Validation des méthodes alternatives d’analyse Détection ... · 18/12/2007 Validation initiale IPL SED Nord Rev. 0 (2006) 10/06/2011 Reconduction 1 Evolution du mix PCR 2 modalités

AdGène laboratoire 1 rue des conquérants – 14220 Thury-Harcourt – www.adgene.fr

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BIO-RAD 3 boulevard Raymond Poincaré 92430 MARNES LA COQUETTE

Marque NF Validation

Validation des méthodes alternatives d’analyse Détection et

quantification des Legionella spp

Renouvellement des kits iQ-Check® Legionella spp. pour la recherche et le

dénombrement des légionelles dans les eaux de réseau chaudes et les tours

aéroréfrigérantes

N° d’attestation BRD 07/15 – 12/07

Rapport de synthèse

Ce rapport comprend 15 pages dont 0 annexe. La reproduction de ce rapport n’est autorisée que sous sa forme

intégrale.

Version 1.1

7 juillet 2016 Annule et remplace la version précédente L’ancienne version doit être détruite.

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2 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1

Table des matières

Rappel sur la méthode commerciale d’analyse ...................................................................................... 3

Date de première attribution de la marque NF Validation ................................................................. 3

Principe de la méthode ....................................................................................................................... 3

Références du protocole : ................................................................................................................... 4

Domaine d’application ........................................................................................................................ 4

Restrictions .......................................................................................................................................... 4

Méthode de référence ........................................................................................................................ 4

Historique de la validation ...................................................................................................................... 5

Synthèse des résultats obtenus .............................................................................................................. 7

Raccordement de la solution calibrante et du matériau de référence à l’étalon primaire. ............... 7

Fonction de calibrage .......................................................................................................................... 8

Validation de la limite de détection .................................................................................................... 9

Validation de la limite de quantification ........................................................................................... 10

Etude du rendement et de la robustesse de l’extraction.................................................................. 11

Sélectivité : inclusivité et exclusivité ................................................................................................. 12

Inclusivité ....................................................................................................................................... 12

Exclusivité ...................................................................................................................................... 12

Praticabilité........................................................................................................................................ 12

Facilité d’utilisation : ..................................................................................................................... 12

Rendu de résultats rapide : ........................................................................................................... 12

Sécurisation des résultats : ............................................................................................................ 12

Etude interlaboratoire ....................................................................................................................... 13

Etude bibliographique ........................................................................................................................... 14

Bilan des réclamations utilisateurs ........................................................................................................ 14

Conclusions ............................................................................................................................................ 15


Rappel sur la méthode commerciale d’analyse

Date de première attribution de la marque NF Validation Les kits iQ Check® Legionella spp. et iQ Check® Legionella pneumophila ont été validés

pour permettre l’utilisation de la marque NF VALIDATION en 2007. Une première

reconduction a été accordée en 2011 puis deux extensions ont eu lieu en 2012 (voir chapitre

historique de la validation).

Principe de la méthode Le kit iQ Check® Legionella spp. est un kits destiné à la détection ou la quantification des

bactéries du genre Legionella dans les échantillons d’eau, à l’aide de la PCR (Réaction de

Polymérisation en Chaine) qui permet grâce à des séquences spécifiques du genre

Legionella d’être amplifiées et détectées grâce à des sondes fluorescentes.

Le principe repose sur trois étapes (voir annexe 1) :

- Filtration de l’échantillon

- Extraction de l’ADN via le kit Aquadien™ (et protocole W2 pour les échantillons

colmatant)

- Amplification des séquences cibles Legionella spp.

L’extraction de l’ADN via le kit Aquadien™ repose sur une lyse alcaline et un choc thermique

suivi d’une purification par ultrafiltration. Une fraction de cet ADN est ensuite utilisée pour

être amplifiée par PCR en temps réel.

Au cours de la réaction de PCR, les amorces s’hybrident à la région cible. La Taq

polymérase utilise alors ces amorces et les desoxynucléotides triphosphates (dNTPs) pour

élonger l’ADN créant des copies de l’ADN cible de Legionella spp. Durant la PCR, la sonde

oligonucléotidique spécifique s’hybride aux amplicons. Cette sonde est marquée par un

fluorophore qui émet une fluorescence uniquement après hybridation aux amplicons. En

présence d’ADN cible dans l’échantillon, l’intensité de la fluorescence croit

proportionnellement à l’augmentation de la quantité de produits amplifiés.

La fluorescence est mesurée directement par le module optique du thermocycleur pendant

l’étape d’hybridation. Le logiciel associé à l’appareil affiche en temps réel l’intensité de la

fluorescence mesurée en fonction du nombre de cycle d’amplification. Pour chaque réaction,

le logiciel détermine un Ct (cycle à partir duquel la fluorescence est supérieure au bruit de

fond). La lecture des valeurs de Ct permet de détecter la présence des séquences d’ADN

cibles de Legionella spp., qui signale la présence de la bactérie dans l’échantillon d’eau

analysée.

La quantification est possible en utilisant des solutions d’ADN calibré iQ Check® Legionella

Quantification Standards, raccordées à l’étalon primaire du Centre National de Référence

des Légionelle.

Pour chaque échantillon, un ADN synthétique servant de contrôle interne (IPC) est inclus

dans la solution d’amplification pour détecter d’éventuels phénomènes d’inhibition de la


PCR. L’IPC est amplifié en même temps que les séquences cibles de legionella spp., avec

les mêmes amorces, mais détecter avec un autre fluorophore.

Les kits iQ Check® Legionella spp. sont validés avec les matériels suivants :

Logiciel Opticon Monitor 3.4

CFX manager Software Industrial Diagnostic Edition v2.2

CFX manager Software Industrial Diagnostic Edition V2.2

Chassis PTC-200 C1000 C1000 touch Tête optique / bloc chauffant Chromo4 CFX96 CFX96 Deep

well touch

Références du protocole :

Aquadien™ (Réf. 3578121) : 10/2013 – Code : 881116

iQ-Check® Legionella spp (Réf. 3578102) : 10/2013 – Code : 881117

Domaine d’application

Prélèvements tous types d’eaux.

Restrictions

La certification du kit porte sur l’utilisation avec les thermocycleurs Bio-Rad Chromo™4 et

CFX96 Deep well Touch.

Méthode de référence

NF T90-471 (juin 2015) : Qualité de l’eau - Détection et quantification des Legionella et/ou

Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de

polymérisation en chaîne en temps réel (RT-PCR).

ISO/TS 12869 (Novembre 2012) : Qualité de l'eau - Détection et quantification de Legionella

spp. et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de

polymérisation en chaîne quantitative (qPCR).

Protocole de validation PCR :

Protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement

de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par

réaction de polymérisation en chaîne (PCR) V3.0


Historique de la validation

Méthode certifiée Certificat Date

approbation Objet commentaires

Labo expert

Protocole de

validation PCR

iQ-check Legionella spp.

BRD 07/15-12/07

18/12/2007 Validation initiale IPL SED Nord

Rev. 0 (2006)

10/06/2011 Reconduction 1

Evolution du mix PCR

2 modalités d’extraction

(protocole W2) Mise à jour selon

protocole version 1

IPL SED Nord

Rev. 1 (2011)

04/04/2012 Extension 1 Nouveau thermocycleur

(Deep Well touch)

Eurofins IPL Nord

Rev. 1 (2011)

27/05/2013 Extension 2 Protocole de validation V.2

NA Rev. 2 (2013)

05/11/2013 Modification Logiciel V2.1 NA Rev. 2 (2013)

09/03/2015 Modification Logiciel V2.2 NA Rev. 2 (2013)

18/12/2015 Reconduction 2

AdGene avec

extension sur test

qualitatif

Rev 3 (2015)

2007 :

La méthode a été initialement validée en 2007.

2011 :

L’étude réalisée en 2010/2011 en vue de la reconduction de validation, a tenu compte

des modifications apportées à la fois au kit validé et au protocole de validation (révision

n°1 prenant en compte la norme NF T90-471 publiée en avril 2010).

Une étude tierce partie a porté sur les 2 premières phases du protocole de validation,

afin de vérifier les performances annoncées par le fournisseur pour la nouvelle

formulation du kit iQ-Check™ L. spp :

Phase 1 : étude des limites de détection et de quantification de l’étape PCR, de la

fonction de calibrage, du raccordement à l’étalon primaire, du rendement et de la

robustesse de l’extraction en utilisant le kit Aquadien™. Le nouveau thermocycleur

CFX 96 a été mis en œuvre.

Phase 2 : étude de l’inclusivité et de l’exclusivité, de la praticabilité et de la qualité des

réactifs.

L’étude inter laboratoire réalisée en 2007, n’a pas été refaite.

Les modifications intervenues depuis la validation initiale étaient les suivantes :

Dans le kit iQ-Check® L. spp : origine différente de la Taq polymerase et évolution de

la chimie des sondes du contrôle interne (fluorophore TEXAS RED remplacé par le

fluorophore HEX).


Dans le kit Aquadien™ : 2 modalités d’utilisation selon la filtrabilité des échantillons (un

protocole W2 pour échantillons colmatants s’ajoute au protocole classique) et la

microfiltration double-tangentielle remplace la microfiltration horizontale pour l’étape de

purification de l’ADN. Les membranes et matériaux restent de même composition.

Un nouveau thermocycleur peut être utilisé : le CFX96 avec le logiciel CFX Manager

Sofware Industrial Diagnostic Edition en version V1.1.

2012 :

Une extension de validation a été prononcée en 2012 suite à l’évolution des

caractéristiques du thermocycleur CFX96, qui devient le CFX96 Deep Well Touch. Les

modifications portent sur le volume réactionnel du bloc chauffant, sur l’interface

utilisateur (clavier et écran), et sur le logiciel CFX Manager qui passe en version V1.2.

Le Bureau Technique d’AFNOR Certification a qualifié ces évolutions comme mineures

et sans impact sur les performances du kit, aucun essai supplémentaire n’a donc été

réalisé.

2013 :

Fin mai 2013, la validation de la méthode iQ-Check® L. spp a été étendue à la norme

ISO/TS 12869. Aucun complément d’étude de validation n’a été nécessaire : les essais

précédemment réalisés selon la norme NF T90-471 répondent aux exigences de la

norme ISO/TS 12869 et font suite au passage à la révision 2 du protocole de

validation.

Novembre 2013 : Evolution de la version du logiciel CFX manager IDE v2.1. Aucun

complément d’étude de validation n’a été nécessaire

2015 :

Mars 2015 : Evolution de la version du logiciel CFX manager IDE v2.2. Aucun

complément d’étude de validation n’a été nécessaire

Octobre 2015 : reconduction de la méthode iQ-Check® L. spp avec extension sur la

détection (recherche qualitative) Legionella spp sans test supplémentaire. Le Bureau

Technique d’AFNOR Certification a qualifié cette évolution comme sans impact sur les

performances du kit, aucun essai supplémentaire n’a donc été réalisé.


Synthèse des résultats obtenus Les résultats présentés ci-dessous ont été obtenus avec la révision V1.0 du protocole de

validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella

et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de

polymérisation en chaîne (PCR). Ils sont également conformes avec la version V2.0 car elle

ne contient aucune modification majeure engendrant d’étude complémentaire.

Raccordement de la solution calibrante et du matériau de référence à l’étalon

primaire.

Méthodologie

Le raccordement de la solution calibrante de travail à l’étalon primaire est effectué pour

couvrir le domaine de quantification avec 3 gammes de solutions d’ADN calibré iQ-Check®

Legionella spp. et comprenant 4 niveau de concentration d’unités génome de Legionella

pneumophila sérogroupe (QS1, QS2, QS3, QS4) et 3 gammes indépendantes d’étalon

primaire préparées en ciblant les 4 niveaux de concentration de la gamme d’ADN calibré iQ-

Check® Legionella Quantification Standards.

Le raccordement du matériau de référence à l’étalon primaire a été évalué en analysant les

résultats de deux dépôts du matériau de référence fourni avec le kit iQ-Check® Legionella

spp..

Les 6 gammes indépendantes obtenues et le matériau de référence ont été analysées avec

le kit iQ-Check® Legionella spp. au cours de la même série d’amplification sur le

thermocycleur CFX96.

Résultats

Les paramètres analysés pour évaluer le raccordement des solutions calibrantes et du

matériau de référence à l’étalon primaire sur le thermocycleur CFX96 et chromo 4sont repris

dans le tableau suivant :

Droite de régression Corrélation Efficacité (%)

Gamme de référence (CFX96) C(t) moyen = -3,198.log(x) + 39,076 0,998 105,5

Gamme de référence (Chromo 4) C(t) moyen = -2,891.log(x) + 38,674 0,995 121,75

Solution calibrante Erreur de calibrage

QS1 QS2 QS3 QS4

Par niveau (CFX96) 0,07 0,20 0,14 0,07

Par niveau (Chromo 4) 0,03 0,30 0,23 0,16

Moyenne (CFX96) 0,12

Moyenne (Chromo 4) 0,18*

Equivalence des pentes (CFX96) 0,00

Equivalence des pentes (Chromo 4) 0,13

Matériau de référence Erreur de calibrage

CFX96 0,19

Chromo 4 0,19

* Avec le thermocycleur Chromo 4, l’erreur de calibrage de la solution calibrante est de 0,18 log.


Néanmoins, l’équivalence des pentes de la gamme de référence et de la solution calibrante est vérifiée. L’erreur de calibrage de la solution calibrante est inférieure à 0,15log. Les pentes de la

gamme de référence et de la solution calibrante sont équivalentes.

Conclusion

Sur le thermocycleur CFX96, la solution calibrante et le matériau de référence du kit iQ-

Check® Legionella spp satisfont les conditions de raccordement à l’étalon primaire.

Sur le thermocycleur Chromo 4, la solution calibrante satisfait globalement les conditions de

raccordement à l’étalon primaire. Le matériau de référence du kit iQ-Check® Legionella spp

satisfait les conditions de raccordement à l’étalon primaire.

Fonction de calibrage

Méthodologie

L’étude de la fonction de calibrage est réalisée en déposant 5 gammes différentes de

solutions d’ADN calibré iQ-Check® Legionella Quantification Standards (comprenant 4

niveaux de concentration d’unités génomes de Legionella pneumophila), fournie avec le kit

iQ-Check® Legionella spp..

Les 5 mesures ont été effectuées avec le kit iQ-Check® Legionella spp. pour chaque niveau

de concentration dans les conditions de reproductibilité.

Résultats

Dans ces conditions, l’équation de la droite de régression et l’efficacité de la réaction de PCR

ont été définis. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.

Droite de régression -3,197.log(x) + 41,347

Efficacité 105,5%

Performances de la régression linéaire :

QS1 QS2 QS3 QS4

Biais 0,06 -0,10 0,00 0,04

Ecart type 0,12 0,06 0,08 0,05

Exactitude de linéarité

0,13 0,12 0,08 0,07

Incertitude de linéarité

0,42 0,37 0,27 0,22

Conclusion

Pour chaque niveau de la gamme, la régression linéaire satisfait l’exigence d’exactitude

inférieure à 0,15. La linéarité est donc vérifiée sur tout le domaine couvert par la gamme de

solutions d’ADN calibré iQ-Check® Legionella Quantification Standards fournie avec le kit

iQ-Check® Legionella spp..


Validation de la limite de détection

Méthodologie

L’évaluation de la limite de détection a été réalisée à partir de 30 dilutions indépendantes

d’ADN de Legionella pneumophila à 5 UG par PCR. Les amplifications en duplicat ont été

faites dans des conditions de répétabilité. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.

Résultats

Conclusion

Les 30 duplicats sont positifs, la limite de détection est donc validée pour 5 UG/puits de

PCR.

L’ensemble des Ct présentés dans le tableau ci-dessus est inférieur à la l’intercept. La

détection qualitative est conforme.


Validation de la limite de quantification

Méthodologie

L’évaluation de la limite de quantification est réalisée en analysant 30 dilutions

indépendantes de Legionella pneumophila à 15 UG par puit de PCR. Les 30 solutions ont

été amplifiées simultanément en duplicat. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.

Résultats

Résultats Valeurs théoriques ou critères de validation

Moyenne x’ (Log UG/puits) 1,309 1,279 Ecart-type (Log UG/puits) 0,097 Biais 0,030 Exactitude de LQ 0,101 0,15 Incertitude de la LQ 0,207

Conclusion

La valeur de l’exactitude de la limite de quantification estimée à 0,101. Cette valeur est

inférieure à 0,15. La limite de quantification à 0,15 UG/puits PCR du kit iQ-Check®

Legionella spp. est validée.

Seuil de positivité

Le manuel utilisateur prévoit un Cq de 43 au-delà duquel les échantillons sont considérés

comme étant inférieure à la limite de détection.

L’ensemble des valeurs obtenues pour caractériser la limite de détection a un Cq plus faible

que celui de 43. Cette valeur correspond donc bien à un seuil de positivité comme étant

inférieure à la limite de détection.


Etude du rendement et de la robustesse de l’extraction

Méthodologie

Les études de rendement ont été réalisées avec le kit d’extraction Aquadien™ (pour les eaux

propres), et Aquadien W2 (pour les eaux colmatantes). Le rendement a été évalué sur 10

échantillons indépendants, artificiellement contaminés à deux niveaux de concentration

(1000 et 100 000 UG/puit PCR) de Legionella pneumophila ATCC 33152 et pour 3 matrices

différentes : eau stérile, eau chaude sanitaire, eau de tour aéro-réfrigérante.

Les échantillons ont été artificiellement contaminés par la suspension mère dont la

concentration a été déterminée par 3 quantifications après une étape d’extraction de l’ADN

par le protocole de lyse directe sur 3 aliquots. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.

Résultats

Rendement

Protocole Aquadien Protocole Aquadien W2

Log Moyenne Log Moyenne

Eau chaude sanitaire 1000 UG/L 100 000 UG/L

-0,29 -0,39

-0,34 -0,16 -0,45

- 0,30

Eau de tour aéroréfrigérante

1000 UG/L 100 000 UG/L

-0,09 -0,31

-0,20 -0,45 -0,47

- 0,46

Eau minérale 1000 UG/L 100 000 UG/L

-0,25 -0,42

-0,33 -0,55 -0,46

- 0,50

Rendement moyen (log) -0,29 -0,41 Variance (log) 0,04 0,03 Incertitude globale élargie (log) 0,71 0,89

Conclusion

L’étude du rendement et de la robustesse de la méthode permet d’évaluer le rendement

moyen de :

- la méthode Aquadien à -0,29 log

- la méthode Aquadien W2 à -0,41 log

Les rendements avec les deux méthodes d’extraction sont conformes aux critères -0,6 log / +0,3 log (ce qui correspond à un rendement compris entre 25 % et 199 %).


Sélectivité : inclusivité et exclusivité Pour chacune des souches testées, l’ADN a été extrait à partir d’une suspension bactérienne

pure.

Inclusivité

Les essais d’inclusivité ont été réalisés sur des extraits d’ADN à une concentration d’environ

100 UG/puits PCR, estimée à partir de la suspension bactérienne par une mesure de la DO

à 600 nm.

Les ADN des 35 souches Legionella testées (15 Legionella pneumophila et 20 Legionella

spp) ont montré une amplification.

Exclusivité

Les essais d’exclusivité ont été réalisés sur des extraits d’ADN à une concentration d’environ

10 000 UG/puits PCR estimée à partir de la suspension bactérienne par une mesure de la

DO à 600 nm.

Les ADN des 16 souches testées montrent l’absence d’amplification sauf pour 5 d’entre elles

où une très faible amplification a été observée.

Conclusion

La sélectivité du kit iQ-Check® Legionella spp. est satisfaisante.

Praticabilité

Facilité d’utilisation : les réactifs sont tous fournis dans les kits, et sont prêts à l’emploi. Les

séries d’analyse de 1 à 30 échantillons, dans le cadre d’une quantification, sont faciles à

gérer. Un technicien connaissant les techniques de microbiologie, biologie moléculaire ainsi

que le thermocycleur et son logiciel peut être formé en 1 jour.

Rendu de résultats rapide : la durée des différentes phases est compatible avec un délai de

rendu des résultats court (5 heures).

Sécurisation des résultats : elle est garantie par l’utilisation d’un contrôle interne d’inhibition

(dans le même puits que l’échantillon), et par un logiciel d’analyse des résultats. L’utilisation

du logiciel assure en outre la traçabilité complète des informations.


Etude interlaboratoire

Méthodologie

Une étude inter-laboratoire a été réalisée en 2007, avec 14 laboratoires collaborateurs. Les

résultats d'un laboratoire n'ont pas été pris en compte en raison d’un problème technique

ayant conduit à l’invalidation de l’étalonnage. Au final, 13 laboratoires ont été retenus pour

l’exploitation statistique.

La finalité de cette étude est d’évaluer la fidélité (répétabilité et reproductibilité) de la

méthode iQ-Check® Legionella spp. :

- pour l’étape d’amplification génique seule (envoi de deux solutions d’ADN de L.

anisa et L. pneumophila sg1 à deux niveaux de concentration différents);

- pour l’ensemble de l’analyse (concentration, lyse, extraction, purification et

amplification génique) sur des suspensions bactériennes caractérisées de L.

pneumophila et Escherichia coli (CIP 54.8) à 2 niveaux de concentration

différents;

- pour l’ensemble de l’analyse en situation réelle (eau chaude sanitaire

naturellement contaminée en L. pneumophila et Legionella non pneumophila).

- Egalement, une eau garantie sans ADN de Legionella a été envoyée.

Résultats

Type d’échantillons

Solution

d’ADNs

calibrés

Eau de distribution

dopée

Echantillon

naturel

Niveaux de

dopage

(UG/L)

L. pneumophila

ATCC 33152

2000

UG/µl

20000

UG/µl

4000

UG/200

ml

40000

UG/200

ml

Eau chaude

sanitaire

naturellement

contaminée

L. anisa 500

UG/µl

5000

UG/µl

1000

UG/200

ml

10000

UG/200

ml

E. coli

5000

UG/200

ml

50000

UG/200

ml

Nombre de

laboratoires

participant 14 14 14 14 14

retenus 13 13 13 13 13


Test

d’homogénéité

Nbre d’analyses 20 20 9 9 9

Moyenne (Log) 2.91 3.97 3.42 4.41 3.76

Résultats

Moyenne (Log) 3.02 4.11 3.52 4.47 3.69

r (Log) 0.18 0.15 0.28 0.34 0.46

R (Log) 0.43 0.32 0.72 0.66 0.8

Sr (Log) 0.06 0.06 0.10 0.12 0.16

SR (Log) 0.14 0.10 0.24 0.20 0.23

Conclusion

Les valeurs de répétabilité en r (Log), se situent autour de 0,15 pour les solutions d’ADN

(étape de PCR uniquement), et autour de 0,3 pour les suspensions bactériennes (méthode

globale), ce qui est acceptable. Cela signifie qu’au sein d’un même laboratoire, on s’attend à

des écarts de mesure, sur un même échantillon, de l’ordre d’un facteur 2. La répétabilité

n’apparaît donc pas comme une source majeure d’erreur.

Les valeurs de reproductibilité en R (Log) se situent autour de 0,4 pour les solutions d’ADN

(étape de PCR uniquement), et autour de 0,7 pour les suspensions bactériennes (méthode

globale). Par rapport à la répétabilité, cet ordre de grandeur reste conforme à ce que l’on a

l’habitude de rencontrer en analyse microbiologique de l’environnement. Ce qui signifie

qu’entre deux laboratoires, on s’attend à des écarts de mesure, sur un même échantillon, de

l’ordre d’un facteur 5. La reproductibilité ne participe donc pas de manière démesurée à la

dispersion des résultats.

Etude bibliographique

- Pas de publications recensées depuis la dernière parution de la méthode

- Pas de validations externes réalisées par un autre organisme de certification

Bilan des réclamations utilisateurs

Pas de réclamation client utilisateur.


Conclusions

Les performances de la méthode iQ-Check® Legionella spp. sont conformes aux exigences des normes NF T90-471 et ISO/TS 12869 ainsi qu’au protocole de validation AFNOR : Protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) V3.0. Les modifications entre la version 2.0 et 3.0 protocole de validation AFNOR concerne le seuil de positivité (détection qualitatif) et n’engendre pas d’étude complémentaire.

Le kit iQ-Check® Legionella spp est un kit validé pour la détection et la Détection et Quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (qPCR)

IPL santé, environnement durables Nord – 1 rue du Professeur Calmette – 59046 LILLE cedex

iQ-Check™ Quanti Legionella spp. - Ext 2011 - v01

ANNEXE C

RACCORDEMENT A L’ETALON PRIMAIRE

Rac

cord

emen

t

Rac

cord

emen

t sur

CFX

Rac

cord

emen

t sur

Chr

omo

4

Gam

me

de ré

fére

nce

Gam

me

de ré

fére

nce

Niv

eaux

test

és(U

G/p

uits

)15

420

4200

4200

0N

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stés

(UG

/pui

ts)

1542

042

0042

000

log

(UG

/Pui

ts)

1,17

609

2,62

325

3,62

325

4,62

325

log

(UG

/Pui

ts)

1,17

609

2,62

325

3,62

325

4,62

325

C(t)

obt

enus

Gam

me

étal

on 1

35,4

231

,17

27,6

224

,14

C(t)

obt

enus

Gam

me

étal

on 1

35,2

731

,28

28,2

624

,99

35,3

430

,90

27,5

524

,31

34,8

531

,37

28,1

825

,00

Gam

me

étal

on 2

35,3

330

,83

27,5

424

,47

Gam

me

étal

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35,0

931

,26

28,4

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,02

35,2

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35,0

131

,31

28,2

924

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724

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35,0

731

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28,3

525

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eaux

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/pui

ts)

1939

039

0039

000

Niv

eaux

est

imé

(UG

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ts)

1939

039

0039

000

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(UG

/Pui

ts)

1,27

875

2,59

106

3,59

106

4,59

106

log

(UG

/Pui

ts)

1,27

875

2,59

106

3,59

106

4,59

106

C(t)

obt

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Gam

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31,8

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24,7

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232

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29,0

625

,95

35,2

931

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27,9

624

,70

35,0

632

,09

29,0

926

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Gam

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calib

234

,99

31,3

428

,03

24,5

2G

amm

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34,9

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28,8

725

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35,6

931

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28,0

924

,63

35,0

532

,12

29,0

425

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Gam

me

calib

335

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31,3

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24,6

7G

amm

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lib 3

35,1

832

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525

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631

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724

,54

35,0

131

,92

28,8

25,7

6

C(t)

moy

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ar n

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31,4

428

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24,6

3C

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35,0

732

,05

28,9

725

,87

Qua

ntité

retro

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par

niv

eau

(Lo

1,20

2,39

3,45

4,52

Qua

ntité

retro

uvée

par

niv

eau

(Lo

1,25

2,29

3,36

4,43

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eur d

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ar n

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u0,

070,

200,

140,

07E

rreu

r de

calib

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niv

eau

0,03

0,30

0,23

0,16

moy

enne

moy

enne

Vér

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ts)

540

Val

eur d

e ré

fére

(UG

/pui

ts)

540

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(UG

/Pui

ts)

2,73

239

log

(UG

/Pui

ts)

2,73

239

C(t)

obt

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MR

130

,93

C(t)

obt

enus

MR

131

,34

MR

230

,99

MR

231

,31

C(t)

moy

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,96

C(t)

moy

en31

,33

Qua

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uvée

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niv

eau

(Log

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54Q

uant

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trouv

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ar n

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2,54

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19E

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0,19

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réla

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(r2 )

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0,00

0,12

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98

39,0

76

0,99

8

105,

466

Cor

réla

tion

(r2 )

0,99

5

Effi

caci

té (%

)12

1,75

2

0,18

0,13

38,6

74





ANNEXE D

FONCTION DE CALIBRAGE

Fonction de calibrage

Niveau (UG/puits) x i 19 390 3900 39000 19 390 3900 39000x' i =Log(x i ) 1,28 2,59 3,59 4,59 1,28 2,59 3,59 4,59

gamme gamme 1 37,08 33,33 29,60 26,49yij 36,49 33,27 29,84 26,72

gamme 2 37,02 33,18 29,44 26,36k=5 répétitions 36,77 33,33 29,71 26,24

gamme 3 37,78 33,30 29,69 26,5436,69 33,31 29,99 26,46

gamme 4 37,32 33,81 30,14 26,6537,16 33,32 30,32 26,84

gamme 5 37,40 33,57 30,01 26,5236,90 33,41 30,05 26,50

Moyenne mi 37,06 33,38 29,88 26,53 37,06 33,38 29,88 26,53

Estimation de la droite de régression

Pente a = -3,197Ordonnée à l'origine b = 41,347

Estimation de l'efficacité

Efficacité e = 105,5%

Vérification des performances de la régression linéaire

Niveau x i 19 390 3900 39000 19 390 3900 39000x' i =Log(x i ) 1,28 2,59 3,59 4,59 1,28 2,59 3,59 4,59

gamme gamme 1 1,33 2,51 3,67 4,65yij 1,52 2,53 3,60 4,57

gamme 2 1,35 2,55 3,72 4,69k=5 répétitions 1,43 2,51 3,64 4,73

gamme 3 1,12 2,52 3,65 4,631,46 2,51 3,55 4,66

gamme 4 1,26 2,36 3,51 4,601,31 2,51 3,45 4,54

gamme 5 1,23 2,43 3,55 4,641,39 2,48 3,53 4,64

Moyenne mi 1,34 2,49 3,59 4,63 1,34 2,49 3,59 4,63

Biais 0,06 -0,10 0,00 0,04

Ecart type S = 0,12 0,06 0,08 0,05

Exactitude de linéarité ELIN = 0,13 0,12 0,08 0,07

Incertitude de linéarité ULIN = 0,42 0,37 0,27 0,22

1,31 2,46 3,54 4,64

1,28 2,43 3,48 4,57

1,29 2,52 3,60 4,64

1,39 2,53 3,68 4,71

1,43 2,52 3,64 4,61

37,15 33,49 30,03 26,51

37,24 33,57 30,23 26,75

37,24 33,31 29,84 26,50

36,90 33,26 29,58 26,30

36,79 33,30 29,72 26,61

Droite de calibrage

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00x'i

C(t)

gamme 1

gamme 2

gamme 3

gamme 4

gamme 5





ANNEXE E

LIMITE DE DETECTION

Limite de détection à 5UG

Echantillons à la concentration 5UG

Well Sample C(t) I.C. C(t) SQe1 37,88 33,12 6,445

A02 e1 37,73 33,12 7,232B02 e2 39,38 36,36 1,982C02 e2 38,41 34,8 4,257D02 e3 37,65 34,56 7,690E02 e3 38,19 34,14 5,046F02 e4 37,92 34,09 6,237G02 e4 38,12 34,01 5,328H02 e5 38,25 32,97 4,826A03 e5 37,77 33,71 7,028B03 e6 38,99 35,71 2,685C03 e6 38,34 34,12 4,496D03 e7 38,1 34,39 5,432E03 e7 38,02 34,24 5,775F03 e8 39,21 34,53 2,268G03 e8 37,86 34,21 6,526H03 e9 37,39 32,78 9,424A04 e9 37,82 33,79 6,734B04 e10 41,57 39,12 0,356C04 e10 37,97 34,42 5,989D04 e11 38,9 34,49 2,887E04 e11 38,13 34,04 5,271F04 e12 38,93 34,35 2,816G04 e12 37,85 34,08 6,557H04 e13 37,15 32,87 11,400A05 e13 38,08 34,53 5,489B05 e14 38,19 34,68 5,041C05 e14 38,56 34,31 3,786D05 e15 37,91 34,44 6,301E05 e15 38,43 34,93 4,193F05 e16 38,04 34,35 5,667G05 e16 37,42 34,07 9,195 Contrôle Gamme StandardH05 e17 37,32 32,73 9,950A06 e17 38,47 35,11 4,058 Well Content C(t) I.C. C(t) SQB06 e18 40,81 37,79 0,645 A01 QS1 36,02 33,04 19,00C06 e18 38,08 34,36 5,515 B01 QS1 36,06 33,22 19,00D06 e19 37,78 34,27 6,964 C01 QS2 34,01 35,6 390,00E06 e19 37,9 34,15 6,307 D01 QS2 42,26 N/A 390,00F06 e20 38,16 34,63 5,147 E01 QS3 29,99 34,11 3900,00G06 e20 39,2 34,48 2,280 F01 QS3 29,72 33,4 3900,00H06 e21 37,28 33,31 10,260 G01 QS4 26,4 33,75 39000,00A07 e21 41,82 35,38 0,293 H01 QS4 26,37 33,98 39000,00B07 e22 39,31 35,69 2,096C07 e22 37,61 33,71 7,956D07 e23 37,95 34,28 6,091 Contrôle négatifE07 e23 38,17 34,39 5,128F07 e24 38,14 34,38 5,261 Content C(t) I.C. C(t) SQG07 e24 37,92 34,65 6,214 G09 Neg Ctrl N/A 34,62 N/AH07 e25 37,33 33,41 9,875 H09 Neg Ctrl N/A 34,39 N/AA08 e25 37,47 33,94 8,870B08 e26 37,84 34,55 6,629C08 e26 37,97 34,48 5,997D08 e27 38,04 34,37 5,654E08 e27 37,53 34,6 8,487F08 e28 38,98 34,64 2,712G08 e28 38,15 34,36 5,218H08 e29 37,74 33,16 7,195A09 e29 41,52 39 0,372B09 e30 38,16 34,32 5,146C09 e30 38,22 34,72 4,908D09





ANNEXE F

LIMITE DE QUANTIFICATION

Limite de quantification LQ à 15UG

Gamme de calibrage QS

UG/puits Moy Log (UG/puits) C(t)

QS1 1,278753601 36,87

1,278753601 37,23

QS2 2,591064607 33,65

2,591064607 33,71

QS3 3,591064607 29,73 Pente -3,241

3,591064607 29,87 Ordonnée origine 41,514

QS4 4,591064607 26,41 Corrélation (r2) 0,992

4,591064607 26,51 Efficacité (%) 103,474

LQPCR à 15UG : 30 mesures en réplicat

Réplicat Moyenne UG/puits Moy UG/puits x' (Log) Moyenne x'LQ-1 37,55 16,7 1,223

37,87 13,4 1,124LQ-2 37,57 16,5 1,217

37,27 20,4 1,309LQ-3 37,17 22,0 1,340

37,08 23,3 1,368LQ-4 37,21 21,4 1,328

37,49 17,5 1,241LQ-5 37,53 17,0 1,229

37,63 15,8 1,198LQ-6 37,73 14,7 1,167

37,21 21,3 1,328LQ-7 36,83 27,9 1,445

37,00 24,8 1,393LQ-8 37,07 23,5 1,371

37,21 21,3 1,328LQ-9 37,73 14,8 1,167

37,68 15,2 1,183LQ-10 37,82 13,8 1,140

38,15 11,0 1,038LQ-11 37,25 20,7 1,315

37,09 23,1 1,365LQ-12 36,54 34,4 1,534

37,06 23,7 1,374LQ-13 37,35 19,3 1,285

37,26 20,5 1,312LQ-14 37,56 16,7 1,220

37,57 16,4 1,217LQ-15 37,50 17,3 1,238

37,04 24,0 1,380LQ-16 36,48 35,7 1,553

37,37 19,0 1,278LQ-17 37,13 22,5 1,352

37,43 18,3 1,260LQ-18 37,39 18,7 1,272

37,65 15,6 1,192LQ-19 36,69 30,8 1,488

37,00 24,7 1,393LQ-20 36,57 33,5 1,525

37,13 22,5 1,352LQ-21 37,70 15,0 1,177

37,18 21,8 1,337LQ-22 37,75 14,5 1,161

37,68 15,2 1,183LQ-23 37,29 20,2 1,303

37,25 20,7 1,315LQ-24 37,00 24,7 1,393

36,94 25,8 1,411LQ-25 37,29 20,1 1,303

37,62 15,9 1,201LQ-26 37,55 16,7 1,223

36,63 32,1 1,507LQ-27 36,54 34,3 1,534

37,02 24,4 1,386LQ-28 36,83 28,0 1,445

36,99 24,9 1,396LQ-29 37,58 16,4 1,214

37,15 22,3 1,346LQ-30 37,12 22,8 1,356

37,34 19,5 1,288

1,309

0,097

0,030

0,101

0,207

37,37

37,23

37,46

37,09

36,78

36,91

37,44

37,72

37,27

36,97

37,28

37,52

36,85

36,85

37,31

37,57

37,27

36,93

37,7

37,99

37,17

36,8

37,58

37,47

36,91

37,14

37,71

37,42

37,13

37,35

C(t) UG/puits

Biais

Incertitude ULQ

Ecart-type s

Moyenne x'

Exactitude de LQ ELQ

1,50E+01

1,84E+01

2,26E+01

2,63E+01

1,94E+01

1,64E+01

2,19E+01

1,50E+01

1,24E+01

1,80E+01

1,99E+01

2,80E+01

2,77E+01

1,72E+01

2,04E+01

2,73E+01

2,07E+01

1,66E+01

1,49E+01

2,44E+01

2,04E+01

2,52E+01

2,11E+01

2,94E+01

2,64E+01

1,285

1,214

1,248

1,93E+01

1,80E+01

1,84E+01

2,91E+01

1,173

1,263

1,354

1,419

1,349

1,175

1,089

2,24E+01

39000

3900

390

19

1,340

1,454

1,298

1,218

1,309

1,416

1,306

1,232

1,440

1,439

1,257

1,172

1,309

1,402

1,252

1,365

1,460

1,420

1,280

1,322





ANNEXE G

RENDEMENT ET ROBUSTESSE

Ren

dem

ent e

t rob

uste

sse

Rob

uste

sse

Eau

Cha

ude

San

itaire

Prot

ocol

e A

quad

ien

Prot

ocol

e A

quad

ien

W2

Niv

eau

N1

100

000

UG

/LU

G/p

uits

A (l

og)

C(t)

UG

/pui

tsM

oyen

ne U

G/p

uits

B (l

og)

log

%U

G/p

uits

A (l

og)

C(t)

UG

/pui

tsM

oyen

ne U

G/p

uits

B (l

og)

log

%E

C1N

16,

55E

+02

5,02

29,4

31,

31E

+03

EC

2N1W

2,32

E+0

46,

5725

,79

3,27

E+0

429

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