ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS …tesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/4276/1/DETECCIONPOSIBLES.… · I.7.6 Elementos genéticos móviles 9 ... CTX Bacteriófago filamentoso

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

PROGRAMA DE MAESTRÍA EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS

Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de

agua y alimentos

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICO BIOLÓGICAS

P R E S E N T A: Q.B.P. TERCERO ALBURO JOSE JULIO

MÉXICO, D.F. DICIEMBRE 2008

Agradecimientos:

A Dios:

Por permitirme continuar por este camino en compañía de gente valiosa.

A mis abuelitos:

Por cuidarme siempre.

A mi Mamá y Maru:

Por que aún en los momentos más difíciles hemos estado juntos.

A mi Tía Titi Ricardo, Toño y Joana:

Por su cariño, y apoyo invaluables.

A la Maestra Elsa, al Doctor Carlos y al Doctor Francisco:

Por confiar en mi desde siempre, por la oportunidad de ser parte de su equipo,

por las oportunidades brindadas y por su cariño.

A Liz y Alex:

Por estar a mi lado, alentarme a seguir adelante a pesar de lo malo y brindarme

su cariño.

A Iván:

Por su amistad, por enseñarme el valor del trabajo y por aprender juntos.

A Claudia, Marcela, Chayo, Andrés, Viri, Diana, Laura, Claudia y a todos

aquellos que por alguna circunstancia halla olvidado mencionar:

Gracias por sus consejos, amistad y el tiempo compartido.

A mis sinodales:

Por sus consejos y el tomarse el tiempo para revisar este trabajo.

I

Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Microbiología Sanitaria del Departamento de

Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional,

bajo la dirección de la M en C Elsa Irma Quiñones Ramírez con el financiamiento clave SIP

20080926 y en el Laboratorio de Inocuidad Alimentaria del Departamento de Biotecnología de la

Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa a cargo del Dr. Carlos Vázquez Salinas y bajo

la co-dirección del Dr. Francisco José Fernández Perrino.

.

II

JURADO

M. en C. Elsa Irma Quiñones Ramírez

Dr. Francisco José Fernández Perrino

Dr. Carlos Vázquez Salinas

Dra. Ethel A. García Latorre

Dra. Silvia Giono Cerezo

Dr. Cesar H. Hernández Rodríguez

III

Índice general III Índice de Cuadros V Índice de figuras Abreviaturas

VI VII

Resumen Abstract

VIII IX

I. Introducción 1 I.1 Antecedentes 1 I.2 Historia 2 I.3 Características del microorganismo 3 I.4 Hábitat y distribución 4 I.5 Epidemiología 5 I.6 Patogénesis 5 I.7 Factores de virulencia 6 I.7.1 Hemolisinas 6 I.7.2 Proteasas 7 I.7.3 Factores de adherencia 7 I.7.4 Mecanismos de adquisición del hierro 8 I.7.5 Enterotoxinas 9 I.7.6 Elementos genéticos móviles 9 I.7.6.1 Isla de patogenicidad de Vibrio I (VPI-1) 10

I.7.6.2 El bacteriófago CTX 11

I.7.7 Cápsula 12 I.7.8 toxR 13 Justificación

15 Hipótesis

15 Objetivos 16 Esquema general de trabajo

17 II. Metodología 18 II.1 Obtención del DNA genómico 18 II.2 Amplificación de los genes vmhA, ctxA, zot, tcpA, toxT, toxT, iuT y wza mediante la técnica de PCR.

18

II.3 Purificación de productos de PCR a partir de geles de agarosa 19 II.4 Análisis bioinformática 19 II.5 Presencia de hemolisina 19 II.5.1 Prueba fenotípica 19 II.5.2 Prueba genotípica 19

II.6 Amplificación de los genes del fago CTX 20

II.7 Amplificación de los genes de la VPI1 21

II.8 Amplificación del gen tox R 21

II.9 Presencia de sideróforos 22

II.9.1 Prueba fenotípica 22

ÍNDICE GENERAL

IV

II.9.2 Prueba genotípica 22

II.10 Presencia de cápsula 22

II.10.1 Prueba fenotípica Tinción de cápsula 23

II.10.2 Prueba genotípica 23

II.11 Evaluación del efecto citotóxico del filtrado libre de células de V. mimicus

24

II.11.1 Obtención del filtrado 24

II.11.2 Obtención de un abasto de células CHO 24

II.11.3 Efecto de los filtrados de V. mimicus 25

II.12 Ensayo de adherencia en la línea celular HEp-2 25

II.12.1 Preparación de los cultivos 26

II.12.2 Preparación de la monocapa de células HEp-2 y ensayo . de adherencia

26

III. Resultados 27 III.1 Hemolisina y vmhA 27

III.2 Presencia de la VPI-1 y del bacteriófago CTX 28

III.3 toxR 30 III.4 Búsqueda de sideróforos 31 III.5 Cápsula 32 III.6 Efecto de los filtrados libres de células sobre la línea celular CHO 36 III.7 Adherencia en la línea celular HEp-2 38 IV. Discusión 41 V. Conclusiones 49 VI. Bibliografía 50 VII. Anexos 56

V

Páginas Cuadro 1. Lugares en donde se ha reportado la presencia de V. mimicus 4

Cuadro 2 Cepas testigo usadas en este trabajo 18

Cuadro 3 Condiciones de amplificación para vmhA 20

Cuadro 4 Condiciones de amplificación para los genes del fago CTX 20

Cuadro 5 Condiciones de de los genes de la VPI1 21

Cuadro 6 Condiciones de amplificación para toxR 22

Cuadro 7 Condiciones de amplificación para el operón de aerobactina 23

Cuadro 8 Condiciones de amplificación para del gen wza 24

Cuadro 9 Ensayo de citotoxicidad sobre la línea celular CHO 37 Cuadro 10 Genotipos y fenotipos mostrados las cepas de V. mimicus 40

ÍNDICE DE CUADROS

VI

Páginas Figura 1. Estructura química de los Sideróforos producidos por el género Vibrio 8 Figura 2. Organización del cluster de aerobactina en V. mimicus 9 Figura 3. Organización de la VPI-1 10

Figura 4. Organización del bacteriófago CTX 11

Figura 5. Papel de la proteína Wza en la translocación del polisacárido cápsular 13 Figura 6. Procesos que controla la proteína ToxR en V .mimicus 14 Figura 7. Diagrama general de trabajo 17

Figura 8. - hemólisis en agar sangre 27

Figura 9. Electroferograma del producto amplificado del gen vmhA 27 Figura 10. Confirmación del tamaño del amplificado para el gen vmhA 28 Figura 11. Búsqueda de la VPI1 29

Figura 12 Búsqueda del fago CTX 30

Figura 13. Electroferograma del producto amplificado del gen toxR 31 Figura 14. Producción de Sideróforo tipo hidroxamato en agar CAS 31 Figura 15. Electroferograma del producto amplificado del operón de aerobactina 32 Figura 16. Presencia de cápsula en cepas de V. mimicus por medio de la tinción de Rojo Congo

32

Figura 17. Electroferograma de los productos amplificados para el gen wza 33 Figura 18 Electroferograma del gradiente de temperatura para el gen wza hecho con el ADN de V. mimicus ATCC 33653

33

Figura 19 Análisis BLAST de la secuencia de 500 pb amplificada por V. mimicus. 34 Figura 20 Análisis BLAST de la secuencia de 800 pb amplificada por V. mimicus.

34

Figura 21 Análisis BLAST de la secuencia de 800 pb amplificada por V. cholerae. 35 Figura 22 Análisis BLAST de la secuencia de 500 pb amplificada por V. vulnificus ATCC 29307

35

Figuras 23 Ensayo de citotoxicidad sobre la línea celular CHO 38 Figura 24 Determinación del tiempo adecuado para el ensayo de adherencia 38 Figura 25 Adherencia de V. mimicus a las células HEp-2. 39 Figura 26 Localización de los iniciadores en los genes wza y 16S RNA de V. mimicus y V. cholerae

45

ÍNDICE DE FIGURAS

VII

ABREVIATURAS VPI-1 Isla de patogenicidad de Vibrio 1

CTX Bacteriófago filamentoso que en su genoma tiene los genes para la toxina del cólera

CT Toxina del cólera (por sus siglas en ingles cholera toxin)

TCP Pili co regulado con la toxina (por sus siglas en ingles toxin corregulated pilus)

HEp-2 Células de carcinoma laríngeo humano.

CHO Células epiteliales de ovario de hámster chino

OMS Organización mundial de la salud

FAO Organización de las naciones unidas para la agricultura y alimentación (por sus siglas en

ingles Food and Agriculture Organization of the United Nations)

OPS Organización panamericana de la salud

CAS Cromo Azurol S

ETA Enfermedad transmitida por alimentos

ºC Grado centígrado

pH Potencial de iones H+

UFC Unidad formadora de colonia

Kda Kilodalton

% G-C Proporción de Guanina y Citocina en el DNA

DNA Acido Desoxiribonucléico

Seg segundo

μl microlitro

pb pares de bases

BLAST Herramienta de búsqueda de alineamiento básico local (por sus siglas en ingles Basic

Local Alignment Search Tool)

NCBI Centro nacional de información biotecnológica (por sus siglas en ingles National Center

of Biotechnology Information)

dNTP`s Desoxinucleótidos fosfato

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislados de agua y alimentos

II

RESUMEN

Vibrio mimicus es una bacteria de hábitat acuático que se ha aislado de costas, estuarios, ríos, lagos y lagunas de agua dulce y salada de las zonas templadas o cálidas. Se encuentra formando parte de la microbiota del zooplancton, en crustáceos y moluscos que se alimentan por filtración. Los alimentos involucrados en su transmisión al humano son ostras, huevos de tortuga, camarón y pescado, que se consumen crudos o poco cocidos, causando casos de gastroenteritis y diarreas severas tipo cólera. Dentro del género Vibrio, V. mimicus y V. cholerae son las especies que están filogenéticamente más relacionadas, compartiendo múltiples características fenotípicas y genotípicas. En la actualidad se desconoce el mecanismo de patogenicidad de V. mimicus, sin embargo, se han descrito algunos factores asociados a la virulencia, como hemolisinas, hemaglutininas, proteasas, sideróforos, enterotoxinas y la presencia de la VPI1 y

del fago CTX , necesarios para causar un cuadro similar al cólera. Por ello, en el presente trabajo se consideró de interés estudiar la presencia de algunos factores potencialmente involucrados en la virulencia de V. mimicus en cepas ambientales aisladas de agua, pescados y ostiones capturados en las costas del Golfo de México,. Se trabajó con 20 cepas de V. mimicus aisladas de la laguna de Pueblo Viejo Veracruz: 6 provenientes de agua, 5 de pescado y 9 de ostión. Se utilizaron eritrocitos de carnero y conejo para determinar la actividad hemolítica, el medio CAS para la detección de sideróforos y la tinción con rojo congo para la observación de la presencia de cápsula. Se hizo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se analizó la

presencia de los genes para la hemolisina (vmhA), fago CTX (ctxA y zot), VPI1 (tcpA y tox), parte del operón de aerobactina (iutA ,Inc. iucD), cápsula (wza) y un gen regulador, (toxR). Se observó, asimismo, la capacidad citotóxica sobre la línea celular CHO y la adherencia sobre

células HEp-2. El 100% de las cepas estudiadas resultaron ser -hemólíticas y poseen el gen de la hemolisina vmhA, confirmando su identidad como V. mimicus, no encontrándose en ellas el

fago CTX ni la VPI-1.Todas las cepas tienen el gen toxR. El 40% de las cepas producen sideróforos de tipo hidroxamato en medio CAS y todas amplificaron los genes del operón de aerobactina. Por vez primera se describió en V. mimicus la presencia de cápsula en las cepas, corroborándose al amplificar el gen homólogo al wza. El 75% de las cepas presentaron efecto citopático a las 3 horas de exposición al filtrado, observándose destrucción de la monocapa a las 6 horas de exposición al sobrenadante filtrado. Los filtrados mostraron títulos desde 1:3 hasta 1:81. Se encontró que todas las cepas presentaron adherencia a la línea celular HEp-2, con un patrón de tipo agregativo. En el presente estudio se demostró que las cepas de V. mimicus aisladas de alimentos poseen la capacidad de producir factores asociados a la virulencia. En México no existen estudios sobre aislados de V. mimicus que provengan de productos de la pesca, por lo que nuestros datos son una contribución para describir el modelo de patogénesis de este microorganismo.


III

ABSTRACT

Vibrio mimicus is a bacterium inhabiting aquatic environments; it has been isolated from fresh and salt water shores, estuaries, rivers, lakes, and lagoons in temperate and warm climates, It is found as part of the microbiota of zooplankton, in crustacea and molluscs that feed through filtration. Its transmission to humans occurs through food, like oyters, turttle eggs, shrimp, and fish that are consumed raw or barely cooked, causing gastroenteritis and severe cholera-type diarrhea. Among the Vibrio genus, V. mimicus and V. cholerae are the most phylogenetically related species, sharing multiple phenotypic and genotypic characteristics. The pathogenicity mechanism of V. mimicus is still unknown; however, some factors associated to virulence have been described, such as hemolysins, hemagglutinins, proteases, siderophores, enterotoxins, and

the presence of VPI1 and of the CTX phage, which are necessary to cause similar symptoms to those of cholera. Based on this, the present work was aimed at studying the presence of some factors involved in the virulence of V. mimicus in environmental strains isolated from water, fish, and oysters in the coast line of the Gulf of Mexico. We worked with 20 V. mimicus strains isolated from the Pueblo Viejo lagoon in the state of Veracruz, Mexico; six isolates from water, five from fish, and nine from oysters. We used sheep and rabbit erythrocytes to determine hemolytic activity, CAS medium to detect siderophores, and Congo red staining to determine the presence of the capsule. In addition, we used polymerase chain reaction (PCR) to analyze the presence of

genes encoding for hemolysin (vmhA), phage CTX (ctxA and zot), VPI1 (tcpA and tox), part of the aerobactin operon (iutA ,Inc. iucD), capsule (wza), and of a regulator gene (toxR). Likewise, we observed the cytotoxic capacity on the CHO cell line and the adherence on Hep-2 cells. Hundred percent of the studied strains were -hemolytic and possessed the hemolysin vmhA

gene, confirming their identity as V. mimicus, neither phage CTX nor VPI-1 were found. All strains had the gene toxR. Forty percent of the strains produced hydroxamate-type siderophores in the CAS medium, and all amplified the aerobactin operon gene. The presence of a capsule in V. mimicus is described for the first time, and was confirmed by amplifying the homologous gene to wza. Seventy-five percent of the strains presented a cytopathic effect at 3 hours of exposition to the filtrate, observing destruction of the monolayer at 6 hours of exposure to the filtered supernatant. Filtrates showed titers from 1:3 to 1:81. All strains presented adherence to the HEP-2 cell line, with an aggregating pattern. It was also demonstrated that the V. mimicus strains isolated from food possess the capacity to produce factors associated to virulence. In Mexico, there are no studies on V. mimicus isolates originating from fish products; therefore, these data are an important contribution to characterize the pathogenesis of this microorganism.


Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos

1

I INTRODUCCIÓN

I.1 ANTECEDENTES

Los problemas de inocuidad de los alimentos son considerados en la actualidad como un

problema de salud pública. Los gobiernos del mundo están intensificando esfuerzos para

aumentar la seguridad alimentaria, ya que según datos de la OMS en el año 2005 murieron en el

mundo alrededor de 1.8 millones de personas debido a enfermedades diarreicas transmitidas por

alimentos y agua. Se estima que las pérdidas económicas que generan los alimentos

contaminados por algún patógeno ascienden a 35,000 millones de dólares USA al año tan sólo

en los EUA (OMS, 2007). Un factor que agrava estos problemas es la apertura del comercio

internacional de alimentos, lo que favorece la propagación de microorganismos en poco tiempo,

en forma adicional a la mayor movilización de personas y productos (Bertullo y Pollak, 2001).

Los productos del mar, como peces, moluscos y crustáceos, entre otros, son de gran importancia

para el ser humano, tanto como fuente de alimento (en el 2002 hubo una producción mundial

cercana a las 96,029,000 toneladas), como por razones económicas (ganancias en el 2002 por

valor de 548,933,000 dólares USA) (SAGARPA, 2003). En países como China y Japón, que son

los mayores consumidores a nivel mundial (SAGARPA, 2003), este tipo de alimentos son

fundamentales en su dieta. Existen factores que condicionan esta situación, destacando los

sociales (condiciones de vida, distribución de la población), los económicos (distribución de la

riqueza social, acceso a este tipo de productos) y los culturales (cualidades de los alimentos,

preferencia por ciertos sabores) (Barradas et al., 1993). En nuestro país, los productos de la

pesca no forman parte de la dieta básica de la población, excepto en las zonas costeras. Aún

así, su consumo ascendió a 922,000 toneladas en 2002 y supusieron ganancias por un valor de

777,000 dólares, USA (SAGARPA, 2003). Es importante señalar que México es exportador de

este tipo de mercancías.

La explotación, conservación y consumo adecuados de los productos de la pesca son de vital

importancia para evitar la transmisión de enfermedades, como las infecciones (salmonelosis,

disentería y cólera, por ejemplo) e intoxicaciones (botulismo y marea roja, por ejemplo)

(González, 1983). En la actualidad, los riesgos asociados al consumo de alimentos marinos se

han visto en aumento en países desarrollados y en vías de desarrollo, a pesar de los avances en

los procesos tecnológicos (Tantillo et al., 2004).


2

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA`s) son especialmente importantes por sus

altas tasas de morbilidad y mortalidad entre los grupos más vulnerables de la población, y

porque representan una proporción muy alta del costo de la atención médica y de las

hospitalizaciones (OPS, 1991). En nuestro país han ocurrido varios brotes de ETA`s

relacionados con productos de la pesca, que corresponden al 2.8% del total de ETA`s (Barradas

et al., 1993). Oficialmente, no se han reportado casos de cólera desde 2001 (DGE, 2008).

Los géneros bacterianos más importantes que se encuentran en los productos de la pesca son:

Pseudomonas spp., Alteromonas spp., Vibrio spp., Moraxella spp., Klebsiella spp., Acinetobacter

spp., Flavobacterium spp., Micrococcus spp., Bacillus spp., Salmonella spp., Corynebacterium

spp., Escherichia spp. y Clostridium spp., entre otras (González, 1983; Quiñones et al., 2000).

Las bacterias del género Vibrio son las más abundantes de este grupo y la mayoría de estas

bacterias son fácilmente cultivables en los laboratorios, siendo algunas especies patógenos para

los humanos y organismos marinos vertebrados e invertebrados (Okada et al., 2005; Zhang y

Austin 2005).

Las especies del género Vibrio que están principalmente relacionadas con enfermedades en

humanos, y cuya transmisión se da generalmente por agua y alimentos, son Vibrio cholerae

(agente causal del cólera), Vibrio parahaemolyticus (que causa gastroenteritis, infección de

heridas y septicemia), Vibrio vulnificus (causante de infección necrosante severa en heridas y

septicemia invasiva fulminante) y Vibrio mimicus (causa gastroenteritis) (Vora et al., 2005).

I. 2 HISTORIA

Desde 1854, con los trabajos de Pacini y en 1883 con los de Koch se inició el estudio del género

Vibrio. La primera especie del género que se describió fue V. cholerae, el agente etiológico del

cólera. El serotipo O1 ha causado 7 pandemias y actualmente se predice que la octava será

debida al serotipo O139 (Faruque y Albert, 1998; Janda y Powers, 1998; Thompson y Lida,

2004).

Las cepas de V. cholerae con características bioquímicas atípicas se designaban antiguamente

como V. cholerae lisina descarboxilasa negativo o V. cholerae sacarosa negativo, entre otras. En

1981, Davis y colaboradores estudiaron cepas representativas de estos biogrupos, utilizando

técnicas de hibridación de DNA entre cepas de V. cholerae típicas y atípicas y realizando análisis

fenotípicos extensos, lo que les llevó a concluir que la mayoría de las cepas atípicas

correspondían a V. cholerae, pero que el biogrupo sacarosa negativo formaba un grupo definido


3

y aparte, por lo que se propuso una nueva especie denominada V. mimicus. El nombre de esta

bacteria hace alusión a que “imita” o es muy “semejante” a V. cholerae (Davis et al., 1981).

I. 3 CARACTERÍSTICAS DEL MICROORGANISMO

V. mimicus y V. cholerae comparten múltiples características fenotípicas y genotípicas, como son

habitar en agua dulce, aglutinar con un mismo anticuerpo monoclonal dirigido contra el flagelo

(Simonson y Siebeling, 1988), tener dos cromosomas (Okada et al., 2005), e incluso tener

capacidad de transferirse información genética entre ellos (Boyd et al., 2000a). En estudios

recientes, se ha comprobado que estas dos especies son las más relacionadas entre sí dentro

del género, desde el punto de vista filogenético (Thompson y Lida, 2004), formando un grupo

separado de las demás especies del género.

En cuanto a su taxonomía, a este microorganismo se le ubica según el Manual Bergey´s 2ª

edición de la siguiente forma:

DOMINIO: Bacteria

PHYLUM : Proteobacteria

SECCION: Gammaproteobacteria

CLASE: Zymobacteria

ORDEN : Vibrionales

FAMILIA : Vibrionaceae

GENERO : Vibrio

ESPECIE: mimicus

Vibrio mimicus es un bacilo curvo Gram negativo, aunque bajo condiciones de estrés puede ser

pleomórfico (Janda et al., 1988); es catalasa y oxidasa positivo y móvil por un flagelo polar. Es un

microorganismo halotolerante, crece en intervalos de cloruro de sodio de 0 a 3%, y en presencia

de iones Na+ se estimula su crecimiento (Wong y Chen, 1994).

Su temperatura óptima de crecimiento es de 37°C siendo su máxima de 45°C. Es capaz de

sobrevivir a la congelación (hasta -30°C), y se ha aislado de alimentos congelados (Wong y

Chen, 1992). También se ha descrito su capacidad para crecer a temperaturas de refrigeración,

desde 4 hasta 10°C (Wong y Chen, 1994). El intervalo de pH en el cual se desarrolla es de 5 a

11.


4

I.4 HÁBITAT Y DISTRIBUCIÓN

Vibrio mimicus es de hábitat acuático; se ha aislado de costas, estuarios, ríos, lagos y lagunas

de agua dulce y salada, de las zonas templadas o cálidas. Las poblaciones de este

microorganismo no se mantienen constantes a lo largo de todo el año, debido a que factores

ambientales como el pH, la salinidad y la temperatura afectan a su desarrollo. Se ha reportado

que en verano aumenta la concentración de estos microorganismos, debido a que el calor

promueve su proliferación; en cambio, las poblaciones disminuyen en invierno (cuando

disminuye la temperatura de la columna de agua) (Chowdhury y Yamanaca, 1989; Vieira et al.,

2001). Se ha observado que bajo condiciones no favorables estas bacterias pasan a un estado

de disminución de la actividad respiratoria llamado “viable no cultivable”, y por ello no pueden ser

detectados con métodos convencionales (Okada et al., 2005).

Cuadro 1. Lugares en donde se ha reportado la presencia de V. mimicus

PAIS REFERENCIA

ASIA

Japón Chowdhury y Yamanaca, 1989; Alam et al., 1996; Miyoshi et al., 1997; Shinoda y Nakagawa, 2004

Taiwán Wong y Chen., 1993

China Chowdhury y Yamanaca, 1989

India Davis et al., 1981; Chowdhury y Yamanaca, 1989; Albert et al., 1992

OCEANÍA

Nueva Zelanda Davis et al., 1981

Filipinas Davis et al., 1981

Australia Wong et al., 1995; Payne et al., 2004

ÁFRICA

Egipto Davis et al., 1981

Senegal Schandevyl et al., 1984

EUROPA

España Pérez et al., 2001

Francia Hervio-Heath et al., 2002

Italia Baffone et al., 2001

Rumania Janda y Powers., 1988

AMÉRICA

Perú Cabezas et al., 2005

Brasil Vieira et al., 2001

Cuba Leyva et al., 1996

Ecuador Vandenberghe et al., 1999

Costa Rica Acuña et al., 1999; Campos et al., 1996

México Davis et al., 1981; Vandenberghe et al., 1999

Estados Unidos Davis et al., 1981; Marano et al., 2000

Canadá Davis et al., 1981


5

I.5 EPIDEMIOLOGÍA

V. mimicus es reconocido como un patógeno emergente humano, aunque también tiene

importancia a nivel económico porque es patógeno también para crustáceos y algunos peces de

importancia económica (Shandera et al., 1983; Wong et al., 1995; Miyoshi et al., 1997;

Vandenberghe et al., 1999).

A partir de que en 1981 se identificó identificara V. mimicus como una especie distinta a V.

cholerae, comenzaron los reportes sobre la posible patogenicidad de la misma. Uno de los

primeros reportes es de Bangladesh, en 1981, en el cual V. mimicus se vio involucrado en dos

casos de otitis, uno en una persona de 39 años y el otro en un niño, ambos causados por la

exposición al agua de mar. En otro reporte se presentaron 17 casos de gastroenteritis en adultos

que habían consumido ostiones crudos, así, como infección en heridas expuestas al agua de

mar (Davis et al., 1981).

Con el paso del tiempo, se han reportado más casos en otras partes del mundo. En 1991, por

ejemplo, durante la epidemia de cólera en América Latina (la séptima pandemia), se describieron

casos de diarrea aguda debidos a la presencia de V. mimicus en Costa Rica (Campos et al.,

1996) Albert y col. (1992) informaron de casos de diarrea severa y de un caso de bacteriemia en

un niño, causado por V. mimicus. En la parte norte de Brasil se reportaron casos de diarrea tipo

cólera, identificando cepas atípicas de V. cholerae sacarosa negativo, que se confirmaron

posteriormente como V. mimicus (Vieira et al., 2001).

El 12 de febrero de 2005, después de una fiesta de carnavales en Cuncashca, (provincia de

Carhuaz, en Perú), se produjo un brote de diarrea aguda que afectó a 32 personas, de las cuales

31 eran mayores de 5 años y sólo un menor de 5 años. En todos ellos se determinó a V. mimicus

como el agente causal (Cabezas et al., 2005). En México hay reportes de su presencia (Davis et

al., 1981), sin embargo no se tienen datos de algún caso clínico, probablemente debido a que

este microorganismo no se busca rutinariamente.

I.6 PATOGENESIS

V. mimicus es capaz de causar varios cuadros clínicos, como son gastroenteritis, otitis, infección

de heridas, diarrea tipo cólera, disentería y, en muy raras ocasiones, septicemia. La dosis

infectiva aún se desconoce, pero se ha considerado que puede ser similar a la de Vibrio cholerae

(104 a 109 UFC), debido a la estrecha relación entre ambos (Reidl y Klose, 2002).


6

El periodo de incubación puede variar de persona a persona, desde unas cuantas horas después

de ingerir el alimento hasta tres a cuatro días, dependiendo del inóculo con el que se haya tenido

contacto y del estado inmune de la persona.

I.7 FACTORES DE VIRULENCIA

En la actualidad se desconoce el mecanismo de patogenicidad de Vibrio mimicus, sin embargo,

se han descrito algunos factores de virulencia, como hemolisinas, hemaglutininas, proteasas,

sideróforos y enterotoxinas (Chowdhury y Yamanaca, 1991; Bi et al., 2001; Moon et al., 2004;

Shinoda y Nakagawa, 2004).

I.7.1 HEMOLISINAS

El factor de virulencia más estudiado de este microorganismo es una hemolisina, conocida como

VMH (hemolisina de Vibrio mimicus). Esta hemolisina es una proteína termolábil, de

aproximadamente 66 kDa, que en su forma activa tiene un 81.6% de identidad con la HlyA de V.

cholerae. La VMH se considera especie específica, y se encuentra presente en las cepas

ambientales y en las aisladas a partir de casos clínicos (Shinoda y Nakagawa, 2004). Wei y

colaboradores en 2008 demuestran que la amplificación de este gen correlaciona con otras

técnicas con fines de identificación, como perfiles de ácidos grasos y la comparación de

secuencias de los genes 16S DNAr, oriC, pyrH, recA y rpoA.

La VMH es capaz de formar poros de 2.8 a 3.5 nm de diámetro sobre la superficie de las células

del huésped. También induce la producción de AMP en los enterocitos y activa un canal de iones

de Cl- (CFTR), lo que provoca el desbalance de electrolitos y genera diarrea (Bi et al., 2001; Li et

al., 2005).

Se ha descrito otra hemolisina, ésta termoestable, denominada Vm-TDH (hemolisina directa

termoestable de Vibrio mimicus). Esta segunda termolisina es un dímero, con subunidades de 21

KDa, y está relacionada con la TDH de V. parahaemolyticus. La Vm-TDH le da la capacidad al

microorganismo de producir diarrea tipo disentería. V. mimicus adquiere este gen por

transferencia horizontal de DNA, ya que el gen de la TDH se encuentra en un transposón (Terai

et al., 1991). A diferencia de la VMH que se encuentra en todos los aislados de esta bacteria,

ésta hemolisina se encuentra distribuida en el 10% de las cepas de origen clínico y se reporta su

presencia en el 1% de las cepas ambientales (Shinoda y Nakagawa, 2004).


7

En 2000 se reportó la presencia de una tercera hemolisina, la HLX de aproximadamente 11 KDa,

en V. cholerae O1 y V. mimicus. Su contribución a la virulencia de la bacteria, sin embargo, se

desconoce (Shi et al., 2000; Zhang y Austin, 2005)

Se ha descrito también que la lecitinasa A PHL de V. mimicus tiene un efecto citotoxico sobre la

línea celular CHSE-214 (Lee et al., 2002). Su actividad es similar a la VHH de V. harvey y a la

TLH de V. parahaemolyticus (Zhang y Austin, 2005).

I.7.2 PROTEASAS

Se ha descrito en V. mimicus la presencia de diversos tipos de proteasas. Una de ellas, con

actividad de hemaglutinina (Vm-HA/proteasa) (Alam et al., 1997) y la denominada VMP (proteasa

de Vibrio mimicus), es capaz de cambiar la permeabilidad en los vasos sanguíneos, generar

edema y causar la acumulación de fluido en asa ligada de conejo. Requiere iones de Ca++ para

su actividad y se sugiere que puede ser un factor importante para la patogenicidad (Chowdhury

et al., 1991).

En 2005 se describió la VMC (colagenasa de V. mimicus), proteasa con actividad de colagenasa,

que se une al colágeno por su extremo carboxilo y se considera que está relacionada con

infecciones extraintestinales y con patogenicidad en peces (Lee et al., 2005).

I.7.3 FACTORES DE ADHERENCIA

Se sugiere que los microorganismos patógenos deben ser capaces de adherirse y colonizar

superficies bióticas y abióticas para poder sobrevivir en diversos ambientes (Kirn et al., 2005).

Para muchas bacterias enteropatógenas, la capacidad de adherirse a la mucosa intestinal es el

primer paso en la colonización y un prerrequisito para causar diarrea. Esta interacción está

mediada por macromoléculas llamadas colectivamente adhesinas (Bag et al., 2008).

En Vibrio mimicus se han caracterizado 3 hemaglutininas (un tipo de adhesina), que están

relacionadas con la adherencia a la mucosa intestinal: el lipopolisacárido (Vm-LPSHA), una

proteína de membrana externa termoestable (Vm-OMPHA) de 39 KDa y una proteasa (Vm-

HA/proteasa). Estas moléculas interaccionan eficientemente con las glicoproteínas de la

superficie de los enterocitos (Alam et al., 1997).

La Vm-HA/proteasa tiene un doble papel: ayuda a la unión de la bacteria con la célula del

huésped y tiene como sustrato a la Vm-OMPHA. Tras una proteólisis limitada la capacidad de la

bacteria para adherirse a las células aumenta en gran medida. Se especula con que la

interacción de la bacteria con las células blanco es multifactorial, lo que indica que otras


8

moléculas o estructuras (como pueden ser el flagelo, o algún tipo de fimbria) pueden estar

involucrados en el proceso de adhesión (Alam et al., 2006).

I.7.4 MECANISMOS DE ADQUISICIÓN DE HIERRO

Se ha descrito que para algunos integrantes del género Vibrio el hierro es un factor determinante

en la virulencia. Por ello, los microorganismos requieren de mecanismos de captación de hierro

eficientes. Los sideróforos son moléculas de bajo peso molecular que tienen una alta afinidad por

el hierro y pueden extraerlo de complejos minerales o de proteínas acarreadoras, como la

lactoferrina y la ferritina (Litwin y Calderwood, 1993). En el género Vibrio se producen por lo

general sideróforos de tipo catecolato, como la vibriobactina (Figura. 1). Sin embargo, en V.

mimicus se ha descrito la presencia del sideróforo aerobactina (Okujo y Yamamoto, 1994)

(Figura. 1) como sideróforo principal, que está más relacionado con las enterobacterias (Moon et

al., 2004). La estructura química de la aerobactina es de tipo hidroxamato y se ha considerado

como un factor importante (y en algunos casos fundamental) para la virulencia de Shigella

flexneri, S. boydii, Klebsiella pneumonie, algunos serotipos de Salmonella spp, y varias cepas

invasivas de Escherichia coli. (Schmidt y Hensel, 2004).

A

Figura 1 Estructura química de los Sideróforos producidos por algunas bacterias del género Vibrio. A . Sideróforo

producido por V. mimicus. B. Sideróforo producido por V. cholerae.

Moon y colaboradores en 2004 demostraron que en V. mimicus los genes para la síntesis y

funcionamiento de la aerobactina son cromosomales, ya que no existe evidencia que indique que

provengan de algún tipo de transferencia horizontal (al no haber secuencias de inserción, o

integrasas, flanqueando el operón de aerobactina). Además, los genes necesarios para el

transporte del sideróforo se encuentran organizados en otro operón,, contiguo al de la

aerobactina. Esta organización es única, ya que en las enterobacterias estos genes se

A B


9

encuentran en elementos móviles como plásmidos, islas de patogenicidad, transposones o

fagos.

Figura 2 Organización del cluster de aerobactina en V. mimicus

Fuente: Modificado de Moon et al., 2004

Se encontró además que V. mimicus tiene un segundo mecanismo para la captación de hierro: el

complejo ferricromo. Para ello dispone de otro juego de genes homólogos, exclusivo para el

transporte de este complejo, al igual que ocurre en Vibrio cholerae (Moon et al., 2004)

I.7.5 ENTEROTOXINAS

V. mimicus es capaz de producir una enterotoxina termoestable (Vm-ST) y una enterotoxina

termolábil (Vm-LT), las cuales están relacionadas con la gastroenteritis, y una toxina tipo cólera

(CT), semejante en estructura a la producida por Vibrio cholerae (Spira y Fedorka-Cray, 1984;

Shi et al., 2000) y que es la causante del cuadro clínico de cólera.

I.7.6 ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVILES

En 1984 Spira y Fedorka-Cray encontraron que algunas cepas de V. mimicus producían una

toxina fisicoquímica, biológica, funcional e inmunológicamente indistinguible de la CT sintetizada

por V. cholerae, por lo que se sospechaba que probablemente era la misma toxina. Años

después, Acuña y colaboradores en 1999 informaron de la presencia de cepas de V. mimicus

con capacidad toxigénica e involucradas en casos de diarrea tipo cólera, encontrando los genes

de la toxina colérica en el genoma de éstas. Casi al mismo tiempo, se demostró que las cepas

toxigénicas de V. mimicus (al igual que las de V. cholerae) requieren de dos elementos genéticos

para ser toxigénicas: un bacteriófago filamentoso llamado CTX y la isla de patogenicidad de

Vibrio 1 (VPI1) (Faruque et al., 1999; Boyd et al., 2000a). En los últimos años se han

caracterizado cepas de V. mimicus que tienen la VPI 1 y el fago CTX integrados en su genoma

(Islam et al., 2005). Se han descrito también cepas que tienen el elemento CTX integrado en

su genoma, y que son capaces de expresarlo, pero no contienen el elemento VPI. Esto indica

TRANSPORTE BIOSÍNTESIS RECEPTOR


10

que existen otros mecanismos para adquirir el CTX así como para su regulación (Lazar y

Waldor, 1998).

I.7.6.1 ISLA DE PATOGENICIDAD DE Vibrio 1 (VPI-1)

La VPI1 tiene un tamaño aproximadamente de 40 kb, un %G-C distinto al de V. cholerae y se

inserta cerca del gen ssrA (que es muy similar a un gen de RNAt) por medio de secuencias att

(Schinidt y Hensel, 2004). Tiene muchos marcos de lectura abierta (ORFs) con similitud con

bacteriófagos, por lo que Karaolis en 1999 propuso que en realidad la isla se trata de un

bacteriófago (al que llamó VPI , aunque este tema sigue siendo de gran controversia ya que la

forma en que se transmite horizontalmente la VPI es desconocida. Dentro de este elemento se

encuentra un grupo de genes necesarios para la síntesis y regulación del TCP (pili corregulado

con la toxina), un pili de tipo IV que funciona como factor de colonización y como receptor del

fago CTX Karaolis et al.,1999 Este pili es un polímero de la proteína TcpA, la cual podría

ser parte de la cápside del fago VPI . Se sabe que el TCP favorece la colonización del intestino,

por las interacciones bacteria-bacteria durante la formación de la microcolonia (Reidi y Klose

2002). La isla tiene además otros loci que son co-regulados por proteínas codificadas en la isla,

así como algunas otras codificadas en el cromosoma de la bacteria (toxT, por ejemplo, que es un

regulador transmembranal que esta encargado directamente de activar la transcripción de los

genes del pili o los genes ctxAB del fago CTX así como con genes que están relacionados

con la colonización del intestino (Figura. 3) (Karaolis et al., 1999, Schinidt y Hensel, 2004).

.

Figura 3 Organización de la VPI-1

Fuente: Karaolis et al.,1999


11

I.7.6.2 EL BACTERIOFAGO CTX

Se ha demostrado que la generación de cepas toxigénicas de V. cholerae O1 y O139 a partir de

cepas no toxigénicas se debe a la presencia de un bacteriófago filamentoso que contiene en su

genoma los genes de la toxina colérica (Waldor y Mekalanos, 1996; Faruque y Mekalanos,

2003). El fago CTX lleva en su genoma el operón ctxAB, que corresponde a la toxina colérica

responsable de la diarrea severa.

En 2000 se describió que el fago CTX puede infectar tanto a V. cholerae como a V. mimicus

(Boyd et al., 2000a)

El fago tiene un tamaño de aproximadamente 6.9 kb y está organizado en dos dominios

funcionales:

a) la región del núcleo, en donde se encuentran los genes necesarios para la morfogénesis,

como algunas proteínas de cápside (Psh, Cep, OrfU y Ace) y proteínas que ensamblan el virus

(Zot). A algunas de estas proteínas, además de ser fundamentales para el virus, se les ha dado

un papel como enterotoxinas, como es el caso de la toxina accesoria a la colérica y la toxina de

la zónula ocludens (codificadas en los genes ace y zot, respectivamente).

b) la región RS2, que contiene genes para la replicación (rstA), integración (rstB) y regulación

(rstR) del virus y dos regiones intergénicas llamadas ig-1 e ig-2 (Figura. 4) (Boyd et al., 2000b).

Figura 4. Organización del bacteriófago CTX

Fuente: Boyd et al., 2000 B

Los genes ctxAB tienen un contenido de %G-C distinto al resto del fago, lo cual indica que se

adquirieron recientemente durante la evolución del fago. Esto explica, en parte, la presencia de

cepas de V. cholerae y V. mimicus que contienen el gen zot pero son negativas para ctxAB

(Boyd et al., 2000b; Faruque et al., 2001). Este virus se encuentra integrado por lo general en el

genoma de su hospedero, por medio de sitios attRS, aunque también se ha detectado la forma

replicativa, que incluso produce más toxina que cuando el fago está integrado en el cromosoma.

(Boyd et al., 2000b).

NÚCLEO


12

I.7.7 CÁPSULA

Las células bacterianas tienen la capacidad de secretar una gran variedad de moléculas,

incluyendo polisacáridos muy complejos y proteínas. Algunas de estas moléculas son requeridas

para la viabilidad de la célula, mientras que otras son usadas para la interacción con el ambiente.

Los polisacáridos pueden ser secretados por la célula en dos formas: polisacáridos que se

vierten al ambiente próximo a la célula (exopolisacárido para la formación de biopeliculas) y

polisacáridos asociados a la célula (cápsulas y lipopolisacárido) (Drummelsmith y Whitfield,

2000).

Dentro de la familia Vibrionaceae se han encontrado estos dos tipos de polisacáridos, que a la

fecha no han sido descritos para V. mimicus. La cápsula juega un papel critico en las

interacciones entre la bacteria y su ambiente más inmediato. Así, se sabe que en algunos

patógenos de este género (como V. vulnificus, V. parahaemolyticus y V. cholerae O139) la

cápsula es importante para la virulencia (Wright et al., 2001; Nesper et al., 2002; Whitfield, 2006).

La cápsula es una estructura que envuelve la superficie de la bacteria, compuesta por

polisacáridos de alto peso molecular que están firmemente anclados a la superficie celular; está

demostrado que esta estructura es un factor de virulencia, ofreciendo protección contra la

respuesta inmune del hospedero (opsonización, fagocitosis y acción lítica del complemento)

(Whitfield, 2006).

El proceso por el cual V. mimicus se sintetiza y exporta este polisacárido se desconoce; en V.

cholerae y V. vulnificus se ha descrito el locus de biosíntesis de cápsula, que es homólogo al de

las especies de E. coli, del grupo 1, encontrándose altamente conservados tanto en secuencia

como en función (Livanis et al., 2006).

El proceso de síntesis de la cápsula es muy complejo e involucra a varias proteínas. Una de las

más importantes es la lipoproteína Wza, miembro de la familia de proteínas auxiliares de

membrana externa (secretinas), que tiene una estructura octamérica con simetría de tetrámero.

Su forma tridimensional es de “tipo hongo” y en su interior forma un canal de aproximadamente

40 Å de diámetro, por donde transloca el polisacarido capsular hacia la superficie de la bacteria.

Esta proteina es esencial para el ensamble del polisacarido capsular y requiere acoplarse a la

proteína Wzc para su funcionamiento, ya que se sabe que el proceso de biosíntesis está

sincronizado con el de translocación (Figura, 5) (Drummelsmith y Whitfield 2000; Beis et al,.

2004; Whitfield 2006; Collins y Derrick, 2007).


13

Figura 5 Papel de la proteína Wza en la translocación del polisacárido capsular.

Fuente: Collins y Derrick 2007

I.7.8 ToxR

En respuesta a los cambios en el ambiente, los microorganismos responden expresando o

reprimiendo genes dependiendo del estimulo (temperatura, pH, u osmolaridad). En V. mimicus y

V. cholerae se ha descrito que la mayoría de los genes asociados con la virulencia están

regulados por la proteína ToxR, el regulón de esta proteína comprende la expresión aproximada

de 20 genes (Skorupski y Taylor, 1997). ToxR es un activador transcripcional del tipo del sistema

de 2 componentes: la proteína se divide en 3 dominios, uno transmembranal para anclarse a la

membrana de la célula, otro que sirve como sensor de las condiciones del espacio periplásmico

y uno más que es citoplásmico y que tiene la capacidad de unirse al DNA. Se sabe que para su

funcionamiento esta proteína debe ser un dímero, pudiéndose dimerizar con ella misma o con

otros activadores transcripcionales como son ToxS, ToxT o TcpP (Skorupski y Taylor, 1997;

Osorio et al., 2000). Un aspecto interesante de esta proteína (Figura. 6) es que controla la

expresión de genes presentes en elementos móviles, tanto de la VPI-1 (formación del pili TCP)

como del fago CTX ,(se puede unir directamente al promotor de ctxAB).

Peptidoglicana

Membrana

externa

Membrana

interna

Peptidoglicana

Membrana

externa

Membrana

interna


14

Bilis

Citoplasma

Es probable que regule también la expresión de la hemolisina vhmA y de algunas proteínas de

membrana externa que están relacionadas con la resistencia a la bilis, con la modulación de la

adherencia y con la regulación de la movilidad del flagelo. Por ello, se le considera el regulador

maestro de la virulencia (Provenzano et al., 2000).

Figura 6 Procesos que controla la proteína ToxR en V .mimicus

Fuente: Modificado de Skorupski y Taylor 1997


15

JUSTIFICACIÓN

Vibrio mimicus ha sido involucrado en diversas etiologías, principalmente las causadas por

consumo de alimentos, y son pocos los estudios sobre sus factores de patogenicidad. Por ello se

consideró de interés estudiar en cepas ambientales aisladas de agua, pescados y ostiones

capturados en las costas del Golfo de México, la presencia de algunos factores involucrados en

su virulencia.

HIPÓTESIS

Si las cepas de Vibrio mimicus aisladas de alimentos presentan características asociadas con la

virulencia entonces probablemente sean patógenas y pudieran en un momento dado producir un

padecimiento en las personas que consuman los alimentos o estén en contacto con agua

contaminada.


16

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Determinar por medio de pruebas fenotípicas, técnicas de biología molecular y biología celular la

presencia de factores de virulencia en cepas de Vibrio mimicus

OBJETIVOS PARTICULARES

1. Determinar por medio de pruebas fenotípicas y genotípicas la presencia de una

hemolisina.

2. Evidenciar mediante la técnica de PCR la presencia de algunos marcadores y elementos

genéticos móviles relacionados con la virulencia.

3. Estimar si V. mimicus es capaz de sintetizar sideróforos.

4. Observar si V. mimicus presenta cápsula.

5. Llevar a cabo ensayos de citotoxicidad en la línea celular CHO.

6. Evaluar si las cepas de V. mimicus tienen capacidad adherente en la línea celular HEp-2


17

Figura 7. Diagrama general de trabajo

BBiioollooggííaa cceelluullaarr

AAddhheerreenncciiaa

eenn HHEEpp--22 EEffeeccttoo

cciittoottóóxxiiccoo

eenn CCHHOO

BBiioollooggííaa mmoolleeccuullaarr

OObbtteenncciióónn ddee

DDNNAA

BBúússqquueeddaa YY ddiisseeññoo

ddee iinniicciiaaddoorreess

EEnn llaa lliitteerraattuurraa

AAmmpplliiffiiccaacciióónn ppoorr PPCCRR

Pruebas fenotípicas

CCeeppaass ddee VV.. mmiimmiiccuuss

DDIIAAGGRRAAMMAA GGEENNEERRAALL

DDEE TTRRAABBAAJJOO


18

II METODOLOGÍA

Se trabajó con 20 cepas de Vibrio mimicus aisladas de la laguna de Pueblo Viejo, Veracruz: 6 de muestras de agua, 5 de pescado y 9 de ostión.

Cuadro 2. Cepas testigo usadas en este trabajo

Cepa Características

Vibrio mimicus ATCC 33653 vmhA+, iutA+,vm toxR+,CTX -,VPI1-.

Vibrio vulnificus ATCC 29307 vvhA+, vvtoxR+, pilA+, viuB+,wza+

Vibrio cholerae O1 Ogawa CLBM-ENCB hly+, vctoxR+, CTX +,VPI1+.

Vibrio cholerae O1 Inaba CLBM-ENCB hly+, vctoxR+, CTX +,VPI1+.

Vibrio cholerae No O1-noO139 CECT 557 hly+, vctoxR+, CTX -,VPI1+.

Escherichia coli ATCC 25922 No adherente

CLBM-ENCB = Colección del Laboratorio de Bacteriología Médica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.

II.1 Obtención de DNA genómico

Las cepas se sembraron en caldo Luria Bertani y se incubaron a 37°C durante 24 horas. Para

obtener el DNA se empleó el sistema Wizard® Genomic DNA Purification, de la casa

comercial PROMEGA, usando el protocolo indicado por el proveedor.

II.2 Amplificación de los genes vmhA, ctxA, zot, tcpA, toxT, toxR, iuT y wza mediante la

técnica de PCR.

Se preparó la mezcla de reacción con: 34.95 l de agua destilada estéril, 5 l de regulador 10×

(200 mM Tris-HCl pH 8.4 y 500 mM KCl), 2.5 l de MgCl2 50mM, 0.25 l de la mezcla de dNTP

(10 mM), 2.5 l de cada iniciador (1 nM), 0.3 l de Taq polimerasa (5 U/ l) y 2 l de la solución

que contiene el DNA (aproximadamente 100 ng). Eel volumen total de la mezcla de reacción fue

de 50 l. Las reacciones se hicieron en un termociclador Hybaid® Omn-E. Las condiciones de

los ciclos tiempos y temperaturas utilizados para cada gen serán descritos posteriormente.

Posteriormente se prepararon geles de agarosa al 1.5% (p/v) para los genes vmhA, ctxA, tcpA,

toxT y toxR y al 1% (p/v) para los genes zot, uitA y wza, Se mezclaron 4 l del producto de PCR

con 1.5 l del regulador de carga [azul de bromofenol (0.25%), sacarosa (40%) y xileno cianol

(0.25%)] y 9 l de agua. Las electroforesis se desarrollaron utilizando regulador Tris-Acido


19

acético glacial-EDTA (TAE),. mediante la aplicación de 121 V durante una hora. Como

referencia, se empleó un marcador de talla molecular de 100 pb (Invitrogen®).

La tinción de los geles se hizo con una solución de bromuro de etidio a una concentración final

de 0.5 g/ml. Los geles se observaron en un transiluminador Gel Doc 2000 (Bio Rad®) que

emite luz a una longitud de onda de 302 nm y permitió obtener la imagen digital en el software

Quality One (BioRad®).

II.3 Purificación de productos de PCR a partir de geles de agarosa

Para la purificación previa al análisis de secuencia para verificar la identidad de las bandas

amplificadas para el gen wza se usó el sistema QIAquick PCR Purification Kit, de la casa

comercial QIAgen®.

II.4 Análisis bioinformático

Se hizo con el paquete DNASTAR® versión 7.1 de Lasergene, el programa Seaview 4.32 y

usando las aplicaciones GenBank y la herramienta BLAST del sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

II.5 Presencia de hemolisina

II.5.1 Prueba fenotípica (García y Landgraf, 1998)

Como testigo positivo se usó la cepa V. mimicus ATCC 33653

1. Se cultivó cada una de las cepas en caldo TSC de 18-24 horas a 37°C

2. Se sembraron en agar sangre con eritrocitos de carnero y de conejo

3. Se incubaron durante 24 horas a 37°C

4. Se observó el halo de hemólisis, parcial o total

II.5.2 Prueba genotípica

Como testigo positivo se usó la cepa V. mimicus ATCC 33653, y como testigo negativo las cepas

V. cholerae O1 serotipo Ogawa y V. cholerae O1 serotipo Inaba (de la colección del Laboratorio

de Bacteriología Medica de la ENCB).

Se hizo una revisión bibliográfica y se utilizaron los iniciadores descritos por Shi et al., 2000.


20

Cuadro 3. Condiciones de amplificación para vmhA

Secuencia blanco Iniciadores Referencia

vmhA F- 5´GGTAGYCATCAGTCTCATCACG -3´

R-5´TCRTSTCCCAATACTTCACCG-3´

Modificados de

Shi, et al., 2000

Desnaturalización inicial 94°C/ 60 seg

Desnaturalización

Alineamiento

Extensión

94°C/ 45 seg

58.5°C/ 45 seg

72°C/ 45 seg

Número de ciclos 30

Tamaño del fragmento 389 pb

II.6 Amplificación de los genes del fago CTX

Se hizo la revisión bibliográfica correspondiente, eligiéndose los marcadores ctxA y zot que se

encuentran el bacteriófago. Como testigos positivos se usaron las cepas V. cholerae O1 serotipo

Ogawa y V. cholerae O1 serotipo Inaba, que se sabe que tienen el bacteriófago integrado en su

genoma, y como testigo negativos las cepas V. mimicus ATCC 33653 y V. cholerae No O1 CECT

557.

Cuadro 4. Condiciones de amplificación para los genes del fago CTX


ctxA F- 5´ CTCAGACGGGATTTGTTAGGCACG-3´

R-5´TCTATCTCTGTAGCCCCTATTACG -3´

Shinoda y Nakagawa, 2004

zot F- 5´ TCGCTTAACGATGGCGCGT-3´

R-5ÁACCCCGTTTCACTTCTACC -3´

Singh, et al., 2002

ctxA zot

Desnaturalización inicial 94°C/ 4 min 94°C/ 3 min

Desnaturalización

Alineamiento

Extensión

94°C/ 60 seg

55°C/ 30 seg

72°C/ 30 seg

94°C/ 60 seg

60°C/ 45 seg

72°C/ 45 seg

Número de ciclos 30 32

Tamaño del fragmento 301 pb 947 pb


21

II.7 Amplificación de los genes de la VPI1

Se hizo la revisión bibliográfica correspondiente, basada en los genes tcpA y toxT, genes que se

encuentran en la VPI1. Como testigo positivo se usaron las cepas V. cholerae O1 serotipo

Ogawa, V. cholerae O1 serotipo Inaba y V. cholerae No O1 CECT 557 que se sabe tienen la

VPI1 en su genoma. Como testigo negativo se utilizó la cepa V. mimicus ATCC 33653.

Cuadro 5. Condiciones de amplificación para los genes de la VPI1

II.8 Amplificación del gen toxR

Para amplificar este gen se buscaron los iniciadores que están descritos para V. mimicus. Como

testigo positivo se usó la cepa V. mimicus ATCC 33653 y como testigo negativo las cepas V.

cholerae O1 serotipo Ogawa, V. cholerae O1 serotipo Inaba y V. vulnificus ATCC 29307.


tcpA F- 5´ GAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACAC-3´

R-5´GAAAGGACCTTCTTTCACGTTG -3´

Islam et al,. 2005

toxT F- 5´ TTGCTTGGTTAGTTATCAGAT-3´

R-5´TTGCAAACCCAGACTGATAT -3´


tcpA toxT

Desnaturalización inicial 94°C/ 5 min 94°C/ 5 min

Desnaturalización

Alineamiento

Extensión

94°C/ 45 seg

57.5°C/ 40 seg

72°C/ 40 seg

94°C/ 45 seg

51.5°C/ 45 seg

72°C/ 45 seg

Número de ciclos 30 30

Tamaño del fragmento 472 pb 581 pb


22

Cuadro 6. Condiciones de amplificación para toxR


toxR F- 5ÁCAACAGCGACTCCTCAGAA -3´

R-5ÁCACACAGTTCTATCGAGGG -3´


Desnaturalización inicial 94°C/ 5 min

Desnaturalización

Alineamiento

Extensión

94°C/ 45 seg

51.5°C/ 45 seg

72°C/ 45 seg



II.9 Presencia de sideróforos

II.9.1 Prueba fenotípica

El agar CAS (Schwyn y Neilands, 1987) está diseñado para inducir la producción de sideróforos,

porque el medio no contiene hierro disponible para los microorganismos. Todos los ingredientes

y materiales fueron desferrados por métodos químicos. La única fuente de hierro del medio está

asociada al colorante Cromo-Azurol S; por ello, si el microorganismo produce sideróforos éstos

captarán el hierro del colorante y se producirá un viraje en el color de medio.

Como testigo positivo se usó la cepa V. mimicus ATCC 33653 y V. vulnificus ATCC 29307

Se cultivaron las cepas de V. mimicus en caldo nutritivo durante 18-24 horas a 37°C

1. Se sembraron en el agar CAS

2. Se incubaron durante 24 horas a 37°C

Interpretación: Los microorganismos productores de sideróforos estarán rodeados de un halo

amarillo-anaranjado, dependiendo del tipo de sideróforo producido.


Se ha descrito que V. mimicus produce aerobactina como sideróforo, por lo que se diseñaron los

iniciadores de acuerdo a la secuencia del GenBank para poner en evidencia parte de los genes

requeridos para la síntesis y transporte de la aerobactina: iucC, iucD y iutA. (Figura. 2). Como


23

testigo positivo se uso la cepa V. mimicus ATCC 33653 y como testigo negativo las cepas V.

cholerae O1 serotipo Ogawa, y V. vulnificus ATCC 29307.

Cuadro 7. Condiciones de amplificación para el operón de aerobactina


iut F- 5ÀACCGCTACCAAATGACCCCAGAT -3´

R-5ĆAAAACCGGCGACAGAACCTACTT -3´

Este estudio


snaturalización

Alineamiento

Extensión

94°C/ 60 seg

62°C/ 60 seg

72°C/ 75seg



II.10 Presencia de cápsula

II.10.1 Prueba fenotípica Tinción de cápsula (Clarck, 1973)

1. Se sembraron placas con gelosa glicerol y un 2% (p/v) de NaCl y se incubaron a 37°C

durante 24 horas.

2. Pasado el tiempo de incubación se hizo un frotis y se tiñó por la técnica de Rojo Congo.

3. Se observó al objetivo de inmersión

Interpretación: la prueba es positiva cuando hay halos sin color alrededor de los bacilos teñidos

de rojo en un fondo del mismo color


Hasta el momento no existe reporte alguno de la presencia de capsula en V. mimicus, por lo que

se diseñaron los iniciadores a partir de las secuencias de los genes wza de V. cholerae y V.

vulnificus. Como testigo positivo se usaron las cepas de V. cholerae O1 serotipo Ogawa y V.

vulnificus ATCC 29307.


24

Cuadro 8 Condiciones de amplificación para del gen wza


wza F- 5ÀTTTGGGATCCACCCAGAGCTGACCA -3´

R-5ÁCTTCGCCCATTACAAACACTTTTT -3´

Este estudio


Desnaturalización

Alineamiento

Extensión

94°C/ 60 seg

62°C/ 45 seg

72°C/ 40 seg



II.11 Evaluación del efecto citotóxico del filtrado libre de células de V. mimicus (Elliot et

al., 1995, Baffone et al., 2001)

Como testigo positivo se utilizaron las cepas de Vibrio cholerae O1 Serotipo Ogawa e Inaba, y como testigo negativo caldo AKI.

II.11.1 Obtención del filtrado

1. Se sembró cada una de las cepas de V. mimicus en caldo AKI, se incubó durante 18

horas con agitación (200 rpm) a 37°C.

2. Se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos.

3. Se esterilizó por filtración utilizando una membrana de 0.22 m de diámetro de poro.

4. El filtrado se conservó en congelación a -70°C hasta su uso.

II.11.2 Obtención de un abasto de células CHO

1. A partir de un vial que contiene células CHO (células de ovario de hámster chino) se

obtuvo una monocapa confluente después de crecerlas en medio F12 con suero fetal

bovino (SFB) al 10%, incubado a 35°C con un 5% de CO2.

2. Pasado el tiempo de incubación, se eliminó el suero y el medio y se adicionaron 2

mililitros de solución de tripsina-verseno al 0.05% para lavar la células.

3. Posteriormente, se adicionó un mililitro más de solución de tripsina-verseno al 0.05% y

se incubó durante 5 minutos a 35ºC, disgregándose a continuación la monocapa.

4. Se agregaron 9 mL del medio F12 al 10% de SFB.


25

5. Posteriormente se transfirieron 3 mL de la suspensión de células a dos botellas para

cultivo y se completó el volumen con 5 mL de medio F12 al 10% de SFB y se incubó a

35°C durante 24-48 horas hasta obtener una confluencia de 100%.

II.11.3 Efecto de los filtrados de V. mimicus

1. Se colocaron 200 l de suspensión de células CHO en medio F12 al 15 % de SFB a

cada uno de los 96 pozos de una placa de cultivo. Las placas se Incubaron a 37°C con

un 5% de CO2, hasta lograr la confluencia.

2. Transcurrido el tiempo de incubación, se eliminó el medio y se lavó tres veces con

regulador salino de fosfatos (PBS) estéril.

3. Se agregaron por pozo 100 L de las diluciones 1:1, 1:3, 1:9, 1:27, 1:81, 1:253, 1:729 y

1:2187 del filtrado (inciso V.XI.I) en medio F12 y se incubó a 35°C con un 5% de CO2,

por triplicado.

4. Se observó al microscopio invertido cada 60 minutos hasta observar alteraciones en la

morfología del 50% de las células de la monocapa.

5. Paralelamente, en otra placa de 96 pozos con células CHO confluentes, se agregaron

por pozo 100 L de las mismas diluciones (por triplicado). En cuanto apareció el cambio

en la morfología de las células se retiró el contenido del pozo y se hizo un lavado con

PBS estéril, adicionándose 100 l de medio F12 para observar si la alteración era

reversible.

6. Terminado el tiempo de incubación, se eliminó el medio y se lavó tres veces con PBS

estéril, se fijó con metanol absoluto e inmediatamente se lavó tres veces más con PBS.

7. Finalmente se tiñó con colorante de Giemsa cubriendo los pozos durante 20 minutos, se

lavó con agua destilada hasta no observar de colorante en el enjuague y se observó al

microscopio invertido.

El efecto citopático y citotóxico se consideró positivo cuando >50% de las células presentaron

destrucción o alteración de su morfología (Baffone et al., 2001).

II.12 Ensayo de adherencia en la línea celular HEp-2 (Cravioto et al., 1979, Gander y

Larocco, 1989, Baffone et al., 2001)

Como testigo positivo se utilizó la cepa Vibrio mimicus ATCC 33653 y como testigo negativo

E. coli ATCC 25922.


26

II.12.1 Preparación de los cultivos

1. Se sembró una asada de cada cepa en tubos con 3 mL de caldo triptona con manosa al

1% y se incubó a 37°C/ 18 horas

2. Se centrifugó a 2500 rpm/ 20 min/ 4°C.

3. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el botón en 1 mL de PBS estéril.

II.12.2 Preparación de la monocapa de células HEp-2 y ensayo de adherencia

1. Se prepararon microplacas de 24 pozos al 100% de confluencia de células HEp-2

(cáncer laringeo humano), crecidas sobre un cubreobjetos estéril. Se lavaron 3 veces

con PBS estéril.

2. Se colocaron en cada pozo 975 L de medio MEM + 25 L de la suspensión bacteriana.

Se incubaron a 37°C con 5 % de CO2 durante 1.5 horas (para determinar este tiempo se

hizo una cinética previa).

3. Se eliminó el medio con una pipeta Pasteur y se lavó 3 veces con PBS estéril.

4. Las células se fijaron con metanol durante 1 minuto y se lavaron 3 veces con PBS

estéril.

5. A continuación se tiñeron con Giemsa durante 20 minutos y se lavaron los pozos con

agua destilada hasta que el agua de enjuague no tuviera colorante.

6. Se desmontaron los cubre objetos y se deshidrataron, colocándose 1 min. en acetona, 1

min. en acetona-xilol (1:1) y 1 min. en xilol.

7. Se montaron las preparaciones en portaobjetos y se sellaron con una gota de resina de

Permount.

8. Se observó al microscopio con en el objetivo de inmersión (100x).

Sí al menos el 40% de las células tenían bacterias adheridas, la cepa se considera

adherente (Baffone et al ,.2001),


27

III RESULTADOS

En las cepas estudiadas se encontraron varios fenotipos y genotipos (hemolisinas, sideróforos,

cápsula, genes de regulación de la virulencia, citotoxicidad y adherencia), factores que pueden

estar involucrados en la patogénesis de este microorganismo (Cuadro 10).

III.1 Hemolisina y vmhA

La presencia de hemolisinas se demostró en el 100% (20/20) de las cepas, a través de la

hemólisis de eritrocitos de carnero y conejo en gelosa sangre (Figura. 8), en donde se observó

actividad hemolìtica del tipo .

Figura 8. - hemólisis en agar sangre. A. Eritrocitos de carnero. B Eritrocitos de conejo

Se amplificó el gen de la hemolisina vmhA, obteniéndose un fragmento de 389 pb en todas las

cepas estudiadas (Figura. 9).

Figura 9. Electroferograma del producto amplificado del gen vmhA. M= marcador de talla molecular 100pb, 1 V.

mimicus ATCC, 2-17 V. mimicus, O= V. cholerae O1 Ogawa, I= V. cholerae O1 Inaba

MM 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 1144 1155 1166 1177 OO II MM

338899 ppbb

330000 ppbb

A B


28

La literatura indicaba que estos iniciadores amplifican un producto de 289 pb. Al hacer la

reacción de PCR se encontró un fragmento cercano a las 400 pb. Se descargó de las bases de

datos la secuencia del gen vmhA y se buscó en qué posición del gen se alineaban los

iniciadores, encontrandose que los iniciadores abracan desde la posición 2110 hasta la 2499 y

que el tamaño esperable del amplificado era realmente de 389 pb y no el indicado en la

literatura.

Figura 10. Confirmación del tamaño del amplificado para el gen vmhA

La amplificación de este gen permitió demostrar la presencia del gen que codifica para la

hemolisina VMH en las cepas, característica que se usa como rasgo distintivo para la

identificación a nivel molecular de Vibrio mimicus.

III.2 Presencia de la VPI-1 y del bacteriófago CTX

Se ajustaron las reacciones hasta condiciones óptimas y se encontró que en ninguna de las

cepas se amplificaron productos correspondientes a los genes toxT y tcpA, presentes en la VPI-1

(corresponden a un regulador transcripcional y a la proteína estructural del pili TCP,

respectivamente) ni a los genes ctxA y zot presentes en el bacteriófago CTX (en este caso

corresponden respectivamente a la subunidad A de la toxina del cólera y a una proteína

implicada en el ensamble del virus, a la que también se le han atribuido propiedades citotóxicas)

(Figuras 11 y 12). Si se observó amplificación en esas condiciones en los controles positivos

utilizados.

389 pb


29

MM 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 1144 1155 1166 1177 1188 1199 2200 NNoo OO II VVmm MM

500 pb

Figura 11 Búsqueda de la VPI1. A Electroferograma del producto amplificado del gen toxT. B. Electroferograma del

producto amplificado del gen tcpA. M= marcador de talla molecular 100pb, Vm V. mimicus ATCC, 1-20 V. mimicus,

O= V. cholerae O1 Ogawa, I= V. cholerae O1 Inaba, No= Vo cholerae No O1 CECT 557

MM 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 1144 1155 1166 1177 1188 1199 2200 VVmm NNoo OO II MM

600 pb

581 pb

A

47

2

B

452pb


30

Figura 12 Búsqueda del fago CTX A. Electroferograma del producto amplificado del gen ctxA B. Electroferograma

del producto amplificado del gen zot. M= marcador de talla molecular 100pb, Vm V. mimicus ATCC 1-20 V.

mimicus, O= V. cholerae O1 Ogawa, I= V. cholerae O1 Inaba, No= Vo cholerae No O1 CECT 557*

III.3 toxR

Este gen implicado en la regulación se encontró en el 100% (20/20) de las cepas estudiadas. El

tamaño del fragmento amplificado fue de 221 pb (Figura. 13).

MM 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 1144 1155 1166 1177 1188 1199 2200 VVmm OO II NNoo MM

900 pb

947 pb

B

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Vm No O I M

301 pb

300 pb

A


31

Figura 13 Electroferograma del producto amplificado del gen toxR M= marcador de talla molecular 100pb, Vm V.

mimicus ATCC 1-20 V. mimicus, O= V. cholerae O1 Ogawa, I= V. cholerae O1 Inaba Vv= V.vulnificus ATCC

III.4 Búsqueda de sideróforos

En esta prueba, el 40% (8/20) de las cepas fueron capaces de producir sideróforos del tipo

hidroxamato, lo cual se observa por el cambio de color (amarillo) en el medio CAS (Figura. 14).

Figura 14 Producción de Sideróforo tipo hidroxamato en agar CAS

Posteriormente, se busco en ´la base de datos GenBank la secuencia reportada del operón de

aerobactina de V. mimicus y se diseñaron iniciadores específicos para amplificar parte de los

genes iucC, ,iucD e iutA, implicados en la síntesis y transporte de este sideróforo (Figura. 2). Se

buscaron las condiciones óptimas de amplificación y se encontró que el producto esperado, de

aproximadamente 1500 pares de bases amplifico en el 100% (20/20) de las cepas (Figura, 15).

MM 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 1144 1155 1166 1177 1188 1199 2200 VVmm OO II VVvv MM

220000 ppbb

221 pb


32

Figura 15 Electroferograma del producto amplificado del operón de aerobactina. M= marcador de talla molecular

100pb, Vm V. mimicus ATCC 1-20 V. mimicus, O= V. cholerae O1 Ogawa, Vv= V.vulnificus ATCC

III.5 Cápsula

Al realizarse la tinción negativa con Rojo Congo se evidenció la presencia de la cápsula en el

100% (20/20) de las cepas. Las bacterias que tienen cápsula se observaron con una zona clara

sobre un fondo teñido de rojo (Figura. 16).

Figura 16 Presencia de cápsula en cepas de V. mimicus por medio de la tinción de Rojo Congo

Al no estar descrita la presencia de los genes que participan en la síntesis de la cápsula en V.

mimicus, se buscaron secuencias que codifican para el gen wza (que es importante en el

ensamblaje de esta estructura en algunos miembros de la familia Vibrionaceae). Se obtuvieron

las secuencias correspondientes a este gen de V. cholerae y de V. vulnificus, con el objeto de

diseñar iniciadores para PCR. El producto amplificado que se esperaba era de 514 pb.

MM 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 1144 1155 1166 1177 1188 1199 2200 VVmm OO VVvv MM

1573 pb

1500 pb


33

Al realizar la PCR se encontró que la cepa testigo de V. vulnificus ATCC 29307 amplificó un

fragmento de aproximadamente 500 pb, las cepas de V. cholerae O1 serotipo Ogawa e Inaba un

fragmento de aproximadamente 800 pb, la cepa de V. mimicus ATCC 33653 y las cepas de

trabajo tanto el fragmento de 500 pb como el de 800 pb (Figura. 17).

Figura 17 Electroferograma de los productos amplificados para el gen wza

Para tratar de eliminar el producto no esperado (800 pb) se hizo una PCR en gradiente de

temperatura con el DNA de V. mimicus ATCC 33653, utilizando desde 52.1 hasta 70ºC. Se

encontró que el producto de 800 pb amplificaba en todas las temperaturas analizadas (Figura.

18).

Figura 18 Electroferograma del gradiente de temperatura para el gen wza hecho con el DNA de V. mimicus ATCC

33653

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Vm Vv Vc

800 pb

500 pb

514 pb

800 pb

62.1 63.3 64.2 65.2 66.362.1 63.3 64.2 65.2 66.3


34

Se decidió secuenciar los dos productos de PCR, tanto el de 800 como el de 500 pb, obtenidos a

partir de las cepas testigo.

Tras obtener las secuencias de los productos de PCR, se llevó a cabo un análisis bioinformático

que reveló que el producto de 500 pb amplificado para V. mimicus ATCC 33653 tiene alta

similitud con un gen relacionado con la síntesis del polisacárido capsular de V. cholerae, el

resultado que se perseguía al principio del experimento (Figura 19).

Figura 19 Análisis BLAST de la secuencia de 500pb amplificada por V. mimicus.

El producto de 800 pb amplificado para V. mimicus ATCC 33653 tiene alta similitud con una

región que sintetiza el polisacárido capsular de V. cholerae, aunque los resultados más

frecuentes de similitud se dieron con el gen 16S RNA de V. cholerae y V. mimicus (Figura. 20).

Figura 20 Análisis BLAST de la secuencia correspondiente al fragmento de 800 pb amplificado para V. mimicus.


35

El producto de 800 pb amplificado por V. cholerae CLBM-ENCB dio la mayor similitud con el gen

para el RNA 16S de este mismo organismo y el de V. mimicus (Figura. 21)

Figura 21. Análisis BLAST de la secuencia correspondiente al fragmento de 800 pb amplificado para V. cholerae.

El fragmento de 500 pb amplificado para la cepa testigo V. vulnificus ATCC 29307 tiene la

máxima similitud con la región que codifica para la síntesis del polisacárido capsular de esta

especie (Figura. 22).


36

Figura 22 Análisis BLAST de la secuencia correspondiente al fragmento de 500 pb amplificado para r V. vulnificus

ATCC 29307

Después de los análisis, se encontró que el 100% de las cepas de V. mimicus tienen un gen

homólogo al wza, que está relacionado con la expresión de la cápsula.

III.6 Efecto de los filtrados libres de células sobre la línea celular CHO

El 75% (15/20) de los filtrados de las cepas de V. mimicus presentaron efecto citopático a las 3

horas y destrucción de la monocapa a las 6 horas. (Figura. 23). El 25% (5/20) restante sólo

presentó efecto citopático a las 6 horas, caracterizado por el redondeo de las células.

Se evaluó si el efecto observado sobre las células era reversible, encontrándose que aún

después de cambiar el medio e incubar 3 horas, las células seguían presentando alteraciones.

Los títulos de la citotoxicidad de los filtrados variaron desde 1:3 hasta 1:81, mostrando el 25%

(5/20) un título de 1:81, el 50% (10/20) de ellas un título de 1:27, el 10% (2/20) de 1:9 y el 15%

(3/20) de 1:3 (Cuadro 9).


37

Cuadro 9 Resultados del ensayo de citotoxicidad

Cepa Origen Fenotipo sobre la línea CHO a las 6 horas de exposición

Dilución máxima donde se observó efecto a las 6

horas de exposición

1 Agua Destrucción 1 : 27


3 Ostión Destrucción 1 : 27


5 Pescado Destrucción 1 : 27

6 Pescado Efecto citopático 1 : 9





11 Agua Efecto citopático 1 : 3





16 Ostión Efecto citopático 1 : 9

17 Pescado Destrucción 1 : 27




V. mimicus ATCC 33653 Destrucción 1 : 27

V. cholerae serotipo Ogawa

ENCB Destrucción 1 : 27

V. cholerae serotipo Inaba

ENCB Destrucción 1 : 27


38

Figuras 23 Ensayo de citotoxicidad sobre la línea celular CHO. A. Testigo de células CHO. B. Testigo positivo con filtrado de V. cholerae O1 serotipo Ogawa. C. Efecto citopático causado por los filtrados de V. mimicus a las 3 horas de exposición. D. Destrucción de la monocapa de células causada por los filtrados de V. mimicus a las 6 horas de exposición.

III.7 Adherencia en la línea celular HEp-2

En el ensayo de adherencia, se hizo una cinética para encontrar el tiempo de interacción célula-

bacteria, debido a que al hacer el ensayo a las 3 horas de interacción como indica la literatura las

bacterias destruían la monocapa. El tiempo ideal que se encontró fue de 90 minutos (Figura. 24).

A B

C D

D

C B A

F E

Figura 24 Determinación del tiempo adecuado para el ensayo de adherencia A. 0 minutos. B. 30 mininutos.C. 60 minutos. D. 90 minutos. E. 120 minutos. F. 150 minutos.


39

El 100% (20/20) de las cepas fueron adherentes en la línea celular HEp-2, observándose un

patrón de adherencia agregativo (Figura. 25).

Figura 25 Adherencia de V. mimicus a las células HEp-2. A. Testigo de células HEp-2. B. Patrón de adherencia

mostrado por las cepas de V. mimicus.

Los resultados indican que las cepas 3, 7, 17 y 19 presentaron las mismas características que la

cepa de referencia V. mimicus ATCC 33653 (patógena para los humanos). Sin embargo, las 16

cepas restantes, que no presentaron el mismo comportamiento que la cepa testigo, tienen

marcadores de virulencia que se han relacionado con la patogenicidad de V. mimicus,

independientemente del origen de las cepas (Cuadro 10).

A B


40

Cuadro 10 Genotipos y fenotipos mostrados por las distintas cepas de V. mimicus

Cepa Origen -hemólisis vmhA CAS Aerobactina CTX VPI-1 toxR Cápsula wza Citotoxicidad Título del filtrado

Adherencia

Vm ATCC + + + + - - + + + D 1 : 27 +

1 A + + - + - - + + + D 1 : 27 +

2 A + + - + - - + + + D 1 : 27 +

3 O + + + + - - + + + D 1 : 27 +

4 O + + - + - - + + + D 1 : 27 +

5 P + + + + - - + + + E 1 : 9 +

6 P + + + + - - + + + E 1 : 3 +

7 P + + + + - - + + + D 1 : 81 +

8 A + + - + - - + + + D 1 : 81 +

9 A + + - + - - + + + D 1 : 81 +

10 A + + + + - - + + + E 1 : 3 +

11 A + + - + - - + + + E 1 : 3 +

12 P + + - + - - + + + D 1 : 27 +

13 O + + - + - - + + + D 1 : 81 +

14 O + + - + - - + + + D 1 : 81 +

15 O + + + + - - + + + E 1 : 9 +

16 O + + - + - - + + + D 1 : 27 +

17 P + + + + - - + + + D 1 : 27 +

18 O + + - + - - + + + D 1 : 27 +

19 O + + + + - - + + + D 1 : 27 +

20 O + - + - - + + + D 1 : 27 + A=agua, O=ostión, P=pescado, += positivo, -=negativo, D=destrucción de la monocapa a las 6 horas de exposición y E= efecto de arredondamiento de las células a las 6 horas de exposición


41

IV DISCUSIÓN

La presencia de factores de virulencia en V. mimicus es un hecho reconocido, aún cuando se

desconoce el mecanismo de patogenicidad de esta bacteria.

El gen vmhA codifica para una hemolisina, y ya se ha mencionado que se encuentra presente en

todas las cepas de V. mimicus por lo que se esperaría un fenotipo hemolítico. Este dato se

corroboró, en forma de -hemólisis sobre eritrocitos de carnero y conejo (Figura. 8). Para la

amplificación del gen vmhA se usaron los iniciadores y condiciones de reacción reportadas por

Shi y colaboradores en 2000. El producto amplificado esperado debía ser de 289 pb, utilizando

una temperatura de hibridación de 55ºC. Al realizar la reacción de PCR en esas condicones se

obtenían bandas inespecíficas, lo que llevó a probar una temperatura de alineamiento superior,

58.5ºC, encontrándose que el amplificado era de aproximadamente 400 pb, mayor de lo

esperado por los datos previos de la literatura. Se buscó el sitio de hibridación de los iniciadores

dentro de la secuencia del gen vmhA que se encuentra en la base de datos GenBank,

encontrándose que el tamaño del amplificado es realmente de 389 pb, lo que coincide con

nuestros resultados (Figura 10). En un estudio realiado en 2008, se identificaron 68 cepas

aisladas de varios brotes utilizando el sistema API 20E (Biomerieux), señalando los resultados

que la identidad de algunas de ellas era V. mimicus. Al hacer pruebas de perfiles de ácidos

grasos, hibridación DNA-DNA, y analizar las secuencias del oriC y de los genes DNAr 16S, pyrH,

recA, rpoA, hlyA, y vmhA para corroborar la especie, se encontró que en realidad se trataba de

cepas de V. cholerae con características bioquímicas atípicas. Ninguna de ellas amplificó el gen

vmhA, salvo los controles positivos de V. mimicus, correlacionándose la presencia del gen vmhA

con V. mimicus (Wei et al., 2008). Otros autores han mencionado que el gen vmhA es descriptivo

para la identificación de V. mimicus (Shi et al., 2000; Shinoda et al., 2004). Al haber amplificado

todas nuestras cepas este gen se confirmó molecularmente su identidad como V. mimicus.

La hemolisina VMH es considerada un factor de virulencia (Bi et al., 2001, Shi et al,. 2000,

Shinoda et al,.2004, Zhang y Austin 2005). Esta proteína tiene actividad de hemolisina/citolisina y

forma poros en la membrana de las células. Estos poros son permeables al agua y a iones

pequeños como Na+ y K+ e induce cambios en la polaridad; la despolarizacion activa canales

para otros iones presentes en la célula, causando la perdida de liquido y diarrea (Li et al., 2005),

por ello se le considera una toxina (Takahashi et al., 2006).

Debido a la similitud que hay entre V. mimicus y V. cholerae se decidió investigar la presencia de

la toxina del cólera, la cual se encuentra codificada en el bacteriófago filamentoso CTX que


42

únicamente infecta a V. cholerae O1, O139 y a V. mimicus, cuando la bacteria contiene en su

genoma la VPI-1 (Boyd et al,. 2000a).

No existe un estudio que indique las funciones o ventajas que confiere a V. mimicus la presencia

del fago y la isla, salvo la capacidad de ser toxigénicas y causar un cuadro clínico similar al

cólera (Campos et al,. 1996). La ausencia de estos dos elementos genéticos en las cepas de

estudio (0/20) (Cuadro 10) coincide con lo reportado por Shinoda y colaboradores en 2004,

quienes indican que la presencia del fago en cepas V. mimicusde origen ambiental es menor al

1%. Aún y cuando la frecuencia es baja, existen informes de casos de cólera provocados por

cepas toxigénicas de V. mimicus (Campos et al., 1996; Acuña et al., 1999). Se desconoce la

frecuencia con que se presenta la VPI-1 en V. mimicus, así como la razón por la cual V. cholerae

es capaz de generar brotes epidémicos y V. mimicus no (incluso más si se considera que ambas

bacterias dependen de los mismos mecanismos para llegar a ser toxigénicas). Las cepas de V.

mimicus que presentan estos dos elementos se han aislado en zonas en donde el cólera es

endémico, por ejemplo de la Cuenca del Río Ganges en la India, en Japón y en la costa del

Golfo de México. Existen datos de cepas de V. mimicus provenientes de estas regiones en los

cuales la VPI1 está incompleta, no tienen el gen que codifica para la proteína estructural del pili

TCP (tcpA) o no tienen el gen regulador toxT (motivo por el cual se decidió buscar ambos genes

en las cepas de V. mimicus) (Bi et al,.2001; Shinoda et al., 2004). En cuanto al fago CTX , Boyd

y colaboradores (2000b) reportaron que hay bacteriófagos incompletos que sólo tienen el gen zot

(esencial para el ensamble de la cápside viral) pero no presentan el operón ctxAB (toxina

colérica).

Se sabe que los principales factores de virulencia de V. cholerae son adquiridos de fuentes

exógenas. Sin embargo, los donadores de este material genético siguen siendo desconocidos,

aunque se considera que V. mimicus podría tener un papel importante en la evolución de las

cepas toxigénicas de V. cholerae (Faruque y Mekalanos, 2003; Jermyn y Boyd, 2005).

En el 100% de las cepas estudiadas se amplificó el gen toxR (Figura. 13). Nuestros datos

concuerdan con lo descrito por Shinoda en 2004 y por Provenzano y colaboradores en 2000,

quienes indicaron que este gen está presente en todas las especies del género Vibrio. Este gen

codifica para una proteína transmembranal que regula muchas de las funciones de virulencia en

V. mimicus y V. cholerae. Su presencia faculta a V. mimicus para regular tanto funciones de

virulencia propias como para cambiar el patrón de expresión de proteínas de membrana externa

ante estímulos del ambiente, favoreciendo la colonización del intestino, la expresión de la

hemolisina y la movilidad del flagelo (Skorupski y Taylor, 1997). Regula, además, las funciones


43

de virulencia.obtenidas a través de un evento de transferencia horizontal y es capaz de regular

los genes presentes en la isla de patogenicidad y del fago, de modo que las cepas que no tienen

la isla pero sí el fago pueden ser toxigénicas debido a que ToxR se puede unir directamente al

promotor del operón ctxAB (Islam et al., 2005).

El 40% (8/20) de las cepas fueron capaces de producir sideróforos de tipo hidroxamato (Figura.

14), datos que concuerdan con lo reportado por Okujo y Yamamoto en 1994 quienes indicaron

que el sideróforo producido por V. mimicus es la aerobactina. No todas las cepas fueron capaces

de producir sideróforos: una posible explicación pudiera ser la toxicidad de algunos de los

componentes del medio, pues se ha demostrado que el medio CAS puede inhibir el crecimiento

de algunos microorganismos (Pérez-Miranda et al., 2007), o bien deberse a defectos en la

expresión o mutaciones en algún gen implicado en la ruta de biosíntesis de aerobactina

Se diseñaron iniciadores de acuerdo a la secuencia del operón de aerobactina de V. mimicus,

amplificándose parte de los genes iucC e iucD relacionados con la síntesis, así como parte del

gen iutA, implicado en el transporte del complejo ferri-sideroforo desde el exterior hacia el interior

de la bacteria (Figura. 2). Al hacer la reacción de PCR se encontró que todas las cepas (20/20)

tienen los genes iucC.,iucD y iutA (Figura 15). Estos datos coinciden con lo reportado por Moon y

colaboradores en 2004, los cuales estudiaron 6 cepas de V. mimicus (3 de origen clínico y 3 de

origen ambiental) que contenían el operón de aerobactina. Las 20 cepas de V. mimicus de este

estudio (que son ambientales) también los poseen, lo cual apoya la teoría que sostienen estos

autores acerca de una localización cromosomal de estos genes y una amplia distribución entre

las cepas de esta especie.

El papel de los sideróforos como factores de virulencia es muy controvertido, en otras bacterias

como Klebsiella pneumoniae, Shigella spp. y Escherichia. coli invasivas, las bacterias pierden su

patogenicidad al perder el operón de aerobactina. Esto indicaría que los mecanismos de

captación de hierro son un factor clave durante el proceso de infección del hospedero, lo que

haría de los sideróforos un posible blanco para el diseño de nuevos medicamentos (Schmidt y

Hensel, 2004).

La presencia de cápsula es un factor de virulencia que no estaba reportado para V. mimicus,

aunque en el presente trabajo se evidenció en el 100% de las cepas estudiadas (20/20), por

medio de la técnica de tinción con Rojo Congo (Figura. 16). Del mismo modo, la expresión

fenotípica se corroboró con evidencia genética. Para ello se eligió el gen wza, fundamental para

la construcción de la cápsula. Este gen codifica para una proteína que tiene como función


44

translocar el polisacárido capsular desde el espacio periplásmico hacia el exterior, a través de la

membrana externa (Wright et al., 2001).

Para diseñar los iniciadores se hizo una búsqueda bibliográfica, encontrándose que nunca se ha

hecho referencia a esta estructura en V. mimicus y no existen secuencias depositadas en las

bases de datos. Por ello, los iniciadores se diseñaron a partir de regiones conservadas de las

secuencias de V. cholerae y V. vulnificus, microorganismos filogenéticamente cercanos en los

que se ha reportado la presencia de la cápsula. Al hacer la reacción de PCR se encontró que

todas las cepas de V. mimicus (incluida la cepa de referencia ATCC 33653) amplifican 2

productos, uno de aproximadamente 800 pb (que también se obtiene en la amplificación de las

cepas testigo de V. cholerae) y otro, mas pequeño, de aproximadamente 500 pb (que también es

amplificado en la cepa testigo de V. vulnificus) (Figura. 17).

Teóricamente, el producto de 500 pb corresponde al gen wza que se obtuvo en todas las cepas

de V. mimicus. Para eliminar la banda de 800 pb se hizo una reacción de PCR en gradiente de

temperatura para la etapa de hibridación de los iniciadores, sin embargo el producto de 800 pb

no desaparece en ninguna de las condiciones probadas (Figura. 18) por lo que se decidió

secuenciar los fragmentos obtenidos.

Tras obtener las secuencias y hacer un analisis BLAST, la secuencia del producto de 500 pb

amplificado por V. mimicus mostró similitud con una región del cromosoma de V. cholerae

relacionada con la síntesis del polisacárido capsular (Figura. 19), lo que indica que todas las

cepas de V. mimicus analizadas tienen en su genoma un gen homólogo al wza. Lo mismo ocurre

con el amplificado de 500 pb de V. vulnificus, el cual tiene similitud con una región involucrada en

la síntesis de la cápsula (Figura. 22). Todos los datos que da el análisis BLAST están referidos a

regiones en los cromosomas, debido a que los genomas de V. cholerae y V. vulnificus no están

anotados completamente.

El amplificado de 800 pb de V. mimicus presentó similitud con la misma región del fragmento de

500 pb, con una identidad del 83%, pero también la mostró con el gen para el RNA 16S de V.

cholerae y V. mimicus, con una identidad de 81% (Figura. 20), lo que probablemente indique que

este amplificado se trata de una quimera o un producto inespecífico de la PCR.

Al analizarse la secuencia del fragmento de 800 pb de V. cholerae se encontró similitud del 95%

y 94% con los genes para el RNAr 16S de V. cholerae y V. mimicus, respectivamente, lo que

indica que los iniciadores probablemente estén hibridando con una región de dicho gen en

ambas especies (Figura. 21). Cuando se diseñaron los iniciadores, el análisis BLAST no reveló

que tuvieran similitud con alguna región de los genes ribosomales, por lo que se compararon las


45

secuencias de los genes wza de V. cholerae y V. vulnificus (con las que se diseñaron los

iniciadores) con las secuencias de los genes 16S RNA de V. mimicus y V. cholerae. Los

resultados arrojaron que:

1) Los genes para el RNAr 16S de V. mimicus y V. cholerae son casi idénticos,

2) Los genes wza de V. cholerae y V. vulnificus, tienen similitud entre si, pero además también

presentan una región semejante a la de los genes para el RNAr 16S y

3) Los iniciadores hibridaron en esa zona de similitud, lo que justifica la existencia de bandas

adicionales de 800 pb además de las esperadas de 500 pb (Figura. 26).

Figura 26. Localización de los iniciadores en los genes wza y RNAr 16S de V. mimicus y V. cholerae

La cápsula juega un papel muy importante desde el punto de vista de la patogenicidad. Por

ejemplo, en V. cholerae O139 la presencia de cápsula es fundamental para la colonización del

epitelio intestinal, facilitando la formación de las microcolonias (Nesper et al., 2002). Por otro

lado, la presencia de esta estructura en V. vulnificus es útil para sobrevivir a la acción del

complemento y evadir la fagocitosis cuando se encuentra circulando en el torrente sanguíneo

(Wright et al., 1999). También favorece la sobrevivencia en el ambiente, facilita la formación de

biopelículas y la transmisión horizontal de genes (debido al contacto tan estrecho entre las

bacterias), aumentando la frecuencia de adquisición de factores de virulencia, algo fundamental

en la patogenicidad de V. cholerae y V. mimicus (Reidl y Klose, 2002).

Al hacer el ensayo de citotoxicidad utilizando el modelo de la linea celular CHO descrito para el

género Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas shigeloides (Elliot et al,. 1995, Gardner et al,.1987) se

observó con las cepas de V. mimicus un efecto citopático de redondeo a las 3 horas y la

destrucción de la monocapa a las 6 horas (Figura. 23). No se tiene antecedente sobre el efecto

que produce este microorganismo en la línea celular CHO, la única información similar era el

reporte de un efecto citotóxico sobre las líneas Y-1 (Campos et al., 1996), CHSE-214 (Lee et al.,

2002) y T84 (Li et al,. 2005). En todos estos casos se reporta la destrucción de la monocapa.


46

Los títulos de los filtrados de V. mimicus van desde 1:3 a 1:81, y no existe antecedente que

estime la actividad de éstos. Baffone y colaboradores en 2001 encontraron que los filtrados de V.

alginolyticus, V. parahaemolyticus y V. cholerae no O1 tenían títulos desde 1:4 hasta 1:10,

considerando que éstos últimos son fuertemente citotóxicos, lo que contrasta con lo descrito por

Bag y colaboradores en 2008, quienes indican que sus aislados de V. cholerae no O1 no O139

presentan títulos que van desde 1:4 hasta 1:128. En nuestro caso, se encontró que un titulo por

menor a 1:9 se traduce en un fenotipo citopático; en cambio, en uno mayor el efecto es

citotóxico, llegando incluso hasta 1:81 en las cepas 8, 9, 10, 14 y 15 (Cuadro 9). Las diferencias

entre los títulos pueden deberse a variaciones en la expresión de los genes de hemolisinas, que

por lo general son la causa del efecto de destrucción y daño celular que producen las bacterias

del género Vibrio (Zhang y Austin 2005; Bag et al., 2008).

La hemolisina de V. cholerae es capaz de vacuolizar células VERO (Figueroa-Arredondo et al.

2001; Arellano et al., 2007; Vidal et al., 2007) y causar un efecto de redondeo sobre células HeLa

(Bag et al., 2008). La hemolisina VVH de V. vulnificus tiene un efecto de alargamiento y

destrucción sobre células CHO (Kreger y Lockwood, 1981), mientras que la TDH de V.

parahaemolyticus tiene actividad citolítica y citotóxica sobre enterocitos humanos y de ratón

(Zhang y Austin, 2005). Todo lo anterior nos lleva a pensar que el efecto que estamos

observando pudiera relacionarse con la hemolisina que se detectó en el agar sangre y que

probablemente sea la VMH la responsable.

Bag y col. en 2008 demostraron en cepas de V. cholerae no O1- no O139 un efecto citopático de

redondeo, seguido de lisis, sobre la línea HeLa, correlacionando la citotoxicidad con la

patogenicidad en un modelo de ratón. Esto hace inferir que las cepas que tienen capacidad de

daño in vitro son probablemente patógenas in vivo.

Al analizar los datos del ensayo de adherencia, se encontró que el 100% (20/20) de las cepas

son adherentes (Figura. 25), lo que coincide con las investigaciones hechas por Alam y

colaboradores en 1996a, 1996b, 1997 y 2006. Estos autores describen ampliamente algunos de

los factores de adherencia por los cuales V. mimicus se adhiere a las superficies de las células o

al intestino de ratones. Se ha descrito que en V. mimicus la capacidad de adherirse a las células

del intestino es un proceso multifactorial, y se ha visto que las proteínas de la membrana

externa, varias proteasas y el lipopolisacárido (LPS) tienen capacidades como hemaglutininas,

(Alam et al,. 2006).

Se tiene la certeza de que muchas de las proteínas que se han estudiado para entender la

patogénesis de V. cholerae en humanos tienen también importantes papeles en la sobrevivencia


47

en el ambiente acuático, es decir, estas proteínas tendrían un papel bifuncional (Kirn et al.,

2005). En V. cholerae se ha visto que la mutación de un gen que está involucrado en el

ensamble del flagelo produce un fenotipo que tiene disminuida la capacidad de adherirse a las

células del intestino de ratones, lo que se señalaría que el flagelo facilita la colonización inicial

del intestino (Attridge y Rowley, 1983). Se puede sugerir una situación similar para V. mimicus.

Existen otros factores de adherencia descritos en especies patógenas del genero Vibrio, como

son los pilis tipo IV (PilA de V. vulnificus y TCP y PilA de V. cholerae). Hasta la fecha no existe

reporte alguno que indique que V. mimicus tenga un mecanismo similar (Alam et al., 2006).

Como se puede ver en las figuras 24 y 25, las cepas de V. mimicus presentan una adherencia de

tipo agregativa, las bacterias se están adhiriendo tanto a la superficie de las células como a la

superficie del vidrio. Tampoco existen antecedentes que indiquen el tipo de adherencia que tiene

esta bacteria sobre las células HEp-2. Está reportado que V. alginolyticus presenta una patrón de

adherencia similar, V. cholerae no O1- no O139 tiene dentro de la misma especie diferentes

patrones de adherencia, que van desde adherencia difusa y agregativa hasta de tipo alfombra

(Baffone et al., 2001; Bag et al., 2008).

Se sabe que moléculas como la fibronectina, colágena y algunos tipos de carbohidratos son

moléculas blanco para las adhesinas de las bacterias del género Vibrio y que, en general, el

proceso de adherencia es multifactorial (Wang y Leung, 2000).

En la Cuadro 10 se observa que las cepas analizadas en este trabajo tienen por lo menos algún

marcador que se ha descrito en cepas patógenas y que el origen de las cepas es independiente

a la distribución de los marcadores. Esto coincide con la propuesta de Chowdhury y

colaboradores (1986), quienes afirman que V. mimicus es un grupo heterogéneo, en donde cada

cepa tiene diferentes capacidades patogénicas y que éstas están relacionadas con la presencia

o ausencia de ciertos factores de virulencia, descritos con el paso del tiempo (Shi et al., 2000; Bi

et al., 2001; Faruque y Mekalanos, 2003;, Shinoda et al., .2004).

27 años después de haber sido descrito por Davis y col. existen muchas lagunas sobre las

características patogénicas que presenta V. mimicus: no existe información suficiente en las

bases de datos genéticas, no se ha secuenciado su genoma, y tampoco existen datos actuales

sobre su incidencia (ya que no existe ninguna regulación nacional o internacional que indique su

búsqueda o reporte, pese a la importancia que pudiera tener en un momento dado la generación

de cepas de V. cholerae toxigénicas en el medio ambiente). Se desconocen también cuestiones

muy interesantes, como el por qué siendo tan similar a V. cholerae y teniendo la capacidad de

causar diarrea tipo cólera no ha causado brotes importantes, además de otros aspectos como el


48

por qué esta bacteria tiene aerobactina como sideróforo o el papel que juega la cápsula en su

patogénesis, entre otros aspectos.

En México, durante la epidemia de cólera de los años 90´s, la zona del Golfo de México (de

donde provienen las cepas estudiadas en este trabajo), se vio gravemente afectada y hubo

numerosos casos, por lo que se consideró importante en ese momento mantener la vigilancia

sobre la presencia del género Vibrio en la laguna; actualmente solo los casos de V. cholerae son

los que se notifican a las autoridades, de ninguna otra bacteria del género Vibrio se tiene

información en nuestro país. Por ello, no se conoce el verdadero comportamiento que tiene V.

mimicus en el ambiente ni su impacto epidemiológico, las autoridades mexicanas deben

promover el que se generen modelos que puedan ayudar a prevenir enfermedades en la

población o asegurar la inocuidad de los productos de la pesca que se producen en nuestro país.


49

V CONCLUSIONES

• En este estudio se demostró la presencia de posibles factores asociados a la virulencia, en las cepas de V. mimicus, lo que indica que en un momento dado pudieran causar un padecimiento en personas susceptibles .

• Al haber amplificado todas las cepas el gen vmhA, se confirma que son Vibrio mimicus • Todas las cepas que tuvieron el gen vmhA son beta-hemolíticas y resultaron citotóxicas

sobre la línea celular CHO.

• Las cepas estudiadas no tienen la VPI-1 ni el CTX , lo que indica que no son capaces de producir toxina colérica.

• La presencia del gen toxR es un indicador de que las cepas pueden regular las

funciones de virulencia propias como las adquiridas de manera horizontal.

• Los genes del operón de aerobactina están distribuidos en todas las cepas de V. mimicus analizadas, aunque algunas fueron incapaces de expresarlos.

• Se ha descrito por vez primera la presencia de cápsula en V. mimicus.

• Se confirmó que V. mimicus se puede adherir a la línea celular HEp-2

• No se encontró relación alguna entre la fuente de aislamiento de las cepas y la

distribución de los marcadores de virulencia.


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VI ANEXOS Agar sangre

Cantidad por litro de agua:

Infusión de músculo cardiaco 375 g

Peptona de carne 10 g

NaCl 5 g

Agar 15 g

pH 7.3

Preparación:

Todos los ingredientes componen la base, se disuelven con agitación constante y calentando

hasta ebullición. Se esterilizan a 121ºC durante 15 minutos. Se deja enfriar y cuando se

encuentra a 45ºC se adiciona la sangre desfibrinada hasta alcanzar una concentración del 5%.

Mezclar. Enfriar y vaciar en cajas de Petri.

Agar glicerol extracto de levadura

Cantidad por litro de agua:

Caldo nutritivo deshidratado 8 g

Extracto de levadura 2.5 g

Glicerol 20 ml

Agar 15 g

pH 6.8

Preparación:

Disolver todos los ingredientes, calentar hasta la disolución del agar y esterilizar a 121°C durante

15 minutos, distribuir en cajas Petri estériles.


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Agar CAS:

NaOH 5.3 g PIPES 30.24 g 10×MM9 100 ml Agar 15 g Agua 750 ml

Ajustar el pH a 6,8 , Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos y enfriar hasta 50°C.

Añadir:

30 ml Casaminoácidos al 10% desferrados

10 ml de glucosa al 20% (p/v) (u otra fuente de carbono)

1 ml 1 M MgCl2

1 ml 100 mM CaCl2

4 ml tiamina 500 µg/ml

4 ml ácido nicotínico 500 µg/ml

Mezclar y añadir 100 ml de la solución CAS-HDTMA. Mezclar abundantemente evitando la

formación de burbujas.

Plaquear. Las colonias de bacterias productoras de sideróforos crecidas en este medio estarán

envueltas de un halo amarillo-anaranjado.

Componentes del medio:

•10×MM9

KH2PO4 3 g NaCL 5 g NH4Cl 10 g Agua 1000 ml

Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

•CAS-HDTMA

Cromo Azurol S 60.5 mg Agua 50 ml

Disolver y añadir 10 ml de 1 mM FeCl3 6H2O en 10 mM HCl.

Añadir lentamente a la solución de HDTMA (72,9 mg HDTMA en 40 ml de H2O).

Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

•Casaminoácidos al 10% desferrados

Disolver 10 g de Casaminoácidos en 100 ml de agua bidestilada.


58

Para desferrar la solución de Casaminoácidos se mezcla con un volumen equivalente de una

solución al 3% de 8-hidroxiquinolina en cloroformo, y se agita hasta que el color azul intenso del

complejo férrico del agente quelante desaparece de la capa de cloroformo. El proceso se repite

únicamente con cloroformo, para eliminar las cantidades traza de 8-hidroxiquinolina.

Medio Luria Bertani

Extracto de levadura 5 g

Peptona tríptica de caseína 10 g

NaCl 10 g

Preparación:

Disolver todos los ingredientes, distribuir en tubos de 13 × 100 mm. y esterilizar a 121° C durante

15 minutos.

Regulador Tris-Ácido acético glacial-EDTA (TAE) 50×

Acido acético glacial

57.1 ml

EDTA 0.5 M 100 ml

Base Tris 242 g

Agua destilada Completar volumen a 1000 ml

Mezclar bien y ajustar pH a 8.0

Regulador de carga 6×

Azul de bromofenol al 0.25% (p/v), sacarosa al 40% (p/v) y xileno cianol al 0.25% (p/v).

Esterilizar en autoclave a 121ºC por 20 minutos. Se conserva a 4ºC.

Bromuro de etidio

Se prepara una solución 10 mg/ml en agua y se conserva a 4ºC. Para preparar un litro de

bromuro de etidio a una concentración de 0.5 g/ml, se adicionan 50 L de la solución a un litro

de agua destilada.


59

Medio Mínimo Esencial

FORMULACIÓN

Medio mínimo esencial (10×)

50 ml

Regulador de pH HEPES 1 M

5 ml

Glutamina estéril (200 mM)

5 ml

Bicarbonato de sódio al 7.5% estéril

5 ml

Água desionizada estéril

450 ml

Preparación

En condiciones de esterilidad se colocan todos los ingredientes en un frasco con tapón de rosca

estéril y se almacenan en refrigeración hasta su uso. Al usarse se suplementa con la cantidad

deseada de suero fetal bovino.

Medio F-12

Formulación

Medio F-12 (10×)

50 ml

Regulador de pH HEPES 1 M

5 ml

Glutamina estéril (200 mM)

5 ml

Bicarbonato de sódio al 7.5% estéril

5 ml


450 ml

Preparación

En condiciones de esterilidad se colocan todos los ingredientes en un frasco con tapón de rosca

estéril y se almacenan en refrigeración hasta su uso. Al usarse se suplementa con la cantidad

deseada de suero fetal bovino.


60

SOLUCIÓN REGULADORA DE FOSFATOS (PBS)

Formula en gramos por litro de agua desionizada

Cloruro de sodio

8 g

Cloruro de potasio

0.2 g

Fosfato de sodio dibásico

1.15 g

Fosfato de potasio monobásico

0.2 g


1000 ml

PREPARACIÓN

Se disuelven cada uno de los ingredientes y antes de aforar con el agua se ajusta el pH a 7.2 ±0.2. Posteriormente se esteriliza 15 minutos/ 121ºC/ 15 libras de presión.

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