“Activity and metabolic roles of the pentose phosphate cycle in several rat

tissues”

Trabalho realizado por:Ana Isabel MartinsAna Luísa DelindroAna Sofia Ferreira

Cristina AlvesInês Queirós

Bioquímica II

Introdução

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Principal função do ciclo das pentoses

Outros papéis metabólicos importantes: • Produção de NADPH para a redução da metamioglobina no músculo e da

metahemoglobina nos eritrócitos • Produção de NADH para a síntese de ribose

Via das pentoses vista como um paradigma da versatilidade metabólica: • sistema capaz de ceder diferentes produtos • tem recursos para ajustar a sua estequiometria com as necessidades celulares

desses produtos

Modelo da via das pentoses

produção de NADPH, indispensável à biossíntese de ácidos gordos

Resultado de um processo de optimização desenvolvido durante a evolução metabólica para maximizar o fluxo e minimizar o tempo de resposta.

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Avaliação da actividade desta via em diferentes tecidos (2 abordagens): • ensaio de fluxo de carbono radioactivo • ensaio da actividade das enzimas consideradas como pontos chave da

regulação

(1) Ensaio de fluxo de carbono radioactivo:

• Este método baseia-se na libertação de CO2 a partir do metabolismo da glicose fosforilada no C-1 ou no C-6, em experiências separadas.

•A partir da glicólise acoplada ao ciclo de Krebs, quer a partir do C-1 ou C-6

A libertação de CO2 acontece

•quando a glicose é fosforilada no C-1

• Nos ensaios de CO2 de cada experiência, a relação ou a diferença entre estes dois resultados dá-nos a razão entre a via das pentoses e a glicólise, através da qual a glicose é metabolizada.

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Este método, apesar de obter alguns resultados, não é completamente fiável:

• O CO2 libertado a partir do metabolismo da glicose fosforilada no C-1 e o CO2 libertado a partir da glicólise acoplada ao ciclo de Krebs, quer a partir do C-1 ou C-6 é válido apenas nos primeiros momentos da reacção porque as reacções da via das pentoses reorganizam-se com o resto dos carbonos da glicose, que podem entrar novamente na via de acordo com a sua estrutura cíclica como substrato frio.

• Para além disso, a triose, produto da via das pentoses, é usualmente incorporada no fluxo glicolítico, e pode fazer com que o C-1 e C-6 da glicose libertem CO2, apesar disto se passar na via das pentoses.

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Métodos enzimáticos utilizadosActividade da desidrogénase da glicose-6-fosfato ( partindo do pressuposto que é o ponto de regulação principal da via das pentoses ).

Não há nenhuma etapa limitante na via das pentoses

A actividade da enzima testada em condições velocidade inicial pode ser diferente da que apresenta no estado de equilíbrio.

(2) Ensaio da actividade das enzimas consideradas como pontos chave da regulação:

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Vários autores têm investigado a actividade da via mediante análise de diferentes enzimas, individualmente.

Os dados fornecem um conjunto de actividades sem fornecerem uma visão ampla da via

A via das pentoses fosfato apresenta várias reacções com estequiometria variável.

A actividade enzimática da glicose-6-P desidrogénase no tecido adiposo, glândula mamária em período de lactação e no fígado é elevada.

Método utilizado no estudo: Doseamento da actividade global da enzima com base no registo da curva do progresso da ribose ou a transformação de glicose ou ribose produzindo NADPH, em espectofotometria a 340nm. Aplicado em vários tecidos de ratos, fornecendo assim uma visão ampla desta via em diferentes tecidos.

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MATERIAL E MÉTODOS

3 Ensaios

Estudo da via das pentoses

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MATERIAL E MÉTODOS

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MATERIAL E MÉTODOSMistura incubada:•Extracto de tecido (2-3 mg proteína)•Substracto•Coenzimas

Espectrofotómetro (NADPH)

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Via completa das pentoses

Início da reacção

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Via oxidativa das pentoses

Início da reacção

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Via não oxidativa das pentoses

Início da reacção

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Resultados e discussão

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• Tempo de latência e declive dependem do tecido, da diluição da amostra e da fase testada.

• A via completa e a via não oxidativa necessitam de mais tempo para se formarem todos os intermediários desde o início

Maior tempo de latência

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• Relação linear entre actividade e concentração de proteínas todos os tecidos

• Necessário para validar o método:- avaliar a actividade nas condições mais convenientes para obter valores mensuráveis de declive;- controlo do período de latência.

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Actividade da via das pentoses e de cada fase

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• Grande variedade de actividades nos tecidos diversidade de funções metabólicas

• Via das pentoses é usada de forma mais ampla do que apenas para a síntese de ácidos gordos. Ex. músculo esquelético

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• Necessidades de NADPH na célula são maiores do que as de ribose

Vasta utilização do NADPH em processos de biossíntese e desintoxicação

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• Actividade da fase oxidativa é sempre maior do que a actividade da fase não oxidativa

Fase oxidativa – papel básico da viaFase não oxidativa – ajuste da estequiometria de acordo com as necessidade relativas de NADPH e ribose

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Relação OP/NOP

• Baixa relação: maior quantidade de ribose a ser reciclada necessidade de NADPH é maior do que a de ribose- Mucosa intestinal, rim, fígado

• Relação média - Músculo esquelético, cérebro e intestino

• Elevada relação: maior parte da ribose não é reciclada alto consumo de ribose- Glândula mamária, tecido adiposo

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Diferença OP-NOP

• Elevado valor: elevada produção de ribose(síntese de RNA)- Tecido adiposo (baixa actividade mitótica)

• Baixo valor- mucosa intestinal

• Valor moderado- pulmão

Actividade mitótica semelhante

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Síntese de RNA no tecido Síntese de proteínas de exportação- Fígado, glândula mamária lactante, mucosa

intestinal

Síntese de RNA nula Síntese de proteínas para a estrutura do tecido (enzimas, material estrutural)- Tecido adiposo, cérebro, rim, músculo

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Glândula mamária: mudança do estado não lactante para o estado lactante

• Aumento da actividade global da via das pentoses

• Manutençao da relação OP/NOP

Estrutura metabólica, no que diz respeito aos processos suportados por esta via, é a mesma.

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Elevada actividade da via das pentoses na glândula mamária, tecido adiposo e fígado

Aumento da actividade na mudança do estado não lactante para o estado lactante

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