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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
TALITA JUNIA SILVA CANDIDO
“FATORES DE VIRULÊNCIA E SUBTIPAGEM DE
Staphylococcus aureus ISOLADOS DE LATICÍNIOS
ORGÂNICOS E CONVENCIONAIS NO ESTADO DE SÃO
PAULO”
CAMPINAS
2018
TALITA JUNIA SILVA CANDIDO
“FATORES DE VIRULÊNCIA E SUBTIPAGEM DE
Staphylococcus aureus ISOLADOS DE LATICÍNIOS
ORGÂNICOS E CONVENCIONAIS NO ESTADO DE SÃO
PAULO”
Dissertação apresentada à Faculdade de
Engenharia de Alimentos da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de
mestra em Ciência de alimentos
Orientador: Profa. Dra. Nathália Cristina Cirone Silva
Este exemplar corresponde à versão final da
dissertação defendida pela aluna Talita Junia Silva
Candido e orientada pela Profa. Dra. Nathália Cristina
Cirone Silva
CAMPINAS
2018
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES, 33003017027P1
Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de AlimentosClaudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Candido, Talita Junia Silva, 1992- C161f CanFatores de virulência e subtipagem de Staphylococcus aureus isolados de
laticínios orgânicos e convencionais no estado de São Paulo / Talita Junia SilvaCandido. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
CanOrientador: Nathália Cristina Cirone da Silva. CanDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade
de Engenharia de Alimentos.
Can1. Staphylococcus aureus. 2. Queijo Minas Frescal. 3. Enterotoxinas. 4.
spa-typing. 5. Subtipagem molecular. I. Silva, Nathália Cristina Cirone da. II.Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos.III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Virulence factor and subtyping of Staphylococcus aureus isolatedfrom organic and conventional dairy in the state of São Paulo, BrazilPalavras-chave em inglês:Staphylococcus aureusMinas Frescal CheeseEnterotoxinsspa-typingMolecular subtypingÁrea de concentração: Ciência de AlimentosTitulação: Mestra em Ciência de AlimentosBanca examinadora:Nathália Cristina Cirone da Silva [Orientador]Liliana de Oliveira RochaMarjory Xavier RodriguesData de defesa: 03-05-2018Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Nathália Cristina Cirone Silva Departamento de Ciência de Alimentos FEA/UNICAMP - Orientadora
Profa. Dra. Liliana de Oliveira Rocha Departamento de Ciência de Alimentos FEA/UNICAMP – Membro Titular
Prof. Dra. Marjory Xavier Rodrigues Department of Population Medicine and Diagnostic Science,/Cornell University – Membro
Titular
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida
acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, pela minha vida, pela sabedoria concebida e a oportunidade
de chegar até aqui. Principalmente por estar sempre comigo em todos os momentos mesmo
quando achava que estava sozinha, quando pensava que o caminho estava difícil demais pra
seguir, Ele sempre esteve ao meu lado e me mostrou o caminho.
A minha Mãe, minha fortaleza por não medir esforços para me ajudar a realizar as minhas
conquistas, só nós sabemos o que passamos e como nos tornamos mais fortes por cada
dificuldade vencida.
Aos meus familiares por todo o apoio e incentivo. E por estarem sempre ao meu lado apesar da
distância.
Agradeço a minha orientadora Nathália C. Cirone da Silva, pelo auxílio, confiança, apoio e
conhecimento técnico transmitido e também pelas conversas nos momentos de descontração.
Aos membros da banca examinadora, composta pelas professoras Dra Liliana Rocha, Dra.
Marjory Rodrigues, Dra. Maristela Nascimento, Dra. Vera Rall, pela atenção com que
corrigiram este trabalho e pelas valiosas sugestões.
À Unicamp por abrir suas portas para realização do mestrado e ao Departamento de Ciência de
Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos por disponibilizar todo o necessário para
a realização desta pesquisa.
À FAPESP pelo apoio financeiro para o desenvolvimento do trabalho, à CAPES pela bolsa
concedida.
Às funcionárias do laboratório de Toxinas Bacterianas e Microbiologia de Alimentos –
FEA/UNICAMP, pelo apoio e auxílio para a realização do trabalho.
Aos alunos Jhonatan, Bárbara, Luisa, Maria Luiza e Jéssica, pela disposição, pelos momentos
de tentativas, erros e aprendizado, obrigada pela parceria, foi muito importante o
desenvolvimento desses trabalhos com vocês.
Aos alunos da pós graduação e da graduação do laboratório de Toxinas Bacterianas, pelos
momentos de descontração e também pelos de nem tanta descontração assim rsrsr... Pelas horas
e horas no ar condicionador a 16°C (Congelando) tudo para manter a qualidade dos
equipamentos e dos resultados.
Às minhas meninas da casa, do primeiro ano na casa. Comadres, vocês foram muito importantes
pra mim nessa etapa, levarei vocês sempre comigo.
As minhas amigas de longa data Isabela e Jessica pelo apoio e companheirismo, apesar da
distância e dos poucos encontros vocês são essenciais para mim. Com certeza cada palavra me
ajudou a superar cada momento de solidão e tristeza. E claro o compartilhamento de momentos
de conquistas e de alegrias.
E como esquecer da pessoa que eu ligava quando precisava de força e de desabafar? Flávia
minha querida obrigada pelo carinho e atenção. Sou muito grata a senhora por tudo.
Agradeço a todos os meus amigos que se dedicaram um tempo para me ajudar a superar todos
os desafios durante esse período, seja com um abraço, uma palavra amiga.
Obrigada a todos que contribuíram para eu me tornar quem sou hoje!!!
RESUMO
As doenças transmitidas por alimentos (DTAs) são causadas pela ingestão de água ou alimentos
contaminados. O Staphylococcus aureus é capaz de produzir enterotoxinas e é um dos agentes
mais comuns responsáveis por surtos de intoxicação alimentar. A intoxicação é decorrente da
ingestão de enterotoxinas pré-formadas no alimento contaminado pela bactéria, a qual pode
continuar viável ou não. Entre os alimentos envolvidos em intoxicação alimentar estafilocócica,
destaca-se o queijo, devido ao S. aureus ser encontrado tanto no leite cru como em
manipuladores. O objetivo desse trabalho foi isolar, identificar e caracterizar molecularmente
S. aureus isolados da cadeia de processamento de queijo tipo Minas frescal orgânico e
convencional. Foram realizadas coletas em seis laticínios dentro do Estado de São Paulo em um
raio de até 200 quilômetros de Campinas, com duas coletas em cada um. As coletas realizadas
em cada visita foram: leite cru, leite pasteurizado, manipulador, ambiente (equipamento,
utensílio, piso) e produto final. A partir das amostras coletadas fez-se o isolamento da bactéria
alvo. As amostras foram incubadas em Agar Baird Parker (BP) e foram isoladas as colônias
características com posterior realização de testes bioquímicos e reação em cadeia polimerase
(PCR) para a identificação de S. aureus. Após a confirmação da espécie, foi realizada a pesquisa
dos genes codificadores de enterotoxinas (sea-see, seg-sej) por PCR e subtipagem das cepas por
spa typing, agr type e eletroforese em campo pulsado (PFGE). Foram identificados 38 S. aureus,
sendo 18 (47,36%) de laticínios orgânicos e 20 (52,63%) de laticínios convencionais. Pelo
menos 34 isolados (89,47%) apresentaram genes produtores de enterotoxinas, sendo seg em 25
isolados (65,79%), sei em 18 (47,37%), seb em 7 isolados (18,42%), sej em 8 (21,05%), seh em
5 (13,16%) e não foram identificados genes sea, sec, sed e see. O gene agr I foi encontrado em
5 isolados (13,16%), agr II em 11 (29,0%), agr III em 17 (44,74%), agr IV em 3 (7,89%) e não
foi possível identificar agr em 2 isolados (5,3%). Foram identificados 14 Spa type diferentes,
os mais frequentes foram o t021 em 8 isolados (21,05%), o t127 em 5 isolados (13,16%) e o
t1062 em 3 isolados (7,89%). Para a técnica de PFGE, no total foram 17 clusters diferentes,
sendo 1 cluster com 5 isolados, 1 com 4, 2 com 3, 4 com 2 e 9 com apenas 1. Dos 32 perfis 4
clusters apresentaram 2 clones com similaridade de 100%. A abundância de isolados foi
parecida entre os laticínios convencionais e orgânicos. Os resultados obtidos no PFGE
corroboram na identificação dos principais pontos de transmissão das estirpes de S. aureus,
como a salmoura, utensílios (lira), leite cru e pasteurizado utilizados para produção do queijo
Minas frescal.
Palavras chaves: S. aureus, Caracterização molecular, Queijo Minas frescal, PFGE, spa-typing.
ABSTRACT
Foodborne illnesses are caused by ingestion of contaminated food or water. Staphylococcus
aureus is able to produce enterotoxins and is one of the most common agent responsible for
outbreaks of food poisoning. Intoxication is due to the ingestion of preformed enterotoxins in
the food contaminated by the bacteria, which may continue viable. Among the foods involved
in staphylococcal food poisoning, the cheese stands out due to the fact that S. aureus is found
both in raw milk and in manipulators. The objective of this work was to isolate, identify and
molecularly characterize S. aureus isolated from the processing chain of organic and
conventional Minas frescal type cheese. Samples were collected from six dairies in the State of
São Paulo within a radius of up to 200 kilometers from Campinas, with two collections in each
dairy. The following samples were collected: raw milk, pasteurized milk, manipulators,
environment (equipment, utensil, floor) and final product in order to isolate the target
bacterium. Afterwards, the samples were incubated in Baird Parker Agar (BP) and the
characteristic colonies were isolated with subsequent biochemical tests and polymerase chain
reaction (PCR) for the identification of S. aureus. After confirmation of the species, the
enterotoxin encoding genes (sea-see, seg-sej) were investigated by PCR and subtyping of spa-
typing, agr type and pulsed-field electrophoresis (PFGE) were performed. Thirty-eight S.
aureus were identified, 18 (47.36%) of organic dairy products and 20 (52.63%) of conventional
dairy products. Among the 38 isolates, 34 isolates (89.47%) presented at least one enterotoxin
producing gene, with seg in 25 isolates (65.79%), sei in 18 isolates (47.37%), seb in 7 isolates
(18.42%), sej in 8 (21.05%), seh in 5 (13.16%) and no sea, sec, sed and see genes were detected.
The agr I gene was found in 5 isolates (13.16%), agr II in 11 (29.0%), agr III in 17 (44.74%),
agr IV in 3 (7.89%); it was not possible to identify agr in 2 isolates (5.3%). A total of 14
different spa types were identified, t021 was the most frequent type (8 isolates, 21.05%), t127
was found in 5 isolates (13.16%) and t1062 in 3 isolates (7.89%). Seventeen clusters were
detected based on the PFGE technique, 1 cluster with 5 isolates, 1 with 4, 2 with 3, 4 with 2
and 9 with only 1. Of the 32 profiles 4 clusters presented 2 clones with similarity of 100%. The
abundance of isolates was similar between conventional and organic dairy products. The results
obtained in the PFGE corroborate the identification of the main transmission points of the S.
aureus strains, such as brine, utensils (lira), raw and pasteurized milk used to produce Minas
frescal cheese.
Key words: S. aureus, Molecular characterization, Minas frescal cheese, PFGE, spa-typing.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Fluxograma geral do processamento de queijo Minas frescal .................................. 18
Figura 2 - Esquema da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). ............................................ 27
Figura 3: Esquema da técnica de spa typing ............................................................................. 30
Figura 4: Esquema da técnica de PFGE ................................................................................... 31
Figura 5: Região onde foram selecionados os laticínios para realizar as coletas. .................... 32
Figura 6: S. aureus em placa de Baird Parker Agar ................................................................. 34
Figura 7: Gel para identificação de Staphylococcus aureus isolados em laticínios orgânicos e
convencionais. .......................................................................................................................... 44
Figura 8: Identificação de enterotoxinas clássicas (sea, seb, sec, sed e see) em gel de agarose.
.................................................................................................................................................. 48
Figura 9: Identificação de enterotoxinas não-clássicas ( seg, seh, sei e sej) em gel de agarose.
.................................................................................................................................................. 49
Figura 10: Identificação agr types em gel de agarose .............................................................. 50
Figura 11: Gel de amplificação do gene spa em S. aureus isolados ........................................ 52
Figura 12: Dendrograma PFGE ................................................................................................ 58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Oligonucleotídeos iniciadores e condições da reação para detecção do gene coa ... 35
Tabela 2: Oligonucleotídeos de identificação de S. aureus ...................................................... 36
Tabela 3: Oligonucleotídeos para investigação de genes de virulência de S. aureus ............... 37
Tabela 4: Oligonucleotídeo iniciadores e as condições da reação para tipagem do locus agr. 38
Tabela 5: Sequências dos oligonucleotídeo iniciadores e as condições da reação para tipagem
da região spa ............................................................................................................................. 39
Tabela 6: Quantidade de isolados e S. aureus identificados por tipo de amostras ................... 43
Tabela 7: Frequência dos Spa types encontrados. .................................................................... 53
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 13
2. OBJETIVOS .............................................................................................................. 15
2.1. Objetivos gerais ....................................................................................................... 15
2.2. Objetivos específicos ............................................................................................... 15
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 16
3.1. Laticínio Orgânico e Convencional ......................................................................... 16
3.2. Queijo Minas frescal ................................................................................................ 17
3.3. Doenças transmitidas por alimentos (DTAs) ........................................................... 19
3.4. Staphylococcus aureus ............................................................................................ 20
3.4.1. Morfologia e Crescimento ................................................................................. 20
3.4.2. Fatores de virulência .......................................................................................... 20
3.4.3. Enterotoxinas produzidas por Staphylococcus aureus ...................................... 21
3.4.4. Intoxicação estafilocócica ................................................................................. 23
3.4.5. Prevalência de S. aureus em alimentos no Brasil .............................................. 23
3.4.6. Casos de intoxicação estafilocócicas ................................................................. 25
3.5. Métodos moleculares para identificação de S. aureus e genes de produção de
enterotoxinas ......................................................................................................................... 26
3.5.1. Reação em cadeia polimerase (PCR) ................................................................. 26
3.6. Métodos de tipagem molecular ................................................................................ 28
3.6.1. Tipagem por agr typing ..................................................................................... 28
3.6.2. Tipagem por spa typing ...................................................................................... 29
3.6.3. Tipagem por Eletroforese em Campo Pulsado PFGE ........................................ 30
4. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 32
4.1. Origem, obtenção das amostras e identificação fenotípica de S. aureus .................. 32
4.2. Identificação genotípica de Estafilococos Coagulase Positiva e S. aureus ............... 34
4.2.1. Extração do material genético ............................................................................ 34
4.2.2. Identificação molecular do gene coa ................................................................. 35
4.3. Detecção de genes para produção de enterotoxinas ................................................. 36
4.4. Tipagem molecular e caracterização genética ......................................................... 37
4.4.1. Tipagem por agr typing ...................................................................................... 37
4.4.2. Tipagem por spa typing ...................................................................................... 38
4.4.3. Tipagem por PFGE ............................................................................................. 39
4.5. Análise dos resultados .............................................................................................. 40
5. ASPECTOS ÉTICOS ................................................................................................ 41
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................. 42
6.1. Isolamento e Identificação fenotípica ...................................................................... 42
6.2. Identificação genotípica ........................................................................................... 42
6.3. Detecção de genes para produção de enterotoxinas ................................................. 45
6.4. Tipagem agr typing .................................................................................................. 49
6.5. Tipagem spa typing .................................................................................................. 51
6.6. Tipagem por PFGE .................................................................................................. 57
7. CONCLUSÃO ........................................................................................................... 61
REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 62
ANEXOS ............................................................................................................................ 79
13
1. INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas, tem-se observado um maior número de doenças transmitidas
por alimentos (DTA), relacionado a vários fatores como o desenvolvimento econômico, a
globalização do comércio de alimentos, a intensificação da urbanização e a modificações dos
hábitos alimentares dos consumidores devido ao aumento do consumo de alimentos frescos ou
in natura, preferência por alimentos prontos ou semi-prontos, além do consumo de refeições
fora do domicílio. Esse aumento também sugere ao maior número de notificações, pois no geral,
a qualidade microbiológica melhorou nas últimas décadas. A oferta de alimentos isentos de
agentes patogênicos assumiu mundialmente uma grande relevância em relação a saúde pública,
sendo as bactérias um dos principais patógenos envolvidos (OZFOODNET WORKING, 2015).
Entre as espécies do gênero Staphylococcus, a mais frequentemente encontrada em
casos de intoxicações alimentares é S. aureus, devido a produção de diferentes toxinas
(BORGES et al., 2008), sendo estas muito patogênicas e responsáveis por surtos muito
significativos (JAY, 2005; FORSYTHE, 2013). Além de ser altamente encontrado em
manipuladores de alimentos (MOTTIN & ABREU, 2011) e de ser uma das bactérias que se
multiplica rapidamente, ser resistente aos antimicrobianos, considera-se este micro-organismo
como um dos principais à Saúde Pública (ARRUDA, 2006).
A ingestão de toxinas, que são produzidas e liberadas pelas bactérias durante sua
proliferação no alimento, representa um risco para a saúde pública. No caso, das enterotoxinas
estafilocócicas trata-se de uma substância termoestável, podendo permanecer no alimento
mesmo após o cozimento, favorecendo a ocorrência da intoxicação (TEWARI & ABDULLAH,
2015).
A mesma amostra de alimento pode conter diferentes enterotoxinas estafilocócicas,
uma vez que podem estar presentes diferentes cepas de Staphylococcus. aureus, um dos
principais agentes envolvidos. Sendo assim, é importante avaliar vários isolados a partir das
placas de cultivo, principalmente nos casos em que sintomas típicos de intoxicação
estafilocócica são observados (JØRGENSEN et al., 2005). A detecção dos genes responsáveis
pela produção de enterotoxinas também se torna relevante para auxiliar no levantamento do
número de casos de surtos de doenças alimentares e na análise de risco para surtos de origem
alimentar (ZOCCHE et al., 2010).
O uso das técnicas de biologia molecular contribui para detectar associações de
maneira mais confiável, além de fortalecer e refinar dados, o que garante classificações mais
sensíveis e específicas (FOXMAN & RILEY, 2001). Os resultados obtidos através de análises
14
utilizando a técnica auxilia as atividades epidemiológicas, como vigilância, investigações de
surtos de DTA, identificação de modelos de transmissão e fatores de risco entre casos
aparentemente sem relação, caracterizando interações hospedeiro–patógeno, o que gera melhor
entendimento da patogênese das doenças em nível molecular (FOXMAN & RILEY, 2001).
Existem poucos dados disponíveis sobre leite orgânico na literatura, mas há
indicações de que este apresenta maior teor nutritivo quando comparado ao leite produzido em
sistema convencional (FANTI et al., 2008). Além disso, não há estudos no Brasil envolvendo a
qualidade microbiológica da cadeia produtiva do queijo Minas frescal provenientes de leite
orgânico. Sabendo que no sistema orgânico o uso de antibiótico é vedado em tratamentos de
animais com infecções, é relevante avaliar se o produto e subprodutos como queijo Minas
frescal são acarretados pela contaminação de patógenos.
Portanto, para a saúde pública é de suma importância a realização de estudos sobre
a qualidade microbiológica de laticínios, a partir da caracterização molecular, utilizando
identificação de genes e a tipagem das cepas isoladas, podendo assim analisar a relação da
prevalência de genes que codificam fatores de produção de enterotoxinas com a possível origem
das cepas responsáveis pela contaminação dos alimentos.
15
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
Isolar, identificar e caracterizar molecularmente Staphylococcus aureus em cadeia de
processamento de queijo tipo Minas frescal orgânico e convencional.
2.2. Objetivos específicos
-Isolar Staphylococcus aureus em planta de processamento de queijo tipo Minas frescal
com produção orgânica e convencional;
- Identificar molecularmente as cepas isoladas de Staphylococcus aureus;
- Identificar genes codificadores da produção de enterotoxinas (sea-see, seg-sej);
-Identificar o spa-type dos isolados;
-Determinar a distribuição dos grupos agr (I, II, III e IV) nos isolados;
-Verificar a diversidade das cepas de S. aureus através da técnica de PFGE.
16
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Laticínio Orgânico e Convencional
A agricultura orgânica tem por princípio estabelecer sistemas de produção com base
em tecnologias de processamentos, ou seja, a junção de procedimentos que relacionam a planta,
o solo e as condições climáticas, na produção de alimento e com suas características e sabor
originais, que atenda as expectativas do consumidor (PENTEADO, 2000).
Segundo Brasil (2007), agricultura orgânica é um termo definido por padrões da
International Federation of Organic Agriculture Movements (IFOAM)e toda produção e todo
processamento de alimento orgânico obedecem a um rigoroso conjunto de normas e diretrizes.
Desta maneira, é considerado leite orgânico aquele produzido em sistema no qual é vedado o
uso de agrotóxico sintético, antibióticos ou outros insumos artificiais tóxicos e organismo
geneticamente modificado, visando à oferta de produtos saudáveis e de elevado valor
nutricional. Além disso, os animais possuem alimentação contendo no mínimo 90% de
alimentos orgânicos oriundos da fazenda. A produção de volumosos e concentrados deve ser
feita por meio da formação e manejo das pastagens, capineiras, silagem e feno. A utilização de
alimentos verdes frescos como hortaliças, rami, guandu e gramíneas é indicada para
suplementar a alimentação dos animais, pois, influenciam diretamente na composição do leite.
Deste modo, o leite orgânico pode apresentar características diferentes daquele obtido de
animais criados em pecuária leiteira convencional (VON BORELL & SORENSEN, 2004).
No caso da produção convencional de leite, as vacas leiteiras são selecionadas e
melhoradas geneticamente para uma alta produção, portanto envolvendo animais transgênicos,
sendo alimentados inclusive de suplementação transgênica. Em relação a produtos químicos,
muitas vezes possui a necessidade de uso durante a criação e podem ser adicionados na ração,
injetados no corpo dos animais ou banhos. O uso de antibiótico é permitido assim como os
hormônios, analgésicos, anti-inflamatórios, dentre outros produtos. Porém os produtores são
orientados a respeitar o período de carência quanto ao uso dos produtos. Muitos produtores
utilizam medicamentos homeopáticos na produção de leite convencional, afim de produzir leite
com resíduo controlado e com baixa contagem de células somáticas (TECNOLOGIA E
TREINAMENTO, 2012).
17
3.2. Queijo Minas frescal
Segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), por meio
da Portaria nº 352 de 04/09/1997, entende-se por queijo Minas frescal, “o queijo fresco obtido
por coagulação enzimática do leite com coalho e/ou outras enzimas coagulantes apropriadas,
complementada ou não com ação de bactérias lácticas específicas”. É classificado como queijo
semigordo (entre 25 e 44,9% de gordura no extrato seco), de muito alta umidade (superior a
55%), apresenta consistência branda e macia, com ou sem olhaduras mecânicas, cor
esbranquiçada, sabor suave a levemente ácido, sem ou com crosta fina, de forma cilíndrica e
com peso de 0,3 a 5 Kg (FURTADO & LOURENÇO, 1994; BRASIL, 1996; BRASIL, 1997).
Assim, a qualidade do queijo pode ser influenciada pela contaminação da matéria-
prima (leite) e demais ingredientes, bem como pelos manipuladores, equipamentos e após o
processamento industrial, além do tempo de exposição a temperaturas que favoreçam a
proliferação de micro-organismos (LOGUERCIO & ALEIXO, 2001).
No processamento do queijo Minas Frescal, primeiramente o leite é tratado
termicamente (pasteurização), após pasteurizado, recebe a adição dos ingredientes como, o
cloreto de cálcio, que repõe o cálcio que ficou indisponível durante o tratamento térmico. É
necessário para que ocorra a coagulação da caseína (proteína do queijo), o fermento, que são as
bactérias que promovem entre outros aspectos a formação de sabor nos queijos, o coalho
(enzima que promove a coagulação do leite). Após adicionar o coalho, o leite fica em repouso
pelo período médio de 40 minutos até a massa atingir o ponto de corte. Para o corte em cubos
ou grãos são utilizadas as liras, a fim de promover a dessoragem da massa. Ao atingir o ponto
final de dessoragem, realiza-se a enformagem da massa. A salga pode ser realizada por
salmoura, sobre o queijo enformado ou na massa. Ao final do processo, os queijos são
embalados em embalagens plásticas e armazenados sob refrigeração até 8 °C (AGEITEC,
2017). Abaixo na Figura 1, está representado o fluxograma geral do processamento de queijo
Minas frescal.
18
Ingredientes
Figura 1: Fluxograma geral do processamento de queijo Minas frescal
Fonte: AGEITEC, 2017
Os principais pontos de contaminação são os que o manipulador tem contato direto
com o produto sem o uso de luvas, sendo eles as etapas de enformagem, desforma e embalagem
dos queijos. Outra forma de contaminação no processamento pode ser através do uso do tanque
de coagulação higienizado de forma inadequada, pois é onde o leite é alocado após o processo
Ordenha
Estocagem do leite cru
Pasteurização
Coagulação
Corte
Dessoragem
Enformagem
Estocagem
Salga
Embalagem
Distribuição
19
de pasteurização. Além disso, pode ocorrer a contaminação cruzada principalmente pelo uso de
utensílios, como a lira, durante o corte do coágulo.
3.3. Doenças transmitidas por alimentos (DTAs)
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), as doenças transmitidas por
alimentos (DTAs) são definidas como doenças infecciosas ou tóxicas, causadas pelo consumo
de agentes através da ingestão de alimentos contaminados ou água. (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2017). Os sinais e sintomas variam muito, dependendo dos agentes
etiológicos, mas diarreia e vômito são os sintomas mais comuns (FREITAS, 2005).
No Brasil, o S. aureus é o terceiro agente etiológico mais associado a surtos de
origem alimentar com 5,8% dos casos notificados. A região com maior número de notificações
é a sudeste com 43,8% dos casos. Em relação a alimentos vinculados a intoxicações alimentares,
em quarto lugar está o leite e seus derivados (SVS, 2016). A intoxicação alimentar estafilocócica
representa uma das DTAs mais prevalentes no mundo e é causada pela ingestão de
enterotoxinas pré-formadas nos alimentos (ECDC, 2015)
O consumo de leite e derivados lácteos, sobretudo o de queijo e outros preparados
à base de leite cru, são atribuídos como causa de vários surtos de origem alimentar (SANTANA
et al., 2010), uma vez que na produção de queijos esses são alimentos naturalmente susceptíveis
à contaminação por esse micro-organismo, já que que a fonte de contaminação por S. aureus
pode ser multifatorial, como leite cru, ambiente de processamento e manipuladores (ANDRÉ
et al., 2008; SANTOS, 2008; VIÇOSA et al. 2010).
A manipulação inadequada é responsável pela maioria dos casos de DTAs,
incluindo também a utilização inadequada da temperatura durante o processamento e
conservação dos alimentos, contaminação cruzada, falta de higiene pessoal e dos equipamentos
(GONÇALVES, 1998). Como se encontra frequente na pele e membranas mucosas, S. aureus
pode entrar na cadeia de alimentos, devido ao contato com portadores do micro-organismo é
importante a identificação da ocorrência de S. aureus entre manipuladores (UDO et al., 2009;
HENNEKINNE et al., 2012).
20
3.4. Staphylococcus aureus
3.4.1. Morfologia e Crescimento
O gênero Staphylococcus possui morfologia na forma de cocos Gram positivos,
isolados ou agrupados em cachos, pares ou tétrades, são coagulase positiva, sendo um patógeno
oportunista (KONEMAN et al., 2008), anaeróbios facultativos, não esporulados, imóveis e
produtores usuais de catalase (KLOSS & LAMBE, 1991). Além disso, o Staphylococcus aureus
é uma bactéria mesófila apresentando temperatura de crescimento na faixa de 7 a 47,8 ºC, as
enterotoxinas são produzidas entre 10 a 46 ºC, com ótima produção na faixa entre 35 a 37 ºC.
Estas bactérias são tolerantes a concentrações de 10 a 20% de NaCl e a nitrato. Em relação ao
pH, S. aureus apresentam melhor crescimento na faixa de 4,0 a 9,8, com ótimo entre 6,0 e 7,0
(DIAS et al., 2016). Devido a essa característica, o S. aureus possui capacidade de crescimento
numa grande variedade de alimentos.
No homem, o S. aureus está presente na superfície da pele, destacando a região das
mãos, mucosa nasal, olhos, garganta, trato gastrintestinal, sendo encontrado com frequência em
feridas e infecções (DIAS, 2010).
O gado bovino também é importante portador desta bactéria, devido à frequente
ocorrência de infecções causadas pela mesma como, por exemplo, as mastites, que favorecem
a contaminação do leite e de seus derivados durante a ordenha, devido as condições higiênicas
inadequadas (SERIDAN et al., 2012). Além disso, S. aureus frequentemente causa mastite
subclínica, que pode se tornar persistente. Uma vez que a prática da ordenha exige uma
higienização eficiente e menor exposição ambiental aos patógenos (TAPONEN & PYORALA,
2009; PELLEGRINO et al., 2010). Os alimentos podem se contaminar em diferentes etapas do
processo de produção, principalmente aqueles que são altamente manipulados, como o queijo
(LE LOIR et al., 2003; ARGUDIN et al., 2010).
3.4.2. Fatores de virulência
O potencial patogênico de S. aureus está relacionado com a capacidade de produzir
moléculas como enzimas e toxinas que ajudam a sua habilidade em colonizar e provocar
doenças em mamíferos (HAVERI et al., 2007). Algumas linhagens podem formar uma cápsula
de natureza polissacarídica, o que contribui para impedir a fagocitose do micro-organismo por
células de defesa. Podem produzir e expelir proteína A, que apresenta alta compatibilidade pela
21
região Fc das moléculas de IgG e impede a ação do sistema imunológico (KONEMAN et al.,
2008).
Dentre as enzimas produzidas pela bactéria, destacam-se a catalase, responsável
pela decomposição do peróxido de hidrogênio; a termonuclease (Tnase) responsável pela
degradação do DNA e RNA em fosfomononucleosídeos e a coagulase, responsável pela síntese
de fibrina, que confere resistência à opsonização e à fagocitose (KONEMAN et al., 2008). A
produção da enzima coagulase é o principal critério usado pela microbiologia clínica para a
identificação de S. aureus isolados de infecções humanas. Apesar de dados controversos a
respeito da importância da coagulase como um fator de virulência, esta é indicada como a
primeira linha de contestação do S. aureus (MARTINEZ et al., 2001). Segundo Bergdoll
(1990), se um isolado apresenta resultados positivos para a síntese das enzimas coagulase e
termonuclease, pode ser considerado como potencialmente produtor de enterotoxinas. Porém
alguns estafilococos coagulase negativa (ECN), envolvidos em uma variedade de infecções
animais e humanas, têm se tornado importantes por também produzirem enterotoxinas
(CUNHA et al., 2006).
3.4.3. Enterotoxinas produzidas por Staphylococcus aureus
Enterotoxinas estafilocócicas (SEs) são os principais agentes de intoxicação de
origem bacteriana no homem e os principais sintomas são náusea, vômito, diarreia, dor de
cabeça, cólica abdominal, cãibra muscular, queda de pressão sanguínea e prostração
(LAMAITA et al., 2005).
Até o momento, são conhecidas mais de 20 SE, excluindo-se as variantes
moleculares, as quais são nomeadas com letras do alfabeto romano na ordem cronológica em
que foram descritas e de acordo com a sua capacidade de apresentar vômito em primatas quando
inserida via oral (LINA et al., 2004; THOMAS et al., 2007). Portanto, as SE incluem: (i) as
enterotoxinas clássicas SEA, SEB, SEC, SED, SEE, que foram descritas em cepas de S. aureus
recuperadas de surtos de intoxicação alimentar e classificadas em diferentes grupos sorológicos;
(ii) as novas toxinas/ não clássicas (SEG, SEH, SEI, SER, SES, SET); e (iii) as staphylococcal
enterotoxin-like ou SEl, sendo denominadas por não apresentarem capacidade emética ou por
não terem sido testadas em modelos animais até o momento (SElJ, SElK, SElL, SElM, SElN,
SElO, SElP, SElQ, SElU, SElU2, SElV) (ARGUDIN et al., 2010; HENNEKINNE et al., 2012).
Recentemente trabalhos identificaram enterotoxina estafilocócica tipo X (SELX), sendo que a
22
mesma se liga através de múltiplos receptores a superfície de neutrófilos glicosilados, inibindo
a fagocitose e contribuindo para a patogênese (LANGLEY et al., 2017; TUFFS et al., 2017).
A produção de enterotoxinas é influenciada pela temperatura, pH, aw, tamanho
do inóculo, fonte de carbono e nitrogênio, concentração de sal e condições atmosféricas do
substrato. As enterotoxinas são produzidas entre 10°C a 46°C, contudo a faixa de temperatura
ótima é de 40°C a 45°C, sendo na temperatura ótima, a enterotoxina pode ser detectável entre
4 a 6 horas (WONG & BERGDOL, 2002; FRANCO & LANDGRAF, 2005).
Uma característica importante das SEs é a sua termo-ácido-resistência, sendo
capazes de resistir a tratamentos térmicos como a cocção, pasteurização e a ultrapasteurização
(BORGES et al., 2008). As SEs possuem uma estrutura compacta, o que proporciona
resistência a enzimas proteolíticas como pepsina, tripsina, renina e papaína (BERGDOLL,
1989) dessa forma suportando a ação da hidrólise pelas enzimas gástricas e jejunais
preservando sua atividade no trato digestivo após ingestão (LUZ, 2008).
As SEs pertencem à família dos superantígenos, apresentando como principais
características a pirogenicidade, a antigenicidade e a capacidade de aumentar a sensibilidade
celular à endotoxinas. Além de serem capazes de estimularem uma resposta policlonal
inespecífica de células T e a liberação aumentada de citocinas, o qual causa toxicidade
sistêmica e supressão da resposta imune adaptativa, prolongando a infecção bacteriana. Os
superantígenos ligam-se simultaneamente às moléculas do complexo de histocompatibilidade
principal (MHC) de classe II e aos receptores de células T, independentemente de suas
especificidades de ligação a peptídeos, formando um complexo trimolecular, que induz a
proliferação demasiada de células (PARHAM, 2001; BAKER & ACHARYA, 2004).
Apenas a presença de genes enterotoxigênicos não indica necessariamente, que o
micro-organismo é capaz de produzir toxina biologicamente ativa suficiente para provocar
manifestações clínicas (MCLAUCHLIN et al., 2000). Porém, o simples fato de uma estirpe
conter um ou mais genes enterotoxigênicos deve ser significante, pois caso o micro-
organismo encontre condições favoráveis à produção de enterotoxinas pode oferecer risco à
saúde pública (MEDEIROS et al., 2013).
23
3.4.4. Intoxicação estafilocócica
Sintomas clínicos súbitos e relacionados ao trato digestivo como náuseas, vômitos
e diarreia são os mais frequentes relacionados à intoxicação alimentar, dor abdominal e
alteração neurológica também podem se fazer presentes. O grau das manifestações clínicas vai
variar de acordo com o inóculo da infecção, a virulência do agente e a competência imunológica
do hospedeiro (DESEL, 2015).
Os sintomas das intoxicações estafilocócicas aparecem, logo depois de um curto
período de incubação quando comparados a outras intoxicações e infecções alimentares,
decorrendo de 30 minutos a 8 h (3 h, em média), após a ingestão do alimento contaminado
(YOUSEF & CARISTROM, 2003; HENNEKINNE et al., 2011), esse período varia com a
susceptibilidade do indivíduo e a quantidade de toxina no alimento ingerido (cerca 10- 20 μg
/kg, num indivíduo adulto) para apresentar sintomas (EFSA, 2009; SANTANA et al., 2010;
HENNEKINNE et al., 2011).
O diagnóstico da intoxicação alimentar estafilocócica é baseado nos sintomas
clínicos e também pela detecção de enterotoxinas nos alimentos ingeridos. O curto período de
incubação é fator que caracteriza a intoxicação, porém, o que dificulta a identificação da
condição, prejudicando a vigilância epidemiológica, uma vez que não há constância esperada
de casos notificados, podendo explicar as alterações e a aparente baixa na prevalência de
intoxicações alimentares envolvendo S. aureus (SERIDAN et al., 2012).
3.4.5. Prevalência de S. aureus em alimentos no Brasil
Em um estudo realizado no estado da Paraíba, dados mensais da vigilância
epidemiológica do período de 2005 a 2009 na cidade de Manaus (AM), revelaram que o S.
aureus foi o agente etiológico veiculado em 50% dos casos de queijos contaminados (RUWER
et al., 2011).
Segundo os resultados do trabalho realizado por Medeiros et al. (2013), das 140
amostras colhidas nos diversos pontos do processo de elaboração do queijo Minas frescal, foram
isoladas e identificadas 74 estirpes de estafilococos coagulase-positivos, após amplificação de
fragmentos de DNA cromossômico específico da espécie de S. aureus, 41 amostras
apresentaram confirmação das estirpes de S. aureus. Dentre as 41 estirpes de S. aureus, foi
amplificado o DNA cromossômico específico de algumas das enterotoxinas SEA, SEB, SEC,
SED e a TSST – 1 em 25 amostras. Das amostras com positividade para o gene da enterotoxina
24
SEA (56%), duas amostras com positividade para o gene da enterotoxinas SEB (8%), cinco
amostras com positividade para o gene da enterotoxina SEC (20%), uma amostra apresentando
positividade para os genes das enterotoxinas SEA e SEC (4%), uma amostra apresentando
positividade para os genes das enterotoxinas SEB e SEC (4%), uma amostra apresentando
positividade para os genes das enterotoxinas SEA e SEB (4%) e uma amostra apresentando
positividade para os genes da enterotoxina SEA e da toxina TSST-1(4%). Nesse mesmo estudo,
os pontos de coleta com maior frequência de isolados de S. aureus toxigênicos foram: as mãos
do manipulador (16,0%), leite cru do tanque de recepção (12,0%), superfície do tanque de
estocagem do leite cru (12,0%), leite pasteurizado para elaboração do queijo (12,0%) e o queijo
Minas frescal pronto para consumo (12,0%).
Em estudo realizado por Song et al., (2014), avaliou a diversidade genética e
potencial de virulência dos isolados de S. aureus de produtos alimentares crus e processados
em Xangai. Foi avaliada a distribuição de genes de toxinas entre os isolados e os resultados
mostraram que a incidência de sec, sed, seg, sei, sej, sel, sem, sen, seo, ser, e seu, foi
significativamente diferente entre os isolados de diferentes categorias de alimentos (p <0,05).
Verificou-se que os quatro genes clássicos de enterotoxina (sea, seb, sec, e sed) foram
encontrados em isolados obtidos a partir de carne fresca, leite cru e produtos de soja
processados. Dois isolados de S. aureus, um de leite cru e outro de produtos de soja processados,
possuíam 12 genes de diferentes toxinas. A porcentagem de isolados toxigênicos de S. aureus
foi maior para os isolados de carne (80%) ou de leite cru (89,7%) do que outros isolados
recuperados de produtos de soja processados (50%), legumes frescos / frutas (31,3%) ou
alimentos congelados (50%).
Recentemente, em um estudo de Dias et al., (2016) no Sul de Goiás, para os
resultados obtidos de contagem de S. aureus, apenas 30% das amostras de queijo Minas Frescal
apresentaram-se de acordo com o padrão estabelecido pela ANVISA (5,0 x 10² UFC/g),
conforme Resolução – RDC nº 12, de 02 de janeiro de 2001(ANVISA, 2001).
Em um trabalho realizado por Acosta et al., (2017), foram identificados 27 isolados
(50,94%) como S. aureus pela amplificação do gene nuc (responsável pela produção de enzima
nucleasse) oriundos de leite de tanques expansão comunitários. 13/27 isolados (48,1%) foram
positivos para pelo menos um gene das enterotoxinas estudadas, sendo as frequências dos genes
sea 33,3%, seh 18,5%, sei11,1% e sed 7,4%; não entanto não foram identificados os genes seb
e seg nestas bactérias.
25
3.4.6. Casos de intoxicação estafilocócicas
Nos Estados Unidos a dose média de SEA ingerida por estudantes em um surto
causado por um achocolatado foi de 144 ± 50 ng (EVENSON et al., 1988). Outro surto de
doença transmitida por alimentos em Kansai, Japão, onde 13.420 pessoas foram afetadas após
a ingestão de leite desnatado e iogurte (preparado com leite em pó) contaminado com 0,38 ng/
ml e 3,7 ng/ g de SEA, respectivamente (ASAO et al., 2003).
O envolvimento da SEH em surtos de intoxicações alimentares estafilocócicas foi
estabelecido desde a detecção em produtos alimentares responsáveis por dois surtos. No
primeiro surto ocorrido em Osaka em 2000 relatado no estudo realizado por Ikeda et al., (2005),
foi devido a pequenas quantidades de SEA e SEH em leite reconstituído. E no segundo surto
que ocorreu também no Japão descrito por Jørgensen, et al., (2005), foram isolados S. aureus
produtores de SEH no purê de batata, que causou a intoxicação alimentar.
Em Minas Gerais foram relatados surtos que envolveram queijo Minas frescal, no
qual se identificou as enterotoxinas estafilocócicas dos tipos A, B e C; e em leite cru, onde se
identificou as enterotoxinas C e D (CARMO et al., 2002).
Veras et al., (2003), investigaram surtos de intoxicação alimentar envolvendo leite
e seus derivados no estado de Minas Gerais, e constataram que os principais agentes causadores
foram S. aureus e estafilococos coagulase negativa enterotoxigênicos, sendo SEA, SEB e SEC
as principais toxinas envolvidas nos surtos.
Em um surto na França causado por queijo contaminado, as doses de SEE ingeridas
por pessoas sintomáticas foram estimadas em cerca de 90 ng, com base no peso médio da porção
de queijo (cerca de 200 g) e na quantidade total de SE de amostra de alimentos (0,45 ng/g)
(OSTYN et al., 2010).
Pires et al., (2012) estudaram vários surtos causados por S. aureus ocorridos em
diferentes países e relataram que os produtos lácteos eram a principal fonte de doença (30,3%),
seguidos de grãos e feijão (12,9%), carne (10,5%) e outras fontes (7,0%).
26
3.5. Métodos moleculares para identificação de S. aureus e genes de produção de
enterotoxinas
3.5.1. Reação em cadeia polimerase (PCR)
A amplificação específica de sequências de ácidos nucleicos através da Reação em
Cadeia Polimerase (PCR) (Figura 2), tem sido empregada no diagnóstico de inúmeras doenças
infecciosas e diversos estudos utilizam a PCR para detecção de diferentes tipos de micro-
organismos em alimentos (SILVA et al., 2003; BLAIOTTA et al., 2004; CHEN et al., 2004). A
identificação de S. aureus em alimentos de origem animal pode ser feita através desta técnica e
possui resultados relevantes na avaliação epidemiológica de casos e surtos de intoxicação
estafilocócica, já que possibilita determinar o tipo de SE e os genes produtores das mesmas
(ZOCCHE et al., 2009).
27
Figura 2 - Esquema da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
Fonte: Tortora et al. (2000).
28
3.6. Métodos de tipagem molecular
Os métodos de tipagem surgiram devido às necessidades de técnicas eficazes para
determinação da origem dos agentes patogênicos com alta taxa de virulência, transmissibilidade
e resistência aos antibióticos (MCDOUGAL et al., 2003; AGIUS et al., 2007).
As técnicas de tipificação são específicas e podem ser baseadas em parâmetros
fenotípicos e genotípicos das bactérias. Os procedimentos fundamentados no fenótipo são
aqueles que diferenciam as cepas através da caracterização dos produtos da expressão gênica,
como por exemplo, a presença de antígenos na superfície celular e o perfil de suscetibilidade a
antimicrobianos (TENOVER et al., 1997). Já os métodos que utilizam o padrão genético, são
baseados na análise da estrutura genética do micro-organismo em que se utilizam enzimas de
restrição, amplificação de ácido nucleico ou sequenciamento de nucleotídeos (YAN et al., 2003;
FOLEY et al., 2009)
A adequada identificação do patógeno é um requisito indispensável para detecção
da fonte de infecção. A epidemiologia microbiana é útil, pois permite conhecer o perfil dos
isolados, entender as relações genéticas entre diferentes clones, assim como detectar o fluxo
gênico e traçar as estratégias de sobrevivência e virulência de micro-organismos patogênicos
ou multirresistentes como parte de sistemas de vigilância (ARBEIT, 1999; VAN BELKUM et
al. 2001). As diferentes populações de S. aureus apresentam variabilidade do conteúdo
genômico, o que torna necessária a identificação dos isolados antes de se aplicar medidas para
controle dessa bactéria (FITZGERALD et al., 2001). A combinação de métodos de tipificação
fenotípicos e genotípicos é a melhor forma para compreensão da epidemiologia da intoxicação
alimentar estafilocócica (SHIMIZU et al., 2000).
3.6.1. Tipagem por agr typing
Em S. aureus, no mínimo quatro sistemas regulatórios influenciam a produção das
enterotoxinas. O principal é o gene acessório regulador (agr), que atua juntamente com o gene
acessório regulador estafilocócico (sar). O sistema agr é responsável pela regulação da
produção de algumas SE como as SEB, SEC e SED. Já a SEA é expressa de maneira diferente,
e que ainda não se conhece mecanismos de regulação responsáveis pela produção desta toxina
(LE LOIR et al., 2003; JOHLER & STEPHAN, 2010). Estudos destes grupos revelam que o
peptídeo autoindutor (AIP) de cepas pertencentes ao mesmo grupo ativam respostas entre si, já
cepas pertencentes a grupos distintos competem por níveis de expressão. Vale ressaltar que
29
associações entre grupo, têm sido mencionadas (JARRAUD et al., 2002; SHOPSIN et al.,
2003).
Jarraud et al., (2002) relatam que cepas dos grupos agr I e agr II causam,
preferencialmente, doenças mediadas por enterotoxinas, como a intoxicação alimentar, e que o
grupo agr III está envolvido com a síndrome do choque tóxico. Além disso, Jarraud et al.,
(2001) também descreveram que as cepas pertencentes ao grupo agr IV estão relacionadas com
a produção de exotoxinas exfoliativas, envolvidas na síndrome da pele escaldada.
A classificação dos grupos do sistema agr é baseada em o domínio hiper-variável
do locus agr para Shopsin et al. (2003). A identificação é realizada a partir da PCR, sendo um
gene para cada grupo (I, II, III, IV).
3.6.2. Tipagem por spa typing
Umas das proteínas de evasão, específica de S. aureus, é a proteína estafilocócica
(SpA), codificada pelo gene spa. Ela é uma exoproteína ligada à membrana cuja estrutura e
função tem sido caracterizada com frequência, devido a capacidade de bloquear a iniciação da
via clássica do Sistema Complemento através do reconhecimento com alta afinidade do
domínio Fc de imunoglobulinas, o que resulta em alvo invertido e impedimento dos sítios de
ligação de C1q e do receptor Fcɤ (STOIBER et al., 1995; ALONSO & DAGGET, 2000;
THIELENS et al., 2002; IZMAILOVA et al., 2003). Assim, se ligando à IgG, a proteína A
impede a fagocitose mediada pelo receptor Fcɤ e também atinge eficientemente a ativação do
sistema complemento interferindo na ligação de C1q (GOWARD et al., 1993; VERHOEF et
al., 2004). Além disso, SpA pode estimular a multiplicação de linfócitos B, promovendo sua
expansão clonal e em seguida a morte celular (VERHOEF et al., 2004).
Utilizando o genes spa de S. aureus é realizada a tipagem por spa typing, um
método de sequenciamento de um único locus que determina as variações na sequência da
região polimórfica X ou sequência de repetições curtas (SSR) do gene da proteína A, uma
proteína de superfície que atua como um disfarce imunológico, sendo considerada um potente
fator de virulência. A diversidade do gene spa consiste no número de pequenas sequências de
repetições (repeats) contidas na região X, onde a diversidade da região SSR parece surgir da
deleção e duplicação de repetitivas unidades e também por pontos de mutação. Um código alfa
numérico é atribuído a diferentes repetições, definindo a ordem de repetições específicas como
tipos de spa. Devido a uma região interna de repetições curtas variáveis em tandem, que variam
tanto em números em número, quanto a substituições de nucleotídeos dentro das unidades de
30
repetição individuais, faz com que esse locus seja altamente polimórfico (HAMSEN et al.,
2003; AGIUS et al., 2007; MEDIAVILLA, et al., 2012).
A análise da sequência da região da proteína A (spa typing) (Figura 3) fornece um
método rápido e preciso para discriminar Staphylococcus aureus isolados de surtos e alimentos,
sendo possível relaciona-los epidemiologicamente (KORSEN et al., 2004).
Figura 3: Esquema da técnica de spa typing.
Fonte: www.applied-maths.com
3.6.3. Tipagem por Eletroforese em Campo Pulsado PFGE
A técnica de PFGE, que está representada abaixo na Figura 4, tem sido utilizada em
trabalhos para tipificação de um grande número de organismos Gram-negativos, Gram-
positivos e espécies de micobactérias (BLANC et al., 2001) com resultados positivos para
determinação da fonte bacteriana em surtos de intoxicação alimentar estafilocócica e em
investigações epidemiológicas e genéticas. É utilizada com diferentes propósitos genéticos e
epidemiológicos e permite comparar e classificar isolados, estimar o tamanho do genoma de
cada cepa e analisar a relação genética entre essas cepas (MARTÍN et al., 2004).
O PFGE consiste na digestão do genoma total bacteriano com enzimas de restrição
(em S. aureus, geralmente usa-se a SmaI, por exemplo), seguida de eletroforese em uma cuba
com campo pulsátil (que permite a discriminação de bandas de alto peso molecular). O padrão
de bandas gerado (pulsotipo) pode ser analisado visualmente ou através de softwares
31
específicos (TENOVER et al. 1995; CHURCH et al., 2011). Essa técnica é utilizada para
identificar o parentesco dos isolados em contextos epidemiológicos restritos.
Figura 4: Esquema da técnica de PFGE.
Fonte: www.applied-maths.com
32
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Origem, obtenção das amostras e identificação fenotípica de S. aureus
Foram realizadas coletas em seis laticínios dentro do Estado de São Paulo em um
raio de até 200 quilômetros de Campinas (Figura 5), sendo três laticínios orgânicos e três
convencionais com duas coletas em cada. .
Figura 5: Região onde foram selecionados os laticínios para realizar as coletas.
No Quadro 1, são apresentados os pontos de coletas e quantidade de amostras
realizadas durantes as visitas em cada laticínio, como amostras de ordenhadeira (quando a
produção de leite está no mesmo lugar que o processamento do queijo), da linha de
processamento (forma, lira, mesa de enformagem, caixa de armazenamento de queijo, estante
de estocagem, piso, ralo), salmoura, coágulo, manipulador, leite cru, leite pasteurizado e do
queijo Minas frescal.
As amostras foram retiradas de acordo com as condições dos laticínios e
disponibilidade dos funcionários e proprietários. Para leite cru e pasteurizado foram coletadas
amostras de pelo menos 1 litro.
33
Quadro 1: Pontos de coletas e quantidade de amostras realizadas durantes as visitas em cada
Laticínio.
Foram realizadas 12 coletas, sendo duas coletas em cada laticínio. A identificação
dos laticínios (A a F), número da coleta considerando o total de 12 realizadas (1 a 12) e tipo de
laticínio (orgânico e convencional) estão apresentados no Quadro 2.
Quadro 2: Identificação das coletas e tipo dos laticínios
Para a análise das amostras de leite e queijo, foram medidos 25 mL e 25 g,
respectivamente, em seguida as amostras foram homogeneizadas em 225 mL de água
tamponada esterilizada, em sacos plásticos apropriados, que foram levados ao homogeneizador
por trinta segundos. Para a análise de utensílios, equipamentos, área e manipuladores foram
coletados amostras por swab, e em ambiente grande utilizou molde em superfície de 100 cm².
34
A partir da diluição inicial de cada amostra, foi preparada uma série de diluições decimais,
utilizando-se solução salina (0,9%) (LANCETTE & BENNETT, 2001).
Para a identificação e enumeração de Staphylococcus aureus apresentando na
Figura 6, foram utilizadas placas contendo Baird Parker Agar (BPA) suplementado com solução
de gema de ovo com telurito de potássio. A partir de cada diluição seriada, um volume de 0,1
mL foi adicionado sobre a placa e espalhadas com alça de Drigalski. Em seguida, as placas
foram incubadas a 37ºC por 48 horas. Após a incubação, foi realizada a contagem da placa que
apresentar entre 25 e 250 UFC (Unidades Formadoras de Colônias). Foram consideradas
colônias suspeitas de S. aureus as que apresentaram cor negra, com ou sem halo (Figura 6) e
um máximo de três colônias foram isoladas e repicadas para tubos com BHI Agar inclinado,
que foram incubados por 24 horas a 35 ºC. Foram realizados os testes da produção de catalase
e coloração pelo método de Gram. Após estes testes iniciais, foi realizado o teste da coagulase
em tubo (LANCETTE & BENNETT, 2001).
Figura 6: S. aureus em placa de Baird Parker Agar.
4.2. Identificação genotípica de Estafilococos Coagulase Positiva e S. aureus
4.2.1. Extração do material genético
Para a extração do DNA, os isolados positivos para o teste de coagulase foram
inoculados em Caldo BHI (Brain Heart Infusion), em seguida uma alíquota do cultivo foi
estriadas em BHI Agar. Foi adicionada uma colônia em um microtubo 1,5 mL contendo 1 mL
de água Miliq estéril, seguindo para centrifugação, 12.000 rpm, durante 1 minuto. O
sobrenadante foi descartado e o pélete foi submetido à metodologia de extração de DNA
conforme recomendações do fabricante do reagente comercial “InstaGene Matrix” (BIO -
RAD).
35
4.2.2. Identificação molecular do gene coa
A reação para a identificação do gene coa foi realizada empregando os
oligonucletídeos (Tabela 1) descritos por Aarestrup et al.(1995).
Para o mix da reação de PCR foram utilizados 5µL de Buffer 5X, 0,5 µL de
desoxinucleotídeo (dNTP) (10 mM), 1U de Taq Polimerase (GoTaq® Hot Start Polymerase,
Promega Corporation, Madison, EUA), 2 µL de DNA, 1 µL de cada primer (10pmol), 2,0 µL
de MgCl2 (25mM) e água ultrapura (Milli-Q, Millipore, EUA) esterilizada, para completar um
volume final de 25 μL.
Os fragmentos de DNA amplificados foram analisados por eletroforese em gel de
agarose 1,5% (m/v), em tampão TBE 0,5x (Tris Base 1M- Ácido Bórico - EDTA 0,5M pH
8,0) por 60 minutos a 100 V e foi aplicado um padrão de peso molecular de 100 pb (Promega).
Os géis foram visualizados após coloração com Syber Safe (Invitrogen) e fotografados sob
luz UV em transiluminador e capturados com o sistema UVI-1D (Uvitec
Cambridge).
Como controle positivo da reação foi utilizada a cepa S. aureus ATCC 23235.
Tabela 1: Oligonucleotídeos iniciadores e condições da reação para detecção do gene coa
Oligonucleotídeo iniciador Sequência (5´ 3´) Condições da reação
COAG2
ACCACAAGGTACTGAATCAACG 95 °C/5 minutos
95 °C/30 segundos
55 °C/2 minutos 40 ciclos
72 °C/ 4 minutos
72 °C/10 minutos
COAG3
TGCTTTCGATTGTTCGATGC
Fonte: Aarestrup et al., (1995).
4.2.3 Identificação molecular de Staphylococcus aureus
Para identificação da espécie S. aureus entre as cepas coagulase positiva foram
utilizados os oligonucleotídeos iniciadores apresentados (Tabela 2) e as condições descritos
por Sasaki et al., (2010).
A reação de amplificação do fragmento do gene S. aureus foi realizada contendo
5µL de Buffer 5X, 0,5 µL de desoxinucleotídeo (dNTP) (10 mM), 1U de Taq Polimerase
(GoTaq® Hot Start Polymerase, Promega Corporation, Madison, EUA), 2 µL de DNA, 1 µL
36
de cada primer (10pmol), 2,5 µL de MgCl2 (25mM) e água ultrapura (Milli-Q, Millipore,
EUA) esterilizada, para completar um volume final de 25 μL.
Os fragmentos de DNA amplificados foram analisados por eletroforese em gel de
agarose 1,5% (m/v), em tampão TBE 0,5x (Tris Base 1M- Ácido Bórico - EDTA 0,5M pH
8,0) por 60 minutos a 100 V e foi aplicado um padrão de peso molecular de 100 pb (Promega).
Os géis foram visualizados após coloração com Syber Safe e fotografados sob luz
UV em transiluminador e capturados com o sistema UVI-1D (Uvitec Cambridge).
Tabela 2: Oligonucleotídeos para identificação de S. aureus.
4.3. Detecção de genes para produção de enterotoxinas
Para todas as cepas foram realizadas a pesquisa por PCR convencional dos genes
associados com a produção das enterotoxinas (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei e sej) (Tabela
3). As reações de amplificação dos fragmentos dos genes que codificam enterotoxinas foram
realizadas contendo tampão para a reação PCR foram 5µL de Buffer 5X, 0,2 mM de cada
desoxinucleotídeo (dNTP), 1U de Taq Polimerase (GoTaq® Hot Start Polymerase, Promega
Corporation, Madison, EUA), 2 µL de DNA molde, 1 µL de cada primer (10pmol), água
ultrapura (Milli-Q, Millipore, EUA), esterilizada, para um volume final de 25 μL. A
concentração de MgCl2 (variou) de acordo com a Tabela 3. As reações foram realizadas em
termociclador nas seguintes condições: 94 °C/5 min de desnaturação inicial, 94 °C/2 min
desnaturação, temperatura de anelamento e a quantidade de ciclos variavam de acordo com o
primer, 72 °C/1 min de extensão; extensão final de 72 °C/7 min. Os controles positivos
utilizados foram ATCC 13565 (sea), ATCC 14458 (seb), ATCC 19095 (sec), ATCC 23235
(sed, seg, sei, sej), ATCC 27664 (see), FRI 361 (seh).
37
Tabela 3: Oligonucleotídeos para investigação de genes de virulência de S. aureus
4.4. Tipagem molecular e caracterização genética
4.4.1. Tipagem por agr typing
O locus agr em S. aureus possui quatro grupos agr (I, II, III e IV) que foram
detectados por amplificação utilizando os oligonucleotídeos iniciadores mostrados na Tabela
4.
As reações de amplificação dos fragmentos do genes de agr foram realizadas
contendo 5µL de Buffer 5X, 0,5 µL de desoxinucleotídeo (dNTP) (10 mM), 1U de Taq
Polimerase (GoTaq® Hot Start Polymerase, Promega Corporation, Madison, EUA), 2 µL de
DNA, 1 µL de cada primer (10pmol), 1,5 µL de MgCl2 (25mM) e água ultrapura (Milli-Q,
Millipore, EUA) esterilizada, para completar um volume final de 25 μL. As cepas controles
positivos utilizada foram COL (agr I), N315 (agr II) e MW2 (agr III). Foram realizadas
reações para o agr IV sem controle positivo.
38
Tabela 4: Oligonucleotídeo iniciadores e as condições da reação para tipagem do locus
agr.
4.4.2. Tipagem por spa typing
Para a tipagem por spa typing, foi realizada a amplificação por PCR do fragmento
variável da região polimórfica do gene spa que encontra-se na Tabela 5, seguida de purificação
do produto.
As reações de amplificação do fragmento do gene spa foram realizadas contendo
tampão para a reação com 10µL de Buffer 5X, 0,4 mM de cada desoxinucleotídeo (dNTP), 2U
de Taq Polimerase (GoTaq® Hot Start Polymerase, Promega Corporation, Madison, EUA),
3µL de DNA molde, 2 µL de cada primer (10pmol), 3,0 µL de MgCl2 (25mM) e água ultrapura
água ultrapura (Milli-Q, Millipore, EUA) esterilizada para um volume final de 50 μL. Após a
corrida em gel do produto da reação foi realizada a purificação.
Para a purificação foram adicionados ao produto da reação 60 μl de isopropanol
75%. Seguiu-se incubação por 15 min/temperatura ambiente e centrifugação por 20 min/13500
rpm/4 °C. O sobrenadante foi retirado e a seguir foram adicionados 500 μl de etanol 70 %.
Procedeu-se a nova centrifugação por 15 min/13500 rpm/4 °C. Após remoção do sobrenadante,
o pellet foi seco por aproximadamente 2 horas/37°C e em seguida foi ressuspendido em 20 μl
de água Miliq esterilizada. As amostras purificadas foram enviadas para sequenciamento pelo
método de Sanger em serviço terceirizado no Centro de Biologia Molecular e Engenharia
Genética (CBMEG), localizado na Universidade Estadual de Campinas – Unicamp. O
sequenciamento do produto obtido e análise dos resultados foram realizados de acordo com as
recomendações da página “www.ridom.com”.
39
Tabela 5: Sequências dos oligonucleotídeo iniciadores e as condições da reação para
tipagem da região spa.
4.4.3. Tipagem por PFGE
A tipagem por PFGE foi realizada em todos os isolados de S. aureus obtidos nas
amostragens, utilizando a enzima de restrição SmaI (New England, BioLabs, EUA). O DNA
celular para realização da técnica de PFGE foi preparado segundo protocolo estabelecido por
McDougal et al. (2003) e adaptado pelo Laboratório de Bacteriologia do Instituto Adolf Lutz
(IAL, São Paulo).
As amostras foram incubadas em 5 mL de caldo BHI por 18- 24 horas, logo uma
alíquota de 700µL foi transferida para um microtubo de centrífuga de 1,5 mL e centrifugada
por 2 minuto a 7.000 rpm. A seguir, o sobrenadante foi desprezado, as células foram
ressuspendidas em 1 mL de solução tampão de TE (Tris Cl 0,1 M, NaCl 0,15 M, EDTA 0,1 M)
e novamente centrifugado. As células lavadas foram ressuspensas em 0,3 ml de tampão EC
autoclavado (Tris 6 mM Cl, NaCl 1 M, EDTA 0,1 M, 0,5% Brij 58, desoxicolato a 0,2%,
Sarkosil a 0,5%), após foram adicionados 2,0 µL de lisostafina (1mg/mL) (Sigma Aldrich,
USA). Após homogeneização, 300µL de agarose low melting (Bio Rad, EUA) 2% dissolvida
em solução de TE foram acrescentados. Foram homogeneizados e distribuídos em moldes para
preparação dos plugs em temperatura ambiente cerca de 10-15 minutos (Bio Rad, EUA).
Os plugs quando solidificados foram removidos dos moldes e adicionados em placa
contendo 3 mL de tampão de lise EC (6 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5% Brij-
58, 0,2%de Deoxicolato de sódio, 0,5% de N-Lauroylsarcosine [pH 8,0]) e incubados a 37 °C
por 1 hora. Em seguida, descartou-se o tampão e adicionou-se 3 mL de tampão TE com
incubação a 55 °C por 1 hora para lavagem dos plugs, o tampão foi removido e substituído por
3 mL de TE para o armazenamento dos plugs em placa a 4°C até a utilização.
Para a digestão restritiva um pedaço do plug foi cortado, foi utilizada a enzima Fast
Digest Sma I (BioLabs, Inglaterra), que cliva o DNA cromossômico. Em um eppendorf
40
contendo 45 μL de solução tampão de restrição 1X foi transferido um plug, foi mantido a
temperatura ambiente por 30 minutos. Após a remoção do tampão, foram acrescidos 45 μL de
reação com 20 U de enzima Sma I. (20U/45l) e incubados a 25°C por 4 horas, o DNA digerido
foi mantido a 4 °C até o momento da corrida. Em seguida, preparou-se o gel de agarose 1%
(Pulsed Field ultra pure DNA grade [Bio Rad, Espanha]) em tampão TBE 0,5X pH 8,0. Os
plugs foram introduzidos no pente e fixados com a agarose (1%), após o alinhamento dos plugs
e do peso molecular, verteu-se a agarose no molde cuidadosamente, e quando solidificado o
pente foi retirado da agarose e o gel foi submetido à eletroforese em campo pulsado com os
seguintes padrões de corrida: pulso inicial: 5s; pulso final: 40s; voltagem: 200 V ou 6 V/cm;
tempo: 20 horas; ângulo: 120° e temperatura: 14 °C. O gel foi corado com solução Brometo de
Etídio 10 mg/ml e descorado com água destilada até obter boa nitidez. Em seguida o gel foi
fotografado no e a imagem capturada, sob luz UV, em equipamento fotodocumentador modelo
Gel Doc XR (Bio Rad, EUA). O marcador de peso molecular Lambda Ladder PFGE Marker
(New England, BioLabs, EUA) foi utilizado em todas as análises.
4.5. Análise dos resultados
Devido ao baixo número de isolados, as análises dos resultados foram de forma
descritiva para caracterizar os laticínios participantes e a diversidade microbiológica das cepas
isoladas. Caracterização dos isolados quanto aos genes produtores de enterotoxinas, agr type e
o spa type. As análises dos resultados dos isolados foram fundamentadas nas frequências e
comparações dos dados obtidos de média e porcentagem, a partir do SAS versão 9.3 (SAS
Institute, Cary, NC), em nível de significância de 0,05.
Os perfis eletroforéticos da técnica de PFGE foram analisados utilizando-se o
software de bioinformática BioNumerics (Versão 6.0, Applied Maths, Bélgica). Foram
considerados os agrupamentos realizados pelo método de Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic Mean (UPGMA) com amostras que apresentaram coeficiente de similaridade de
Dice ≥80%, com otimização de 0,5% e tolerância de 1,25%.
41
5. ASPECTOS ÉTICOS
Este projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa, uma vez que se tratou
de pesquisa com seres humanos. Todavia, foram garantidos os critérios da resolução nº
466/2012 (BRASIL, 2012). O projeto foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da
Unicamp com o número do parecer: 1.383.294. O documento consta no Anexo 1.
42
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES
6.1. Isolamento e Identificação fenotípica
Foram considerados isolados positivos no teste de coagulase os que apresentaram
resultados de 1 a 4 cruzes, afim de não subestimar quantidade de S. aureus isolados. A partir
do teste bioquímico de coagulase foram isoladas 198 cepas de Estafilococos coagulase positiva
(ECP), 84 (42,4%) de laticínios orgânicos e 114 (57,6%) de convencionais.
Dos 144 isolados que apresentaram 1+ para o teste de coagulase, 58 isolados foram
positivos para o gene coa, ou seja, mesmo a apresentação do mínimo de coágulo é possível que
a cepa possua o gene e o mesmo tenha sido expressado de forma fraca no teste fenotípico.
6.2. Identificação genotípica
Dos 198 isolados foi amplificado gene coa em 93, a partir desses foram
identificadas 38 S. aureus sendo 18 (47,3%) de laticínios orgânicos e 20 (52,6%) de laticínios
convencionais. Sendo, 9 isolados de ambiente (lira, mesa, piso, ralo, tanque de coagulação)
(23,7%), 8 isolados de leite cru (21,0%), 1 de leite pasteurizado (2,6%), 17 de queijos (44,7%),
1 de manipulador (2,6%),1 de salmoura (2,6%),1 de coágulo (2,6%).
A presença de S. aureus em leite pasteurizado e em queijo pode indicar problema
na pasteurização ou a ocorrência de recontaminação após o tratamento térmico, devido a falhas
nas boas práticas higiênico-sanitária (O'BRIEN et al., 2009).
Abaixo na Tabela 6 está representado a quantidade de isolados a partir do teste de
coagulase, os isolados identificados com o gene coa e os S. aureus confirmados pelo
oligonucleotídeo nuc. Em um estudo de Medeiros et al. (2013), os pontos de coletas de amostras
que apresentaram maior frequência de isolamento de estirpes de Staphylococcus aureus foram
das mãos do manipulador (19,5%), leite cru do tanque de recepção (14,6%), tanque de expansão
de estocagem do leite cru (12,2%) e o leite cru do tanque de estocagem (12,2%).
43
Tabela 6: Quantidade de isolados e S. aureus identificados pela origem das amostras
Para a identificação dos isolados foram aplicadas as seguintes convenções, por
exemplo: isolado C1A5; Coleta 1 (C1), Laticínio A(A), número da colônia (5); outro exemplo
C7D1; coleta 7 (C7), Laticínio D (D), número da colônia (1). Ressaltando que os laticínios
orgânicos são os A, B e C, e os convencionais D, E e F.
Na Figura 7, está apresentado o gel de identificação de S. aureus, no primeiro poço
o marcador genético de 100bp, no segundo poço a cepa ATCC 23235 utilizada como controle
positivo, seguindo do controle negativo da reação e um isolado positivo de cada coleta
realizada, com exceção da coleta 9, onde não foi identificado nenhum S. aureus. O tamanho da
banda é de 359 pb.
44
Figura 7: Gel para identificação de Staphylococcus aureus isolados em laticínios orgânicos e
convencionais. LADDER – marcador genético de 10 0pb. ATCC 23235 – controle positivo da reação
de S. aureus nuc (359bp), CONT N - controle negativo da reação sem DNA, isolados (C1A5, C2B4,
C3C4, C4D23, C5C20, C6B15, C7D1, C8A25, C10E1, C11F15 e C12F1).
Abaixo no Gráfico 1, pode-se observar que 40,86 % das cepas estafilococos
coagulase positivas (ECP), foram identificadas como S. aureus, sendo que o laticínio F
apresentou a maior porcentagem de cepas identificadas com 80,0% e o laticínio B apresentou
apenas 22,2%. Porém o número de amostras do laticínio B foi superior ao do F, sendo 46 e 37
amostras, respectivamente.
Gráfico 1: Proporção de cepas de S. aureus identificadas em relação à quantidade cepas com o gene
coa. Sendo as variáveis gene coa e S. aureus em números absolutos e a variável Gene coa/S. aureus
em porcentagem.
0102030405060708090
100
Laticinio
A
Laticinio
B
Laticinio
C
Laticinio
D
Laticinio
E
Laticinio
F
Total
Gene coa 10 27 13 25 8 10 93
S. aureus 3 6 9 10 2 8 38
Gene coa/ S. aureus 30,00 22,22 69,23 40,00 25,00 80,00 40,86
Qd
e d
e ce
pa
s
Proporção de S. aureus identificados dos ECP
45
6.3. Detecção de genes para produção de enterotoxinas
Dos 38 S. aureus identificados, 34 (89,47%) apresentaram genes codificadores de
enterotoxinas investigados na presente pesquisa. Em relação às enterotoxinas clássicas, foram
identificados apenas o gene da seb em 7 isolados (18,42%). Por outro lado, genes de
enterotoxinas não-clássicas foram identificadas em pelo menos 31 isolados, os genes das seg
foi encontrado em 25 isolados (65,8%), seh em 5 (13,1%), sei em 18 (47,3%) e sej em 8
(21,0%). No Quadro 3, está apresentado a relação dos isolados com seus respectivos genes
identificados.
No estudo realizado por Rall et al., (2014) dentre os 15 S. aureus isolados de leite
de vacas ou vacas saudáveis com mastite subclínicas apenas o gene sea foi identificado, porém
está presente em todas as cepas isoladas, diferente do presente trabalho onde não houve a
identificação do gene sea. Em trabalho realizado por Medeiros (2013), no processo de produção
do queijo Minas frescal em micro-usina do Estado de São Paulo, cepas de Staphylococcus
aureus potencialmente toxigênicas isoladas, foram identificadas quanto aos genes da sea, seb,
sec e sed dentre os isolados. Nesse presente trabalho a seb está distribuída em 18,4% dos
isolados, já no trabalho de Medeiros em 8% dos isolados.
Os genes seg e sei foram identificadas em leite, queijo e ambiente totalizando em
15 isolados (39,4%), apresentando com maior frequência em isolados oriundos de queijo 7
(46,7%). De forma geral o gene sei está distribuído de forma uniforme entre os laticínios e o
seg está com uma frequência relativamente mais alta nos convencionais, sendo identificada em
16 isolados, enquanto que nos orgânicos em nove isolados.
No estudo realizado por Johler et al., (2015), forneceram mais evidências sugerindo que
uma das enterotoxinas ou uma combinação de SEG, SEI, SEM, SEN e SEO causam intoxicação
alimentar estafilocócica. Uma vez que todas as amostras de queijo retiradas dos domicílios dos
pacientes após um surto na Suíça, apresentaram resultados negativos para as enterotoxinas
clássicas SEA-SEE. Assim, 3 cepas de S. aureus foram selecionadas para posterior
caracterização por microarray de DNA para testar não apenas os genes que codificam as
enterotoxinas clássicas (sea-see), mas também os genes que codificam as enterotoxinas recém-
descritas (seg, seh, sei, sej sek, sel, sem, sen, seo, sep, seq, ser, selu). Os únicos genes de
enterotoxina detectados pelo DNA microarray foram os genes do cluster do gene da
enterotoxina seg, sei, sem, sen e seo. Os surtos foram causados pelo consumo de queijo de cabra
cru e queijo de cabra semi-duro. A partir disso esses surtos fornecem evidências de que
enterotoxinas estafilocócicas recém-descritas são susceptíveis de causar intoxicação alimentar
estafilocócica em seres humanos.
46
Recentemente outro surto ocorrido na cidade de Osaka, no Japão em maio de 2016,
em uma festa de almoço realizada em uma casa do grupo de idoso foi descrito por Umeda et
al., (2017) As características genotípicas de 18 isolados de S. aureus associados ao surto
transmitido por alimentos foram: nenhum isolado produziu SE clássica, em relação as
enterotoxinas não clássicas apresentaram presença de 20 genes SE / SEl, 17 isolados de 18
isolados foram encontrados os genes seg, sei, sem, sen, seo e selu.
Os genes seg e sei foram encontrados em todos os isolados do laticínio F menos no
isolado C11F3. Segundo Jarraud et al. (2001), o conjunto de genes de enterotoxina (egc),
incluindo seg, sei, selm, seln, selo e selu estão no mesmo cluster genético, cuja propriedade
emética é incerta mas com atividade superantigênica comprovada. Devido a isso a seg e sei são
normalmente encontradas juntas nos isolados. Apenas o isolado C11F19 oriundo do queijo
Minas frescal (laticínio convencional) possui quatro genes de enterotoxinas sendo o seb, seg,
sei e sej. Foram isolados S. aureus toxigênicos portadores do gene seg em todos os laticínios
com exceção do A.
O trabalho de Liu et al. (2014) demonstrou que o gene seh foi o mais prevalente em
298 S. aureus isolados de vacas com mastite, nesse estudo o seh foi encontrado em 13,16% dos
isolados. Além disso, casos de surtos mostraram que a SEH é um risco para saúde pública uma
que vez que pode causar intoxicação estafilocócica, como em surto ocorrido em 2000 na cidade
de Osaka, onde acreditavam que a intoxicação alimentar foi causada devido a pequenas
quantidades de enterotoxina estafilocócica A (SEA) em leite reconstituído. Porém, no estudo
realizado por Ikeda et al., (2005), os resultados indicaram claramente que a SEH também estava
presente no leite reconstituído, indicando que a intoxicação alimentar foi causada por
estafilococos produtor de múltiplas enterotoxinas. Em 2003 outro surto também ocorrido no
Japão foi descrito por Jørgensen, et al., (2005), foram isolados S. aureus do leite da fazenda que
havia sido fornecido para o preparo do purê de batata. Os isolados de purê de batata e leite foram
positivos para o gene que codifica a enterotoxina H estafilocócica (seh), e a toxina protéica
correspondente, SEH, foi detectada por ELISA no purê de batata. A produção de SEH por
isolados de S. aureus de purê de batata (n = 4) e leite em massa (n = 4) também foi demonstrada
por ELISA. Realizou-se o PFGE e revelou que os padrões de bandas eram indistinguíveis entre
isolados de ambas as fontes. Parece provável que o leite bovino cru utilizado na preparação de
purê de carne continha S. aureus que posteriormente produziu SEH suficiente na purê de batata
para causar intoxicação alimentar.
Nos isolados dos laticínios orgânicos a sej não foi identificada, enquanto que o seh
foi encontrado apenas nesses laticínios. No trabalho realizado por Rodrigues et al., (2017a), em
47
S. aureus isolados de planta de processamento de queijo, no Brasil, dentre as 22 enterotoxinas
estafilocócicas pesquisadas o seh foi o mais encontrado, sendo detectado em 62% dos isolados
e os genes da sed, see, não foram identificados. Em relação o seh o mesmo ocorreu no estudo
de Ferreira et al., (2016), em queijo Minas frescal artesanal e industrial comercializados no sul
e Goiás, no qual a seh foi detectada em 11 isolados (37,9%) e dentre as enterotoxinas clássicas
apenas o sec foi encontrada com 3,4 % das amostras de queijo.
Em estudo realizado por Rodrigues et al. (2017b) 52 isolados de plantas de
processamento de queijos (85.7% dos isolados), apresentaram resultado positivo para 1 ou mais
gene de enterotoxinas. Os genes de enterotoxinas observados foram para o seh (59,2%), seb
(4,1%), seg (51,0%); sea, sec, sed, see e sei não foram identificados. Em 7 isolados não foram
identificados genes produtores de enterotoxinas.
Na Figura 8, estão apresentadas as enteroxinas estafilocócias clássicas (sea, seb,
sec, sed e see), primeiro o marcador genético de 100 pb, em seguida a sea com controle positivo
a ATCC 13635, o controle negativo sendo a reação sem DNA e 2 isolados que apresentaram
resultado positivo para o gene. Em seguida a seb com o controle positivo, controle negativo e
2 isolados positivos. Em seguida sec, sed e see.
48
Figura 8: Identificação de enterotoxinas clássicas (sea, seb, sec, sed e see) em gel de agarose. LADDER
– marcador genético de 100pb. ATCC 23235 – controle positivo para a reação de sea (120bp), CN-
controle negativo da reação sem DNA, isolados (C7D1 e C11F15)- ATCC 14458 - controle positivo
para a reação de seb (478bp), CN- controle negativo da reação sem DNA, isolados (C5C20 e C10E1) -
ATCC 19095 - controle positivo para a reação de sec (257bp), CN- controle negativo da reação sem
DNA, isolados (C5C20 e C6B20) - ATCC 23235 - controle positivo para a reação de sed (317bp), CN-
controle negativo da reação sem DNA, isolados (C8A25 e C11F21)- ATCC 27664 - controle positivo
para a reação de see (209), CN- controle negativo da reação sem DNA, isolados (C2B4 e C6B11).
Na Figura 9, está apresentado o gel das enterotoxinas não - clássicas (seg, seh, sei
e sej), no primeiro poço está o marcador genético, seguido do controle positivo ATCC 23235,
controle negativo sendo reação sem DNA e 4 isolados que apresentaram a presença do gene. E
assim sucessivamente para os genes seh, sei e sej.
49
Figura 9: Identificação de enterotoxinas não-clássicas (seg, seh, sei e sej) em gel de agarose.
LADDER – marcador genético de 100pb. ATCC 23235 – controle positivo para as reação de seg(287bp),
CN- controle negativo da reação sem DNA, isolados (C2B4, C5C20, C7D1 e C11F15) - FRI361 -
controle positivo para a reação de seh (213bp), CN- controle negativo da reação sem DNA, isolados
(C6B11, C6B15, C6B20 e C6B21) - sei (454bp) CN- controle negativo da reação sem DNA, isolados
(C2B4, C5C20, C7D1 e C11F15) - sej (142bp), CN- controle negativo da reação sem DNA, isolados
(C7D13, C7D16, C7D19 e C11F19).
6.4. Tipagem agr typing
O gene agr I foi encontrado em 5 isolados (13,2%), agr II em 11 (29,0%), agr III
em 17 (44,7%), agr IV em 3 (7,9%) e não foi possível identificar o gene agr em 2 isolados
(5,3%). Para a confirmação do gene agr IV foi realizado o sequenciamento, pois não
possuíamos o controle positivo. Jarraud et al. (2002) relatam que cepas que possuem os agr I e
agr II causam, preferencialmente, doenças mediadas por enterotoxinas, como a intoxicação
alimentar, e que o grupo agr III está relacionado com a síndrome do choque tóxico. Jarraud et
al. (2001) descreveram que as cepas pertencentes ao grupo agr IV estão envolvidas com a
produção de exotoxinas exfoliativas, envolvidas na síndrome da pele escaldada. Estudos
também relataram que o grupo agr I é prevalente entre os isolados de mastite, e os grupos agr
II e agr III parecem estar mais associados a isolados com resistência a antimicrobianos
(MOISE-BRODER et al., 2004; VAUTOR et al., 2007).
50
Abaixo na Figura 10, apresenta os agr types identificados entre os isolados.
Figura 10: Identificação agr types em gel de agarose. LADDER – marcador genético de 100pb. COL –
controle positivo para a reação de agr I (440bp), CN- controle negativo da reação sem DNA, isolados
(C3C4, C5C21 e C10E1) - N315 - controle positivo para a reação de agr II (572bp), CN- controle
negativo da reação sem DNA, isolados (C4D23, C5C20 e C11F16) -, MW2 - controle positivo para a
reação de agr III (406bp), CN- controle negativo da reação sem DNA, isolados (C6B11, C7D1 e C7D36)
- agr IV (588bp), CN- controle negativo da reação sem DNA, isolados (C2B4, C8A30 e C10E4).
Nos laticínios orgânicos o agr mais identificado foi o agr III, e os isolados estão
concentrados nos laticínios B e C (orgânicos).
Nos laticínios convencionais as quantidades do agr II e agr III identificados foram
de 8 e 9, respectivamente, portanto podemos considerar que eles estão distribuídos de forma
uniforme. De acordo com os relatos anteriormente descritos (MOISE-BRODER et al., 2004;
VAUTOR et al., 2007), há possibilidade desses isolados apresentarem maior resistência à
antimicrobianos. Como reporta o estudo realizado por Silva et al., (2013), com isolados de
Staphylococcus aureus susceptível a meticilina (MSSA) oriundos de vacas leiteiras com
mastites, foram identificados os agr I, II e III. Os tipos de agr que apresentaram maior
frequência no estudo de Silva et al. (2013) foram o II e III, sendo 41,1% e 48,2%
respectivamente; resultado similar ao encontrado no presente estudo onde o agr III foi mais
encontrado em 44,7% dos isolados.
Em um trabalho realizado por Fabres-Klein et al., (2015), S. aureus isolados a partir
de mastite bovina, se distribuiram da seguinte forma entre os tipos de agr I (12/54), II (34/54),
III (6/54) e IV (2/54). Como nesse presente trabalho foi possível identificar S. aureus do grupo
agr IV.
51
No trabalho realizado por Rodrigues et al., (2017b) os genes de agr identificados
entre os 42 S. aureus isolados de vacas leiteiras com mastite foram o I (11.9%) e II (88.1%).
No estudo realizado por Soares et al., (2017), com 55 Staphylococcus aureus
oriundos do leite bovino de mastite subclínica no estado do Rio de Janeiro, a maioria dos
isolados (45/55) foram identificados com o agr II em 18,2% (10/55) isolados não foi possível
identificar o agr type. Em relação ao presente trabalho 5 isolados oriundos do leite cru
apresentaram o agr III, sendo 2 de laticínios orgânicos e 3 de convencionais.
6.5. Tipagem spa typing
Foram identificados 14 spa types diferentes, o mais frequente foi o t021 em 8
isolados (21,0%), sendo que 6 foram do laticínio F (convencional). Em seguida o t127 foi
identificado em 5 isolados (13,1%) todos do laticínio B, o t1062 em três isolados (7,9%), o t012,
t13730, t1546, t2155, t2734 e t318 cada um em dois isolados (5,3%), e o t084, t189, t433, t605
e t693 foram identificados cada um em 1 isolado (2,6%) (Tabela 7).
Não foi possível identificar o spa em 5 isolados (13,2%). Segundo o trabalho de
Bhati et al., (2016) foram isolados 38 S. aureus de vacas com mastite subclínica e um isolado
também não produziu nenhum produto amplificado para o gene spa. No estudo realizado por
Shakeri et al., (2010), de 208 isolados de S. aureus MRSA e MSSA provenientes de laboratórios
e hospitais no Irã, três estirpes de S. aureus sem gene spa foram isoladas urina humana.
No trabalho de Rodrigues et al. (2017a), os S. aureus isolados de planta de
processamento de queijo foram tipados com os seguintes os spa types, t002 (1,14%), t008
(5,68%), t021 (1,14%), t037 (3,41%), t064 (6,82%), t114 (1,14%), t127 (22,72%), t128
(2,27%), t177 (2,27%), t267 (1,14%), t318 (1,14%), t521 (4,54%), t605 (32,95%), t777
(1,14%), t922 (1,14%), t4158 (4,54%), t5605 (1,14%), t6367 (2,27%), e um novo tipo, t14969
(3,41%). O t127 foi o segundo mais encontrado em ambos os trabalhos, sendo que, no trabalho
de Rodrigues et al. (2017a) o t605 foi o mais observado (32,9%), e no presente trabalho foi
encontrado em apenas um isolado (2,6%). Ao contrário, nesse estudo, o t021 foi o mais
encontrado com 21,05%, enquanto foi observado em apenas 1,14% dos isolados no trabalho de
Rodrigues et al. (2017a).
Na Figura 11, estão os fragmentos amplificados de alguns isolados de cada coleta e
na Tabela 7 os isolados com seus respectivos spa types.
52
Figura 11: Gel de amplificação do gene spa em S. aureus isolados. Tamanho de bp variável. LADDER
– marcador genético de 100pb. ATCC 23235 – controle positivo da reação, CN- controle negativo da
reação sem DNA. Isolados e seus respectivos spa types: CIA5 –t2734, C2B4- t2155, C3C4-t2734,
C4D23-t318, C5C20-t1546, C6B11-t127, C7D1-t012, C8A25-t605, C10E1-t189, C11F19-t1062 e
C12F6- NI - não identificado.
53
Tabela 7: Frequência dos Spa types encontrados.
A partir da tipagem pode se observar que dentre os isolados dos laticínios orgânicos
existem 8 spa types diferentes enquanto que nos convencionais a quantidade é menor com 6
spa types.
No laticínio B todos os isolados foram de queijos, apenas o isolado da primeira
coleta (C2B4) possui spa e agr diferente dos demais isolados, sendo t2155 e IV,
respectivamente. Os isolados da segunda coleta apresentam agr III, spa t127 e o gene da seh.
No Laticínio C, foi identificado dois isolados com o mesmo spa t13730, sendo
isolado de manipulador e do queijo Minas frescal.
No trabalho de Rodrigues et al., (2017b), os spa identificados entres os 42 S. aureus
isolados de vacas leiteira com mastite o mais frequente foi o t605 (83,3%), em seguida foram o
t267 (9.5%), t521 (4.8%) e t9129 (2.4%).
Os spa types t091, t127 e t701 foram implicados em surtos de intoxicação alimentar
na China (Yan et al., 2012), e os tipos t127 e t084 foram implicados em isolados de SFP
(Intoxicação Alimentar Estafilocócica) da Alemanha (Wattinger et al., 2012). No estudo
realizado por Jeffery et al., (2015), em portadores de S. aureus, 13 tipos de spa types presentes,
três tipos de spa de predominaram: t189 (45,8%), t127 (14,6%) e t338 (12,5%).
No trabalho realizado por van Duijkeren et al., (2014), foram isolados S .aureus de
gado leiteiro com a finalidade de avaliar a prevalência de MRSA. Dentre os 16 isolados MRSA
identificados não foi encontrado uma cepa com spa type t021, contudo dentre os 39 isolados de
MSSA um foi identificado com o spa type t021.
Em um caso de surto descrito por Fetsch et al., (2014), em abril de 2013, uma
intoxicação alimentar causado por enterotoxinas estafilocócicas (SEs) no sorvete ocorreu em
54
Freiburg, na Alemanha, as cepas de S. aureus enterotoxigênicos isoladas de sorvete e casos
humanos eram do mesmo tipo de spa (t127), e portadora do gene do sea.
Em trabalho realizado por Basanisi et al., (2017), foram isolados 484 cepas de S.
aureus de leite e produtos lácteos no sul da Itália, sendo 40 (8,3%) de MRSA que foram
caracterizadas por tipagem de spa, os tipos mais identificados foram t355 (27/40; 67,5%),
seguido de t899 (8/40; 20%), t108 e t127 (2/40; 5%) e t688 (1/40; 2,5%). Sendo nesse presente
trabalho o spa t127 foi o segundo mais prevalente encontrado em (5/38; 13,2%).
Em um trabalho sobre genes superantigênicos com isolados oriundos de humanos
realizado por Holtfreter et al., (2007), foi analisada a distribuição de S. aureus isolados da
Pomerânia Ocidental no Nordeste da Alemanha oriundos de colonizações nasais e de cultura de
sangue, o tipo de spa t012 era predominante nas cepas de origem nasal, enquanto que t021 foi
o tipo de spa mais frequente no sangue. Nesse trabalho o spa type t012 encontrado no coágulo
(1/2) e na mesa de enformagem do queijo (1/2), enquanto que o t021 foi encontrado em 8
isolados de S. aureus oriundos do ralo(1/8), piso (1/8), leite cru (4/8) e queijo Minas frescal
(2/8).
Um surto ocorrido em quatro hospitais em Berlim foi descrito por Layer et al.,
(2015). Foram analisados um total de 213 recém-nascidos, 123 profissionais de saúde e 205
pais recém-nascidos no período de novembro de 2011 a novembro de 2012 e identificaram que
trinta e quatro isolados foram caracterizados como estirpe de surto pertencentes ao spa t021,
esse isolado foi caracterizado como um MSSA, capaz de produzir a toxina do choque tóxico-1
e enterotoxina A. A estirpe foi encontrada em dezessete neonatos (dos quais dois morreram de
síndrome do choque tóxico), quatro profissionais de saúde e três pais envolvidos no surto.
Abaixo no Quadro 3, estão apresentados os 38 S. aureus identificados e com seus
respectivos genes encontrados, assim como os genes produtores de enterotoxinas, os agr types
e o spa type.
55
Quadro 3: Isolados e os seus genes de enterotoxinas e tipagem por spa e agr.
ISOLADOS ORIGEM sea seb sec sed see seg seh sei sej Agr
type
Spa
type
C1A5 Ambiente (Piso Câmara fria) - - - - - - - - - I t2734
C2B4 Queijo - - - - - - - + - IV t2155
C3C4
Ambiente (Tanque de
coagulação)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
I
t2734
C4D23 Queijo - - - - - + - - - II t318
C4D26 Queijo - - - - - + - - - III t318
C5C4 Manipulador - - - - - - - - - I t13730
C5C6 Leite Cru - - - - - + - + - III t021
C5C7 Leite Cru - - - - - + - + - III t021
C5C15 Queijo - - - - - + - - - III t433
C5C17 Queijo - + - - - + - + - II t1546
C5C19 Queijo - - - - - + - + - II t084
C5C20 Queijo - + - - - + - + - II t1546
C5C21 Queijo - - - - - + - + - I t13730
C6B11 Queijo - - - - - + + - - III t127
C6B15 Queijo - - - - - - + - - III t127
C6B19 Queijo - - - - - - + - - III t127
C6B20 Queijo - - - - - - + - - III t127
C6B21 Queijo - - - - - + + - - III t127
C7D1
Ambiente (Mesa de
enformagem)
-
-
-
-
-
+
-
-
+
III
t012
C7D5 Coágulo - - - - - - - - + III t012
C7D9 Ambiente (Ralo) - - - - - + - - + III t021
C7D13 Leite Cru - - - - - + - - + III t021
56
C7D16 Ambiente (Piso Câmara fria) - - - - - + - + + III t021
C7D17 Leite Cru - - - - - + - - - III t021
C7D19 Leite Cru - - - - - + - - + III t021
C7D36 Queijo - - - - - - - - + III t021
C8A25 Leite Cru - - - - - - - - - NI t605
C8A30 Ambiente (Lira) - + - - - - - + - IV t2155
C10E1 Leite Cru - + - - - + - + - I t189
C10E4 Leite Cru - - - - - - - + - IV NI
C11F3 Salmoura - + - - - - - - - NI NI
C11F15 Ambiente (Lira) - - - - - + - + - II t1062
C11F16
Ambiente (Mesa de
enformagem)
-
+
-
-
-
+
-
+
-
II
t1062
C11F19 Queijo - + - - - + - + + II t1062
C11F21 Queijo - - - - - + - + - II t693
C12F1 Queijo - - - - - + - + - II NI
C12F6 Leite Pasteurizado - - - - - + - + - II NI
C12F8 Ambiente (Lira) - - - - - + - + - II NI
NI- Não Identificado
57
6.6. Tipagem por PFGE
Os fragmentos de DNA foram digeridos pela enzima de restrição Sma I, obtendo-
se 32 perfis determinados pela técnica de PFGE, conforme apresentado na Figura 12. Apenas
do cluster G, encontrado isolado tanto no laticínio E quanto no F. Nos demais os perfis foram
diferentes a cada laticínio e com variedade dentro do próprio laticínio. No total foram 17 cluster
diferentes, um com 5 isolados, um com 4, dois com 3, quatro com 2 e nove com 1.
Dos 32 perfis, 4 clusters apresentaram 2 clones com similaridade a 100%, sendo
eles do cluster B: os isolados C5C17 e C5C20, oriundos de queijos; cluster D: os isolados
C6B11 e C6B21, oriundos de queijos; do cluster G: C11F3 e C12F1, oriundo de salmoura e
queijo, respectivamente; cluster N: os isolados C5C6 e C5C7, oriundos de leite cru.
58
Figura 12: Dendrograma PFGE. Dendrograma criado a partir do padrão eletroforético por PFGE de
amostras de S. aureus (coeficiente de similaridade de Dice >80%, otimização de 0,5%, tolerância de
1,25%; método de clusterização: UPGMA).
91.7
85.2
68.6
85.7
63.5
92.6
70.3
95.7
95.5
94.2
68.0
59.6
57.8
51.2
60.9
49.9
95.2
82.1
79.7
66.9
94.7
74.5
63.4
54.7
50.9
47.2
PFGE
100
80
60
PFGE
10
.00
20
.00
40
.00
10
0.0
0
15
0.0
0
20
0.0
0
25
0.0
0
30
0.0
0
40
0.0
0
50
0.0
0
80
0.0
0
kb
AGR
AG
RI
AG
RII
AG
RIII
AG
RIV
Key
C11F15
C11F19
C11F16
C5C17
C5C20
C5C15
C5C19
C6B11
C6B21
C6B19
C6B20
C11F3
C12F1
C12F8
C12F6
C10E4
C7D17
C11F21
C8A25
C8A30
C7D13
C7D19
C7D9
C7D36
C7D16
C5C6
C5C7
C7D1
C7D5
C10E1
C1A5
C2B4
SpaType
t1062
t1062
t1062
t1546
t1546
t433
t084
t127
t127
t127
t127
NI
NI
NI
NI
NI
t021
t693
t605
t2155
t021
t021
t021
t021
t021
t021
t021
t012
t012
t189
t2734
t2155
Origem
ambiente
queijo
ambiente
queijo
queijo
queijo
queijo
queijo
queijo
queijo
queijo
salmoura
queijo
ambiente
leitepast
leitecru
leitecru
queijo
leitecru
ambiente
leite cru
leite cru
ambiente
queijo
ambiente
leite cru
leite cru
ambiente
coágulo
leitecru
ambiente
queijo
PFGE
A
A
A
B
B
C
C
D
D
D
F
G
G
G
G
G
H
I
J
K
L
L
L
L
M
N
N
O
O
P
Q
R
59
Nos laticínios orgânicos, no laticínio A, os 3 isolados apresentaram perfis
diferentes. No B, o C2B4 isolado da primeira coleta, apresentou perfil diferente dos isolados da
segunda coleta. Na segunda coleta foi analisado o perfil de 4 isolados oriundos de queijos e que
possuem o mesmo agr e spa-type, 3 foram agrupados em um mesmo cluster (D) e um em um
cluster diferente (F), portanto ocorreu uma discriminação entre eles pelo método. No C, os
isolados C5C6 e C5C7 de leite cru tiveram o mesmo perfil (N), os isolados dos queijos
apresentaram dois perfis diferente sendo 2 do cluster (B) e 2 do cluster (C).
Já nos convencionais, na segunda coleta no laticínio D, foram identificados quatro
clusters diferentes entres os isolados, sendo o perfil de 4 isolados, oriundos de leite cru (n=2),
ambiente (1) e queijo (1), agrupados em um mesmo cluster (L). No E, os 2 isolados
apresentaram perfis diferentes, nos clusters P e G. Na primeira coleta no laticínio F, 3 isolados
com o mesmo agr e spa-type estão no cluster (G) sendo de origem ambiental e de queijo. Os
isolados C11F15 e C11F16 são oriundos de lira e mesa respectivamente, e C11F19 de queijo.
Com isso pode-se considerar que devido à falta de higienização correta dos equipamentos e
utensílios utilizados no processamento ocorreu uma contaminação cruzada durante o corte do
coágulo, pois utiliza-se a lira e/ou durante a enformagem do queijo, que é realizada na mesa.
Na segunda coleta do laticínio F os três isolados, possuem o mesmo agr e estão no mesmo
cluster (G) sendo eles os C12F1, C12F6 e C12F8, oriundos de queijo, leite pasteurizado e lira
respectivamente. Nesse caso, a contaminação do queijo pode ter ocorrido por duas fontes: a
bactéria que sobreviveu ao tratamento térmico ou pela lira utilizada no corte do coágulo,
reafirmando a sanitização inadequados dos utensílios utilizados no processamento.
Nesse mesmo laticínio, o isolado da primeira coleta o C11F3 oriundo da salmoura
está no mesmo cluster que os isolados da segunda coleta, sendo também a salmoura um dos
principais pontos de contaminação. A troca da salmoura é realizada a cada 4 meses de uso, isso
contribui com a contaminação dos queijos após o processamento.
No trabalho de Ferreira et al., (2016) uma amostra de queijo continha quatro
isolados que, embora agrupada no mesmo cluster, apresentou pulsotipos distintos, diferentes
susceptibilidade e perfil de virulência. Isso corrobora e evidencia com esse presente estudo que
durante o processamento da cadeia do queijo, a contaminação pode ocorrer de várias fontes, tanto
proveniente do leite, ambiente de produção, bem como do manipulador de animais ou alimentos.
Não foi possível identificar o gene agr do isolado C5C17, porém ele está no mesmo
cluster com 100% de similaridade que o C5C20 que é portador do agr II, além de apresentarem
os mesmo genes codificadores de enterotoxinas e spa-type t1546.
60
A partir dos resultados do trabalho de Souza (2010), onde foram isolados S. aureus
de diferentes pontos do fluxograma de produção de leite, os autores sugeriram que os
procedimentos usuais de higiene adotados durante a ordenha, a limpeza e a desinfecção dos
utensílios e dos equipamentos nas propriedades, não foram realizados adequadamente.
A combinação de PFGE com PCR é uma ferramenta importante para o diagnóstico
epidemiológico, bem como para entender os padrões de transmissão de patógenos e fontes de
possível contaminação de alimentos (SAID et al., 2010). Assim, as associações entre os grupos
agr, spa-type junto com o perfil genético dos isolados por PFGE pode evidenciar de uma forma
mais clara a relação entre os isolados.
Nesse presente trabalho foram identificados 14 spa types e 17 clusters diferentes.
Esta observação confirmou que a técnica de PFGE é o método de tipagem de maior poder
discriminatório para S. aureus, uma vez que se baseia em todo o genoma do isolado,
corroborando com achados de outros autores (SILVEIRA FILHO, 2007; SANTOS, 2009).
Contudo, a metodologia é demorada, laboriosa e onerosa (HWANG et al., 2010), além da
dificuldade de ser interpretados os dados, sendo necessária uma análise visual detalhada e
subjetiva dos resultados (TENOVER et al., 1995).
61
7. CONCLUSÃO
A quantidade de isolados foi parecida entre os laticínios convencionais e orgânicos
com 20 e 18 isolados, respectivamente. Em relação aos gene codificadores de enterotoxinas foi
possível perceber que, os genes das enterotoxinas clássicas foram pouco identificados enquanto
que o genes das novas enterotoxinas apresentaram maior quantidade. Portanto, devido a
identificação dos genes, há um potencial risco de intoxicação na ingestão desses produtos.
Foram encontrados isolados dos quatro grupos de agr, sendo o agr III apresentando
em maior quantidade.
O número de spa-type apresentou diversidade com 14 tipos diferentes. O spa-type
mais encontrado nos queijos foi o t127, esta que já foi relacionado a surtos.
Os resultados obtidos no spa-type e PFGE corroboram na identificação dos principais
pontos de transmissão das estirpes de S. aureus, como a salmoura, utensílios (lira), leite cru e
pasteurizado utilizados para produção do queijo Minas frescal.
Logo, a partir dessas informações, é necessário e possível estabelecer
Procedimentos Operacionais Padrões (POPs) de limpeza e sanitização das plantas de
processamento. Afim de garantir a qualidade na produção de alimentos, e de promover a
segurança alimentar dos consumidores.
62
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ANEXOS
Anexo 1
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81
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83
84
