Anticorpos anti-HLA
Igen - Instituto de Imunogenética
Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa
São Paulo, SP, Brasil
Renato de Marco
Estrutura do HLA
KLEIN J, SATO A:. The HLA system. First of two parts. N Eng J Med 2000; 343;10: 702-9.
HLA - NOMENCLATURA
A*
01:01:01:01Locus
Nível sorológico
– Grupo de
alelos
Alelo
AleloSubstituição silenciosa
Variantes
intron
POLIMORFISMO HLA
Numbers of HLA Alleles
HLA Class I Alleles 12,021
HLA Class II Alleles 4,230
HLA Alleles 16,251
Other non-HLA Alleles 178
HLA Class I
Gene A B C E F G
Alleles 3,830 4,647 3,382 25 22 53
Proteins 2,703 3,408 2,391 8 4 18
Nulls 173 141 119 1 0 2
HLA Class II
Gene DRA DRB DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 DMA DMB DOA DOB
Alleles 7 2,252 77 1,054 44 740 7 13 12 13
Proteins 2 1,661 34 727 22 615 4 7 3 5
Nulls 0 62 2 28 0 19 0 0 1 0
HLA Class II - DRB Alleles
Gene DRB1 DRB2 DRB3 DRB4 DRB5 DRB6 DRB7 DRB8 DRB9
Alleles 2,011 1 130 57 46 3 2 1 1
Proteins 1,465 0 109 46 41 0 0 0 0
Nulls 50 0 4 5 3 0 0 0 0
IMGT/HLA Database (02/2017)
GRUPO DE ALELOS (NÍVEL SOROLÓGICO)
HLA A: 21
HLA B: 43
HLA C: 15
HLA DR: 17
HLA DQ: 7 DQB1 e 6 DQA1
HLA DP: 18 DPB1 e 4 DPA1
Hipersensibilizados (PRA >80%)
Não Hipersensibilizados (PRA < 80%)
Teste Exato de Fisher
N 493 3.737
TX prévio 199 (40,4%) 266 (7,1%)P<0.0001OR:8,9IC 95%:7,1 – 11,1
Mulheres com gestação prévia
1 a 2 gestações 107( 21,7%)
≥ 3 gestações: 169 (34,3%)
Gestação ≥ 1: 492 (13,2%)
Gestação ≥ 3; 502 (13,4%)
P<0.0001OR:1,8IC 95%:1,4 – 2,3P<0.0001OR:3,4IC 95%:2,7 – 4,2
TransfusõesSanguíneas
N: 1 a 4 = 274 (55,6%)
N ≥ 5=136 (27,6%)
N: 1 a 4 = 1521 (40.7%)
N ≥ 5= 560 (15,0%)
P<0.0001OR: 1,8IC 95%:1,5 - 2,2
P<0.0001OR:2,16IC 95%:1,7 – 2,7
FATORES ASSOCIADOS À CONDIÇÃO DE HIPERSENSIBILIZADOS
Metodologias de Uso Corrente para Detecção de
Anticorpos Anti-HLA
ALTA SENSIBILIDADE
BAIXA SENSIBILIDADE
LUMINEX SA-Ig
Beads recobertas
por antígenos HLA
purificados
Definição da especificidade dos anticorpos
CDC
CDC-AGH
CITOMETRIA DE FLUXO
Crossmatch (XM) contra o doador
HLA doador +
Crossmatch Virtual
CrossmatchLinfócitos do Doador + Soro do Receptor
Método de Linfocitotoxicidade dependente de complemento (CDC)
Linf. do Doador + Soro do Receptor + Complemento + Corante
D
DD
D
D
Y
D
Y D
D D
D
D
D
T
Ficoll
PBMC
30’ 37ºC
Crossmatch30’ 4ºC
5x105céls/tubo
50µL soro/tubo
B
TB
30’ 4ºC
Marcação
PFA 2%
FACSCalibur
Pronase
IgG FITC
CD19 PE
CD3 PE-Cy5
Lavagens
Lavagens
CD19
Tratamento Pronase
FCXM – Crossmatch por Citometria de Fluxo
Fc
FI=1x FI=4x
FI=1x
FI=2x
MFI=4/3=1,33x
FI=5x
FI=6x
MFI=15/3=5x• MFI= Valor médio da leitura, pelo luminex, da fluorescência emitida pelo conjugado.
5
5
5
6
6
6
Leitura no Luminex
LUMINEX SINGLE ANTIGEN
EXEMPLO DE SINGLE I
- Paciente não forma anticorpos contra HLA próprio
- Contem todos dos grupos de alelos descritos para os HLAs A, B, C
- Cada grupo de alelos é representado por 1 ou mais alelos - mais frequente na população
EXEMPLO DE SINGLE II
- Paciente não forma antircorpos contra HLA próprio
- Contem todos dos grupos de alelos descritos para os HLAs DRB1, DRB3/45, DQB1, DQA1, DPB1 e DPA1
- Cada grupo de alelos é representado por 1 ou mais alelos - mais frequente na população
PROBLEMAS NO LUMINEX
Reações falso Negativas
Interferência do complemento presente no soro do receptor na reatividade dos
anticorpos anti-HLA testados no SAB
Pre-tratamento do soro com: Aquecimento, DTT ou EDTA
Anti-A2Média de MFIA2=1.170
TRATAMENTO DO SORO
Anti-A2 Aq 1 min.
Média de MFIA2=15.010
INIBIÇÃO DE REATIVIDADE PELO COMPLEMENTO
PROBLEMAS NO LUMINEX
Reações falso-Positivas
Presença de antígenos HLA desnaturados aderidos a Bead do luminex
Experiência do analista para identificar
Não correlacionam com prova cruzada real positiva
Desnaturar antígeno HLA do kit – experimental
Absorção / Eluição - experimental
PRESENÇA DE ANTICORPOS CONTRA ANTÍGENO HLA
DESNATURADO
Doador: HLA-A*02,31; B*14(B65),49; DRB1*01,13
LINFÓCITOS T LINFÓCITOS B
Controle Negativo Cut-off MCF = 212 Cut-off MCF = 238
Soro da Paciente MCF = 174 (Neg) MCF = 208 (Neg)
Single Antigen Padrão
Single Antigen Antígeno HLA Desnaturado
Reação falso-Positiva
Qual a relação MFI x Citometria de
Fluxo ?
-5000
0
5000
10000
15000
20000
-200 -100 0 100 200 300 400 500 600
> M
FI D
SA H
LA -
A,B
MCF - Cutoff
Citometria de Fluxo - Linfócitos TMFI do DSA AB mais alto x Delta (MCF - cutoff)
Correlação: 0,93
1500
MFI
Cutoff MFI ≥ 1500
VPN: 98,7%
VPP: 92,0%
Acurácia: 97,5%
NEG POS
Presença de Anticorpos Anti-HLA
nMFI: cut-off # para # objetivos
Crossmatch Virtual Positivo por CDC
POSNEG
Crossmatch Virtual Positivo por CF
POSNEG
Anticorpos Clinicamente Relevantes
POSNEG ? ? ? ? ? ? ?
Ac identificados no soro:
anti-A2, anti-B7, anti-DR1
PRA A,B,DR ou PRA HLA I + II
7 céls+/10: cPRA 70%
% PRA calculado (cPRA) ou “PRA virtual
Painel constituído por fenótipos HLA-A,B,DR de 3600 doadores de
rim tipificados em nosso laboratório
A 01,02; B07,44; DR03,04A 01,03; B08,14; DR15,07A 02, - ; B51,44; DR03,04A 11,24; B51,35; DR16,11A 02,30; B15,38; DR 08,04A 29,31; B13,27; DR 01,09A 23,33; B07,60; DR 01,09A 11,26; B57,41; DR 07,08A 03,32; B18,61; DR 01,14A 02,25; B08,45; DR12,13
PRA A,B ou PRA HLA I
5 céls+/10: cPRA 50%
PRA DR ou PRA HLA II
3 céls+/10: cPRA 30%
Crossmatch virtual contra
os indivíduos do painel
E PORQUE ESTUDAR ANTICORPOS NO TRANSPLANTE DE
MEDULA?
30 % dos casos é encontrado doador HLA idêntico
Presença de DSA aumenta o risco de falha primária do enxerto (PGF)
Taxas de PGF em pacientes que apresentam DSA está entre 24 a 83%
Esses dados levam à recomendação da realização do PRA antes de transplante.
O QUE PODEMOS AJUDAR?
Quando houver transplante de medula envolvendo alguma
incompatibilidade HLA (quando pelo menos um antígeno do doador
não esteja presente na tipificação HLA do receptor).
- PRA por Luminex
- Definição da presença/ausência de DSA
- Anticorpos contra antígeno HLA não tipificado do doador
- Sugestão de tipificação
- Realização de prova cruzada por citometria de fluxo
Igen - Instituto de Imunogenética
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