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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD CIENCIAS DE LA INGENIERÍA
CARRERA INGENIERÍA DE ALIMENTOS
“DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE CRECIMIENTO
EXPONENCIAL DE LA LEVADURA Saccharomyces
carlsbergensis, EN TANQUES VERTICALES CILINDRO
CÓNICOS, EN LA FASE DE FERMENTACIÓN DEL PROCESO
DE ELABORACIÓN DE CERVEZA PILSENER, CERVECERÍA
NACIONAL S. A. PLANTA QUITO.”
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TITULO
DE INGENIERA DE ALIMENTOS
LAURA CARINA FERNÁNDEZ ALMACHE
DIRECTOR: ING. MANUEL CORONEL
Quito, octubre 2013
© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2013
Reservados todos los derechos de reproducción
DECLARACIÓN
Yo LAURA CARINA FERNÁNDEZ ALMACHE, declaro que el trabajo aquí
descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para
ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias
bibliográficas que se incluyen en este documento.
La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos
correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de
Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional
vigente.
_________________________
Laura Carina Fernández Almache
C.I. 1720118056
CERTIFICACIÓN
Certifico que el presente trabajo que lleva por título “Determinación del
tiempo de crecimiento exponencial de la levadura Saccharomyces
carlsbergensis, en tanques verticales cilindro cónicos, en la fase de
fermentación del proceso de elaboración de cerveza Pilsener,
Cervecería Nacional S. A., Planta Quito”; que, para aspirar al título de
Ingeniera de Alimentos fue desarrollado por Laura Fernández, bajo mi
dirección y supervisión, en la Facultad de Ciencias de la Ingeniería; y cumple
con las condiciones requeridas por el reglamento de Trabajos de Titulación
artículos 18 y 25.
___________________
Ing. Manuel Coronel
DIRECTOR DEL TRABAJO
C.I. 1710625227
DEDICATORIA
Dedico este trabajo con todo mi amor a mi madre Laura quién ha sido el
motor fundamental para la culminación de este trabajo, quién con mucha
comprensión, ayuda y amor me ha motivado y alentado día a día para
cumplir mis metas.
A mi padre y hermanos que con cada palabra me llenaron de fortaleza
cuando más lo necesite.
A mis amadas hijas, Laurita y Micaela, quiénes son mi luz y mi inspiración en
cada momento.
AGRADECIMIENTO
Agradezco a mi Padre Celestial, ser supremo que me acompañó siempre y
brindó todo lo necesario para culminar este trabajo con éxito.
A mis padres quiénes hicieron que las herramientas dadas puedan ser
usadas, gracias de todo corazón.
A todos mis maestros quiénes compartieron todos sus conocimientos con
paciencia y mucho afán.
A mi director de Tesis, Ing. Manuel Coronel, por su comprensión, paciencia y
motivación para realizar un trabajo bien hecho.
A todos los profesionales de Cervecería Nacional S. A., que me brindaron
sus sabios conocimientos y compartieron conmigo su experiencia de una
manera desinteresa.
A todo el personal y directivos de la Universidad Tecnológica Equinoccial
que de alguna manera contribuyeron para cumplir esta meta.
i
ÍNDICES DE CONTENIDOS
PÁGINA
RESUMEN ............................................................................................... vii
ABSTRACT ............................................................................................ viii
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................... 1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ................................................................ 3
2.1. LEVADURAS .................................................................................. 3
2.1.2. ORIGEN ............................................................................ 5
2.1.3. CLASIFICACIÓN ............................................................... 6
2.1.3.2. Levaduras de poder fermentativo medio-alto ........... 7
2.1.3.3. Levaduras de elevado poder fermentativo ............... 8
2.1.4. REPRODUCCIÓN ............................................................. 8
2.1.4.1. Medios de reproducción ........................................... 9
2.1.4.2. Tipos de reproducción ........................................... 10
2.1.5. MORFOLOGÍA ................................................................ 13
2.1.6. FISIOLOGÍA .................................................................... 15
2.1.7. METABOLISMO .............................................................. 16
2.1.7.1. Efecto pasteur ........................................................ 16
2.1.7.1. Efecto crabtree ....................................................... 17
2.1.8. NUTRICIÓN .................................................................... 17
2.1.9. CICLO DE VIDA .............................................................. 18
2.1.10. CULTIVOS PUROS ......................................................... 19
2.2. SACCHAROMYCES CARLSBERGENSIS ................................... 19
2.2.1. CLASIFICACIÓN CIENTÍFICA ........................................ 20
2.2.2. CARACTERÍSTICAS GENERALES ................................ 20
2.2.3. MORFOLOGÍA ................................................................ 21
2.2.4. NUTRICIÓN .................................................................... 21
2.2.5. BIOLOGÍA ....................................................................... 22
2.3. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA ................................................. 23
2.3.1. DEFINICIÓN DE FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA ........ 23
2.3.2. TIPOS DE FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA .................. 24
2.3.2.1. Fermentación alta .................................................. 24
2.3.2.2. Fermentación baja ................................................. 24
ii
PÁGINA
2.3.3. CONDICIONES PARA LA FERMENTACIÓN
ALCOHÓLICA ............................................................................. 25
2.3.3.1. Selección de levaduras .......................................... 25
2.3.3.2. Temperatura .......................................................... 26
2.3.3.3. Aireación ................................................................ 27
2.3.3.4. Ph .......................................................................... 29
2.3.3.5. Nutrientes y activadores......................................... 29
2.3.3.6. Concentración inicial de azúcares ......................... 30
2.3.4. ETAPAS DE LA FERMENTACIÓN ................................. 31
2.3.4.1. Fase lag ................................................................. 33
2.3.4.2. Fase temporal de aceleración ................................ 33
2.3.4.3. Fase de crecimiento exponencial ........................... 33
2.3.4.4. Fase estacionaria ................................................... 36
2.3.4.5. Fase de muerte ...................................................... 36
2.4. GEOMETRÍA DE BIORREACTORES QUÍMICOS ....................... 36
2.4.1. TIPOS DE BIORREACTORES (FERMENTADORES) .... 37
2.4.2. TANQUES FERMENTADORES CILINDRO CÓNICOS .. 39
3. METODOLOGÍA ................................................................................. 42
3.1. PROPAGACIÓN CELULAR ......................................................... 42
3.2. FERMENTACIÓN ......................................................................... 43
3.2.1. CONTROLES MICROBIOLÓGICOS ............................... 43
3.2.2. CONTROLES OPERATIVOS .......................................... 43
3.3. ANÁLISIS EXPERIMENTALES .................................................... 44
3.3.1. CONTAJES ..................................................................... 44
3.3.2. DIACETILO ..................................................................... 45
3.3.3. EXTRACTO PRESENTE ................................................ 45
3.3.4. TEMPERATURA ............................................................. 45
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS ............................................................ 46
4.1. CARACTERIZACIÓN DE LA LEVADURA PROPAGADA ............ 46
4.2. PROCESO DE FERMENTACIÓN ................................................ 46
4.2.1. INFLUENCIA DEL CRECIMIENTO EXPONENCIAL EN EL
EXTRACTO PRESENTE ................................................. 46
4.2.2. INFLUENCIA DEL CRECIMIENTO EXPONENCIAL EN EL
DIACETILO ..................................................................... 47
iii
PÁGINA
4.2.3. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN EL
CRECIMIENTO CELULAR .............................................. 49
4.3. IDENTIFICACIÓN DE LA ETAPA DE CRECIMIENTO
EXPONENCIAL........................................................................... 50
4.4. CURVAS DE CONTROL DEL PROCESO DE FERMENTACION 51
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...................................... 53
5.1. CONCLUSIONES ......................................................................... 53
5.2. RECOMENDACIONES ................................................................ 55
BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 56
ANEXOS…………………………………...…………………………………...64
iv
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1. Características comparativas de los tipos de fermentación……… 25
Tabla 2. Principales subproductos no deseables presentes en la
cerveza...........................................................................................32
Tabla 3. Dosificación de levadura en cada etapa de propagación………….42
Tabla 4.Resultados de parámetros de control de tanques…………………..44
Tabla 5.Características de la levadura utilizada para seguimiento………….46
v
ÍNDICE DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 1. Reproducción por gemación………………………………………….9
Figura 2. Vista microscópica de reproducción por gemación………………..12
Figura3. Reproducción por fisión……………………………………………….12
Figura 4. Reproducción por fisión y gemación combinadas…………...…….13
Figura 5. Vista 3D del genoma de una levadura…………………..………….14
Figura 6. Estructura celular de una levadura…………...……………………..15
Figura 7. Colonias de Saccharomyces carlsbersgensis……………………..23
Figura 8. Ecuación gráfica de la fermentación alcohólica……………………23
Figura 9. Población de levaduras en las etapas de la fermentación………..33
Figura 10. Estructura de un tanque cilindro cónico………..……………….…37
Figura 11. Tipos de fermentadores, Discontinuos y continuos…………..….38
Figura 12. Tipos de Fermentadores, Tubular, De Lecho Fluidizado………..39
Figura 13. Partes de un tanque cilindro cónico clásico………………………41
Figura 14. Consumo de extracto presente durante la fermentación………..47
Figura 15. Mecanismo de la formación de diacetilo…………………………..48
Figura 16. Consumo de diacetilo durante el proceso de fermentación…….48
Figura 17. Control de la temperatura durante el proceso de fermentación..49
Figura 18. Resultados de contajes realizados a tanques cilindro cónicos…50
Figura 19. Resultados de contajes en la fase logarítmica…………………...51
Figura 20. Gráfica de control del proceso de fermentación………………....52
vi
ÍNDICE DE ANEXOS
PÁGINA
Anexo I. Procedimiento para propagación de levadura……………….....64
Anexo II. Resultados Microbiológicos………………………………….......66
Anexo III. Contajes………………………………………………………..….67
Anexo IV. Instructivo de Trabajo para Contajes……………………….….69
Anexo V. Técnica para análisis de Extracto Presente…….……………..71
Anexo VI. Técnica para análisis de Temperatura…………..…………….73
Anexo VII. Ensayo Experimental, seguimiento a tanques………..……...81
Anexo VIII. Control de condiciones óptimas………..……………………..84
vii
RESUMEN
El objetivo de este estudio fue determinar el tiempo de crecimiento
exponencial de la levadura Saccharomyces carlsbergensis en tanques
verticales cilindro cónicos. Para la experiencia la cepa fue propagada
partiendo de una dilución de 25 mL hasta llegar a 200 hL, durante todo el
proceso de propagación se controló que la oxigenación no sobrepase los 13
ppm, la temperatura se mantenga en 20 ºC y se controló su inocuidad
realizando en cada etapa siembras microbiológicas. La experiencia se
realizó a 4 tanques cilindro cónicos, se dosificó 40 hL de la levadura
propagada a cada tanque, que contenían alrededor de 3200 hL de mosto
frío, previamente estos tanques fueron aprobados microbiologicamente por
siembras en medios NBB-B, medio selectivo para bacterias dañinas. Se
controló que el mosto tenga un extracto presente de 15.4 ºP, temperatura
de 12 ºC y una aeración de 13 ppm. Controlados estos parámetros en cada
tanque, se dio inicio a los análisis. Se realizó contajes durante 258 horas a
cada tanque; durante las 102 primeras horas, el contaje se lo realizó cada 3
horas y luego cada 12 horas. Adicional, cada 12 horas se realizó análisis de
diacetilo, extracto presente y temperatura. Los datos de contajes recopilados
evidenciaron que el tiempo de crecimiento exponencial de Saccharomyces
carlsbergensis en tanques verticales cilindro cónicos fue de 48 horas. El
extracto presente y el diacetilo fueron disminuyendo proporcionalmente al
crecimiento logaritmico alcanzando, a las 48 horas, 10 ºP y 340 ppb
respectivamente. Conocido el tiempo de crecimiento exponencial se
establecieron las curvas de control de la fermentación basados en los
parametros de extracto presente (°P) y temperatura (ºC); con estas curvas
el tiempo total del proceso de fermentación se estableció en 204 horas.
viii
ABSTRACT
The aim of this study was to determine the time of exponential growth of the
yeast Saccharomyces carlsbergensis tapered cylinder in vertical tanks . To
experience the strain was propagated starting from a dilution of 25 mL until
reaching 200 hL throughout the propagation process was controlled aeration
does not exceed 13 ppm , the temperature is maintained at 20 ° C and
monitored their safety performing microbiological plantings at each stage .
The experiment was performed at 4 cylinder conical tanks was dosed 40 hL
of yeast propagated to each tank , which contained about 3200 hL cold wort ,
these tanks were previously approved by seeding media microbiologically
NBB- B, selective medium for bacteria harmful . It was controlled that the
present extract must have a 15.4 ° P , temperature of 12 ° C and an aeration
of 13 ppm. Controlled these parameters in each tank, the analysis began .
Counts was performed for 258 hours at each tank , during the first 102 hours
, the count is made at every 3 hours and then every 12 hours. Additional ,
every 12 hours diacetyl analysis was performed , this extract and
temperature. Counts data collected showed that the time of exponential
growth in Saccharomyces carlsbergensis vertical cylinder conical tanks was
48 hours . The extract present and diacetyl were decreased proportionally
reached logarithmic growth at 48 hours, 10 ° P and 340 ppb respectively.
Time known exponential curves were established fermentation control based
on this extract parámentros (° P) and temperature (° C ), with these curves
the total time of fermentation was set at 204 hours.
1. INTRODUCCIÓN
1
INTRODUCCIÓN 1.
La fermentación es un proceso biotecnológico que tuvo sus inicios primitivos
hace mucho tiempo. Este procedimiento se va desarrollando a grandes
pasos gracias a estudios microbiológicos, biotecnológicos, matemáticos,
etc., y de manera especial a los avances tecnológicos con el mejoramiento
en la manipulación y automatización de los procesos (Quintero, 2005).
La industria cervecera tiene un amplio campo de aplicación y mejoramiento,
uno de ellos es el cambio de sus cubas de fermentación, denominadas así
en la antigüedad. Estos cambios van desde la forma de su base, la forma de
desfogue, compuertas, y lo más importante su forma geométrica, llegando
así a mejorar su manipulación y fermentación con la implementación de los
tanques verticales cilindro cónicos en la industria.
Estos biorreactores a más de tener mayor capacidad y ocupar menor
espacio, dentro del proceso es motivo de alteraciones en los estándares de
control, ocasionando problemas operativos, pérdidas de tiempos, mermas y
disminución en la eficiencia en la producción. La práctica permite identificar
que la geometría del tanque está afectando el crecimiento celular por lo que
se propone un estudio del proceso de fermentación, centrado en la fase de
crecimiento exponencial para determinar nuevos estándares de control.
El proceso de crecimiento celular se ve afectado por varios factores, los
principales son la temperatura, la presión, aeración y el extracto presente en
el mosto (Garassini, 1997), este estudio se basa en su control y seguimiento.
Los objetivos del estudio fueron:
Objetivo General:
Determinar el tiempo de crecimiento exponencial de la levadura
Saccharomyces carlsbergensis en tanques fermentadores verticales cilindro
cónicos.
2
Objetivos específicos:
Propagar desde una misma cepa de Saccharomyces carlsbergensis
la cantidad necesaria para la experiencia.
Generar una fermentación con acondicionamientos microbiológicos y
operativos óptimos.
Analizar el comportamiento del crecimiento exponencial versus
parámetros de extracto presente, temperatura y diacetilo durante
todas las etapas de la fermentación.
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
3
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.
LEVADURAS 2.1.
La levadura es el micro organismo que se nutre de los azúcares
fermentables contenidos en el mosto produciendo como subproductos
alcohol etílico y CO2 bajo condiciones de ausencia de oxígeno. Si existe
oxígeno en el mosto, la levadura lo consume para multiplicarse produciendo
pequeñas cantidades de agua (Prescott, 1992).
Las levaduras se han definido como hongos microscópicos, unicelulares, la
mayoría se multiplican por gemación (Kretzschmar, 1991). Este grupo de
microorganismos comprende alrededor de 60 géneros y unas 500 especies
(Gonzalez, 1999).
Históricamente, los estudios sobre microbiología enológica se han centrado
en las levaduras pertenecientes al género Saccharomyces, que son las
responsables de la fermentación alcohólica. Anteriormente se creía que sólo
ellas participaban en el proceso de producción de alcohol, sin embargo, las
diferentes levaduras no-Saccharomyces, especialmente durante la fase
inicial de la fermentación, pueden influir en las propiedades organolépticas
de las bebidas alcohólicas (Mesa, 2000).
Existe un gran número de especies que se diferencian por su aspecto, sus
propiedades, sus formas de reproducción y por la forma en la que
transforman el azúcar. Las especies más extendidas son Saccharomyces
ellipsoideus, Kloeckera apiculata y Hanseniaspora uvarum, las cuales
representan por sí solas el 90% de las levaduras utilizadas para la
fermentación. Como todos los seres vivos, tienen necesidades precisas en lo
que se refiere a nutrición y al medio en que viven (Fernández, 2003).
Son muy sensibles a la temperatura, necesitan una alimentación apropiada
rica en azúcares, elementos minerales y sustancias nitrogenadas, tienen
ciclos reproductivos cortos, lo que hace que el inicio de la fermentación sea
4
tan rápido, pero así como se multiplican, pueden morir por la falta o el
exceso de las variables mencionadas (Tabera & Iznaola, 1995).
Al fermentar el mosto se produce una espuma. El primer paso hacia el uso
de levadura se produjo cuando se constató que se podía quitar esta espuma
y añadirla a la siguiente producción provocando la fermentación al instante,
donde la espontánea tardaba mucho en arrancar (Gancedo, 2007). Poco a
poco descubrieron que lo que provocaba la fermentación era la levadura,
que es una bacteria, un microorganismo de 5-10 micras,que transforma el
azúcar en alcohol + gas carbónico (CO2) + calor (Garassini, 1997).
La primera observación de la levadura con un microscopio la realizó un
científico holandés Van Leeuwenhoek en 1680. Pero fue Pasteur quien
descubrió los secretos de la levadura al completo en 1857 (Vaughan &
Martini, 1995).
Tras el descubrimiento de la levadura y de su función, se realizaron los
primeros cultivos de levaduras específicas para cervezas. La fábrica
Carlsberg danesa fue la primera en realizar cultivos de la levadura que
domina ahora los mercados internacionales (Póo & Millán, 1990), la levadura
Saccharomyces cerevisiae uvarum, que tiene como característica principal
que fermenta a temperaturas muy bajas y produce sabores muy limpios
(Serafini, Dillon, Pistoriello & Moyna, 1994).
Para la fabricación de la cerveza se puede partir de cultivos de una sola
célula (cultivo puro) para la propagación de la levadura; pero para los
cerveceros la levadura se recupera después de la fermentación y se puede
emplear una y varias veces durante varias generaciones. Si el manejo de la
levadura no se controla estrictamente, es necesario reemplazar esta a
menudo con cultivos nuevos realizados en laboratorios en condiciones de
esterilidad total (Serafini, Dillon, Pistoriello & Moyna, 1994).
Diversas cepas de levadura tienen características diferentes e individuales
de sabor, las levaduras que se usan en la fabricación de cerveza se pueden
5
clasificar como pertenecientes a una u otra de las dos especies del género
Saccharomyces (Cárdenas, 2004).
En la actualidad, las bebidas alcohólicas se encuentran disponibles en todo
el mundo bajo las más diversas formas. Se elaboran a partir de frutas,
cereales o miel, a los que se añaden distintas cepas de levadura para
fermentar los azúcares presentes en estos productos y obtener así alcohol
(López & Ochoa, 2013). Se utilizan diversos métodos para mejorar las
variedades de levadura destinadas a este tipo de fermentación. Una de las
principales metas consiste en aumentar la tolerancia de la levadura al
alcohol (Donmenech, Garcia & Sipiczky, 1992).
Las fábricas cerveceras producen grandes cantidades de levadura, de las
que una pequeña proporción sirve para inocular la siguiente producción de
cerveza, mientras que la mayoría restante se emplea en la elaboración de
aditivos alimentarios o pastas para untar a base de extracto de levadura
(Otero, Cabello, Vasallo, García & López, 2000).
Con la introducción de la aireación en el proceso de producción, que tiene
lugar en 1879, se aumentan considerablemente los rendimientos, que pasan
a ser del 50 al 60% del teórico (Hoggan, 1999). La última etapa importante
de modificación de la tecnología tiene lugar con la alimentación controlada
de azúcar a los mostos en fermentación, cambio introducido por un científico
danés, Sak, y un alemán, Hayduck, en 1919 (Treat, Home & Gift, 2008).
2.1.1. ORIGEN
En 1675, un mercader de paños holandés, Antonj Van Leeuwenhoek,
combinando las lupas que se utilizaban para examinar tejidos, inventó el
microscopio, siendo el primero que observó la existencia de
microorganismos vivos en la levadura (Marrero, Galindo & Torres, 2009).
Se trataba de las células vegetales responsables de las numerosas
fermentaciones que tienen lugar en la Naturaleza (Sanchez, 1992).
6
Estas células se encuentran en gran abundancia en el aire, como demostró
Pasteur dos siglos más tarde (Miazzo, Peralta & Picco, 2005) y, al entrar en
contacto con el mosto de uva, por ejemplo, desencadenan su fermentación,
que convierte el mosto en vino (Ramón, 2010). Igual ocurre con el malta
obtenido de la cebada, que se convierte en cerveza, y así con otras muchas
fermentaciones (Saavedra, Hodaifa & Muñoz, 2013).
El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fue reconocido
sino hasta 1856 por Luis Pasteur (Escobar, 2012).
Las teorías científicas de esa época reconocían la presencia de éstas en la
fermentación alcohólica, pero eran consideradas como compuestos químicos
complejos, sin vida. Esta era la teoría mecanística liderada por los químicos
alemanes Von Liebig y WöhLer. (Ward, 1991).
Luis Pasteur, propuso la teoría vitalística y demostró que las células viables
de levaduras causan fermentación en condiciones anaerobias; durante la
cual el azúcar presente en el jugo es convertido principalmente en etanol y
CO2 (Mejía, Albán, Murcia, Cuervo & Durán, 2009).
2.1.2. CLASIFICACIÓN
Las levaduras se clasifican en base a sus caracteres morfológicos, aunque
para algunos microbiólogos, sus propiedades fisiológicas tienen mayor
importancia.
La mayoría de las levaduras son hongos unicelulares sencillos
microscópicos, la mayoría se reproducen asexualmente por gemación, y
otras especies lo hacen por fisión múltiple (Paipa & Carulla, 2012). Las
levaduras que pueden reproducirse sexualmente se conocen como
verdaderas, este proceso implica la formación de ascosporas, sirviendo la
propia levadura como asca, de aquí que ellas se clasifican como
Ascomicetos; por el contrario las falsas que no producen ascosporas,
pertenecen a los hongos imperfectos (Collado, 2001).
7
La clasificación de las levaduras es compleja, no obstante el desarrollo de
nuevas técnicas basadas en Biología Molecular, ha permitido separar o
reagrupar las especies. Las levaduras pertenecen al Reino Fungi y dentro de
él, a la división Eumicota que agrupa a los hongos verdaderos. En esta
división, las levaduras se incluyen en 2 de las 5 subdivisiones de los
Eumicetos, la Ascomycotina representada por las levaduras capaces de
producir ascosporas, (Gancedo, 2007).
Además las levaduras pueden ser clasificadas por debajo de los taxones
género y especie, en subespecies y variedades, que a menudo adquieren
rango de especie tras nuevas revisiones taxonómicas, o varias especies son
unificadas en una sola como subespecies de la misma, con lo que la
clasificación se complica aún más y se incrementa el número de sinonimias.
(Gancedo, 2007).
Teniendo en consideración la variedad de parámetros a considerar para su
clasificación hemos estimado, de acuerdo a nuestro objeto de estudio,
profundizar en la clasificación de levaduras por su influencia dentro del
proceso fermentativo, para ello tenemos lo siguiente:
2.1.3. LEVADURAS DE INICIO DE FERMENTACIÓN
Se trata generalmente de levaduras apiculadas, es decir con forma de limón,
que tienen un bajo poder fermentativo (hasta 4-5 %Vol.) (Herráiz, 1990).
Muchas de ellas son poco beneficiosas ya que producen bastante acidez
volátil, a excepción de Schizosaccharomyces veronae. Podemos citar
Kloeckera apiculata como la levadura de este tipo más común en la mayoría
de las vinificaciones (Ribereau, Peynaud & Bethencourt, 1992).
2.1.3.1. Levaduras de poder fermentativo medio-alto
Una vez que se han superado los 4-5 %Vol. de alcohol, otras especies de
levaduras dominan el proceso como es el caso de Saccharomyces
8
cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomycespastorianus, y otras (Collado,
2001).
2.1.3.2. Levaduras de elevado poder fermentativo
Al alcanzar los 10-11 %Vol de alcohol, hay otras especies de levaduras que
comienzan a ejercer su predominio debido a que gozan de un elevado poder
fermentativo como son Saccharomyces oviformis, Saccharomyces bayanus,
y otros Saccharomyces ellipsoideus, entre otras (Dequin, Barre, Feuillat,
Sablavrolles, Blondin & Salomon, 2009). Exceptuando microvinificaciones de
laboratorio en las que se han llegado a alcanzar hasta 18-20 % Vol. de
alcohol, lo habitual es que no puedan fermentar mas allá de los 13,5-14,5 %
Vol. de alcohol (Ramón, 2010).
2.1.4. REPRODUCCIÓN
La mayoría de las levaduras se reproducen por gemación multicelular o por
gemación polar (Duarte, 2004), que es el mecanismo en el cual una porción
del protoplasma sobresale de la pared de la célula y forma una
protuberancia, la cual aumenta de tamaño y se desprende como una nueva
célula de levadura, en las levaduras que forman película, la yema crece a
partir de una prolongación tuboliforme de la célula madre, el material nuclear
replicado se reparte entre la célula madre y la célula hija, como se puede ver
en la Figura 1. (Frazier & Weathoff, 1998).
9
Figura 1. Reproducción por gemación.
(Frazier & Weathoff, 1998)
En la mayoría de las especies de levaduras verdaderas, la formación de
ascosporas tiene lugar tras la conjugación de dos células, aunque algunas
pueden producir ascosporas sin que exista conjugación previa, teniendo
lugar después la conjugación de las ascosporas. Tanto el número y el
aspecto de esporas por asca, son típicos de cada especie de levadura, y se
pueden diferenciar por su color, rugosidad o lisura de su pared y por su
forma (redondeada, ovalada, arriñonada, falciforme, forma de saturno o de
sombrero, hemisférica, angular) (Fernández & Jiménez, 2003).
2.1.4.1. Medios de Reproducción
Los aspectos fundamentales a considerar son la disponibilidad y la
composición del mosto incluyendo la presencia de inhibidores o substancias
extrañas que pueden contener (Gooding, 2007). La sacarosa es el azúcar
predominante. La materia orgánica no azúcares está compuesta
fundamentalmente por gomas solubles, compuestos nitrogenados como
10
betaína y ácido glutámico y algunos ácidos orgánicos como láctico, málico,
acético y oxálico (Puigdomenech, 2012).
Las melazas se utilizan generalmente diluídas al 50%, el mosto es casi
siempre clarificado. La clarificación puede hacerse antes o después de la
esterilización, que se realiza en la última etapa por inyección directa de
vapor. La clarificación se realiza fundamentalmente con la ayuda de
centrífugas intermitentes. Se han mencionado como ventajas de utilizar
mostos clarificados que la levadura es más fácil para prensar, la clarificación
facilita la transferencia de O2 y reduce la formación de espuma (Rodríguez,
Infante, Domínguez, Reboording & Cantoral, 2010).
El mosto es deficiente en algunos macroelementos como N, P, S, Mg, y
también Zn en la mayoría de los casos, por lo cual es necesario su agregado
a los mostos (Civello, 1994). La cantidad de nitrógeno y fósforo a ser
agregado depende de las prácticas comerciales. El nitrógeno puede
representar entre el 6.5 y el 10% de la levadura seca y el fósforo expresado
como P2O5 varía entre 1.5 y 3.5% (Ulloa, Libkind, Fontela & Van, 2009).
Ambos valores, sobre todo el contenido de nitrógeno, están relacionado con
el poder fermentativo y la estabilidad de la levadura en el almacenamiento.
El nitrógeno que se suministra generalmente como agua amoniacal y el
fósforo como ácido fosfórico, son alimentados durante el proceso de acuerdo
a programas de alimentación que dependen de las prácticas comerciales. El
Mg, S, y Zn son incorporados en forma de sulfatos (Briceño, 1999). El
MgS04 se suele incorporar a razón de 1 g de la sal heptahidratada y el Zn en
una proporción de 10 mg del sulfato tetrahidratado por Kg de melaza a
fermentar (Escobar, 2012).
2.1.4.2. Tipos de reproducción
Las levaduras se reproducen asexualmente por gemación o brotación, fisión
y de forma combinada (gemación y fisión) (Sánchez, 1992). Durante la
reproducción asexual, una nueva yema surge de la levadura madre cuando
11
se dan las condiciones adecuadas, tras lo cual la yema se separa de la
madre al alcanzar un tamaño adulto (Ulloa, Libkind, Fontenla & Van, 2009).
Gemación:
La modalidad más común es la gemación, proceso asexual, en el cual la
célula progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia
un punto periférico próximo a la misma (Fernández & Jiménez, 2003).
Entonces se forma, en la dirección del conducto, una pequeña protuberancia
en la superficie externa de la célula, y el conducto pasa atravesando la pared
celular a dicha protuberancia, la cual se ensancha, llenándose con el
material citoplásmico y nuclear de la célula progenitora. Cuando el brote o
yema formado llega a ser casi tan grande como la célula progenitora, los
aparatos nucleares de ambas células se orientan de forma que sus
centrosomas respectivos equidisten del punto de unión (Sánchez, 1992).
Al llegar este momento, la célula madre y la célula hija se separan y se inicia
la formación de nuevas yemas. En la gemación normal no se forman
tabiques de separación entre célula madre y células hijas, pero en algunos
casos, el proceso se inicia en la gemación y se completa por división, con la
separación definitiva de ambos individuos como se puede ver en la Figura 2.
(Puigdomenech, 2012).
La célula madura se puede reproducir por gemación, durante el curso de
vida, un promedio de 24 generaciones de células hijas (Sánchez, 1992). Las
yemas sucesivas se forman siempre en sitios diferentes de la superficie de la
célula (Civello, 1994).
12
Figura 2. Vista microscópica de reproducción por gemación.
(Puigdomenech, 2012).
Fisión:
También llamada fisión binaria (fisiparidad), es un tipo de reproducción
vegetativa o asexual, es semejante al proceso reproductor de las bacterias
(Sánchez, 1992). Las células de levadura aumentan de tamaño o se alargan,
el núcleo se divide y se originan dos nuevas células semejantes como se
puede ver en la Figura 3. (Harvey, Drew & Wang, 1995).
Figura 3. Reproducción por fisión.
(Sánchez, 1992).
13
Gemación y fisión combinadas:
Esta cuarta modalidad de reproducción de las levaduras se denomina
gemiparidad, y es intermedia entre la gemación y la fisión binaria que se han
descrito antes (M.R.Adamas, 2006). En este proceso se desarrollan las
yemas en los extremos de las células, y después se forma un tabique
transversal entre la célula progenitora y la célula hija, separándolas como se
puede ver en la Figura 4. (Lobato, 2001).
Figura 4. Reproducción por fisión y gemación combinadas.
(Lobato, 2001).
2.1.5. MORFOLOGÍA
Los caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su
observación microscópica (H.J.Peppler & Perlman, 1999). Además, los
criterios morfológicos se basan en el modo de reproducción vegetativa de la
morfología celular, de la formación de pseudomicelio y de micelio (Izquierdo,
2009).
14
La forma de la levadura puede ser desde esférica a ovoide, en forma de
limón, piriforme, cilíndrica, triangular, e incluso alargada formando un
verdadero micelio o un falso micelio (Palacios, 2006). También se
diferencian en cuanto a su tamaño, miden de 1-10 um ancho por 2-3 um de
longitud (Sanz, Serrano & Torralba, 2003). Son partes observables de su
estructura, la pared celular, el citoplasma, las vacuolas, los glóbulos de
grasa, y los gránulos, los cuales pueden ser metacromáticos, de albúmina o
de almidón (Brock, 2003).
Figura 5. Vista 3D del genoma de una levadura.
(Nodarse, 2007).
La pared rígida, se caracteriza por la presencia, en su composición, de dos
polisacáridos: manano y glucano (Nodarse, 2007). Algunas levaduras
producen una cápsula constituida por fosfomanos como se puede ver en la
Figura 5. (Nodarse, 2007).
El núcleo está rodeado de una membrana que persiste durante la división
celular. El número de cromosomas es variable de unas a otras. Las
levaduras en ningún caso son móviles (Sanz, Serrano & Torralba, 2003).
15
Figura 6. Estructura celular de una levadura.
(Sánchez, 1992).
La Figura 6 muestra la estructura de las envolturas celulares de la levadura,
en ella se distinguen la membrana plasmática y la pared celular que se
hallan separadas por el llamado espacio periplasmático (Sánchez, 1992). La
membrana celular se compone básicamente de fosfolípidos y proteínas de
acuerdo con el modelo del mosaico fluido. Por su parte, la pared celular se
compone básicamente de ß-glucanos y manoproteínas. Finalmente, el
espacio periplasmático contiene algunas proteínas exocelulares (Carrau,
2005).
2.1.6. FISIOLOGÍA
Las distintas especies de levaduras pueden ser muy diferentes en cuanto a
su fisiología, la mayoría necesitan más humedad para crecer y desarrollarse
(Cañon & Aldana, 1998). El intervalo de temperatura de crecimiento de las
levaduras es en general, parecido al de los hongos, con una temperatura
óptima en torno a los 25 a 30ºC y una temperatura máxima en torno a los 35
a 47ºC (Miazzo, Peralta & Picco, 2005). Una reacción ácida del medio,
próxima a un pH de 4 a 4.5, estimula el crecimiento de la mayoría de las
levaduras, mientras que en medios básicos no crecen bien a no ser que se
16
hayan adaptado a los mismos, crecen mejor en aerobiosis, aunque las
especies de tipo fermentativo son capaces de crecer, lentamente, en
anaerobiosis (Sánchez, 1995).
En general, los azúcares son la fuente energética más apropiada para las
levaduras, aunque en las oxidativas, por ejemplo, las formadoras de película
oxidan los ácidos orgánicos y el alcohol, y también contribuyen en la
producción de los sabores (Kerridge, 1998).
2.1.7. METABOLISMO
Las levaduras son oxidativas y fermentativas, o bien su actividad metabólica
es a la vez de ambos tipos (Palacio y Llanes, 2006).
En la superficie de un líquido, las levaduras oxidativas pueden crecer en
forma de película, de velo, o de espuma, y por ello se denominan levaduras
formadoras de película. Las levaduras fermentativas suelen crecer en toda la
masa del líquido y producen alcohol (Duarte, 2004).
2.1.7.1. Efecto Pasteur
Si se introduce oxígeno durante la fermentación, la célula de la levadura
invertirá a la respiración. Esto significa que el piruvato de la glicólisis se
moverá directamente hacia el ciclo de kreb's y fosforilación oxidativa en la
presencia del oxígeno. En este caso la glucosa se oxida totalmente a bióxido
de carbono y agua (Mesa, Rebordinos, Cantoral & Sánchez, 2000).
Una observación dominante de Pasteur era que la toma de glucosa es más
lenta en las celulas respirativas que en las celulas fermentativas es debido al
hecho de que la respiración aerobia produce más energía a la célula por
cada molécula de glucosa que la fermentación y por lo tanto menos
substrato es necesario para proveer a la célula de levadura de una cantidad
dada de energía (Jagnow & Dawid, 2001).
17
2.1.7.2. Efecto Crabtree
La respiración es inhibida y la fermentación ocurre. Aun si hay oxígeno
presente pero los niveles de glucosa son altos la vía fermentativa es usada y
no el ciclo de Krebs (Usseglio, 1998).
En Saccharomices cerevisiae, una levadura sensible a la glucosa, la
respiración se reprime en presencia de concentraciones pequeñas de
glucosa en el medio (0.4%wv) (Serafini, Dillon, Pistoriello & Moyna, 1994).
Esto se da sin importar la presencia o la ausencia de oxígeno molecular.
Ninguno de las dos maltosa o maltotriose exhibe una acción represiva en la
respiración (Izquierdo, 2009).
2.1.8. NUTRICIÓN
De las fuentes de carbono y energía que pueden emplear las levaduras
figuran en primer lugar la glucosa y la sacarosa, aunque también pueden
emplearse fructuosa, galactosa, maltosa y suero hidrolizado (Lobato, 2001).
También puede utilizarse etanol como fuente de carbono. El nitrógeno
asimilable debe administrarse en forma de amoníaco, urea o sales de
amonio, aunque también se pueden emplear mezclas de aminoácidos. Ni el
nitrato ni el nitrito pueden ser asimilados (Ward, 1991).
Aparte de carbono y el nitrógeno los macroelementos indispensables son el
fósforo que se emplea comunmente en forma de ácido fosfórico y el Mg
como sulfato de magnesio. Finalmente son también necesarios el Ca, Fe, Cu
y Zn como elementos menores (Palacios, 2006).
Un requerimiento esencial está constituido por las vitaminas del grupo B
como biotina, ácido pantoténico, inositol, tiamina, pyridoxina y niacina
(Uscanga, Gaviño, Córdova & Pacheco, 2009) . Entre las vitaminas
mencionadas la biotina es requerida por la casi totalidad de las mismas
(Marrero, Galindo & Torres, 2009). Los requerimientos cambian según las
condiciones de cultivo, ya que el aumento de la aerobiosis disminuye los
18
requerimientos de esa vitamina y el uso de urea como fuente de nitrógeno
los aumenta por la necesidad de biosíntesis de 3 sistemas enzimáticos que
contienen biotina (Sanz, Serrano, Barrero & Torralba, 2003).
El ácido pantoténico, que es un componente de la coenzima A, es también
requerido por muchas especies, mientras pocas especies requieren inositol
(Marrero, Galindo & Torres, 2009).
Con respecto a la tiamina se ha demostrado que aumenta la actividad
fermentativa de la levadura (Dulau & Palacios, 2003).
Finalmente debe mencionarse al oxígeno como otro requerimiento
nutricional para la producción de levadura. Como se estableció
anteriormente se necesita 1 g de oxígeno para la producción de 1g de
levadura seca en el caso de crecimiento en condiciones óptimas (Roig &
Yérle, 2003). El oxígeno se suministra con el aire que se inyecta en los
medios durante la fermentación. Si existe limitación de oxígeno no se puede
alcanzar los rendimientos óptimos. La velocidad de transferencia de oxígeno
requerida depende del proceso empleado (Calderon, 2010).
2.1.9. CICLO DE VIDA
La edad en las células de levadura se determina según el números de brotes
producidos por la célula, generalmente una levadura joven deberá tener de
tres a cuatro cicatrices de brotes, mientras que las células viejas llegan a
tener por encima de 20 cicatrices (Paipa & Carulla, 2012).
Dependiendo del tipo de instalaciones en que se produzca la fermentación o
el manejo de los cultivos, los mismo se pueden considerar viejos por encima
de las 10 generaciones (vueltas ó inoculaciones) (Kretzschmar & Cuchí,
1991).
19
En la actualidad para simplificar el proceso y trabajar de forma segura, sin
riesgo de contaminación, se introducen cultivos nuevos por encima de la 5ta
generación (Garassini, 1994).
2.1.10. CULTIVOS PUROS
Se obtienen del aislamiento de una célula única de manera que se garantice
la obtención de una masa genéticamente homogénea por la multiplicación
vegetativa (García, Quintero & López, 2008).
Emil Christian Hansen (1884) fue el pionero, desarrollo el método para aislar
una sola célula de levadura y propagarla hasta alcanzar la cantidad
necesaria para la siembra de un cocimiento a escala comercial (Prescott,
Dunn, García & Palasí, 1992).
Beneficios
• Consistencia de sabor y de fermentación.
• Ayuda a que la levadura permanezca libre de contaminantes no
deseados en la cepa madre.
• Proporcionan mayor facilidad y seguridad en los controles de calidad.
Saccharomyces carlsbergensis 2.2.
Una levadura conocida como Saccharomyces carlbergensis es la
responsable de la transformación del azúcar en alcohol, el fenómeno más
trascendental en la producción de cerveza. Esta levadura se encuentra en
forma salvaje en la naturaleza y, generalmente, sobre el hollejo de la uva en
unas especies de oasis que se llaman estomates y que están llenos de
pequeñísimas gotitas de jugo de uva (Kerridge, 1998).
20
Es una Levadura de fermentación de baja, tiende a depositarse en el fondo
de los tanques (flocular) en cuanto ha fermentado parte del mosto. En
lengua española se la define como Levadura de fermentación baja, que no
quiere decir que fermente poco, sino que fermenta principalmente en el
fondo.
2.2.1. CLASIFICACIÓN CIENTÍFICA
La clasificación de una Saccharomyces carlsbergensis es (Kerridge, 1998):
Reino: Fungi
Filo: Ascomycota
Clase: Hemiascomycetes
Orden: Saccharomycetales
Familia: Saccharomycetaceae
Género: Saccharomyces
Especie: S. carlsbergensis
Nombre binomial: Saccharomyces carlsbergensis
2.2.2. CARACTERÍSTICAS GENERALES
Es una levadura de alta resistencia al alcohol, lo que presenta grandes
ventajas técnicas y biológicas, el uso de esta levadura permite obtener
mostos con gran riqueza alcohólica (Póo & Millán, 1990), lo que mejora la
potencia de la instalación, consiguiendo una destilación económica, puesto
que habrá menos consumo de combustible.
Es una levadura industrial porque no se perjudica, en su actividad
fermentativa, una concentración de 8-9% de alcohol en volumen.
21
Esta levadura posee resistencia a la acidez, este parámetro se aumenta en
ocasiones para combatir infecciones, igualmente resiste los cambios de
temperatura.
2.2.3. MORFOLOGÍA
Las especies de Saccharomyces carlsbergensis producen pseudomicelio en
cultivos muy viejos, el pseudomicelio está constituido por células brotantes
en las que los brotes hijos (o sea las células hijas) no se desprenden de las
células madres y las células hijas pueden desarrollarse, presentándose
entonces como cadenas de células que se entrelazan dando la impresión de
un micelio (Fernández, 1998) (Sánchez, 1995).
En medio sólido se observan colonias blanquecinas, beige, húmedas y algo
viscosas con aspecto de porcelana como se puede ver en la Figura 7.;
algunas veces las colonias son irregulares, son ovales y pueden medir de 5
– 10 µm (Sánchez, 1995). La levadura puede vivir aislada o formando
colonias.
Figura 7. Colonias de Saccharomyces carlsbersgensis.
(Sánchez, 1995)
2.2.4. NUTRICIÓN
Una levadura S. carlsbergensis puede resistir temperaturas muy bajas sólo
permanece estable, dormida (Gonzalez, 1999). El calor excesivo, sin
22
embargo, la mata. Un mosto que supera los 35ºC es un ambiente aniquilador
de Saccharomyces carlsbergensis (Kerridge, 1998).
Si la temperatura comienza a aumentar, la actividad de la levadura se vuelve
más y más lenta y lo que se debe hacer es tratar de bajar lentamente porque
S. carlsbergensis no sólo odia el calor sino aborrece los cambios bruscos de
temperatura (Serafini, Dillon, Pistoriello & Moyna, 1994). A unos 15 grados
esta levadura puede hacer muy bien su trabajo, el rango de supervivencia es
de 10ºC a 20ºC (Gonzalez, 1995).
La S. carlsbergensis necesita oxígeno para poder vivir y multiplicarse,
puede estar sin él por un tiempo razonable, en el fondo, trabajar en medios
anaeróbicos (Escobar, 2012). S. carlsbergensis puede trabajar bien en
medios alcohólicos como lo son los mostos transformándose en cerveza,
aunque no resiste extremos. Más allá de los 14 grados de alcohol, su trabajo
se hace muy lento (Alma, 1993).
Se ha establecido que S. carlsbergensis requiere 200 mg de Zn, 75 mg de
Fe y 12-15 mg de Cu por litro de medio, para un crecimiento óptimo
(Garassini, 1994).
Además el medio acuoso debe tener un pH min 2.2 – Optimo 4- 6 y una Aw
0.91 – 0.87 para poder desarrollarse de una manera eficiente (Mejía, Albán,
Murcia, Cuervo & Durán, 2009).
2.2.5. BIOLOGÍA
La levadura S. carlsbergensis permite una conversión aproximada del 85%
al cabo de 72 horas y del 90% al cabo de 110 horas en la producción de
etanol. Este microorganismo tiene un porcentaje en peso de carbono del
45%, de oxígeno del 30.6%, de hidrógeno del 6.8%, y de nitrógeno del 9%
(Prescott, Dunn & Palasí, 1992).
23
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA 2.3.
2.3.1. DEFINICIÓN DE FERMENTACIÓN
ALCOHÓLICA
El tipo de fermentación alcohólica de la cerveza es en donde la acción de la
cimasa segregada por la levadura convierte los azúcares simples, como la
glucosa y la fructosa, en alcohol etílico y dióxido de carbono (Escobar,
2012). En detalle, la diastasa, la cimasa, la invertasa y el almidón se
descomponen en azúcares complejos, luego en azúcares simples y
finalmente en alcohol (Kretzschmar & Cuchí, 1991). La fermentación
alcohólica es un proceso anaerobio en el que las levaduras y algunas
bacterias, descarboxilan el piruvato dando acetaldehído, y éste se reduce a
etanol como se puede ver en la Figura 8. (Donmenech, Garcia & Sipiczky,
1992):
Figura 8. Ecuación gráfica de la fermentación alcohólica.
(Donmenech, Garcia & Sipiczky, 1992).
24
2.3.1. TIPOS DE FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
La fermentación desde un punto de vista práctico, se dividen en
fermentación alta y fermentación baja.
2.3.1.1. Fermentación alta
Estas levaduras se desarrollan en la superficie de medios líquidos formando
cadenas largas de hasta veinte células que se separan con dificultad
(Collado, 2001); no sedimentan mientras se realiza la fermentación; al hacer
la prueba de fermentación con rafinosa, sólo la fermentan en una tercera
parte; temperatura óptima de trabajo entre 12°C y 22°C, aunque pueden
seguir trabajando a mayor temperatura (Tabera & Iznaola, 1995). Ejemplos:
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoides,
Schizosaccharomyces pombe.
2.3.1.2. Fermentación baja
Estas levaduras se desarrollan y sedimentan en el fondo del recipiente con
medio líquido, formando pequeñas cadenas de hasta cuatro células;
fermentan totalmente la rafinosa; trabajan de preferencia entre 0°C y 10°C
(Quintero & Sciascio, 2005). La cerveza lager se introdujo en el 1840
(Collado, 2001). Las cerveza lager tienden a ser más pálidas, más
espumosas, más secas y con menos alcohol que cervezas Ale (Roig &
Yérle, 2003). Ejemplos: Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces
pastorianus, Saccharomyces logos.
25
Tabla 6. Características comparativas de los tipos de fermentación
2.3.2. CONDICIONES PARA LA FERMENTACIÓN
ALCOHÓLICA
2.3.2.1. Selección de levaduras
El estudio de la dinámica, cuantificación y composición de los
microorganismos responsables de las fermentaciones espontáneas, ha
mostrado diferencias tanto cualitativas como cuantitativas, en las levaduras
aisladas en una misma zona e incluso dentro de los depósitos de una misma
Fermentación Fondo (S.carlsbergensis)
Fermentación Superficie (S.cerevisiae)
Sedimenta en el fondo al final de la fermentación
Sube a la superficie al final de la fermentación
Metaboliza la melibiosa No utiliza la melibiosa
Fermenta la rafinosa Fermentación parcial de la rafinosa
Fermenta hasta maltotriosa Fermenta hasta maltotetrosa
Fermenta a bajas temperaturas (8 –14 °C)
Fermenta a altas temperaturas (14 – 25 °C)
Forma más compuestos sulfurosos (SO2> 4 ppm)
Forma menos compuestos sulfurosos (SO2< 2 ppm)
Produce menos alcoholes superiores Produce más alcoholes superiores
No crece a 37 °C Si crece a 37 °C
Más sensible a la inhibición catabólica
Menos sensible a la inhibición
Menor actividad respiratoria Mayor actividad respiratoria
26
bodega (Hough, 2006). Las causas de esta variabilidad pueden ser: cambios
en las técnicas de aislamiento, cambios en las condiciones climáticas, etc.
(Bellmer, Knoepfel & Brauwelt, 1990). Por tanto, la necesidad de asegurar la
fermentación alcohólica, así como la tipicidad y reproducibilidad de las
cervezas, requiere cada vez más, el uso de cultivos iniciadores (Donmenech,
Garcia & Sipiczky, 1992). Las levaduras seleccionadas se han utilizado con
excelentes resultados en muchos países, obteniéndose productos finales de
calidad más uniforme que los que se producían con las fermentaciones
espontáneas (Garassini, 1997). A pesar de que existen levaduras
comerciales para realizar las fermentaciones, es más efectivo el uso de
cultivos puros de levaduras que procedan de la zona donde se van a utilizar,
lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas, ya que se cree que
las levaduras que se encuentran en una zona son: específicas del área,
totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona y a la materia
prima, es decir al mosto a fermentar, son responsables al menos
parcialmente, de las características únicas de los productos obtenidos
(Coors, 1997),(Donmenech, Garcia & Sipiczky, 1992).
La selección de la cepa adecuada para cada tipo de fermentación es una
estrategia muy importante para garantizar por un lado una fermentación
correcta, así como para mejorar las características del producto final, ya que
las levaduras pueden producir compuestos que den un toque de distinción al
producto obtenido, tales como el glicerol, ésteres, alcoholes superiores, etc.
(Dellweg, Monat & Brauwissenschaft, 1995).
2.3.2.2. Temperatura
Las levaduras son microorganismos mesófilos, esto hace que la
fermentación pueda tener lugar en un rango de temperaturas desde los 13-
14ºC hasta los 33-35ºC (Martínez, Viguera, Domínguez & López, 1995).
Dentro de este intervalo, cuanto mayor sea la temperatura mayor será la
velocidad del proceso fermentativo siendo también mayor la proporción de
27
productos secundarios ( Drost, 1997). Sin embargo, a menor temperatura es
más fácil conseguir un mayor grado alcohólico, ya que parece que las altas
temperaturas que hacen fermentar más rápido a las levaduras llegan a
agotarlas antes (Geiger & Brauwelt, 2001).
La temperatura más adecuada para realizar la fermentación alcohólica se
sitúa entre los 18-23ºC (Martínez, Viguera, Domínguez & López, 1995).
Por encima de 33-35 ºC el riesgo de parada de fermentación es muy elevado
(Haag, 1994), al igual que el de alteración bacteriana ya que a estas
elevadas temperaturas las membranas celulares de las levaduras dejan de
ser tan selectivas, emitiendo substratos muy adecuados para las bacterias
(Godtfrendsen & Ottesen, 1992). La selección de esta variable es
influenciada tanto por factores fisiológicos como por problemas físicos, es
decir, pérdidas debidas a la evaporación de etanol al trabajar con
temperatura elevada (Harris & Irvine, 1998).
Se debe tener en cuenta que para cada levadura existe una temperatura
óptima de desarrollo, en la cual se muestra activa (Haukeli, Lie & J. Inst,
1998). Además, se tiene una zona independiente de la temperatura óptima
en la cual la levadura aún presenta actividad; a medida que se aleja de la
temperatura óptima su actividad disminuye notablemente (Duarte, 2004). Por
debajo de la temperatura señalada como mínima y por encima de la máxima,
las levaduras continúan viviendo en estado latente, sin embargo, al exponer
cualquier levadura a una temperatura de 55 ºC por un tiempo de 5 minutos
se produce su muerte (Martínez, Viguera, Domínguez & López, 1995).
2.3.2.3. Aireación
Durante mucho tiempo se pensó que las levaduras eran microorganismos
anaerobios estrictos, es decir, debía realizarse la fermentación en ausencia
de oxígeno (Hoggan, 1990). Sin embargo, es un hecho erróneo ya que
requieren una cierta aireación (Sharpe, 2012). Esta oxigenación se consigue
28
en los procesos previos a la fermentación y mediante equipos de aireación
en la elaboración de cerveza (Alma, 1993).
Una aireación sumamente excesiva es totalmente absurda ya que, entre
otras consecuencias en la cerveza, no obtendríamos alcohol sino agua y
anhídrido carbónico debido a que las levaduras, cuando viven en
condiciones aeróbicas, no utilizan los azúcares por vía fermentativa sino
oxidativa, para obtener con ello mucha más energía (Kader, 1998).
El aire es un factor decisivo en toda fermentación, ya que su presencia hace
más vigoroso el crecimiento de la levadura. Hay tres puntos de vista de gran
importancia que favorecen el rendimiento debido a una buena
aireación(Jimenez, Ponc & Elizabeth, 2013):
El libre y constante abastecimiento de oxígeno de cada célula en el
sustrato.
La eliminación rápida del CO2 , porque en concentraciones
relativamente pequeñas inhibe el crecimiento.
El mantener en suspensión las células de levadura, a fin de que
durante la mezcla se renueve constantemente el contacto entre la
membrana celular y el sustrato nutritivo.
Las cantidades de aire que se precisan para la producción de levadura, varia
entre 275 y 530 pies3/lb de levadura con un contenido de 30% de materia
seca (Briceño, 2009). Al comenzar la fermentación se debe procurar que la
aireación no sea muy intensa, porque el contenido alcohólico del medio es
escaso y pueden proliferar fácilmente los mohos que atacan a las levaduras
del cultivo (Infante, Dombek, Rebordinos, Cantoral & Young, 2003).
Los efectos de la aireación son más críticos en la fermentación en continuo,
debido a la necesidad de mantener en este tipo de crecimiento la levadura,
una velocidad de fermentación satisfactoria (Mesa, Infante, Rebordinos &
Cantoral, 1999).
29
2.3.2.4. pH
El pH de la cerveza (3,5- 4,5) no es el más adecuado para la vida de las
levaduras, menos para la de las bacterias, prefiriendo convivir con valores
más elevados (Dulau & Palacios, 2003). Cuanto menor es el pH peor lo
tendrán las levaduras para fermentar, aunque más protegido se encuentra la
cerveza ante posibles ataques bacterianos. Además, más elevada será la
fracción de sulfuroso que se encuentra libre (Mesa, Infante, Rebordinos,
Sánchez & Cantoral, 2000).
Este es un factor importante en la fermentación, debido a su importancia en
el control de la contaminación bacteriana como también al efecto en el
crecimiento de las levaduras, en la velocidad de fermentación y en la
formación de alcohol (Costa, 2010).
Durante la fermentación la levadura toma el nitrógeno de los aminoácidos
orgánicos, perdiendo su carácter anfótero y pasando a ácidos, lo cual origina
una disminución del pH del medio (Ramón, 2010).
Cuanto más bajo el pH del medio, tanto menor el peligro de infección, pero si
se trabaja con pH muy bajos la fermentación es muy lenta, ya que la
levadura no se desarrolla de la forma conveniente. Según estudios se halló
que el pH más favorable para el crecimiento de la Saccharomyces
calrsbergensis se encuentra entre 4.4 - 5.0, con un pH de 4.5 para su
crecimiento óptimo (Póo & Millán, 1990).
2.3.2.5. Nutrientes y Activadores
Las levaduras fermentativas necesitan los azúcares para su catabolismo, es
decir para obtener la energía necesaria para sus procesos vitales, pero
además necesitan otros substratos para su anabolismo como son nitrógeno,
fósforo, carbono, azufre, potasio, magnesio, calcio y vitaminas,
especialmente tiamina (Kerridge, 1998). Por ello es de vital importancia que
el medio disponga de una base nutricional adecuada para poder llevar a
30
cabo la fermentación alcohólica (Rodríguez, Infante, Molina, Domínguez,
Rebordinos & Cantoral, 2010). El nitrógeno es de todos el más importante,
siendo necesario que el mosto contenga inicialmente nitrógeno amoniacal y
en forma de aminoácidos por encima de 130-150 ppm (Gonzalez, 1999).
Una deficiencia de estos nutrientes hará que ataque contra las moléculas
proteínas, liberándose H2S (aroma a huevos podridos) (Vaughan & Martini,
1995). La presencia de esteroles y ácidos grasos insaturados es también
necesaria obteniéndolos inicialmente del mosto y posteriormente de las
células madres. Esteroles y ácidos grasos insaturados de cadena larga son
necesarios fundamentalmente para que sus membranas celulares puedan
ser funcionales (Escobar, 2012). Suelen usarse diversas materias como
solución nutritiva, lo importante es que contengan los elementos
indispensables para conservar la vida de los microorganismos; ellos son los
carbohidratos, nitrógeno y sales adecuadas propias para cada organismo
(Serafini, Dillon, Pistoriello & Moyna, 1994).
2.3.2.6. Concentración inicial de azúcares
No podemos pensar en fermentar un mosto con una concentración muy
elevada de azúcares (Civello, 1994). En estas condiciones osmófilas las
levaduras simplemente estallarían al salir bruscamente el agua de su interior
para equilibrar las concentraciones de solutos en el exterior y en el interior
de la célula, es decir, lo que se conoce como una plasmólisis (Cárdenas,
2004). El carbono es suministrado por los azúcares contenidos en la materia
prima, siendo la concentración de azúcar un valor que se debe considerar ya
que afecta la velocidad de la fermentación, el comportamiento y el desarrollo
de las células de la levadura(Fernández & Jiménez, 2003).
Suele ser satisfactoria una concentración de azúcar del 10 al 18%, el valor
más corriente es del 12%. Cuando se trabaja con concentraciones de azúcar
muy altas, del orden de 22%, se observa una deficiencia respiratoria en la
levadura y un descenso de la velocidad de fermentación (Puigdomenech,
31
2012); por el contrario, al trabajar con concentraciones muy bajas, el proceso
resulta antieconómico ya que requiere un mayor volumen para la
fermentación. Por esto se utiliza como sustrato la melaza, que tiene de 10 -
15% de azúcar (Saavedra, Hodaifa & Muñoz, 2013).
2.3.3. ETAPAS DE LA FERMENTACIÓN
En el caso de las cervezas, el ciclo de fermentación depende del lugar
donde esta se produzca, variando para los casos del tipo fabricado en
Alemania, Bélgica, Inglaterra, Estados Unidos, Brasil o el país de origen que
fuera (Tabera & Iznaola, 1995). La fermentación alcohólica es la base, sin
embargo, su importancia no radica únicamente en la obtención de etanol a
partir de los azúcares, sino que además durante el proceso fermentativo se
van a formar una gran cantidad de productos secundarios que influyen en la
calidad y tipicidad de la cerveza, generalmente procesos no controlados
desarrollan aromas y características no deseables, en la Tabla 2 se
presentan algunos ejemplos (Sanchez, 1992).
Tabla 7. Principales subproductos no deseables presentes en la cerveza
PRODUCTO AROMA
Diacetilo Mantequilla
Lactato de etilo y su succinato de etilo Café
Acetato de etilo Pegamento
Esteres y acetatos Vegetales
Vinil-fenoles Farmacia, aroma fenolazo
Etil-fenoles Orina de caballo
32
En un principio, antes del inicio de la fermentación, el mosto contiene una
gran cantidad y variedad de microorganismos como hongos, bacterias,
levaduras e incluso protozoos (Collado, 2001). Al inicio de la fermentación,
las levaduras y las bacterias empiezan a multiplicarse, ya que inicialmente el
caldo supone un medio adecuado, que poco a poco se va haciendo más
inhóspito, debido a la formación de alcohol, la disminución de azúcares
necesarios para su catabolismo y la reducción de los nutrientes necesarios
para su anabolismo. Una vez superado un periodo inicial de adaptación, las
poblaciones de levaduras y bacterias se incrementan rápidamente, pero
estas últimas pierden la batalla de la supervivencia, permaneciendo durante
gran parte del proceso fermentativo en un estado de latencia (Uscanga,
Gaviño, Córdova & Pacheco, 2009). La velocidad del proceso fermentativo
ésta ligada a la densidad de población de levaduras fermentativas (Dequin,
Barre, Feuillat, Sablayrolles, Blondin & Salomon, 2000). Primero sucede una
etapa de adaptación, seguida de una segunda etapa de crecimiento
exponencial, que va siendo cada vez menor hasta llegar a una etapa de
crecimiento nulo como se puede ver en la Figura. 9, donde el número de
nacimientos es igual al número de defunciones. Tras esta etapa la
mortalidad comienza a ser mayor a la multiplicación, lo que corresponde a
las últimas fases de la fermentación (Gancedo, 2007).
Figura 9. Población de levaduras en las etapas de la fermentación.
(Gancedo, 2007).
33
En el caso de Saccharomyces carlsbergensis, se muestran 5 fases de
crecimiento. La fase lag, es un período de adaptación en el cual la célula se
prepara para dividirse (Nodarse, 2007). Durante la fase logarítmica las
células alcanzan su máxima velocidad de duplicación y llevan a cabo un
metabolismo fermentativo del que se produce etanol (Collado, 2001). Al
disminuir los nutriente, las células atraviesan por el cambio diáuxico, un
periodo breve de tiempo en el cual no hay división y la célula cambia de un
metabolismo fermentativo a uno respiratorio. En la fase postdiáuxico las
células usan como fuente de carbono el etanol producido durante la fase
logarítmica y en la fase estacionaria se presenta cuando los nutrientes del
medio se han agotado y no hay división celular (Tabera & Iznaola, 1995).
2.3.3.1. Fase lag
Fase de inactividad de duración variable ya que depende del número de
células así como de las características metabólicas de las mismas. Grandes
fases lag indican la presencia de sustancias tóxicas, muerte de células o
inactividad de éstas (Marrero, Galindo & Torres, 2009).
2.3.3.2. Fase temporal de aceleración
No ha sido definida matemáticamente pero en ellas las proporciones de las
células hijas tienden a alcanzar el 50% de la población total (Roig & Yérle,
2003).
2.3.3.3. Fase de crecimiento exponencial
La fase exponencial es un período caracterizado por la duplicación celular.
El número de nuevas células que aparecen por unidad de tiempo es
proporcional a la población actual. La velocidad de crecimiento es máxima y
el tiempo de generación es mínimo (Coors, 1997).
34
Durante esta fase las células consumen los nutrientes del medio a velocidad
máxima si el crecimiento no se limita, la duplicación continuará a un ritmo
constante, por lo tanto el número de células y la tasa de crecimiento de la
población se duplica con cada período de tiempo consecutivo.
Para este tipo de crecimiento exponencial, representando el logaritmo
natural del número de células frente al tiempo se obtiene una línea recta. La
pendiente de esta línea es la tasa de crecimiento específica del organismo
que es una medida del número de divisiones por célula y por unidad de
tiempo (Sharpe, 2012).
La tasa real de este crecimiento depende de las condiciones de crecimiento,
que afecta a la frecuencia de los eventos de división celular y a la
probabilidad de que ambas células hijas sobrevivan. Bajo condiciones
controladas, las células pueden duplicar su población cuatro veces al día.
El crecimiento exponencial no puede continuar indefinidamente, porque el
medio llega pronto al agotamiento de nutrientes mientras se acumulan los
desechos (Hoggan, 1999).
Las levaduras crecen siguiendo una progresión geométrica en la que el
número de células se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado
tiempo de generación (Haag, 1994).
Las levaduras crece en un medio líquido, por tal motivo las células que se
producen en cada división continúan su vida independientemente en la
mayoría de los casos formando una suspensión de células libres (Sharpe,
2012).
Cuando una célula aislada comienza a crecer sobre un substrato sólido, el
resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Se denomina
unidad formadora de colonia (UFC) a una célula viva y aislada que se
encuentra en un substrato y en condiciones ambientales adecuadas y
produce una colonia en un breve lapso de tiempo (Coors, 1997).
35
La relación entre la velocidad específica de crecimiento y la concentración
de sustrato puede ser representada por la ecuación de Monod (Haukeli &
Lie, 1998).
La eficiencia de un proceso industrial de producción de biomasa como es el
caso de la levadura se mide fundamentalmente en base al valor dl
rendimiento celular (Hoggan, 1999). Los valores óptimos a partir de azúcares
están alrededor de 0.5 g de biomasa seca por g de azúcar asimilada.
La temperatura óptima del proceso se ha establecido en 12.5 °C; a mayores
temperaturas disminuye el rendimiento, probablemente debido al aumento
de energía de mantenimiento (Gooding, 2007).
El rendimiento celular puede también afectarse por la presencia de
inhibidores como S02, ácido aconítico y metales pesados o restos de
herbicidas o bactericidas que pueden estar presentes en las melazas
(Izquierdo, 2009).
Para alcanzar rendimientos aceptables, que pueden ser cercanos al 0.5 g
por g de azúcar, la concentración de la fuente de carbono debe mantenerse
debajo de ciertos límites para evitar la producción de alcohol (Ward, 1991).
El tiempo de proceso para la última etapa puede variar entre 10 y 20 h
durante el cual la población de levadura puede multiplicarse entre 6 y 7
veces (Lobato, 2001).
Un proceso correctamente conducido debe facilitar lo que se denomina
maduración de la levadura, que se logra manteniendo el mosto fermentado
una hora más después del agregado de nutrientes con una aireación muy
suave (Dulau & Palacios, 2003).
Durante este período, los sustratos no empleados hasta ese momento son
asimilados, y las células con brotes completan su desarrollo (Carrau, 2005).
36
2.3.3.4. Fase estacionaria
Aquí ya se ha alcanzado el máximo valor de producción, en esta fase
algunas células se dividen y otras mueren donde las células vivas utilizan los
compuestos provenientes de las muertas como nutriente (Quintero &
Sciascio, 2005), manteniendo la población constante durante la fase.
2.3.3.5. Fase de muerte
Dado que la población celular presente no se mantiene por sí misma
comienza a morir. Tiene un comportamiento exponencial. Muchos procesos
se terminan antes de que inicie esta fase.
GEOMETRÍA DE BIORREACTORES QUÍMICOS 2.4.
Los biorreactores, ordinariamente llamados fermentadores, son recipientes
de reacción, en los que se crean técnicamente las condiciones óptimas para
el cultivo y la multiplicación de microorganismos (Jimenez, Ponc & Elizabeth,
2013), (Ulloa, Libkind, Fontanla & Van, 2009).
La forma de construcción de los biorreactores depende principalmente de si
se prevén para un funcionamiento discontinuo, por cargas o para un proceso
de fermentación continuo (López & Ochoa, 2013).
Para las fermentaciones en procesos discontinuos, así como para la
fermentaciones en continuo se emplean diferentes tipos de biorreactores,
por ejemplo los tanques de fermentación con agitación, los fermentadores
agitados por burbujeo, fermentadores con agitación por ruedas de paletas
(Guarda, 2010). Se puede observar un modelo clásico de un tanque por
agitación en la Figura. 10.
37
Figura 10. Estructura de un tanque cilindro cónico.
(Guarda, 2010).
La posición geométrica de estos recipientes en lo que afecta al modelo del
flujo del liquido, contribuye significativamente a la realización de una
fermentación medida en términos de rendimiento y velocidad de producción
(Echeverry, Quintero, Ramirez & Alvarez, 2004). La principal influencia en el
modo de operar de los reactores deriva de las propiedades físicas de los
propios microorganismos (Tabera & Iznaola, 1995), (Dequin, Barre, Feuillat,
Sablayrolles, Blondin & Salomon, 2000).
2.4.1. TIPOS DE BIORREACTORES
(FERMENTADORES)
Los biorreactores se clasifican de diversas maneras, de acuerdo con el
criterio que se utilice para ello: tipo y forma del biocatalizador, configuración
del biorreactor, modos de operación, forma en la que se suministra la
38
energía para la agitación, entre otros. Con base en las similitudes en el
modelamiento matemático, los biorreactores pueden agruparse de la
siguiente forma: biorreactores de tanque agitado, biorreactores de columna
de burbujeo, biorreactores con biocatalizador inmovilizado y biorreactores
con separación integrada de producto como se puede ver en la Figura. 11 y
la Figura. 12 (Echeverry, Quintero, Ramirez & Alvarez, 2004).
Figura 11. Tipos de fermentadores, Discontinuos y continuos.
(Coors, 1997)
39
Figura 12. Tipos d Fermentadores, Tubular, De Lecho Fluidizado.
(Coors, 2007)
2.4.2. TANQUES FERMENTADORES CILINDRO
CÓNICOS
El tanque cilindro cónico es en la actualidad la elección de la mayoría de los
cerveceros y lo que parecía muy prometedor al principio como era la
fermentación en continuo para lograr una reducción del tiempo de
fermentación (Garassini, 1997).
Los tanques cilindro cónicos más utilizados en la industria cervecera son
reactores de tipos discontinuos (Guarda, 2010)
Durante todos estos años el número de trabajos científicos aparecidos
acerca de: los métodos de trabajo con este tipo de tanques, las
características construccionales, los resultados obtenibles, los aspectos
económicos de su uso, son números.
40
Las patentes de Nathan para un recipiente cerrado para fermentación se
remontan a los años 1908 y 1927 (Garassini, 1997). Tras ofrecer una serie
de conferencias acerca de su invento y patente, con vistas a mejorar la
fermentación y maduración de la cerveza, popularizó su uso y
posteriormente dio lugar al nombre del más común de los tanques cilindro
cónicos (Guarda, 2010).
El sistema, que en un principio estaba diseñado para usarse en países de
clima tropical para de este modo reducir las infecciones, implicaba el uso de
un tanque cilindro cónico e inyección de la levadura por el fondo del mismo.
Después de la fermentación la levadura se sedimentaba al fondo con lo que
se podía proceder a la maduración de la cerveza en el mismo tanque
(Tabera & Iznaola, 1995).
Como continuación de las investigaciones llevadas a cabo con los tanques
cilindro cónicos a mediados de los años 60 aparecieron otros tipos de
tanques cilíndricos: el tanque Asahi que se diferenciaba por tener un fondo
plano aunque con una ligera pendiente lateral para permitir recolectar la
levadura. Este tanque se diseñó para ser usado en fermentación y
maduración aunque al final de la fermentación se hacía necesario el trasiego
a un tanque diferente (López & Ochoa, 2013).
Posteriormente, en el año 1968 la compañía Rainier desarrollo el unitanque
que se caracterizaba por tener un suelo con una ligera pendiente en el
centro como se puede ver en la Figura. 13, este tanque no precisaba de un
trasiego de la cerveza entre el final de la fermentación y el inicio de la
maduración, aunque poseía unas características de enfriamiento muy lentas
(Escobar, 2012).
Con todo ello empezaron los estudios para ver cual era el diseño óptimo de
un tanque, así como del proceso de fermentación y maduración.
41
Figura 13. Partes de un tanque cilindro cónico clásico.
(Escobar, 2012)
La geometría de los tanques fermentadores ha constituido en la mayor parte
de las cervecerías del mundo una fermentación principal hasta el límite,
seguida de un corto período a temperatura alta para reducción del diacetilo,
enfriamiento posterior y eliminación de la levadura por centrifugación
previamente a una filtración de la cerveza junto con un tratamiento
estabilizador coloidal de la misma (Echeverry, Quintero, Ramirez & Alvarez,
2004).
3. METODOLOGÍA
42
METODOLOGÍA 3.
PROPAGACIÓN CELULAR 3.1.
Tomando cepas puras de Saccharomyces carlsbergensis, cultivadas en
laboratorios propios de la empresa, se procedió a su propagación partiendo
de una dilución de 15 mL en la primera etapa, 200 mL en la segunda etapa,
5000 mL en la tercera ( sin tomar en cuenta el volumen de agua adicionada
para disolver el alimento de levadura) y 200 hL en la cuarta. Se puede
revisar el procedimiento en el Anexo 1.
Tabla 8. Dosificación de levadura en cada etapa de propagación.
Para la primera y segunda etapa se utilizó mosto sin oxigenar con 16 ºP
(grados plato) que luego se diluyó hasta alcanzar 11.3 ºP. Para las
siguientes etapas se utilizó mosto de 16 ºP.
Etapa
Volumen de mosto
esteril
Alimento de
levadura (g)
Volumen de agua
adicionada para
disolver alimento de
levadura (ml)
Primera 15 mL 0,02 20
Segunda 200mL 0,04 40
Tercera 5000 mL 0,2 100
43
FERMENTACIÓN 3.2.
Se dio inicio a la fermentación con la dosificación de 40 hL de levadura
propagada a cada tanque cilindro cónico que contenían aproximadamente
3200 hL de mosto estéril y frío.
3.2.1. CONTROLES MICROBIOLÓGICOS
a. Se comprueba que la levadura a dosificar esté libre de
contaminaciones, realizándose cultivos de rutina, las siembras se las
realiza en medio NBB-C, que indica la presencia de bacterias
aeróbicas.
Si el medio se torna de un color rojizo la presencia de bacterias
aeróbicas es positiva, si se mantiene con un color amarillo ladrillo su
resultado es negativo como se puede ver en el Anexo II
b. Se comprueba la esterilidad de los tanques a ser utilizados realizando
siembras microbiológicas en medio NBB-B, que mide la presencia de
bacterias dañinas.
Si el medio se torna rojizo su resultado es positivo, si se mantiene
amarillo ladrillo su resultado es negativo, como se observa en el
Anexo II.
3.2.2. CONTROLES OPERATIVOS
Se realizan dosificaciones iguales a los 4 tanques a realizar el seguimiento.
Los parámetros controlados son volumen de mosto, extracto original de la
mezcla, tiempo de reposo, temperatura, aireación y la prueba de yodo, sus
resultados se muestran en la Tabla 4.
44
Tabla 9. Resultados de parámetros de control de tanques.
Para los 4 tanques se utiliza una dosificación de levadura proveniente de la
misma propagación.
ANÁLISIS EXPERIMENTALES 3.3.
3.3.1. CONTAJES
El contaje de levaduras es el análisis que nos va a permitir saber de manera
certera como se va desarrollando el crecimiento en cada tanque.
Se realiza contajes durante 258 horas a cada tanque, durante las 102
primeras horas, el seguimiento se lo hace cada 3 horas, luego se lo realiza
TANQUE 1 TANQUE 2 TANQUE 3 TANQUE 4
Volumen (hL) 3217 3215 3217 3216
Extracto
Original (ºP) 15,45 15,42 15,46 15,39
Tiempo de
reposo (min) 20 20 20 20
Temperatura
(ºC) 12,6 12,5 12,4 12,5
Aireación
(ppm) 12,93 13,0 12,99 12,96
Prueba Yodo OK OK OK OK
45
cada 12 horas, como se puede observar en el Anexo II. Para este análisis se
utiliza la técnica adjunta en el Anexo III establecida por la compañía.
3.3.2. DIACETILO
El control de este parámetro es importante ya que es producido por las
levaduras y por consiguiente un alto valor de este nos indica que la
fermentación aún continúa. Se realiza el análisis de diacetilo cada 12 horas
durante 219 horas. Para este análisis se utilizó la técnica de la ASBC
Methods of Analysis-Beer-25: Diacetyl
3.3.3. EXTRACTO PRESENTE
La medición de este parámetro pudo indicar de que manera están
consumiendo el sustrato las levaduras, y este debe ser inverso al
crecimiento de la población
Este análisis se lo realiza cada 12 horas durante 219 horas. Se utiliza la
técnica establecida por la compañía como se puede ver en el Anexo IV.
3.3.4. TEMPERATURA
Se realiza seguimiento de este parámetro para poder asegurar que las
condiciones dadas a cada tanque sean las óptimas y permitan su
crecimiento normal, una deficiencia o exceso de este parámetro puede
afectar directamente a nuestro objeto de estudio. Se realiza el seguimiento
cada 12 horas durante 219 horas, y se utiliza la técnica establecida por la
compañía como se puede ver en el Anexo V.
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS
46
ANÁLISIS DE RESULTADOS 4.
CARACTERIZACIÓN DE LA LEVADURA PROPAGADA 4.1.
Para comprobar que la propagación es apta para la fermentación se realizó
análisis de viabilidad utilizando la técnica descrita en ASBC Methods of
Analysis-Yeast-3:Yeast Stains, su resultado fue del 98%, para que una
fermentación alcance los resultados esperados se utiliza una levadura cuya
viabilidad no sea menor al 95% (Collado, 2001), es decir, fue apta para ser
empleada en nuestra experiencia. También se analizó su consistencia
utilizando la técnica descrita en ASBC Methods of Analysis-Yeast-
1:Consistency, su resultado fue de 35% que nos indica que la propagación
es apta para ser utilizada, una propagación debe tener el 30% de
consistencia para ser empleada en la fermentación (Donmenech, Garcia &
Sipiczky, 1992). La Tabla 5 muestra las características de la levadura que se
utilizó para la experiencia.
Tabla 10. Características de la levadura utilizada para seguimiento.
Generación A0
Consistencia 35%
Viabilidad 98%
PROCESO DE FERMENTACIÓN 4.2.
4.2.1. INFLUENCIA DEL CRECIMIENTO
EXPONENCIAL EN EL EXTRACTO PRESENTE
El extracto inicial es de 15.46 ºP, el mosto tiene los azucares necesarios
para que la levadura comience a reproducirse (Godoy, 2005). La disminución
de este parámetro, como se observa en la Figura 14., nos indica un
desarrollo normal del crecimiento exponencial, ya que en la etapa de 3 horas
47
a 75 horas es donde existe una disminución rápida hasta llegar a los 6.2 ºP,
la etapa de crecimiento logarítmico representa una disminución importante
en su sustrato (Brock, 2003) para los 4 tanques detallados como CC1 hasta
el 4to. Luego de este periodo su descenso es lento, al detenerse
paulatinamente el crecimiento celular.
Figura 14. Consumo de extracto presente durante la fermentación
4.2.2. INFLUENCIA DEL CRECIMIENTO
EXPONENCIAL EN EL DIACETILO
El mecanismo de la formación de Diacetilo como se puede ver en la Figura
15. comienza con el ácido Pirúvico (o Piruvato) y el acetaldehído, que son
transformados en ácido alfa-acetoláctico (o Alfa-Acetolactato) dentro de la
célula de la levadura (M.R.Adams, 2006). Al fugarse este ácido del interior
de la levadura, aparentemente por oxidación es transformado en diacetilo.
Esta vía es inhibida por la síntesis del aminoácido Valina que utiliza ácido
alfa-acetoláctico para su formación y por consiguiente reduce la cantidad de
este ácido que puede llegar a transformarse en diacetilo.
48
Figura 15. Mecanismo de la formación de diacetilo.
(M.R.Adams, 2006).
Por lo tanto, mientras más cantidades de levadura exista la cantidad de
diacetilo va disminuyendo, es por ello que si revisamos la Figura 16. hasta
las 51 horas se produce un descenso brusco de diacetilo de 760 ppb a 340
ppb, luego de esta etapa el crecimiento celular es en menores rangos e
inicia el periodo de fermentación donde las pocas levaduras que continúan
utilizando los aminoácidos libres (valina y leucina) siguen consumiendo el
diacetilo restante.
Figura 16. Consumo de diacetilo durante el proceso de fermentación.
49
4.2.3. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN EL
CRECIMIENTO CELULAR
La temperatura es una medida de la energía cinética de las moléculas, entre
mayor sea la energía cinética en la molécula es mayor la temperatura de la
sustancia (Gooding, 2007), el rango óptimo de inicio de fermentación es de
12 ºC a 13ºC (García, 2008), esto nos asegura un acondicionamiento ideal
para el crecimiento exponencial, como podemos observar en la Figura 17.
hasta a las 75 horas se mantiene dentro de este rango, para nuestro
seguimiento la temperatura oscilo entre los 12.4 ºC y 12.9ºC, al existir gran
movimiento de moléculas durante el crecimiento exponencial la temperatura
tiende a aumentar por lo que su control es crítico. Gracias al estudio
realizado se estandarizó el inicio de temperatura a 12 ºC, este valor se
mantiene constante durante toda la etapa de crecimiento logarítmico.
Figura 17. Control de la temperatura durante el proceso de fermentación
50
IDENTIFICACIÓN DE LA ETAPA DE CRECIMIENTO 4.3.EXPONENCIAL
La Figura 18. muestra que el crecimiento celular se da de una manera
acelerada, el crecimiento logarítmico de microorganismos celulares como la
levadura tienen un promedio 60 horas antes de iniciar propiamente la
fermentación (Brock, 2003).
Figura 18. Resultados de contajes realizados a tanques cilindro cónicos
Para nuestro estudio el crecimiento exponencial termina a las 48 horas, el
rango comprendido entre las 30 horas y las 48 horas muestran una curva
exponencial casi perfecta como podemos ver en la Figura 19.
51
Figura 19. Resultados de contajes en la fase logarítmica.
Concluida la etapa de crecimiento logarítmico se debe estimular la
fermentación (Jagnow, 2001), en los tanques cilindro cónicos para evitar una
fermentación acelerada se disminuye la temperatura inicial de 12.5 ºC a 12
ºC y a las 48 horas se inicia el incremento de temperatura hasta las 96 horas
donde se desea dar inicio a la etapa de fermentación.
Un crecimiento acelerado no controlado de levaduras puede generar
subproductos no deseables como el diacetilo (Palacio, 2006).
CURVAS DE CONTROL DEL PROCESO DE 4.4.
FERMENTACIÓN
Modificados los valores de temperatura (ºC) versus horas de proceso se
puede modificar el consumo de extracto presente (ºP) y se restablecen los
parámetros de control como se observa en la Figura 20.
10000000
11000000
12000000
13000000
14000000
15000000
16000000
17000000
18000000
19000000
20000000
21000000
22000000
23000000
0 9 18 27 36 45
Cé
lula
s
Horas de Proceso
52
Figura 20. Gráfica de control del proceso de fermentación.
En la Figura 25. se presentan los estándares anteriores con color azul y los
estándares actuales en color rojo. Como podemos observar las horas de
proceso se redujeron de 216 horas a 204 horas.
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
53
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 5.
CONCLUSIONES 5.1.
- El crecimiento celular de la levadura Saccharomyces carlsbergensis
dentro de una biorreactor cónico vertical se presenta de manera
logarítmica cuyas características son fundamentalmente estadísticas,
donde se produce una duplicación ordenada de los componentes de
la célula que corresponde a una duplicación de masa.
- Las poblaciones microbianas de Saccharomyces carlsbergensis
raramente mantienen un crecimiento exponencial prolongado.El
crecimiento está limitado por el agotamiento de nutrientes o por la
acumulación de productos del mismo metabolismo microbiano, que
les son tóxicos a la población.
- El tiempo de generación es igual al tiempo de duplicación, este tiempo
va a depender de las condiciones de fermentación como la
temperatura, pH, oxigenación, etc., la velocidad de crecimiento se ve
alterado principalmente por la forma del biorreactor y del tipo de cepa,
lo que otorga a cada especie una velocidad metabólica diferente.
- Alta variabilidad de temperatura dentro de la fase de crecimiento
exponencial puede frenar o acelerar su velocidad de reproducción y
generar subproductos no deseables a la cerveza.
- La presión tiene un efecto contrario a la temperatura, a mayor presión
el crecimiento de la levadura y la velocidad de fermentación
disminuyen. Esto es debido a que aumenta la concentración del CO2
disuelto en el líquido, lo cual afecta la multiplicación de la levadura y
su metabolismo.
54
- El contenido de oxígeno disuelto permite que la levadura entre a la
etapa aeróbica de la fermentación y se reproduzca, es por eso que el
oxígeno favorece el crecimiento de la levadura y la síntesis de ciertos
compuestos necesarios como el esterol y los ácidos grasos, por lo
tanto un alto contenido de oxígeno favorece en el crecimiento de la
levadura.
- Para un tanque cilindro cónico vertical la temperatura inicial se debe
disminuir para frenar un poco el crecimiento logarítmico y no tener
una fermentación acelerada, en nuestro estudio la curva de la
temperatura disminuyó su inicio de 12. 5 ºC a 12 ºC, con lo que se
consigue tener 60 horas en la etapa de fermentación.
- Con las 60 horas de la etapa de fermentación se asegura que las
levaduras consuman el aminoácido valina y descienda las cantidades
de diacetilo hasta tener valores dentro de parámetros de este
subproducto no deseable, para nuestro estudio este parámetro se
encuentra en un promedio de 100 ppb a las 156 horas cuando termina
la etapa de fermentación.
- Para nuestro estudio se logró establecer que el tiempo de crecimiento
exponencial fue de 48 horas, los biorreactores cilindro cónicos
diseñados de forma vertical aumentan la vitalidad de las levaduras
permitiendo que su fase de crecimiento logarítmico tenga un menor
tiempo de duración, por lo que se afirma que el crecimiento celular
tiene una relación directa con la geometría del tanque fermentador.
- Con la modificación de la temperatura se consiguió frenar el descenso
del extracto presente, a las 48 horas cuando se inicia el incremento
de la temperatura para detener el crecimiento logarítmico el extracto
presente se encuentra en 10 ºP, de esta manera se consigue llegar a
un extracto final de 3.5 ºP.
- Los tanques cilindro cónicos al incrementar la viatalidad de las
levaduras disminuyen el tiempo de proceso de la fermentación, las
55
curvas propuestas de temperatura y extracto presente redujeron las
horas totales de proceso de 216 horas a 204 horas, esta disminución
genera ahorros de energía, insumos, mano de obra e incrementa la
eficiencia del proceso.
RECOMENDACIONES 5.2.
Una vez concluida la tesis se considera interesante investigar sobre otros
aspectos relacionados con la fermentación y el crecimiento exponencial y se
propone:
- El estudio matemático del crecimiento exponencial de la levadura
Saccharomyces carlsbergensis, para la determinación de una
ecuación que represente su desarrollo metabólico específico.
- El estudio del incremento de la presión al inicio de la fermentación y
generación de un crecimiento saturado.
- El estudio de las principales causas de autólisis de la levadura dentro
de la fermentación y su efecto en la maduración y filtración.
- Estudio de principales maltas que aporte mayores cantidades de
aminoácidos asimilables al mosto con el fin de aumentar la capacidad
de síntesis de la levadura.
- Estudio de la inclusión de aminoácidos en el mosto para mejorar su
aprovechamiento en la fermentación.
- Estudio de disminución de tiempos en cocimientos de mostos para
incremento de nutrientes (azúcares, alfa-aminos y minerales)
sensibles al calor en el producto final (mosto frío listo para ser
fermentado).
BIBLIOGRAFÍA
56
BIBLIOGRAFÍA
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ANEXOS
64
ANEXO I. PROCEDIMIENTO PARA PROPAGACIÓN
DE LEVADURA
PRIMERA ETAPA
a. Se tomó muestras de 500 ml de mosto (16ºP) sin oxigenar.
b. Se filtró el mosto.
c. Se tomó 353 ml de mosto filtrado y se diluyó a 500ml con agua
destilada (hasta conseguir 11.3°P).
d. Se pesó alimento de levadura.
e. Se tomó dos Erlenmeyer c/u con agitador:
Se colocó 15 ml del mosto diluido + 0.02 g de alimento de levadura
diluida en el Erlenmeyer A.
Se colocó 200 ml de mosto diluido + 0.04g de alimento de levadura
diluida en el Erlenmeyer B.
f. Se tapó y sometió a ambos Erlenmeyer a esterilización por 17 min a
121°C.
g. Una vez estéril el Erlenmeyer B, se lo dejó reposar a temperatura
ambiente.
h. Se colocó en el Erlenmeyer A la levadura obtenida de la cepa.
i. Se incubó a 25°C, 150 rpm. por 24 h.
SEGUNDA ETAPA
a. Se tomó 5000ml de mosto sin oxigenar.
b. Se filtró el mosto.
c. Una vez concluida la etapa 1 (agitación de 24 horas) se colocó la
mezcla propagada al segundo Erlenmeyer (200ml).
d. Se aireó un poco agitando manualmente por unos segundos y se
tapó.
65
e. Se incubó a 20°C, 150 rpm por 24 h.
f. Los 5000ml de mosto filtrado colocar en el carlsberg (equipo
destinado para la esterilización), agregar 0.2 g de alimento de
levadura y esterilizar.
g. Se dejó reposar hasta el siguiente día.
TERCERA ETAPA:
a. Se instaló el carlsberg con las respectivas mangueras de entrada de
aire y materiales de protección.
b. Se colocó mediante un embudo la mezcla del Erlenmeyer B.
c. Se tapó (material estéril) y abrió la llave de aire hasta 0.1 bar de
presión.
d. Se incubó a 20°C por 24h .
CUARTA ETAPA:
a. Se transfirió la mezcla del carlsberg a un tanque propagador de 200
hL con mosto estéril.
b. Luego de la trasferencia se procedió a la comprobación de las
respectivas presiones y entradas de aire para asegurar que la
propagación continúe.
66
ANEXO II. RESULTADOS MICROBIOLÓGICOS
Figura 1.1. Cultivo de levadura en medio NBB-A, resultado negativo.
Figura 1.2. Cultivo de Fermentadores en medio NBB-B, resultado negativo.
67
ANEXO III. CONTAJES
CONTAJES EN UFC
HORAS Tanque CC1
Tanque CC2
Tanque CC3
Tanque CC4
0 25000000 24875000 24750000 25250000
3 26375000 26250000 26125000 26250000
6 26875000 26500000 26375000 26750000
9 26625000 26625000 26875000 26500000
12 27125000 27000000 27250000 27000000
15 27375000 27250000 27375000 27250000
18 27625000 27500000 27500000 27500000
21 27750000 27625000 27875000 27625000
24 28125000 28125000 28250000 28000000
27 28875000 29000000 28750000 28750000
30 29500000 29375000 29375000 29375000
33 30125000 29875000 30250000 30000000
36 31500000 31625000 31250000 31375000
39 40333333 40500000 41333333 40166667
42 40500000 41000000 41666667 40333333
45 43666667 43666667 43833333 43500000
48 43166667 43666667 44000000 43000000
51 44166667 44333333 43833333 44000000
54 44000000 44333333 44500000 44166667
57 44333333 44500000 44666667 44166667
60 44500000 45000000 44833333 44333333
63 44666667 45000000 44666667 44500000
66 44833333 45333333 44500000 45000000
69 43750000 44750000 44750000 45000000
72 44333333 45166667 45333333 44500000
75 43500000 45833333 45000000 44166667
78 44666667 46000000 45166667 44833333
81 44833333 46500000 45333333 45000000
84 45000000 46666667 45500000 45166667
87 45166667 46833333 45500000 45333333
90 45500000 47333333 45666667 45666667
93 45666667 47666667 45833333 45833333
96 46000000 48000000 46000000 46166667
99 48000000 48000000 48166667 48166667
102 49166667 49833333 49000000 49333333
114 48333333 49500000 48333333 48500000
126 48000000 46833333 47500000 48166667
138 45833333 45166667 45166667 46000000
68
150 40000000 43666667 39666667 40166667
162 39166667 39000000 38000000 39333333
174 37000000 36333333 35000000 37166667
186 33500000 31166667 32833333 33333333
198 30333333 29000000 30333333 30166667
210 29000000 28000000 28166667 28833333
222 25666667 24500000 25000000 25500000
234 19000000 17833333 18666667 18666667
246 17000000 17000000 16666667 16833333
258 11500000 15625000 11100000 11300000
69
ANEXO IV. INSTRUCTIVO DE TRABAJO PARA
CONTAJES
70
71
ANEXO V. TÉCNICA PARA ANÁLISIS DE EXTRACTO
PRESENTE
72
ANEXO VI. TÉCNICA PARA ANÁLISIS DE
TEMPERATURA
74
75
76
77
78
79
80
81
ANEXO VII. ENSAYO EXPERIMENTAL, SEGUIMIENTO
A TANQUES.
Figura 7.1. Preparación de material para toma de muestra
Figura 7.2. Toma de muestra en tanques horizontales
82
Figura 7.3. Toma de muestra en tanques cilindro cónicos
83
Figura 7.4. Contajes
84
ANEXO VIII. CONTROL DE CONDICIONES ÓPTIMAS
Figura 8.1. Control de pH
Figura 8.2. Control de oxígeno
85
Figura 8.3. Control de extracto presente
