UNIVERSIDADE DE SXO PAULO

INSTITUTO DE FlSICAE QUlHICA .DE SXO CARLOS

"SELKTIVIDADE IONICA NA LIGAc;XO

DO tON C'ALCIO A .(CIDOS NUCI£ICOS:

o EFKITO DA ESTRUTURA SECUNl)(RIA

E DE COSOLVKNTKS"

SE~YIC;:O OE 81BLlOTECA E INFORMA<;,1,O - 'FoseF1SICA

rr="IC'? UNIV~RSIDADE~~ DE SAO PAULOInstituto de Fisica e Quimica de Sao Carlos Fone (0162) 72-6222

Fax (0162) 72-2218

Av. Dr. Carlos Botelho, 1465Caixa Postal 369CEP 13560.970 - Sao Carlos· SPBrasil

MKKBROS DA COMISSAO JULGADORA DA TKSK DK DOUTORADO DK Marcelo Andres Fossey APRKSKN1ADA AOINS111U70 DE lISICA E QUIKICA DE SAO CARLOS, DA UaIVERSlDADE DE SAO PAULO, IK 30/09/1992

______~_: ~~1:_~:? _Profa.Dra.Rosetar, Sanches

A minha filhaMarcela

determ1nantea da 1ntera9ao de ae1doa nuele1eoa eom eapee1ea

1en1eaa em aolu:;:ao,a ligli9ao do cation bivalente Caz+ a eata

z+moatraramque a intera9ao do ea: aoa aeidoa nucleieoa dependem

SE:?\f Ic;:OOESI B L lOT tC:AE--I-~JFoiM~A<;: A 0 _

F Is Ie A

fundamental factors that govern the interaction of nucleic acids2+with ions in solution. The bonding of divalent cations (Ca) to

these macromolecules was examined under different physical andchemical conditions. The natural nucleic acids, and synthetic polydeoxyribonucleotides (poli(dA-dT), poli(dG-dC», and syntheticpoly ribonucleic acid poli(rI).poli(rC) were utilized to determinethe influence of the sequence and secondary structure, factorswhich modulate the interactions of ligands from ions to proteins

The thermodynamic Parameters obtained from theinteraction of these polymers in the presence of monovalent ionssuch as Na+, K+ and Li+ which behave as electrolytic supports wereobtained by the method of multiple equilibrium and were analysedby poly electrolytical models: condensation of counter and celularmodels. These results indicate that the interaction of ea2+ withnucleic acids strongly depends on the ionic species of thesupporting salt and the primary and secondary structures of themacromolecule. An additional factor of importance is themacromolecule and ionic hydrations.

CAPITULOCAPITULO ICAPITULO II

T1 TULO PAGINAiNTRO~AO .... . . . . . . . 01MATERIAlS K ~TODOS • • . . . . • . . . • 092.1.lntrodU9~o 102.2. Materiaia . . . • . . . . . .. 102.3. H? todo de Preparat;~ 0 daa Amoatraa •.. 112.4. H?todoa de Medidaa . • • . • . . 122.5. H?todo de Caracterizay~o do Indicador

MetalocrOmico Tetrametilmurexida (TMM).. 132.5.1. H?todo da Difere~a entre aa

Abao!'9i:Sea ... . • . . . . . .. 162.5.2. H?todo da Razao . . . . • . . .. 192.6. Metodo de Determinay~o daa Conatantea

Aparentea de Liga9ao do calcio aoaPol1meroa: Kz(O)' ••••••

2.7. Metodoa Computacionaia Uaadoa noProceaaamento doa Dadoa Kxperimentaiae na Implementa;ao doa ModeloaTe6ricoa . . • . . .

MODE LOS TK6 RIcas .......•. . . .3.1. IntrodU9~o . . . . . ....3.2. Modelo de Condenaay~o de Contra!.ona3.3. Modelo Celular . . • . . . . . . . .3.3.1. Equat;ao de Poiaaon-Boltzmann (EPB)RESULTADOS' E DISCUS~ES . . . . . . . . .4.1. IntrodU9~o ...•..•....••..4.2. Eatudo da Seletividade Ionica de Acido

Nucleico Natural em DiferenteaConcentrayi:Sea de Eletr6lito SuporteNaCl (Fo!'9a Ionica) .•...•.•.• 47

4.3. Eatudo da Seletividade Ionica do DNA coma Eapecie do Eletr6lito Suporte .•.. 58

4.4. Katudo da Dependencia da Ligayao Ca-NaDNAcom a Temperatura . . . . . . .

4.5. Infl~ncia da Eatrutura Secundaria naSeletividade Ionica ..••••••

232526263133

4546

CAPITULO V

AP£:NDlCE 1

4.5.1. Composi~~o de Bases. . . . . . . . . . 744.5.2. Tipo de Conformo.~~o:A e B . . . . . • 754.6. Infl~ncio. do Cosolvente no.

Seletividade Ionico. . • . . . • • . • 784.7. ~lise dos Resultados Kxperimento.is

Segundo 0 Modelo de CondensBY~o deContra1ons e 0 Modelo Celular .... 84

CONCWS'KS •••••••• • • • • • • • 98

. . . . . . . . . . . . . . 1011. Determina~~o do.Constante Aparente de

Liga~~o do calcio 0.0 THH (~NN) ••••• 1021.1. Fo~a Ionica e Kspecie Ionica .. . . 1021.2. Temperatura .... . . . . . . . 1051.3. Cosolvente . . . . . . . . . . . 108

Neata introd~ao faremoa um apanhado hiat6rico daa

principaia peaquiaaa que contribuiram para que ae conheceaae acorrelac;:aoentre conformac;:aoe fun:;ao doa acidos nucleicos. 0grande numero de dUvidas que exiatem na atualidade sabre osmecaniamos fisico-quimicos que regulam as propriedadee deetaemoleculae foi a principal motiv~ao deete trabalho.

Ae peequieae fundamentaie que reaultaram nadescoberta doe acidoe nucleicoe foram realizadae par FRIEDERICHMIKSCHKR (Davidaon, 1957), coneiderado como 0 fundador dabioqtdmica do nucleo celular. Em 1868 MIKSCHKR isolou 0 Ducleo decelulaa ret1radas do pus, e obaervou que 0 mater1al nuclearcont1nha um raro compaeto de f6eforo, e em 1872 moetrou que"cabe;:ae"de eaperma de salmon cODt1nham um composto acido,1dent1ficado como ac1do nucleico. Em pesquiaaa poaterioreaobaervou que a preaeD9a deatea ac1doa da-ae em d1ferentea tipoa decelulae e tecidoa, concluindo que oa acidoa nucleicoa ~oconatituintea naturaia de celulaa e tecidoa.

ALTMANN, em 1889 (Davidaon, 1957) , deacreve um~todo para a obteD9ao de acidoa nucleicoa de tecido animal elevedo aem proteina, paia oa acidoa nucleicoa eram anteriormenteobt1doa aaaociadoa com proteinaa. A Partir do trabalho de ALTMANN,variaa tecnicaa de obteD9ao e purificac;:aode acidoa nucleicoa ~odeaenvolvidaa, aaaim como melhorea fontea fornecedoraa de acidoanucleicoe sao identificadaa, entre ae quaie ee deataca 0 timo debezerro.

A 1dent1ficayao do acido nucleico comoev1denciada cODvincentemente a

o materialPartir doe

experimentos sabre transforma;ao bacteriana realizados em 1944 por

AVERY e Col. (Avery, 1944). Estes demonstraram que 0 acido

nucleico isolado de uma especie de pneumococo podia entrar em umaoutra 1inhagem ~ 0 capaulada e podia converter essa segunda numalinhagem produtora de capsula.

Quando foi compreendido, no in1cio dos anos 50, queas proteinas e ~o 0 material genetico, eram produtos dos genesiniciou-se a procura pelo elo entre as linguagens dos doispolimeros: as linguagens dos acidos nucledcos e as das proteinas.

A identifica;ao do acido desoxiribonucleico (DNA)com 0 material genetico e 0 estabelecimento de sua estrutura emhelice dupla padem ser considerados os pontos iniciais nocrescimento na nova disciplina da Biologia Molecular.

WATSON e CRICK (Watson, 1953, 1968; Crick, 1954)conseguiram juntar as pee;as do enorme quebra-cabe;:as de dadosobtidos par varios pesquisadores, ao propar ~o somente umaestrutura para os acidos nucleicos, como tambem indicaram como 0

DNA poderia duplicar-se para permitir a continuidade hereditAriadurante a divi~o celular. Adaptando dimene::sese formas denucleotideos a partir da estrutura da citosina obtida par FURBKRG(Furberg, 1951), WATSON e CRICK propuseram um modele no qual ospares de base adenina e timina (A-T) e citosina e guanina (C-G)s~o ligados par pantes de hidro~nio, 0 que justificava aaobservaeyoes feitaa por CHARGAFF (Zamenhof, 1952) e GULLAND(Gulland, 1947), empilhando-se numa eatrutura de dupla-helice com10 pares de bases par volta, na qual a distAncia de empacotamentoe de 3.4 A, conforme dados obtidoa par ASTBURY (Astbury, 1947) eWILKINGS (Wilkins, 1953). Esta conforma;~o e conhecida comoconforma~~o B (Saenger, 1988).

Com 0 desenvolvlmento de novas tecnicasexperimentais~ equipamentos e ~todos utilizados na determina~~o

de estruturas de acidos nucleicos, verificou-se que os acidosnucleicos podem asaumir diferentes conforma;~es~ Benda estasagrupadas em 3 f~lias principais: A~ B e Z (Saenger~ 1988).

Os acidos ribonucleicos (RNA) ~o encontradossomente em duas conform~~es correlatas~ A e A'~ constituindo afamilia A de estruturas de dupla ~lice. Em fo~a ionica baixa, nafaixa de valores fisio16gicos~ a conforma;~o A apresenta 11 paresde bases por volta completa de ~ lice. Entretanto, se aconcentra;:ao de sal do meio onde se encontra 0 pollmero foiaumentada aclma de 20%~ a conforma:;:~oA transforma-se naconforma~~o A'~ com 12 pares de bases (Arnott~ 1964). Dadosreferentes a detalhes geo~tricos da estrutura de dupla ~liceA-RNA e A'-RNA foram obtidos de pollmeros sinteticos, tais comopoli(rI).poli(rC) e poli(rA).poli(rU) (Chambelin~ 1965; Arnott,1972) .

Enquanto 0 RNA~ tanto 0 natural quanto 0 sintetico,sob uma grande variedade de condi~~es experimentais, apresenta-sefP sob duas formas A e A', 0 DNA pode adotar varios tiposdiferentes de conforma;~es dependendo das condi~~es experimentais,como especie de contr~on~ concentrayao e especie do eletr61itoBUporte~ hidratay~o e composi~ao e de bases.

As conforma;~es apresentadas pelo DNAclsssificadas nas seguintes familias: A~ sando 0 A-DNA unicorepresentante ~ com caracteristicas conformacionaissemelhantes ao A-RNA; B~ com os tipos B~ C, D~ E e T-DNA.destas conforma:;:~esde dupla ~lice a direita~ uma variedade com

muitoAlem

Variaa evi~nciaa moatram uma eatreita interliga;~oentre a forma e a funy~o doa acidos nucleicoa. :ua tam~mevi~nciaa de que 0 ambiente i6nico em que se encontram oa acidoanucleicoa e determinante na manute~~o da forma e,conaegUentemente, tem algum papel na determina;~o da funy~o dosacidoa nucleicos.

Para estabelecer a natureza das fOr9asna manute~~o da eatrutura e estabilidade dos acidosforam realizadoa varioa estudos f1sico-quimicos dasconformacionaia.

Aa transit;C5eaordem-desordem dos acidos nucleicoasao caracterizadas por uma grande entalpia positiva e varia;~o deentropia. Kntretanto, a interpreta;~o destas mudan;:astermodi~micas nao e facil. FOr9as hidrof6bicas, pontes dehidrogenio, inter~~o de empilhamento de bases (base-staking),intera;C5es eletrostaticas e entropias conformacionais ~o ascontribuit;C5esprincipais dos fen6menos observados. No entanto, suaimportAncia relativa e de dif1cil acesso.

o alto grau de complexidade do sistema, entretanto,dificulta 0 conhecimento de qual destas intera;C5es determina amanute~~o de uma dada conforma;~o destes pol1meros. Resultadosexperimentais tem mostrado que 0 ambiente ionico no qual 0

pol1mero se encontra e muito importante na manute~~o da suaconformay~o e configuray~o (Anderson, 1982). 0 ambiente ionico temse mostrado modulador de varios fen6menos biol6gicos nos quaisocorre interay~o de ligante com acidos nucleicos. Om exemploimportante destes fen6menos e a intera;~o de proteinas com acidosnucleicos, que ocorre tanto na replica;~o, quanto na regula;~o daexpresaao ganica (Record, 1985). Estes fen6menos biol6gicos,

nucleicos,transit;C5es

f1sico-quimicamente.

Apeaar da liger:;~ode lons aos Acldos nucleicos ser

pouco compreendida. seu papel como intermediArio na liger:;~o de

protei nas comacidos nucleicos. tem Bide reconhecido por varios

autores (SissoEioff. 1976; Pezzano. 1980). Recentemente. estes

estudos ~m demostradoque as camadas de hidratay~o dos Acidos

nucleicos desempenhamumimportante papel na ligay~o de ligantes e

na seletividade observada (Texter. 1978; Saenger. 1987; Westhof.

1988)•Varlos modelos e teorias foram propostos para

descrever esta complexaintera;~o entre ions e acidos nucleicos.

Os modelosde ordem-desordem. usados comsucesso na analise da

estabilidade termodi~mica de polipepti deos (Poland. 1970). ~o

sao perfeitamente adequadosao estudo da estabilidade de acidos

nucleicos. pois ~o levamemconta a intera;~o eletrostatica de

longo alcance. e esses poll meros apresentam um forte carater

polieletroll tico.

Assim. a intera;~o de ions com polieletr61itos

lineares tem sido estudada principalmente atraves de t~s

modelos: 0 modele de condensa;~o de contra-i ona proposto

inicialmente por OOSAWA(Oosawa. 1971) e desenvolvido

posteriormente por HANNING(Manning. 1974. 1978); 0 modele

celular. que envolve a solu;~o da equa;:~o de Poisson-Boltzmann

(Katchalsky. 1971; Klein. 1981; Granot. 1983; Le Bret. 1984); e 0

oalculo da distribui~~o de contra-ions ao redor do polieletr6lito

atraves de simula;:~o de MonteCarlo (Devarajan. 1988; Jayaram.

1990; Schaefer. 1990; Anderson. 1990).As caracteristicas conformacionais. relativamente

-'vgeral. e ante a rigides apresentada par estes biopoll meros. 0 que

adquiridos da PHARHACIA FINK CHEMICALS.o indicador metaloc~mico TKTRAMKTIuroREXIDA ('rHH).

A concentray~o ds BOlur~o SquOBS de CaClz (Merck)utilizada nas titulaye5es. foi determinada par KspectroBCopis de

-iapreaentando eondutividade ele-trieade ~ 2.()..lO •

A eondutividade ele-trieadaa amoatras e da agua

intercalados com intervalos de borbulhamento de Hz. diminuindo-aedesta forma a formac;:~ode radicais livres. Durante 0 proeesBO deaon1cac;:~o,0 reeipiente eontendo 0 pol1mere fo1 mant1do em banho aO°C.

o et-DNA son1eado foi eentrifugado em centrifugarefriserada durante aproximadamente 1 hora a 15000 rpm e a 4°C.

+Na •

foram filtradas em filtros Hilipore .25J..tm.e armazenadas em

recipientes de poliuretano a -20°C.

todos os caBOSanalisados a concentra;:~o de sal suporte XCI (Cs) e

muito maior que a concentra;~o de grupos carregadoB dOB pollmero

(Cp) e a concentr8!;=~odo 10n bivalente titulante (Cz) ( Cs ~ 50Cp

e Cs ~ 25Cz). Aaalm. a f0Z'98 l6nlca 14-(2Cs+6Cz+Cpr'~ serA

aproxlmadamente19ual a concentrar~o de sal auporte (Cs). pols as

concentr8Y~ea de.1ona monovalentea 11beradoa palo poll mere' e a

~TODO DE CARACTKRI~XO DO INDICADOR HET~MlCO

TKTRAMKTluroREXIDA (TMM)

lig~~o do calcio ao THM.Como sera mostrado abaixo. 0 J~todo

utilizado consiste em determinar a concentrar~o de ~leio

calcular 8 frar~o de calcio ligada ao poll mero.

o indicador metalocr6mlco TMM

lons bivalentes (~ 1J.lM). e grande eatabilidade

lig~~o ao ea++ numa grande faixa de

(8pro~imadamenteentre 4 e 10) (Ohnishi. 1978).

Figura 1: Kstrutura doTetrametilmurexidatrabalho.

indicador(THH) ,

metalocrOmicoutilizado neste

f&490

f f 0 0A -& C +& C-'1590 - ~90 TMW ~90 TMM

f 0onde &A e &A sao oa coeficientea de extiD9~o molar do corantelivre e ligado, respectivamente, no comprimento de onda A, e <MWe CO sao as concentrac;CSeade corante livre e complexada com 0

TMM

r 8400 Hol-1 -1 b 20000 Hol-1 -1£ - em £ = em-

" .PO .PO

r 13800 Hol-1 -1 b 8420 Hol-1 -1 (3)£ em £ = em530 530

b - J(CTN1i; [THH ] e a eoneentra;~o de THHlivre (G

TMM) e

eoneentra;:~o de caleio livre (c:) _ Kataa eoneentra;oes podem aer

eaeritas em fun:;:~o da fra;:~o IF de caleio eomplexada ao THH, da

eoneentra;:~o total de THH (CTMM) e da eoneentra;:~o total de caleio

na solu;:~o (Cz). Asaim, temos:

[THHCa.+] =IF CTMW

[THH-] = (1~) C (6)TWW

[ea++] = Cz - IF CTWW

K...MM como:

IF

(l-IF ) [C2

-IF CTMM

]

,\

calcio na BoluYao (C ) e a concentra;ao de TMH(C ), determinar2 TMM

a valor de IfTMM-

Na determin8l;ao da fra;ao de calcio complexada ao

molar (£A.) no comprimento de

Figura 2: Espectro de abso~ao 6ptica referente ati tulac;ao CaCl

2• Condic;e5es experimentais

referentes ao expectro mostrado nests figura:-~

C = 6.23 10 H, T = 290K, I = 10mH NaCl.TNN

(Ao)' durliDte a titula9~o (A) e a absorc;:~o correspondente ao

sistema com0 corliDte totalmente complexado com0 cAlcio (As). As

absorc;:eles~o dadas por:

Ao- f

CT••••- £X

Af <.... b b= £X + £X CT•••• (8)

As bCT••••= £'A

- AoIF= ---~-~

(Cz-fF CT••••)~ Cz. Logo, pode-se reescrever a equac:;:~o(7) como:

in (K,. •••• )IF= in ( 1-1F) + in [1/ Cz ]

IFe. atrave s do gra fico in ( 1-1F) x in [l/Cz]' obtem-se 0 valor de

K,..... ' que corresponde a extrapolac:;:~opara Cz---+ 1.

extrapol~~o envolvida. As titul~~es r-nvolvemconcentr~~o ~ximade CaClz• que e da ordem de 1.0mH. portanto a extrapolacr~o

envolvida e grande.Kste ~todo e bastante simples. mas apresenta uma

limitac;:ro.inerente ao corante. Foi observada pequena variCll;~onosvalores da abso~~o 6ptica nos dois comprimentos de onda nodecorrer do experimento. sando esta variacr~omaior A medida em que

Verificou-se que. quando a medida e feitaininterruptamente por periodos inferiores a uma hora. a diminuic;:roda abso~~o Eo muito pequena. Kntretanto. em titulacr~es maisdemoradas. como quando se realizam as titul~eses com os pollmeros.ou quando se estuda a depenciencia de K..-NM com a temperatura. asvariac;C5esna abso~~o ~o auficientes para criar um artefato querepresenta uma quantidade de aproximadamente 100~H de calcio.levando a aubestimar a fra9~o de calcio complexada e.conseqtientemente. a aubestimar 0 valor de KTNN

Embora as abso~eses nos dois comprimentos de ondavarie com 0 tempo e com 0 aumento da temperatura. a r~o entreelas se mantem constante (figura 3) OJ fazendo com que esta fonte deerro (conforme discutido no 1tem anterior) seja minimizada quandose usa a ra~o entre as abso~C5es para determinar a constante de

o procedimento experimental utilizado e

ao descrito no item anterior. com a difereD;a que asemelhante

abso~~o e

£t [THH-] + £b [THHCa+]_ 4PO 4PO

£f [THH-] + £b [THHCa+]530 530

b(£4PO-

eo posB1vel obter os valores de KT

•••• (equR9~o 7) para

R=A490 / A530

A490

rn 0.40~<

120 180TEMPO (MIN)

Figura 3: Variac;:~oda Abeorc;:~o6ptica do TMM em fun;:~odo temPO~ em doie comprimentoa de ondadiferentea: 490 e 530 nm; e a r~o entre aaAbaorc;:~eaneatea doia compr1mentoa de onda.Condic;:~eaexperimentaia:C

T•••• = 66. 71JM~T = 298K~ I = 10mM NaCl.

W::TODO DE DKTKHHINA<:;A:ODAS CONSTANTES APARKNTK DE

LIGA<:;A:ODO CALCIO AOS POL! HEROS: K2

(0)

condi~~o de foI'9a ie>nica e temperatura. AUquotas de CaCl2

de

concentrac:;~o conhecida ~o adicionadas a solur~o e, a partir da

concentrac;~o de calcio livre na solur~o <C:), atraves da rel8;~o:

R £f £f::sao 490

< £b R cb )K490 ::SsoTMM

cf- IF C2 TMM

e we e 8 eoneentr8~~0 de caleio eomplexado 80 THH.TN"

B1 tloB de "llSBTi:o" do poll mero ocupadoBPelo 10n blvalente: 82

-

bC IC , onde C eo 0 valor da concentrac;:~ode mo~meroe ou grupoe2 P P

Scatchard (Scatchard, 1949) (8 Ie! ve 82) e a

2 2

de 821< para valoree de 8

2tendendo a zero, fornece

o valor da constante aparente de llga9i:o do calcl0 ao poUmero

(K2(O», ou em graflcoe de 1/8

2x lIe: ' onde a interee;i:o com 0

fornece 0 valor de lIK2(O).

DADOSEXPKRIMKNTAIS K IHPLKMENTA<;AO DOS MODKLOS

TK6RlCOS

(K,. •••• ) com a fol";a 16nica, e a depen~ncia de K,.ww com a

temperatura, ambaena prese~a ou ~o de cosolvente para oe

Bleam, 1980; Anderaon, 1978, 1982) envolve a aol~~o da equa;~o dePoiaaon-Boltzmann (RPB), uma equ89~o diferencial ~o linear de 2~ordem. Rata equ~~o pade aer deaenvolvida num aiatema de equ~~eadiferenciaia de 1~ ordem, e tranaformado num problema de valor

(Hanning. 1969). 0 modelo celular (Poisson-Boltzmann) (Katchalsky.

1971) e as modific~~es por IPS introduzidas na solu;~o da EquS9~o

parte dos ! ons se condensam num volume Vb nas vizinh~ aa do

poll! on ate 0 ~metro de carga ~ atingir 0 valor l/Z (onde Z e a

ligados. tendo liberdade de deslocamento no volume Vb-

26

zq

£kTb

{ =ef

torne-se igual a unidade. Nessa expres~o 8~ representa a fr&;~ob bde contra1ons ligados ao POlil on (8~= C~/Cp)' Benda C~ a

concentr&Y~ode contra1 ons ligados ao poll mero e C a concentr&;~op

~ f > l/Z., aendo Z. a val~ncia do 10n conaide"rado.. ~ ~

relaclonada a troca de contra!ona em Vb e na aolu:;:~o.Definindo a energia livre de Gibba reduzida por

GI'\. R T

onde I'\. e 0 numero de molea de grupoa carregadoa do polllon(grupoa foafato no caao de Acidoa nucleicos) eRe a constante

onde Sel e a enersia livre aaaociada a repul~o

condensados, e Q. e a energia livre associada ao mov~ento dos--m~x

Q . (ligados) + Q . (livrea) + Q . (aolvente)--m\.x --m~x --m\.x

~\.x= 6t In(6t/Vb) + 62 In(62/Vb)

+ 6t)n( 10-3<) + (C:/C

p) In (10"'-8<)

+ 62

onde 6 = CbIC representa a frarao de lons bivalentes "ligados"2 z p-

por grupo fosfato, C: Eo a eoneentrarao molar de lons bivalentes

"ligados" e c: a eoncentra<;ao molar de lons livres.-to para-metro K (em em ) Eo 0 inver so do eomprimento

-c c.l. l.

grupo fosfato, Eo dado, na aproxima:;:ao em que Ct

» Cp e Ct

» Cz'

Hin~izando a energia livre total em rela;~o a 6 et

6 , satisfazendo a eondi.:;ao que a quantidade total de lons2

bivalentes na solu;ao Eo fixa, ou seja dCz/d92

= -Cp' obtem-se:

In( e Ie! )= 2 In (e Ie )Z Z 1 1

Newton-Raphson): para umpar de valores de c: e c: ' atribuindo um

valor para ez na

encontramos um novo ez

No limite de ez tendendo a zero, temos que:

11m (e /d) = K (0)e -+ 0 z Z 2Z

onde K2(0) representa a constante aParente de ligB.9~o entre 0 ion

bivalente e 0 polil on, e So proporcional ao trabalho por grupo

(livre) para 0 volume de condensay~o Vb (ligado)_

A dependancia de In[Kz (0)] com a fore;::a i6nica I,

para 0 caao em que a concentrayao de aal auporte Cs So muito maior

que aa concentrac;CSeade i ona bi valentea Cz e de grupos foafato Cp

'

e portanto Cs~ Ct, , logo I~ Ct,' pode obter-ae a partir da

(10), Benda dada por:

d[ In( Kz (0) ) ]

d[ln(Ct, )]

foI'lrlJ. i6nica, poiB ~(O) diminui com 0 creBcimento de Ct.

polieletrol1 ticaB dilut daB, a macromolecula carre gada E..'{macroion)

como Bendo cilindroB de altura b e di~metro 2Rc' onde b ~ igual a

diB~ncia entre aB proj~~eB dOBgrUPOBcarregadoB aobr~o eixo do

poll mero, e 2R Eo igual a diaUncia ~dia entre OB eixoB dOBc

poll merOB (figura I).

o p~metro b Eo obtido a Partir da eBt~utura do

~lula, Rc' eo determinado a Partir da concentr8;~o de mo~meroB na

N (n!fb) = 1p

R = 1/(N nb )i./zc P

Figura 1: Desenho esquematico para ilustrarcelular para polieletr61itos(Katchalsky. 1971)

32

o modelolineares

Ar}"o _ IFOSCS!'.~\f\CO OC 818L10TECA E INfORM v

f1S1CA

eNter)dr ) =

onde n (r) eo igual ao numero de ions por cm3 da especie i. em r, e\.

z. a val~ncia da especie i~nica i. e q a carga do pr6ton. A rela;~o\.

entre n (r) e a concentra;~o molar local da especie i (C.(r» eo\. \.

n (r) = 10-3 tr C. (r)\. \.

onde tr eo 0 numero de Avogadro e n (r) e C.(r) ~o expresBOS em\. \.

3numeros de ions por cm e em moles por litro, resPectiva.mente.

on. Pelo fator de Boltzmann, envolvendo 0 potencial eletrostatico

\.

q:±r) )

R ).c

eletroatatico como Benda nulo: lIt(R ) = o.c

n (r)l.

z. qlllm l.

1 d(r :) L ---

J _ 4nq 0 kT (19)dr = Z.n. er £ l. l.

i=t.

fDefinindo 0 potencial reduzido y = qlll

e 0kT.

parAmetro de Debye para fOI'9a i~nica unitaria ~=2

4rr q£kT

parAmetro adimenaional x = ~r, pode-Be reeacrever a KPB como:

ddX (x : ) = oZ-n.

l. l.

-2:iYe

poli on-aolu;~o (xp - ~ Rp' onde Rp eo 0 raio do poli mero) :

dydX Ix=x =-p

-.?Lxp

2- q /£ kTb eo conhecido como parAmetro de carga.

dy I = 0dx x=xc

onde xc

ER.• c

diferentes val~ncias, a KPB nro apreseota solU9~or~'o(' Q:,", <' ';

razoavelmente seguros e ja estiro hem deseovolvidos. Aaaim, foi

aplicado 0 metodo de Runge-Kutta de 4~ ordem (Gear, 1971).

cly 1 ~ (0 e-Y 200 -2y 0 eY ) (23)- o. + e DB

dx2 dx 2X

onde 0 0 0 representam as conceotr8l;e5es de refe~Dcia {emn.. " O2 e 0.

35

numero de lons por emS) de lons monovalentes positivos •. bivalentes

~o p~metros a serem determinados.

A equa<;:J:o(23) eo uma equa<;:J:o difereneial de 2~

Y1--

Yz =Ys =

iY.•=Y~ =

YdY1

<IX

dY1

<fit = Yz

dyz =dx y - (y + 2y - y. )z s .• ~

y =~z xp

Kstando a borda de celula Rc geralmente a umadisUncia duas a tres vezes maior que este ponto (r ~ 5/K) ,

valor inicial do potencial ~ (R ), e como ja e conhecido 0 valorp

do campo neste meamo ponto, e posaivel aplicar 0 ~todo de

Portanto, conhecidos y•.(x) e yz (x) no ponto x = xp'

pode-se aplicar 0 ~todo de Runge-Kutta de 4~ ordem. Kste ~todo

com valores iniciais dados por y (x ) e Y. (x ), consiete em•. p z p

os valoree de y e Y. Para um ponto x + h, uma vez conhecidoe os•. z p

valoree em x , onde h e 0 paaeo de integr~~o.p

dos valores de y (x +h)•. p

pode-ee calcular, reaplicando 0 ~todo, os valoree de y•.(x) eyz (x) Para x = xp + 2h, e asslm BUcessivamente.

SERVICO DE lllBLIOTECA E INFORMAC,l.O - IFQSCFISICA

y (x = x ) e integra-se a equ8Y~o(23) pelo metodo de Runge Kutta.• p

Se 0 valor y (x ) escolhido ~o for 0 correto, 0 campoeletrico e• p

o potencial emx = x (na borda da celula) ~o se~o nulos.<:

oa especific8Y~o de todos os ni, e do ponto ~onde 0 campoeletrico

e 0 potencial ~o praticamente nulos. Classicamente, ~ e

calculado comosendo 5 vezes 0 inverso do ParAmetro de Debye, pois

~ ~o coincide comRc no caso em que ha sal auporte na solu;:~o. 0

ParAmetro de Debyee calculado em fUDT~Oda fOI'9a ie,nica I da

1 121= -2 E IZ. C.\. \.

de valores de {, R , ~ e n~ , utiliza-ae 0 metodo de Runge-Kuttap -1> \.0-

de 4- ordem, iniciando-se a aolu;:~o da KPB atribuindo um valor

inicial ao potencial reduzido na borda do polimero (y.(~». Se

ap6s a evolu;:~o da aolu;:~o conforme deacrito anteriormente, ate 0

variando aiatematicamente y. (x..). 0 procedimento e repetido ate

que 0 campoe 0 potencial eletrico ae anulem emx = ~, ou eatejam

--.dentro do intervalo de tolerAncia deaejado (da ordem de 10 ).

Com oa valorea de y. (x) obtidoa, e

calcular 0 numero total de i ona (N) de cada eapecie ie,nica na\.

o -Z"Yi, (X)n. e dv

\.

onde V - 1lbIf e dv = 2nb r dr.c c

N. pode eer eecrito em fUll9~o dae concentrli9~ee\.

molareB de refe~ncia if, poie Bendo a rel89~o entre if e nO em\. \. \.

r = Re dada pela equ~~o (17), temos que:

-Z. Y (x)e \. i, dv

c. = v1 J C. (x) dv\. C V \.

C

onde C. e a concentr~~o molar na celula e C. (x) e a\. \.

C. (x)\.

Obtidoe oe valoree de Yi,(x) e, coneeqUentemente, de

N., parte do problema fica reeolvido. Porem a sollJl;:~oobtida deve\.

1: Z. N. = Np\. \.

on..

\.

o23) para umnovo conjunto de valoree de n . Depoie de encontrar 0\.

valor do potencial na superfi cie, y (x ) e obter a eolu;~o da EPB,t p

procede-ee a integral (equ~~o 28). Se 0 valor da equ~~o (32) for

diferente de N por uma quantidade maior que um certo valorp

opre-determinado, criterioeamente muda-ee oe ni, e retorna-ee ao

eetagio inicial da reeolu;~o.

poll mere que determina oe valoree de R e b, e Para umconjunto dep

(C) e de i one suporte nap

de poll mere (e BeneparAmetroeeetruturaie caracterl aticoa b e R )p

e aa concentrB;C5ee mediae de Bale suportee na eolu;~o, e

refe~ncia) doe lone na eolu;~o, poie ~o eetae concentra;:C5ee

livree, n°(ou cf), que determinam 0 valor de y.•(x).\. \. A

Umavez determinado 0 valor de Yt(x), e neceesario,

ainda, verificar Be ae concentr~C5ea mediae obtidae para 0

conjunto de cf correepondemaoe valoree conhecidoe. Caeo ieao ~o\.

aproximac:;~outilizada consiste em supor Cs

para 0 caso de Cs ~ 10 Cp' 0 que implica em supor fontes infinitas

de 10ns na borda da cela. Neata aituac:;~o a concentr8.9~o ~dia de

sal auporte deaejada pode aer obtida variando apropriadamente 0

valor de~, implicando numa aolU9~o iterativa entre a equ89~o

(23) e a equ89~0 (28).

mesmoco! on, com a condic;~o de que Cs + C2

~ 10 Cp (onde Cs e a

eoneentrac;~o de cations monovalentea provenientes do aal suporte e

C2e a eoneentr89~o de cat! ons bivalentes). Nesta situac;~o pode-ae

supor que c: = ~ + 2~, onde C:' ~ e ~ ~o coneentr89C5es de

Anions monovalentea e cations mono e bivalentea de refe~neia,

reapectivamente. Nesta aproximac;~o, para um determinado eonjunto

de valorea de c:: e ~ (e eonseqtientemente c:) obtem-ae 0 valor de

y~(x). Variando eonvenientemente oa valores de c:: e ~ e posai vel

obter as eoneentrac;C5es ~dias desej adaa. Deve-ae notar que, para

da solU9~O obtida e verifiear a aeguinte rel89~o: Cs + 2C2

= Cs.

Entretanto, eate ~todo e poueo pratieo quando ae

concentra9~0 de pollmero (cerca de duas or dens de grandeza menor)

Benda incorreto supor que Cz = c:. Ksta igualdade implica em

aSBumir fonte infinita de i onB bivalentes~ valida Bomente para 0

caBO em que Cz ~ 10 Cp•

Nesta situa9~o~ pode-se iniciar a solU9~o supondo a

oexis~ncia de fonte infinita para os i ons monovalentes~ ou Beja C1

~ = Cs~ e atribuir a ~ um valor inferior a Cz~ e ap6s resolver

a KPB~verificar se a concentra9~0 de ions bivalenteB obtida ap6s

tolerAncia previamente eBcolhida) a concentra;:~o deBejada. CaBO

nao Beja~ modifica-Be 0 valor de referencia c: e reinicia-Be a

Bolu;:~o da KPB_

Ao obter-Be 0 valor de Cz deBejado~ deve-Be ainda

verificar 0 cumprimento da equa9~o (32) (eletroneutralidade)~ e em

e cf = cf + 2cf. sando que 0a t 2

-2yt

e

onde VL

= nb (I{ - ~ ) e l\ e 0 ponto onde O~C~~l::dUZidO e!

igual a unidade. 0 numerode ions bivalentes livres. sera igual a:

onde Vf = nb (R~ - I{).

a) a fr8.9~o de ions bivalentes "ligados·· ao pol1mero 82:

= -N-p

lim (8-+0

2

onde N e igual ao numero total de 1ons bi valentes em cada ce lula:2

-4nulos (da ordem de 10 ) •. sendo que este ponto (~) e determinado

Hstas modific~~es introduzidas na solU9~o da KPB:""inversao" do problema e riiro impo.si9~0 do ponto ~ •.

possibilitaram a simul~~o rapida e eficiente dos eXPerimentos de

ESTUDO DA SELKTIVIDADE IONICA DE ACIIX> NUcL£ICO

NATURALEM DIFERKNTES CONCENTRACOESDE EOOl\OLITO

SUPORTE NaCl (FORC;A IONICA)

solu::;::iro"em diferentes condic;:i:Sesf1 sico-qui micas" fornecem uma

variedade de informac;C5esexperimentais" que possibili taDi7i8.~tlfiar

as duas principais contribuic;:C5es energeticas da inte~~6 do

calcio aos acidos nucleicos: a contribuic;::iro eletrostaticadevido

Os experimentos de ligac;:~o do calcio ao: Sal de

acido desoxiribonucleico extra1 do de timo de bezerro (ct..,iDNA)na

Nos experimentos de ti tulac;:~o" all quotas de CaClz••

a uma concentrac;:~o molar conhecida.. foram adicionadas ;:-a estas

A (nm)

0 0 0 0 00 C» ~ C") 0"'l:I' "'l:I' aD aD l'-

1.20

1.00 5J..-..J~ 0.80Q-Z 0.60~-en 0.40~<

0.20

0.0026000 23000 20000 17000 14000

A (em-I)

Figura 1: Rspectros de absol"r~o 6ptica t1picos,referentes a uma titul~~o contendo: C =

TNN

60.1J,JH,Cp= 0.22 mH, NaCl= 10.0mH. T = 290K

conatante de aaaoci8!;ao entre 0 ca lcio e 0 THH (K.rNN ) , na meama

condic;:ao fi aico-qui mica (A~ndice I), e a concentr8!;ao total de

C +Cb +cfzz TMM

onde Cz So a concentrac;:ao total de ca lcio na aolu;:ao;

concentrac;ao de calcio ligada ao poll mero; Cb e a concentr8!;aoTMN

de calcio complexada ao corante e ~ a concentr8!;ao de calcio

livre na aolu;:ao.

r~o entre 8 (8z z

(e ).z

KzGrupoa foafato livrea + Ligante livrea c »

-[Ligantea ligadoa][Ligantea livrea] = Kz[Grupos fosfato livrea]

[Ligantea ligadoa] = 'r~_a',toSfa:tb;--~ = C:[Ligantea livrea] = <

[Total de grupoa fosfato] - Cp

[Grupos foafato ocupadoa] = n C:bpoia ae 1 ligante ocupa n grupo foafato, en~o Cz ligantea ligadoa

bocupam nCz grupoa foafato. Logo a equa«;~o de a;:~o daa maasaa pode

ser eacrita como:

Dividindo amboa oa membroa por Cp obtem-ae a equa<;:~o

da ~~o daa massaa na formul~~o de Scatchard tradicional:

lig89ao para ligar 0 primeiro ligante ao poll mere K2(0) e 0 numero

n de grupos fosfatos do pol1meroocupados por um ligante. pois

quandoe2 tende a zero. e2/< tende a ~ (0). e quando

e tende a l/n.2

pontos correspondentes a e < 0.2. estao razoavelmente alinhados.2

e lsto permite a obten;:ao dos valores de K2(0) atraves de

extrapol8l;ao para e =0.2

Entretanto. a determin8l;ao do valor de K2(0) por

extrapol8l;ao para e = 0 rjio e preclsa. pois nesta regiao a2

00000 NaDNA-I0mM00000 NaDNA-20mMt>t>I>I>t> NaDNA-30mM

.:' 60000I

~ 0., "-' 5000 0~

0

••••U4000 00

"'-C\!@ 3000 0

0 0 c92000 00

880 0

0 0 0cc 0 0

1000 c 88 c ct>1> C

1>1>I> 0 C C OJt> t> tAadJ cttfb

00.00 0.10 0.20 0.30 0.40

82:::l

Figura 2: Isotermas de Scatchard referentes a inter&9~ocalcio-NanNA em tres forc;:asi6nicas: 10, 20,30 mH. T =290K. As barras indicam a magnitudedo erro em diversos pontos das curvas.

52

Omaforma alternativa, e maie preciea para ee obter

oe valoree de K (0) e n e atravee de umgrafico l/e xl/d , iato Eo,2 2 2

1e-2

- n + 1Kz

eixo (e2)-~ fornece 0-~o valor (K

2) _ A figura

entre 0 calcio e 0 DNA (K2

(0» a 290K aeelm determinadoe,

eatudaremoa aua dependencia com a fol'lYa i6nica (I).

A dependencia linear entre In(K2

(0» e In( I),

moatrada na figura 4, Eo previata pela teoria de condenaa:;:~o de

vari89ao de In(K2(0)) com 0 In(I), iato e, d[ln(~(O»] /

d[ln( I)], Eo igual a valencia do ion tranaferido da aolu;ao (livre)

dln(K2

(0»d In(I)

10.0 0

••••I 8.0...-...

N® 0'-'

6.0

Figura 3: Forma inveraa do grafieo de Scatehard, para aliga~~o caleio-NanNA na preae~a de 10mH NaCI.T =290K. A linha repreaenta 0 melhor ajuatelinear aoa dadoa experimentaia.

54

Tabela I sao mostrados os valores de Kz(O) e d[ln(Kz(O»)/d[ln(I»)

nas diferentes fo~as i6nicas e temperaturas.

Valores de Kz(O) e d[ln(Kz(O»)/d[ln(I») para variastemperaturas e fo~as i6nicas para 0 sistema DNA/Na/Casal suporte: NaCl.

TEMPERATURA (K) 287 290 298 I 303FOR;A IONICA I (M) Kz(O)(M-·)

0~01 9700 7870 7050 63000~02 2400 2070 1750 15300~03 1080 950 770 670

d[ln"(Kz(0»)-1.84 -1.98 -2.05 -1.87

d[ln(I)) .

100009

a

7

I~

••••I 5

~"-'" 4

,-......0 3

'-"ro~

2

(M)

Grafieo l.n[~(O)] vs l.n(I)

caleio-NanNA na prese~a delinha representa 0 ajusteexperimentais.

Para a lig~~oNaCl a T= 290K. Alinear aos dados

10000 8a7

•5

00000 NaDNA-290K00000 NaDNA-298Kt>t>t>t>t> NaDNA-303K

1000 8

a7

•5

1000.01

I (M)

Figura 5: GrAfieo In[K2(O)] VB In(I) para a lig~~o

"

caleio-NaDNA na preaen;a de NaCl naatemperaturaB de 290" 298" 303 K. As linhaarepreaentam 0 ajuate linear aoa dadosexperimentaiB.

+ +trocado par K e Li atraves de cromatografia de troca i~nica; os

Os dados moatradoa na figura 6 ~o reapreaentadoana forma de um grafico 1/8

2X 1/< na figura 7 _ As linhas cheias

neste grafieo repreaentam 0 melhor ajuate obtido par regrea~ofornecendo os valores de K2(O) e 0 numero n de grupas fosfato do

80000

00000 KDNA-l0mM00000 NaDNA-l0mMt>t>t>t>t> LiDNA-l0mM

0

6000 100

~ 0~ .-4I 0

640000

0t> 0

t>•••• C\l 0U t> 0

" 0 8~ 2000 t>

cP0 0

t> 0 0t>o 0 0

~otI

1P9~o 0 0 0t> 0

00.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50

')82

Iaotermaa de Scatcbard referentea ado calcio com trea eapeciea de aalKDNA, NanNA e LiDNA, na preae~a dereapectivo aal. T= 290K.

59

interac;:~ode DNA:10mH do

20.0

J ~ 16.0I~

N0'-"" 12.0

00000 NaDNA-l0mM 290K00000 KDNA-l0mM 290Kt>t>t>t>t> LiDNA-l0mM 290K

Figura 7: Forma inveraa do grAfico de Scatchardreferente aoa dadoa moatradoa na figura 6. Aalinhaa repreaentam 0 ajuate linear aoa dadoaexper1mentaia.

ValoreB de K2{O) e n. referenteB aOB dadoB mOBtradoB na

figura 7. obtidoB par regreB~o linear.

I (H) K2(O) (H-·) n

KDNA 0.01 8200 2.9NanNA 0.01 7800 3.0LiDNA 0.01 3800 4.1

}> +Aproximamente igual do que na preaen;:a de K • iato eo:

eletroforetica dos mesmos sais do DNA que os aqui estudados~encontraram a seguinte sequencia de especificidade: Li+ > Na+ >

23 +competiey~ode Na com diferentes sais~ obtiveram a sequencia K >

, d ~(ti 11 OCUpadOBpeio 10n £,_2+ ,numero e ~ OBno po mero "C1

(8 )-12

observada na liga9~0 de calcio ao DNA e, de uma maneira geral 0fator proposto por Friedman-Manning BUperestima aanticooperatividade, a exemplo do que ocorre quando se estuda a

liga9~0 de drogas cationicas com DNA (Ruggiero, 1987).Uma outra tentativa foi feita no sentido de colocar

o fator de corre9~o proposta por Friedman-Manning na f~~o deScatchard (equa9~0 5), que descreve a ligCl9~oa a1tios iQ§onticoseindependentes (Cantor, 1979) . Mesmo com esta expres~ 0, aconcavidade devida somente ao termo de Friedman-Manning e maisacentuada do que a observada experimentalmente.

A adi9~0 de um fator exponencial as f~eies deScatchard e de McGhee e Von HippeI para descrever a interCl9~oentre os sitios de lig~~o foi realizada par oPs. 0 ajuste destasequa9eies modificadas aos dados experimentais forneceram umaenergia de interCl9~oentre os a1tios de aproximadamente 3kcal/molno ajuste com a f~~o de Scatchard e de 60cal/mol com a f~~o deMcGhee e Von Hippel. Em ambos os casos os resultados ~o dedificil compreen~o pois os valores de energia de inter~~odiferem duas ordens de grandeza.

Kntretanto, 0 pequeno valor da energia de interCl9~oentre os sitios obtido com a utiliz~~o da McGhee e yon Hippelmodificada parece indicar que basta levar em considerCl9~o aexclu~o estat1stica de a1tios de lig~~o, Para descrever aanticooperatividade observada.

Kstes dados Parecem evidenciar que aanticooperatividade observada e devida mais a um efeito dasdimenfiSesdos ions envolvidos do que propriamente a inter89~onegativa entre os sitios ou ao efeito polieletrolitico ao menoscomo descrito por Friedman-Manning.

64

Eeta hip6teee aeima e refor9ada peloe valoree doe

numeroe de at tioe do palH on oeupadoe pela lig~ao de umion ea2+.

+Na. presen;:a. de Li ~ 0 caleio oeupa quatro grupos fosfato 80 passo

2+ligayao do Ca na sua. preeen:;:a.

Sl:~YIC;O OE 81BLlOTECA E INFORMAC;:,I,O - IFQSCflSICA

ESTUDODA DEPEND£NCIADA GIGACXOCa-NaDNA COM A

TEMPERATURA

Os valores de Kz(0), apresentados na Tabe la I ( item

4.2), referentes a uma mesma fo~a ionica e nas diferentes

In( ~ (0» em fun;a;o, do inverso da temperatura (diagrama de van' t

Hoff). Este diagrama. a mostrado na figura 8. A variB9ao da

d [Rln(Kz(O)]

d ( lIT )

referentes a intena9ao THH-Ca, ~~~s do sistema e 0 AEC:A para aTMMintera9ao NaDNA-Caiionde ~H foi obtido da Tabela II dovH

Apendice 1, ~HFis foi obtido da declividade da curva mostrada navH

e ~J:fNA = ~HFi e _ ~HTMM _figura 8 vH vH vH

Vari~~o de Kntalpia (kcal/Hol) calculada atraves dadeclividade do diagrama de van't Hoff mostrado nafigura 8 para 0 sistema DNA/Na/Ca em 10mH NaCl

f:1I:fi.e f:1HTWW f:1J.fNAvH vH vH

-4.10 -3.85 -0.25

llHvH

Com 0 valor de f:1H para 0 sistema DNA/Na/Ca evH

conhecendo 0 valor de Kz (0) em varias temperaturas pode-secalcular a variayao de energia livre (f:1G)e a variay~o de entropia

f:1HvH

Tf:1G- --or

Varia~ao da Energia Livre (kcal/mol) com a temperaturapara 0 sistema DNA/Na/Ca. Fo~a i6nica 10mH NaCl.

298K __ 30_3_K__ 11__ -5_._2_3 -5_-_2_5_,

TABELA IV-B

Variaç~o da Rntropia (cal/moI K) coma temperatura parao sistema DNA/Na/Ca.Força iônica 10mH NaCl.

T = 287K-18.0

290K

17.6

298K

17.4

303K

17.2

Estes dados mostram que a complexaç~o exotérmica

(AHva < O) é acompanhada de um ganho entr6pico AS>O. Podemcontribuir para deste processo entr6pico os seguintes fatores:

a) desidrataç~o do 10n bivalente: a ligaç~o do 10n

bivalente ao grupo fosfato induz a perda da camada de hidratação

do 10n, fazendo umaponte como oxigênio do grupo fosfato.

b) desidratação do poUmero: a ligaç~o do 10n

cálcio ao poUmero pode conduzir, semelhantemente, à desidratação

do DNA.

c) redistribuiç~o iônica: quando o cálcio se liga

ao poUmero, há uma redistribuição dos contra.1.ons na solu;ão,

devido à liberaç~o/reJDOTãodestes da regi~o de condensação.

68

,....-..,•••I::?J e

'-'")

~0 7

'-"N

~

5

3.25E-003

Figura 8: Diagrams de van't Hoff referentes a inter~aocalcio-NaDNA",na presen;a de 10mH NaCl. Alinha representa 0 ajuste linear aos dadosexperimentais.

INFLU£NCIA DA KSTRUTURA SECUN~RIA NA SELETIVIDADE

IONICA

empacotamento do 89ucar, Bendo C;-endo para a f~lia A e C;-endopara a faudlia B. OB diferenteB modoB de empacotamento dOB89ucareB implicam na variay~o na diBtancia entre grUPOB fOBfatoadjacenteB, variando de 5.9 A para a conforma;~o C;-endo (A) a 7.0A para a conforma9~o C;-endo (B) (figura 9).

Alem dOB modoB de empacotamento dOB 89ucareB, 0

Na conforma9~0 A, 0 pa~metro D varia de +4.4 a+4.9 A, indicando que OB pareB de baBeB eB~o afaBtadoB na dir~~o

Na conform~~o B, 0 pa~metro D varia de -0.2 a-1.8 A, indicando que OB pareB de baBeB eBtao compactadoB no

Figura 9: Conforma~~o A: figuras (a) e (b). Conformac;::~oB: figuras (c) e (d). As figuras (a) e (c) ~ovistas perpendiculares ao eixo da duplahelice. As figuras (b) e (d) representam ashelices rodadas de 27° e 31.5°resPectivamente, para poder visualizar aprofundidade ~xima dos sulcos.

71

POLtHERO CONF h(A)* ~** SULCOSLARGURA(A) PROFUNDIDADK(A)MAIOR MENOR MAIOR MENOR

ct-DNA B 3.4 4.2 14.0 10.0 8.0 9.5p(dA-dT) B 3.4 4.2 14.0 10.0 8.0 9.5p(dG-dC) B 3.4 4.2 14.0 10.0 8.0 9.5p(I).p(C) A 2.6 5.6 6.5 10.0 13.0 3.0

* distAncia entre pares de grupos fosfato (projeysrosabre a eixo do polimero).

** em solU9sroaquosa na temperatura de 298K.

Isotermas de liga9~o de Ca2+ a polinueleoti deos

ligac;:~o do caleio (K2(0» e 0 numero n de grupos fosfato oeupados

por eada caleio, determinados para estes polineoeleotideos ~o

TABKLAVIDados Referentes a interac;:~o ca leio-poll mero na presen;: ade 10mM de eletr6lito suporte . T= 290K.

POUHERO Sal Suporte K2(O)(M-~)(Conform. B) (10mM) n

et-DNA Na 7800 3.2Li 3800 4.1

poli(dA-dT) Na 5800 3.9Li 2900 4.5

poli(dG-dC) Na 6800 2.9Li 4400 4.6

SHYI<;:O DE 818L10TECA E INFORMA<;:AO - IfOSCFISICA

1/8 X l/Cf2 2 • Deatea graficoa oa valorea de K2(0) e n foram

TABELA VII

Dadoa referentea a intera;::aoca lcio-poli mero na preaen;:ade 10mM de diferentea eletr61itoa auporte. T= 290K.

POUMKRO Sal Suporte K2

(0) (H-· ) n(O.OlH)

ct-DNA Na 7800 3.2Li 3800 4.1

poli(rI). Na 13500 3.8poli(rC) Li 16000 4.2

00000 NaDNA-IOmM 290K1>1>1>1>1> NaRNA-IOmM 290K

Figura 10: Forma inversa do diagrama de Scatehard para ainterac:;~ocaleio-NaDNA e caleio-NaRNA" napresen;a de 10mH NaCl. T= 290K. As linhasrepresentam 0 ajuste linear aos dadosexperimentaia.

11tio diminui a constante de ligay3:o do calcio ao DNA em relay3:o

ao da constante observada na presell9a de ~dio, ou seja: ~i. (0) <

K;Q ( 0) . Na conf iguracr~0 A

comportamento, pois a constante de ligacr~o do calcic ao RNA na

prsen; a de 11tio ~ menor que na presen; a de ~dio: ~i. (0)

K;Q (0) •

2+que 0 trabalho realizado pelo ea: para deslocar esta es¢cie e. i

maior na conformacrao B que na conforma;:ao A (~l. (A) > ~ (B».

Se tomarmos como refe~ncia ainda a constante de2+liga;:ao de Ca na presen;a de i:Pdio na conforma;:ao B,

Analisando-se as constantes de ligacrao de calcio ao

DNAe ao RNA,na presen;a dos dois contra! ons, nota-se que 0 ea2+

2+liga;:ao do ea: tanto ao RNAquanto ao DNA,na presen;a de i:Pdio,

ca leio ao poll mero, K2(0), naa eondic;CSea experimentaia deaeri taa

foram obtidoa a partir de grafieoa de Scatehard e de grafieoa de

1/8 x l/ef .2 2

metanol produz um aumento de K2(0) da ordem de 50% em rela;~o a.

agua, e a aaearoae aumenta K2(0) aproximadamente 25%, tambem em

ligll9~oKz (O)(~ 40%) e a BacarOBe diminui ~ (0) (~ 48%), emrela<;~oa agua (figura 12).

Em um experimento ~logo, realizado com OBnucleiCOB naB configurll9~eBA e B na forma de Bal de

acidOBIi tio,

Conforma<;~oB: Tanto 0 metanol como a BacarOBe naoproduzem mud~aB BignificativaB na conatante de lig89~o (e daordem de 8%), quando OB dadoa sao comparadoB com 0 reaultadoobtido para a Bol~~o aquoBa.

aproximadamente 37% em Kz(O) e a BacarOBe nao altera 0 valor deK (0), quando OB dadoB sao comParadoB com 0 valor de K (0) obtidoz z

para a aolU9~o aquoBa.

10000-,-'

I> 00000 NaDNA-METANOL1>1>1>1>1> NaDNA-SACAROSE

8000....-.-4

I 0~

-I~~ 6000

'+-c 0C\l

U~4000

E>

0<!) E>E>

E> 0) 0

2000 E>E>

E> 0 0E> 0 0I> E> E> 0 0 0

E>

00.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50

82)

Figura 11: Iaotermaa de Seatehard referentea a inter~~ocaleio-NanNA na preeeD9a de 10mH NaCl e 20% empeeo de metanol e eaearoae. T= 290K.

20000)

00000 NaRNA-METANOL0 t>t>t>t>t> NaRNA-SACAROSE

16000~.-4I 0::g"-'"

12000~

NU 0

" t>N 8000(!)

0

)t>

t> t> 04000 0

t>t> 0

t> t> 0 0 0I> t> 6' 0 0I>

00.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

82)

Figura 12: Isotermas de Scatcbard referentes a interac;:~ocalcio-NaRNAna prese~a de 10mHNaCl e 20%empeso de metanol e sacarose. T= 290K.

Valores de K(0)2 para as configura;:e5esA e B em sal de 11tio~ e6dio (10mH) na preseD9a e auaencia de cosolvente. T=290K.

Conform~~o Sal suporte K2

(0) (M-t)

(O,OlM) Agua Metanol Sacarose- (20%)--(20%)

B Na 7800 11850 9780B Li 3800 4100 4110A Na 13500 18900 9100

A Li 16000 21700 16100- concentra;~o molal - 0.73-- concentr~~o molal = 7.8

(Cp)' eoneentr~~o de eletr6lito suporte (Ci), eoneentr~~o de

CaClz (Cz)' temperatura, eonstante dieletriea

distaneia entre grUpoB fosfato (b) e diAmetro do poli mero (R )_p

Na eompar~~o dOBdadoB te6rieoB (M2Ve KPB) eom OB

"ligada" (8z) (figura 13b) e em grafieoB da atividade aparente do

10n bivalente (1'z) (figura 13c) em fun:;~o da fra<;~o total de

caleio na BolU;~o (r = C IC ).z z p

Vb em torno do poli mero, comoe via':,o na figura 13c.

condenaa~~o Vb utilizado neate modelo e aubeatimado, reaultando em

uma concentra~~o de lona bivalentea condenaadoa exceaaiva. A

teoria. Vb e determinado por:

4.16 para B-DNAa 290K), K e 0 par~metro de Debye e C. a

concentrac;~o de aal auporte C.' poia 0 produto Jlc~· nao depende

de C•.

di veraoa valorea de Vb ' ate que ae obti veaBe uma iaoterma

coincidente com a gerado pelo modelo celular, que e a que melhor

o valor do raio do volume de condenaac;~o obtido

deata maneira, foi de ~ ~ 25 A, aproximadamente 8 A maior que 0

raio que pode aer determinado a Partir da equ~~o (9). Por outro

R ~ 34 A.p

o0.00

00000 NaDNA-IOmM 290K---- M2V-I0rnM 290K. - - EPB-I0rnM 290K

20000..-.....-tI::s'-"

~N

U~ 10000®

Figura 13a: Iaotermaa de Scatchard referentea a inter&;~ocalcio-NaRNA na preaeD9a de 10mH NaCl, 290K. Alinha cheia repreaenta a previ~o pelo modeloH2V e a linha tracejada a previs~o pelo modeloKPB, com oa aeguintea parAmetroa: 1= 10mH, :a..=loA, b=1.7A e T=290K.

86

00000 NaDNA-l0mM 290KM2V-l0mM 290K

. __ EPB-10mM 290K

0.000.00 4.00 6.00

r2

Figura 13b: Grafieo mostrando a variac;ao da frac;ao desf. tios oeupados do pol! mere (8

2) emfun;:ao da

razao entre a eoneentr~ao total de caleio e aeoneentrac;ao de grupos fosfato do pollmero C

p

(r2

). HesDlaseondic;esesda fisura 13a.

87

1.00

0.90

0.80"..

056 /()

0.701>

g&0.60 S

I

0.5061

N ,r.-0.40

I

0.30

0.20

0.10

00000 NaDNA-l0mM 290K____ M2V-l0rnM 290K. __ EPB-l0mM 290K

0.000.00

Figura 13c: Gr~fico da atividade aparente Yz= ~/Cz emfU1l9~Ode rz. KeBlll8.Bcondi9i3eB da figura 13a.

40000

.-..~I

630000

•••• NU" 20000

N(!)

)

10000 ..••.•..

OBOBD Rb=17.6A (M2V)00000 Rb=5.0A (M2V)00000 NaDNA-I0mM

- - Rb=34-.0A (EPB)~~~~~ Rb=25.5A (M2V)

o0.00 0.20 0.30

82

Figura l3d: Grafico mostrando as isotermas de Scatchardobtidas com 0 mode1o M2V para t~e raioe decondensa9~0 diferentee. mode 10 KPB e dadoeexperimentaie. Mesmae condi9~es da figura l3a.

89

condenea~~o, pode eer eecolhido no ponto onde 0 potencial reduzido

y.= q~~r) e igual a -1,0 : y.(~) = -1.0, poie para valoree dey.(r) maior que -1.0, a energia cinetica kT e maior que a energiaeletroetatica ~(r).

No modele celular 0 valor do potencial reduzido emr - 25 A e aproximadamente igual a -1,8.

d [ In{ Kz (O) ]

d[ln{I)]

d[In (Kz (O» ]d[ln{I)] ~ -1.86

~ -2.0. Na figura 14 e moetrado 0 grafico da varia:;~o do In{K2

(O»

00000 M2Vt> t> t> t> t> EPB00000 NaDNA

•••....•••....-e

l::g 10000 9

'-"" 87

a

100098

8 90.01

I (M)

Figura 14: Grflfico moatrando a variac;:~o de In[(K2(O)] em

fun;~o de In( I) para 8. interac;:~o ca lcio-NaDNAe aegundo aa previ~ea doe modeloa H2Ve KPB.Condi9~ee experimentala: aal BUPOrte NaCl, T =290K.

A dependência constante de ligaçãO

cálcio-polimero com a temperatura" mostrada na figura 15" indica

que a variação de entalpia" descrita pelos dois modelos" é

pequena" e pr6xima em IIPdulo"do valor experimental obtido para o

caso estudado (NaDNA em 10 mH NaCI). Rste resultado é um forte

ind1cio que a interação polimero-cálcio é do tipo territorial"

pois ambos os modelos pressupêSemque a associação é deste tipo. Os

valores de .âHVH obtidos com os dois modelos e o obtido

experimentalmente" ~o mostrados na Tabela IX.

TABELA IX

Valores da Entalpia de van't Hoff (kcal/mol)experimentalmente e com os dois modelos te6ricosKPB) Para o sistema DNA/Na/Ca em 10mH NaCI •

.âIfXP .â..r2V.âIfPBvHvHvH

-0.25

-0.15+0.45

obtidos{M2V e

Na figura 16 é mostrada a dependência da constante2

aparente de ligaç~o com o parAmetro de carga { = &k "onde este

parâmetro descreve a densidade de carga do POlimero sendo

determinada principalmente pela distância das projeç~es dos grupos

fosfato sobre o eixo do polimero (b). Os valores de { = 3.2" 4.16

e 5.2 utilizados nas simulaç~es com os modelos M2V e KPB descrevem

os parâmetros de carga de uma configuração em fita simples"

conformaç~o B e conformaç~o A" respectivamente a 290K" sendo os

respectivos valores de b = 3.26" 1.7" 1.26 1. Os dados

experimentais apresentados nesta figura correspondem aos valores

por n6s obtidos com ct-DNA" POli{rI)-POli{rC) e dados da

literatura (Hanzini" 1990) para POli{rC). Verifica-se

92

que a

00000 M2Vt> t> t> t> t> EPB00000 NaDNA-IOmM

~ 3

•••I

B 8::s 0 8

"'-""2

..-...0""-'"

C\2~

10000 t> ~t

e

7

e

5

3.25E-003 3.35E-003 3.45E-003 3.55E-003

Figura 15: GrAfico de van't Hoff moatrando 0 ajuate aoadadoa exper1mentaia (oa meamoadadoa moatradoana figura B) obtidoa com oa modeloa H2Ve KPB.

93

",......... 2~I EPB::g'-"

10000 •~ •0 7

'-" •N

II

~4

~)

2 Fs B-DNA A-RNA

10002.00 4.00

{

Figura 16: Grafieo moatrando a depedeneia da eonatanteaparente de ligac;~o ca leio-pol1 meros eom 0parAmetro de earga ~. Os valores de ~referem-se a eonfigur~~o de fita simples (~=3.26); eonform~~o B (~= 4.16) e eonformac;~oA(~= 5.22). T= 2901[.

94

depen~ncia entre K2

(0) e ~ deacrita pelo modelo KPB ~ pr6xima Ii

obaervada experimentalmente, indicando novamente que a

contribuityao principal para a interac;:aopollmero-calcio e deorigem eletroatatica, Benda que a contribui9~0 da componenteentr6pica, incorPOrada no modelo H2V e aupereatimada neate modelo.

Dutro dado que corrobora eata obaerva9~0 POde aer

viato na figura 17, onde e moatrada a dependencia entre K2(0) e a

constante dieletrica da sol~ao, determinada experimentalmente ao

se utilizar coaolvente na aolU9~o.Observa-se nesta figura que 0 modelo H2V deacreve

um comportamento inverao ao obaervado em experimentoa de liga9aocalcio-Na. Por outro lado, 0 modelo celular parece deacrevermelhor os dados experimentais.

No entanto, a dependencia de K2(0) com £, deacrita

pelo modelo celular DaO e capaz de explicar POrque a interay~oLiDNA-Ca e insenaivel a variayao da constante dieletrica, porque ainter~ao NaRNA-Ca e maia intenaa na preae~a de metanol e menoaintensa na prese~ a de aacaroae, e porque na preae~ a de 11tio aaacaroae nao tem nenhum efeito na ligay~o LiRNA-Ca em relay~o aagua.

Aa varia9~es obaervadaa na constante de ligayao deiona a poliions determinadas pela prese~a de aolutoa neutroa emsolU9~o ~o freqtientementeatribu1da na literatura, aa mud~aaocorridaa no valor da constante dieletrica na aolU9~o. Adiveraidade apreaentada na Tabela VIII mostra claramente que enecessario buacar outros fatorea que posaam descrever 0 efeitoobservado.

t> t> t> t> t> EPBOQ9Q9 EXPERIMENTAL00000 M2V

~ 3.-II::g.•..••.•...

2 ,~ ,0 ,'-"" ,

C\2 "-~ "0 ,

10000,

~t ,

)

8 " ~7 "-

"-8 ,5

5 7 8 t

100[;

)

G~fico mostrando a depen~ncia entre ~ (0) ea constante dieletrica £ da solu;~o, segundopreviaao fei ta pelos modelos H2V e KPB. Oedados experimentaie referem-ee a inter&;~ocalcio-NanNA na preseD9a de 10mHNaCl a 290K e20% de metanol (&=71) ou 20% de eacaroee(&=76) ou na au~ncla de cosolvente (£=82).

Os resultados apresentados e discutidos neste iteM

mostram que o modelo celular fornece uma descriç~o muito

satisfatória do comportamento destes biopoli meros em solu;:~o. e o

modelo de condensaç~o de contra.1ons atribui umpeso relativo muito

grande às interaçeíes de origem ~o eletrostáticas. resultando numa

descriç~o insatisfatória Para o sistema composto por estes

biopoli meros_

97

o eBtudo d...lcompeti9~0 de ionB cAlcio com ~dio,

potaBBio, Iitio, em BUa lig8!T~ocom acidoB nucleicos natural e

sinteticos mostraram que a BUbstitui9~0 do ion monovalente pelo

calcio apreBenta uma ordem Beletiva, Bendo mais facil deslocar 0~dio e 0 potassio das vizinhac;:asda conformac;:~oB (DNAs) do que 0litio. Oma ordem inverBa foi obBervada com a conformac;:aoA (RNA).

Outra diBti~ao detectada foi que 0 numero degrupos fOBfato diBporUveis para liga9ao do cAlcio tambem e uma

fun;:aoda eBpecie do contraion monovalente e segue a meama ordemde Beletividade obaervada nas conatantes de ligac;:aodeterminadas.

Estes dados permitiram correlacionar fatoresligados a geometria do macroi on com 0 tamanho do contraionhidratado, levando a constatac;:ao de que fatores esteroqtdmicostambem sao responaaveis pela determinac;:ao do estado deeletroneutralizac;:aodo polieletr6lito em sol~ao ionica.

Foi pos~vel ainda correlacionar a afinidadeobservada com OB estadoa de hidratac;:aodos iona monovalentes e oado macroion. Ou seja, 0 11tio, que dentre os estudados e 0 maiahidratado foi 0 que apresentou maior afinidade pela confo~ao B,ao paaso que 0 ~dlo e 0 pot.aaalo, menoa hldratadoa, apreaentarammalor aflnldade pela conformac;:aoA.

Entre oa modeloa te6ricoa analisadoa: condenaac;:aode contraions (M2V) e celular (KPB), eate ultimo se moatrou malaadequado a deacrl~ao de parte doa dadoa experimentals,eapecialmente no que concerne aB variac;:~esda conatante de ligac;:~odo calcio aos acidos nucleicos com a fo~a lonica, temperatura edenBldade linear de carga. Kntretanto, amboB os modeloa foramlncapazes de deBcrever a seletlvldade lonica observada. Multoprovavelmente, eBteB modelos falham por nao inclulr em BUa

99

formul8.9~opar:metroB que deBcrevam aB dimenfiSeB dOB 10nB e OB

detalheB eBtruturaiB do polieletr6lito.Detectou-Be, tambem, que 0 modele de condenBa;ao de

contrai onB M2V falha na eBtimativa da exten~o da regi~o de

condenaac;ao, conduzindo 8 aupereatimar 8 concentrBl;:ao de lona

bivalenteB ligadoB ao polieletr6lito e, conBegtientemente, aBupereBtimar a energia deBta liga~ao. A eBtequiometria determinadapara a conformayao B na presenca dos diferentes contraions indicaque 0 litio ocuparia um volume de cOndenBayaO maior do que 0ocupado pelo a6dio ou pelo potasBio.

Finalmente, OB experimentoB realizadoB na prese~ade cOBolventeB indicaram que a vari8.9ao da conBtante dieletricapar si a6 nao e capaz de explicar as mudan;:as observadas naaconstantea de liga~ao do calcio aos acidos nucleicos induzidas porcoaolvente. Outroa fatorea necessariamente devem ser exploradoa afim de explicar os efeitos observados na inter~aocalcio-polimeros na presen:;:ade coaolventes.

C;,?VI<;O O~ 818L10TECA E INFORMA<;.l.O - IFQSCF1S:CA

1. DKTKRHINAÇXO DA CONSTANTE APARKNTX DE LIGAÇXO DO

CÁLCIO AO THM (Ir )T••••

Para monitorar o cálcio na soluç~o contendo os

ácidos nucléicos. forammedidas as concentraç~es de cálcio ligado

ao corante e determinadas as concentraç~es de cálcio livre na

soluç~o. Comestes valores. e conhecendo-sea concentraç~o total

de cálcio na soluç~o. é possivel determinar a concentração de

cálcio ""ligado" ao pol1mero.

Para determinar a concentraç~o de cálcio livre é

necessário conhecer a constante aparente de ligaç~o entre o cálcio

e o TMM(KT•••• ). Observamosque esta constante aparente de ligaçãodo cáleio ao TMMdependedas diferentes condições fi sico-qui.mieas

nas quais se trabalha (força iônica. espécie de sal suporte.

temperatura. cosolvente).

Lembramosque na determinaç~ode K foi utilizadoT••••

o ~ todo da r~o. descri to no Capttulo II.

Nosi tens apresentados a seguir. São mostrados os

resultados obtidos na determinaç~o da constante aparente de

ligaç~o do cálcio ao THHnas mesmas situaç~es fi sico-qui.micasutilizadas no estudo realizado comos ácidos nucléicos.

1.1 FORÇA IONICA E K~CIK IONICA

Os valores da constante aparente de ligaç~o do

cáleio ao 'l'HM.obtidos como DJéotododa r~o emdiferentes forças

iônicas (I )• foram determinados ti tulando-se com cáleio uma102

+ + +Na , Li , K ). Para ~o alterar eignificativamente a fOI'9a

de medida realizada, pois a KTNN DaOsofre alter~ao significativa

quando a fOI'9a ionica apreeenta vari~~ee deeta ordem de grandeza.

Oe valoree de KTNN obtidoe Para cada fOI'9a ionica e para

cada especie de sal suporte, resultado de 7 a 8 adi9~es de Ca++,

A figura 1 mostra os graficos de In(KTNN) x In(I)

Nesta figura verifica-se que a vari~ao de KTNN com a

fOI'9a ionica e diferente Para os tres Bats suporte. A diminui9ao

de KTNN observada com os tres tipos de Bats suporte

regresaao linear, que relacionam a vari~ao da KTNN

com a

concentra;ao molar de sal suporte para as tres especies i6nicas a

nucleicos serao utilizados os valores de KTNN

obtidos com 0

auxi liD destas expresa5es, pois nem sempre e posst vel ajustar 0

7

..-...-t eI::?J'-'"

)!!

J) 4

00000 K00000 Nat> t> t> t> t> Li

3 ,0.01

(M)

Figura 1: Grafieo In{K.r••••) va In{!) obtido para ainter~~o caleio-TMM em aal suporte XCI, a290K, onde X = Li, Na, K. Aa retaa repreaentamo ajuate linear aoa dadoa experimentaia.

TABKLA IRelay~es entre a eoneentray~o de sal auporte

KCl In(KTMM

)= -0.178 In([K])+ 5.76

NaCl In(K )= -0.167 In([Na])+ 5.71TMM

LiCl In(KTMM

)= -0.258 In([Li])+ 5.15

a eonstante aparente de liga;ao do caleio ao TMM (~MM).

de ~MM em rela;ao a temperatura.A variayao da eonatante de

temperatura permitiu eatimar a entalpia de van't Hoff (AH ) paravH

deelinidade da eurva In(~MM) x 1/T (grafieo de van't Hoff):

d [ Rln(~MM) ]

d(l/T)

determina;ao dOB valoreB de ~MM para cada temperatura e fOr9ai6nica foram OB meamOB deBcritoB no item anterior (4.2.1).

Na Tabela II sao mOBtradoB OB valoreB de ~HvH

TABELA II

Varia;ao da entalpia de van't Hoff para a intera;aocalcio-TMM com a concentra;ao de Bal auporte NaCl.

I (M) t.H (Kcal/mol)vH

0,01 -3.850,02 -3.800,03 -3.650,04 -3.26

00000 NaDNA-IOmM00000 NaDNA-20mM1>1>1>1>1> NaDNA-30mM

") ~ 7....•I

~'-'"

e::11

J-J

4

3.25E-003

Figura 2: Dependencia de K..:.... com 0 inverao datemperatura. Diagrama de van't Hoff. Variaafo~ aa i6nicaa. Sal auporte: NaCI.

1.3 COSOLVENTE

Sendo um dos objetivos deste trabalho estudar a

infl~ncia de cosolventes (soluto + água) na seletividade iônica

de ácidos nucléicos, foi necessário avaliar sua influência sobre a

constante aparente de ligaç~o do cálcio ao THH.

Inicialmente foi estudada a influência de metanol,

etanol, etileno glicol e sacarose no valor de K , na ausência deYMN

eletr6litos suportes.

Nestes experimentos, realizados à temperatura de

290K, manteve-se o cuidado de ~o ultrapassar, durante as

titulaçeses, a força iônica de 1,0 mM. Os valores de ~MN obtidos

para cada tipo de cosolvente em cada concentração molal do soluto

na soIUÇ~o, foram resultado da ~dia simples dos valores de ~NM

obtidos em cada titul8Y~o da solUÇ~o com cálcio, sendo em ~dia

realizadas 7 adiçesesde cálcio em cada titulaç~o_

Durante as titulaçeses de cálcio ao foi

observado um ponto isosbéstico em 510 nm, tanto na presen;:a,

quanto na ausência dos diferentes solutos estudados. Este

resultado indica que as espécies envolvidas no equillbrio qui.mico

considerado são as mesmas, tanto no meio simples quanto no meio

misto (soluto + água), indicando assim a inexistência de interaç~o

direta entre soluto-corante.

A figura 3 mostra os gráficos de ln(~NN)

determinados em funç~o da concentr8Y~o molal dos diferentes

solutos estudados. Como pode ser observado, o ln( ~NN) mantém uma

relaç~o linear para todos os solutos e em toda a faixa de valores

da concentração molal investigada. As retas representam o melhor

ajuste linear obtido, e as expresaêSesque relacionam a K com aYNN

108

TABELA III-ADepen~ncia entre KTMM e a molalidade X do cosolvente

ne aua§ncia de sal suporte. T =290K

Metanol: KTMN - 863 exp (0.172 X )-

Ktanol: K.rMN - 899 exp (0.195 X )-

Ktileno Glicol: KTNN - 898 exp (0.103 X )-

Sacarose: K - 887 exp (0.306 X )-TWW

Depen~nciaentre ~MMe amolalidade Xdo cosolventena prese~ade 10mH desalauporte NaCle LiCl.T = 290K.

COSOLVENTE SAL SUPORTE(Molal)

)

HETANOL K..-WN- 666 exp(0.114 X) K..-MN= 575 exp(0.141 X)-

SACAROSE K..-MM- 642 exp(0.156 X) K..-NN= 550 exp(0.717 X)-

Analisando as taxas de vari89~o da I com a•.••••NN

)1 1000~ g

~ :00000 METANOL

e 00000 ETANOLIS I> I> I> I> I> ETILENOGIJCOL

<><><><><> SACAROSE

PM=32.03PM=46.07PM=62.07PM=342.3

3

0.00

MOLALIDADE (MOLAL)

Figura 3: Depend.encia de K,.•••• com 0 tipo e a frac;~omolal de cOBolvente. Fore;a it>nica nula T=290K.

de ~MM na preBe~a de BolutoB e NaCl e LiCl como eletr6litoB

A depen~ncia de ~MM com a concentra;ao molal deBacarOBe na auaencia de eletr6lito BUporte~ na preBe~a de 10mH de

l~MM e a concentrayao de BolutoB na preBe~a e na auaencia deeletr6lito Buporte na concentr~ao de 10 mH;

d[ In(KTMM

)]

d [X ] e 50% menor na preBe~ a

d [ In(K,.MM) ]d [ X ] e 66% menor na presenc;:a de 10

Taxa de variacyaoda KTMM

com a concentra;~o molal X decosolvente, na prese~a de 10mM de NaCI ou LiCI e naauaencia de sal suporte. T=290K.

COSOLVENTE d[ln(KTMM

)]/d[X ]

sem sa.t O,OlM NaCI O,OlM LiCIsuporle.

METANOL 0.172 0.114 0.141SACAROSE 0.306 0.156 0.717

, ,--.~I 1000~ t'-'

~a

~E-4 7

~

,)

000000.0 mMDOC CO 10mM Nat>t>t>t>t> 10mM Li

MOLALIDADE (MOLAL)

Figura 4a: Dependencia de ~ww com a concentr~~o molalde Metanol. Concentrac;~ode Bal auPDrte: 0 e10 mM, NaCI ou LiCI. T = 290K.

113

000000.0 mM00000 10mM Na1>1>1>1>1> 10mM Ii

2...-..~I~'-'

=-~ 1000

~ II

a

7

8

5

4

0.00

MOLALIDADE (MOLAL)

Figura 4b: Depen~ncia de K.r •••• com a concentr&Y~o molalde Sacaro5e. Concentra~~o de 5al BUPDrte: 0 e10 mH, NaCl ou LiCl. T = 290K.

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