V8 Immunodisplacement Kit - Diachel 2011-02(3) [800300-Multi... · The V8 Immunodisplacement Kit is intended for the ... Immunodisplacement is a subtractive analytical ... further

V8 Immunodisplacement Kit

REF 800300

HL-2-2152P 2011-02(3) [Multi Language V8 Immunodisplacement Kit].indd 1 11/10/11 10:24:53

2



en

3

ContentsEnglish ..................................................................................................................... 5

Français ..................................................................................................................11

Deutsch ...................................................................................................................19

Italiano ................................................................................................................... 27

Español .................................................................................................................. 35

Português ............................................................................................................... 43

Ελληνικά ................................................................................................................51

Русский ................................................................................................................. 59


4



en

5

EnglishINTENDED PURPOSEThe V8 Immunodisplacement Kit is intended for the separation and identification of monoclonal gammopathies by capillary zone electrophoresis. This technique separates proteins on the basis of their net charge in an alkaline buffer solution in combination with their differing interaction with the wall of the silica capillary. Immunotyping of gammaglobulins is achieved by testing aliquots of sample with a panel of monospecific antisera. The complex formed by the test antisera and it’s target protein has a modified migration profile and is therefore displaced from the standard serum protein electropherogram. By comparing the results from the test panel with a reference analysis the immunoglobulin type present can be determined by the specific removal or reduction of the abnormal spike from the CE electropherogram.

The greatest demand for Immunodisplacement is in the clinical laboratory, where it is used primarily for the detection of monoclonal gammopathies. A monoclonal gammopathy is a primary disease state in which a single clone of plasma cells produces elevated levels of an immunoglobulin of a single class and type. Such immunoglobulins are referred to as monoclonal proteins, M-proteins or paraproteins. Their presence may be of a benign nature or of uncertain significance. In some cases, they are indicative of a malignancy, such as multiple myeloma or Waldenström’s macroglobulinaemia. Differentiation must be made between polyclonal and monoclonal gammopathies, as polyclonal gammopathies are a secondary disease state due to clinical disorders such as chronic liver disease, collagen disorders, rheumatoid arthritis and chronic infection.

Urinary proteins are derived primarily from plasma proteins that filter through the kidney. The appearance of abnormal plasma proteins in the urine is of great value in evaluating renal function. The appropriate study of proteinuria should include quantitative and qualitative assessment of the type and amount of proteins excreted1-5. The combination of electrophoretic separation of urine proteins, coupled to the identification of specific protein types by immunoprecipitation allows the differentiation of several types of proteinuria - Physiological, Glomerular (selective and non-selective), Tubular and proteinuria associated with Dysglobulinaemias1-5.

WARNINGS AND PRECAUTIONSThe reagents contained in this kit are for in-vitro diagnostic use only. Do not ingest or pipette by mouth any kit component. Wear gloves when handling all kit components. Refer to the product safety data sheet for risk and safety phrases and disposal information.


6


COMPOSITIONAnti-human IgG antisera. REF HL-3-2125SA (1 x 50 tests).1. Anti-human IgA antisera. REF HL-3-2126SA (1 x 50 tests).2. Anti-human IgM antisera. REF HL-3-2127SA (1 x 50 tests).3. Anti-human kappa antisera. REF HL-3-2128SA (1 x 50 tests).4. Anti-human lambda antisera. REF HL-3-2129SA (1 x 50 tests). 5. Each bottle contains enough antisera for the completion of 50 tests. The antisera is ready for use and should be placed in the appropriate location on the Helena V8 instrument as instructed in the operator manual.Instructions for Use. 6. Each kit contains Instructions for Use.

STORAGE AND SHELF-LIFEAnti-human IgG antisera.1. Anti-human IgA antisera.2. Anti-human IgM antisera.3. Anti-human kappa antisera. 4. Anti-human lambda antisera. The antisera should be stored at 2…8°C and is stable until the expiry date indicated on the label. Opened bottles are stable for 4 weeks when stored at 2…8°C. Ensure antisera vials are re-capped when not in use to minimise evaporative losses. The antisera solutions are clear and colourless. Discard the antisera solutions if changes to their appearance are noted, for example colouration or cloudiness indicating bacterial contamination. DO NOT FREEZE THE ANTISERA SOLUTIONS.

ITEMS REQUIRED BUT NOT PROVIDEDREF 830100 V8 Storage Buffer REF 830200 V8 Maintenance Buffer REF 800200 V8 Serum Protein 6-band Kit (If conducting 6-band analysis) REF 800500 V8 Serum Protein SPE Kit (if conducting SPE analysis) REF 800800 V8 Serum Protein 6-band Zoom Kit (if conducting 6-band Zoom analysis) REF 830400 V8 Clinical Waste Drawer Pack


en

7

OPTIONAL ITEMSREF 800410 V8 Urine Preparation Buffer SP6 REF 800411 V8 Urine Preparation Buffer SP6 Zoom REF 800412 V8 Urine Preparation Buffer SPE REF VS2002 Sartorius VivaSpin 20 Centrifugal Concentrators REF GEHE 17-0853-02 GE Healthcare NAP-5 Desalting Columns - if conducting urine immunodisplacement

REF 820500 V8 Free kappa / Free lambda Kit REF 821400 V8 Anti-IgD / Anti-IgE Kit

SAMPLE COLLECTION AND PREPARATIONFor serum protein analysis, freshly collected serum is the specimen of choice as plasma samples will contain a large fibrinogen band between the beta and gamma fractions. Samples can be stored at 2…8°C for up to 7 days and up to 1 month at -20°C. If samples are to be stored frozen, they should be refrigerated immediately and frozen within 8 hours of collection. Storing samples at 2…8°C can result in protein degradation, particularly, but not exclusively of complement fractions. Consequently, after 7 days storage at 2…8°C detection of a distinct beta-2 region may no longer be possible. DO NOT store samples at room temperature - the sample will degrade rapidly. Samples which contain cryoglubulins may become viscous or tubid after refrigeration or freezing. It is advisable to warm these samples to room temperature before analysis. For urine analysis, freshly collected urine (24 hour collection) is the specimen of choice. Samples can be stored at 2…6°C for up to 7 days. For longer storage periods, it is recommended to store samples at -70°C, for up to 1 month. DO NOT store samples at -20°C. Urine samples must be de-salted before analysis on the V8 system, using one of the optional urine preparation buffer and device combinations listed above.


8


STEP BY STEP PROCEDUREEnsure that the waste container drawer is on-board.1. Before switching on the V8, ensure that Storage Buffer, Maintenance Buffer and 2. disposable cups are on-board and in their correct positions. For correct installation of all consumables, please refer to the operator manual.Launch Platinum 4V and begin a new CE session. In Platinum 4V, select ‘CE 3. SYSTEM’ from the drop down menu, click ‘DEFAULT METHOD’ and ensure the relevant Immunodisplacement assay is selected (refer to operator manual). For reflex testing or individual test ordering please refer to the operator manual.Switch on the Helena V8 as instructed in the operator manual.4. To conduct Immunodisplacement testing, install the relevant Serum Protein Buffer 5. and Diluent if required. For correct installation of all Serum Protein Buffer bottles and Serum Protein Diluents please refer to the operator manual.Ensure that the Immunodisplacement reagent barcode information is loaded into 6. Platinum 4V by selecting ‘CE SYSTEM’ from the drop down menu. Click ‘DEFINE REAGENTS’ and ensure the barcode information for each antisera type has been entered and that the location of the reagent information corresponds with the intended vial location on-board the V8.Uncap the antisera vials and place them in the reagent bay of the V8.7. When the V8 is ready to accept samples for operation, 8. the instrument will pulse red.For samples that have been ordered for Reflex testing and are NOT already 9. on-board the V8, place each primary sample tube into the sample rack, ensuring that the barcode is clearly visible through the rack window (refer to the operator manual).Load sample racks onto the left-hand side of the V8 sample transport area and 10. close lid as instructed in the operator manual.The V8 will automatically commence analysis of all loaded samples, and the results 11. will be transferred to Platinum 4V.After analysis, and if required, initiate V8 shut-down mode by switching off the 12. instrument as instructed in the operator manual.It is important that the V8 is post-conditioned correctly at the end of the day.13. Please refer to the operator manual.


en

9

INTERPRETATION OF RESULTSThe majority of monoclonal proteins migrate in the cathodic, gamma region of the protein pattern, but due to their abnormal nature, they may migrate anywhere within the globulin region on capillary electrophoresis. Immunodisplacement is a subtractive analytical technique and the abnormal protein is identified by noting which antisera types react with it, resulting in the originally identified peak being reduced or removed in the test CE electropherograms. Care must be taken when analysing results as normal polyclonal immunoglobulins will be removed from the trace as well as abnormal paraproteins. Attention must therefore be paid to the shape of the test electropherograms as well as their relative peak areas.

QUALITY CONTROLHelena Biosciences Abnormal CEtrol Serum Control (Cat. no. 802500) can be used to verify all phases of the Immunodisplacement procedure.

LIMITATIONSReaction with Kappa or Lambda light chain antisera but no reaction with 1. IgG, IgA or IgM heavy chain antisera. Samples showing this pattern may either have a free light chain monoclonal gammopathy or they may have an IgD or IgE monoclonal protein. In this situation, the ID should be repeated, substituting IgD and IgE antisera for two of the other heavy chain antisera. Failure to obtain a reaction with IgD or IgE antisera would be indicative of free light chain disease.Band in gamma region showing no reactivity with ID antisera.2. C Reactive Protein (CRP) may be detected in patients with acute inflammatory response6-7. Elevated alpha-1 antitrypsin and haptoglobin are supportive evidence for CRPNon-reactivity with Kappa and Lambda antisera.3. Occasionally a sample will have a reaction with a heavy chain antiserum but no light chain reaction is obvious. In this situation, the following need to be ruled out –

Heavy chain disease,a. Very high concentrations of light chains, leading to antigen excess,b. Low concentrations of light chains,c. Atypical light chain molecule that does not react with the antiserum,d. Light chains with ‘hidden’ light chain determinants (as sometimes seen with e. IgA and IgD).

Cross Reactivity of Antisera4. . Due to the modified nature of Immunodisplacement antibody molecules, antibody-antigen reactions performed on capillary can result in some antisera cross reacting with monoclonal components present in a sample. Cross reactivity, which is a rare occurrence, may lead to the clinical conclusion of a bi-clonal gammopathy. If cross reactivity of antisera is suspected further testing using gel immunofixation may be necessary to confirm results. There is no risk of false negative results as a consequence of cross reactivity.


10


The Immunodisplacement antisera are capable of completely removing monoclonal peaks of < 30 g/L from serum samples and of < 0.6 g/L from urine samples. Gammaglobulins in large excess of these concentrations may not be entirely removed from the trace, rendering interpretation of the results difficult. In such cases it is advised that the original patient sample is diluted with either isotonic saline or the appropriate V8 Urine Preparation Buffer to reduce the protein concentration to a level at which complete displacement can occur, and the Immunodisplacement assay procedure is repeated. Alternatively, the overide dilution function can be used to reduce the protein concentration to a level at which complete displacement can occur. Please refer to the operator manual for further information.

SENSITIVITYThe V8 Immunodisplacement Kit is able to immunotype monoclonal gammopathies with serum protein concentrations of 0.208 g/L or urine protein concentrations of 0.02 g/L, or higher.

PERFORMANCE CHARACTERISTICSA series of samples were tested and compared to another commercially available test kit - both kits showed equivalent results.

BIBLIOGRAPHYFauchier, P. and Catalan, F. ‘Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis’ Alfred 1. Fournier Institute, Paris, France, 1988.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. ‘Finding Clues to Disease in 2. Urine’ Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : 69-75.Umbreit, A. and Wiedemann, G. ‘Determination of Urinary Protein Fractions. A 3. Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations’ Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172.Wiedemann, G. and Umbreit, A. ‘Determination of Urinary Protein Fractions by 4. Different Electrophoretic Methods’, Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262.Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and 5. Lockhart, S. ‘A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria’ Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : 371-374.Jeppsson, J.O., Laurell, C.B. and Franzen, B., ‘Agarose Gel Electrophoresis’, Clin. 6. Chem., 1979; 25 (4) : 629-638.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M., ‘Protein Analysis’, Diagnostic 7. Medicine, 1980; Jan/Feb : 3-15.


11

fr

FrançaisUTILISATIONLe kit V8 Immunodisplacement (immunodéplacement V8) sert à la séparation et à l’identification des gammapathies monoclonales par électrophorèse capillaire (CE). Cette technique sépare les protéines en fonction de leur charge nette dans une solution tamponnée alcaline en combinaison avec leur interaction différentielle avec la paroi du capil-laire en silice. L’immunotypage des gammaglobulines s’effectue en analysant des aliquotes de l’échantillon avec un panel d’antisé-rums monospécifiques. Le complexe formé par l’antisérum du test et la protéine ciblée présente un profil de migration modifié, ce qui fait que sa migration est différente de celle observable sur un électrophorégramme de protéines séri-ques normales. En comparant les résultats du panel du test avec une analyse de référence, il est possible de déter-miner le type d’immunoglobuline présent par l’absence ou la réduction du pic anormal de l’électrophorégramme obte-nu par électrophorèse capillaire.

Les protéines urinaires proviennent principalement de la filtration des protéines plasmatiques par le rein. L’apparition de protéines plasmatiques anormales dans l’urine est un élément important dans l’évaluation de la fonction rénale. L’étude d’une protéinurie doit inclure l’évaluation qualitative et quantitative du type et de la quantité de protéines excrétées1-5. La séparation électrophorétique des protéines urinaires, unie à l’identification des types de protéines spécifiques par immunoprécipitation, permet de différencier plusieurs types de protéinuries : physiologique, glomérulaire (sélective et non sélective), tubulaire et protéinurie associée à une dysglobulinémie1-5.

AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONSLes réactifs du kit sont à usage diagnostique in vitro uniquement. Ne pas ingérer ou pipeter à la bouche aucun composant. Porter des gants pour la manipulation de tous les composants du kit. Se reporter aux fiches de sécurité des composants du kit pour la manipulation et l’élimination.

COMPOSITIONAntisérum Anti-human IgG (anti-IgG humaines). RÉF HL-3-2125SA (1 x 50 1. analyses). Antisérum Anti-human IgA (anti-IgA humaines). RÉF HL-3-2126SA (1 x 50 2. analyses). Antisérum Anti-human IgM (anti-IgM humaines). RÉF HL-3-2127SA (1 x 50 3. analyses). Antisérum Anti-human kappa (anti-kappa humaines). RÉF HL-3-2128SA (1 x 4. 50 analyses).


12


Antisérum Anti-human lambda (anti-lambda humaines). RÉF HL-3-2129SA (1 5. x 50 analyses). Chaque flacon contient assez d’antisérum pour réaliser 50 analyses. L’antisérum est prêt à l’emploi et doit être mis dans l’emplacement approprié de l’instrument Helena V8 comme indiqué dans le manuel d’utilisation. Notice d’utilisation. 6. Chaque kit contient une notice d’utilisation.

STOCKAGE ET CONSERVATIONAntisérum anti-IgG humaines. 1. Antisérum anti-IgA humaines. 2. Antisérum anti-IgM humaines. 3. Antisérum anti-kappa humaines. 4. Antisérum anti-lambda humaines. Les antisérums doivent être conservés à 2…8 °C ; ils sont stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquet-te. Les flacons ouverts sont stables 4 semaines à 2…8 °C. S’assurer de reboucher les flacons d’antisérum quand ils ne sont pas utilisés afin d’éviter les pertes dues à l’évaporation. Les solutions d’antisérum sont transparentes et incolores. Jeter les solutions d’antisérum en cas de modification de leur aspect, par exemple, une coloration ou un aspect flo-conneux indiquant une contamination bactérienne. NE PAS CONGELER LES SOLUTIONS D’ANTISÉRUM.

MATÉRIEL NÉCESSAIRE NON FOURNIRÉF 830100 V8 Storage Buffer RÉF 830200 V8 Maintenance Buffer RÉF 800200 V8 Serum Protein 6-band Kit (en cas de séparation en 6 bandes analyse) REF 800500 V8 Serum Protein SPE Kit (en cas de séparation en 6 bandes, SPE analyse) REF 800800 V8 Serum Protein 6-band Zoom Kit (en cas de séparation en 6 bandes, zoom analyse) REF 830400 V8 Clinical Waste Drawer Pack


13

fr

MATÉRIEL OPTIONNELRÉF 800410 Tampon V8 Urine Preparation Buffer SP6 (préparation d’urine SP6 V8 RÉF 800411 Tampon V8 Urine Preparation Buffer SP6 Zoom (préparation d’urine SP6 zoom V8) RÉF 800412 Tampon V8 Urine Preparation Buffer SPE (préparation d’urine SPE V8) RÉF VS2002 Concentrateurs par centrifugation VivaSpin 20 de Sartorius RÉF GEHE 17-0853-02 Colonnes de dessalement NAP-5 de GE Healthcare

- en cas d’immunodéplacement d’urine

RÉF 820500 Kit V8 Free kappa / Free lambda (anti-kappa libre / anti-lambda libre V8) RÉF 821400 Kit V8 Anti-IgD / Anti-IgE (anti-IgD / anti-IgE V8)

PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONSPour les analyses des protéines sériques, l’utilisation de sérum fraîchement prélevé est fortement recommandée car les échantillons de plasma laissent apparaître une large bande de fibrinogène entre les fractions bêta et gamma. Les échantillons peuvent être conservés 7 jours à 2…8 °C ou 1 mois à -20 °C. S’il est nécessaire de congeler les échantillons, ils doivent être réfrigérés immédiatement et congelés dans les 8 heures suivant le prélèvement. La conservation des échantillons à 2…8 °C peut entraîner une dégradation des protéines, en particulier, mais pas uniquement les fractions du complément. Par conséquent, après 7 jours de conservation à 2…8 °C, la détection d’une zone bêta 2 différenciée risque de ne plus être possible. NE PAS conserver les échantillons à température ambiante, car ils se dégradent rapidement. Les échantillons qui contiennent des cryoglobulines peuvent présenter un aspect visqueux ou trouble après la réfrigé-ration ou la congélation. Il est conseillé de ramener ces échantillons à température ambiante avant d’effectuer l’analy-se.

Pour l’analyse d’urine, l’utilisation d’urine fraîchement prélevée (prélèvement dans les 24 heures) est fortement re-commandée. Les échantillons peuvent être conservés 7 jours à 2…6 °C. Pour une conservation plus longue, il est recommandé de conserver les échantillons à 70 °C, pendant 1 mois maxi-mum. NE PAS conserver les échantillons à 20 °C. Les échantillons d’urine doivent être dessalés avant l’analyse sur l’instrument V8 à l’aide de l’une des combinaisons de tampon de préparation d’urine et de dispositif de dessalement en option indiqués ci-dessus.


14


MÉTHODOLOGIES’assurer que le chariot du réservoir à déchets est placé sur l’instrument.1. Avant d’allumer le V8, s’assurer qu’il dispose de tampon de stockage, de tampon 2. de maintenance et de cupules jetables correctement mis en place. Consulter le manuel d’utilisation pour savoir comment mettre en place correctement les consommables.Lancer Platinum 4V et initier une nouvelle session d’électrophorèse capillaire (CE). 3. Dans Platinum 4V, sélectionner CE SYSTEM (Système d’électrophorèse capillaire) dans le menu déroulant, cliquer sur DEFAULT METHOD (Méthode par défaut), puis s’assurer que l’option pertinente d’immunodéplacement est sélectionnée (consulter le manuel d’utilisation). Consulter le manuel d’utilisation pour savoir comment réaliser une analyse spécifique ou une analyse complémentaire conditionnelle.Mettre l’instrument Helena V8 sous tension conformément aux instructions du 4. manuel d’utilisation.Pour réaliser un immunodéplacement, mettre en place le flacon approprié de 5. tampon et de diluant Protéines sériques si nécessaire. Pour une mise en place correcte de tous les flacons de tampon Protéines sériques et de diluants Protéines sériques, consulter le manuel d’utilisation.S’assurer que les informations du code-barre du réactif d’immunodéplacement 6. sont chargées dans Platinum 4V en sélectionnant CE SYSTEM (Système d’électrophorèse capillaire) dans le menu déroulant. Cliquer sur DEFINE REAGENTS (Définir les réactifs) et s’assurer que les informations du code-barre de chaque type d’antisérum ont été saisies et que l’emplacement indiqué du réactif correspond à l’emplacement prévu pour le flacon dans le V8. Déboucher les flacons d’antisérum et les placer dans le compartiment des réactifs 7. du V8.Lorsque l’instrument V8 est prêt à accepter des échantillons pour les analyser, il 8. clignote en rouge.Pour les échantillons qui doivent être soumis à une analyse complémentaire 9. conditionnelle et qui NE SONT PAS déjà placés dans le V8, placer chaque tube d’échantillon initial dans le portoir en s’assurant que le code-barre est clairement visible dans la fenêtre du portoir (consulter le manuel d’utilisation).Charger les portoirs échantillons sur le côté gauche de la zone de transport des 10. échantillons du V8, puis fermer le couvercle comme indiqué dans le manuel d’utilisation.Le V8 démarre automatiquement l’analyse des échantillons chargés et les résultats 11. sont transmis à Platinum 4V.Après l’analyse, et si vous le désirez, initier le mode d’arrêt du V8 en éteignant 12. l’instrument comme indiqué dans le manuel d’utilisation.Il est important que la mise hors service en fin de journée du V8 soit 13. effectuée correctement. Consulter le manuel d’utilisation.


15

fr

INTERPRÉTATION DES RÉSULTATSLors d’une électrophorèse capillaire, la plupart des protéines monoclonales migrent du côté cathodique, c’est-à-dire dans la zone gamma du protéinogramme, mais, en raison de leur caractère anormal, il est possible qu’elles migrent ailleurs dans la zone des globulines. L’immunodéplacement est une technique analytique soustractive et la protéine anormale est identifiée grâce aux types d’antisérum avec lesquels elle réagit, ce qui est indiqué par une absence ou une diminution du pic d’origine corres-pondant sur les électrophorégrammes obtenus par électrophorèse capillaire. Il convient de faire attention lors de l’analyse des résultats car les immunoglobulines polyclonales normales sont sous-traites de l’électrophorégramme en même temps que les protéines monoclonales anormales. Il faut regarder attenti-vement la forme des électrophorégrammes de l’analyse ainsi que leurs zones de pic correspondantes.

CONTRÔLE QUALITÉLe contrôle Abnormal CEtrol Serum Control d’Helena Bioscience (RÉF 802500) peut être utilisé pour vérifier toutes les phases de la procédure d’immunodéplacement.

LIMITESRéaction avec les chaînes légères kappa ou lambda, mais pas de réaction 1. avec les antisérums à chaînes lourdes IgG, IgA ou IgM. Les échantillons présentant cette réaction peuvent avoir une chaîne libre légère monoclonale ou une IgD ou IgE monoclonale. Dans ce cas, il est nécessaire de répéter l’analyse en substituant les antisérums IgD et IgE par deux autres à chaînes lourdes. L’absence de réaction avec les antisérums IgD et IgE indique en principe l’existence d’une maladie des chaînes légères libres.Bande dans la zone gamma, pas de réaction avec les antisérums de l’ID.2. Il est possible que la protéine C-réactive (CRP) soit détectée chez les patients présentant une réaction inflammatoire aiguë6-7. Un niveau élevé d’alpha-1-antitrypsine et d’haptoglobine corrobore la présence de CRP.Absence de réaction avec les antisérums kappa et lambda.3. De temps en temps, un échantillon réagit avec un antisérum à chaîne lourde mais vous ne détectez aucune réaction avec les chaînes légères. Dans ce cas, vous devez éliminer les hypothèses suivantes :

maladie des chaînes lourdes,a. concentration très élevée en chaînes légères (ce qui entraîne un excès b. d’antigènes),faible concentration en chaînes légères,c. molécule à chaîne légère atypique ne réagissant pas avec l’antisérum,d. chaînes légères avec des déterminants antigéniques « cachés » (comme cela e. existe parfois avec l’IgA et l’IgD).


16


Réactivité croisée des antisérums4. . Étant donné que les molécules d’anticorps d’immunodéplacement sont des molécules modifiées, les réactions anticorps-antigène ayant lieu sur le capillaire peuvent entraîner certaines réactions croisées des antisérums avec des composants monoclonaux présents dans un échantillon. Cette réactivité croisée, qui se produit rarement, peut conduire à la conclusion clinique d’une gammapathie biclonale. Si une réactivité croisée des antisérums est suspectée, d’autres tests utilisant une immunofixation sur gel peuvent être nécessaires pour confirmer les résultats. Il n’y a aucun risque de résultats faussement négatifs en raison d’une réactivité croisée.

Les antisérums d’immunodéplacement permettent de soustraire totalement des pics monoclonaux < 30 g/l pour les échantillons de sérum et < 0,6 g/l pour les échantillons d’urine. Il est possible que les gammaglobulines présentant un taux largement plus élevé ne soient pas totalement soustraites de l’électrophorégramme, ce qui complique l’interprétation des résultats. Dans ce cas, il est conseillé de diluer l’échan-tillon patient d’origine soit avec du sérum physiologique, soit avec le tampon de préparation d’urine V8 Urine Prepara-tion Buffer approprié pour réduire le taux de protéines à un taux permettant un immunodéplacement total, puis de répéter la procédure d’immunodéplacement. Sinon, il est possible d’utiliser la fonction de dilution pour réduire le taux de protéines à un taux permettant un immunodéplacement total. Consulter le manuel d’utilisation pour de plus amples informations.

SENSIBILITÉ Le kit V8 Immunodisplacement (immunodéplacement V8) peut effectuer l’immunotypage des gammapathies monoclo-nales avec un taux de protéines sériques supérieur ou égal à 0,208 g/l ou un taux de protéines urinaires supérieur ou égal à 0,02 g/l.

PERFORMANCESUne série d’échantillons a été analysée et comparée avec un autre kit disponible sur le marché. Les résultats obtenus sur ces deux kits sont équivalents.


17

fr

BIBLIOGRAPHIEFauchier, P. and Catalan, F. ‘Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis’ Alfred 1. Fournier Institute, Paris, France, 1988.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. ‘Finding Clues to Disease in 2. Urine’ Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : 69-75.Umbreit, A. and Wiedemann, G. ‘Determination of Urinary Protein Fractions. A 3. Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations’ Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172.Wiedemann, G. and Umbreit, A. ‘Determination of Urinary Protein Fractions by 4. Different Electrophoretic Methods’, Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262.Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and 5. Lockhart, S. ‘A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria’ Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : 371-374.Jeppsson, J.O., Laurell, C.B. and Franzen, B., ‘Agarose Gel Electrophoresis’, Clin. 6. Chem., 1979; 25 (4) : 629-638.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M., ‘Protein Analysis’, Diagnostic 7. Medicine, 1980; Jan/Feb : 3-15.


18



19

de

DeutschANWENDUNGSBEREICHDer V8 Immunodisplacement Kit dient zur Auftrennung und Identifizierung monoklonaler Gammopathien mittels Kapillarzonenelektrophorese. Diese Technik trennt Proteine in einer alkalischen Pufferlösung auf Basis ihrer Nettoladung auf zusammen mit ihrer unterschiedlichen Wechselwirkung mit der Wand der Quarzkapillare.

Die Immuntypisierung von Gammaglobulinen wird durch Testen von Probenaliquots mit einem Panel mo-nospezifischer Antiseren durchgeführt. Der durch die Antiseren des Tests gebildete Komplex und sein Ziel-protein haben ein modifiziertes Migrationsprofil und ist daher zum normalen Serumproteinelektrophero-gramm versetzt. Durch den Vergleich der Ergebnisse des Testpanels mit einem Referenztest kann der vor-liegende Immunglobulintyp durch die spezifische Entfernung oder Reduzierung der abnormalen Zacke be-stimmt werden.

Der größte Bedarf für eine Immunodisplacement-Analyse liegt im klinischen Laborbereich, hier vor allem in der Diagnose monoklonaler Gammopathien. Bei einer monoklonalen Gammopathie handelt es sich um eine Primärerkrankung, in der ein einzelner Plasmazellklon vermehrt erhöhte Mengen von Immunglobulin einer einzelnen Klasse und eines einzelnen Typs produziert. Solche Immunglobuline werden als monoklonale Proteine, M-Proteine oder Paraproteine bezeichnet. Ihre Anwesenheit kann harmlos oder von unspezifischer Bedeutung sein. In manchen Fällen ist ihr Nachweis ein Hinweis auf das Vorliegen einer malignen Erkrankung wie dem multiplen Myelom oder Morbus Waldenström. Man muss zwischen polyklonalen und monoklonalen Gammopathien unterscheiden. Polyklonale Gammopathien sind sekundäre Erkrankungszustände, die durch chronische Lebererkrankungen, Kollagenosen, rheumatoide Arthritis und chronische Infektionen hervorgerufen werden.

Proteine im Urin stammen hauptsächlich von durch die Niere gefilterten Plasmaproteinen ab. Das Vorkommen abnormaler Plasmaproteine im Urin ist bei der Beurteilung der Nierenfunktion von großer Bedeutung. Die richtige Untersuchung der Proteinurie sollte quantitative und qualitative Bewertungen von Typ und Menge der ausgeschiedenen Proteine umfassen1-5. Die Kombination der elektrophoretischen Auftrennung der Urinproteine und Bestimmung bestimmter Proteintypen durch Immunpräzipitation erlaubt eine Unterteilung mehrerer Proteinurieformen: physiologische, glomeruläre (selektiv und nicht-selektiv), tubuläre sowie Proteinurie, die mit Dysglobulinämie im Zusammenhang steht1-5.


20


WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMENDie Reagenzien dieses Kits sind nur zur In-vitro-Diagnostik bestimmt. Nicht einnehmen oder mit dem Mund pipettieren. Beim Umgang mit den Kitkomponenten Handschuhe tragen. Siehe Sicherheitsdatenblatt bezüglich der R- und S-Sätze sowie Informationen zur Entsorgung.

INHALTAnti-human IgG antisera. REF HL-3-2125SA (1 x 50 Tests)1. Jede Flasche enthält ausreichend Antiserum für 50 Tests. Das Antiserum ist gebrauchsfertig und muss, wie im Bedienungshandbuch angegeben, auf dem V8-Gerät von Helena in die entsprechende Position eingesetzt werden.Anti-human IgA antisera. REF HL-3-2126SA (1 x 50 Tests)2. Jede Flasche enthält ausreichend Antiserum für 50 Tests. Das Antiserum ist gebrauchsfertig und muss, wie im Bedienungshandbuch angegeben, auf dem V8-Gerät von Helena in die entsprechende Position eingesetzt werden.Anti-human IgM antisera. REF HL-3-2127SA (1 x 50 Tests)3. Jede Flasche enthält ausreichend Antiserum für 50 Tests. Das Antiserum ist gebrauchsfertig und muss, wie im Bedienungshandbuch angegeben, auf dem V8-Gerät von Helena in die entsprechende Position eingesetzt werden.Anti-human kappa antisera. REF HL-3-2128SA (1 x 50 Tests)4. Jede Flasche enthält ausreichend Antiserum für 50 Tests. Das Antiserum ist gebrauchsfertig und muss, wie im Bedienungshandbuch angegeben, auf dem V8-Gerät von Helena in die entsprechende Position eingesetzt werden.Anti-human lambda antisera. REF HL-3-2129SA (1 x 50 Tests)5. Jede Flasche enthält ausreichend Antiserum für 50 Tests. Die Antiseren sind gebrauchsfertig und müssen, wie in der Gebrauchsanleitung im Bedienungshandbuch angegeben, in die entsprechende Position auf dem V8-Gerät von Helena eingesetzt werden.Gebrauchsanweisungen.6. Jedes Kit enthält eine Gebrauchsanweisung.

LAGERUNG UND STABILITÄTAnti-human IgG antisera.1. Anti-human IgA antisera.2. Anti-human IgM antisera.3. Anti-human kappa antisera. 4. Anti-human lambda antisera. Die Antiseren sollten bei 2 bis 8 ℃ gelagert werden und sind bis zum aufgedruckten Verfallsdatum sta-bil.Geöffnete Fläschchen sind bei 2 bis 8 °C 4 Wochen stabil. Achten Sie darauf, dass die Fläschchen mit Antiseren nach Gebrauch wieder verschlossen werden, um den Verdunstungsverlust so gering wie möglich zu halten.


21

de

Die Antiserumlösungen sind klar und farblos. Die Antiseren verwerfen, wenn Veränderungen im Aussehen bemerkt werden. Verfärbung oder Trübung weist zum Beispiel auf eine Verunreinigung hin. ANTISEREN NICHT EINFRIEREN.

NICHT MITGELIEFERTES, ABER BENÖTIGTES MATERIALREF 830100 V8 Storage Buffer REF 830200 V8 Maintenance Buffer REF 800200 V8 Serum Protein 6-band Kit (Bei Durchführung einer 6-Banden- Analyse)REF 800500 V8 Serum Protein SPE Kit (Bei Durchführung einer 6-Banden- Analyse)REF 800800 V8 Serum Protein 6-band Zoom Kit (Bei Durchführung einer 6-Banden- Analyse) REF 830400 V8 Clinical Waste Drawer Pack

OPTIONAL ZU VERWENDENDE PRODUKTEREF 800410 V8 Urine Preparation Buffer SP6 REF 800411 V8 Urine Preparation Buffer SP6 Zoom REF 800412 V8 Urine Preparation Buffer SPE REF VS2002 Sartorius VivaSpin 20 Centrifugal Concentrators REF GEHE 17-0853-02 GE Healthcare NAP-5 Desalting Columns - Bei Durchführung von Immunodisplacement im Urin


PROBENENTNAHME UND VORBEREITUNGFür Serumproteinanalysen ist frisch entnommenes Serum das Untersuchungsmaterial der Wahl, da Plasma-proben zwischen der Beta- und Gammafraktion eine große Fibrinogenbande enthalten. Proben können bei 2 bis 8 ℃ bis zu 7 Tagen und bei -20 °C bis zu 1 Monat gelagert werden. Wenn Proben eingefroren werden sollen, müssen sie sofort gekühlt und innerhalb von 8 Stunden nach Ent-nahme eingefroren werden. Aufbewahren der Proben bei 2 bis 8 ℃ kann zu einem Proteinabbau, insbesondere der Komplementfrak-tionen, führen. Folglich kann bei einer Lagerung bei 2 bis 8 ℃ nach 7 Tagen der Nachweis einer eindeutigen Beta-2-Region nicht mehr möglich sein. Proben NICHT bei Raumtemperatur lagern - die Probe wird schnell abgebaut. Proben mit Kryoglobulinen können nach Kühlen oder Einfrieren viskös oder trübe werden. Es ist anzuraten, diese Proben vor dem Testen auf Raumtemperatur zu bringen.


22


Das Untersuchungsmaterial der Wahl für die Urinanalyse ist frisch gesammelter Urin (24-Stunden- Samme-lurin). Proben können bei 2 bis 6 ℃ bis zu 7 Tagen gelagert werden. Für längere Lagerzeiten können die Proben bis zu einem Monat bei -70 °C aufbewahrt werden. Proben NICHT bei -20 °C aufbewahren. Urinproben sind vor dem Testen auf dem V8-System mit einem der oben aufgeführten optionalen Urinvor-bereitungspuffer (Urine Preparation Buffer) und Gerätekombinationen zu entsalzen.

SCHRITT-FÜR-SCHRITT METHODEVergewissern Sie sich, dass sich der Einschub für den Abfallbehälter im Gerät 1. befindet.Vergewissern Sie sich vor Einschalten des V8, dass sich Lager- und 2. Wartungspuffer sowie Einweggefäße auf dem Gerät und in den richtigen Positionen befinden. Im Bedienungshandbuch ist beschrieben, wie das Verbrauchsmaterial richtig eingesetzt wird.Starten Sie die Platinum 4V-Software und legen eine neue CE-Sitzung an. Wählen 3. Sie in Platinum 4V aus dem Dropdown-Menü ‘CE SYSTEM’ (CE-System) und klicken auf ‘DEFAULT METHOD’ (Standardmethode). Achten Sie darauf, dass das richtige Immunodisplacement Assay ausgewählt ist (siehe Bedienungshandbuch). Für Reflex-Testing oder Einzeltestanforderungen siehe Bedienungshandbuch.Schalten Sie das V8-Gerät von Helena wie im Bedienungshandbuch beschrieben 4. ein.Setzen Sie für die Durchführung eines Immunodisplacement-Tests ggf. die 5. entsprechende Serumproteinpufferflasche und das Diluent ein. Für das korrekte Einsetzen aller Serumproteinpuffer- und Diluentflaschen (siehe Bedienungshandbuch).Überprüfen Sie, ob der Barcode des Immunodisplacementreagenz in die Platinum 6. 4V geladen wurde, indem Sie aus dem Dropdown-Menü „CE SYSTEM“ (CE-System) wählen. Klicken Sie auf DEFINE REAGENTS’ (Reagenzien festlegen) und vergewissern Sie sich, dass für jedes Antiserum der Barcode eingegeben wurde und die Position der Reagenzieninformationen mit den vorgese-henen Positionen der Fläschchen auf dem V8 übereinstimmen.Die Verschlusskappen der Antiseren abnehmen und sie in das Reagenzienfach des 7. V8 setzen.Wenn das V8-Gerät für die Probenaufnahme betriebsbereit ist, blinkt es rot.8. Für Proben, die für ein Reflex-Testing angefordert wurden und sich NICHT bereits 9. auf dem V8-Gerät befinden, das jeweilige Primärprobenröhrchen in das Probenrack stellen. Dabei darauf achten, dass durch das Rackfenster der Barcode deutlich zu erkennen ist (siehe Bedienungshandbuch).


23

de

Die Probenracks links in den V8-Probentransportbereich stellen und wie im 10. Bedienungshandbuch beschrieben den Deckel schließen.Das V8-Gerät beginnt automatisch mit der Analyse aller geladenen Proben. Die 11. Ergebnisse werden an die Platinum 4V-Software übertragen.Bei Bedarf nach Testende das Gerät herunterfahren, indem es wie im 12. Bedienungshandbuch beschrieben ausgeschaltet wird.Am Ende eines Arbeitstags muss das V8 unbedingt wieder richtig aufbereitet 13. werden. Siehe Bedienungshandbuch.

AUSWERTUNG DER ERGEBNISSEDie Mehrzahl der monoklonalen Proteine wandern in den katodischen Gammabereich des Proteinmusters, können aber aufgrund ihrer pathologischen Beschaffenheit bei der Kapillarelektrophorese innerhalb des Globulinbereichs überall hinwandern. Immunodisplacement ist eine subtraktive Analysetechnik. Das abnormal Protein wird identifiziert, indem getestet wird, mit welchem Antiserum es reagiert. Daraufhin wird der ursprünglich identifizierte Peak in den Test-CE-Elektropherogrammen vermindert oder entfernt. Bei der Analyse der Ergebnisse muss berücksichtigt werden, dass normale polyklone Immunglobuline sowie abnormale Paraproteine ebenfalls aus der Spur entfernt werden. Es muss deshalb die Form des Testelek-tropherogramms sowie ihre relativen Kurvenabschnitte beachtet werden.

QUALITÄTSKONTROLLEHelena Biosciences Abnormal CEtrol Serum Control (REF 802500) von Helena Biosciences kann zur Identifizierung aller Phasen des Immunodisplacement-Verfahrens eingesetzt werden.

EINSCHRÄNKUNGENReaktion mit Kappa- oder Lambda-Leichtketten-Antiseren, aber keine 1. Reaktion mit IgG-, IgA- oder IgM-Schwerketten-Antiseren. Proben, die dieses Verhalten aufzeigen, haben entweder eine monoklonale freie Leichtketten-Gammopathie oder eventuell ein monoklonales IgD- oder IgE-Protein. Unter diesen Umständen sollte die ID unter Austauschen von IgD- und IgE-Antiseren gegen zwei der anderen Schwerkettenantiseren wiederholt werden. Falls es nicht zur Reaktion mit IgD- oder IgE-Antiseren kommt, kann dies ein Hinweis auf eine Leichtketten-Gammopathie sein.Die Bande in der Gamma-Region zeigt keine Reaktion mit den ID-Antiseren. 2. C-reaktives Protein (CRP) kann bei Patienten mit akuter Entzündungsantwort nachgewiesen werden6-7. Erhöhtes Alpha-1-Antitrypsin und Haptoglobin bestärkt die Anwesenheit von CRP.


24


Keine Reaktivität mit Kappa- und Lambda-Antiserum.3. Gelegentlich reagiert eine Probe mit einem Schwerketten-Antiserum, ohne dass eine Reaktion mit einem Leichtketten-Antiserum ersichtlich ist. Unter diesen Umständen muss Folgendes ausgeschlossen werden:

Schwerkettenkrankheita. Sehr hohe Leichtkettenkonzentrationen, die zu Antigenüberschuss führenb. Niedrige Konzentrationen von Leichtkettenc. Atypische, nicht mit dem Antiserum reagierende Leichtketten-Moleküled. Leichtketten mit „versteckten“ Leichtkettendeterminanten (wird manchmal bei e. IgA und IgD beobachtet).

Kreuzreaktivität der Antiseren4. . Aufgrund der veränderten Beschaffenheit der Antikörpermoleküle für Immunodisplacement können die in der Kapillare durchgeführten Antikörper-Antigen-Reaktionen mit einigen Antiseren in einer Kreuzreaktivität mit den monoklonalen Komponenten einer Probe resultieren. Diese selten auftretende Kreuzreaktivität kann zu der klinischen Schlussfolgerung einer biklonalen Gammopathie führen. Falls eine Kreuzreaktivität der Antiseren vermutet wird, können weitere Tests mit einer Gel-Immunfixation erforderlich sein, um die Ergebnisse zu bestätigen. Es besteht kein Risiko, als Folge einer Kreuzreaktivität falsch negative Ergebnisse zu erhalten.

Die Antiseren für das Immunodisplacement sind in der Lage, monoklonale Peaks von <30 g/l aus Serum-proben und <0,6 g/l aus Urinproben vollständig zu entfernen. Gammaglobuline, die diese Konzentrationen wesentlich überschreiten, können möglicherweise nicht voll-ständig aus der Spur entfernt werden, was eine Interpretation der Ergebnisse erschwert. In diesen Fällen ist es ratsam, die Originalpatientenprobe entweder mit isotonischer Kochsalzlösung oder dem entsprechenden V8 Urine Preparation Buffer zu verdünnen, um die Proteinkonzentration auf einen Wert zu reduzieren, bei dem es zu einer kompletten Verdrängung kommen kann, und dann den Immunodisplacement-Test zu wie-derholen. Alternativ kann die Funktion “Verdünnung ausschalten” verwendet werden, um die Proteinkon-zentration auf ein Maß zu reduzieren, an dem eine vollständige Verdrängung stattfinden kann. Für weitere Informationen siehe Bedienungshandbuch.

EMPFINDLICHKEITDie Immuntypisierung mit dem V8 Immunodisplacement Kit kann monoklonale Gammopathien mit Serum-konzentrationen von 0,208 g/l oder Urinproteinkonzentrationen von 0,02 g/l oder höher nachweisen.

LEISTUNGSEIGENSCHAFTENEine Anzahl Proben wurden mit dieser Methode und einem anderen, kommerziell erhältlichen Testkit analysiert und die erhaltenen Messwerte verglichen. Beide Methoden liefern übereinstimmende Resultate.


25

de

LITERATURFauchier, P. and Catalan, F. ‘Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis’ Alfred 1. Fournier Institute, Paris, France, 1988.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. ‘Finding Clues to Disease in 2. Urine’ Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : 69 - 75.Umbreit, A. and Wiedemann, G. ‘Determination of Urinary Protein Fractions. A 3. Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations’ Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163 - 172.Wiedemann, G. and Umbreit, A. ‘Determination of Urinary Protein Fractions by 4. Different Electrophoretic Methods’, Clin. Lab.; 1999, 45 : 257 - 262.Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and 5. Lockhart, S. ‘A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria’ Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : 371 - 374.Jeppsson, J.O., Laurell, C.B. and Franzen, B., ‘Agarose Gel Electrophoresis’, Clin. 6. Chem., 1979; 25(4) : 629 - 638.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M., ‘Protein Analysis’, Diagnostic 7. Medicine, 1980; Jan/Feb : 3 - 15.


26



27

it

ItalianoSCOPO PREVISTOV8 Immunodisplacement kit è stato formulato per la separazione ed identificazione delle gammopatie mo-noclonali mediante elettroforesi di zona capillare. Questa tecnica separa le proteine sulla base della loro ca-rica netta in tampone alcalino in combinazione con la differente interazione con la parete del capillare in si-lice.

L’immunotipizzazione delle gammaglobuline avviene testando le frazioni di campione con un gruppo di an-tisieri monospecifici. Il complesso formato dagli antisieri del test e la sua proteina target ha un profilo di migrazione modificato ed è pertanto dislocato dall’elettroferogramma delle sieroproteine standard. Confron-tando i risultati del gruppo del test con un’analisi di riferimento è possibile determinare il tipo di immuno-globuline presenti tramite la rimozione o la riduzione specifica dello spike anomalo dall’elettroferogramma CE.

La maggiore necessità di immunosostituzione si registra nei laboratori clinici, dove viene utilizzata principalmente per il rilevamento di gammopatie monoclonali. Una gammopatia monoclonale è uno stato patologico primario, in cui un singolo clone di cellule plasmatiche produce livelli elevati di un’immunoglobulina di una sola classe e di un solo tipo. Tali immunoglobuline sono identificate come proteine monoclonali, proteine M o paraproteine. La loro presenza può essere di natura benigna oppure di incerto significato. In alcuni casi sono indicative di tumori maligni come mielomi multipli o la macroglobulinemia di Waldenström. Bisogna differenziare le gammopatie policlonali da quelle monoclonali. Le gammopatie policlonali sono il secondo stato di malattie dovute a disturbi clinici quali l’epatopatia cronica, disordini del collagene, artrite reumatoide e infezioni croniche.

Le proteine presenti nell’urina derivano principalmente dalle proteine plasmatiche filtrate dal rene. La comparsa di proteine del plasma anomale nell’urina è estremamente importante per la valutazione della funzionalità renale. Un accurato esame della proteinuria deve comprendere una valutazione quantitativa e qualitativa del tipo e della quantità di proteine escrete1-5. Combinando una tecnica di separazione elettroforetica delle proteine urinarie con l’identificazione di tipi specifici di proteine mediante immunoprecipitazione, è possibile differenziare diversi tipi di proteinuria: fisiologica, glomerulare (selettiva e non selettiva), tubulare e proteinuria associata a disglobulinemie1-5.


28


AVVERTENZE E PRECAUZIONII reagenti contenuti in questo kit sono destinati esclusivamente alla diagnostica in vitro. Non ingerire né pipettare con la bocca i componenti del kit. Indossare guanti durante l’uso di tutti i componenti del kit. Per le indicazioni relative ai rischi e alla sicurezza e per le informazioni sullo smaltimento, fare riferimento alle schede tecniche dei prodotti.

COMPOSIZIONEAnti-human IgG antisera. RIF HL-3-2125SA (1 x 50 test).1. Anti-human IgA antisera. RIF HL-3-2126SA (1 x 50 test).2. Anti-human IgM antisera. RIF HL-3-2127SA (1 x 50 test).3. Anti-human IgM antisera. RIF HL-3-2127SA (1 x 50 test).4. Anti-human lambda antisera. RIF HL-3-2129SA (1 x 50 test). 5. Ciascun flacone contiene antisiero sufficiente per il completamento di 50 test. L’antisiero è pronto per l’uso e deve essere collocato in una posizione appropriata sullo strumento Helena V8 secondo le istruzioni del manuale utente.Istruzioni per l’uso. 6. Ogni kit contiene un foglio procedurale.

CONSERVAZIONE E STABILITÀAnti-human IgG antisera.1. Anti-human IgA antisera.2. Anti-human IgM antisera.3. Anti-human kappa antisera. 4. Anti-human lambda antisera. Gli antisieri devono essere conservati a 2…8°C e sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull’etichet-ta. I flaconi aperti sono stabili per 4 settimane se conservati a 2…8°C. Controllare che le fiale di antisiero siano richiuse quando non vengono utilizzate per ridurre al minimo le perdite per evaporazione. Le soluzioni di antisiero sono trasparenti e incolori. Gettare le soluzioni di antisiero se si notano cambiamenti nel loro aspetto, ad esempio colorazione o torbi-dezza che possono indicare contaminazione batterica. NON CONGELARE LE SOLUZIONI DI ANTISIERO.


29

it

MATERIALI NECESSARI, MA NON IN DOTAZIONEREF 830100 V8 Storage Buffer REF 830200 V8 Maintenance Buffer REF 800200 V8 Serum Protein 6-band Kit (in caso di esecuzione di separazione a 6 bande analisi) REF 800500 V8 Serum Protein SPE Kit (in caso di esecuzione di separazioneSPE analisi) REF 800800 V8 Serum Protein 6-band Zoom Kit (in caso di esecuzione di separazione Zoom a 6 bande analisi) REF 830400 V8 Clinical Waste Drawer Pack

MATERIALI OPZIONALIRIF 800410 V8 Urine Preparation Buffer SP6 RIF 800411 V8 Urine Preparation Buffer SP6 Zoom RIF 800412 V8 Urine Preparation Buffer SPE RIF VS2002 Sartorius VivaSpin 20 Centrifugal Concentrators RIF GEHE 17-0853-02 GE Healthcare NAP-5 Desalting Columns - in caso di esecuzione di immunosostituzione di urina

RIF 820500 V8 Free kappa / Free lambda Kit RIF 821400 V8 Anti-IgD / Anti-IgE Kit

RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONIPer l’analisi delle proteine del siero, i campioni ideali sono costituiti dal siero fresco in quanto i campioni del plasma contengono un’ampia banda di fibrinogeno tra le frazioni beta e gamma. I campioni possono essere conservati a 2…8°C per un massimo di 7 giorni e per 1 mese a -20°C. Se i campioni devono essere conservati refrigerati, dovrebbero essere congelati immediatamente ed entro 8 ore dalla raccolta. La conservazione dei campioni a 2…8°C può determinare la degradazione delle proteine in particolare, ma non limitatamente alle frazioni complementari. Di conseguenza, dopo 7 giorni di conservazione a 2…8°C potrebbe non essere più possibile rilevare una distinta regione beta-2. NON conservare i campioni a temperatura ambiente - il campione subisce un rapido degrado. I campioni contenenti crioglobuline possono diventare viscosi o torbidi dopo la refrigerazione o il congela-mento. È consigliabile scaldare tali campioni a temperatura ambiente prima dell’analisi.


30


Per l’analisi delle urine, l’urina fresca (raccolta nelle 24 ore precedenti) è il campione da preferire. I cam-pioni possono essere conservati a 2…6°C fino a 7 giorni. Per periodi più lunghi di conservazione si consiglia di conservare i campioni a -70°C, fino ad 1 mese. NON conservare i campioni a -20°C. I campioni di urina devono essere desalinizzati prima dell’analisi sul sistema V8, utilizzando uno dei tampo-ni di preparazione delle urine opzionali e le combinazioni di dispositivi elencate sopra.

PROCEDURAControllare che il cassetto del contenitore dei rifiuti sia on-board.1. Prima di accendere il V8 controllare che il tampone di conservazione, il tampone di 2. manutenzione e le coppette monouso siano on-board e nelle loro corrette posizioni. Per la corretta installazione di tutti i materiali di consumo consultare il manuale utente.Lanciare Platinum 4V e iniziare una nuova sessione CE. In Platinum 4V selezionare 3. ‘CE SYSTEM’ (SISTEMA CE) dal menu a tendina, fare clic su ‘DEFAULT METHOD’ (METODO PREDEFINITO) e assicurarsi che sia selezionato il relativo Immunodisplacement assay (fare riferimento al manuale utente). Per il test dei riflessi o per l’ordine individuale dei test fare riferimento al manuale utente.Accendere il dispositivo Helena V8 come descritto nel manuale utente.4. Per eseguire il test dell’immunosostituzione installare il rispettivo tampone 5. sieroproteico e se necessario il diluente. Per la corretta installazione di tutti i flaconi dei tamponi e dei diluenti sieroproteici fare riferimento al manuale utente.Controllare che l’informazione sul codice a barre del reagente di 6. immunosostituzione sia caricata in Platinum 4V selezionando ‘CE SYSTEM’ dal menu a tendina. Fare clic su ‘DEFINE REAGENTS’ e controllare che le informazioni sul codice a barre per ciascun tipo di antisiero siano state inserite e che la posizione delle informazioni sul reagente corrispondano alla posizione prevista del flacone on-board di V8Togliere il tappo alle fiale di antisiero e collocarle nel deposito dei reagenti di V8.7. Quando V8 è pronto per accettare i campioni per l’uso lo strumento lampeggerà di 8. rosso.Per i campioni che sono stati ordinati per il test dei riflessi e che NON sono già on-9. board in V8 posizionare ogni provetta di campione primaria nel rack per campioni controllando che il codice a barre sia chiaramente visibile attraverso la finestra del rack (fare riferimento al manuale utente).Caricare iI rack dei campioni sul lato sinistro dell’area di trasporto dei campioni V8 10. e chiudere il coperchio seguendo le istruzioni del manuale utente.V8 inizierà automaticamente l’analisi di tutti i campioni caricati e i risultati verranno 11. trasferiti a Platinum 4V.


31

it

Dopo l’analisi, e se richiesto, avviare V8 in modalità arresto spegnendo lo 12. strumento come indicato nel manuale utente.È importante che V8 sia postcondizionato correttamente a fine giornata.13. Fare riferimento al manuale utente.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATILa maggior parte delle proteine monoclonali migra nella regione gamma del catodo del pattern proteico, ma a causa della loro natura anomala, potrebbero migrare in qualsiasi punto della frazione globulinica in seguito ad elettroforesi capillare. L’immunosostituzione è una tecnica analitica per sottrazione e la proteina anomala viene identificata anno-tando con quali tipi di antisieri reagisce, per cui il picco identificato originariamente si riduce o viene rimos-so negli elettroferogrammi CE del test. Prestare attenzione nell’analisi dei risultati, poiché le normali immunoglobuline policlonali, così come le pa-raproteine anomale, saranno rimosse dal tracciato. Occorre pertanto osservare attentamente la forma degli elettroferogrammi del test e le relative aree di picco.

CONTROLLO QUALITÀHelena Biosciences Abnormal CEtrol Serum Control (N. cod. 802500) può essere utilizzato per verificare tutte le fasi della procedura di immunosostituzione.

LIMITIReazione con gli antisieri per catena leggera kappa o lambda ma nessuna 1. reazione con gli antisieri per catena pesante IgG, IgA o IgM. I campioni in cui si verifica questa situazione possono avere catene libere e leggere (gammopatia monoclonale) o possono avere proteine monoclonali IgD o IgE. In questo caso ripetere l’ID sostituendo gli antisieri IgD e IgE ai due degli altri antisieri delle catene pesanti. Se non si hanno reazioni di precipitazione si può parlare di malattie delle catene leggere.Banda in regione gamma senza reazione con antisieri ID.2. È possibile riscontrare la proteina C reattiva (CRP) in pazienti affetti da risposta infiammatoria acuta6-7. Un’elevata alfa-1-antitripsina e aptoglobina sono la prova a sostegno della CRPNon reattività con gli antisieri kappa e lambda.3. A volte un campione può reagire con un antisiero anti catena pesante ma non necessariamente con una catena leggera. In una situazione di questo tipo, è necessario escludere le seguenti possibilità –

Malattia delle catene pesanti,a. Concentrazioni molto elevate di catene leggere, che determinano un eccesso b. di antigene,Basse concentrazioni di catene leggere,c.


32


Molecola a catena leggera atipica che non reagisce con l’antisiero,d. Catene leggere che presentano determinanti delle catene leggere ‘nascoste’ e. (come osservato talvolta con la IgA e IgD).

Reattività crociata degli antisieri4. . Data la natura modificata delle molecole di anticorpi di immunosostituzione, le reazioni anticorpo-antigene eseguite sul capillare possono determinare in alcuni antisieri una reazione crociata con i componenti monoclonali presenti nel campione. La reattività crociata, che è un’eventualità piuttosto rara, può portare alla conclusione clinica di una gammopatia biclonale. In caso di sospetta reattività crociata degli antisieri potrebbe essere necessario effettuare altri test di immunofissazione su gel per accertare i risultati. Non vi è alcun rischio di falsi negativi come conseguenza della reattività crociata.

Gli antisieri di immunosostituzione possono rimuovere completamente i picchi monoclonali < 30 g/L dai campioni di siero e < 0.6 g/L dai campioni di urina. Una concentrazione molto maggiore di gammaglobuline potrebbe non essere interamente rimossa dal trac-ciato, complicando l’interpretazione dei risultati. In tali casi è consigliabile che il campione originario del paziente sia diluito con soluzione isotonica salina o con V8 Urine Preparation Buffer appropriato, al fine di ridurre la concentrazione di proteine a un livello che consenta la sostituzione completa e di ripetere la proce-dura di dosaggio dell’immunosostituzione. In alternative è possibile utilizzare la funzione di override della diluizione per ridurre la concentrazione di proteine a un livello che consenta la sostituzione completa. Per maggiori informazioni fare riferimento al manuale utente.

SENSIBILITÀV8 Immunodisplacement Kit è in grado di immunotipizzare gammopatie monoclonali con concentrazioni di proteine nel siero di 0.208 g/L o concentrazioni di proteine nell’urina di 0.02 g/L, o superiori.

CARATTERISTICHE PRESTAZIONALIUna serie di campioni sono stati testati e comparati con altri kit disponibili in commercio - entrambi i kits hanno mostrato risultati equivalenti.


33

it

BIBLIOGRAFIAFauchier, P. and Catalan, F. ‘Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis’ Alfred 1. Fournier Institute, Paris, France, 1988.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. ‘Finding Clues to Disease in 2. Urine’ Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : 69 - 75.Umbreit, A. and Wiedemann, G. ‘Determination of Urinary Protein Fractions. A 3. Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations’ Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163 - 172.Wiedemann, G. and Umbreit, A. ‘Determination of Urinary Protein Fractions by 4. Different Electrophoretic Methods’, Clin. Lab.; 1999, 45 : 257 - 262.Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and 5. Lockhart, S. ‘A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria’ Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : 371 - 374.Jeppsson, J.O., Laurell, C.B. and Franzen, B., ‘Agarose Gel Electrophoresis’, Clin. 6. Chem., 1979; 25 (4) : 629 - 638.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M., ‘Protein Analysis’, Diagnostic 7. Medicine, 1980; Jan/Feb : 3 - 15.


34



35

es

EspañolOBJETIVO PREVISTOEl kit de inmunodesplazamiento V8 está pensado para la separación y la identificación de gammapatías monoclona-les mediante electroforesis en zona capilar. Esta técnica separa proteínas de acuerdo con su carga neta en una solu-ción tampón alcalina en combinación con su diferente interacción con la pared del los capilares de sílice. La inmunotipificación de las gammaglobulinas se alcanza estudiando alícuotas de la muestra con un panel de los antisueros monoespecíficos. El complejo formado por los antisueros de prueba y su proteína diana tiene un perfil de migración modificado y, por tanto, se ve desplazado del electroferograma de proteínas séricas estándar. Al comparar los resultados del panel de pruebas con un análisis de referencia, puede determinarse el tipo de inmunoglobulina presente mediante la eliminación específica o la reducción del pico anormal del electroferograma de la EC.

La mayor demanda de inmunodesplazamiento corresponde al laboratorio clínico, donde se usa fundamentalmente para la detección de gammapatías monoclonales. Una gammapatía monoclonal es un estado de enfermedad primario en el que un único clon de células plasmáticas produce niveles elevados de una inmunoglobulina de una única clase y un único tipo. Dichas inmunoglobulinas se conocen como proteínas monoclonales, proteínas M o paraproteínas. Su presencia puede ser de naturaleza benigna o de significación incierta. En algunos casos, son indicativas de un tumor maligno, como un mieloma múltiple o macroglobulinemia de Waldenström. Debe diferenciarse entre las gammapatías policlonales y monoclonales, porque las gammapatías policlonales son un estado de enfermedad secundario debido a trastornos clínicos como la hepatopatía crónica, los trastornos del colágeno, la artritis reumatoide y la infección crónica.

Las proteínas urinarias se derivan fundamentalmente de las proteínas plasmáticas que se filtran a través del riñón. La aparición de proteínas plasmáticas anormales en la orina tiene un gran valor para evaluar la función renal. El estudio adecuado de la proteinuria debe incluir la evaluación cuantitativa y cualitativa del tipo y la cantidad de proteínas excretadas1-5. La combinación de la separación electroforética de las proteínas urinarias, junto con la identificación de tipos específicos de proteínas mediante inmunoprecipitación permite la diferenciación de varios tipos de proteinuria - fisiológica, glomerular (selectiva y no selectiva), tubular y proteinuria asociada a disglobulinemias1-5.


36


ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONESLos reactivos contenidos en este kit son exclusivamente para uso diagnóstico in vitro. No ingiera ni pipetee con la boca ningún componente del kit. Lleve guantes al manipular todos los componentes del kit. Consulte la ficha técnica de seguridad del producto para ver las frases de riesgo y seguridad y la información sobre eliminación.

COMPOSICIÓNAntisueros anti-IgG humana. REF HL-3-2125SA (1 x 50 pruebas). 1. Antisueros anti-IgA humana. REF HL-3-2126SA (1 x 50 pruebas). 2. Antisueros anti-IgM humana. REF HL-3-2127SA (1 x 50 pruebas). 3. Antisueros anti-kappa humana. REF HL-3-2128SA (1 x 50 pruebas).4. Antisueros anti-lambda humana. REF HL-3-2129SA (1 x 50 pruebas). 5. Cada frasco contiene la cantidad suficiente de antisuero para 50 tests. El antisuero está listo para su uso y debe colocarse en el lugar apropiado del instrumento Helena V8, tal como se indica en el manual del operario.Instrucciones de Uso. 6. Cada kit contiene instrucciones de uso.

CONSERVACIÓN Y PERÍODO DE VALIDEZ

Antisueros anti-IgG humana. 1. Antisueros anti-IgA humana. 2. Antisueros anti-IgM humana. 3. Antisueros anti-kappa humana. 4. Antisueros anti-lambda humana. Los antisueros deben guardarse a 2-8 °C y permanecen estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Los frascos abiertos permanecen estables durante 4 semanas cuando se guardan a 2-8 °C. Asegúrese de que vuel-ven a colocarse las tapas de los viales de antisueros cuando no estén en uso para reducir al mínimo las pérdidas por evaporación. Las soluciones de antisueros son transparentes e incoloras. Deseche las soluciones de antisueros si se observan cambios en su aspecto, por ejemplo, cambios de color o turbi-dez que indican contaminación bacterianas. NO CONGELE LAS SOLUCIONES DE ANTISUEROS.


37

es

ARTÍCULOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOSREF 830100 V8 Storage Buffer REF 830200 V8 Maintenance Buffer REF 800200 V8 Serum Protein 6-band Kit (si se realiza separación de 6 bandas análisis) REF 800500 V8 Serum Protein SPE Kit (si se realiza separación SPE análisis) REF 800800 V8 Serum Protein 6-band Zoom Kit (si se realiza separación de 6 bandas Zoom análisis) REF 830400 V8 Clinical Waste Drawer Pack

ARTICULOS OPCIONALESREF 800410 Tampón de preparación de orina SP6 de V8 REF 800411 Tampón de preparación de orina SP6 Zoom de V8 REF 800412 Tampón de preparación de orina SP6 de V8 REF VS2002 Concentradores de centrífuga Sartorius VivaSpin 20 REF GEHE 17-0853-02 Columnas de desalación NAP-5 de GE Healthcare - si realiza inmunodesplazamiento en orina

REF 820500 Kit de kappa libre / lambda libre V8 REF 821400 Kit de Anti IgD / Anti IgE V8

RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRASPara el análisis de proteínas en el suero, la muestra de elección es el suero recién recogido, porque las muestras de plasma contendrán una gran banda de fibrinógeno entre las fracciones beta y gamma. Las muestras pueden conservarse a 2-8 °C durante hasta 7 días y hasta 1 mes a -20 °C. Si las muestras deben conservarse congeladas, deben refrigerarse inmediamente y congelarse en el plazo de 8 horas después de la recogida. Conservar las muestras a 2-8 °C puede conducir a degradación de las proteínas, especialmente, pero no exclusiva-mente, de fracciones de complemento. En consecuencia, después de 7 días de conservación a 2-8 °C, podría no ser posible ya la detección de una región beta-2 diferenciada. NO conserve las muestras a temperatura ambiente - la muestra se degradará rápidamente. Las muestras que contienen crioglobulinas pueden hacerse viscosas o turbias después de la refrigeración o congela-ción. Es aconsejable calentar estas muestras a temperatura ambiente antes del análisis.


38


Para el análisis de orina, la muestra de elección es orina recién recogida (recogida de 24 horas). Las muestras se pueden guardar a una temperatura entre 2 y 6 °C hasta 7 días. Para períodos de conservación más largos, se recomienda conservar las muestras a 70 °C, durante hasta 1 mes. NO conservar las muestras a -20 °C. Las muestras de orina deben desalinizarse antes del análisis en el sistema V8, usando una de las combinaciones opcionales de tampón y dispositivo de preparación de la orina enumeradas antes.

PROCEDIMIENTO PASO A PASOCompruebe que el cajón contenedor de residuos está colocado y vacío.1. Antes de encender el V8, compruebe que el tampón de conservación y el tampón 2. de mantenimiento y las copas desechables están colocados y en sus posiciones correctas. Para la instalación correcta de todos los consumibles, consulte el manual del usuario.Lance el Platinum 4V y comience una nueva sesión de EC. En el Platinum 4V, 3. seleccione “CE System” (Sistema EC) del menu desplegable, haga clic en “DEFAULT METHOD” y compruebe que está seleccionado el Immunodisplacement assay relevante (consulte el manual del usuario). Para las pruebas debidas a otros resultados o las pruebas individuales, consulte el manual del usuario.Active el Helena V8 tal como se indica en el manual del operario.4. Para realizar las pruebas de inmunodesplazamiento, instale el tampón de proteínas 5. séricas correspondiente y el diluyente, si es necesario. Para la instalación correcta de todos los frascos de tampón de proteínas séricas y de los diluyentes de proteínas séricas, consulte el manual del usuario.Asegúrese de que la información del código de barras del reactivo de 6. inmunodesplazamiento se carga en Platinum 4V seleccionando “CE SYSTEM” (SISTEMA CE) en el menú desplegable. Haga clic en “DEFINE REAGENTS” (DEFINIR REACTIVOS) y compruebe que la información del código de barras de cada tipo de antisuero se ha introducido y que la localización de la información del reactivo se corresponde con la localización del vial prevista en el interior del V8. Quite la tapa de los viales de antisueros y colóquelos en el hueco para reactivos 7. del V8.Cuando el V8 esté listo para aceptar muestras para el funcionamiento, el 8. instrumento emitirá pulsos rojos.En las muestras que se hayan pedido para pruebas consecutivas a otros 9. resultados y NO estén la en el V8, coloque cada tubo de muestra primaria en el bastidor de muestras, comprobando que el código de barras está claramente visible a través de la ventana del bastidor (consulte el manual del usuario).Cargue los bastidores de muestras en el lado izquierdo del área de transporte de 10. muestras del V8 y cierre la tapa como se indica en el manual del usuario.


39

es

El V8 comenzará automáticamente el análisis de todas las muestras cargadas y los 11. resultados se transferirán al Platinum 4V.Después del análisis y si es necesario, inicie el modo de apagado del V8 apagando 12. el instrumento como se indica en el manual del usuario.Es importante que el V8 se posacondicione adecuadamente al final del día.13. Consulte el manual del usuario.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOSLa mayoría de las proteínas monoclonales migran en la región gamma catódica del patrón de proteínas, pero, debido a su naturaleza anómala, lo hacen a cualquier lugar de la región globulina en la electroforesis capilar. El inmunodesplazamiento es una técnica analítica sustractiva y se identifica la proteína anormal observando qué tipos de antisueros reaccionan con él, lo que lleva a que el pico identificado originalmente se reduzca o se elimine en los electroferogramas de EC de prueba. Hay que tener cuidado al analizar los resultados, porque se eliminarán del trazado las inmunoglobulinas policlonales normales, así como las paraproteínas anormales. Por tanto, debe prestarse atención a la forma de los electrofero-gramas de la prueba así como a las áreas de sus picos relativos.

CONTROL DE CALIDADPuede usarse el Helena Biosciences Abnormal CEtrol Serum Control (REF –802500) para verificar todas las fases del procedimiento de inmunodesplazamiento.

LIMITACIONESReacción con antisueros de cadena ligera kappa o lambda pero ausencia de 1. reacción con antisueros de cadena pesada IgG, IgA o IgM. Las muestras que tienen esté patrón podrían corresponder a una gammapatía monoclonal de cadena ligera libre o podrían tener una proteína monoclonal IgD o IgE. En esta situación, debería repetirse la ID, cambiando por antisueros IgD e IgE dos de los otros antisueros de cadenas pesadas. Si no se obtiene una reacción con antisueros IgD o IgE, eso indicaría una enfermedad de cadenas ligeras libres.Banda en la región gamma que no muestra reactividad con antisueros 2. ID. Podría detectarse proteína C reactiva (PCR) en pacientes con respuesta inflamatoria aguda6-7. La elevación de alfa-1 antitripsina y de haptoglobina son pruebas en apoyo de la PCR.Falta de reactividad con antisueros kappa y lambda Ocasionalmente.3. una muestra tendrá una reacción con un antisuero de cadena pesada, pero no se apreciará reacción de cadena ligera. En esta situación, es necesario descartar lo siguiente-

Enfermedad de cadena pesada,a.


40


Concentraciones muy elevadas de cadenas ligeras, que conducen a exceso b. de antígeno,Concentraciones bajas de cadenas ligeras,c. Molécula atípica de cadena ligera que no reacciona con el antisuero,d. Cadenas ligeras con determinantes ‘ocultos’ de cadenas ligeras (como se ve e. a veces con IgA e IgD).

Reactividad cruzada de los antisueros4. . Debido a la naturaleza modificada de las moléculas de anticuerpos para inmunodesplazamiento, las reacciones anticuerpo/antígeno producidas en los capilares pueden motivar la reacción cruzada de algunos antisueros con los componentes monoclonales presentes en una muestra. La reactividad cruzada, bastante inusual, puede dar lugar a la conclusión clínica de una gammapatía biclonal. Si se sospecha la reactividad cruzada de los antisueros, serán necesarias nuevas pruebas con inmunofijación en gel para confirmar los resultados. No hay riesgo de falsos resultados negativos a consecuencia de la reactividad cruzada.

Los antisueros de inmunodesplazamiento son capaces de eliminar por completo los picos monoclonales de < 30 g/l de muestras de suero y de < 0,6 g/l de muestras de orina. Las gammaglobulinas que superen con mucho estas concentraciones podrían no eliminarse completamente del tra-zado, haciendo que la interpretación de los resultados sea difícil. En tales casos, se aconseja diluir la muestra original del paciente con solución salina isotónica o el tampón adecuado de preparación de orina V8 para reducir la concen-tración de proteínas a un nivel al que pueda producirse un desplazamiento completo y repetir el procedimiento del ensayo de inmunodesplazamiento. Como opción, puede usarse la función de superar dilución para reducir la concen-tración de proteína a un nivel al que pueda producirse un desplazamiento completo. Consulte el manual del operador para obtener más información.

SENSIBILIDADEl kit de inmunodesplazamiento V8 es capaz de inmunotipificar gammapatías monoclonales con concentraciones de proteínas séricas de 0,208 g/l o concentraciones de proteínas urinarias de 0,02 g/l o superiores.

CARACTERÍSTICAS FUNCIONALESSe estudió una serie de muestras y se comparó con otro kit de prueba disponible comercialmente – ambos kits mostraron resultados equivalentes.


41

es

BIBLIOGRAFÍAFauchier, P. and Catalan, F. ‘Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis’ Alfred 1. Fournier Institute, Paris, France, 1988.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. ‘Finding Clues to Disease in 2. Urine’ Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : 69-75.Umbreit, A. and Wiedemann, G. ‘Determination of Urinary Protein Fractions. A 3. Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations’ Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172.Wiedemann, G. and Umbreit, A. ‘Determination of Urinary Protein Fractions by 4. Different Electrophoretic Methods’, Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262.Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and 5. Lockhart, S. ‘A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria’ Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : 371-374.Jeppsson, J.O., Laurell, C.B. and Franzen, B., ‘Agarose Gel Electrophoresis’, Clin. 6. Chem., 1979; 25 (4) : 629-638.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M., ‘Protein Analysis’, Diagnostic 7. Medicine, 1980; Jan/Feb : 3-15.


42



43

pt

PortuguêsOBJECTIVO DO KITO Kit V8 Immunodisplacement (Kit V8 de Imunodeslocamento) é indicado para a separação e identificação de gamapatias monoclonais por electroforese capilar de zona. Esta técnica separa as proteínas com base na sua carga total numa solução tampão alcalina, em combinação com a sua interacção divergente com a parede do capilar de sílica.

A imunotipagem das gamaglobulinas é realizada analisando alíquotas da amostra com uma bateria de anti-soros monospecíficos. O complexo formado pelos anti-soros de teste e a sua proteína alvo possui um perfil de migração modificada e é, portanto, deslocado a partir do electroferograma padrão de proteínas séricas. Comparando os resultados da bateria de teste com uma análise de referência, pode determinar-se o tipo de imunoglobulina presente pela remoção ou redução específica do pico anormal do electroferograma de EC.

O Imunodeslocamento é utilizado principalmente em laboratórios de análises clínicas para a detecção de gamapatias monoclonais. Uma gamapatia monoclonal é um estado patológico primário no qual um único clone de células plasmáticas produz níveis elevados de uma imunoglobulina de uma única classe e de um único tipo. Tais imunoglobulinas são denominadas proteínas monoclonais, proteínas M ou paraproteínas. A sua presença pode ser de natureza benigna ou ter um significado incerto. Em alguns casos são indicativas de uma doença maligna como, por exemplo, o mieloma múltiplo ou a macroglobulinemia de Waldenström. Deve efectuar-se a diferenciação entre as gamapatias policlonais e as gamapatias monoclonais, pois as gamapatias policlonais constituem um estado patológico secundário devido a anomalias clínicas como doença hepática crónica, doenças do colagénio, artrite reumatóide e infecção crónica.

As proteínas urinárias provêm principalmente de proteínas plasmáticas que são filtradas através dos rins. O aparecimento de proteínas plasmáticas anormais na urina é muito importante para a avaliação da função renal. Um estudo adequaado da proteinúria deve incluir uma avaliação quantitativa e qualitativa do tipo e quantidade das proteínas excretadas1-5. A combinação da separação electroforética de proteínas urinárias com a identificação dos tipos específicos de proteínas por imunoprecipitação, permite diferenciar entre vários tipos de proteinúrias: fisiológica, glomerular (selectiva e não selectiva), tubular e proteinúria associada a disglobulinemias1-5.


44


ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕESOs reagentes incluídos neste kit são exclusivamente para uso em diagnóstico in vitro. Não ingerir nem pipetar com a boca nenhum dos componentes do kit. Usar luvas ao manusear todos os componentes do kit. Consultar a ficha de dados de segurança do produto no que respeita às frases de risco e segurança e informações sobre eliminação.

COMPOSIÇÃOAnti-human IgG antisera (Anti-soros anti-IgG humana). REF HL-3-2125SA (1 1. x 50 testes). Anti-human IgA antisera (Anti-soros anti-IgA humana). REF HL-3-2126SA (1 2. x 50 testes).Anti-human IgM antisera (Anti-soros anti-IgM humana). REF HL-3-2127SA (1 3. x 50 testes).Anti-human kappa antisera (Anti-soros anti-capa humana) REF HL-3-2128SA 4. (1 x 50 testes).Anti-human lambda antisera (Anti-soros anti-lambda humana). REF HL-3-5. 2129SA (1 x 50 testes). Cada frasco contém suficiente anti-soro para realizar 50 testes. Os anti-soros estão prontos a ser utilizados e devem ser colocados no local apropriado do instrumento Helena V8, tal como indicado no manual do operador.Instruções de utilização. 6. Cada kit contém Instruções de Utilização.

CONSERVAÇÃO E PRAZO DE VALIDADEAnti-soros anti-IgG humana.1. Anti-soros anti-IgA humana.2. Anti-soros anti-IgM humana. 3. Anti-soros anti-capa humana.Anti-soros anti-lambda humana. 4. Os anti-soros devem ser conservados a 2…8°C e permanecem estáveis até ao prazo de validade indicado no rótulo. Os frascos abertos são estáveis durante 4 semanas quando conservados a 2…8°C. Assegurar-se de que os frascos com os anti-soros estão tapados quando não estão em uso para minimizar as perdas por evaporação. As soluções dos anti-soros são límpidas e incolores. Eliminar as soluções dos anti-soros caso se detectem alterações no seu aspecto, por exemplo, coloração ou turvação indicativas de contaminação bacteriana. NÃO CONGELAR AS SOLUÇÕES DE ANTI-SOROS.


45

pt

COMPONENTES NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOSREF 830100 V8 Storage Buffer (tampão de conservação) REF 830200 V8 Maintenance Buffer (tampão de manutenção) REF 800200 V8 Serum Protein 6-band Kit (no caso de separação em 6 bandas análise) REF 800500 V8 Serum Protein SPE Kit (no caso de separação em 6 bandas análise) REF 800800 V8 Serum Protein 6-band Zoom Kit (no caso de separação em 6 bandas análise) REF 830400 V8 Clinical Waste Drawer Pack (embalagem do tabuleiro para resíduos clínicos)

COMPONENTES FACULTATIVOSREF 800410 V8 Urine Preparation Buffer SP6 (Tampão de preparação da urina SP6) REF 800411 V8 Urine Preparation Buffer SP6 Zoom (Tampão de preparação da urina SP6 Zoom) REF 800412 V8 Urine Preparation Buffer SPE (Tampão de preparação da urina SPE) REF VS2002 Sartorius VivaSpin 20 Centrifugal Concentrators (Concentradores centrífugos) REF GEHE17-0853-02 GE Healthcare NAP-5 Desalting Columns (Colunas de dessalinização) - caso se efectue o imunodeslocamento de urina


RECOLHA E PREPARAÇÃO DE AMOSTRASNo caso de análise das proteínas séricas, a amostra de eleição é o soro recentemente colhido, dado que as amostras de plasma conterão uma banda larga de fibrinogénio entre as fracções beta e gama. As amostras podem ser conservadas a 2…8ºC durante um máximo de 7 dias e até 1 mês a -20ºC. Se as amostras tiverem de ser conservadas congeladas, devem ser imediatamente refrigeradas e congeladas num período de 8 horas após a colheita. A conservação de amostras a 2…8°C pode resultar na degradação de proteínas, especialmente, mas não exclusivamente, das fracções do complemento. Consequentemente, após 7 dias de conservação a 2…8°C, pode já não ser possível detectar uma região beta-2 distinta. NÃO conservar as amostras à temperatura ambiente - a amostra sofrerá uma degradação rápida. As amostras que contêm crioglobulinas podem ficar viscosas ou turvas após refrigeração ou congelação. É aconselhável aquecer estas amostras à temperatura ambiente antes da análise.


46


No caso de análise de urina, a amostra de eleição é a urina recentemente colhida (recolha em 24 horas). As amostras podem ser conservadas a 2…6ºC durante um máximo de 7 dias. No caso de períodos de conservação mais longos, recomenda-se conservar as amostras a -70°C, durante um máximo de 1 mês. NÃO conservar as amostras a -20°C. As amostras de urina devem ser dessalinizadas antes da análise no sistema V8, utilizando um tampão opcional de preparação da urina e as combinações do dispositivo acima indicadas.

PROCEDIMENTO PASSO A PASSOCertificar-se de que o tabuleiro do recipiente de resíduos está instalado.1. Antes de ligar o V8, certificar-se de que o tampão de conservação, o tampão 2. de manutenção e as cúpulas descartáveis estão instalados e nas posições devidas. Consultar o manual do operador para a instalação correcta de todos os consumíveis.Efectuar o arranque do Platinum 4V e iniciar nova sessão de electroforese capilar 3. (EC). No Platinum 4V, seleccionar “CE SYSTEM” (Sistema de CE) no menu pendente, clicar em “DEFAULT METHOD” (Método predefinido) e certificar-se de que foi seleccionado o ensaio de imunodeslocamento pertinente (consultar o manual do operador). Para realizar ensaios complementares secundários ou para encomendar ensaios específicos, consultar o manual do operador.Ligar o Helena V8 tal como indicado no manual do operador.4. Para realizar os testes de imunodeslocamento, instalar o tampão de proteínas 5. séricas e o solvente relevantes, se necessário. Consultar o manual do operador para efectuar a instalação correcta de todos os frascos de tampão de proteínas séricas e de solventes de proteínas séricas.Certificar-se de que as informações do código de barras do reagente de 6. Imunodeslocamento são carregadas no Platinum 4V, seleccionando “CE SYSTEM” (Sistema de EC) no menu pendente. Clicar em “DEFINE REAGENTS” (Definir reagentes) e certificar-se de que foram introduzidas as informações do código de barras de cada tipo de anti-soro e que o posicionamento da informação do reagente corresponde à posição prevista do frasco no V8.Retire a tampa dos frascos de anti-soros e coloque-os no suporte de reagentes 7. do V8.Quando o V8 estiver pronto para aceitar amostras para análise, o instrumento 8. emitirá uma luz intermitente vermelha.No caso de amostras que tenham sido encomendadas para ensaios 9. complementares secundários e que NÃO estejam ainda instaladas no V8, colocar cada tubo de ensaio inicial no suporte de amostras, assegurando-se de que o código de barras é claramente visível através da janela do suporte (consultar o manual do operador).


47

pt

Colocar os suportes de amostras no lado esquerdo da zona de transporte de 10. amostras do V8 e fechar a tampa, como indicado no manual do operador.O V8 iniciará automaticamente a análise de todas as amostras carregadas e os 11. resultados serão transferidos para o Platinum 4V.Depois de efectuada a análise, iniciar o modo de encerramento do V8, desligando 12. o instrumento como indicado no manual do operador.É importante que o V8 seja correctamente acondicionado no fim do dia.13. Consultar o manual do operador.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOSA maioria das proteínas monoclonais migra na região do cátodo da zona gama do proteinograma, mas devido à sua natureza anormal, podem migrar para qualquer local na região das globulinas em electroforese capilar. O imunodeslocamento é uma técnica analítica subtractiva e a proteína anormal é identificada registando os tipos de anti-soros que reagem com ela, resultando na redução ou remoção do pico inicialmente identificado nos electroferogramas de EC de teste. Deve ter-se cuidado ao analisarem-se os resultados, dado que imunoglobulinas policlonais normais serão removidas do traçado assim como as paraproteínas anormais. Portanto, deve prestar-se atenção às formas dos electroferogramas de teste assim como às áreas relativas dos respectivos picos.

CONTROLO DA QUALIDADEPode usar-se o Helena Biosciences Abnormal CEtrol Serum Control REF. 802500 para verificar todas as fases do procedimento de imunodeslocamento.

LIMITAÇÕESReacção com antisoros de cadeia leve kapa ou lambda mas ausência de 1. reacção com antisoros de cadeia pesada IgG, IgA ou IgM. As amostras que exibem este padrão podem ter ou uma gamapatia monoclonal de cadeia leve livre ou uma proteína monoclonal IgD ou IgE. Neste caso deve repetir-se o ID, substituindo os antisoros IgD e IgE por dois dos outros antisoros de cadeia pesada. A ausência de reacção com os antisoros IgD ou IgE, indica doença das cadeias leves livres.Banda na região gama não revela reactividade com os antisoros do ID. 2. A proteína reactiva C (PRC) pode ser detectada em doentes com uma reacção inflamatória aguda6-7. Os níveis elevados de antitripsina alfa-1 e de haptoglobina confirmam a presença de PRC.Ausência de reactividade com antisoros kapa e lambda.3. De vez em quando uma amostra tem uma reacção com um antisoro de cadeia pesada, mas não é óbvia uma reacção com as cadeias leves. Neste caso é necessário confirmar a ausência do seguinte:


48


Doença das cadeias pesadas,a. Concentrações muito elevadas de cadeias leves, resultando num excesso de b. antigénios,Concentrações baixas de cadeias leves,c. Molécula atípica de cadeia leve que não reage com o antisoro,d. Cadeias leves com determinantes “escondidos” de cadeia leve (o que por e. vezes se verifica com IgA e IgD).

Reactividade Cruzada dos Anti-soros4. . Dada a natureza modificada das moléculas do imunodeslocamento dos anticorpos, as reacções anticorpo-antígeno efectuadas em capilar podem causar uma reacção cruzada entre os anti-soros e os componentes monoclonais presentes na amostra. A reactividade cruzada, que ocorre raras vezes, pode levar à conclusão clínica de que se trata de uma gamapatia biclonal. Em caso de suspeita da reactividade cruzada dos anti-soros, pode ser necessário efectuar testes adicionais, por meio da imunofixação com gel, para confirmar os resultados. A reactividade cruzada não causa risco de resultados falso negativos.

Os anti-soros de imunodeslocamento são capazes de remover completamente os picos monoclonais de < 30 g/l das amostras séricas e de < 0,6 g/l das amostras de urina. As gamaglobulinas em níveis muito superiores a estas concentrações podem não ser totalmente removidas do traçado, dificultando a interpretação dos resultados. Nestes casos, é aconselhável que a amostra original do doente seja diluída com solução salina isotónica ou com o Tampão de Preparação de Urina V8 apropriado para diminuir a concentração de proteínas para um nível no qual o deslocamento completo pode ocorrer e que o procedimento de análise por Imunodeslocamento seja repetido. Como alternativa, pode uti-lizar-se a função de diluição sobreposta para diminuir a concentração de proteínas para um nível em que pode ocorrer o deslocamento completo. Consultar o manual do operador para mais informações.

SENSIBILIDADEO Kit de Imunodeslocamento V8 pode efectuar a imunotipagem de gamapatias monoclonais com con-centrações de proteínas séricas de 0,208 g/l ou com concentrações de proteínas urinárias de 0,02 g/l ou supe-riores.

CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHOAnalisou-se uma série de amostras e comparou-se com um outro kit comercialmente disponível – ambos os kits deram resultados equivalentes.


49

pt

BIBLIOGRAFIAFauchier, P. and Catalan, F. ‘Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis’ Alfred 1. Fournier Institute, Paris, France, 1988.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. ‘Finding Clues to Disease in 2. Urine’ Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : 69-75.Umbreit, A. and Wiedemann, G. ‘Determination of Urinary Protein Fractions. A 3. Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations’ Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172.Wiedemann, G. and Umbreit, A. ‘Determination of Urinary Protein Fractions by 4. Different Electrophoretic Methods’, Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262.Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and 5. Lockhart, S. ‘A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria’ Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : 371-374.Jeppsson, J.O., Laurell, C.B. and Franzen, B., ‘Agarose Gel Electrophoresis’, Clin. 6. Chem., 1979; 25 (4) : 629-638.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M., ‘Protein Analysis’, Diagnostic 7. Medicine, 1980; Jan/Feb : 3-15.


50



51

el

ΕλληνικάΣΚΟΠΟΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΟΠΟΙΟ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙΤο κιτ ανοσολογικής εκτόπισης V8 προορίζεται για τον διαχωρισμό και την ταυτοποίηση μονοκλωνικών γαμμαπαθειών με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (CΕ). Με αυτή την τεχνική διαχωρίζονται οι πρωτεΐνες με βάση το ουδέτερο φορτίο τους σε διάλυμα αλκαλικού ρυθμιστικού διαλύματος σε συνδυασμό με τη διαφοροποίηση ως προς την αλληλεπίδραση με τα τοιχώματα του τριχοειδούς από οξείδιο του πυριτίου.

Ο προσδιορισμός ανοσοτύπου των γάμμα σφαιρινών επιτυγχάνεται με εξέταση κλασμάτων δείγματος με μια ομάδα μονοδύναμων αντιορών. Το σύμπλεγμα που σχηματίζεται από τους αντιορούς της εξέτασης και την πρωτεΐνη-στόχο τους έχει ένα τροποποιημένο προφίλ μετακίνησης και, επομένως, εντοπίζεται σε διαφορετική θέση σε σχέση με το τυπικό ηλεκτροφόρημα πρωτεϊνών ορού. Με σύγκριση των αποτελεσμάτων της ομάδας εξετάσεων με μια ανάλυση αναφοράς, ο τύπος ανοσοσφαιρινών που ανευρίσκεται μπορεί να καθοριστεί από συγκεκριμένη μετακίνηση ή μείωση της παθολογικής κορυφής στο ηλεκτροφόρημα της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης(CE).

Η μέθοδος ανοσολογικής εκτόπισης χρησιμοποιείται κατά κόρον στα κλινικά εργαστήρια, κυρίως για την ανίχνευση των μονοκλωνικών γαμμαπαθειών. Η μονοκλωνική γαμμαπάθεια είναι μια πρωτοπαθής παθολογική κατάσταση, στην οποία ένας και μόνον κλώνος πλασματοκυττάρων παράγει αυξημένα επίπεδα μίας ανοσοσφαιρίνης συγκεκριμένης τάξης και τύπου. Οι ανοσοσφαιρίνες αυτές αναφέρονται ως μονοκλωνικές πρωτεΐνες, πρωτεΐνες Μ ή παραπρωτεΐνες. Η παρουσία τους ενδέχεται να είναι καλοήθους φύσεως ή αμφίβολης σημασίας. Σε ορισμένες περιπτώσεις, είναι ενδεικτικές κάποιας κακοήθειας, όπως το πολλαπλό μυέλωμα ή η μακροσφαιριναιμία του Waldenström. Θα πρέπει να γίνεται διάκριση μεταξύ πολυκλωνικών και μονοκλωνικών γαμμαπαθειών, καθώς οι πολυκλωνικές γαμμαπάθειες αποτελούν μια δευτεροπαθή παθολογική κατάσταση που οφείλεται σε κλινικές διαταραχές όπως η χρόνια ηπατική νόσος, οι διαταραχές του κολλαγόνου, η ρευματοειδής αρθρίτιδα και οι χρόνιες λοιμώξεις.

Οι πρωτεΐνες των ούρων προέρχονται κυρίως από τις πρωτεΐνες του πλάσματος που διηθούνται μέσω των νεφρών. Η εμφάνιση παθολογικών πρωτεϊνών πλάσματος στα ούρα είναι πολύτιμη για την αξιολόγηση της νεφρικής λειτουργίας. Η κατάλληλη μελέτη της πρωτεϊνουρίας θα πρέπει να περιλαμβάνει ποσοτική και ποιοτική εκτίμηση του τύπου και της ποσότητας των πρωτεϊνών που απεκκρίνονται1-5. Ο συνδυασμός του ηλεκτροφορητικού διαχωρισμού


52


των πρωτεϊνών ούρων μαζί με την ταυτοποίηση ειδικών τύπων πρωτεϊνών με ανοσοκατακρήμνιση επιτρέπει τη διαφοροποίηση διαφόρων τύπων πρωτεϊνουρίας - φυσιολογική, σπειραματική (εκλεκτική και μη εκλεκτική), σωληναριακή πρωτεϊνουρία, καθώς και πρωτεϊνουρία που σχετίζεται με δυσφαιριναιμίες1-5.

ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣΤα αντιδραστήρια που περιέχονται σε αυτό το κιτ προορίζονται αποκλειστικά για in vitro διαγνωστική χρήση. Μην καταπίνετε και μην αναρροφάτε με το στόμα κανένα από τα συστατικά του κιτ. Να φοράτε γάντια κατά το χειρισμό όλων των συστατικών του κιτ. Ανατρέξτε στο φύλλο δεδομένων ασφάλειας του προϊόντος για τις φράσεις κινδύνου και ασφάλειας, καθώς και για πληροφορίες σχετικά με την απόρριψη.

ΣΥΝΘΕΣΗΑντιοροί έναντι της ανθρώπινης IgG. REF HL-3-2125SA (1 x 50 εξετάσεις). 1. Αντιοροί έναντι της ανθρώπινης IgA. REF HL-3-2126SA (1 x 50 εξετάσεις). 2. Αντιοροί έναντι της ανθρώπινης IgM. REF HL-3-2127SA (1 x 50 εξετάσεις). 3. Αντιοροί έναντι των ανθρώπινων κ αλύσων. REF HL-3-2128SA (1 x 50 4. εξετάσεις). Αντιοροί έναντι των ανθρώπινων λ αλύσων. REF HL-3-2129SA (1 x 50 5. εξετάσεις). Κάθε φιάλη περιέχει αρκετή ποσότητα αντιορών για τη διενέργεια 50 εξετάσεων. Οι αντιοροί είναι έτοιμοι για χρήση και θα πρέπει να τοποθετούνται στην κατάλληλη θέση στο όργανο V8 της Helena, σύμφωνα με τις οδηγίες που αναγράφονται στο εγχειρίδιο χρήσης.Οδηγίες χρήσης. 6. Κάθε κιτ περιέχει οδηγίες χρήσης.

ΦΥΛΑΞΗ ΚΑΙ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΖΩΗΣΑντιοροί έναντι της ανθρώπινης IgG.1. Αντιοροί έναντι της ανθρώπινης IgA.2. Αντιοροί έναντι της ανθρώπινης IgM.3. Αντιοροί έναντι των ανθρώπινων κ αλύσων. 4. Αντιοροί έναντι των ανθρώπινων λ αλύσων. Οι αντιοροί θα πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία 2…8 °C και παραμένουν σταθεροί μέχρι την ημερομηνία λήξης που υποδεικνύεται στην ετικέτα. Οι ανοιγμένες φιάλες παραμένουν σταθερές για 4 εβδομάδες όταν φυλάσσονται σε θερμοκρασία 2…8 °C. Βεβαιωθείτε ότι τα φιαλίδια των αντιορών επαναπωματίζονται όταν δεν χρησιμοποιούνται, ώστε να ελαχιστοποιούνται οι απώλειες λόγω εξάτμισης.


53

el

Τα διαλύματα αντιορών είναι διαυγή και άχρωμα. Απορρίψτε τα διαλύματα αντιορών, εάν παρατηρήσετε μεταβολές στην εμφάνισή τους, για παράδειγμα χρωματισμό ή θολερότητα που υποδεικνύει επιμόλυνση από βακτήρια. ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ ΤΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΑΝΤΙΟΡΩΝ.

ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΟΥΝΤΑΙ ΑΛΛΑ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙREF 830100 V8 Storage Buffer REF 830200 V8 Maintenance Buffer REF 800200 V8 Serum Protein 6-band Kit (σε περίπτωση διενέργειας διαχωρισμού 6 Ανάλυση) REF 800500 V8 Serum Protein SPE Kit (σε περίπτωση διενέργειας διαχωρισμού 6 Ανάλυση) REF 800800 V8 Serum Protein 6-band Zoom Kit (σε περίπτωση διενέργειας διαχωρισμού 6 Ανάλυση) REF 830400 V8 Clinical Waste Drawer Pack

ΠΡΟΑΙΡΕΤΙΚΑ ΕΙΔΗREF 800410 Ρυθμιστικό διάλυμα παρασκευής ούρων SP6 V8 REF 800411 Ρυθμιστικό διάλυμα παρασκευής ούρων SP6 Zoom V8 REF 800412 Ρυθμιστικό διάλυμα παρασκευής ούρων SPE V8 REF VS2002 Σωληνάρια συμπύκνωσης με φυγοκέντρηση VivaSpin 20 της Sartorius REF GEHE 17-0853-02 Στήλες αφαλάτωσης NAP-5 της GE Healthcare - σε περίπτωση διενέργειας ανοσολογικής εκτόπισης ούρων

REF 820500 Κιτ ελεύθερων κ αλύσων/ελεύθερων λ αλύσων V8 REF 821400 Κιτ Αντι-IgD / Αντι-IgE V8


54


ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣΓια την ανάλυση πρωτεϊνών ορού, το προτιμώμενο δείγμα είναι ορός που έχει συλλεχθεί πρόσφατα, καθώς τα δείγματα πλάσματος θα δώσουν μια μεγάλη ζώνη ινωδογόνου μεταξύ των κλασμάτων βήτα και γάμμα. Τα δείγματα μπορούν να φυλάσσονται σε θερμοκρασία 2…8 °C επί έως και 7 ημέρες και επί έως και 1 μήνα στους -20 °C. Εάν τα δείγματα πρέπει να φυλαχθούν στην κατάψυξη, θα πρέπει να ψύχονται αμέσως και να καταψύχονται εντός 8 ωρών από τη συλλογή. Η φύλαξη των δειγμάτων σε θερμοκρασία 2…8 °C μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα αποικοδόμηση πρωτεϊνών και ειδικά, αλλά όχι αποκλειστικά, των κλασμάτων του συμπληρώματος. Κατά συνέπεια, μετά από φύλαξη επί 7 ημέρες σε θερμοκρασία 2…8 °C, ενδέχεται να μην είναι πλέον δυνατή η ανίχνευση μιας διακριτής περιοχής βήτα-2. ΜΗ φυλάσσετε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου - το δείγμα θα αποικοδομηθεί ταχέως. Τα δείγματα που περιέχουν κρυοσφαιρίνες ενδέχεται να εμφανίσουν υψηλό ιξώδες ή θολερότητα μετά την ψύξη ή την κατάψυξη. Συνιστάται να αφήνετε αυτά τα δείγματα να φθάσουν σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την ανάλυση.

Για ανάλυση ούρων, το προτιμώμενο δείγμα είναι ούρα που έχουν συλλεχθεί πρόσφατα (συλλογή 24ώρου). Tα δείγματα μπορούν να αποθηκευθούν σε θερμοκρασία 2…8 °C για έως και 7 ημέρες. Για περιόδους φύλαξης μεγαλύτερης διάρκειας, συνιστάται η φύλαξη των δειγμάτων σε θερμοκρασία -70 °C, έως και 1 μήνα. ΜΗ φυλάσσετε τα δείγματα σε θερμοκρασία -20 °C. Τα δείγματα ούρων πρέπει να αφαλατώνονται πριν από την ανάλυση στο σύστημα V8, με χρήση ενός από τους προαιρετικούς συνδυασμούς ρυθμιστικού διαλύματος παρασκευής ούρων και συσκευής, οι οποίοι παρατίθενται παραπάνω.

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΒΗΜΑ ΠΡΟΣ ΒΗΜΑΒεβαιωθείτε ότι το συρτάρι του δοχείου αποβλήτων βρίσκεται στο όργανο.1. Προτού ενεργοποιήσετε το όργανο V8, βεβαιωθείτε ότι το ρυθμιστικό 2. διάλυμα φύλαξης, το ρυθμιστικό διάλυμα συντήρησης και οι αναλώσιμοι υποδοχείς βρίσκονται στο όργανο και στις σωστές θέσεις τους. Για τη σωστή εγκατάσταση όλων των αναλωσίμων, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης.Πραγματοποιήστε εκκίνηση του λογισμικού Platinum 4V και ξεκινήστε μια νέα 3. περίοδο λειτουργίας CE. Στο λογισμικό Platinum 4V, επιλέξτε «CE SYSTEM» από το αναπτυσσόμενο μενού, κάντε κλικ στο πλήκτρο «DEFAULT METHOD» και βεβαιωθείτε ότι είναι επιλεγμένη η σχετική ανάλυση Immunodisplacement assay (ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης). Για εντολή επαναληπτικής εξέτασης ή μεμονωμένης εξέτασης, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης.Ενεργοποιήστε το όργανο Helena V8, σύμφωνα με τις οδηγίες που 4. αναγράφονται στο εγχειρίδιο χρήσης.


55

el

Για να διενεργήσετε εξέταση ανοσολογικής εκτόπισης, εγκαταστήστε το 5. σχετικό διάλυμα Serum Protein Buffer και το διάλυμα αραίωσης Diluent, εάν απαιτείται. Για τη σωστή εγκατάσταση όλων των φιαλών ρυθμιστικού διαλύματος Serum Protein Buffer καθώς και των διαλυμάτων αραίωσης Serum Protein Diluent ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης.Βεβαιωθείτε ότι οι πληροφορίες γραμμικού κώδικα του αντιδραστηρίου 6. ανοσολογικής εκτόπισης έχουν καταχωριστεί στο λογισμικό Platinum 4V, επιλέγοντας «CE SYSTEM» (Σύστημα CE) από το αναπτυσσόμενο μενού. Κάντε κλικ στο πλήκτρο «DEFINE REAGENTS» (Ορισμός αντιδραστηρίων) και βεβαιωθείτε ότι έχουν εισαχθεί οι πληροφορίες γραμμικού κώδικα για κάθε τύπο αντιορού και ότι η θέση των πληροφοριών για το αντιδραστήριο αντιστοιχεί στη θέση στην οποία προορίζεται να τοποθετηθεί το φιαλίδιο στο όργανο V8. Αφαιρέστε τα πώματα από τα φιαλίδια αντιορών και τοποθετήστε τα στην 7. περιοχή αντιδραστηρίων του οργάνου V8.Όταν το όργανο V8 είναι έτοιμο να δεχτεί δείγματα για εκτέλεση ανάλυσης, 8. ένα κόκκινο φως θα αναβοσβήνει στο όργανο.Για δείγματα για τα οποία έχει δοθεί εντολή επαναληπτικής εξέτασης και ΔΕΝ 9. βρίσκονται ήδη στο όργανο V8, τοποθετήστε κάθε πρωτογενές σωληνάριο δείγματος στο φορέα δειγμάτων, διασφαλίζοντας ότι ο γραμμικός κώδικας είναι σαφώς ορατός μέσω του παραθύρου του φορέα (ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης).Τοποθετήστε τους φορείς δειγμάτων στην αριστερή πλευρά της περιοχής 10. μεταφοράς δειγμάτων του οργάνου V8 και κλείστε το καπάκι, σύμφωνα με τις οδηγίες που αναγράφονται στο εγχειρίδιο χρήσης.Tο όργανο V8 θα ξεκινήσει αυτόματα την ανάλυση όλων των δειγμάτων που 11. έχουν φορτωθεί και τα αποτελέσματα θα μεταφερθούν στο λογισμικό Platinum 4V.Μετά την ανάλυση, και εάν απαιτείται, ξεκινήστε τον τρόπο τερματισμού 12. λειτουργίας του οργάνου V8 απενεργοποιώντας το όργανο σύμφωνα με τις οδηγίες που αναγράφονται στο εγχειρίδιο χρήσης.Είναι σημαντικό να εκτελέσετε σωστή συντήρηση του οργάνου V8 μετά τη 13. χρήση, στο τέλος της ημέρας. Ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης.

ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝΗ πλειονότητα των μονοκλωνικών πρωτεϊνών κατευθύνεται προς την κάθοδο, στην περιοχή γ του προτύπου των πρωτεϊνών, αλλά λόγω της παθολογικής φύσης τους, πιθανόν να κατευθυνθούν σε οποιοδήποτε σημείο εντός της περιοχής των σφαιρινών στην τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Η ανοσολογική εκτόπιση είναι μια αφαιρετική αναλυτική τεχνική και η παθολογική πρωτεΐνη ταυτοποιείται παρατηρώντας ποιοι τύποι αντιορών αντιδρούν με αυτήν, γεγονός το οποίο έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση ή την απουσία της κορυφής που


56


είχε ταυτοποιηθεί αρχικά στα ηλεκτροφορήματα της εξέτασης CE. Θα πρέπει να δίνεται προσοχή κατά την ανάλυση των αποτελεσμάτων, καθώς οι φυσιολογικές πολυκλωνικές ανοσοσφαιρίνες θα απουσιάζουν από το ίχνος, όπως επίσης και οι παθολογικές παραπρωτεΐνες. Επομένως, πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στο σχήμα των ηλεκτροφορημάτων των εξετάσεων, καθώς επίσης και στο σχετικό εμβαδό των κορυφών τους.

ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣΤο διάλυμα ελέγχου Helena Biosciences Abnormal CEtrol Serum Control (αρ. κατ. –802500) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επαλήθευση όλων των φάσεων της διαδικασίας ανοσολογικής εκτόπισης.

ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙΑντίδραση με τους αντιορούς των ελαφρών κ ή λ αλύσων αλλά όχι με τους 1. αντιορούς των βαρέων αλύσων IgG, IgA ή IgM. Τα δείγματα που εμφανίζουν αυτό το πρότυπο προέρχονται από ασθενείς που ενδέχεται να έχουν είτε μια μονοκλωνική γαμμαπάθεια ελεύθερης ελαφριάς αλύσου είτε μια μονοκλωνική πρωτεΐνη IgD ή IgE. Στην περίπτωση αυτή, η ανοσολογική εκτόπιση θα πρέπει να επαναληφθεί, αντικαθιστώντας τους αντιορούς IgD και IgE με τους αντιορούς δύο άλλων βαρέων αλύσων. Η απουσία αντίδρασης με τους αντιορούς IgD ή IgE θα υποδεικνύει την ύπαρξη νόσου ελεύθερης ελαφριάς αλύσου.Η ζώνη στην περιοχή γ δεν εμφανίζει καμία αντίδραση με τους αντιορούς 2. ηλεκτροφόρησης ανοσοκαθήλωσης (ID). Είναι δυνατό να ανιχνευθεί C αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) σε ασθενείς με οξεία φλεγμονώδη αντίδραση6-7. Τα αυξημένα επίπεδα α1 αντιθρυψίνης και απτοσφαιρίνης αποτελούν υποστηρικτικές ενδείξεις για την ύπαρξη CRPΔεν υπάρχει αντίδραση με τους αντιορούς κ και λ.3. Περιστασιακά, ένα δείγμα θα εμφανίζει αντίδραση με τον αντιορό μιας βαριάς αλύσου, αλλά δεν θα υπάρχει εμφανής αντίδραση ελαφριάς αλύσου. Σε αυτή την περίπτωση, χρειάζεται να αποκλειστούν τα εξής –

Νόσος βαρέων αλύσων,a. Πολύ υψηλές συγκεντρώσεις ελαφρών αλύσων που προκαλούν περίσσεια b. αντιγόνου,Χαμηλές συγκεντρώσεις ελαφρών αλύσων,c. Άτυπο μόριο ελαφράς αλύσου που δεν αντιδρά με τον αντιορό,d. Ελαφρές άλυσοι με «κρυφούς» καθοριστές ελαφρών αλύσων (όπως e. παρατηρείται ορισμένες φορές με τις ανοσοσφαιρίνες IgA και IgD).

Διασταυρούμενη αντιδραστικότητα του αντιορού4. . Λόγω της τροποποιημένης φύσης των μορίων αντισωμάτων ανοσολογικής εκτόπισης, οι αντιδράσεις αντισώματος-αντιγόνου που πραγματοποιούνται στο τριχοειδές μπορούν να προκαλέσουν, μερικώς, διασταυρούμενη αντιδραστικότητα του


57

el

αντιορού με τα μονοκλωνικά συστατικά τα οποία υπάρχουν σε ένα δείγμα. Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα, η οποία είναι ένα σπάνιο συμβάν, είναι δυνατό να οδηγήσει σε κλινικό συμπέρασμα δικλωνικής γαμμαπάθειας. Εάν πιθανολογείται διασταυρούμενη αντιδραστικότητα του αντιορού, ενδέχεται να απαιτείται περαιτέρω εξέταση χρησιμοποιώντας ανοσοκαθήλωση σε πήκτωμα για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων. Δεν υπάρχει κανένας κίνδυνος δημιουργίας ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων ως συνέπεια της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας.

Οι αντιοροί ανοσολογικής εκτόπισης μπορούν να εξαλείψουν πλήρως τις μονοκλωνικές κορυφές σε δείγματα ορού με συγκέντρωση < 30 g/L και σε δείγματα ούρων με συγκέντρωση < 0,6 g/L. Εάν οι γάμμα σφαιρίνες βρίσκονται σε μεγάλη περίσσεια σε αυτές τις συγκεντρώσεις, ενδέχεται να μην εξαλειφθούν πλήρως από το ίχνος, καθιστώντας δύσκολη την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Σε αυτές τις περιπτώσεις, συνιστάται το αρχικό δείγμα ασθενούς να αραιώνεται είτε με ισότονο διάλυμα φυσιολογικού ορού είτε με το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα παρασκευής ούρων V8, ώστε η συγκέντρωση της πρωτεΐνης να μειωθεί σε ένα επίπεδο στο οποίο μπορεί να συμβεί πλήρης εκτόπιση, και η ανάλυση ανοσολογικής εκτόπισης επαναλαμβάνεται. Εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί η λειτουργία υπέρβασης αραίωσης, ώστε η συγκέντρωση της πρωτεΐνης να μειωθεί σε ένα επίπεδο στο οποίο μπορεί να συμβεί πλήρης εκτόπιση. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης.

ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣΕξετάστηκε μια σειρά δειγμάτων και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με εκείνα από ένα άλλο κιτ εξέτασης που διατίθεται στο εμπόριο – και τα δύο κιτ έδωσαν ισοδύναμα αποτελέσματα.

ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΜε το κιτ ανοσολογικής εκτόπισης V8 μπορεί να προσδιοριστεί ο ανοσοτύπος των μονοκλωνικών γαμμαπαθειών σε συγκεντρώσεις πρωτεϊνών στον ορό 0,208 g/L ή συγκεντρώσεις λευκωμάτων στα ούρα 0,02 g/L ή υψηλότερες.


58


ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑFauchier, P. and Catalan, F. ‘Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis’ Alfred 1. Fournier Institute, Paris, France, 1988.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. ‘Finding Clues to Disease in 2. Urine’ Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : 69-75.Umbreit, A. and Wiedemann, G. ‘Determination of Urinary Protein Fractions. A 3. Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations’ Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172.Wiedemann, G. and Umbreit, A. ‘Determination of Urinary Protein Fractions by 4. Different Electrophoretic Methods’, Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262.Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and 5. Lockhart, S. ‘A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria’ Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : 371-374.Jeppsson, J.O., Laurell, C.B. and Franzen, B., ‘Agarose Gel Electrophoresis’, Clin. 6. Chem., 1979; 25 (4) : 629-638.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M., ‘Protein Analysis’, Diagnostic 7. Medicine, 1980; Jan/Feb : 3-15.


59

ru

РусскийНАЗНАЧЕНИЕV8 Immunodisplacement Kit (набор для иммуновытеснения на аппарате V8) предназначен для разделения и идентификации моноклональных гаммапатий с помощью капиллярного зонального электрофореза. При использовании этого метода разделение белков происходит в зависимости от их суммарного заряда в щелочном буферном растворе в сочетании с различиями во взаимодействии со стенками кварцевого капилляра. Иммунотипирование гаммаглобулинов достигается путем тестирования аликвот образца на панели моноспецифической антисыворотки. Комплекс, образованный контрольной антисывороткой и ее целевым протеином, имеет модифицированный профиль миграции, а, следовательно, вытесняется из стандартной электрофореграммы сывороточных протеинов. Путем сравнения результатов, полученных с помощью контрольной панели, и результатов анализа эталона можно определить тип иммуноглобулина по специфическому удалению или уменьшению патологического пика на электрофореграмме КЭ.

Максимальная потребность в иммуновытеснении имеется в клинической лаборатории, где этот метод применяется преимущественно для выявления моноклональных гаммапатий. Моноклональная гаммапатия — это первичная патология, при которой один единственный клон плазматических клеток вырабатывает повышенные уровни иммуноглобулина одного класса и типа. Такие иммуноглобулины называют моноклональными белками, M-белками или парапротеинами. Их наличие может не представлять опасности, а может оставаться невыясненным. В некоторых случаях такие белки являются признаком злокачественной опухоли, такой как миеломная болезнь или макроглобулинемия Вальденстрема. Моноклональные гаммапатии необходимо отличать от поликлональных, так как поликлональные гаммапатии — вторичные патологические состояния, обусловленные такими заболеваниями, как хронические болезни печени, коллагенозы, ревматоидный артрит и хронические инфекции.

Белки, содержащиеся в моче, в основном относятся к белкам плазмы, фильтрующимся через почки. Аномальное появление белков плазмы в моче играет важную роль в исследовании функции почек. Исследование при протеинурии должно включать определения типа и количеств экскретируемых белков.1-5 Комбинация электрофоретического разделения белков мочи вместе


60


с идентификацией типов белков методом иммунопреципитации позволяет дифференцировать несколько типов протеинурии — физиологическую, клубочковую (селективную и неселективную), канальцевую и протеинурию, сочетающуюся с дисглобулинемиями1-5.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИРеактивы, содержащиеся в этом комплекте, предназначены только для диагностики in vitro. Не глотайте и не капайте пипеткой в рот какие-либо компоненты комплекта. При манипуляциях со всеми компонентами комплекта используйте перчатки. Данные по безопасности продукта и сведения об утилизации приведены в спецификации продукта в отношении безопасности.

СОСТАВAnti-human IgG antisera. REF HL-3-2125SA (1 x 50 анализов)1. -Anti-human IgA antisera. REF HL-3-2126SA (1 x 50 анализов)2. -Anti-human IgM antisera. REF HL-3-2127SA (1 x 50 анализов)3. -Anti-human kappa antisera. REF HL-3-2128SA (1 x 50 анализов) 4. -Anti-human lambda antisera. REF HL-3-2129SA (1 x 50 анализов)5. - Каждый флакон содержит антисыворотку в количестве, достаточном для 50 анализов. Антисыворотка готова к применению; его следует помещать в соответствующее место на аппарате Helena V8 согласно инструкции в руководстве пользователя.Инструкция по применению.6. В каждом комплекте имеется инструкция по применению.

ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИAnti-human IgG antisera1. Anti-human IgA antisera2. Anti-human IgM antisera3. Anti-human kappa antisera4. Anti-human lambda antisera Антисыворотку следует хранить при температуре 2—8°C; она сохраняет стабильность до истечения срока годности, указанного на этикетке. После вскрытия флаконов сохраняет стабильность в течение 4 недель при хранении при температуре 2—8°C. Во избежание испарения обязательно закрывайте флаконы крышками, когда они не используются. Растворы антисывороток прозрачные и бесцветные. При изменении внешнего вида растворов антисывороток, например, при изменении цвета или помутнении (что свидетельствует о микробной контаминации), утилизируйте их. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ РАСТВОРЫ АНТИСЫВОРОТОК.


61

ru

НЕОБХОДИМЫЕ КОМПОНЕНТЫ, НЕ ВКЛЮЧЕННЫЕ В КОМПЛЕКТ ПОСТАВКИREF 830100 V8 Storage Buffer — буфер для хранения V8 REF 830200 V8 Maintenance Buffer — буфер для поддержания V8 REF 800200 V8 Serum Protein 6-band Kit — шестиполосный комплект для определения сывороточных белков V8 (если проводится анализ шестиполосного разделения) REF 800500 V8 Serum Protein SPE Kit – SPE-комплект для определения сывороточных белков методом электрофореза V8 (если проводится анализ разделения сывороточных белков электрофорезом) REF 800800 V8 Serum Protein 6-band Zoom Kit – шестиполосный Zoom-комплект для определения сывороточных белков V8 (если проводится анализ шестиполосного разделения) REF 830400 V8 Clinical Waste Drawer Pack – выдвижной контейнер для медицинских отходов

НЕОБЯЗАТЕЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫREF 800410 V8 Urine Preparation Buffer SP6 — буфер SP6 для подготовки образца мочи к исследованию на аппарате V8. REF 800411 V8 Urine Preparation Buffer SP6 Zoom — буферный раствор SP6 Zoom для подготовки образца мочи к исследованию на аппарате V8. REF 800412 V8 Urine Preparation Buffer SPE — буферный раствор SPE для подготовки образца мочи к исследованию на аппарате V8. REF VS2002 Sartorius VivaSpin — 20 концентраторов для центрифуг REF GEHE17-0853-02 GE Healthcare NAP-5 колонок для обессоливания при проведении анализа мочи с иммуновытеснением

REF 820500 V8 Free kappa / Free lambda Kit — набор антисывороток к свободным каппа-цепям / к свободным лямбда-цепям для аппарата V8. REF 821400 V8 Anti IgD / Anti IgE Kit— набор антисывороток к IgD / к IgE


62


ОТБОР И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВДля анализа на сывороточные белки оптимальным образцом является свежесобранная сыворотка, поскольку при использование для этих целей плазмы приведет к выявлению широкой полосы фибриногена между полосами бета- и гамма-фракций. Образцы можно хранить до 7 дней при температуре 2—8°C и до 1 месяца при температуре -20°C. Если образцы подлежат хранению в замороженном виде, их следует охладить тотчас после сбора и заморозить в течение 8 часов. Хранение образцов при температуре 2—8°C может привести к разрушению белков, особенно (но не только) принадлежащих к фракциям комплемента. Следовательно, спустя 7 дней хранения при температуре 2—8°C четкое определение области бета-2 может оказаться невозможным. ЗАПРЕЩАЕТСЯ хранение образцов при комнатной температуре — это приведет к их быстрому разрушению. Образцы, содержащие криоглобулины, после охлаждения или замораживания могут стать вязкими или мутными. Рекомендуется нагревать такие образцы перед анализом до комнатной температуры.

Для проведения анализа мочи оптимальным образцом является свежесобранная (в течение 24 часов) моча. Образцы могут храниться при температуре 2—6℃ до 7 дней. При необходимости более длительного хранения рекомендуется хранить образцы при температуре -70°C до 1 месяца. ЗАПРЕЩАЕТСЯ хранение образцов при температуре -20°C. Перед анализом на аппарате V8 образцы мочи следует обессолить с помощью комбинации одного из дополнительных буферных растворов для подготовки мочи и устройства, перечисленных ниже.

ПОЭТАПНАЯ ПРОЦЕДУРАУбедитесь, что имеется выдвижной контейнер для отходов.1. До перехода к V8 убедитесь, что имеются буфер для хранения, буфер для 2. поддержания и одноразовые колпачки, и они находятся в соответствующих положениях. Установка всех расходных компонентов описана в руководстве пользователя. Переключитесь на инструмент Platinum 4V и начните новый сеанс КЭ. В 3. Platinum 4V выберите ‘CE SYSTEM’ (СИСТЕМА КЭ) из выпадающего меню, нажмите на ‘DEFAULT METHOD’ (МЕТОД ПО УМОЛЧАНИЮ) и выберите соответствующий метод Immunodisplacement assay - иммуновытеснения (см. руководство пользователя). Выбор дополнительного или отдельного анализа описан в руководстве пользователя.


63

ru

Переключитесь на инструмент Helena V8, как описано в руководстве 4. пользователя.Для иммуновытеснения вставьте соответствующий буфер для анализа 5. сывороточных белков и растворитель, при необходимости. Чтобы правильно установить флаконы с буфером и растворителем для анализа сывороточных белков см. руководство пользователя.Убедитесь в том, что в Platinum 4V загружен соответствующий штрихкод 6. реагента для иммуновытеснения, выбрав в выпадающем меню «CE SYSTEMN» (Система КЭ). Щелкните «DEFINE REAGENTS» (Определить реагенты) и убедитесь в том, что введены данные штрихкода для каждого типа антисыворотки, а расположение данных о реагенте соответствует расположению целевого флакона в аппарате V8Откройте флаконы с антисывороткой и разместите их в отсек для реагентов 7. аппарата V8.Когда V8 будет готов для обработки образцов, на инструменте начнет мигать 8. красный индикатор.В отношении образцов, выбранных для дополнительных анализов, но еще 9. НЕ находящихся на инструменте V8, поместите пробирки с первичными образцами в подставку для образцов, при этом убедившись, что штрих-код четко виден через окошечко в подставке (см. руководство пользователя).Установите подставки для образцов на левую половину транспортной 10. области V8 и закройте крышку, как описано в руководстве пользователя.V8 автоматически начнет анализ всех загруженных образцов, и результаты 11. будут передаваться в Platinum 4V.После анализа и при необходимости запустите режим прекращения работы 12. V8, выключив инструмент, как описано в руководстве пользователя.Важно, чтобы инструмент V8 был правильно установлен в конце дня. 13. См. руководство пользователя.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВБольшинство моноклональных протеинов мигрирует к катодной гамма-области паттерна протеинов, однако с учетом их патологической природы возможна миграция в любом направлении в пределах области глобулинов при капиллярном электрофорезе. Иммуновытеснение относится к вычитающим методам анализа; патологический протеин идентифицируется по типу антисыворотки, с которой он связывается, приводя к уменьшению или исчезновению пика, изначально определявшегося на электрофореграммах КЭ. Следует с особой тщательностью анализировать полученные результаты,


64


поскольку наряду с патологическими парапротеинами возможно удаление нормальных поликлональных иммуноглобулинов. Поэтому следует уделять внимание как форме контрольных электрофореграмм, так и относительной площади их пиков.

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВАДля верификации всех стадий процедуры иммуновытеснения можно использовать контрольную сыворотку Helena Biosciences Abnormal CEtrol Serum Control (Кат. № 802500).

НЕДОСТАТКИРеакция с антисыворотками к легким цепям каппа или лямбда, но 1. отсутствует реакция с антисыворотками к тяжелым цепям IgG, IgA или IgM. Образцы, в которых это наблюдается, могут указывать либо на моноклональную гаммапатию со свободными легкими цепями, либо содержать моноклональный белок IgD или IgE. В такой ситуации анализ на ID следует повторить, заменив антисыворотки к IgD и IgE на две другие антисыворотки к другим тяжелым цепям. Отсутствие реакции с антисыворотками к IgD или IgE будет указывать на патологию свободных легких цепей. Полоса в гамма-участке, не реагирующая с антисыворотками с 2. иммунофиксацией. У больных с острой воспалительной реакцией может выявляться C-реактивный белок (СРБ)6-7. Повышенные уровни альфа-1-антитрипсина и гаптоглобина — дополнительные свидетельства в пользу СРБ.Отсутствие реакции с антисыворотками к цепям каппа и лямбда.3. В отдельных случаях образец будет реагировать с антисывороткой к тяжелым цепям, но не к легким цепям. В такой ситуации следует исключить:

патологию тяжелых цепей;a. очень высокие концентрации легких цепей, что ведет к избытку b. антигена;низкие концентрации легких цепей;c. атипичные молекулы легких цепей, не реагирующие с антисывороткой;d. легкие цепи со «скрытыми» детерминантами легких цепей (как иногда e. наблюдается в отношении IgA и IgD).

Перекрестная реактивность антисывороток4. . В силу изменений структуры молекул иммунозаместительных антител реакции «антиген – антитело», наблюдаемые на уровне капилляров, могут привести к перекрестным реакциям определенных антисывороток с моноклональными компонентами, присутствующими в образце. Перекрестная реактивность, возникающая сравнительно редко, может, тем не менее, привести к таким клиническим последствиям, как биклональная гаммапатия. Для


65

ru

подтверждения или опровержения предполагаемого наличия перекрестной реактивности антисывороток может потребоваться дополнительное тестирование с использованием иммунофиксации на геле. Риск получения ложноотрицательных результатов вследствие перекрестной реактивности при этом отсутствует.

Антисыворотка, применяемая для иммуновытеснения, способна полностью удалить моноклональные пики менее < 30 г/л из образцов сыворотки и менее 0,6 г/л из образцов мочи.

Если концентрация иммуноглобулинов намного превышает указанные, они не могут быть полностью удалены, что затрудняет трактовку результатов. В таких случаях полученный у пациента оригинальный образец разбавляется либо физиологическим раствором, либо соответствующим буферным раствором для подготовки мочи к исследованию на аппарате V8 для уменьшения концентрации белка до уровня, когда возможно полное вытеснение, после чего повторяют анализ с иммуновытеснением. Как вариант, можно воспользоваться функцией упреждающего разведения уменьшения концентрации белка до уровня, когда возможно полное вытеснение. Дополнительную информацию см. в руководстве пользователя.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬС помощью набора для иммуновытеснения на аппарате V8 можно иммунотипировать моноклональные гаммапатии с концентрациями сывороточных протеинов 0,208 г/л и выше или концентрацией белка в моче 0,02 г/л и выше.

ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДАПроведены серия анализов и сравнение с коммерческим тест-комплектом, при этом оба комплекта показали одинаковые результаты.


66


ЛИТЕРАТУРАFauchier, P. and Catalan, F. ‘Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis’ Alfred 1. Fournier Institute, Paris, France, 1988.Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. ‘Finding Clues to Disease in 2. Urine’ Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : 69-75.Umbreit, A. and Wiedemann, G. ‘Determination of Urinary Protein Fractions. A 3. Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations’ Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172.Wiedemann, G. and Umbreit, A. ‘Determination of Urinary Protein Fractions by 4. Different Electrophoretic Methods’, Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262.Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and 5. Lockhart, S. ‘A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria’ Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : 371-374.Jeppsson, J.O., Laurell, C.B. and Franzen, B., ‘Agarose Gel Electrophoresis’, Clin. 6. Chem., 1979; 25 (4) : 629-638.7. Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M., ‘Protein Analysis’, Diagnostic 7. Medicine, 1980; Jan/Feb : 3-15.


67

ru


www.helena-biosciences.com

Helena Biosciences EuropeQueensway South, Team Valley Trading Estate, Gateshead, Tyne and Wear, NE11 0SD, United Kingdom

Tel +44 (0)191 482 [email protected]

©2010-2011; HL-2-2152P 2011/02 (3)


Documents

V8 Immunodisplacement Kit - Diachel 2011-02(3) [800300-Multi... · The V8 Immunodisplacement Kit is intended for the ... Immunodisplacement is a subtractive analytical ... further