura. 26).
Figura 26. Localización de los iniciadores en los genes wza y RNAr 16S de V. mimicus y V. cholerae
La cápsula juega un papel muy importante desde el punto de vista de la patogenicidad. Por
ejemplo, en V. cholerae O139 la presencia de cápsula es fundamental para la colonización del
epitelio intestinal, facilitando la formación de las microcolonias (Nesper et al., 2002). Por otro
lado, la presencia de esta estructura en V. vulnificus es útil para sobrevivir a la acción del
complemento y evadir la fagocitosis cuando se encuentra circulando en el torrente sanguíneo
(Wright et al., 1999). También favorece la sobrevivencia en el ambiente, facilita la formación de
biopelículas y la transmisión horizontal de genes (debido al contacto tan estrecho entre las
bacterias), aumentando la frecuencia de adquisición de factores de virulencia, algo fundamental
en la patogenicidad de V. cholerae y V. mimicus (Reidl y Klose, 2002).
Al hacer el ensayo de citotoxicidad utilizando el modelo de la linea celular CHO descrito para el
género Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas shigeloides (Elliot et al,. 1995, Gardner et al,.1987) se
observó con las cepas de V. mimicus un efecto citopático de redondeo a las 3 horas y la
destrucción de la monocapa a las 6 horas (Figura. 23). No se tiene antecedente sobre el efecto
que produce este microorganismo en la línea celular CHO, la única información similar era el
reporte de un efecto citotóxico sobre las líneas Y-1 (Campos et al., 1996), CHSE-214 (Lee et al.,
2002) y T84 (Li et al,. 2005). En todos estos casos se reporta la destrucción de la monocapa.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
46
Los títulos de los filtrados de V. mimicus van desde 1:3 a 1:81, y no existe antecedente que
estime la actividad de éstos. Baffone y colaboradores en 2001 encontraron que los filtrados de V.
alginolyticus, V. parahaemolyticus y V. cholerae no O1 tenían títulos desde 1:4 hasta 1:10,
considerando que éstos últimos son fuertemente citotóxicos, lo que contrasta con lo descrito por
Bag y colaboradores en 2008, quienes indican que sus aislados de V. cholerae no O1 no O139
presentan títulos que van desde 1:4 hasta 1:128. En nuestro caso, se encontró que un titulo por
menor a 1:9 se traduce en un fenotipo citopático; en cambio, en uno mayor el efecto es
citotóxico, llegando incluso hasta 1:81 en las cepas 8, 9, 10, 14 y 15 (Cuadro 9). Las diferencias
entre los títulos pueden deberse a variaciones en la expresión de los genes de hemolisinas, que
por lo general son la causa del efecto de destrucción y daño celular que producen las bacterias
del género Vibrio (Zhang y Austin 2005; Bag et al., 2008).
La hemolisina de V. cholerae es capaz de vacuolizar células VERO (Figueroa-Arredondo et al.
2001; Arellano et al., 2007; Vidal et al., 2007) y causar un efecto de redondeo sobre células HeLa
(Bag et al., 2008). La hemolisina VVH de V. vulnificus tiene un efecto de alargamiento y
destrucción sobre células CHO (Kreger y Lockwood, 1981), mientras que la TDH de V.
parahaemolyticus tiene actividad citolítica y citotóxica sobre enterocitos humanos y de ratón
(Zhang y Austin, 2005). Todo lo anterior nos lleva a pensar que el efecto que estamos
observando pudiera relacionarse con la hemolisina que se detectó en el agar sangre y que
probablemente sea la VMH la responsable.
Bag y col. en 2008 demostraron en cepas de V. cholerae no O1- no O139 un efecto citopático de
redondeo, seguido de lisis, sobre la línea HeLa, correlacionando la citotoxicidad con la
patogenicidad en un modelo de ratón. Esto hace inferir que las cepas que tienen capacidad de
daño in vitro son probablemente patógenas in vivo.
Al analizar los datos del ensayo de adherencia, se encontró que el 100% (20/20) de las cepas
son adherentes (Figura. 25), lo que coincide con las investigaciones hechas por Alam y
colaboradores en 1996a, 1996b, 1997 y 2006. Estos autores describen ampliamente algunos de
los factores de adherencia por los cuales V. mimicus se adhiere a las superficies de las células o
al intestino de ratones. Se ha descrito que en V. mimicus la capacidad de adherirse a las células
del intestino es un proceso multifactorial, y se ha visto que las proteínas de la membrana
externa, varias proteasas y el lipopolisacárido (LPS) tienen capacidades como hemaglutininas,
(Alam et al,. 2006).
Se tiene la certeza de que muchas de las proteínas que se han estudiado para entender la
patogénesis de V. cholerae en humanos tienen también importantes papeles en la sobrevivencia
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
47
en el ambiente acuático, es decir, estas proteínas tendrían un papel bifuncional (Kirn et al.,
2005). En V. cholerae se ha visto que la mutación de un gen que está involucrado en el
ensamble del flagelo produce un fenotipo que tiene disminuida la capacidad de adherirse a las
células del intestino de ratones, lo que se señalaría que el flagelo facilita la colonización inicial
del intestino (Attridge y Rowley, 1983). Se puede sugerir una situación similar para V. mimicus.
Existen otros factores de adherencia descritos en especies patógenas del genero Vibrio, como
son los pilis tipo IV (PilA de V. vulnificus y TCP y PilA de V. cholerae). Hasta la fecha no existe
reporte alguno que indique que V. mimicus tenga un mecanismo similar (Alam et al., 2006).
Como se puede ver en las figuras 24 y 25, las cepas de V. mimicus presentan una adherencia de
tipo agregativa, las bacterias se están adhiriendo tanto a la superficie de las células como a la
superficie del vidrio. Tampoco existen antecedentes que indiquen el tipo de adherencia que tiene
esta bacteria sobre las células HEp-2. Está reportado que V. alginolyticus presenta una patrón de
adherencia similar, V. cholerae no O1- no O139 tiene dentro de la misma especie diferentes
patrones de adherencia, que van desde adherencia difusa y agregativa hasta de tipo alfombra
(Baffone et al., 2001; Bag et al., 2008).
Se sabe que moléculas como la fibronectina, colágena y algunos tipos de carbohidratos son
moléculas blanco para las adhesinas de las bacterias del género Vibrio y que, en general, el
proceso de adherencia es multifactorial (Wang y Leung, 2000).
En la Cuadro 10 se observa que las cepas analizadas en este trabajo tienen por lo menos algún
marcador que se ha descrito en cepas patógenas y que el origen de las cepas es independiente
a la distribución de los marcadores. Esto coincide con la propuesta de Chowdhury y
colaboradores (1986), quienes afirman que V. mimicus es un grupo heterogéneo, en donde cada
cepa tiene diferentes capacidades patogénicas y que éstas están relacionadas con la presencia
o ausencia de ciertos factores de virulencia, descritos con el paso del tiempo (Shi et al., 2000; Bi
et al., 2001; Faruque y Mekalanos, 2003;, Shinoda et al., .2004).
27 años después de haber sido descrito por Davis y col. existen muchas lagunas sobre las
características patogénicas que presenta V. mimicus: no existe información suficiente en las
bases de datos genéticas, no se ha secuenciado su genoma, y tampoco existen datos actuales
sobre su incidencia (ya que no existe ninguna regulación nacional o internacional que indique su
búsqueda o reporte, pese a la importancia que pudiera tener en un momento dado la generación
de cepas de V. cholerae toxigénicas en el medio ambiente). Se desconocen también cuestiones
muy interesantes, como el por qué siendo tan similar a V. cholerae y teniendo la capacidad de
causar diarrea tipo cólera no ha causado brotes importantes, además de otros aspectos como el
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
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por qué esta bacteria tiene aerobactina como sideróforo o el papel que juega la cápsula en su
patogénesis, entre otros aspectos.
En México, durante la epidemia de cólera de los años 90´s, la zona del Golfo de México (de
donde provienen las cepas estudiadas en este trabajo), se vio gravemente afectada y hubo
numerosos casos, por lo que se consideró importante en ese momento mantener la vigilancia
sobre la presencia del género Vibrio en la laguna; actualmente solo los casos de V. cholerae son
los que se notifican a las autoridades, de ninguna otra bacteria del género Vibrio se tiene
información en nuestro país. Por ello, no se conoce el verdadero comportamiento que tiene V.
mimicus en el ambiente ni su impacto epidemiológico, las autoridades mexicanas deben
promover el que se generen modelos que puedan ayudar a prevenir enfermedades en la
población o asegurar la inocuidad de los productos de la pesca que se producen en nuestro país.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
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V CONCLUSIONES
• En este estudio se demostró la presencia de posibles factores asociados a la virulencia, en las cepas de V. mimicus, lo que indica que en un momento dado pudieran causar un padecimiento en personas susceptibles .
• Al haber amplificado todas las cepas el gen vmhA, se confirma que son Vibrio mimicus • Todas las cepas que tuvieron el gen vmhA son beta-hemolíticas y resultaron citotóxicas
sobre la línea celular CHO.
• Las cepas estudiadas no tienen la VPI-1 ni el CTX , lo que indica que no son capaces de producir toxina colérica.
• La presencia del gen toxR es un indicador de que las cepas pueden regular las
funciones de virulencia propias como las adquiridas de manera horizontal.
• Los genes del operón de aerobactina están distribuidos en todas las cepas de V. mimicus analizadas, aunque algunas fueron incapaces de expresarlos.
• Se ha descrito por vez primera la presencia de cápsula en V. mimicus.
• Se confirmó que V. mimicus se puede adherir a la línea celular HEp-2
• No se encontró relación alguna entre la fuente de aislamiento de las cepas y la
distribución de los marcadores de virulencia.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
50
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Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
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VI ANEXOS Agar sangre
Cantidad por litro de agua:
Infusión de músculo cardiaco 375 g
Peptona de carne 10 g
NaCl 5 g
Agar 15 g
pH 7.3
Preparación:
Todos los ingredientes componen la base, se disuelven con agitación constante y calentando
hasta ebullición. Se esterilizan a 121ºC durante 15 minutos. Se deja enfriar y cuando se
encuentra a 45ºC se adiciona la sangre desfibrinada hasta alcanzar una concentración del 5%.
Mezclar. Enfriar y vaciar en cajas de Petri.
Agar glicerol extracto de levadura
Cantidad por litro de agua:
Caldo nutritivo deshidratado 8 g
Extracto de levadura 2.5 g
Glicerol 20 ml
Agar 15 g
pH 6.8
Preparación:
Disolver todos los ingredientes, calentar hasta la disolución del agar y esterilizar a 121°C durante
15 minutos, distribuir en cajas Petri estériles.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
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Agar CAS:
NaOH 5.3 g PIPES 30.24 g 10×MM9 100 ml Agar 15 g Agua 750 ml
Ajustar el pH a 6,8 , Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos y enfriar hasta 50°C.
Añadir:
30 ml Casaminoácidos al 10% desferrados
10 ml de glucosa al 20% (p/v) (u otra fuente de carbono)
1 ml 1 M MgCl2
1 ml 100 mM CaCl2
4 ml tiamina 500 µg/ml
4 ml ácido nicotínico 500 µg/ml
Mezclar y añadir 100 ml de la solución CAS-HDTMA. Mezclar abundantemente evitando la
formación de burbujas.
Plaquear. Las colonias de bacterias productoras de sideróforos crecidas en este medio estarán
envueltas de un halo amarillo-anaranjado.
Componentes del medio:
•10×MM9
KH2PO4 3 g NaCL 5 g NH4Cl 10 g Agua 1000 ml
Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
•CAS-HDTMA
Cromo Azurol S 60.5 mg Agua 50 ml
Disolver y añadir 10 ml de 1 mM FeCl3 6H2O en 10 mM HCl.
Añadir lentamente a la solución de HDTMA (72,9 mg HDTMA en 40 ml de H2O).
Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
•Casaminoácidos al 10% desferrados
Disolver 10 g de Casaminoácidos en 100 ml de agua bidestilada.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
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Para desferrar la solución de Casaminoácidos se mezcla con un volumen equivalente de una
solución al 3% de 8-hidroxiquinolina en cloroformo, y se agita hasta que el color azul intenso del
complejo férrico del agente quelante desaparece de la capa de cloroformo. El proceso se repite
únicamente con cloroformo, para eliminar las cantidades traza de 8-hidroxiquinolina.
Medio Luria Bertani
Extracto de levadura 5 g
Peptona tríptica de caseína 10 g
NaCl 10 g
Preparación:
Disolver todos los ingredientes, distribuir en tubos de 13 × 100 mm. y esterilizar a 121° C durante
15 minutos.
Regulador Tris-Ácido acético glacial-EDTA (TAE) 50×
Acido acético glacial
57.1 ml
EDTA 0.5 M 100 ml
Base Tris 242 g
Agua destilada Completar volumen a 1000 ml
Mezclar bien y ajustar pH a 8.0
Regulador de carga 6×
Azul de bromofenol al 0.25% (p/v), sacarosa al 40% (p/v) y xileno cianol al 0.25% (p/v).
Esterilizar en autoclave a 121ºC por 20 minutos. Se conserva a 4ºC.
Bromuro de etidio
Se prepara una solución 10 mg/ml en agua y se conserva a 4ºC. Para preparar un litro de
bromuro de etidio a una concentración de 0.5 g/ml, se adicionan 50 L de la solución a un litro
de agua destilada.
Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos
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Medio Mínimo Esencial
FORMULACIÓN
Medio mínimo esencial (10×)
50 ml
Regulador de pH HEPES 1 M
5 ml
Glutamina estéril (200 mM)
5 ml
Bicarbonato de sódio al 7.5% estéril
5 ml
Água desionizada estéril
450 ml
Preparación
En condiciones de esterilidad se colocan todos los ingredientes en un frasco con tapón de rosca
estéril y se almacenan en refrigeración hasta su uso. Al usarse se suplementa con la cantidad
deseada de suero fetal bovino.
Medio F-12
Formulación
Medio F-12 (10×)
50 ml
Regulador de pH HEPES 1 M
5 ml
Glutamina estéril (200 mM)
5 ml
Bicarbonato de sódio al 7.5% estéril
5 ml
Água desionizada estéril
450 ml
Preparación
En condiciones de esterilidad se colocan todos los ingredientes en un frasco con tapón de rosca
estéril y se almacenan en refrigeración hasta su uso. Al usarse se suplementa con la cantidad
deseada de suero fetal bovino.
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SOLUCIÓN REGULADORA DE FOSFATOS (PBS)
Formula en gramos por litro de agua desionizada
Cloruro de sodio
8 g
Cloruro de potasio
0.2 g
Fosfato de sodio dibásico
1.15 g
Fosfato de potasio monobásico
0.2 g
Água desionizada estéril
1000 ml
PREPARACIÓN
Se disuelven cada uno de los ingredientes y antes de aforar con el agua se ajusta el pH a 7.2 ±0.2. Posteriormente se esteriliza 15 minutos/ 121ºC/ 15 libras de presión.