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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
Jenielly de Noronha Ferreira de Castro
PERFIL DE RESISTÊNCIA DE CEPAS DE Pseudomonas aeruginosa EM TRÊS
CENTROS DE SAÚDE DO ESTADO DO RN
Natal /RN
2015
JENIELLY DE NORONHA FERREIRA DE CASTRO
PERFIL DE RESISTÊNCIA DE CEPAS DE Pseudomonas aeruginosa EM TRÊS
CENTROS DE SAÚDE DO ESTADO DO RN
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Centro de Biociências, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos à obtenção de título de Mestre em Ciências Biológicas.
Área de concentração: Biodiversidade - Microbiologia (Bacteriologia médica).
Orientador: Prof. Dr. Renato Motta Neto
Natal /RN
2015
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Castro, Jenielly de Noronha Ferreira de. Perfil de resistência de cepas de pseudomonas
aeruginosa em três centros de saúde do Estado do RN / Jenielly de Noronha Ferreira de Castro. – Natal, RN, 2014
90 f.: il. Orientador: Prof. Dr. Renato Motta Neto Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas. 1. Pseudomonas aeruginosa – Dissertação. 2. Resistência. –
Dissertação. 3. AmpC. – Dissertação. I. Motta Neto, Renato. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título
RN/UF/BSE-CB CDU 604.2
FOLHA DE APROVAÇÃO
DEDICATÓRIA
Dedico estre trabalho aos meus pais,
meus irmãos e meu esposo por todo o
apoio que me ofereceram nesses anos
de estudos. Especialmente ao meu filho,
o maior presente na minha vida.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Rosa Maria de Noronha e Jessé Ferreira, pelo amor, carinho
e compreensão, e por terem sido um exemplo em minha vida de retidão de caráter,
honestidade e perseverança.
Aos meus irmãos, Jeilma Noronha e Jonatas Noronha, por todo o incentivo,
carinho e amizade que me deram força, muito obrigada por acreditar em mim;
Ao meu esposo, Elnaem Castro, pelo companheirismo, amor e compreensão,
sem o seu apoio seria muito difícil chegar até aqui.
Ao Professor Dr. Renato Motta Neto, pela oportunidade que me foi confiada,
mesmo quando ainda não me conhecia, muito obrigada pela confiança, incentivo,
paciência e pelos valiosos ensinamentos.
Ao Professor Dr. Kassio Michel Gomes de Lima e Professora Maria Celeste
Nunes de Melo pelas contribuições científicas deste trabalho.
Aos colegas de laboratório, Fagner Martins, Miguel Ansaldi, Maria Eduarda
Costa, Ransay Lourenço, e Edilaine Silva pela amizade, convívio e ajuda;
Aos bioquímicos dos laboratórios de Análises Clínicas do HUOL, do HGT e
LACEN-RN, sobretudo aos responsáveis pelo setor de microbiologia pela abertura
cedida para o recrutamento das amostras clínicas.
Aos colegas da Pós Graduação em Ciências Biológicas, especialmente
Israelly Senna e Maria Carolina, que se tornaram grandes amigas, pela troca de
experiências dentro e fora das salas de aula, tornando o período das disciplinas
momentos agradáveis e de crescimento coletivo.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente neste trabalho, os meus
sinceros agradecimentos.
RESUMO
O crescente aumento da resistência aos antimicrobianos em Pseudomonas aeruginosa é um exemplo notável de como as bactérias podem manter e expressar novas informações genéticas que conferem resistência a uma ou várias drogas. No presente estudo avaliou-se o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos em isolados de P. aeruginosa provenientes de três grandes centros de referência do Estado do Rio Grande do Norte: Laboratório Dr. Almino Fernandes (LACEN-RN), Laboratório de Análises Clínicas do HUOL e Laboratório de Análise Clínicas do Hospital Giselda Trigueiro (HGT). Os isolados foram obtidos entre janeiro de 2013 e junho de 2014, onde 113 cepas foram isoladas de diversas amostras clínicas por demanda espontânea. A espécie de P. aeruginosa foi identificada inicialmente nos laboratórios de origem e confirmada, através de testes fenotípicos, no Laboratório de Micobactérias (LABMIC) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN. A determinação da susceptibilidade aos antimicrobianos deu-se através do Teste de Disco Difusão. Após a determinação do perfil de resistência, as amostras foram submetidas à avaliação fenotípica confirmatória para detecção de produção de Beta Lactamase do tipo AmpC e Metallo Beta Lactamase. Dos 113 isolados 67,2% (n = 76) apresentaram perfil de resistência a, pelo menos, uma classe de antimicrobianos. Todas as cepas de P. aeruginosa foram susceptíveis a Polimixina B. As maiores taxas de resistência foram verificadas frente à Ofloxacina 57,5% (n=65), Ciprofloxacina 55,7% (n=63), Norfloxacina 55,7% (n=63), Ticarcilina-ácido clavulânico 43,3% (n=49), Ceftazidima 41,5% (n=47), Meropenem 39,8% (n=45), Aztreonam e Cefepime 38,9% (n=44), Imipenem 36,2% (n=41), Tobramicina 36,2% (n=41), Piperacilina-tazobactam 28,3% (n=32) e Amicacina 28,3% (n=32). Das 113 cepas estudadas, 46 (40,7%) apresentaram resultados fenotípicos positivos para produção de β-Lactamases do tipo AmpC através do método de disco aproximação. Cinquenta (44%) isolados apresentaram resistência a, pelo menos, um dos carbapenêmicos avaliados, e estes foram submetidas ao teste de detecção fenotípica para produção de Metallo Beta Lactamase – MBL, através do teste de bloqueio enzimático com discos combinados com EDTA. Das 50 amostras com resistência a carbapenêmicos, 21 (42%) apresentaram teste fenotípico positivo para produção de metallo-β-lactamase, sendo presuntivamente consideradas produtoras de MBL. Os dados obtidos, demonstram elevada produção de β-lactamases do tipo ampC e Metallo-β-lactamases. Foram também observadas elevadas taxas de resistência a antimicrobianos, especialmente em carbapenêmicos. Portanto conclui-se que a identificação de patógenos e a análise da resistência de microrganismos aos antimicrobianos constituem importante ferramenta para auxiliar os clínicos no tratamento de infecções.
Palavras-Chave: Pseudomonas aeruginosa. Resistência. MBL. AmpC.
ABSTRACT
The enhanced antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa is a remarkable
example of how the bacteria can maintain and express the new genetic information
conferring resistance to one or more drugs. In the present study we evaluated the
profile of antimicrobial susceptibility in isolates of P. aeruginosa from three major Rio
Grande do Norte state reference centers: Laboratory Dr. Almino Fernandes (LACEN-
RN), Laboratory of Clinical Analysis of HUOL and Analysis Laboratory of Clinical
Hospital Giselda Trigueiro (HGT). The isolates were obtained between January 2013
and June 2014, in which 113 strains were isolated from various clinical specimens by
spontaneous demand. The species of P. aeruginosa was first recognized in home
laboratories and confirmed by phenotypic tests, the Mycobacteria Laboratory
(LABMIC) of the Federal University of Rio Grande do Norte - UFRN. The
determination of antimicrobial susceptibility was given through the disk diffusion test.
After determining the resistance profile, the samples were subjected to confirmatory
phenotypic evaluation to beta lactamase producing AmpC type detection and Metallo
Beta Lactamase. Of the 113 isolates 67.2% (n = 76) showed resistance profile of the
at least one class of antimicrobials. All strains of P. aeruginosa were susceptible to
Polymyxin B. The highest resistance rates were checked against the ofloxacin 57.5%
(n = 65), Ciprofloxacin 55.7% (n = 63), Norfloxacin 55.7% (n = 63), Ticarcillin-
clavulanic acid 43.3% (n = 49) Ceftazidime 41.5% (n = 47), Meropenem 39.8% (n =
45), and Aztreonam Cefepime 38.9% (n = 44), Imipenem 36.2% (n = 41 )
Tobramycin 36.2% (n = 41), piperacillin-tazobactam 28.3% (n = 32) and amikacin
28.3% (n = 32). Of the 113 strains studied, 46 (40.7%) showed positive phenotypic
results for the production of β-lactamases AmpC type of approach through the disk
method. Fifty (44%) isolates showed resistance to at least one of the evaluated
carbapenems, and these were subjected to phenotypic screening test for production
Metallo Beta Lactamase - MBL, by blocking enzymatic test with discs combined with
EDTA. Of the 50 samples with resistance to carbapenems, 21 (42%) showed positive
phenotypic test for the production of metallo-β-lactamase producing considered
presumptively with MBL. The data demonstrate high production of β-lactamases type
ampC Metallo-and β-lactamase. It was also observed high antimicrobial resistance
rates, especially carbapenems. Therefore it is concluded that early identification of
pathogens and analysis of microorganisms to antimicrobial resistance constitute an
important tool to assist clinicians in the treatment of infections.
Keywords: Pseudomonas. Aeruginosa. Resistance. MBL. AmpC.
LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS
Figura 1 - Mecanismo de ação das β-lactamases com serina no sítio ativo ............ 27
Figura 2 - Representação esquemática da disposição dos discos de antimicrobianos
utilizados no teste fenotípico de detecção de AmpC ................................................. 38
Figura 3 - Representação esquemática da disposição dos discos de antimicrobianos
utilizados no teste fenotípico de detecção de MBL. .................................................. 39
Figura 4 - Método de disco aproximação para detecção fenotípica de beta-
lactamases AmpC induzíveis. ................................................................................... 41
Figura 5 - Amostras positivas para produção de MBL no teste fenotípico bloqueio
enzimático com EDTA A) Imipenem e Imipenem + EDTA, Meropenem e Meropenem
+ EDTA e Aztreonam. B) Imipenem + EDTA e Imipenem ......................................... 42
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição de 113 amostras de P. aeruginosa de origem clínica, de
acordo com o sítio de isolamento. ............................................................................. 40
Tabela 2 - Distribuição da frequência de resistência a 13 antimicrobianos, de 113
amostras de P. aeruginosa, de acordo com os resultados do teste de disco difusão.
.................................................................................................................................. 41
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 13
2 REFERENCIAL TEÓRICO .......................................................................... 15
2.1 Gênero Pseudomonas ................................................................................. 15
2.1.1 Identificação e Características Bioquímicas ................................................. 16
2.1.2 Epidemiologia e prevalência das infecções por P. aeruginosa. ................... 17
2.1.3 Potencial De Patogenicidade ....................................................................... 19
2.1.4 Fatores de virulência .................................................................................... 20
2.2 Resistência bacteriana aos antimicrobianos ................................................ 21
2.2.1 Alteração das PBP’s..................................................................................... 24
2.2.2 Perda de porinas .......................................................................................... 24
2.2.3 Sistema de efluxo ......................................................................................... 25
2.2.4 Produção de Enzimas Inativadoras de Antimicrobianos .............................. 26
2.2.4.1 Β-Lactamases .............................................................................................. 26
2.2.4.1.1β-Lactamases de Espectro Estendido (ESBL) ............................................ 27
2.2.4.1.2Metallo-Β-Lactamase ................................................................................... 29
2.2.4.1.3Ampc ........................................................................................................... 30
2.2.4.2 Produção De Enzimas Inativadoras De Aminoglicosídeos ........................... 31
2.2.5 Resistência A Fluoroquinolonas ................................................................... 32
2.2.6 Resistência À Polimixina .............................................................................. 33
3 OBJETIVOS ................................................................................................. 35
3.1 Geral ............................................................................................................ 35
3.2 Específicos ................................................................................................... 35
4 METODOLOGIA .......................................................................................... 36
4.1 Características do estudo ............................................................................. 36
4.2 Local e período do estudo ............................................................................ 36
4.3 Confirmação da identificação dos isolados de P. aeruginosa ...................... 36
4.4 Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos ................................................ 37
4.5 Detecção Fenotípica da produção de Beta-Lactamase do tipo Ampc .......... 37
4.6 Confirmação fenotípica da produção de Metallo-Beta-Lactamases (MBL) .. 38
5 RESULTADOS ............................................................................................ 40
5.1 Amostras bacterianas: fontes de isolamento ................................................ 40
5.2 Determinação do padrão fenotípico de resistência a antimicrobianos. ........ 40
5.3 Detecção da produção de Β-Lactamases do tipo Ampc............................... 41
5.4 Produção de Metallo Β-Lactamase .............................................................. 42
6 DISCUSSÃO ................................................................................................ 43
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................... 52
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 53
ARTIGO .................................................................................................................... 72
ANEXOS ................................................................................................................... 87
13
1 INTRODUÇÃO
Os Bacilos Gram Negativos não Fermentadores (BGNNF) de carboidratos são
organismos versáteis, apresentam baixa necessidade nutricional e boa tolerância a
uma série de condições físicas adversas, devido a sua resistência intrínseca a
desinfetantes, degermantes e múltiplas classes de antimicrobianos, além da
resistência adquirida devido a mutações cromossômicas e aquisição de genes de
resistência (POOLE, 2011).
Considerados organismos oportunistas, raramente estão associados a infecções
comunitárias em indivíduos saudáveis, porém apresentam alta prevalência de
envolvimento em indivíduos imunossuprimidos, principalmente em ambiente
hospitalar (ROSAY et al., 2015). Dentre as espécies de BGNNF, a Pseudomonas
aeruginosa configura-se como a mais prevalente em isolados clínicos de natureza
hospitalar. As infecções causadas por P. aeruginosa podem variar desde infecções
superficiais de pele a septicemia grave, podendo causar infecção aguda pela
produção de toxinas e infecção crônica pela ação da camada espessa que consiste
no seu biofilme, podendo resultar ainda no somatório dos tipos de infecção pela
ação concomitante destes componentes. São bactérias dotadas de mecanismos de
virulência extremamente complexos (produção de leucocidinas, alginato,
fosfolipases, etc.) que contribuem de forma positiva para um aumento crescente do
número de agravos infecciosos principalmente no ambiente hospitalar (PIER et al.,
2005).
Descrito pela primeira vez em 1894, por Walter Friedrich August Emil Migula,
botânico dedicado à taxonomia vegetal, o gênero Pseudomonas figura-se como um
dos gêneros bacterianos mais variáveis e ubíquos, cujas espécies têm sido isoladas
em diversos ambientes, desde a Antártica aos Trópicos, presentes no solo,
sedimentos e água de rios e lagos, plantas, fungos e em amostras clínicas (PEIX,
RAMÍREZ-BAHENA, 2009). As espécies que constituem esse gênero, com o
decorrer do tempo, vêm passando por várias reclassificações e, atualmente,
totalizam 128 espécies, sendo a Pseudomonas aeruginosa a principal espécie de
interesse clínico e também um dos principais patógenos de infecção hospitalar
(EUZÉBY, 2010).
É notável o aumento da resistência aos antimicrobianos por P. aeruginosa, sendo
14
esse microrganismo um exemplo de como as bactérias podem manter e expressar
novas informações genéticas que conferem resistência a uma ou a várias drogas
(WALSH et al., 2008). Mecanismos de resistência intrínsecos ou adquiridos
desempenham um papel crucial. A resistência a vários antibióticos por essa bactéria
é, muitas vezes, resultante da combinação de uma baixa permeabilidade da
membrana externa, a indução ou desrepressão de enzimas β-lactamases do tipo
AmpC e super expressão intrínseca ou induzida de bombas de efluxo.
(POOLE, 2011).
Dentre os diferentes mecanismos de resistência desenvolvidos por espécies de
P. aeruginosa a produção de enzimas beta-lactamases é o mecanismo mais
importante. Penicilinas, cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenêmicos podem
ser hidrolisados por este grupo de enzimas e a interação entre essas enzimas e
seus substratos resultam em compostos inativos que permitem a sobrevida da célula
bacteriana (BUSH, 2001). Entre as amostras de P. aeruginosa, a produção de
AmpC, ESBLs (Beta-lactamases de espectro estendido) e as metallo-beta-
lactamases desempenham papel importante na resistência à antimicrobianos
utilizados para o tratamento de infecções causadas por estes agentes (JACOBY et
al., 2005).
Considerando a gravidade das infecções causadas por P. aeruginosa e da
limitação de antimicrobianos disponiveis para eliminá-las, determinar o perfil de
resistência dessa bactéria poderá contribuir para direcionar de forma adequada o
uso de antimicrobianos.
No estado do Rio Grande do Norte há poucos estudos relacionados a esse P.
aaeruginosa, seus mecanismos de resistência, bem como a disseminação destes
mecanismos. Trata-se de um estudo inédito a ser realizado no estado do RN, o qual
serve como base, e evidencia a importância de conhecer presença de P. aeruginosa
com padrões de resistência a fim de auxiliar a pratica clínica e de controlar a
transmissão desta resistência no estado do Rio Grande do Norte.
15
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Gênero Pseudomonas
Descrito em meados de 1894 por Migula, o gênero Pseudomonas é composto
por bacilos Gram negativos não fermentadores de carboidratos. Esse grupo de
microrganismos oportunistas coloniza plantas, animais e seres humanos
(PALLERONI, 2003).
Pseudomonas spp. são bastonetes Gram-negativos aeróbios não-formadores
de esporos que apresentam-se retos ou ligeiramente curvos, medindo de 0,5 a 1,0
mm por 1,5-5,0 mm. Eles são geralmente móveis, com um ou vários flagelos
polares, possuem um metabolismo respiratório estritamente aeróbio com o oxigênio
como o receptor de elétrons, em alguns casos, o nitrato pode ser utilizado como
aceitador de elétrons alternativo que permite o crescimento anaeróbio. A maioria das
espécies de interesse clínico é oxidase positiva (exceto Pseudomonas luteola e
Pseudomonas oryzihabitans). Pseudomonas spp. são catalase positiva (HENRY;
SPEERT, 2011). A P. aeruginosa é nutricionalmente versátil, não necessitando de
muitos fatores de crescimento orgânico. Cresce a 37°C e também a 42°C, mas não
a 4°C (ZAVASCKI, 2005).
O gênero Pseudomonas é o mais frequente entre isolados de BGNNF. A
espécie P. aeruginosa representa em média 75% dos isolados de amostras clínicas,
essa alta incidência pode ser justificada pelo fato desse microrganismo ser ubíquo e
possuir predileção por ambientes úmidos, podendo ser encontrado no solo, matéria
orgânica em decomposição, água e vegetais. Além disso, apresenta pouca
exigência para o crescimento e grande versatilidade nutricional (KISKA ; GILLIGAN,
2003).
P. aeruginosa é a principal espécie do gênero, e apresenta-se como citocromo-
oxidase positiva e móvel com flagelo monotríquio polar. Além disso, produzem
colônias características de morfologia variada, com ou sem odor característico
(NEVES et al., 2011). Essa espécie bacteriana possui a capacidade de sintetizar
diversos pigmentos hidrossolúveis, dentre esses podemos citar a pioverdina,
piocianina, piorrubina e piomelanina. A pioverdina é um composto fluorescente
também produzido por P. fluorescens e P. putida, já a piocianina é um pigmento azul
fenazínico específico da P. aeruginosa, que quando combinado com a pioverdina
16
gera uma coloração verde brilhante característica. Os outros dois pigmentos citados
são mais raros, sendo a piorrubina de cor vermelha e a piomelanina de coloração
marrom (KISKA;GILLIAN, 2003; FREITAS;BARTH, 2004). Essas substâncias, cuja
produção é favorecida por temperaturas abaixo de 37° C e na presença de ferro no
meio, têm demonstrado possuir atividade antibiótica e efeito sobre a integridade do
epitélio respiratório (TODAR, 2009; KONG et al., 2006).
2.1.1 Identificação e Características Bioquímicas
A identificação da P. aeruginosa é relativamente simples devido a sua
facilidade em se desenvolver em diversos meios de cultura. P. aeruginosa possui
crescimento aeróbico e não fermenta carboidratos. Entretanto, não é facilmente
distinguível de outros bacilos Gram-negativos não fermentadores no exame direto.
Possui um odor característico doce, semelhante à uva, que provém de suas colônias
em meios de culturas, sendo essa uma característica específica da espécie
aeruginosa. Se usado como base suas características bioquímicas, P. aeruginosa
pode ser identificada por vários métodos automatizados. Em alguns casos esses
sistemas não diferenciam as espécies não-aeruginosas, o que pode necessitar de
diferentes oxidações de açúcares, crescimento a 42°C e coloração de flagelos
(POLLACK, 2003; ZAVASCKI, 2005).
A morfologia da colônia, produção de pigmentos e testes bioquímicos são
alguns dos meios diagnósticos de rotina para identificação da P. aeruginosa. Essa
bactéria é comumente isolada em meios de cultivo enriquecido, como ágar
McConkey, ágar sangue e/ou meio seletivo e diferencial como o ágar pseudomonas
e cetiltrimetil cloreto de amônio (cetrimide), ágar cetrimide é um meio específico para
a P. aeruginosa devido à particularidade deste microrganismo resistir aos compostos
de amônia quaternária, como o cetrimide (JACOME, 2012).
A morfologia da colônia (Ex., O tamanho da colônia, atividade hemolítica,
pigmentação, odor) e os resultados de uma variedade de testes bioquímicos rápidos
(Ex., reação de oxidase positivo) são suficientes para a identificação preliminar de
estirpes. A P. aeruginosa cresce rapidamente e formam colônias achatadas, com
bordas irregulares, β-hemólise em ágar sangue, pigmentação verde relacionado à
síntese de piocianina azul, fluoresceína amarelo, e um odor característico doce
semelhante a uvas. (PALLERONI, 2003). Além disso, no processo de identificação,
17
realiza-se a coloração de Gram, e uma bateria de testes bioquímicos que tem como
resultado: fermentação de açúcares negativa, oxidação da glicose em meio basal
(oxidase positivo), utilização de citrato como única fonte de carbono (citrato positivo),
inabilidade de descarboxilar a lisina (lisina negativo) e incapacidade de utilização do
aminoácido triptofano (indol negativo) (WINN et al.,2008). Embora a identificação
final de P. aeruginosa seja relativamente simples, uma vasta gama de parâmetros
fisiológicos para identificar outras espécies do género Pseudomonas é necessária.
2.1.2 Epidemiologia e Prevalência das Infecções por P. aeruginosa.
Segundo dados de programas de vigilância epidemiológica a partir de amostras
de países da América Latina, Pseudomonas aeruginosa é o primeiro agente em
pneumonias e encontra-se entre os cinco patógenos mais isolados em infecções de
corrente sanguínea. (GALES et al.,2012). Uma grande variedade de doenças tem
sido relacionada à P. aeruginosa, incluindo bacteremias, infecções de tecidos moles,
doenças pulmonares, especialmente entre indivíduos portadores de fibrose cística,
infecções urinárias nosocomiais, endocardites, infecções em decorrência de
queimaduras ou trauma e, em alguns casos, pode acometer o sistema nervoso
central, incluindo meningites (HENRY; SPEERT, 2011). O trato respiratório inferior é
o sítio mais comum de infecção por esse agente. Dados do National Nosocomial
Infection Surveillance – (NNIS), nos EUA, de 1986-2003 relatou P. aeruginosa como
a segunda causa mais comum de pneumonia (18,1%), a terceira causa mais comum
de infecção do trato urinário (16,3%) e o oitavo patógeno mais isolado da corrente
sanguínea (3,4%) (GAYNES;EDWARDS, 2005). Embora a proporção global de
infecções causadas por P. aeruginosa tenha se mantido estável durante 1986-2003,
a proporção de isolados resistentes tiveram aumentos alarmantes em 2003 em
comparação com 1998 e 2002 (NNIS, 2004).
Além do trato respiratório, a P. aeruginosa, também está envolvida em
infecções hospitalares do trato urinário, de queimados, de corrente sanguínea e de
sítio cirúrgico. Na América Latina, é o terceiro patógeno mais isolado em infecções
de pele (GALES et al., 2012) e é a segunda bactéria mais isolada de infecções
nosocomiais de pele e tecidos moles (10,8%) na América do Norte (RENNIE;
JONES; MUTNICK; 2003). No Brasil, é o segundo agente causador de infecções do
trato urinário (12,6% dos casos), o segundo agente mais isolado em infecções de
18
sítio cirúrgico (10,5%) e o sexto (7,5%) em infecções de corrente sanguínea
(SADER; GALES; PFALLER; 2001). Uma pesquisa realizada nos EUA entre 2003 e
2004, envolvendo 104 unidades de queimados, foi realizado um levantamento
através de uma pesquisa quantitativa e qualitativa a partir de dados do sistema de
vigilância nacional do país, além de entrevistas com especialistas do controle de
infecção dos hospitais avaliados, onde 44% das instituições
identificaram P. aeruginosa como o patógeno Gram-negativo mais prevalente,
seguida por Acinetobacter baumannii e Enterococcus spp. (HODLE, et al., 2006).
A elevada incidência de P. aeruginosa nas instituições de saúde contribuiu
para o mau estado de saúde dos pacientes, principalmente devido à alta taxa de
cepas resistentes a múltiplas drogas em enfermarias de hospitais, e ao uso prévio
de antibióticos de largo espectro, que contribuíram com o aumento da resistência a
antimicrobianos nesses microrganismos (OTTER et al., 2011 ). Embora as taxas
variem entre os estudos e as instituições, a Pneumonia Associada a Ventilação
(PAV) geralmente demonstra a maior mortalidade, cerca de 30% (WILLIAMS et
al., 2010 ). Os pacientes com PAV muitas vezes sofrem de um epitélio rompido
induzido pela inserção do tubo endotraqueal, que pode servir como um reservatório
para P. aeruginosa a qual cresce em biofilme na superfície de plástico (WILLIAMS et
al ., 2010 ). Estes biofilmes são difíceis de remover, assim como as bactérias
associadas ao biofilme exibem aumento da resistência aos antibióticos e
desinfetantes. Isto, em parte, explica o êxito relativo dos regimes de tratamento com
antibióticos que são iniciados antes da formação de biofilmes em comparação com a
persistência de infecções por P. aeruginosa após o desenvolvimento do biofilme
(GELLATLY e HANCOCK, 2013).
A resistência a antimicrobianos de amplo espectro em isolados multidroga
resistentes (MDR), limita significativamente as opções terapêuticas
eficazes. Comumente, os agentes de último recurso para os organismos MDR
incluem os aminoglicosídeos e as polimixinas. Diversos estudos evidenciaram que
estes agentes podem ou não ser tão eficazes como agentes de primeira linha, mas
também podem estar associados com efeitos adversos mais significativos (isto é,
nefrotoxicidade, ototoxicidade e neurotoxicidade) (HARTZELL, et. al. 2009; LI, et
al.,2006). Isso contribui para a dificuldade em avaliar se patógenos MDR estão
realmente associados a piores desfechos clínicos. Dados clínicos sugerem que
19
infecções por P. aeruginosa MDR podem estar associadas a piores
prognósticos, no entanto estas investigações são muitas vezes confundidas com
definições variadas de resistência a múltiplas drogas (RIBERA et al., 2015).
2.1.3 Potencial de Patogenicidade
Pseudomonas aeruginosa é um agente patogênico oportunista, presente em
muitas e diversas configurações ambientais e que pode ser isolado a partir de várias
fontes vivas, incluindo plantas, animais e seres humanos. A capacidade
de P. aeruginosa para sobreviver com as necessidades nutricionais mínimas e de
tolerar uma variedade de condições físicas permitiu a este organismo persistir em
ambos os contextos comunitários e hospitalares (LYCZAK et al.,2000). .
No hospital, P. aeruginosa pode ser isolado a partir de uma variedade de
fontes, incluindo equipamentos de terapia respiratória, antissépticos, sabão, pias,
esfregões, medicamentos e piscinas de hidroterapia e fisioterapia. A sua
adaptabilidade e alta resistência intrínseca aos antibióticos lhe permite sobreviver
em uma ampla gama de regulações naturais e artificiais, incluindo as superfícies em
instalações médicas. Em sua maioria, as infecções nosocomiais por P.
aeruginosa são muitas vezes sérias, e quase todos são associados com as defesas
do hospedeiro comprometidas, tais como neutropenia, em queimaduras graves, ou
em casos de fibrose cística (LYCZAK et al.,2000).
As opções terapêuticas são cada vez mais limitadas devido ao surgimento
contínuo e disseminação de cepas resistentes aos antimicrobianos. Como
resultado, infecções por P. aeruginosa apresentam alta morbidade e
mortalidade. Nos Estados Unidos, P. aeruginosa está entre os patógenos
hospitalares mais prevalentes e é o segundo patógeno mais frequentemente isolado
de pacientes com pneumonia associada à ventilação mecânica (HIDRON et
al.,. 2008).
A patogênese do ponto de vista microbiológico está associada à capacidade
invasiva e toxigênica dessa bactéria. Basicamente, o processo infeccioso da P.
aeruginosa pode ser dividido em três fases: 1) adesão e colonização; 2) invasão
local; e 3) disseminação e doença sistêmica. Nenhuma das fases se desenvolve
sem que a anterior tenha ocorrido, embora o processo possa se limitar a qualquer
uma delas (ZAVASCKI, 2005).
20
2.1.4 Fatores de Virulência
P. aeruginosa é considerada a espécie mais virulenta dentre os bacilos Gram
negativos não fermentadores como resultado da produção de uma grande variedade
de fatores de virulência celulares e extracelulares. Dentre os fatores celulares se
destacam os pilli, apêndices superficiais que promovem a aderência do
microrganismo a receptores de gangliosídeo GM-1 presentes na superfície das
células epiteliais do hospedeiro; os flagelos, que também participam da aderência; e
a endotoxina (lipopolissacarídeo da parede celular; LPS); responsável pela síndrome
séptica através da ativação e liberação de mediadores de vasodilatação, como
interleucina 1 e fator de necrose tumoral, da ativação do complemento e da
deflagração de coagulação intravascular disseminada, entre outros mecanismos
(BALASUBRAMANIAN et al.,2013).
No que concerne à invasão de tecidos por P. aeruginosa, é promovida pela
produção de elastase, proteases alcalinas, hemolisinas (fosfolipase e lecitinase),
citotoxinas (leucocidina), sideróforos com os seus sistemas de captação, e pigmento
piocianina difusível. As elastases secretadas por P. aeruginosa clivam IgG, IgA, e
proteínas do complemento. Além disso, as elastases rompem a integridade da
barreira epitelial aos desregular junções de células epiteliais, interferindo com a
depuração mucociliar. A elastase da P. aeruginosa também degrada proteínas
surfactantes A e D (SP-A e SP-D), os quais têm um papel importante na imunidade
inata (MARIENCHECK, et al.,2003). As proteases alcalinas promovem a lise da
fibrina, interferindo com a formação de fibrina, e inativando proteínas de defesa do
hospedeiro importantes, tais como anticorpos, proteínas do sistema complemento,
IFN-γ, e citocinas. A leucocidina é uma proteína formadora de poros que tem efeitos
citotóxicos nas células hospedeiras. Fosfolipase e lecitinase são hemolisinas que
agem sinergicamente para quebrar lipídios e lecitina. Estas proteínas promovem a
invasão e provocam efeitos citotóxicos nas células hospedeiras
(BALASUBRAMANIAN et al.,2013).
A maioria das estirpes de P. aeruginosa segregam piocianina (N-metil-1-
hydroxyphenazine), o pigmento que dá cor azul-esverdeada para as colônias
bacterianas. Altas concentrações de piocianina são detectados nas secreções
pulmonares de pacientes com fibrose cística, onde exerce um efeito pró-inflamatório,
perturba o epitélio brônquico, e prejudica a função ciliar. A piocianina também
21
interfere nas defesas antioxidantes do pulmão e facilita o dano oxidativo ao epitélio
pulmonar através da inibição da atividade da catalase ( O’MALLEY, et. al. 2003a;
2003b).
P. aeruginosa pode causar dano tecidual direto e necrose, muitas vezes
consequência da produção de exotoxina A. Exotoxina A é uma enzima de
ribosilação de ADP (Adenosina Difosfato) excepcionalmente potente que entra nas
células eucarióticas por endocitose mediada por receptor e catalisa a ribosilação do
ADP inibindo o fator de alongamento do EF-2 na célula eucariótica. A consequência
disso é a inibição da síntese de proteínas, em última análise conduzindo à morte
celular (YATES, et. al. 2001).
O Lipopolissacarídeo (LPS) é outro componente importante da P. aeruginosa e
outras bactérias Gram-negativas. As cadeias antigênicas O-laterais de LPS foram a
base dos sistemas de tipagem sorológicas, historicamente usados para estudos
epidemiológicos em P. aeruginosa, antes dos métodos de tipagem genômicas
estarem disponíveis. (ERNST ; MILLER, 2000). O LPS está associado com o
aumento da imunogenicidade, embora deva notar-se que em P. aeruginosa é muito
menos imunogênico e evoca uma resposta de citocinas mais modesta a partir de
macrófagos em comparação com outras bactérias como Escherichia
coli ou Salmonella (ERNST et al., 2000).
A produção de alginato é outro mecanismo de virulência muito importante em
P. aeruginosa, o qual trata-se de um polissacarídeo capsular que permite a
aderência às superfícies epiteliais pulmonares com a formação de grandes
conglomerados bacterianos, biofilme que protege a bactéria da ação dos antibióticos
e do sistema imunológico do hospedeiro; este fator de virulência é hiperproduzido
pelas cepas de P. aeruginosa e é responsável por infecções pulmonares em
pacientes com fibrose cística (HEAD et al.,2004).
2.2 RESISTÊNCIA BACTERIANA AOS ANTIMICROBIANOS
A resistência aos antibióticos, entre os vários gêneros bacterianos, representa
um problema de saúde pública mundial. Para alguns estudiosos a situação atual
caminha para o que foi vivenciado na era pré-antibiótico, uma vez que o surgimento
22
de novos recursos terapêuticos não acompanha a evolução dos mecanismos de
resistência bacterianos (PATERSON, 2006).
Os Bacilos Gram-negativos aeróbios, incluindo a família Enterobacteriaceae e
BGNNF como a Pseudomonas e Acinetobacter spp, são as principais causas de
infecções hospitalares A taxa de resistência aos antibióticos entre esses patógenos
acelerou dramaticamente nos últimos anos e atingiu escala pandêmica. Já não é
incomum encontrar infecções por bactérias Gram-negativas que são intratáveis por
antibióticos convencionais em pacientes hospitalizados. (GALES et al., 2012).
As mutações que conferem resistência a antibióticos para bactérias são
evolutivamente antigas e difundidas na natureza, tendo surgido em resposta a
pressões seletivas que antecedem a atividade humana (D’COSTA et al., 2011;
NESME et al.,2014). Estes mecanismos de resistência tem encontrado um nicho
permissivo no ambiente hospitalar, em que uma alta densidade de pacientes
suscetíveis, a intensa pressão seletiva para resistência aos antibióticos, e múltiplas
oportunidades para a transmissão se cruzam. As taxas de resistência são mais altas
na UTI por causa do uso excessivo de antibióticos, práticas de isolamento
imperfeitas, e internamentos prolongados de pacientes que são altamente
suscetíveis a infecções nosocomiais por causa de comorbidades e o uso de
dispositivos de longa permanência, como sonda endotraqueal e nasogástrica,
cateteres urinários, e cateteres centrais venosos (VINCENT et al.,2009). A
propagação clonal de organismos resistentes entre as regiões geograficamente
distantes adicionou um novo impulso para o aumento explosivo na resistência aos
antibióticos nos últimos anos (CANTÓN et al.,2012; PETTY et al.,2014). Essa
disseminação global da resistência antimicrobiana é alimentada pela falta de higiene
e uso comum de antibióticos nos países em desenvolvimento, práticas veterinárias
do uso excessivo de antibióticos em animais de corte para consumo humano, bem
como a frequência das viagens internacionais (LANDERS et al.,2012; World Health
Organization, 2014).
Os bacilos Gram-negativos são a causa mais comum de infecções
hospitalares e a causa mais comum de infecção na UTI (VINCENT et
al.,2009) incluindo a maioria dos casos de pneumonia e infecções do trato urinário,
infecções hospitalares e 25% a 30% de infecções do sangue e do sítio cirúrgico
(ROSENTHAL et al. 2012; ZARB et al. 2012)
23
Um subconjunto de bacilos Gram-negativos, as Enterobacteriaceae, fazem
parte da microbiota comensal normal do intestino humano e, no contexto de doença
aguda, de forma assintomática, colonizam o trato aerodigestivo superior e da pele
em pacientes hospitalizados e quase todos os indivíduos criticamente doentes. Uma
vez estabelecidos como colonizadores, estes organismos causam infecções
hospitalares por microaspiração ou devido a sua introdução em sítios estéreis. Além
disso, as bactérias que colonizam são progressivamente substituídas por estirpes
resistentes aos antibióticos na UTI (TABLAN et al. 2004). Os bacilos Gram-negativos
possuem vários modos de resistência a antibióticos e são altamente eficientes em
transferi-los horizontalmente entre as espécies. O aumento dramático na resistência
a antibióticos entre bactérias Gram-negativas nas últimas décadas foi identificada
pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças entre as ameaças mais
importantes para a saúde humana em todo o mundo (Centers for Disease Control
and Prevention, 2013).
O aparecimento de resistência a múltiplas drogas tornou-se uma grande
ameaça para o tratamento atual de infecções hospitalares causadas
por P. aeruginosa em todo o mundo (MUDAU et al., 2013; MURAKI et al., 2013). As
opções terapêuticas disponíveis para o tratamento de infecções causadas por
P. aeruginosa são limitadas a um pequeno número de compostos que pertencem a
três grandes classes de antimicrobianos: β-lactâmicos anti-pseudomonas,
fluoroquinolonas anti-pseudomonas e aminoglicosídeos (HONG et al, 2013). De
acordo com o estudo de vigilância conduzido pela International Nosocomial Infection
Control Consortium (INICC) em 36 países da América Latina, Ásia, África e Europa,
47,2% casos de P. aeruginosa isoladas foram relatadas como sendo resistentes a
imipenem (ROSENTHAL et al., 2012 ). Da mesma forma, dois proGramas de
vigilância na China, nomeados Surveillance by Etest and Agar Dilution of Nationwide
Isolate Resistance (SEANIR) e Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends
(SMART), informaram que 32,4% de P. aeruginosa isoladas no período de 2008-
2010 apresentaram resistência à ceftazidima ( XIAO et al., 2012 ). O SCOPE Brasil
(Vigilância e Controle de patógenos de importância epidemiológica) constatou que
35,8%, 36,8% e 36,6% de P. aeruginosa isolados foram resistentes ao meropenem,
imipenem e ceftazidima, respectivamente (MARRA et al., 2006 ). É bem sabido que
a resistência antimicrobiana é um determinante importante que mantem
24
P. aeruginosa no ambiente hospitalar, mas os mecanismos de virulência deste
microrganismo são muito importantes. (JIMENEZ et al., 2012 ).
Em P. aeruginosa, podemos citar quatro principais mecanismos de resistência
predominantes os quais podem estar sozinhos ou associados, são eles: mudança no
sítio ativo das PBPs (Protein Bilding Penicilin), diminuição da expressão de porinas
(Outer Membrane Proteins - OMPs), aumento da expressão de bombas de efluxo e
produção de enzimas betalactamases (BABIC; HUJER; BONOMO, 2006).
2.2.1 Alteração das PBP’s
As modificações em PBPs podem acontecer por mutações, hiperexpressão ou
redução da afinidade. Todas essas modificações reduzem a atividade do
antimicrobiano β-lactâmico na inibição da síntese da parede celular conferindo
resistência a esses agentes. É um mecanismo muito importante em Gram-positivos
como Streptococcus pneumoniae resistente à penicilina, e Staphylococcus aureus
resistente à meticilina (MRSA). Na maioria dos Gram-negativos a mutação em PBPs
tem menor importância que os demais mecanismos (SAUVAGE et al.,2008).
2.2.2 Perda de Porinas
A diminuição da expressão de porinas (OprD) é um mecanismo de resistência
prevalente em P. aeruginosa. Para acessar as PBPs no interior da membrana
plasmática, os antibióticos devem se difundir na parede (o que é muito difícil, já que
são moléculas pouco lipofílicas) ou atravessar canais chamados de porinas.
Algumas bactérias apresentam resistência aos carbapenêmicos devido à perda
destas OprD. A perda de porinas também está associada à resistência ao imipenem
e meropenem em Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii (JACOBY;
MILLS; CHOW, 2004; BABIC; HUJER; BONOMO, 2006). As mutações pontuais ou a
presença de sequências de inserção nos genes que codificam as porinas podem
produzir proteínas com função diminuída e, portanto, resultar em menor
permeabilidade aos antimicrobianos. É importante ressaltar, no entanto que, apenas
a deficiência da porina não é suficiente para produzir o fenótipo de resistência,
25
sendo normalmente encontrada combinada à produção de β-lactamases (POOLE,
2004B).
A perda ou alteração da proteína de membrana OprD, ou porina, é considerado
o mecanismo mais comum de resistência aos carbapenêmicos (incluindo imipenem)
em P. aeruginosa (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al., 2009; WANG et al., 2010). Em
comparação com a produção de enzimas do tipo MBL, esse mecanismo não é visto
como promotor de alto nível de resistência, mas associado a outros mecanismos
como super expressão de bombas de efluxo (GUTIERREZ et al.,2007;.
RODRIGUEZ-MARTINEZ et al.,2009; TOMAS et al., 2010 ; WANG et al., 2010 ), ou
produção de enzimas inativadoras de antibióticos, como AmpC, pode ser
considerado como o principal determinante da resistência aos carbapenêmicos não
mediada por beta-lactamases (GUTIERREZ et al., 2007; TOMAS et al., 2010; WANG
et al., 2010).
2.2.3 Sistema de efluxo
Outro mecanismo de grande importância em Gram negativos não
fermentadores, em especial P. aeruginosa, tem sido as bombas de efluxo, que
atuam em conjunto com outros mecanismos de resistência e proporcionam altos
níveis de resistência nessa espécie bacteriana. As bombas de efluxo são capazes
de exportar uma grande variedade de substratos do periplasma para o meio
ambiente. Essas bombas são um importante determinante da multirresistência em
muitos microrganismos Gram-negativos, especialmente P. aeruginosa e
Acinetobacter spp. e funcionam expulsando os antimicrobianos do espaço
periplásmico para fora da célula, conferindo resistência à bactéria. (SHAHID et
al.,2009).
As Bombas de efluxo bacterianas foram classificados em cinco famílias, sendo
elas a superfamília ATP-Binding Cassette (ABC) (Lubelski et al.,2007), a Major
Facilitator Superfamily (MFS), (PAO et al.,1998), a família Multidrug and Toxic
Compound Extrusion (MATE) ( (KURODA et al.,2009), a família Small Multidrug
Resistance (SMR) (JACK et al.,2001), e a superfamília Resistance Nodulation
Division (RND) (SEEGER et al. 2008) em especial, os exportadores de drogas
pertencente à família RND desempenham um papel-chave na resistência
26
clinicamente relevante em bactérias Gram-negativas, que parecem ser os
contribuintes mais significativos para a resistência antimicrobiana
em P. aeruginosa (POOLE, 2004A, 2007 ).
Em P. aeruginosa, o aumento da expressão do sistema de bombas de efluxo
MexAMExB-OprD em combinação com a baixa permeabilidade de membrana
externa pode resultar em redução da susceptibilidade a penicilinas e cefalosporinas,
mas também a antimicrobianos de outras classes como quinolonas, tetraciclina e
cloranfenicol. (DRAWZ et al.,2010).
2.2.4 Produção de enzimas inativadoras de antimicrobianos
2.2.4.1 β-lactamases
Compostos β-lactâmicos são produzidos por diversos microrganismos
presentes no solo e provavelmente sua produção pode representar uma vantagem
competitiva pelo nicho ecológico. De modo análogo, a produção de β-lactamases
pode representar uma vantagem adaptativa para garantir a integridade da parede
celular e, portanto existe no ambiente, resultado de uma adaptação natural (DRAWZ
et al.,2010).
Não é surpresa, portanto, que a primeira β-lactamase a ser descrita tenha
sido identificada em um isolado de E.coli mesmo antes do uso generalizado da
penicilina na prática clínica (KIRBY, 1944). A origem dessa enzima parece estar
relacionada com as próprias PBPs bacterianas, a partir de uma estrutura primordial
e de um ponto de vista evolutivo, sugerindo que aquela proteína possa apresentar
um ancestral comum com bactérias primitivas produtoras de antibióticos (HALL ;
BARLOW, 2004). Hoje em dia, elas já estão amplamente distribuídas entre bactérias
Gram-positivas e Gram-negativas e, configura como principal mecanismo de
resistência em P. aeruginosa (LIVERMORE, 1995).
Essas enzimas são codificadas por genes chamados bla, que podem estar
presentes no cromossomo bacteriano ou em plasmídeos. A expressão dos genes
bla pode ser induzida pela presença dos β-lactâmicos ou estar continuamente
ativada. Assim, as β-lactamases podem estar presentes de forma induzível ou
constitutiva (LIVERMORE, 1995).
27
O seu mecanismo de ação em Gram-negativos ocorre no espaço
perliplasmático e se caracteriza pela hidrólise do anel β-lactâmico presente no
núcleo estrutural das penicilinas, o ácido 6-aminopenicilâmico, provocando assim a
formação do ácido peniciloíco que é desprovido de atividade antimicrobiana.
(TAVARES, 2001). Primeiramente, a enzima associa-se de forma não covalente ao
anel β-lactâmico do antimicrobiano. Então, o radical hidroxila livre do resíduo de
serina presente no sítio ativo da enzima, ataca o anel β-lactâmico, formando uma
ligação covalente acil-éster. A hidrólise do éster formado libera a enzima ativa e os
antimicrobianos hidrolisados e inativos como mostra a FIGURA 1 (LIVERMORE,
1995). É importante ressaltar que algumas β-lactamases utilizam o zinco como
cofator enzimático ao invés da serina. Entretanto a maioria age via éster de serina.
De forma similar, ocorre com a hidrólise das cefalosporinas e dos carbapenêmicos.
Figura 1. Mecanismo de ação das β-lactamases com serina no sítio ativo
Fonte: Adaptado de LIVERMORE, 1995.
2.2.4.1.1 β-lactamases de Espectro Estendido (ESBL)
O primeiro isolado clínico, expressando ESBL, foi identificado por Knothe, na
Alemanha, em 1983 em uma cepa de Klebsiella ozanae (KNOTHE et al.,1983). O
gene responsável por esse fenótipo apresentava uma única mutação quando
comparado à sequência da enzima SHV-1 (intrínseca a este gênero), o que
aumentava consideravelmente seu espectro de ação, passando a ter a capacidade
28
de hidrolisar cefalosporinas de terceira geração; essa enzima foi denominada SHV-2
(KLIEBE et al.,1985). Atualmente, o número de ESBLs caracterizadas já passa de
500, e as pesquisas que as relatam têm origem em mais de 30 países do mundo, o
que demonstra sua ampla distribuição (PATERSON, 2006; GNIADKOWSKI, 2008).
As primeiras ESBLs descritas eram derivadas de β-lactamases do tipo SHV
(primeiro caso descrito na literatura) e do tipo TEM, a partir de mutações em seu
sítio ativo. Essas β-lactamases eram importantes apenas no ambiente hospitalar
(BRADFORD, 2001). Da mesma forma, as ESBLs do tipo OXA são derivadas de
OXA não ESBLs por mutações (NAAS; NORDMANN, 1999). A família CTX-M, no
entanto, ao contrário das ESBLs citadas anteriormente , não são derivadas de β-
lactamases de espectro restrito (LIVERMORE et al.,2007) e desde os seus primeiros
relatos em 1989, vem ganhando cada vez mais importância, tornando-se endêmica
em continentes como a América do Sul, Europa, Ásia e Oceania. (CÁNTON;
COQUE, 2006).
A grande parte das beta-lactamases de espectro ampliado (ESBL) encontram-
se enquadradas no grupo molecular A de Ambler (AMBLER, 1980; BARLOW, 2005),
enquanto que na classificação funcional de Bush e Jacoby, a maioria está situada no
grupo 2be. Estas enzimas são capazes de hidrolisar penicilinas, cefalosporinas
(incluindo as de amplo espectro) e monobactâmicos, mas são ineficazes em relação
aos inibidores de β-lactamases (clavulanato, tazobactam), carbapenêmicos e
cefamicinas (cefoxitina e cefotetan). Todavia, a resistência as cefamicinas pode
ocorrer em cepas produtoras de ESBL, quando houver uma diminuição de porinas
de membrana reduzindo sua permeabilidade. (BUSH; JACOBY, 2010). Os
carbapenêmicos, por sua vez, apresentam-se ineficazes quando existem
mecanismos de resistência diferentes das ESBLs associados a elas ou quando o
mecanismo de resistência for a produção de carbapenemases, enzimas que serão
discutidas mais adiante (QUEENAN; BUSH, 2010). Já os inibidores de β-
lactamases, mostram-se ineficientes quando enzimas conhecidas como IRT (TEM
resistentes a inibidores), pertencentes ao grupo 2br de Bush e Jacoby, estão
atuantes. As últimas emergiram do tipo TEM-1 e TEM-2, mas também são
encontradas na família SHV devido a mutações que comprometeram a afinidade
destas pelos inibidores de β-lactamases (BABIC; HUJER; BONOMO, 2006).
29
Muitas definições já foram atribuídas às β-lactamases de espectro estendido,
mas a fim de simplificar esse conceito foi proposta uma definição durante a
conferência ESCMIC (European Society of Clinical Microbiology and Infectious
Diseases), a qual, em suma, afirma que toda ESBL é uma β-lactamase,
ordinariamente adquirida e na sua grande maioria, não inerente às espécies, as
quais podem hidrolisar rapidamente, ou conferir resistência a oximino-cefalosporinas
(não carbapenêmicos), ou uma β-lactamase mutante, dentro de uma família que
tenha habilidade em fazê-lo. (LIVERMORE, 2008).
2.2.4.1.2 Metallo-β-lactamase
Beta-lactamases de classe B ou metallo-beta-lactamase (MBLs) são enzimas
que requerem íon zinco como um co-factor de metal para a atividade como
carbapenemase. Essas MBL são capazes de conferir resistência aos
carbapenêmicos em uma ampla variedade de bactérias Gram-negativas (JACOBY,
2005; LEE, et al. 2008; WALSH, 2008; SIARKOU et al.,2009).
A primeira MBL foi descrita em 1966, em um isolado de Bacillus cereus
(KUWABARA; HUSSAIN et al.,1985). Devido sua facilidade de propagação, através
de plasmídeos e sua capacidade de hidrolisar todos os beta-lactâmicos, com
exceção do Aztreonam, essa enzima tem se tornado um sério problema de saúde
pública, no Brasil e no mundo (SADER et al. 2005).
Enzimas do tipo MBL, são um motivo de preocupação, porque elas são
capazes de hidrolisar a maioria dos beta-lactâmicos, incluindo o imipenem e
meropenem, consideradas drogas de reserva para o tratamento de estirpes Gram-
negativas multirresistentes (MAGALHÃES et al., 2005; YAN et al. 2001). Além disso,
as MBL são codificadas nos genes associados aos elementos móveis, uma condição
que facilita a sua propagação entre diferentes espécies bacterianas e gêneros
(MAGALHÃES et al. 2005; GALES et. al. 2003).
Ultimamente, tem havido um aumento dramático na detecção e propagação de
famílias adquiridas e transferíveis destas metallo enzimas (IMP, VIM, SPM, GIM,
SIM e AIM) (FRANCO et. al. 2010). Cepas de P. aeruginosa produtoras de MBLs
têm sido relatadas como causadoras de pequenos surtos nosocomiais
(LAGATOLLA, et al. 2006). Diferentes tipos de MBL (IMP, VIM, SPM-1, GIM-1, 1-
30
SIM, NDM-1 e MIF-1) têm sido encontrados em P. aeruginosa (CORNAGLIA et al.,
2011; POLLINI et al., 2013 ). As MBL possuem disseminação lenta, entretanto
crescente, dentro dos hospitais, causando surtos e/ou situações hiperendêmicas em
vários centros, principalmente no Extremo Oriente e no sul da Europa (TSAKRIS et
al. 2009; LAGATOLLA, et al., 2006; PEÑA et al., 2007). Vários estudos identificaram
fatores de risco para a aquisição de MBL, como distúrbios respiratórios, idade acima
de 40 anos, tempo de internação maior que 20 dias e uso inadequado de
antimicrobianos (HORIANOPOULOU et al., 2006; MARRA et. al. 2006) bem como o
resultado de infecções causadas por P. aeruginosa produtores de MBL (LEE et al.,
2004). O aumento da incidência de infecções nosocomiais por estirpes de P.
aeruginosa possuindo MBL compromete severamente a seleção de tratamentos
adequados e está, portanto, associada à significativa morbidade e mortalidade
(TSAKRIS et al., 2000).
2.2.4.1.3 AmpC
As AmpC são serino beta-lactamases pertencentes a Grupo 1, segundo
classificação de Bush-Jacoby-Medeiros (Bush-Jacoby-Medeiros, 1995), e de Classe
C, de acordo com a classificação de Ambler (AMBLER et al., 1991). Elas também
são chamadas cefalosporinases embora o seu espectro de ação hidrolítico não só
inclua as cefalosporinas (JUAN et al.,2005). Certas Enterobacterias têm,
naturalmente, beta-lactamases AmpC, como é o caso da Enterobacter spp.,
Providencia spp., Morganella morganii, Serratia marcescens, freundii Citrobacter e
Hafnia (SUÁREZ et. al. 2006) bem como bacilos Gram-negativos não fermentadores
de importância clínica como Pseudomonas aeruginosa (VILA; MARCO, 2002). A
AmpC produzida pelos microrganismos supracitados são de natureza cromossômica
induzível e explicam a resistência natural a aminopenicilinas, cefalosporinas de 1ª
geração, cefamicinas (cefoxitina, cefotetan) e Aminopenicilinas combinado com
inibidores de beta-lactamase (amoxicilina ácido clavulânico, ampicilina-sulbactam),
expressa por estes agentes bacterianos (SUÁREZ et. al. 2006). E. coli, Shigella spp.
e Acinetobacter baumannii, também possuem beta-lactamase AmpC cromossômica,
porém constitutiva (não indutíveis) (VILA; MARCO, 2002). Por outro lado, há
plasmídeos que codificam AmpC que pode ser induzível ou não (SCHMIDTKE;
31
HANSON, 2006). Uma característica das enzimas AmpC é que elas não têm efeito,
por si só, contra cefalosporinas de 4ª geração, ou em carbapenems, sendo este
último beta-lactâmicos de escolha em cepas produtoras de AmpC (PAI et al., 2004;
PEREZ-PEREZ; HANSON, 2002) Além disso, AmpC não são inibidas pelos
clássicos inibidores de beta-lactamase (ácido clavulânico, sulbactam, tazobactam)
(PETROSINO, et. al. 2002), embora algumas possam ser inibida por sulbactam ou
tazobactam (BUSH, et al.,1993).
As enzimas tipo AmpC são um tipo de beta-lactamases que ao contrário das
ESBLs não possuem atualmente um método padronizado pelo Standards Institute
Laboratory (CLSI) para detecção fenotípica. Este fato, juntamente com a dificuldade
para elucidar fenotipicamente se existe presença de uma AmpC cromossômica ou
plasmidial, e a ausência de inibidores de AmpC para utilização in vivo, fazem
considerar estas enzimas como um emergente problema terapêutico (MARTINEZ,
2009).
2.2.4.2 Produção de enzimas inativadoras de aminoglicosídeos
Os aminoglicosídeos são comumente utilizados no tratamento de infecções
causadas por P. aeruginosa (por exemplo, tobramicina, gentamicina, amicacina;
BARTLETT, 2004), especialmente para tratamento de infecções pulmonares em
pacientes com fibrose cística (FC), onde amicacina e, em particular, tobramicina são
rotineiramente empregadas (TACCETTI et al.,2008). Seu uso é, no entanto, ligada
ao desenvolvimento de resistência devido a produção de enzimas modificadoras de
aminoglicosídeos (Modifying Enzymes Aminoglycosides - AMEs) e metilases rRNA,
além da elaboração de mecanismos de efluxo endógenas. (POOLE, 2005).
A modificação do Aminoglicosídeo, que leva a inativação do antibiótico,
normalmente envolve a fosforilação (por aminoglicosídeos fosforiltransferases,
APHS), acetilação (por aminoglicosídeos acetiltransferases, AACS), ou adenilação
(por aminoglicosídeos Nucleotidiltransferases, ANTs; aminoglicosídeo
adeniltransferase, AAD). As AMEs são determinantes comuns de resistência a
aminoglicosídeo em P. aeruginosa exceto em isolado de Fibrose cistica onde estes
mecanismos são quase desconhecidos (HENRICHFREISE et al.,2007 ; ISLAM et
al., 2009 ). Genes para AMEs são normalmente encontrados em integrons com
32
outros genes de resistência (POOLE, 2005 ; RAMIREZ E TOLMASKY, 2010 ) e,
como tal, isolados AME são frequentemente multirresistente.
2.2.5 Resistência a Fluoroquinolonas
As fluoroquinolonas (FQS), especialmente ciprofloxacina, são comumente
utilizadas no tratamento de infecções por P. aeruginosa. A resistência a esses
agentes é predominantemente mediada por mutações na DNA girase e
Topoismerase IV, enzimas que são alvo das FQS, embora o sistema de efluxo
contribua significativamente (JACOBY, 2005 ; DRLICA et al., 2009 ), muitas vezes
em combinação com mutações no local alvo (HENRICHFREISE et al.,2007 ;.
REJIBA et al.,2008 ;. TAM et al.,2010 ).
A classe das FQ age nas topoisomerases bacterianas [topoisomerase II (aka
gyrase) e topoisomerase IV], que são responsáveis pela introdução e/ou remoção de
superenovelamento, bem como encadeamento/ desencadeamento de DNA e, assim,
desempenham um papel essencial na replicação, transcrição, recombinação e
reparação do DNA (DRLICA e ZHAO, 1997). Em bactérias Gram-negativas, a girase
é o alvo preferido de FQS, dessa forma, mutações nesse sitio são comuns de
ocorrer, além de mutações adicionais em topoisomerase IV, visto em alguns
isolados altamente resistentes (JACOBY, 2005).
A DNA-girase (GyrA e GyrB) e topoisomerase (ParC e parE) são, cada um,
compostos por duas subunidades. Mutações que promovam resistência a FQ
ocorrem tipicamente na chamada "região determinante de resistência à quinolona"
(QRDR) de GyrA e/ou ParC (JACOBY, 2005 ;. DRLICA et al.,2009 ). Tais mutações
são comuns em P. aeruginosa (LEE et al., 2005 ; MURAMATSU et al., 2005 ;
HENRICHFREISE et al.,2007 ;. REJIBA et al., 2008 ) em isolados altamente
resistentes que transportem mutações múltiplas em gyrA e/ou parC (LEE et
al.,2005 ; MURAMATSU et al.,2005 ), com mutações em gyrB (LEE et al.,2005 ;
MURAMATSU et al.,2005 ; SCHWARTZ et al.,2006 ) e parE (LEE et al.,2005 ;.
REJIBA et al.,2008 ), menos comum.
Outro mecanismo de resistência comum a essa classe de antimicrobianos é a
hiper expressão de bombas de efluxo. Quatro membros da família RND de sistemas
de efluxo para múltiplos fármacos, MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-oprN, e
MexXY-OprM são conhecidos por reconhecer e expulsar antibióticos da classe das
33
FQs (POOLE, 2000), consequentemente estes sistemas de efluxo estão
intimamente relacionados com a resistência a FQ em isolados clínicos (POOLE,
2000; REINHARDT et al.,2007 ).
Os plasmídeos também pode produzir diretamente resistência às
fluoroquinolonas. Por muito tempo se pensou não existir resistência às FQs
mediada por plasmídeo, até que foi descoberto, em um isolado clínico de K.
pneumoniae no Alabama, um plasmídeo que poderia transferir resistência de baixo
nível para quinolonas a E. coli e outras bactérias Gram-negativas (MARTÍNEZ-
MARTÍNEZ; PASCUAL; JACOBY, 1998). O plasmídeo aumentou a MIC para todas
as quinolonas testadas, com exceção da Coumermycin A1, uma quinolona inibidora
de função da GyrB. Uma vez que o plasmídeo não afetou as concentrações
intracelulares de quinolonas ou expressão de porina da membrana externa e porque
continuava a aumentar a resistência em estirpes de E. coli com gyrA, gyrB, Parc,
ompF, ompC , ou Marr mutações, um novo mecanismo de resistência foi sugerido
(MARTÍNEZ-MARTÍNEZ et al. 2003).
2.2.6 Resistência à Polimixina
Devido ao aumento da prevalência de P. aeruginosa multi-resistente, os
antimicrobianos Polimixina B e colistina (também chamado de polimixina E),
pertencente a uma família de antimicrobianos oligopeptideos cíclicos, voltaram a
atuar como uma opção de tratamento de último recurso, embora estes agentes
tenham efeitos colaterais fortes (por exemplo, nefrotoxicidade) com alta incidência
(POOLE, 2011). Muito recentemente, as Concentrações de Prevenção de Mutantes
(MPC) a polimixina para P. aeruginosa mostraram-se muito elevada (≥64 ng/ml),
mesmo para isolados sensíveis (ou seja, com concentração inibitória mínima (MIC)
intervalos de 1-2 mg/ml; CHOI e KO, 2013). Nos estudos de MPC, a mutação de
resistência a polimixina aparentemente pode resultar de uma única mutação ( CHOI
e KO, 2013 ).
O mecanismo de ação das polimixinas envolve uma fase inicial de interação
com o lipídio A do Lipopolissacarídeo (LPS), conduzindo à absorção auto-promovida
de polimixinas através da membrana, seguido de morte celular (FERNANDEZ et
al.,2013. ). O mecanismo mais comum de resistência à polimixina surge a partir da
34
modificação do lipídio LPS A com 4-amino- L -arabinose, um processo que tem sido
observado tanto em mutantes selecionados in-vitro quanto em isolados de Fibrose
cística ( MILLER et al.,2011. ; POOLE, 2011 ; . MOSKOWITZ et al.,2012 ). Tais
alterações podem ser alcançados por meio de modificações covalentes do lipídio A
do LPS por meio da adição de fosfoetanolamina (PETN) e modificação da 4-amino-
4-desoxi-L-arabinose (L-Ara4N), através da desacilação, hidroxilação e palmitoilação
por PAgP (palmitoilação não contribuem para a resistência polimixina) (RAETZ et
al.,2007 ). Outras estratégias incluem a utilização de uma bomba de efluxo e
formação de cápsula (PADILLA et al., 2010 ). A modificação da L-Ara4N é a mais
eficaz das duas modificações devido à natureza da alteração de carga. A carga
positiva líquida resultante do LPS modificado reduz a sua ligação a polimixinas,
conduzindo à resistência (OLAITAN et al. 2014).
35
3 OBJETIVOS
3.1 GERAL:
- Avaliar o perfil de resistência a antimicrobianos de Pseudomonas aeruginosa
isoladas em três centros de referência localizados na cidade do Natal/RN.
3.2 ESPECÍFICOS:
- Identificar os principais sítios de isolamento das amostras de P. aeruginosa
isoladas;
- Determinar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos através do método de
disco difusão;
- Avaliar a presença de cepas produtoras de β-lactamases do tipo AmpC e Metallo-
β-Lactamase.
36
4 METODOLOGIA
4.1 CARACTERÍSTICAS DO ESTUDO
Trata-se de um estudo exploratório e descritivo, de abordagem quantitativa. No
presente estudo foram avaliados 113 isolados de P. aeruginosa. Todos os isolados
de P. aeruginosa utilizados foram provenientes de Centro de saúde, sendo
previamente identificados de material clínico e encaminhados dos Laboratórios Dr.
Almino Fernandes (LACEN-RN), Laboratório de Análises Clínicas do HUOL e
Laboratório de Análise Clínicas do Hospital Giselda Trigueiro (HGT) ao Laboratório
de Micobactérias (LABMIC), da Universidade Federal do Rio Grande do Norte -
UFRN. O critério de inclusão utilizado nesse estudo foram a espécies bacterianas de
P. aeruginosa.
4.2 LOCAL E PERÍODO DO ESTUDO
As análises foram realizadas entre o período de Janeiro de 2013 a Junho de
2014 no Laboratório de Micobactérias (LABMIC) da UFRN.
4.3 CONFIRMAÇÃO DA IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS DE P.
aeruginosa
As amostras de Pseudomonas aeruginosa avaliadas neste estudo foram
identificadas, inicialmente, nos laboratórios de origem. A partir da verificação da
pureza das culturas foram feitas, em todas as amostras, testes fenotípicos
confirmatórios de sua identificação no LABMIC. Os testes fenotípicos utilizados na
identificação de P.aeruginosa incluíram: prova da oxidase, metabolismo OF-glicose,
motilidade, produção de pigmento, descarboxilação dos aminoácidos lisina, arginina
e ornitina, prova do indol, hidrólise da uréia, redução do nitrato, hidrólise da esculina,
crescimento em Caldo NaCl 6,5%, crescimento a 42°C e utilização do citrato. Estes
testes foram executados seguindo as recomendações de Koneman et al., (1997)
As espécies foram repicadas para Ágar MacConkey (HIMEDIA, Pennsylvania,
EUA) e incubadas por 18h a 35ºC em estufa bacteriológica.
37
A Cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 foi utilizada como controle dos meios de
cultura.
Após a confirmação da espécie P. aeruginosa através das provas bioquímicas
supracitadas, as amostras foram submetidas a Testes de Sensibilidade a
Antimicrobianos (TSA).
4.4 TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizado, na ocasião do
isolamento das bactérias, no Laboratório de Micobactérias da UFRN, por disco de
difusão, seguindo as recomendações, vigentes na época do isolamento, do Clinical
and Laboratory Standard Institute 2013 (CLSI 2013). Para preparação de uma
suspensão bacteriana com turvação aproximada de 0,5 na escala de McFarland
(Dade Behring, MicroScan®Turbidity Meter) foi feita uma suspensão de 2 a 5
colônias em solução de salina, e em seguida o semeio, em placas de Ágar Muller-
Hinton.
Após 10 minutos aplicaram-se os seguintes discos de antibióticos (13 discos
por placa): Imipenem, Meropenem, Ticarcilina-Ácido Clavulânico, Cefepime,
Ceftazidima, Piperacilina-Tazobactam, Amicacina, Tobramicina, Ciprofloxacina,
Ofloxacina, Norfloxacina, Aztreonam e Polimixina B.
Após incubação da placa, a 37°C por 18 horas, foram mensurados os
diâmetros dos halos de inibição para cada antibiótico. Os resultados obtidos foram
interpretados de acordo com o CLSI 2013/2014.
4.5 DETECÇÃO FENOTÍPICA DA PRODUÇÃO DE BETA-LACTAMASE DO
TIPO AMPC
As amostras de P. aeruginosa foram submetidas à avaliação da produção de
AmpC por meio do método de disco aproximação (DUNNE; HARDIN 2005) com
antibióticos isolados e combinados conforme desenho esquemático na Figura 2. Em
placas contendo meio de ágar Mueller-Hinton foram dispostos os discos, sendo o
Imipenem (10µg) utilizado como indutor, e Ceftazidima (30µ), Piperacilina +
Tazobactam (110/10µg), dispostos equidistantes de 20 a 25 mm do indutor
38
(distância medida de centro a centro). Depois de incubadas por 24 h a 37°C, é
caracterizado como teste positivo a presença de um antagonismo entre o indutor e
um dos substratos caracterizado pela forma de um D (MARTINEZ, 2009).
Figura 2. Representação esquemática da disposição dos discos de antimicrobianos utilizados no teste fenotípico de detecção de AmpC
* PIT= Piperacilina + Tazobactam, CAZ= Ceftazidima, IMP= Imipenem.
4.6 CONFIRMAÇÃO FENOTÍPICA DA PRODUÇÃO DE METALO-BETA-
LACTAMASES (MBL)
As bactérias que se mostraram resistentes a pelo menos um dos
carbapenêmicos (Imipenem ou meropenem) foram submetidas ao teste confirmatório
de MBL pelo método de bloqueio enzimático. Em uma placa de Ágar Mueller-Hinton
HIMEDIA, Pennsylvania, EUA), seguindo a escala de turbidez 0,5 McFarland (Dade
Behring, MicroScan®Turbidity Meter), foi semeada a cepa suspeita por toda a
extensão da placa, conforme padronizado pelo CLSI para realização do teste de
sensibilidade aos antimicrobianos por disco difusão (CLSI 2014). Em seguida, dois
discos, um com Meropenem (10µg) (OXOID) e outro com Imipenem (10µg) (OXOID),
foram posicionados paralelos a outros dois discos de Meropenem (10µg) (OXOID) e
Imipenem (10µg) (OXOID) ambos acrescidos de 10µL de EDTA (0,1M), seguindo
39
recomendações da Nota Técnica nº01/2013 da ANVISA. Os discos combinados com
EDTA foram preparados no dia do teste e aplicados nas placas somente após sua
secagem. Para interpretação, os halos de substrato com e sem EDTA foram
comparados, em amostras produtoras de MBL é observado aumento do halo de
inibição de crescimento da bactéria-teste na região do ágar onde ocorreu a difusão
do EDTA, e o achado de diferença maior ou igual a 7 mm no halo de substrato/
EDTA em relação ao substrato sozinho foi considerado positivo para MBL (YAN et
al., 2004). Já em testes negativos, não se espera alteração no halo de inibição de
crescimento da bactéria testada.
Figura 3. Representação esquemática da disposição dos discos de antimicrobianos utilizados no teste fenotípico
de detecção de MBL.
*IMP – Imipenem, MPM - Meropenem
40
5 RESULTADOS
5.1 Amostras bacterianas: Fontes de isolamento
Um total de 113 cepas de Pseudomonas aeruginosa foram caracterizadas à nível
de espécie e susceptibilidade a antibacterianos no LABMIC-UFRN.
A Tabela 1 mostra a distribuição das 113 P. aeruginosa avaliadas. Observou-se
que 72 (63,7%) foram provenientes do trato respiratório inferior.
Tabela 1. Distribuição de 113 amostras de P. aeruginosa de origem clínica, de acordo com o sítio de isolamento.
Fonte de Isolamento n° de amostras (%)
Secreções¹ 72 (63,7%)
Urina 24 (21,2%)
Sangue 7 (6,1%)
Líquidos de punção² 2 (1,7%)
Ponta de cateter 2 (1,7%)
Outros sítios³ 6 (5,3%)
Total 113 (100%)
¹ Inclui: secreções de feridas, de drenos, oculares, de vesícula, de ouvido, intrabdominais, do trato respiratório inferior e outras. ² Inclui: Líquor ³ Inclui: Fragmento de pleura e raspado de lesão
5.2 Determinação do padrão fenotípico de resistência a antimicrobianos.
A Tabela 2 mostra a frequência da resistência aos 13 antimicrobianos
testados. As maiores taxas de resistência foram verificadas frente às
Fluoroquinolonas.
Todas as amostras avaliadas foram sensíveis a Polimixina B.
41
Tabela 2. Distribuição da frequência de resistência a 13 antimicrobianos, de 113 amostras de P. aeruginosa, de acordo com os resultados do teste de disco difusão.
Classe de antimicrobianos
Antimicrobianos n° (%) de Amostras Resistentes
Ofloxacina 65 (57,5%)
Fluoroquinolonas Ciprofloxacina 63 (55,7%)
Norfloxacina 63 (55,7%)
β-lactâmico + Inibidor Ticarcilina – Ácido
Clavulânico 49 (43,3%)
de β lactamase Piperacilina-tazobactam 32 (28,3%)
Cefalosporinas de 3ª Ceftazidima 47 (41,5%)
e 4ª Geração Cefepime 44 (38,9%)
Carbapenêmicos Meropenem 45 (39,8%)
Imipenem 41 (36,2%)
Monobactâmico Aztreonam 44 (38,9%)
Aminoglicosídeos Tobramicina 41(36,2%)
Amicacina 32 (28,3%)
Polimixina Polimixina B 0 (0%)
5.3 Detecção da Produção de β-Lactamases do tipo AmpC
O índice de positividade para produção de AmpC correspondeu a
(40,7%, n=46) do total de 113 amostras testadas. Na figura 3 observa-se o resultado
positivo apresentado por uma amostra de P. aeruginosa.
Figura 4. Método de disco aproximação para detecção fenotípica de beta-lactamases AmpC induzíveis.
42
5.4 Produção de Metallo β-lactamase
Das 113 amostras avaliadas neste estudo, 50 (44%) apresentaram resistência
a, pelo menos, um dos carbapenêmicos pela técnica de disco difusão, e estas foram
submetidas ao teste de detecção fenotípica para produção de MBL. Das 50
amostras com resistência a carbapenêmicos, 21 (42%) apresentaram teste
fenotípico positivo para produção de metallo β-lactamase a partir do teste de
bloqueio enzimático, sendo presuntivamente consideradas produtoras de MBL. A
Figura 4 ilustra dois resultados positivos conforme observado no teste empregado
para detecção de MBL.
Figura 5. Amostras positivas para produção de MBL no teste fenotípico bloqueio enzimático com EDTA A) Imipenem e Imipenem + EDTA, Meropenem e Meropenem + EDTA e Aztreonam. B) Imipenem + EDTA e Imipenem
43
6 DISCUSSÃO
O estudo avaliou o perfil fenotípico de cepas de P. aeruginosa além de
caracteriza-la quanto à presença de dois dos principais mecanismos de resistência
apresentados por essa bactéria.
A maioria das amostras de P. aeruginosa estudadas foi isolada de espécimes
de secreções, em grande parte proveniente do trato respiratório inferior e de urina.
De um modo geral, estas são as fontes de isolamento mais frequentes, como
verificado pelos estudos de Freitas e Barth (2004), analisando amostras isoladas de
pacientes atendidos em hospitais de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, e por Santos
Filho e colaboradores (2002), com amostras de origem comunitária e hospitalar
isoladas em laboratórios clínicos da cidade de João Pessoa, na Paraíba.
A resistência intrínseca de P. aeruginosa aos antimicrobianos é bem
conhecida, mas a aquisição de novos mecanismos de resistência a antimicrobianos
anti-pseudomonas, como constatado na rotina laboratorial, é um grande desafio. A
alta mortalidade (48,1%) entre os pacientes com infecções por P. aeruginosa
resistente aos carbapenêmicos pode ser reflexo da falta de opções de terapias
antimicrobianas (ZAVASCKI et al.,2005).
No presente estudo, todas as amostras isoladas foram avaliadas quanto à
susceptibilidade aos antimicrobianos utilizando o teste de difusão em ágar. Entre os
antibióticos testados, a Ciprofloxacina, Ofloxacina e Norfloxacina apresentaram as
maiores taxas de resistência. Esses resultados apontam um alto índice de
resistência a essa classe de antimicrobianos, e corroboram com estudos ao redor do
mundo que apontam um crescimento da resistência as fluoroquinolonas. Um estudo
prospectivo de quatro anos realizado por Omigie e colaboradores (2009) procurou
determinar a incidência e taxa de desenvolvimento de resistência às
fluoroquinolonas de patógenos comuns responsáveis por infecções do trato urinário
na Nigéria. Os resultados evidenciaram elevada resistência às quinolonas entre
estirpes de P. aeruginosa (43,4%), E. coli (26,3%), e Proteus spp. (17,1%). Durante
os quatro anos do estudo, observou-se um aumento da resistência a estes
antimicrobianos em P. aeruginosa (14,2%), Proteus spp. (8,8%) e E. coli (9.7%).
Atualmente dois mecanismos diferentes são considerados principais
determinantes da resistência às Quinolonas: mutação da DNA
Girase/Topoisomerase IV, e alteração nos genes reguladores de bomba de
44
efluxo mexR e nfxB como os mecanismos mais comuns encontrados como
promotores da resistência a essa classe de antimicrobianos (HOOPER, 1999). Um
estudo realizado por Hu e colaboradores (2013) através da análise genômica de
espécies de Pseudomonas resistentes a ciprofloxacina, utilizando
pirosequenciamento 454, sugere que há três regiões no genoma da P. aeruginosa
com alto potencial de variabilidade associada à resistência a ciprofloxacina. Soma-
se a esses fatores, o uso em alta escala desses antimicrobianos no âmbito
hospitalar, gerando uma pressão seletiva, e predispondo ao desenvolvimento de
resistência a essa classe de antibióticos.
Os β-lactâmicos associados aos inibidores de beta-lactamase, Piperacilina-
Tazobactam e Ticarcilina-Ácido Clavulânico apresentaram taxas de resistência
também elevadas, em especial a ticarcilina associada ao clavulanato. Para
Piperacilina-Tazobactam, a taxa de resistência detectada nesse trabalho foi
semelhante à encontrada por Soares (27,8%) em 2005 e Almeida (25%) em 2012
entre amostras isoladas no Rio de Janeiro e no estado do Pará, respectivamente, e
ligeiramente inferior à detectada por Figueiredo et. al. (33,9%) em 2007. Para
ticarcilina-ácido clavulânico, a taxa de resistência detectada neste trabalho foi
semelhante à relatada por Soares (50,6%) em 2005. Porém bem inferiores à
detectada por Almeida (91,6%), no ano de 2012, em 12 isolados de origem
hospitalar em Belém do Pará.
Um estudo retrospectivo, conduzido na China por Xu e colaboradores,
realizado entre os anos de 2003 a 2011, demonstrou associação entre o uso de
antimicrobianos e o desenvolvimento de resistência ao longo desse período. O
estudo mostrou um aumento significativo, nas taxas de resistência de P. aeruginosa
a Ticarcilina-ácido clavulânico de 18% e piperacilina-tazobactam de 36,2% no
período de 2003 a 2011 (XU et. al., 2013).
Os resultados discrepantes apresentados na classe dos β-lactâmicos
associados aos inibidores de beta-lactamase, pode ser justificada pela melhor
eficiência do tazobactam como inibidor de beta-lactamases em Gram-negativos, em
relação ao clavulanato. Além disso, Beta-lactamases do tipo AmpC são enzimas que
não sofrem a ação dos inibidores de beta-lactamases, especialmente ácido
clavulânico, e seus genes são de origem cromossomal, no entanto podem
45
apresentar superexpressão induzível aumentando até cerca de 1000 vezes sua
expressão quando na presença de antibióticos (MELETIS,BAGKERI, 2013).
As taxas de resistência a ceftazidima e cefepime foram superiores às
encontradas por Soares (2005) (31,9% e 33,3%, respectivamente) no Rio de
Janeiro, e Carvalho (2004) (22,9% e 26,2%) em São Luís do Maranhão. Por outro
lado, um estudo realizado no Recife/PE por Figueiredo et al., em 2007 mostraram
taxas de resistência superiores (70% e 51,4%, respectivamente) às detectadas
nesse estudo.
Esses resultados apontam um alto índice de resistência em uma classe de
antimicrobianos que não é considerada uma droga de primeira escolha, e segue
recomendação de restrição no seu uso como medida de prevenção da disseminação
de P. aeruginosa produtoras de metallo-beta lactamases (FIQUEIREDO et al.,
2007). Fatores como a utilização inadequada dessa classe de antimicrobianos
podem levar ao aumento de resistência por P. aeruginosa.
Além disso, foi observada resistência à ceftazidima com sensibilidade à
cefepime, o que pode, ao menos em parte, ser atribuído à produção de AmpC cuja
ação é mais efetiva sobre a ceftazidima (LIVERMORE, 1995). Estas discrepâncias
mostram que os resultados de resistência ou sensibilidade encontrados “in vitro”
para uma destas cefalosporinas não podem ser extrapolados para a outra, sendo,
portanto, necessário avaliar a susceptibilidade de ambos antimicrobianos. Outros
mecanismos associados como a super expressão de bombas de efluxo e produção
de enzimas como as MBL, também podem ser determinantes de resistência nessa
classe de antimicrobianos (HONG et al., 2013).
Em relação ao meropenem e imipenem, as taxas de resistência encontradas
neste estudo foram semelhantes à detectada por Figueiredo e colaboradores (41,8%
e 42,3%, respectivamente) em 2007, e Jacome (37,7% e 36%, respectivamente) em
2012, porém superiores às encontradas por Pires e colaboradores (20,7% e 18,2%)
em 2009.
Carbapenêmicos são drogas de última escolha para tratamento de infecções
de P. aeruginosa, entretanto, devido ao uso indiscriminado desses antimicrobianos,
há várias descrições de resistência a essas drogas em hospitais. Um estudo
multicêntrico na América Latina observou diminuição da sensibilidade ao
46
meropenem em 53,8%, 46,7%, 33,3%, e 28,8% dos isolados da Argentina, Brasil,
Chile, e México, respectivamente (GALES et al., 2012).
P. aeruginosa pode adquirir resistência aos carbapenêmicos pela produção
de carbapenemases, principalmente metallo-beta-lactamases e AmpC, que são
bastante comuns nessa espécie bacteriana (LISTER et al., 2009). Além disso, outros
mecanismos também podem estar envolvidos na resistência a essa classe de
antimicrobianos, como a perda de porinas, OprD, ou super expressão de bombas de
efluxo (FERNANDEZ;HANCOCK, 2012).
Para o Aztreonam, obtivemos taxa de resistência de 38,9%, valor superior ao
descrito por Soares (27,8%) em 2005, Pires et. al., (25,6%) em 2009 e Jacome
(29,5%) em 2012. Por outro lado, outros autores reportam taxas de resistências em
concordância com nosso estudo, podemos citar o estudo de Carvalho (37,9%) em
2004 e Figueiredo e colaboradores (40,2%) em 2007.
Um dos principais mecanismos de resistência ao monobactâmico Aztreonam
é a produção da cefalosporinase AmpC, outros mecanismos associados são,
provavelmente, a hiper expressão de bombas de efluxo, combinado com o baixo
número de porinas e a presença de poros muito pequenos, impedindo a passagem
da droga para o interior da membrana (GALES et al.,2003).
O perfil de resistência a amicacina, dos isolados avaliados, foi de (28,3%),
demonstrando ser o antibiótico mais efetivo contra P. aeruginosa além da Polimixina
B, que destacaremos mais adiante. Esse resultado é semelhante aos dados obtidos
por Soares (2005) (32,1%) entretanto foram inferiores as encontradas por Pires et.
al. (2009) (40,6%) e Figueiredo e colaboradores (2007) (44%). Na América do Norte,
Hoban e colaboradores (2003) constataram que o antimicrobiano mais susceptível
para a P. aeruginosa em seus estudos foi a amicacina com 93,7% de sensibilidade.
Em relação à Tobramicina, a taxa de resistência foi de 36,2%, esse resultado está
em concordância com estudos de Pires et. al. (2009) (38,9%) e Almeida (2012)
(41,6%), mas superior à encontrada por Casal et. al. (2012) (4,58%), na Espanha e
Bosso et al., (2013) (10%) nos EUA.
Dentre os aminoglicosídeos, a amicacina é mais utilizada para infecções
causadas por essa bactéria, porque, como foi observado, os isolado de P.
aeruginosa que apresentaram resistência à amicacina exibem altos índices de
resistência a outros aminoglicosídeos como a tobramicina (TORRES et al., 2000).
47
A resistência a aminoglicosídeos em P. aeruginosa está relacionada
principalmente a inativação enzimática da molécula do antibiótico devido à produção
de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos, a nucleotidiltransferase,
fosfotransferase e acetiltransferases. Outros mecanismos também estão
relacionados com a resistência a essa classe de antimicrobianos, são esses a
redução da permeabilidade da membrana através diminuição de porinas na
membrana da célula bacteriana, e modificação do sítio de ligação no ribossomo
(POOLE, 2005).
Todos os isolados deste estudo foram susceptíveis a polimixina B, assim
como relatado em outros estudos (GALES et al.,2002; LOUREIRO et al.,2002), e,
por esta razão, as polimixinas podem ser uma alternativa no tratamento contra P.
aeruginosa multirresistentes, embora esses compostos sejam consideravelmente
tóxicos.
P. aeruginosa pode causar um grande número de falhas terapêuticas, e
representa um desafio clínico significativo se esses mecanismos de resistência
permanecem despercebidos. Portanto, a identificação precoce das infecções
causadas por estes microrganismos é necessária para que o tratamento adequado
possa reduzir a propagação destas cepas resistentes, bem como reduzir a
mortalidade em pacientes hospitalizados. Isto enfatiza a necessidade de vigilância
de isolados que produzem estas enzimas para evitar falhas terapêuticas e de surtos
nosocomiais (KUMAR et al., 2012).
O estudo evidenciou elevada taxa de produção de beta-lactamase da classe
C de Ambler, AmpC (40,7%), corroborando estudos de outros autores (DUNNE E
HARDIN, 2005; PARVEEN et al.,2010; KUMAR et. al., 2012). As beta-lactamases do
tipo AmpC são cefalosporinases que são mal inibidas pelo ácido clavulânico. Elas
podem ser diferenciadas de outras ESBLs pela sua capacidade de hidrolisar
cefamicinas (cefoxitina, cefotetan), bem como outras cefalosporinas de amplo
espectro (JACOBY, 2009). Embora as orientações atuais do CLSI não descrevam
qualquer método para a detecção de isolados que produzem beta-lactamases
AmpC, optou-se por seguir o método de disco aproximação
(Imipenem/Ceftazidima/Piperacilna-Tazobactam) para detectar beta-lactamases
AmpC.
48
Um estudo realizado por Dunne e colaboradores em 2005, avaliou a produção
de AmpC em 200 amostras que incluíram
Enterobacter spp., Serratia spp., Citrobacter spp., e Pseudomonas aeruginosa
usando uma variedade de combinações de antibióticos indutor/substrato,
semelhante ao realizado no estudo. As combinações examinadas incluíram
cefoxitina-piperacilina, imipenem-cefotaxima, imipenem-ceftazidima, imipenem-
piperacilina-tazobactam, e imipenem-cefoxitina. No total, 85,5% dos isolados
mostraram-se indutível para a produção de AMPc, por um ou mais combinações de
indutores/substrato e 11% de todos os isolados foram estavelmente desreprimida
para a expressão de AmpC. De todas as combinações, o imipenem/piperacilina-
tazobactam e imipenem/ceftazidima forneceram maior sensibilidade (100%) em P.
aeruginosa, demonstrando ser um excelente método para detecção fenotípica da
produção de AmpC nessa espécie bacteriana.
A propagação global de bacilos Gram-negativos produtores de
carbapenemases, como as metallo-β-lactamase, na última década é uma séria
ameaça à saúde pública, e limitadas opções de tratamento estão disponíveis para
tais infecções (PATEL; RASHEED; KITCHEL, 2009). A prevalência de MBLs,
entre P. aeruginosa, é elevada em todo o mundo e é um problema significativo, que
limita as opções terapêuticas para o tratamento de pacientes (MALTEZOU, 2009). A
detecção rápida e precisa de mecanismos de resistência é essencial para
determinar as medidas de terapia e controle de infecção antimicrobiana.
P. aeruginosa produtoras de MBL têm sido relatadas como importante causa
de infecções hospitalares. O aparecimento das MBL e sua disseminação entre
bactérias patogênicas são questões de grande importância no que diz respeito ao
futuro da terapêutica antimicrobiana (MARRA et al.,2006).
A frequência de 44% na produção de MBL detectada neste estudo é superior
às encontradas por Torres e colaboradores em Fortaleza (2003) de 9,4%, e
Pellegrino e colaboradores (2002) em amostras isoladas em hospitais do Rio de
Janeiro (18,5%), por Lee e colaboradores (2003) na Coréia (11,4%), por Lagatolla e
colaboradores (2004) na Itália (20%) e Scheffer (2008), no Paraná. Os resultados
apresentados no estudo são de extrema importância para que a Comissão de
Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) possa aplicar medidas e cuidados para evitar
a disseminação da resistência. A disseminação das linhagens de P. aeruginosa
49
produtoras de MBL no hospital exige atenção especial sendo importante observar se
os cuidados para a prevenção de infecção estão sendo tomados, como a lavagem
correta das mãos, uso de luvas esterilizadas e não-esterilizadas de maneira
adequada, aplicação e manutenção correta de cateteres, cuidados pré-, intra- e pós
operatórios e esterilização do instrumental hospitalar.
Em razão dos inúmeros relatos de bactérias produtoras de MBLs em
diferentes regiões do mundo, houve a necessidade de desenvolver testes simples,
práticos e de baixo custo, para tornar possível o rastreamento de bactérias
produtoras de MBLs nos laboratórios de rotina microbiológica. As MBLs necessitam
de íons divalentes, como o Zn++, que funcionam como co-fator para a reação de
hidrólise do b-lactâmico, portanto, estas enzimas podem ser identificadas por testes
fenotípicos com auxílio de agentes quelantes de zinco, como o EDTA. Entre as
metodologias possíveis, a técnica de disco-combinado vem se mostrando efetiva na
detecção de MBL, assim como demonstrado por Young e colaboradores em 2002
em amostras de P. aeruginosa, utilizando discos de imipenem + EDTA com 95,7%
de sensibilidade especificidade. Outro estudo realizado por Tsakris e colaboradores
em 2010, demonstrou 100% de sensibilidade e especificidade utilizando discos de
meropenem + EDTA.
É importante destacar que todas as amostras produtoras de MBL foram
isoladas em um período curto, de janeiro de 2013 a junho de 2014, em três
laboratórios avaliados, indicando possivelmente um evento de caráter pontual,
sendo necessário prosseguir com novas avaliações verificar tendência à
disseminação de estirpes com tal característica.
Estudos nacionais (SADER et al., 2001; FREITAS;BARTH, 2004; LOUREIRO
et al., 2002; PELLEGRINO et al., 2002) e internacionais (FLUIT et al., 2001; MATHAI
et al., 2001; PFALLER et al., 2001) têm demonstrado isolados de P. aeruginosa com
elevadas taxas de resistência aos antimicrobianos e a emergência de alguns
multirresistentes. Entretanto, no estudo, foi observada uma taxa de 9,7% de
resistência simultânea a 12 dos 13 antimicrobianos testados. Outros estudos
encontraram taxas menores ou semelhantes de resistência simultânea, 3,2% em
Hospitais de Porto Alegre (FREITAS; BARTH, 2004) e de 10% em Hospitais da
Grécia (TASSIOS et al., 1998), enquanto Pellegrino e colaboradores (2002)
50
detectaram um elevado percentual de resistência simultânea em 5 hospitais do Rio
de Janeiro (40%).
A alta resistência simultânea aos antibióticos testados aponta um perfil de
multirresistência e limita as opções terapêuticas elevando as taxas de
morbimortalidades em hospitais. P. aeruginosa possui resistência intrínseca a várias
classes de antimicrobianos, aliado a isso, vários mecanismos de resistência já foram
descritos como a super expressão de bombas de efluxo, produção de enzimas
inativadoras de antibióticos, diminuição de porinas, além de vários fatores de
virulência como produção de biofilmes, liberação de exotoxinas e produção de
piocianina, dentre outros fatores que dificultam a terapia antimicrobiana.
A utilização indiscriminada ou inadequada de antimicrobianos parece
favorecer a seleção de microrganismos multirresistentes (ALOUSH et al., 2006).
Dados da literatura descrevem relação significativa entre utilização prévia de
antimicrobianos e desenvolvimento de multirresistência (LODISE et al., 2007a). A
exemplo disto, Paramythiotou et al. (2004) relataram uso prévio de drogas
antipseudomonas como importante fator de risco para o desenvolvimento de cepas
multirresistentes.
No estudo, apenas a polimixina B manteve-se ativa contra todos os isolados
resistentes aos carbapenêmicos. Vários estudos descrevem esta droga como única
opção terapêutica para alguns isolados multirresistentes (GALES et al.,2003;
SADER et al.,2005; ZAVASCKI et al.,2005). Entretanto, o aumento da descrição de
amostras resistentes à polimixina B é proporcional ao aumento da sua utilização na
rotina, principalmente em UTIs (LANDMAN et al.,2005).
Vale salientar ainda que P. aeruginosa possui resistência intrínseca a vários
antibióticos além da habilidade de adquirir novos genes de resistência, como os que
conferem para as MBLs, assim como possuem constitutivamente beta-lactamases
do tipo AmpC, características essas que tornam as infecções causadas por essas
bactérias praticamente intratáveis. Além disso, P. aeruginosa são bactérias que
geralmente causam infecção oportunista, em pacientes que já possuem a saúde
debilitada sendo, desta maneira, muito importante conhecer quais beta-lactamases
estão presentes no hospital.
Os resultados obtidos revelaram um perfil de resistência em P. aeruginosa,
bem como dois dos principais mecanismos de resistência associados a esse
51
microrganismo. É sabido que essa bactéria é o principal não-fermentador
responsável por infecção hospitalar, e que adapta-se rapidamente a condições
ambientais diversas (HILL; HENRY; SPEERT, 2007). Com isso, estudos dessa
natureza tornam-se cada vez mais importantes para identificar mecanismos de
resistência disseminados no hospital, para que assim possam ser implantadas
medidas de vigilância mais adequadas para conter a disseminação destas bactérias.
52
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
As cepas de P. aeruginosa avaliadas nesse trabalho mostraram que esse
microrganismo é mais frequentemente encontrado em isolados de secreção e de
urina. O padrão fenotípico de resistência das amostras analisadas mostrou altas
taxas de resistência, principalmente a fluoroquinolonas, seguida por beta-lactâmicos
associados aos inibidores de β-lactamases, cefalosporinas e carbapenêmicos.
Também foi observada uma alta frequência na detecção de enzimas do tipo AmpC e
metallo-β-lactamases, resultado esse que chama a atenção, visto que esses
mecanismos de resistência inviabilizam diversas terapias antimicrobianos e
dificultam o tratamento de infecções causadas por esse patógeno.
A partir dos dados obtidos conclui-se que, muito embora a compreensão sobre
P. aeruginosa ao longo do tempo tenha avançado, esta bactéria continua a ser um
flagelo em hospitais, causando infecções virulentas e devido a sua capacidade de
desenvolver resistência as mais variadas classes de antimicrobianos, torna-se muito
difícil o tratamento de pacientes acometidos.
Os resultados evidenciam a importância da detecção de mecanismos de
resistência como a produção de beta-lactamases, assim como o estabelecimento de
critérios para utilização de antibióticos a fim de minimizar os riscos de
desenvolvimento de resistência.
Trata-se de um estudo pioneiro no Estado do Rio Grande do Norte que de
certa forma servirá como base para estudos mais aprofundados no que refere à
resistência a antimicrobianos em espécies de P. aeruginosa. A identificação precoce
de patógenos e a análise da resistência de microrganismos aos antimicrobianos
constituem importante ferramenta para auxiliar os clínicos no tratamento de infecções.
Dessa forma, conhecer o perfil de susceptibilidade aos antibióticos de P. aeruginosa
pode nortear a escolha de terapia empírica. Além disso, o conhecimento dos
mecanismos de resistência deste agente, presentes em cada instituição é de extrema
importância para conter a disseminação de microrganismos multirresistentes reduzindo
morbi-mortalidade de pacientes internados em nossos hospitais.
53
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ARTIGO
Título do Artigo: Perfil de Resistência de Cepas de Pseudomonas
aeruginosa em três Centros de Saúde do Estado do RN
*Jenielly N. F¹. Castro, Renato M. Neto¹
1 Laboratório de Micobactérias, Departamento de Microbiologia e Parasitologia,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal 59072-970, RN-Brasil
* Autor correspondente: Jenielly de Noronha Ferreira de Castro
Tel.: +55 84 99932-5910
E-mail: [email protected]
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Resumo
No presente estudo avaliou-se o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos
em isolados de P. aeruginosa provenientes de três grandes centros de
referência do Estado do Rio Grande do Norte. A espécie de P. aeruginosa foi
identificada inicialmente nos laboratórios de origem e confirmada, através de
testes fenotípicos, no Laboratório de Micobactérias (LABMIC) da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte - UFRN. A determinação da susceptibilidade
aos antimicrobianos deu-se através do Teste de Disco Difusão. Do total de 113
isolados 67,2% (n = 76) apresentaram perfil de resistência a, pelo menos, uma
classe de antimicrobianos. Todas as cepas de P. aeruginosa foram
susceptíveis a Polimixina B. As maiores taxas de resistência foram verificadas
frente à Ofloxacina (57,5%), Ciprofloxacina (55,7%), Norfloxacina (55,7%),
Ticarcilina-ácido clavulânico (43,3%), Ceftazidima (41,5%). Quarentas e seis
isolados (40,7%) apresentaram resultados fenotípicos positivos para produção
de β-Lactamases do tipo AmpC. Vinte e um isolados apresentaram teste
fenotípico positivo para produção de metallo-β-lactamase, através do teste de
bloqueio enzimático com discos combinados com EDTA, sendo
presuntivamente consideradas produtoras de MBL. Os dados obtidos,
demonstram elevada produção de β-lactamases do tipo ampC e Metallo-β-
lactamases. Também foi observada elevada taxa de resistência a
antimicrobianos, especialmente em quinolonas e carbapenêmicos. Este
estudo confirma que a identificação precoce de patógenos e a análise da
resistência de microrganismos aos antimicrobianos constituem importante
ferramenta para auxiliar os clínicos no tratamento de infecções.
Palavras-Chave: Pseudomonas aeruginosa. Resistência. MBL. AmpC.
74
INTRODUÇÃO
Os Bacilos Gram Negativos não Fermentadores (BGNNF) de carboidratos
são organismos versáteis, apresentam baixa necessidade nutricional e boa
tolerância a uma série de condições físicas adversas, devido a sua resistência
intrínseca a desinfetantes, degermantes e múltiplas classes de antimicrobianos,
além da resistência adquirida devido a mutações cromossômicas e aquisição
de genes de resistência (POOLE, 2011).
Considerados organismos oportunistas, raramente estão associados a
infecções comunitárias em indivíduos saudáveis, porém apresentam alta
prevalência de envolvimento em indivíduos imunossuprimidos, principalmente
em ambiente hospitalar (ROSAY et al., 2015). Dentre as espécies de BGNNF,
a Pseudomonas aeruginosa configura-se como a mais prevalente em isolados
clínicos de natureza hospitalar.
As infecções causadas por P. aeruginosa podem variar desde infecções
superficiais de pele a septicemia grave, podendo causar infecção aguda pela
produção de toxinas e infecção crônica pela ação da camada espessa que
consiste no seu biofilme, podendo resultar ainda no somatório dos tipos de
infecção pela ação concomitante destes componentes. São bactérias dotadas
de mecanismos de virulência extremamente complexos (produção de
leucocidinas, alginato, fosfolipases, etc.) que contribuem de forma positiva para
um aumento crescente do número de agravos infecciosos principalmente no
ambiente hospitalar (PIER et al., 2005).
Considerando a gravidade das infecções causadas por P. aeruginosa e da
limitação de antimicrobianos disponíveis para eliminá-las, determinar o perfil de
resistência dessa bactéria poderá contribuir para direcionar de forma adequada
o uso de antimicrobianos.
Na região Nordeste do Brasil, estudos sobre resistência bacteriana em
BGNNF são escassos e não se conhece quais formas de resistência são mais
frequentes em P. aeruginosa. No estado do Rio Grande do Norte essa
limitação é ainda maior, com poucos estudos relacionados a esse patógeno,
seus mecanismos de resistência, bem como a disseminação destes
mecanismos. Trata-se de um estudo inédito a ser realizado no estado do RN, o
75
qual serve como base, e evidencia a importância de conhecer presença de P.
aeruginosa com padrões de resistência a fim de auxiliar a pratica clínica e de
controlar a transmissão desta resistência no estado do Rio Grande do Norte.
O objetivo desse trabalho foi avaliar o perfil de resistência a antimicrobianos e
produção de β-lactamases do tipo AmpC e Metallo-β-Lactamase de
Pseudomonas aeruginosa, em três centros de referência localizados na cidade
do Natal/RN
76
MATERIAIS E MÉTODOS
Trata-se de um estudo exploratório e descritivo, de abordagem quantitativa.
Neste estudo foram avaliados 113 isolados de P. aeruginosa. Todos os
isolados de P. aeruginosa utilizados nesse estudo foram provenientes de
Centro de saúde, sendo previamente identificados de material clínico e
encaminhados dos Laboratórios Dr. Almino Fernandes (LACEN-RN),
Laboratório de Análises Clínicas do HUOL e Laboratório de Análise Clínicas do
Hospital Giselda Trigueiro (HGT) ao Laboratório de Micobactérias (LABMIC),
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN. O critério de inclusão
utilizado nesse estudo foram a espécies bacterianas de P. aeruginosa.
O estudo não se enquadra no que normatiza a resolução 196-CNS. Não
necessitando ser revisada por um comitê de ética em pesquisa.
As análises foram realizadas entre o período de Janeiro de 2013 a Junho
de 2014 no Laboratório de Micobactérias (LABMIC) da UFRN.
As amostras de Pseudomonas aeruginosa avaliadas neste estudo foram
identificadas, inicialmente, nos laboratórios de origem. A partir da verificação da
pureza das culturas foram feitas, em todas as amostras, testes confirmatórios
de sua identificação no LABMIC. Os testes fenotípicos usuais utilizados na
identificação de BGNNF incluíram: prova da oxidase, metabolismo OF-glicose,
motilidade, produção de pigmento, descarboxilação dos aminoácidos lisina,
arginina e ornitina, prova do indol, hidrólise da uréia, redução do nitrato,
hidrólise da esculina, crescimento em Caldo NaCl 6,5%, crescimento a 42°C e
utilização do citrato. Estes testes foram executados seguindo as
recomendações de Koneman et al., (1997)
As espécies foram repicadas para Ágar MacConkey (HIMEDIA,
Pennsylvania, EUA) e incubadas por 18h a 35ºC em estufa bacteriológica. Para
cada cepa foi realizado teste confirmatório do padrão fenotípico de
multirresistência segundo recomendações do CLSI 2013.
A Cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 foi utilizada como controle dos
meios de cultura.
Após a confirmação da espécie P. aeruginosa através das provas
bioquímicas, as amostras foram submetidas a Testes de Sensibilidade a
Antimicrobianos (TSA).
77
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizado, na ocasião do
isolamento das bactérias, no Laboratório de Micobactérias da UFRN, por disco
de difusão, seguindo as recomendações, vigentes na época do isolamento, do
Clinical and Laboratory Standard Institute 2013 (CLSI 2013). Para preparação
de uma suspensão bacteriana com turvação aproximada de 0,5 na escala de
McFarland (Dade Behring, MicroScan®Turbidity Meter) foi feita uma suspensão
de 2 a 5 colônias em solução de salina, e em seguida o semeio, em placas de
Ágar Muller-Hinton.
Após 10 minutos aplicaram-se os seguintes discos de antibióticos (13
discos por placa): Imipenem, Meropenem, Ticarcilina-Ácido Clavulânico,
Cefepime, Ceftazidima, Piperacilina-Tazobactam, Amicacina, Tobramicina,
Ciprofloxacina, Ofloxacina, Norfloxacina, Aztreonam e Polimixina B.
Após incubação da placa, a 37°C por 18 horas, foram mensurados os
diâmetros dos halos de inibição para cada antibiótico. Os resultados obtidos
foram interpretados de acordo com o CLSI 2013/2014.
Detecção fenotípica da produção de beta-lactamase do tipo AMPC
As amostras de P. aeruginosa foram submetidas à avaliação da produção
de AmpC por meio do método de disco aproximação (DUNNE ; HARDIN 2005)
com antibióticos isolados e combinados conforme desenho esquemático na
Figura 2. Em placas contendo meio de ágar Mueller-Hinton foram dispostos os
discos, sendo o Imipenem (10µg) utilizado como indutor, e Ceftazidima (30µ),
Piperacilina + Tazobactam (110/10µg), dispostos equidistantes de 20 a 25 mm
do indutor (distância medida de centro a centro). Depois de incubadas por 24 h
a 37°C, é caracterizado como teste positivo a presença de um antagonismo
entre o indutor e um dos substratos caracterizado pela forma de um D
(MARTINEZ, 2009).
78
Figura 6. Representação esquemática da disposição dos discos de antimicrobianos utilizados no teste fenotípico de detecção de AmpC
* PIT= Piperacilina + Tazobactam, CAZ= Ceftazidima, IMP= Imipenem.
Confirmação fenotípica da produção de Metalo-beta-lactamases (MBL)
As bactérias que se mostraram resistentes a pelo menos um dos
carbapenêmicos (Imipenem ou meropenem) foram submetidas ao teste
confirmatório de MBL pelo método de bloqueio enzimático. Em uma placa de
Ágar Mueller-Hinton HIMEDIA, Pennsylvania, EUA), seguindo a escala de
turbidez 0,5 McFarland (Dade Behring, MicroScan®Turbidity Meter), foi
semeada a cepa suspeita por toda a extensão da placa, conforme padronizado
pelo CLSI para realização do teste de sensibilidade aos antimicrobianos por
disco difusão (CLSI 2014). Em seguida, dois discos, um com Meropenem
(10µg) (OXOID) e outro com Imipenem (10µg) (OXOID), foram posicionados
paralelos a outros dois discos de Meropenem (10µg) (OXOID) e Imipenem
(10µg) (OXOID) ambos acrescidos de 10µL de EDTA (0,1M), seguindo
recomendações da Nota Técnica nº01/2013 da ANVISA. Os discos
combinados com EDTA foram preparados no dia do teste e aplicados nas
placas somente após sua secagem. Em amostras produtoras de MBL é
observado aumento do halo de inibição de crescimento da bactéria-teste na
79
região do ágar onde ocorreu a difusão do EDTA. Já em testes negativos, não
se espera alteração no halo de inibição de crescimento da bactéria testada.
Figura 7. Representação esquemática da disposição dos discos de antimicrobianos utilizados no teste
fenotípico de detecção de MBL.
*IMP – Imipenem, MPM – Meropenem
80
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Um total de 113 amostras de Pseudomonas aeruginosa foram
identificadas no LABMIC-UFRN. A caracterização fenotípica desses isolados,
obtida através da realização do TSA, permitiu avaliar a susceptibilidade aos
antibióticos de diferentes classes.
Mais da metade das amostras foi isolada de secreções 72 (63,7%), a
maioria proveniente do trato respiratório inferior. Seguida por amostras de urina
24 (21,2%) e, em menor proporção de sangue 7 (6,1%), ponta cateter 2 (1,7%),
líquidos de punção 2 (1,7%) e de outros espécimes variados 6 (5,3%).
No presente estudo, todas as amostras isoladas foram avaliadas quanto
à susceptibilidade aos antimicrobianos utilizando o teste de difusão em ágar.
Entre os antibióticos testados, Ofloxacina 57,5% (n= 65), Ciprofloxacina
55,7% (n = 63), Norfloxacina 55,7% (n=63) apresentaram as maiores taxas de
resistência. Esses resultados indicam um alto índice de resistência a essa
classe de antimicrobianos, e corroboram com estudos ao redor do mundo que
apontam um crescimento da resistência as fluoroquinolonas (OMIGIE et al.,
2009; HU et al., 2013).
Atualmente dois mecanismos diferentes são considerados principais
determinantes da resistência às Quinolonas: mutação da DNA
Girase/Topoisomerase IV, e alteração nos genes reguladores de bomba de
efluxo mexR e nfxB como os mecanismos mais comuns encontrados como
promotores da resistência a essa classe de antimicrobianos (ADABI et al.,
2015). Um estudo realizado por Hu e colaboradores (2013) através da análise
genômica de espécies de Pseudomonas resistentes a ciprofloxacina, utilizando
pirosequenciamento 454, sugere que há três regiões no genoma da P.
aeruginosa com alto potencial de variabilidade associada à resistência a
ciprofloxacina. Soma-se a esses fatores, o uso em alta escala desses
antimicrobianos no âmbito hospitalar, gerando uma pressão seletiva, e
predispondo ao desenvolvimento de resistência a essa classe de antibióticos.
Os β-lactâmicos associados aos inibidores de beta-lactamase,
Piperacilina-Tazobactam 28,3% (n= 32) e Ticarcilina-Ácido Clavulânico 43,3%
(n= 49) apresentaram taxas de resistência também elevadas, em especial a
ticarcilina associada ao clavulanato. Esse resultado pode ser justificado pela
81
melhor eficiência do tazobactam como inibidor de beta-lactamases em Gram-
negativos, em relação ao clavulanato. Além disso, Beta-lactamases do tipo
AmpC são enzimas que não sofrem a ação dos inibidores de beta-lactamases,
especialmente ácido clavulânico, e seus genes são de origem cromossomal, no
entanto podem apresentar superexpressão induzível aumentando até cerca de
1000 vezes sua expressão quando na presença de antibióticos
(MELETIS,BAGKERI, 2013).
As cefalosporinas Ceftazidima 41,5% (n= 47), e Cefepime 44% (n= 38,9)
também demonstraram alta taxa de resistência. Esses resultados apontam um
alto índice de resistência em uma classe de antimicrobianos que não é
considerada uma droga de primeira escolha, e segue recomendação de
restrição no seu uso como medida de prevenção da disseminação de P.
aeruginosa produtoras de metallo-beta lactamases (FIQUEIREDO et al., 2007).
Fatores como a utilização inadequada dessa classe de antimicrobianos podem
levar ao aumento de resistência por P. aeruginosa. Outros mecanismos
associados como a super expressão de bombas de efluxo e produção de
enzimas como as MBL e AmpC, também podem ser determinantes de
resistência nessa classe de antimicrobianos (HONG et al., 2013).
Em relação ao carbapenêmicos, as taxas de resistência encontradas neste
estudo foram de 39,8% (n = 45) para o Meropenem e 36,2% (n= 41) para o
Imipenem. P. aeruginosa pode adquirir resistência aos carbapenêmicos pela
produção de carbapenemases, principalmente metallo-beta-lactamases e
AmpC, que são bastante comuns nessa espécie bacteriana. Além disso, outros
mecanismos também podem estar envolvidos na resistência a essa classe de
antimicrobianos, como a perda de porinas, OprD, ou super expressão de
bombas de efluxo (FERNANDEZ;HANCOCK, 2012). Carbapenêmicos são
drogas de última escolha para tratamento de infecções de P. aeruginosa,
entretanto, devido ao uso indiscriminado desses antimicrobianos, há várias
descrições de resistência a essas drogas em hospitais. Um estudo
multicêntrico na América Latina observou diminuição da sensibilidade ao
meropenem em 53,8%, 46,7%, 33,3%, e 28,8% dos isolados da Argentina,
Brasil, Chile, e México, respectivamente (GALES et al., 2012).
Para o Aztreonam, obtivemos taxa de resistência de 38,9% (n=44). Um dos
principais mecanismos de resistência ao monobactâmico Aztreonam é a
82
produção da cefalosporinase AmpC, outros mecanismos associados são,
provavelmente, a hiper expressão de bombas de efluxo, combinado com o
baixo número de porinas e a presença de poros muito pequenos, impedindo a
passagem da droga para o interior da membrana (RUPPE et al., 2015).
O aminoglicosídeo amicacina apresentou a menor taxa de resistência
nesse estudo 28,3% (n=32), já em relação à Tobramicina, a taxa de resistência
nesse estudo foi de 36,2% (n=41). Observa-se uma elevada resistência a essa
classe de drogas, em especial a amicacina, que apesar de demonstrar o menor
percentual de resistência entre os antibióticos testados, ainda é considerada
elevada, principalmente se tratando de um fármaco que por anos é apontado
como um dos antibióticos com boa eficácia contra P. aeruginosa. Entretanto,
uma análise univariada realizado por Trigueros e colaboradores (2015) aponta
a exposição prévia à amicacina (<3 dias), está relacionada a aquisição de
resistência piperacilina-tazobactam, fluroroquinolonas e múltiplas drogas.
A resistência a aminoglicosídeos em P. aeruginosa está relacionada
principalmente a inativação enzimática da molécula do antibiótico devido à
produção de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos, a
nucleotidiltransferase, fosfotransferase e acetiltransferases. Outros
mecanismos também estão relacionados com a resistência a essa classe de
antimicrobianos, são esses a redução da permeabilidade da membrana através
diminuição de porinas na membrana da célula bacteriana, e modificação do
sítio de ligação no ribossomo (RUPPE et al., 2015).
Todos os isolados deste estudo foram susceptíveis a polimixina B e, por
esta razão, as polimixinas podem ser uma alternativa no tratamento contra P.
aeruginosa multirresistentes, embora esses compostos sejam
consideravelmente tóxicos.
O presente estudo evidenciou elevada taxa de produção de beta-
lactamase da classe C de Ambler, AmpC (40,7%). As beta-lactamases do tipo
AmpC são cefalosporinases que são mal inibidas pelo ácido clavulânico. Elas
podem ser diferenciadas de outras ESBLs pela sua capacidade de hidrolisar
cefamicinas (cefoxitina, cefotetan), bem como outras cefalosporinas de amplo
espectro (TIAN et al, 2011). Essa alta taxa de produção de AmpC pode ser o
fator determinante da elevada resistência aos antimicrobianos apresentados
83
nesse estudo, em especial cefalosporinas, penicilinas associadas a inibidores
de beta-lactamases e monobactâmicos.
Embora as orientações atuais do CLSI não descrevam qualquer método
para a detecção de isolados que produzem beta-lactamases AmpC, seguimos
o método de disco aproximação (Imipenem/Ceftazidima/Piperacilna-
Tazobactam) para detectar beta-lactamases AmpC e obtivemos resultados
satisfatórios neste estudo.
Cinquenta amostras (44%) apresentaram resistência a, pelo menos, um
dos carbapenêmicos, e estas foram submetidas ao teste de detecção fenotípica
para produção de MBL. Das 50 amostras com resistência a carbapenêmicos,
21 (42%) apresentaram teste fenotípico positivo para produção de metallo β-
lactamase a partir do teste de bloqueio enzimático, sendo presuntivamente
consideradas produtoras de MBL. Os resultados apresentados no presente
estudo são de extrema importância para que a Comissão de Controle de
Infecção Hospitalar (CCIH) possa aplicar medidas e cuidados para evitar a
disseminação da resistência. A disseminação das linhagens de P. aeruginosa
produtoras de MBL no hospital exige atenção especial sendo importante
observar se os cuidados para a prevenção de infecção estão sendo tomados,
como a lavagem correta das mãos, uso de luvas esterilizadas e não-
esterilizadas de maneira adequada, aplicação e manutenção correta de
cateteres, cuidados pré-, intra- e pós operatórios e esterilização do instrumental
hospitalar
84
CONCLUSÃO
As cepas de P. aeruginosa avaliadas nesse trabalho mostraram que esse
microrganismo é mais frequentemente encontrado em isolados de secreção e
de urina. O padrão fenotípico de resistência das amostras analisadas mostrou
altas taxas de resistência, principalmente a fluoroquinolonas, seguida por beta-
lactâmicos associados aos inibidores de β-lactamases, cefalosporinas e
carbapenêmicos. Também foi observada uma alta frequência na detecção de
enzimas do tipo AmpC e metallo-β-lactamases, resultado esse que chama a
atenção, visto que esses mecanismos de resistência inviabilizam diversas
terapias antimicrobianos e dificultam o tratamento de infecções causadas por
esse patógeno.
Os resultados apresentados nesse estudo evidenciam a importância da
detecção de mecanismos de resistência como a produção de beta-lactamases,
assim como o estabelecimento de critérios para utilização de antibióticos a fim
de minimizar os riscos de desenvolvimento de resistência.
Nosso estudo é pioneiro no Estado do Rio Grande do Norte e servirá
como base para estudos mais aprofundados no que refere à resistência a
antimicrobianos em espécies de P. aeruginosa. A identificação precoce de
patógenos e a análise da resistência de microrganismos aos antimicrobianos
constituem importante ferramenta para auxiliar os clínicos no tratamento de
infecções. Dessa forma, conhecer o perfil de susceptibilidade aos antibióticos
de P. aeruginosa pode nortear a escolha de terapia empírica. Além disso, o
conhecimento dos mecanismos de resistência deste agente, presentes em
cada instituição é de extrema importância para conter a disseminação de
microrganismos multirresistentes reduzindo morbi-mortalidade de pacientes
internados em nossos hospitais.
85
REFERÊNCIAS
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86
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Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother.[S.I.]. 55: 2710-
2713. 2011.
87
ANEXOS
Anexo I - Descrição dos meios de cultura empregados na identificação de
Pseudomonas aeruginosa.
Ágar Citrato Simmons
Princípio: Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como
única fonte de carbono, juntamente com sais de amônia, alcalinizando o meio.
Utilidade: Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não
fermentadores.
Base para Oxidação e Fermentação - OF
Princípio: Verificar a capacidade do microrganismo em utilizar os carboidratos
pela via oxidativa ou fermentativa.
Utilidade: Diferenciar bacilos Gram negativos quanto ao tipo de metabolismo
empregado em utilizar carboidratos.
Caldo Base de Moeller (Aminoácidos)
Princípio: As descarboxilases são um grupo de enzimas com substrato
específico, capazes de reagir com o grupo carboxila dos aminoácidos para
formarem aminas alcalinas.
Utilidade: Verificar a capacidade de microrganismos usarem enzimas,
auxiliando na identificação. Utilizado principalmente para identificações de
enterobactérias, bacilos Gram negativos não fermentadores, estafilococos.
88
Provas para Crescimento a 42°C
Princípio: Verificar a capacidade do microrganismo crescer em altas
temperaturas.
Utilidade: Identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores.
Prova de tolerância ao NaCl 6,5%
Princípio: A tolerância ao NaCl a 6,5% é uma prova utilizada para verificar a
capacidade de alguns microrganismos crescerem em presença do sal.
Utilidade: Na identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores.
Teste de motilidade
Princípio: A bactéria é móvel através do seu flagelo. Flagelos ocorrem nos
bacilos Gram negativos, poucas formas de cocos são móveis.
Utilidade: Determinar se o microrganismo é o não móvel;
Ágar TSI – Triplo Açúcar Ferro
Princípio: Este meio contém três açúcares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0%
sacarose, vermelho de fenol para detecção da fermentação de carboidratos e
sulfato de ferro para detecção da produção de sulfato de hidrogênio (indicado
pela cor preta na base do tubo).
89
Utilidade: Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentação de
carboidratos, produção de sulfato
de hidrogênio e gás.
Prova de Gelatinase
Princípio: Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas
proteolíticas (gelatinases) que liquefaz/hidrolisa gelatina.
Utilidade: Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e
bacilos Gram positivos esporulados.
90
ANEXO II- Isolamento e identificação de P. aeruginosa
