University of Groningen

Synthetic biology tools for metabolic engineering of the filamentous fungus PenicilliumchrysogenumPolli, Fabiola

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.

Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of record

Publication date:2017

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):Polli, F. (2017). Synthetic biology tools for metabolic engineering of the filamentous fungus Penicilliumchrysogenum. University of Groningen.

CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

Download date: 24-11-2020

SUMMARY AND CONCLUDING REMARKS

Sum

mar

y

and

conc

ludi

ng re

mar

ks

5

101Summary

SUMMARY

Current industrial production processes of penicillin antibiotics by P. chrysogenum are based on classical strain improvement (CSI) programs that lasted several decades and that resulted in strains with the desired fermentation features and high levels of penicillin production 9; 336. During this process, most mutations occurred untargeted, and statistically no specificity could be found in the distribution of mutations over genomic regions or biochemical functional groups 7. However, some mutations and chromosome alterations that occurred could be directly linked to the high performance of these strains, like the tandem amplification of the penicil-lin gene cluster 3 and the inactivation of genes involved in the expression of other secondary metabolite gene clusters 7. Furthermore, the selection of improved strains also included a selection against the production of coloured metabolites in the fermentations such as the sorbicillinoids 7. Additionally, the general transcription network for secondary metabolism, the Velvet complex was hit by mutations causing the down- regulation of many secondary metabolism genes. Other mutations improved the fermentation characteristics of this filamentous fungi by altering its morphology, increasing the amino acid metabolism 4 and increasing the proliferation of microbody 5, organelles in which key enzymes of the pen-icillin biosynthetic pathway reside 337. The CSI-improved P. chrysogenum strains were shown to be an interesting platform for the production of other β-lactam antibiotics 16; 18; 19; 20; 264 and possibly even for other type of secondary metabolites, like polyketides 315.

The antibiotic penicillin has provided major improvements in care of in-fectious disease 338. Furthermore, it raised interest towards natural com-pounds in general and has led to the discovery of many other antibiotics from a range of sources 339; 340. However, the extensive and immoderate use of antibiotics also has led to the development of antimicrobial resis-tance (AMR) 341 thus providing a strong urge to identify novel antibiot-ics based on unique chemical scaffolds. In this respect, large screening programs have been developed to identify novel natural products with antibiotics activity. Genome sequencing and bioinformatics now allows to perform such screens genome wide 139; 140, resulting in the discovery that the majority of secondary metabolite gene clusters in typical fungal genomes are not transcribed under laboratory conditions and possibly encode unknown molecules with unique bioactivities 6; 142. To exploit the wealth of genomic information, a powerful genetic toolbox is required to clone the corresponding large gene clusters, modulate their expression

Summary

Sum

mar

y

and

conc

ludi

ng re

mar

ks

5 5

102 103Summary

and eventually use this information to assemble novel biosynthetic path-ways. For this approach, however, the genetic toolbox available for the fungus P. chrysogenum is rather limited. Although transcriptional and translational elements are functional across a range of filamentous fungal hosts, only few promoters have been applied in P. chrysogenum and com-pared in performance. Furthermore, DNA manipulation is a key element for further metabolic engineering and improvement of fungal production strains. Recently, the CRISPR/Cas9 DNA system for genome engineering method was developed for P. chrysogenum 174. However, other strategies and methods for pathway reconstruction using large pieces of DNA still need to be developed and exploited. This includes the use of the autono-mously replicating plasmids carrying (ARSs) sequences 250 that are poorly developed for filamentous fungi due to their low stability and high risk of chromosome integration 165; 187; 249; 252; 253.

Chapter 1 gives an overview of the molecular biology of filamentous fungi and focusses on secondary metabolites produced by the filamen-tous fungus P. chrysogenum with an emphasis on nonribosomal peptide synthetase (NRPS) and polyketide synthase (PKS) derived natural prod-ucts and their genetics. It also discusses the classical strain improvement (CSI) program and the genetic toolbox available for the engineering of this fungus that is further expanded in the following chapters of the thesis.

Chapter 2 describes the impact of the deletion of two highly ex-pressed secondary metabolites gene clusters that specify the metabolites chrysogine and roquefortine in a strain of P chrysogenum that is already devoid of the penicillin biosynthetic gene cluster. A method is described for the deletion of the aforementioned large gene cluster (>20Kb) in the genome of P. chrysogenum using Gateway cloning for the construction of the large deletion cassettes. The resultant secondary metabolite deficient strain was further analyzed by metabolite and gene expression profiling. The DS68530∆chy strain in which the chrysogine gene cluster was re-moved, showed higher levels of produced roquefortine-related metab-olites whereas the expression of this gene cluster remained unaltered. Additionally, in this strain, fungisporin derived degradation products were detected in the culture broth, while also expression of the fungisporine NRPS gene was unaltered. Earlier studies have shown that the deletion of the multy-copy penicillin gene clusters resulted in the complete loss of penicillin production that was accompanied with the simultaneous high level production of roquefortine and chrysogine-related metabolites 7. It was suggested that in this strain, a redistribution of amino acids into alter-native secondary metabolites occurred, a phenomenon that also appears

apparent in the strain in which additionally the chrysogine cluster was re-moved. This effect was even further exuberated in the DS68530∆chy∆roq strain which shows the accumulation of a range of fungisporin-derived metabolites, likely degradation products of the original NRPS products. In this strain that lacks the three highest expressed NRPS gene clusters also novel compounds were detected. However, this awaits further structural characterization to link these compounds to one or more of the secondary metabolite gene clusters that are still expressed in this strain. Because of the accumulation of the fungisporin derived metabolites it will be neces-sary to also delete the corresponding NRPS gene in order to generate a secondary metabolite deficient strain that in the future can be used as a generic production platform for secondary metabolites.

Chapter 3 presents a study that classifies a range of homologous and heterologous promoters in terms of expression strength. Specifically, a set of six constitutive promoters from A. niger, and four from P. chrysogenum were tested in combination with two terminators derived from A. nidulans. Additionally, two P. chrysogenum promoters were tested that drive the expression of pcbC and pcbAB genes involved in penicillin production, and these were used for benchmarking 305. A modular promoter–reporter sys-tem was constructed using the Golden gate cloning technique and in vivo homologous recombination in the yeast, Saccharomyces cerevisiae. The promoters were used to drive the expression of green fluorescent GFP protein while microbody targeted red fluorescent protein RFP was used as an internal standard. The synthetic pathways were transferred into P. chrysogenum and growth was performed in the BioLector fermentation system, which is a semi high throughput fermentation system that allows on-line monitoring of fermentation parameters like biomass formation, pH, O2 concentration and fluorescence of the reporter proteins 282. We focused only on high and medium expressed genes employing growth conditions relevant for industrial production of β-lactams. The data pro-vides a catalog of promoter strengths with a promoter of a secretory pro-tein belonging to the cerato-platanin family of phytotoxins, Pc20g15140, being the strongest while the An02g10320 promoter of glucoamylase was the weakest in this analysis. With this catalog of different promoter strength, it will be possible to better tune the expression of target genes in future strain engineering programs.

A strategy to combine and use such new promoter is illustrate in Chap-ter 4. It describes the refactoring of the penicillin biosynthetic gene cluster (pcbAB, pcbC, penDE) in a P. chrysogenum strain lacking this cluster. This in-cluded the restoration of the pathway into its original locus as well as into

Summary

Sum

mar

y

and

conc

ludi

ng re

mar

ks

5 5

104 105Summary

the intergenic region between Pc20g07090 and Pc20g07100 genes that was also used in Chapter 3 for the promoter pathway genome integration. The pathway was constructed from three modules and integrated in the genome using the in vivo recombination of overlapping DNA fragments in P. chrysogenum. In addition, based on the efficiency of AMA plasmids reported in previous studies, a mitotically stable AMA plasmid system was developed as new platform for pathway refactoring and expression. This strategy was based on the maintenance of an AMA replicating plas-mid by complementation of an essential gene function. Specifically, this method relies on the simultaneous use of a deletion cassette for an es-sential gene, in our case Pc22g19890 encoding for the tif35 gene involved in the expression of the translation initiation factor 3 subunit g (eIF3g) 332 and an AMA plasmid carrying a complementing copy of the essential gene. Transformation of the aforementioned deletion cassette and AMA plas-mid results in the inactivation of the essential gene whose function is complemented by the plasmid-encoded gene. This results in stable main-tenance of the plasmid (J. Kiel, personal communications). The penicillin biosynthetic pathway encoded on three DNA fragments was assembled in vivo by Penicillium into the AMA plasmid. In our design, the AmdS selec-tion marker was used in one of the fragments to select for the presence of the assembled pathway in the AMA plasmid. For plasmid maintenance, there is no need to use this marker. With the refactored pathways, the chromosomal targeting resulted in similar penicillin G production levels compared to the single copy strain DS47274, showing a successful in vivo assembly of the pathway from the distinct DNA fragments. On the other hand, with the AMA approach, penicillin G production was evident only from the bioassay analysis, whereas very low levels were found in the culture broth using LC-MS. This low performance is unexpected but could be related to several issues. First, the regular fermentation condition was perhaps not optimal for the expression of the large (33Kb) AMA plasmid. In fact, the use of a lower growth temperature or different pH 342 could improve the pcbAB, pcbC and penDE expression and therefore, the pen-icillin production. Second, filamentous fungal strains exhibit a multinu-clear morphology and since only few rounds of selection were performed on AMA::PEN cluster transformants this could have affected the clonal purification and subsequently the performance of the AMA::PEN cluster containing strain. Therefore, future analysis should focus on the nuclear composition, growth and expression conditions of the strain.

Taken together, the presented pathway refactoring is a first step to-ward the rapid implementation of novel pathways into P. chrysogenum

and shows that the in vivo assembly of pathways from DNA fragments can be effectively employed. Furthermore, the acquired knowledge on functional new promoters and terminators can be combined with the in vivo recombination, to construct new synthetic metabolic pathways in Penicilium. Additionally, a further optimized secondary metabolites defi-cient strain can be used as natural cell factory and they could provide new natural products.

Concluding, the novel strategies can be in applied for more efficient discovery, production and modification of natural products that can be used to treat/combat multi drug resistant bacterial infections.

Sum

mar

y

and

conc

ludi

ng re

mar

ks

5

107Samenvatting

SAMENVATTING

De huidige productie processen van op penicilline gebaseerde antibio-tica door P. chrysogenum zijn gebaseerd op klassieke stamverbeterings-programma’s welke tientallen jaren hebben geduurd. Deze programma’s hebben geresulteerd in stammen met de gewenste fermentatie eigen-schappen en hoge penicilline concentraties 9; 336. Tijdens dit proces von-den de meeste mutaties ongericht plaats. Statistisch gezien kan er geen specificiteit worden ontdekt in de distibutie van de mutaties over de ver-schillende genomische regio’s of functionele groepen 7. Desalniettemin kunnen sommige mutaties en chromosomale modificaties direct worden gelinkt aan de hoge productiecapaciteit van deze stammen, zoals de mul-tiplicatie van het penicilline gencluster 3 en de inactivatie van genen be-trokken bij de expressie van andere secundaire metabolieten 7. De selectie van verbeterde stammen vond ook plaats op basis van gekleurde metabo-lieten, zoals sorbicillines 7 en daarnaast vond er een mutatie plaats in het algemene transcriptie netwerk voor secundaire metabolieten, het Velvet complex, waardoor de expressie van vele secundaire metabolieten is ver-laagd. Andere mutaties verbeterden de fermentatie karakteristieken van P. chrysogenum, doordat de morfologie en het aminozuur metabolisme zijn aangepast 4 en de verhoogde ontwikkeling van peroxisomen 5, waarin zich enkele belangrijke enzymen van het penicilline gencluster bevinden  337. De verbeterde P. chrysogenum productiestammen vormen een interessant platform voor de productie van andere β-lactam antibiotica 16; 18; 19; 20; 264 en mogelijk zelfs voor de productie van andere typen secundaire metabolie-ten zoals polyketides 315.

Penicilline heeft voor grote verbeteringen in de behandeling van in-fectieziekten gezorgd 338. Daarnaast heeft penicilline er voor gezorgd dat er interesse kwam voor natuurlijke verbindingen en in het algemeen heeft dat geleid tot de ontdekking van vele andere antibiotica uit ver-schillende bronnen 339; 340. Desalniettemin, heeft het extensieve gebruik van antibiotica geleid tot de ontwikkeling van resistentie van micro- organismen 341. Hierdoor is er een drang ontstaan voor de ontwikkeling van nieuwe antibiotica met unieke eigenschappen. Dit heeft geleid tot grote programma’s om nieuwe natuurlijke producten met antibiotische activiteit te ontdekken. Het ontrafelen van de DNA sequentie en bioin-formatica geeft ons nu de kans om grote onderzoeken over het gehele genoom te doen 139; 140, dit heeft geleid tot de ontdekking dat het grootste deel van de genclusters welke coderen voor secundaire metabolieten in schimmels niet tot expressie komen onder laboratorium condities. Deze

Samenvatting

Sum

mar

y

and

conc

ludi

ng re

mar

ks

5 5

108 109Samenvatting

genclusters coderen mogelijk voor onbekende moleculen met unieke (actieve) eigenschappen  6; 142. Om de grote hoeveelheid aan informatie goed te kunnen gebruiken is er een goede genetische ‘gereedschapskist’ nodig om de lange genetische clusters tot expressie te kunnen bren-gen en de informatie te kunnen gebruiken om nieuwe biosynthetische clusters te kunnen samenstellen. De ‘gereedschapkist’ om dit te kunnen doen in P. chrysogenum is relatief beperkt. Ondanks dat er transcriptie en translatie elementen zijn voor andere filamenteuze schimmels, zijn er maar enkele toegepast in P. chrysogenum. Daarnaast speelt DNA mo-dificatie een belangrijke rol in verdere engineering en verbetering van schimmels voor de productie van secundaire metabolieten. Recentelijk is het CRISPR/Cas9 DNA modificatie systeem ontwikkeld voor toepas-sing in P. chrysogenum 174. Ondanks dat zullen er echter ook nog andere mogelijkheden moeten worden ontwikkeld voor de reconstructie van metabolische routes met grote stukken DNA, inclusief het gebruik van autonoom replicerende plasmides 250, wellke slecht zijn ontwikkeld voor filamenteuze schimmels vanwege hun lage stabiliteit en de hoge kans op integratie in het genoom 165; 187; 249; 252; 253.

Hoofdstuk 1 geeft een inzicht in de moleculaire biologie van filamen-teuze schimmels en op de productie van secundaire metabolieten door P.  chrysogenum. Het hoofdstuk is gefocust op Non Ribosomale Peptide Synthetases (NRPS) en Polyketide Synthases (PKS) afgeleide producten en hun genetica. Ook wordt het klassieke stamverbeteringsprogramma en de genetische ‘gereedschapkist’ beschikbaar voor de modificatie van deze fila-menteuze schimmel en uitgebreid in de volgende hoofdstukken besproken.

Hoofdstuk 2 beschrijf de impact van de deletie van twee hoog tot expressie komende secundaire metaboliet genclusters welke coderen voor chrysogenine en roquefortine in een stam van P. chrysogenum welke geen penicilline gencluster meer heeft. Daarnaast wordt er een methode beschreven voor de verwijdering van het eerder genoemde penicilline gencluster (>20Kb) uit het genoom van P. chrysogenum door middel van Gateway klonering voor de constructie van grote deletie cassettes. De resulterende metabolieten arme stam is verder geanalyseerd door mid-del van metabolieten en genexpressie profilering. De DS68530∆chy stam waarin het chrysogine gencluster is verwijderd, produceert meer roque-fortine gerelateerde metabolieten, terwijl de expressie van dit genclus-ter hetzelfde blijft. Daarnaast zijn er fungisporine degradatie producten gedetecteerd in het medium, terwijl ook de expressie van het fungispo-rine NRPS eiwit is veranderd. Eerdere studies hebben aangetoond dat de verwijdering van alle kopieën van het penicilline gencluster resulteerde

in het volledige verlies van de penicilline productie, terwijl er grote hoe-veelheden roquefortine en chrysogine gerelateerde metabolieten werden geproduceerd 7. Een suggestie is dat er in deze stam een herverdeling van aminozuren in alternatieve secundaire metabolieten plaatsvindt, een fenomeen dat ook lijkt plaats te vinden in de stam waarin het chrysogine cluster is verwijderd. Het effect wordt vergroot in de DS68530∆chy∆roq stam waarin de opbouw van fungisporine gerelateerde metabolieten, waarschijnlijk degradatie producten, verder toeneemt. In deze stam, welke de drie hoogst tot expressie gebrachte NRPS genclusters mist, zijn ook nieuwe moleculen ontdekt. Deze moleculen zullen verder moeten worden onderzocht om ze aan één of meerdere secundaire metaboliet genclusters te kunnen koppelen. Vanwege de opbouw van fungisporine gerelateerde producten, zal het ook nodig zijn om het corresponderende NRPS gen uit te schakelen om een secundaire metaboliet arme stam te creëren, welke in de toekomst kan worden gebruikt als een productie platform voor gewenste secundaire metabolieten.

Hoofdstuk 3 is een studie welke homologe en heterologe promoters classificeert naar expressieniveau. Een set van zes constitutieve promo-toren uit A. niger en vier uit P. chrysogenum zijn getest in combinatie met twee terminatoren uit A. nidulans. Daarbovenop zijn de twee promoters uit P. chrysogenum welke verantwoordelijk zijn voor de expressie van pcbC en pcbAB getest en gebruikt als referentie 305. Er is een modulair promoter- reporter systeem gemaakt door gebruik te maken van de Golden gate klonerings techniek en door middel van in vivo homologe recombinatie in Saccharomyces cerrevisiae. De promoters zijn gebruikt om Green Flu-orescent Protein (GFP) tot expressie te brengen, terwijl Red Fluorescent Protein (RFP) gericht tegen microbodies werd gebruikt als interne stan-daard. Deze synthetische routes zijn geïntroduceerd in P. chrysogenum en de groei is beoordeeld in een BioLector fermentatiesysteem. Dit sys-teem kan worden gebruikt om op grote schaal fermentatie experimen-ten te doen, waarbij fermentatieparameters zoals de ontwikkeling van biomassa, pH, O2 concentratie en fluorescentie van reporter-eiwitten 282 online kunnen worden gemonitord. Gedurende deze studie is er gefo-cust op gemiddeld en hoog tot expressie komende genen tijdens groei condities welke relevant zijn voor de industriële productie van β-lactam antibiotica. De data levert een catalogus op van verschillende promoter sterktes, waarin een promoter van een secretie eiwit welke behoort tot de cerato-platanine familie van phytotoxines, Pc20g15140, het sterkste is, terwijl de An02g10320 promoter van glucoamylase het zwakst is gedu-rende deze analyse. Deze catalogus van verschillende promoter sterktes

Samenvatting

Sum

mar

y

and

conc

ludi

ng re

mar

ks

5 5

110 111Samenvatting

maakt het mogelijk om de expressie van genen beter te aan te passen aan de gebruikte condities in toekomstige stamverbeterings-programma’s.

In hoofdstuk 4 wordt een strategie beschreven om één van deze nieuwe promoters te combineren en te gebruiken. Het hoofdstuk be-schrijft de herintroductie van het penicilline gencluster (pcbAB, pcbC en PenDE) in een P. chrysogenum stam waar dit gencluster niet aanwezig is. Het cluster is geïntroduceerd op de originele locatie als ook in de inter-genetische regio tussen Pc20g07090 en Pc20g07100, welke ook is ge-bruikt in hoofdstuk 3 voor het introduceren van de promoter-reporter genomische integraties. Het gencluster is opgebouwd uit drie modules en geïntegreerd in het genoom door gebruik te maken van in vivo recom-binatie van overlappende DNA fragmenten in P. chrysogenum. Daarnaast is, gebaseerd op de efficiëntie van AMA plasmides aangetoond in eerdere studies, een mitotisch stabiel AMA plasmide systeem ontwikkeld als een nieuw platform voor de herintroductie en expressie van metabolische rou-tes. Deze methode is gebaseerd op het behoudt van een AMA replicerend plasmide door de complementatie van een essentiële genfunctie. In dit geval is de methode gebaseerd op het gelijktijdig gebruik van een deletie-cassette voor een essentieel gen (in dit geval Pc22g19890 coderend voor het tif35 gen welke is betrokken bij de expressie van de translatie initiatie factor subunit g (elF3g) 332 en een AMA plasmide welke een complemen-terende kopie van het essentiële gen bevat. Transformatie van de eerder genoemde deletiecassette en het AMA plasmide resulteert in de inactiva-tie van het essentiële gen waarvan de functie wordt gecomplementeerd door het gen gecodeerd op het AMA plasmide. Dit heeft tot gevolg dat het plasmide stabiel behouden blijft in P. chrysogenum (J. Kiel, personal communication). Het penicilline gencluster gecodeerd op drie verschil-lende DNA fragmenten is geassembleerd in vivo door Penicillium op het AMA plasmide. In ons ontwerp is de AmdS selectie marker gebruikt in één van de fragmenten om te kunnen selecteren op de aanwezigheid van het gencluster op het AMA plasmide en deze marker is niet nodig om het AMA plasmide in P. chrysogenum te kunnen behouden. Door herintroductie van het penicilline gencluster op chromosomale locaties zijn de penicilline G productieniveaus vergelijkbaar met het productieniveau van de stam met één enkele kopie van het gencluster (DS47274), wat aantoont dat de in vivo herintroductie van het gencluster succesvol is. Wanneer het penicil-line gencluster geherintroduceerd wordt op het AMA plasmide, is penicil-line G productie alleen maar aantoonbaar door middel van een bioassay. Uit LC-MS analyse blijkt dat de penicilline G concentraties in het medium erg laag zijn. Deze lage productie is onverwacht, maar kan verschillende

oorzaken hebben. De reguliere fermentatie condities zijn misschien niet optimaal voor de expressie van het grote (33 Kb) AMA plasmide. Het kan goed mogelijk zijn dat het gebruik van een lagere incubatie temperatuur en een andere pH 342 de expressie van pcbAB, pcbC en penDE verbetert en daarmee de productie van penicilline G. Ten tweede hebben filamenteuze schimmels een multi kern morfologie en aangezien er maar enkele rondes van selectie zijn uitgevoerd op AMA::PEN cluster transformanten, kan het mogelijk zijn dat de zuivering van de verschillende transformanten niet optimaal is. Verdere analyse van deze stammen zal moeten focussen op de kernsamenstelling, groei en expressie condities van deze stam.

Samengevat is de gepresenteerde herintroductie van metabolische rou-tes een eerste stap richting de implementatie van nieuwe metabolische routes in P. chrysogenum en er is aangetoond dat metabolische routes in vivo kunnen worden samengesteld uit verschillende DNA fragmenten. De opgedane kennis van functionele nieuwe promoters en terminators kan worden gecombineerd met in vivo recombinatie om nieuwe metabolische routes samen te stellen in Penicillium. Daarnaast kan de verder geopti-maliseerde secundaire metabolietenarme stam worden gebruikt als een natuurlijk platform voor de productie van secundaire metabolieten, als ook een bron van mogelijk nieuwe natuurlijke producten.

In conclusie kunnen de nieuwe strategieën worden toegepast voor ef-ficiëntere ontdekking, productie en modificatie van natuurlijke produc-ten welke kunnen worden gebruikt om resistente bacteriële infecties te behandelen.