Vos et al. 1995 AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23: 4407-4414

Amplified Fragment Length Polymorphism

RAPD

Molecular Ecology:

Policy on the use of RAPD markers:The appropriateness of RAPD markers for population genetic inference is increasingly questioned by our reviewers and editors because of concernes about reproducibility, dominance, and homology. Given these worries, and the ready availability of other kinds of markers that do not suffer from all of these problems, studies based primarily on RAPDs only rarely pass the scrutiny of peer review in Molecular Ecology

AFLP

1. Restrikcija ukupne stanične DNA s dva različita restrikcijska enzima

2. Ligacija adaptera

T4 DNA ligase, ATPs

3. Preamplifikacija

4. Selektivna amplifikacija *

detekcija pomoću florescencijski označenih početnica i automatskih sekvencera*

Taksonomija i filogenija:

Milla SR. Isleib TG. Stalker HT. Taxonomic relationships among Arachis sect. Arachis species as revealed by AFLP markers. [Article] Genome. 48(1):1-11, 2005 Feb.

Chao CCT. Devanand PS. Chen JJ. AFLP analysis of genetic relationships among Calathea species and cultivars.[Article] Plant Science. 168(6):1459-1469, 2005 Jun.

Koopman WJM. Phylogenetic signal in AFLP data sets [Review]. [Review] Systematic Biology. 54(2):197-217, 2005 Apr.Jang CG. Mullner AN. Greimler J. Conflicting patterns of genetic and morphological variation in European Gentianella

section Gentianella. [Article] Botanical Journal of the Linnean Society. 148(2):175-187, 2005 Jun.Zerega NJC. Ragone D. Motley TJ. Systematics and species limits of breadfruit (Artocarpus, Moraceae). [Article]

Systematic Botany. 30(3):603-615, 2005 Jul-Sep.

Kyndt T. Romeijn-Peeters E. Van Droogenbroeck B. Romero-Motochi JP. Gheysen G. Goetghebeur P. Species relationships in the genus Vasconcellea (Caricaceae) based on molecular and morphological evidence. [Article] American Journal of Botany. 92(6):1033-1044, 2005 Jun

Filogeografija:

Still DW. Kim DH. Aoyama N. Genetic variation in Echinacea angustifolia along a climatic gradient. [Article] Annals of Botany. 96(3):467-477, 2005 Sep.

Schonswetter P. Tribsch A. Vicariance and dispersal in the alpine perennial Bupleurum stellatum L. (Apiaceae). [Article] Taxon. 54(3):725-732, 2005 Aug.

Mant J. Bower CC. Weston PH. Peakall R. Phylogeography of pollinator-specific sexually deceptive Chiloglottis taxa (Orchidaceae): evidence for sympatric divergence?. [Article] Molecular Ecology. 14(10):3067-3076, 2005 Sep.Portis E. Acquadro A. Comino C. Mauromicale G. Saba E. Lanteri S. Genetic structure of island populations of wild cardoon [Cynara cardunculus L. var. sylvestris (Lamk) Fiori] detected by AFLPs and SSRs. [Article] Plant Science. 169(1):199-210, 2005 Jul.

Zaštita:

Kim SC. Lee C. Santos-Guerra A. Genetic analysis and conservation of the endangered Canary Island woody sow-thistle, Sonchus gandogeri (Asteraceae). [Article] Journal of Plant Research. 118(2):147-153, 2005 Apr.Grassi F. Cazzaniga E. Minuto L. Peccenini S. Barberis G. Basso B. Evaluation of biodiversity and conservation strategies in Pancratium maritimum L. for the NorthernTyrrhenian Sea. [Article] Biodiversity & Conservation. 14(9):2159-2169, 2005 Aug.

Li Q. Xiao M. Guo L. Wang L. Tang L. Xu Y. Yan F. Chen F. Genetic diversity and genetic structure of an endangered species, Trillium tschonoskii. [Article] Biochemical Genetics. 43(7-8):445-458, 2005 Aug.Kremer A. Caron H. Cavers S. Colpaert N. Gheysen G. Gribel R. Lemes M. Lowe AJ. Margis R. Navarro C. Salgueiro F. Monitoring genetic diversity in tropical trees with multilocus dominant markers [Review]. [Review] Heredity. 95(4):274-280, 2005 Oct

Mapiranje:

Al-Chaarani GR. Gentzbittel L. Wedzony M. Sarrafi A. Identification of QTLs for germination and seedling development in sunflower (Helianthus annuus L.). [Article] Plant Science. 169(1):221-227, 2005 Jul.Ke LP. Sun YQ. Hong DF. Liu PW. Yang GS. Identification of AFLP markers linked to one recessive genic male sterility gene in oilseed rape, Brassica napus. [Article] Plant Breeding. 124(4):367-370, 2005 Aug.Belaj A. Satovic Z. Cipriani G. Baldoni L. Testolin R. Rallo L. Trujillo I. Comparative study of the discriminating capacity of RAPD, AFLP and SSR markers and of their effectiveness in establishing genetic relationships in olive. [Article] Theoretical & Applied Genetics. 107(4):736-744, 2003 Aug.

Utvrđivanje hibridizacije:

Houghton-Thompson J. Prince HH. Smith JJ. Hancock JF. Evidence of hybridization between Lythrum salicaria (Purple Loosestrife) and L-alatum (winged loosestrife) in North America. [Article] Annals of Botany. 96(5):877-885, 2005 Oct.Hegarty MJ. Jones JM. Wilson ID. Barker GL. Coghill JA. Sanchez-Baracaldo P. Liu GQ. Buggs RJA. Abbott RJ. Edwards KJ. Hiscock SJ. Development of anonymous cDNA microarrays to study changes to the Senecio floral transcriptome during hybrid speciation. [Article] Molecular Ecology. 14(8):2493-2510, 2005 Jul.

Ostalo:

Pafundo S. Agrimonti C. Marmiroli N. Traceability of plant contribution in olive oil by amplified fragment length polymorphisms. [Article] Journal of Agricultural & Food Chemistry. 53(18):6995-7002, 2005 Sep 7.Coyle HM. Palmbach T. Ladd C. Lee HC. Tracking clonally propagated marijuana using amplified fragment length

polymorphism (AFLP) analysis. [Article] FORENSIC BOTANY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS TO CRIMINAL

CASEWORK. PG. 185-196. 2005.

Genetska raznolikost stenoendemične vrste Degenia velebitica (Degen) Hayek

(Brassicaceae)Laboratorij za Sistematiku bilja (PMF-Zagreb) i DNA laboratorij Medicinskog fakulteta u Osijeku

Coefficient

0.11 0.31 0.50 0.69 0.89

PB

T T

T

T T

T

T T

T T

T

T

T

T

S2 T

S2 PB

PB

PB PB

PB

S1

S2

S2 S1

S2

PB PB

PB

PB PB

PB

PB

PB

PB PB

S1

S1 S2

S2

S1 S1

S1 S1

S2

S2

S2

S2

S2 S2

S1 S1

S1

S1 S1

S1

S2

Degenia je nazočna na 3 lokaliteta:

• Tomišina Draga (Kapela),• Prikinuto Brdo (Srednji Velebit) i• Šugarska Duliba (Južni Velebit)

Svrha

1. Ustanoviti točnu rasprostranjenost2. Ustanoviti brojnost populacija3. Utvrditi genetsku varijabilnost4. Sugerirati mjere zaštite

4,8562,332Ukupno

4613134,4321,603Tomišina draga (veće nalazište)6

3053010,0280,073Tomišina draga (manjenalazište)

5

118511670,1170,142Prikinuto brdo (srednji Velebit)4

127912600,0860,120Kriv kuk (južni Velebit)3

128912410,1800,300Krug (južni Velebit)2

131312970,0130,094Krug hrbat (južni Velebit)1

Ndm maxNdm minPovršina (ha)Obim (km)Ime lokalitetaNo

0437,194991139,005491316,00PLOHA 3.3

20.04.2005.

Tomišina draga - veći lokalitet, sjeverniVelebit

3

12446,384991159,105491328,70PLOHA 3.2

20.04.2005.

Tomišina draga - veći lokalitet, sjeverniVelebit

3

11455,314991187,905491369,20PLOHA 3.1

20.04.2005.

Tomišina draga - veći lokalitet, sjeverniVelebit

3

81303,124990979,505490759,60PLOHA 2.1

03.08.2004.

Tomišina draga - manji lokalitet, sjeverniVelebit

2

1581176,044936325,005507717,50PLOHA 1.3

02.08.2004.

Prikinuto brdo, srednji Velebit1

1411179,834936328,105507702,70PLOHA 1.2

02.08.2004.

Prikinuto brdo, srednji Velebit1

1011182,804936320,005507691,80PLOHA 1.1

02.08.2004.

Prikinuto brdo, srednji Velebit1

brojjedinki

ndmy centroidx centroidBr. plohe

DatumIme nalazištabr.

Procjena je da na Zemlji živi oko 37000 jedinki degenije, najveći broj jedinki najmanje gustoće je na lokalitetu Tomišina draga, a najmanji broj jedinki najveće gustoće je na lokalitetu Prikinuto brdo

Na 38 ploha ukupne površine 950 m2 nađeno je 1418 primjeraka degenije

#

#

#

#

#

##

##

#

#

##

##

#

#

#

#

#

#

#

#

#

#

ÑÑÑÑ

ÑÑÑÑÑ

ÑÑÑ

ÑÑÑ

Ñ

ÑÑ

ÑÑ

Ñ

ÑÑ

ÑÑ

Ñ

ÑÑ

ÑÑÑ

ÑÑÑ

Ñ

ÑÑ

Ñ Ñ

ÑÑ

Ñ

Ñ

Ñ

ÑÑÑ

Ñ

Ñ

ÑÑÑÑ

ÑÑ

ÑÑÑÑÑÑÑÑÑ

ÑÑÑÑÑÑÑÑÑÑ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

##

#

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ Ñ

Ñ

ÑÑ

ÑÑ

Ñ

Ñ

#

# #Ñ

Ñ

ÑÑ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

ÑÑ

Ñ

Ñ

Ñ

ÑÑ

#

#

#

Ñ

Ñ

Ñ

ÑÑ

ÑÑ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

ÑÑÑÑÑÑÑ

ÑÑÑ ÑÑÑÑÑ

Ñ

ÑÑ

Ñ ÑÑÑÑÑ

Ñ

Ñ

#

##

#Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

ÑÑÑ

Ñ

Ñ

ÑÑÑÑ

Ñ

Ñ

ÑÑÑÑ

Ñ

Ñ

Ñ

ÑÑ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

Genetska varijabilnost degenije

Male populacije su genetski konzervativnije i neotpornije na promjene

Uzorkovanje:15-30 jedinki sa svakog lokaliteta, cca 200 mg tkiva sa svake jednike pohranjeno u silika-gelDNA izolacija Dneasy® Plant Mini Kit (Qiagen), cca 500 ng ukupne stanične DNA upotrebljeno za AFLP analizu (AFLP Plant Mapping kit), dobiveni rezultati su detektirani upotrebom florescencijski označenih selektivnih primera te ABI PRISM 310 sekvencera (Applied Biosystems).

ABI PRISM 310 electropherogram of DNA sample No. 1 from the population Tomišina draga

ABI PRISM 310 electropherogram of DNA sample No. 28 from the population Prekinuto brdo

ABI PRISM 310 electropherogram of DNA sample No. 50 from the population Šugarska duliba

Genetska varijabilnost degenije

Zaključci:

• Degenia ima malenu genetsku varijabilnost što je čini osjetljivom i nesposobnom da se prilagodi fluktuacijama u okolišu/staništu (klima, sukcesije, migracije, indiretkni ljudski utjecaj i dr.)

• Populacija s lokaliteta Šugarska dulibaima najvišu razinu genetske varijabilnosti unutar cijelog uzorka, te zahtijeva posebnu pažnju i može poslužiti u programima propagacije

• Populacija s lokaliteta Prekinuto brdo je najmanja populacija s izrazito malom genetskom varijabilnošću pa prema tome i potencijalno najugroženija

• Populacija s lokaliteta Tomišina draga genetski je najspecifičnija, te je donekle izdvojena od bliže srodnih velebitskih populacija

• Nastavak slijedi!!!

Coefficient

0.11 0.31 0.50 0.69 0.89

PB

T T

T

T T

T

T T

T T

T

T

T

T

S2 T

S2 PB

PB

PB PB

PB

S1 S2

S2 S1

S2

PB

PB

PB

PB PB

PB

PB PB

PB PB

S1

S1 S2

S2

S1 S1

S1

S1

S2

S2 S2

S2

S2 S2

S1 S1

S1

S1 S1

S1

S2

Analysis of Molecular Variance

Among Pops.

47%Within Pops.

53%

16,50013,50010,0009,867SSWP

14141515n

Sugarska duliba II

Sugarska duliba I

Prekinuto Brdo

Tom. DragaPop

Preporuke u zaštiti

1. Na svim lokalitetima proglasiti jasno prostorno definirane Botaničke rezervate sa zaštitnim zonama

2. Obilježiti područja znakovima upozorenja i regulirati pristup, osobito na lokalitetu Prikinuto brdo, genetski najfragilnijoj populaciji

3. Pristupiti aktivnom sprečavanju napredovanja prirodne potencijalne vegetacije uklanjanjem drvenastih eu- i sub-mediteranskih svojti na lokalitetu Tomišina draga, te jesenje šašike s velebitskih nalazišta

4. Na ovdje definiranim plohama i procedenoj metodologiji provoditi djelatnost nadgledanja promjena (u skladu s točkom 3)

5. Genetski najraznolikiju populaciju sa Šugarske dulibe koristiti u programima ex-situ zaštite i za pohranu sjemenki u banku sjemenki

Utvrđivanje srodstvenih odnosa među svojtama roda Ocimum L. Zavod za sjemenarstvo Agronomski fakultet ZagrebLaboratorij za Sistematiku bilja PMF ZagrebBiotehnički fakultet u Ljubljani

min30:00 60:00 90:00 120:00 150:00 180:00 210:00 240:00

123456789101112131415161718192021222324262728293031

ALFwin Fragmant Analyser

Allel Locator

0.1

22 O. basilicum var. thyrsiflorum

11 O. basilicum cv. Genovese

8 O. basilicum cv. Genovese

7 O. basilicum cv. Genovese

5 O. basilicum cv. Genovese

4 O. basilicum cv. Genovese

19 O. basilicum cv. Dark Opal21 O. basilicum cv. Dark Opal18 O. basilicum cv. Dark Opal

3 O. basilicum cv. Sweet Basil

14 O. basilicum var. purpurascens1 O. basilicum cv. Sweet Basil

26 O. minimum 25 O. minimum

10 O. basilicum cv. Genovese2 O. basilicum cv. Sweet Basil

20 O. basilicum cv. Dark Opal17 O. basilicum cv. Dark Opal

9 O. basilicum cv. Genovese6 O. basilicum cv. Genovese

13 O. basilicum var. difforme12 O. basilicum var. difforme

24 O. x citriodorum 23 O. americanum 16 O. basilicum var. purpurascens15 O. basilicum var. purpurascens

27 O. gratissimum 28 O. tenuiflorum

88

100

58

99

100

8459

55

57

66

79

100

7 pg

6,5 pg7 pg

4.1 pg 0,7 pg

4,0 – 4.7 pg

Veličina genoma kod kritosjemenjača varira i do 500x (npr. 1C Arabidopsis thaliana 0,16 pg ili 157 Mbp, a u vrste Fritilaria davisii 90 pg ili 88 000 Mbp)!!!

Izuzetno veliki genom stvaraju probleme u dobivanju vjerodostojnih i dovoljno varijabilnih AFLP podataka!!!

1C = 0,20 pg

1C = 0,32 pg

1C = 0,65 pg

1C = 0,843 pg

1C = 16,80 pg

1C = 23,62 pg

1C = 24,00 pg

1C = 32,35 pg

Bixa orellana

Damasonium alisma

- kod poliploida treba obratiti pažnju na “genome size”, a ne na1C vrijednost

-kvaliteta dobivenih profila za Damasonium alisma (heksaploid)je superiorna ne samo nad vrstom Tulipa sprengeri (diploid sa sličnom 1C vrijednosti) nego i nad vrstom Cephalantera longifolia (diploid s 71 % 1C vrijednosti)

-standardni AFLP protokol moguće je koristiti u rasponu “genome size” 0,3 – 12 pg

-povećanje broja baza pri selektivnoj amplifikaciji daje vjerodostojne rezultate do “genome size” vrijednosti od 15 pg

-za genome iznad 15 pg preporučljiva je upotreba markera koji su usmjereni na točno određeni dio genoma

ZAKLJUČAK

0,7190990421,425,6243,34337681,551,7482O. tenuifolium

4,1417832530,83,7531,072675232,162,1292O. basilicum var basilicum cv sweet basil

Trifolium repens standard for all (2.07 pg)

pgChiSqu.CV%Area%AreaMeanInde

xPeak

7,171625730,915,2935,781930193,391,6482O. basilicum var. purpurascens

Rod Alstroemeria = Peruanski ljiljani

1C = 20–40 pg

Trifolium repens standard for all Ocimum taxa (2.07 pg)

1991Mowforth, 1986 (Ref. 158)

2.65rotundifoliaCampanula

1991Mowforth, 1986 (Ref. 158)

0.75pubescensBetula

1991Olszewska and Osiecka, 1983 (Ref. 156)

0.85splendensSalvia

2004Grotkopp et al., 2004 (Ref. 35)

26.93nigraPinus

2000Morgan et al., 1995 (Ref. 315)9.68purpuratumLimonium

2005bZonneveld et al., 2005 (Ref. 466)2.65vulgareLimonium

2005bZonneveld et al., 2005 (Ref. 466)

13.20pumilaIris

2005bZonneveld et al., 2005 (Ref. 466)

12.45germanicaIris

1991Olszewska and Osiecka, 1982

2.10sibericaIris