UNIVERSIDAD MARIANO GÁLVEZ DE GUATEMALA

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

¨SENSIBILIDAD DEL STREPTOCOCCUS MUTANS (ATCC 25175)

A 5 BARNICES Y 7 COLUTORIOS DE MARCA COMERCIAL DE

USO EN ODONTOLOGÍA: ESTUDIO IN VITRO¨

ANA CECILIA CABRERA GÁLVEZ

Guatemala, Noviembre de 2016

UNIVERSIDAD MARIANO GÁLVEZ DE GUATEMALA

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

SENSIBILIDAD DEL STREPTOCOCCUS MUTANS (ATCC 25175) A

5 BARNICES Y 7 COLUTORIOS DE MARCA COMERCIAL DE USO

EN ODONTOLOGÍA: ESTUDIO IN VITRO

TRABAJO DE GRADUACIÓN PRESENTADO

POR:

ANA CECILIA CABRERA GÁLVEZ

PREVIO A OPTAR AL GRADO ACADÉMICO DE:

LICENCIADA EN ESTOMATOLOGÍA

Y EL TÍTULO PROFESIONAL DE:

CIRUJANA DENTISTA

Guatemala, Noviembre de 2016

III

AUTORIDADES DE LA FACULTAD Y DEL TRIBUNAL QUE

PRACTICÓ EL EXAMEN DE TESIS O TRABAJO DE GRADUACIÓN

DECANO DE LA FACULTAD:

M.A. Gedeón Rafael Melgar Marroquín

PRESIDENTE DEL TRIBUNAL EXAMINADOR:

M.A. Carlos Enrique Herrera Díaz

SECRETARIA:

M.A. Dorian Leticia Alas Gordillo de Herrera

VOCAL:

Lic. Rodrigo José Vargas Rosales

IV

V

REGLAMENTO DE TESIS

Artículo 80: RESPONSABILIDAD

Solamente el autor es responsable de los conceptos expresados en el

trabajo de tesis. Su aprobación en manera alguna implica

responsabilidad para la Universidad.

VI

CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCIÓN 1

I. MARCO CONCEPTUAL 3

1. Antecedentes 3

1.1 Contexto 3

1.2 Fundamentación Teórica 5

1.3 Trabajos previos realizados 37

2. Justificación 39

3. Determinación del problema 40

3.1 Definición 40

3.2 Delimitación 40

II. MARCO METODOLÓGICO 40

2.1 Objetivos 40

2.1.1 Generales 40

2.1.2 Específicos 41

2.2 Tipo de estudio 41

2.3 Definición de variables 42

2.3.1 Variable dependiente 42

2.3.2 Variable independiente 42

VII

2.4 Hipótesis del estudio 42

2.4.1 Hipótesis nula 42

2.4.2 Hipótesis alterna 42

2.5 Criterios de inclusión y exclusión 43

2.4.1 Criterios de inclusión 43

2.4.2 Criterios de exclusión 43

2.6 Población, muestra y método de muestreo 43

2.7 Metodología 43

III. MARCO OPERATIVO 49

3.1 Cronograma de actividades 49

3.2 Procesamiento de la información 50

IV. MARCO ADMINISTRATIVO 50

4.1 Recursos (humanos) 50

4.2 Recursos (materiales) 50

4.3 Presupuesto 52

V. INFORME FINAL 53

5.1 Resultados 53

5.2 Discusión de resultados 61

VIII

5.3 Conclusiones 63

5.4 Recomendaciones 64

5.5 Bibliografía 65

5.6 Anexos 68

1

INTRODUCCIÓN

En términos mundiales, entre el 60% y el 90% de los niños en edad escolar y cerca del 100% de

los adultos tienen caries dental, a menudo acompañada de dolor o sensación de molestia. La OMS

(2012) ha declarado que se estima que cinco mil millones de personas en el planeta han sufrido

caries dental. En Guatemala la Dirección de Salud y Bienestar Municipal da seguimiento a los

niños examinados desde el año 2008. En la población estudiantil, examinada y bajo control de los

programas municipales, se ha encontrado una prevalencia del 99% de caries dental.

La caries dental es una enfermedad infecciosa en cuyo comienzo y progresión intervienen

microorganismos que conforman la microbiota habitual de la cavidad bucal.

En la etiología multifactorial para la caries dental se incorporan, el nivel socioeconómico, el estilo

de vida y el estado de salud en general, que a su vez inciden en los hábitos de higiene oral y en el

estado de sistema inmune del hospedador. Los microorganismos más relacionados con el inicio y

la progresión de la caries dental son Streptococcus del grupo mutans y especies de Lactobacillus y

Actinomyces.

Se reconoce al Streptococcus mutans como el microorganismo más importante en la patogénesis

de la caries, lo cual orienta a elaborar medidas de prevención dirigidas hacia la eliminación o

disminución de éste microorganismo en la cavidad oral, que se puedan manejar 100% en el

consultorio dental y no dependan de la cooperación del paciente. En tal sentido, el uso de

antimicrobianos y antisépticos, principalmente de uso tópico o local. Existen investigaciones para

determinar el comportamiento de ciertos compuestos sobre la microbiota oral y bacterias de

Streptococcus mutans, entre las que se pueden señalar las realizadas con clorhexidina, fluoruro y

aceites esenciales; Los cuales tienen múltiples beneficios odontológicos como sus propiedades

antiinflamatorias y antisépticas pero su posible uso como bacteriostático de la principal bacteria

implicada en la formación de placa dentobacteriana, no reúne muchas referencias; he allí donde se

pretende consolidar este aporte a la investigación y por ende al medio odontológico.

2

De acuerdo con lo expresado, y considerando a los barnices y colutorios como un sistema efectivo

para el control de placa dentobacteriana y disminución de la caries dental, es sobresaliente

demostrar la susceptibilidad in vitro del Streptococcus mutans, uno de los principales

microorganismos cariogénicos, a los compuestos de fluoruro y clorhexidina presentes en barnices y

colutorios comerciales, mediante el método de difusión en disco y comparar la susceptibilidad del

Streptococcus mutans a los compuestos mencionados, para sostener su recomendación como

sistema de prevención de la caries dental, recalcando sus efectos ante el microorganismo dentro

de la cavidad bucal.

3

I. MARCO CONCEPUTAL

1. ANTECEDENTES

1.1 Contexto

La caries dental es la enfermedad bucal de origen infeccioso que se observa con mayor

frecuencia en nuestro país sobre todo en áreas rurales desde hace muchos años y la

reincidencia de caries después de los tratamientos efectuados en piezas dentales es muy

común debido a la poca o nula utilización de antimicrobianos. Debido al alto porcentaje de

caries en la población se pretende realizar un estudio in vitro para la inhibición del agente

causante de la caries que es el Streptococcus mutans. Por tal razón la inquietud de realizar el

presente estudio para comprobar la efectividad de diversos agentes antimicrobianos y poder

sustentar su recomendación como método de prevención de la caries dental.

El presente estudio se elaboró en el Instituto de Investigaciones Químicas, Biológicas,

Biomédicas y Biofísicas (I2QB3) de la Universidad Mariano Gálvez con la ayuda de docencia

del área de microbiología de la Facultad de Odontología. El I2QB da inicio en febrero del 2004

gracias a la aprobación del Consejo Directivo de la Universidad Mariano Gálvez de Guatemala.

En junio del 2004 se da inicio a la adecuación de espacios y servicios para la creación de 8

áreas: laboratorio de docencia en química, laboratorio de preparación de muestras químicas,

laboratorio de análisis químico instrumental, laboratorio de biotecnología, laboratorio de

fisiología, laboratorio de microbiología e histopatología, laboratorio de bioseguridad de nivel 3 y

el área administrativa. En el año 2008 se define el sistema de gestión de la calidad con vistas a

la acreditación bajo las normas ISO 17025 e ISO 15189 de diversas metodologías en las

áreas de Química y Biotecnología.

En el año 2012 el nuevo edificio cuenta, entre otras mejoras, con espacios diseñados

específicamente para recepción y manejo de diferentes tipos de muestras con el objetivo de

4

evitar la contaminación cruzada en el caso de muestras para análisis de residuos y la

contaminación hacia el personal en el caso de muestras bioinfecciosas.

En la actualidad se alcanza la acreditación con las normas COGUANOR NTG/ISO/IEC 17025

“Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración” y

COGUANOR/NTG/ISO 15189 “Requisitos particulares para la calidad y competencia de

laboratorios clínicos” para los análisis descritos en el alcance bajo el código de acreditación

OGA-LE-040-2011. (https://i2qb3.umg.edu.gt/quienes-somos/#historia)

5

1.2 Fundamentación Teórica

Negroni, M. (2009) expone que la cavidad oral se considera un ambiente, y sus propiedades

intervienen en la estructura y la actividad de los microorganismos que en él se encuentran. La

ecología de la cavidad oral es el estudio de la relación entre los microorganismos y el

ambiente. Las distintas interacciones ecológicas que se producen en la cavidad oral son las

que determinan las características de su microbiota, en los diferentes nichos ecológicos y en

las diferentes situaciones de salud y enfermedad.

También, resalta que los microorganismos que forman parte de la microbiota oral cohabitan en

ecosistemas que están moderados por una serie de factores conocidos como determinantes

ecológicos internos y externos. La microbiota de la cavidad oral es compleja, hasta el 2001 se

reconocían 500 especies; actualmente se calcula que serían unas 700.

Cuando el feto se encuentra en el vientre de la madre la cavidad oral se mantiene libre de

microorganismos. En el momento del nacimiento la cavidad oral queda expuesta a la

microbiota del tracto vaginal materno, es aquí en donde comienza el origen y desarrollo de la

flora oral, donde aparecen microorganismos tales como especies de corinebacterias,

lactobacilos, coliformes y cocos anaerobios facultativos, anaerobios estrictos y algunas veces

protozoos.

Además, dice que a la cavidad oral del recién nacido la colonizan a partir de las ocho horas los

microorganismos que forman parte de la llamada comunidad pionera. Los primeros en alojarse

y los más numerosos son los estreptococos en la lengua, las mucosas y en la saliva. La

cavidad oral es distinguida y los microorganismos que entran en ella no siempre son capaces

de instaurarse en nichos ecológicos. El medio oral sufre sus mayores cambios alrededor de los

seis meses de vida, momento donde inicia la erupción de las piezas dentarias primarias.

6

Liébana, J. (1995) menciona la distribución de los microorganismos que se encuentran en los

ecosistemas primarios. Es prácticamente imposible mencionar todos los microorganismos que

dominan o pueden dominar los ecosistemas primarios orales. A continuación se presenta la

clasificación microbiana aproximada en dichos nichos ecológicos.

Mucosa – cocos gram positivos anaerobios facultativos.

Labios – abundantes Streptococcus viridans procedentes de la saliva y dorso de la lengua

debido al acto de humedecimiento.

Mejillas – Streptococcus viridans.

Paladar duro – existe una microbiota estreptocócica similar al de la mejilla.

Paladar blando – bacterias propias de las vías respiratorias como Neisseria spp., S.

pyogenes y Streptococcus viridans.

Encía – está íntimamente relacionada con la de placa supragingival y con la localización

subgingival.

Dorso de la lengua – amplias posibilidades para la colonización bacteriana.

Aproximadamente un 45% son cocos grampositivos anaerobios facultativos.

Surco gingival – 50% son cocos grampositivos anaerobios facultativos.

Saliva – al carecer de microbiota propia, todos los microorganismos aislados tendrán un

carácter transitorio y dependerá de la composición de los otros ecosistemas. En general

predominan los cocos grampositivos anaerobios facultativos en un 44%.

Así mismo, menciona los determinantes ecológicos que están compuestos por factores

fisicoquímicos, los cuales van de la mano con la humedad, el pH, la temperatura y el potencial

de óxido reducción que representan las condiciones abióticas para los ecosistemas primarios

de la cavidad oral.

Precedentemente se ha visto como cada género o especie microbiana crece, se reproduce, y

viven en unas condiciones ambientales que si no son excelentes, no deberían de pasar los

límites de tolerancia que al menos, permitan cierta reproducción microbiana.

7

La humedad es un agente muy importante para las bacterias, ya que éstas tienen un contenido

acuoso que oscila entre el 70-80% o más. Dependen de ella para el intercambio de nutrientes,

para las reacciones metabólicas y para la eliminación de productos inhibidores de desecho. El

agua es un agente beneficioso para el crecimiento microbiano en la cavidad oral, ya que su

excedencia es muy alta debido a la saliva, que baña abundantemente todos los ecosistemas

primarios.

El pH en condiciones normales de la cavidad oral oscila entre 6.7 y 7.5, que es el pH ideal

para el crecimiento de la mayoría de los microorganismos relacionados con el hombre. Sin

embargo, el pH está sometido a grandes variaciones. En este sentido, los alimentos y bebidas

dulces o los carbohidratos pueden provocar un declive importante, mientras que las proteínas o

las condiciones en ayunas lo pueden elevar.

La temperatura oral está cerca de los 37°C, que es la temperatura ideal para los

microorganismos que invaden las superficies corporales. La mayoría de los microorganismos

tienen un alto poder para tolerar las circunstancias más desfavorables en cuanto a la

temperatura, y aquellos que no son capaces de aguantar son excluidos, aunque de forma

transitoria, de los ecosistemas primarios.

La mayoría de los microorganismos orales son anaerobios o anaerobios facultativos, hecho

que viene condicionado por los potenciales de óxido-reducción en los ecosistemas en los que

se desarrollan. Las condiciones anaerobias vienen determinadas por dos tipos de factores:

Anatómicos: ya que la morfología de las estructuras orales, como por ejemplo las criptas de la

lengua, los surcos gingivales, las fisuras y áreas proximales de los dientes, limitan la

penetración del oxígeno.

Microbianos: ya que ciertas especies, al consumir oxígeno, generan un bajo potencial de óxido-

reducción local. Esta capacidad reductora va ligada por ejemplo a los estreptococos, Neisseria

spp., Corynebacterium spp. y Rothia dentocariosa.

8

Se concluye la importancia ecológica del potencial óxido-reducción, de tal forma que los

microorganismos aerobios estrictos, para su desarrollo es necesaria la presencia de oxígeno,

no sobrevivirán en ambientes muy reducidos, mientras que los anaerobios estrictos, a los que

el oxígeno les es perjudicial, no lo harán en circunstancias aerobias. Por el contrario, los que

son facultativos (pueden usar el oxígeno o no) y los anaerobios aerotolerantes (el oxígeno no

les es necesario, pero sobreviven en su presencia) podrán desarrollarse ante condiciones tanto

aerobias como anaerobias.

La caries es definida por Schawartz, S., Summitt, B., William, J. y Dos Santos, J. (1999) como

una enfermedad bacteriana con una etiología multifactorial que se caracteriza por la disolución

progresiva del componente mineral del esmalte, dentina, o cemento. La placa bacteriana

produce ácidos que causan la desmineralización de la superficie dentaria, la cual puede ser

seguida por una invasión bacteriana y posterior desmineralización. Si el pH del medio oral

permanece por debajo de 5.5 durante períodos repetidos o extensos, la desmineralización

puede progresar hasta originar la caries.

Negroni, M. (2009) hace referencia que W. Miller propuso la etiopatogenia de la caries dental

en 1882; según Miller el factor más importante en la patogenia de la enfermedad era la

capacidad de gran número de bacterias bucales de producir ácidos a partir de los hidratos de

carbono de la dieta.

Además, cita a Paul Keyes el cual en 1960, estableció que la etiopatogenia de la caries

obedece a la interacción simultánea de tres elementos o factores principales que son:

Microorganismos

Dieta

Diente/hospedero

Tiempo

9

Según Negroni, M. (2009) el paradigma actual de Fejerskov define a la caries dental como ¨una

enfermedad infecciosa, compleja, transmisible y multifactorial, en la que un amplio grupo de factores

biológicos, socio-económicos y culturales interactúan, directa o indirectamente en el establecimiento y

desarrollo de los microorganismos cariogénicos incluidos en la comunidad microbiana de la biopelícula

dental. Afecta a la estructura dura de las piezas dentales y se caracteriza por su desintegración

molecular, localizada y progresiva que lleva, si no se detiene su avance natural, a una lesión irreversible¨.

También, añade que se han encontrado varios factores etiológicos que se le atribuyen al

desarrollo de la caries dental; tanto primarios como secundarios, así también, factores

biológicos y sociales. Otros factores propios del hospedador y del medio influyen en la

transmisión y el crecimiento de la enfermedad cariosa. Algunos factores culturales,

socioeconómicos y del estilo de vida no sólo condicionan hábitos dietéticos, de higiene oral y

de frecuencia y tipo de atención odontológica, sino que además favorecen situaciones de

estrés. Todos los factores del hospedero y del medio, que favorecen la biopelícula pueden ser

definidos como factores de riesgo para el desarrollo de caries.

La interacción de los 3 factores principales representados en el esquema de Keyes que con el

tiempo producen un desequilibrio fisiológico entre el mineral de las piezas dentarias y los

constituyentes de la biopelícula, favoreciendo el desarrollo de la caries dental.

Otro aspecto muy importante es la interacción que se da entre la dieta y la caries dental, ya

que los alimentos son la fuente de los nutrientes para el metabolismo de los microorganismos.

En una dieta sin consumo de carbohidratos, no se presenta producción natural de caries.

La sacarosa es el sustrato para el metabolismo bacteriano. El metabolismo de la sacarosa

tiene 3 fases elementales:

1. Producción de ácidos

a. La mayor parte de la sacarosa que ingresa en la cavidad bucal es utilizada

como fuente energética por los microorganismos.

2. Síntesis de polisacáridos extracelulares

10

a. Antes de que la sacarosa penetre en la célula un porcentaje de ella es

transformada por exoenzimas de S. mutans que la rompen y transfieren cada

fracción hexosa a una molécula receptora y forman polímeros que se difunden

en el medio vecino o permanecen asociados con la célula.

3. Síntesis de polisacáridos intracelulares

a. Una vez que la glucosa o la fructosa penetran en la célula, su destino es ser

catabolizadas por la vía glucolítica. Los excesos de azúcares derivan en un

compuesto que almacena reservas de energía para ser utilizada en los

momentos donde disminuye el aporte de nutrientes.

Los principales microorganismos vinculados con la caries dental, son los que participan en el

desarrollo inicial de la enfermedad y la progresión de las lesiones establecidas.

Numerosos estudios han demostrados que S. mutans está relacionado con la biopelícula de

placa cariogénica y asociado a su principio. En la saliva existe un aumento significativo de

estos microorganismos antes de la formación de la caries dental. La segunda especie de

importancia es el S. sobrinus. Sin embargo, se ha descrito en la literatura la presencia de otros

microorganismos implicados en la progresión de las lesiones establecidas como Lactobacilos

spp., Actinomyces spp. Y otros microorganismos capaces de sobrevivir y proliferar en medios

ácidos.

En mención al tiempo Liébana, J. (1995) dice que el consumo de carbohidratos en la dieta no

es adecuado para iniciar el proceso carioso, sino que además deben permanecer durante un

tiempo determinado en la cavidad oral. El tiempo de desmineralización del esmalte por el

consumo de soluciones azucaradas se estima en aproximadamente 20 minutos y corresponde

a la recuperación del pH por sobre el nivel crítico de la disolución del cristal de apatita.

También, menciona que es la persona que tiene el padecimiento. El diente es la parte de la

cavidad oral que es destruida durante el proceso de caries, y pueden encontrarse dientes con

diferente susceptibilidad o resistencia a incrementar la enfermedad ante el mismo estímulo.

11

Con respecto al hospedero, además del diente, deberá tenerse en cuentan la saliva, que

constituye uno de los factores de protección de más impacto frente a la caries.

Según Liébana, J. (1995) entre los factores del hospedero implicados en la etiología de la

caries se tiene a los dientes y la saliva:

La anatomía de las piezas dentarias influye en la susceptibilidad de diferentes zonas a la

caries. La mayor acumulación o retención de placa dental se da en una anatomía especial de

las superficies oclusales de los dientes e impiden una buena práctica de higiene oral. La

susceptibilidad es mayor cuando las fisuras son profundas o presentan defectos morfológicos.

Otro factor importante que se debe tomar en cuenta es el tiempo transcurrido desde que un

diente erupcionó. Hasta que no se alcanza la maduración posteruptiva del esmalte,

aproximadamente 3-4 años después de su erupción, el diente es más susceptible a la

enfermedad.

Algunos otros factores como los siguientes pueden tener influencia en la enfermedad: la

disposición de los dientes en la arcada; algunas formas de maloclusión, que favorecen la

acumulación de placa y dificulta la autolimpieza; también los pacientes portadores de aparatos

fijos o removibles presenta una mayor susceptibilidad por un motivo similar.

Además, la saliva ocupa un papel importante en el mantenimiento de las condiciones normales

de los tejidos orales, y es un elemento protector vital frente a la caries. Por una parte, ejerce

una acción de autolimpieza, que está relacionada en la eliminación de restos alimenticios y

microorganismos que no están ligados a las superficies orales. Por otra parte, tiene una alta

capacidad de amortiguación que ayuda a neutralizar los ácidos producidos en la placa

bacteriana. Su papel en la remineralización de lesiones incipientes de caries y en el

mantenimiento de la estructura del diente es primordial, ya que está sobresaturada de calcio y

fosfato. Sin embargo, el papel que desempeña en la aparición de la caries, los factores

antimicrobianos salivales, tales como la lisozima, la lactoperoxidasa, la lactoferrina o las

inmunoglobulinas, no están aun perfectamente aclarados.

12

Una reducción de la secreción salival, sobre todo cuando es grave, produce cambios en el

ecosistema microbiano de la cavidad oral, y los pacientes experimentan dificultad en la

masticación, la deglución, la utilización de prótesis y, a veces, en el habla. La caries presenta

una exacerbación, así como las enfermedades periodontales, y los tejidos bucales blandos

están secos e inflamados.

Relacionado con la placa dental Negroni, M. (2009) expone que el metabolismo de la

biopelícula es influenciada por distintos causas, entre las que se especifican: buena higiene

oral, aplicación adecuada de fluoruros, la saliva en el medio oral, las condiciones de oxígeno,

etc. El equilibrio fisiológico entre las piezas dentarias y la biopelícula puede alterarse

dependiendo de las características del medio oral. El pH bajo, causado por la fermentación de

los carbohidratos, selección de la población de cepas acidógenas y acidúricas, tales como los

estreptococos del grupo mutans.

Por esta razón ha mencionado que la formación de la placa se da en dos fases: la primera con

la conjunción de proteínas de la superficie bacteriana con película adquirida, enfatizando que la

película adquirida corresponde a una capa orgánica de glucoproteínas y proteínas depositadas

en superficies recién pulidas del esmalte, cuya función es protectora. En cambio, en la

segunda fase ocurre una co-agregación de bacterias mientras se produce la matriz extracelular

de polisacáridos que envuelven la placa dental en sí. Toda esta coagregación bacteriana de

Estreptococos, posterior anaerobios facultativos y gram negativos aumenta a medida que pasa

el tiempo.

Por tanto, ha recalcado que dentro de la morfología bacteriana hay formas básicas y

agrupaciones diferentes; a las formas esféricas se les denominan cocos, también pueden

llamarle a estas morfologías arriñonadas, ovaladas o ligeramente lanceoladas.

Cocos: conforme los planos del espacio en el que se produzca la incapacidad y la

segmentación de las células para separarse completamente, pueden producirse Diplococos,

cuando la segmentación se produce en un solo plano y quedan dos elementos; Estreptococos,

si la segmentación tiene lugar en un plano pero en forma sucesiva se producen cadenetas.

13

Las formas bacterianas que predomina en la cavidad oral de las personas sanas consisten en

distintos tipos de estreptococos, variados bacilos (especialmente del tipo de los filamentosos) y

diplococos. Cuando se modifican las condiciones locales, por ejemplo, si disminuye la tensión

de oxígeno o aumentan ciertas sustancias, es posible individualizar casi todos los tipos de

formas, de interés médico, descritos. Al examinar una preparación microscópica, hay que

prestar atención al tipo de morfología y agrupación que predomina, dado que la manipulación a

que se someten las muestras altera algo el tipo de presentación.

Los microorganismos, como todos los seres vivos, contienen un alto porcentaje de agua (casi

el 70%). El 30% restante consiste en sustancias que forman su peso seco. A grandes rasgos

en ese peso seco los compuestos que alcanzan mayor proporción son las proteínas; también

ácidos nucleicos, DNA y RNA, lipopolisácaridos, fosfolípidos, otras sustancias químicas y

trazas de otros elementos inorgánicos que integran otras moléculas.

En relación a la temperatura, es posible identificar una temperatura mínima de crecimiento, que

es la temperatura más baja a la que la especie puede crecer, una temperatura ideal de

crecimiento, que es aquella en la que el crecimiento más rápido, abundante y mejor; y una

temperatura máxima de crecimiento, que es la temperatura más alta que soporta ese

microorganismo.

Negroni, M. (2009) ha expuesto que las condiciones atmosféricas para un microorganismo

están dadas por el potencial de óxido de reducción. Lo que se denomina como respiración

bacteriana radica en reacciones en cadena en las que varía el aceptor final de electrones o de

hidrógeno. Si se estima este factor, los microorganismos pueden ser clasificados de la

siguiente manera:

Los microorganismos aerobios son los que necesitan oxígeno, porque éste es el aceptor final

de hidrógeno, con el que forma agua y CO2. Estos microorganismos se distinguen por

producir una enzima catalasa que desdobla el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno

naciente. La prueba de la catalasa se utiliza en el laboratorio para distinguir a estos

microorganismos de los otros.

14

Los microorganismos anaerobios son los que viven en carencia de oxígeno. En este caso el

aceptor final de hidrógeno es un compuesto inorgánico que puede reducirse como los nitratos

y los sulfatos. Un tipo singular es la fermentación, en la que la fuente de carbono provee

energía, el donador de hidrógeno y el aceptor final de éste.

Los microorganismos Microaerófilos son aquellos que requieren bajas concentraciones de

oxígeno para desarrollarse. Estos microorganismos, al igual que los aerobios, utilizan el

oxígeno como fuente de energía, pero no soportan la concentración de oxígeno del aire

atmosférico, sino que necesitan niveles que no superen el 15% de este gas.

Liébana, J. (1995) ha mencionado que los estreptococos son cocos grampositivos que se

asocian en parejas y cadenas cortas o largas, dependiendo del producto patológico y del

medio de cultivo. Carecen de catalasa y son anaerobios facultativos; cuando se desarrollan en

presencia de aire, su crecimiento se ve favorecido por una atmósfera de 5-10 por 100 de CO2.

Su tolerancia al oxígeno se debe a peroxidasas flavínicas y pseudocatalasas; sin embargo, la

carencia de las mismas en algunos casos, y la producción de agua oxigenada por ciertas

especies, supone un efecto enormemente tóxico que se puede prevenir añadiendo sangre a

los medios de cultivo, cuya catalasa desdoblaría al peróxido de hidrógeno. La temperatura

óptima de crecimiento es de 36+/-1. Los estreptococos representan un amplio grupo de

microorganismos: algunos forman parte de la microbiota normal, sin que se haya demostrado

su patogenicidad; otros, por el contrario, se comportan como patógenos, produciendo diversas

infecciones en el hombre y los animales.

Así mismo, ha dicho que los Streptococcus viridans son microorganismos no beta hemolíticos y

difícilmente diferenciables por los serogrupos de Lancefield y por las pruebas fisiológicas

clásicas. A nivel ecológico y desde el punto de vista de su patogenicidad, los Estreptococos

viridans son los más importantes en la cavidad oral.

Estos estreptococos tienen su hábitat principal en la cavidad oral, y están manifiestamente

implicados en la población de superficies duras y blandas de la boca. Su trascendencia

patógena más importante va unida a la formación de placa dentobacteriana, caries, gingivitis,

15

periodontitis y a otros procesos odontológicos (p. ej., abscesos periapicales y periodontales y

pulpitis).

En la cavidad oral, los factores de virulencia más relevantes de estos microorganismos son: la

síntesis de polisacáridos extracelulares solubles e insolubles, la síntesis de polisacáridos

intracelulares y su capacidad para iniciar el desarrollo a pH 5.

Liébana, J. (1995) menciona que el Grupo Mutans está formado por las siguientes especies: S.

ferus, S. sobrinus, S. macacae, S. rattus, S. cricetus, S. mutans, S. downei. En base a su

estructura, no hay diferencia comparado con el modelo general de todos los estreptococos.

El Streptococcus mutans es la especie con los polisacáridos antigénicos del grupo mutans c, e

y f. Sus colonias en agar sangre son alfa o gamma hemolíticas y excepcionalmente beta

hemolíticas. Posee enzimas sintetizando glucanos solubles, insolubles y fructanos, además de

polisacáridos intracelulares de reserva que pueden ser degradados por dextranasas,

fructanasas y glucógeno fosforilasas. Aunque es especialmente acidógeno, no es tan acidúrico

como S. sobrinus. Presenta proteínas fijadoras de glucanos, que intervendrían en la adhesión

a la película adquirida, cuando en ella existen glucanos adsorbidos, y en los procesos de

agregación bacteriana.

El principal hospedador es el hombre, en el que al igual que en diferentes animales

gnotobióticos ha mostrado su poder cariógeno. Coloniza especialmente las superficies duras

de la cavidad oral (esmalte o cemento), aunque se han obtenido también aislamientos a partir

de heces humanas. El Streptococcus mutans induce a lesiones cariosas tanto de superficies

lisas, de fosas y fisuras, como en zonas interproximales y en cemento radicular, siendo más

que posible su papel en la progresión del proceso. A nivel extraoral, Streptococcus mutans

está relacionado con endocarditis subagudas y, más raramente con otros procesos

patológicos.

Esta especie sigue siendo sensible a una amplia gama de antibióticos (p.ej., betalactámicos,

macrólidos y lincosamidas). En los últimos años se ha observado una lenta y progresiva

16

pérdida de sensibilidad, y se han descrito cepas con elevados grados de resistencia a los

aminoglucósidos, y tolerantes a penicilina.

1. Metabolismo de la sacarosa:

El sustrato más importante para estos microorganismos, con relación a su papel como

agentes etiológicos de la caries, es la sacarosa. De su metabolización proviene la

producción de ácidos y la síntesis de polisacáridos extra e intracelulares.

1.1 Producción de ácidos

Sólo una pequeña parte de la sacarosa es obtenida para la formación de polisacáridos

extra e intracelulares; la mayor parte de ella se emplea como fuente energética para el

crecimiento de los estreptococos. En el interior de la célula, la sacarosa aparece bajo la

forma de sacarosa y sacarosa 6P.

La capacidad de producir ácidos (acidogénesis), desarrollarse a pH ácido (acidofilia) y

seguir descendiendo el pH a pH ácido (poder acidúrico), junto con la posibilidad de

recuperación ante descensos bruscos de pH (efecto post pH corto), son factores de

virulencia de estos microorganismos en la cariogénesis.

1.2 Producción de polisacáridos extracelulares

Los Streptococcus mutans son capaces de sintetizar homopolisacáridos extracelulares,

especialmente a partir de la sacarosa, que pueden ser de tres tipos: glucanos hidrosolubles

(dextranos), glucanos hidroinsolubles (mutanos y fructanos). Las proteínas enzimáticas

pueden presentarse localizadas en las superficies bacterianas, libres en el medio

ambiente, o adsorbidas a la película adquirida; en todos estos casos, mantienen su

actividad de sintetizar glucanos, y pueden, de esta forma, ser nexo de unión con otras

bacterias que poseen proteínas fijadoras de glucanos.

17

1.3 Síntesis de polisacáridos intracelulares

Ante un exceso de aporte exógeno de sacarosa, se evita la acción tóxica del azúcar

asesino, y por otra parte se fabrica un material de reserva de gran utilidad en ausencia de

aporte exterior. Cuando falta este azúcar, o cuando los niveles de fosfoenolpiruvato están

bajos, se activa una glucógeno fosforilasa, que agotaría las reservas de polisacáridos

intracelulares.

2. Cultivos

Liébana, J. (1995) describe al Streptococcus mutans como anaerobios facultativos. La

temperatura ideal para desarrollarse es de 36+/-1°C. Aunque pueden multiplicarse al aire, una

práctica aconsejable consiste en incubar las placas inoculadas 24 horas en anaerobiosis y,

posteriormente, otras 24 horas en aerobiosis; esto favorece la formación de agua oxigenada,

que es un importante carácter diferencial y también; la síntesis de polisacáridos extracelulares

que, en algunos casos, pueden facilitar el reconocimiento de las colonias.

Los medios de cultivos son: agar sangre de cordero, MSA (mitis salivarius agar) y como medio

más selectivo MSB (mitis-salivarius-bacitracin), TYCSB (tripticasa, extracto de levadura,

cisteína, sacarosa, bacitracina). Las colonias se presentan elevadas, convexas, onduladas,

opacas, con márgenes irregulares, superficie granular, más o menos adheridas, y con una

burbuja de color brillante rodeándolas cuando producen polisacáridos extracelulares. El

aspecto de las colonias puede diferir mucho no sólo entre las especies, sino también entre

cepas de la misma especie.

Los Streptococcus mutans tienen algunas características fenotípicas que son determinantes de

su cariogenenicidad. Es importante recalcar que no todas las cepas tienen estas

características y que unas son más patógenas que otras. La producción de polisacáridos

extracelulares a partir de la sacarosa, y concretamente de glucanos insolubles (mutanos),

desempeña un papel elemental en la colonización y mantenimiento de estreptococos del grupo

mutans sobre el diente. Esta gran atracción por las superficies dentales se debe a fenómenos

de adhesión, agregación y coagregación. La síntesis de polisacáridos intracelulares por

18

Streptococcus mutans, y su capacidad de metabolizarlos son elementos de virulencia, ya que

ofrecen a la célula un sustrato de donde obtener la energía y mantener la producción de ácido

durante largos periodos de tiempo.

A partir del metabolismo de la sacarosa, estos microorganismos producen principalmente ácido

láctico, que es primordial en la virulencia debido a que aparentemente es el ácido más potente

que interviene en la desmineralización del diente. Además, de acidógenos (productores de

ácido), los estreptococos del grupo mutans son acidófilos, o tolerantes al ácido, propiedad que

les es muy necesaria para sobrevivir y desarrollarse con un pH bajo, y acidúrico o capaces de

seguir produciendo ácido con un pH bajo. Otra característica de los Streptococcus mutans es

su corto efecto post-pH, que puede definirse como el tiempo necesario para recuperar su

actividad de crecimiento habitual cuando, tras estar sometidos a un bajo pH, éste vuelve a la

normalidad. No es de extrañar, según todo lo expuesto, que estas especies bacterianas sean

las que consigan alcanzar más rápidamente el pH crítico de 4.5 necesario para iniciar el

proceso de desmineralización.

Liébana, J. (1995) indica los factores de cariogenicidad de estreptococos del grupo mutans, los

cuales son:

Producción de polisacáridos extracelulares a partir de la sacarosa.

Elementos que determinan fenómenos de adhesión, agregación y coagregación.

Producción y metabolización de polisacáridos intracelulares.

Producción de dextranasas y fructanasas.

Rápido metabolismo de los azúcares a ácido láctico y otros ácidos orgánicos.

Poder acidógeno, acidófilo y acidúrico.

Efecto post-pH corto.

Pueden conseguir el pH crítico para la desmineralización del esmalte más

rápidamente que cualquier otro microorganismo de la placa.

19

Así mismo, nombra el Control de los Factores Etiológicos de la Caries Dental:

1. Control de la dieta: el control de la dieta como mecanismo para prevenir la caries dental es

un agente tan importante como difícil de conseguir:

El uso del azúcar debe racionalizarse

Dieta equilibrada

Cambiar los hábitos dietéticos

Sustitutos de azúcar

Los polialcoholes pueden considerarse importantes sustitutos de la sacarosa (manitol,

sorbitol y xilitol)

La lactosa tiene un menor potencial de cariogenicidad

Los edulcorantes no calóricos tienen en común el hecho de poseer un intenso sabor dulce

y no contener energía, o ser ésta tan reducida que carezca de importancia clínica. No

pueden metabolizarse en la placa.

2. Flúor: el flúor tópico interactúa con el esmalte de los dientes, incorporándose en parte a su

estructura cristalina. Para su aplicación, el flúor puede utilizarse como vehículo en los

dentífricos, colutorios, geles y barnices, que tienen niveles más altos de flúor que el agua

de bebida. Los mecanismos de actuación que parecen tener mayor relevancia implican, la

sustitución por el flúor de los grupos hidroxilo de la hidroxiapatita formando fluoropatita,

que es menos soluble en ácido. El flúor también favorece la remineralización de lesiones

incipientes de caries. Igualmente, aunque ha sido considerado como un mecanismo de

actuación de segundo orden, el flúor tópico tiene un efecto antimicrobiano significativo.

3. Control de placa: si la placa dental influye directamente en la génesis de la caries, es lógico

suponer que su control desempeñará un importante papel en la prevención del proceso.

También resulta importante la monitorización de la microbiota cariógena.

20

Suárez et al. (2011) han mencionado que los antimicrobianos se han descrito como los

coadyuvantes en el control de la placa, cuya finalidad es la de reducir las bacterias implicadas en la

formación de ésta. Liébana, J. (1995) menciona que debido a que las enfermedades de la cavidad

oral, con mayor prevalencia como la caries dental, tiene su origen en la existencia de una placa

previa, se han realizado grandes esfuerzos para encontrar la forma de prevenirlas y eliminarlas;

tomando en consideración, las condiciones del agente, forma de aplicación y antimicrobianos

específicos.

Dentro de las condiciones del agente destacan:

Deben tener un cierto grado de especificidad sobre los microorganismos de las placas, deben

penetrar en la placa y quedar retenidos en el ambiente oral durante largo tiempo, deben ser

bactericidas para evitar fenómenos de resistencia, en caso de ingerirse, se inactivarán en el tubo

digestivo para que no alteren la microbiota normal, no deben tener un efecto tóxico ni alérgico para

el hospedador, deben ser estables para que ejerzan una acción prolongada, no se utilizarán

sustancias que puedan ser útiles en enfermedades más graves, deben tener un sabor aceptable,

bien por sí mismos, o por una combinación con otros agentes y su costo será bajo y fácil su

producción

En relación a las formas de aplicación se encuentran: vía tópica, colutorios, irrigadores, geles,

microcápsulas con liberación lenta del agente, dentífricos y barnices.

Negroni, M. (2009) menciona los principales agentes antimicrobianos: la clorhexidina y los

fluoruros, hace referencia al mecanismo de acción, él cual indica que el gluconato de Clorhexidina

es una bisbiguanida catiónica que posee actividad antibacteriana, una fuerte capacidad para

adherirse a las mucosas, a los microorganismos, a la película adquirida, tiene baja toxicidad,

amplio espectro de actividad contra microorganismos grampositivos y gramnegativos, contra

levaduras. La actividad antimicrobiana varía según su concentración: en bajas concentraciones es

bacteriostático, mientras que en altas concentraciones es un bactericida eficaz.

21

El mecanismo de acción radica en que las células de los microorganismos asociados con la

etiología de la caries se encuentran cargadas negativamente, y las moléculas catiónicas de la

Clorhexidina son rápidamente absorbidas a los grupos fosfato de dichas células bacterianas;

esto altera la integridad de la membrana celular de las bacterias, lo que determina que la droga

sea atraída hacia el interior de la célula, donde aumenta la permeabilidad de ésta y permite

que los componentes de bajo peso molecular, como los iones potasio, sean liberados al

exterior.

También alude que en bajas concentraciones el efecto de la Clorhexidina es reversible y los

cambios estructurales producidos en la membrana citoplasmática son menores que los

observados cuando las concentraciones son altas. Posee capacidad de adsorberse sobre

superficies con cargas eléctricas negativas, tales como las paredes celulares bacterianas, lugar

donde ejerce su actividad bacteriostática o bactericida.

La clorhexidina se une a distintas superficies dentro de la cavidad oral, como la mucosa, la

saliva y los dientes. Después de enjuagarse con clorhexidina, la saliva muestra actividad

antibacteriana por más de 5 horas y su duración en las superficies bucales destruye las

bacterias en la saliva por 12 horas. Este agente antimicrobiano tiene una característica muy

importante, que es, la sustantividad; ya que al adherirse a las superficies bucales de diferentes

características, éstas actúan como reservorios, a partir de los cuales se libera lentamente y así

prolonga su acción antimicrobiana.

Por otro lado hacer referencia a la acción antibiofilm que posee el gluconato de clorhexidina,

éste se incorpora a las superficies antes mencionadas inhibiendo la formación de placa. Sin

embargo, un exceso de sacarosa en el medio por la presencia de una biopelícula madura y

organizada disminuye el poder antimicrobiano de la clorhexidina al no ser éste capaz de

penetrar en las paredes celulares de las bacterias del biofilm.

La clorhexidina se encuentra en las siguientes presentaciones de aplicación clínica: colutorios,

geles, barnices y pastas dentales.

22

Después de su uso prolongado pueden presentarse los siguientes efectos colaterales:

Alteraciones transitorias del gusto

Descamación de la mucosa bucal que desaparece al cesar el tratamiento.

Coloraciones pardo-amarillentas sobre la superficie de dientes naturales, artificiales y

restauraciones de composites, que parecen depender de la concentración del producto y

de la susceptibilidad individual. Sin embargo, la coloración no penetra la superficie y, por lo

tanto, puede eliminarse efectuando profilaxis.

Las pigmentaciones aumentan cuando se ingieren simultáneamente ciertos productos,

como el café, té, vino tinto y también con el uso de tabaco.

Aumento de cálculo supragingival que parece tener una composición distinta a la habitual;

es más fácil su eliminación. Ha sido propuesto que durante su administración se aumente

la frecuencia de higiene bucal.

Negroni, M. (2009) nos dice que los antisépticos utilizados en forma de colutorios bucales

actúan de un modo inespecífico reduciendo los niveles de todos los microorganismos de la

cavidad bucal sin distinguir entre bacterias benéficas y dañinas.

También, añade que el método más utilizado, como coadyuvante de la higiene oral, es el

colutorio en concentración de 0.2% y 0.12% de clorhexidina. Del mismo modo, Anderson ha

demostrado la efectividad del gluconato de clorhexidina al 0.12% en colutorios junto con

hábitos de higiene bucal en adolescentes con ortodoncia fija y su efecto se mantiene hasta los

3 meses siguientes a su uso. No es aconsejable enjuagarse con agua inmediatamente

después de usarlo, ya que puede disminuir su sustantividad.

Por otro lado menciona, que los barnices contienen tres componentes principales: un

disolvente, un sistema de polímero y dos agentes antimicrobianos. Los barnices tienen

actividad antimicrobiana frente a las bacterias grampositivas y gramnegativas. El timol, a pesar

de no ser tan efectivo como la clorhexidina, tiene efecto sinérgico con ésta.

23

Así mismo añade que los barnices presentan las siguientes ventajas:

Pueden utilizarse en áreas particularmente susceptibles, no presentan los inconvenientes

comúnmente asociados al uso de clorhexidina, tienen alta efectividad en concentraciones de

1% de clorhexidina.

El método para la aplicación de los barnices, hace referencia a la limpieza a fondo de la

superficie dental, secar con torundas de algodón y chorro de aire, aplicar una fina capa de

barniz con el aplicador o un cepillo apropiado (esquema); en las áreas proximales, la mejor

manera de aplicar el barniz es mediante hilo dental, dejar que el barniz se seque. El barniz

puede dispersarse con aire, retirar los rollos de algodón una vez transcurridos 30 segundos,

advertir al paciente de que no debe enjuagarse la boca.

Consejos para los pacientes:

Después de la aplicación del barniz, el paciente no debe comer ni beber hasta transcurrida 1

hora. (http://www.ivoclarvivadent.co/es-co/)

En la siguiente imagen se muestra la aplicación ideal de los barnices en caras libres (1) y áreas

proximales (2)

Figura 1. Aplicación de barnices en caras libres.

Fuente: http://www.ivoclarvivadent.co/es-co/

24

Figura 2. Aplicación de barnices en caras proximales

Fuente: http://www.ivoclarvivadent.co/es-co/

A continuación de lo antes mencionado, Negroni, M. (2009) ha referido que uno de los

objetivos más importantes al momento de investigar un antimicrobiano para tratar una infección

es que posea selectividad es decir que no afecte al hospedador. Los fluoruros actúan sobre la

célula bacteriana y alteran su crecimiento al inhibir el metabolismo energético celular. Esta

acción está influida por el pH del medio: la eficacia será mayor cuanto más bajo sea el pH o

cuando mayor sea la concentración del ion flúor. Con un pH de 7 en el medio el fluoruro de

hidrógeno está altamente ionizado, lo que dificulta su acción antibacteriana; se necesitan

12,000 ppm de flúor para penetrar en las membranas de los microorganismos. En cambio, en

soluciones con un pH de 5, el fluoruro de hidrógeno está sin ionizar y basta de 5-7ppm para

actuar contra S. mutans. Otro mecanismo de acción de los fluoruros es la inhibición de la

adherencia bacteriana; esta propiedad varía con la concentración: entre 1 y 30 ppm inhibe la

formación de la película adquirida al modificar las cargas electroestáticas de la superficie del

esmalte y altera la adsorción de los aminoácidos de la saliva, mientras que entre 200 y 500

ppm se une al calcio de la saliva e impide que éste actúe como puente en la colonización inicial

a la película adquirida por parte de los microoganismos.

Por otra parte alude que los fluoruros pueden inhibir el desarrollo de los microorganismos

cariogénicos a través de distintos mecanismos:

25

Inhibición de la adsorción de aminoácidos en la película salival.

Inhibición de la adherencia bacteriana por competencia en la captación de calcio con el

ácido lipoteicoico de la pared celular de las bacterias grampositivas.

Depresión enzimática y, como consecuencia, una reducción de la producción de ácido y de

la síntesis de polisacáridos.

Desadsorción de albúminas.

Además, hace mención de otros antisépticos que son: triclosán, cloruro de cetilpiridinio y timol:

El triclosán es un antiséptico, derivado fenólico no iónico, soluble en lípidos y que carece de los

efectos de tinción de los agentes catiónicos que fue inicialmente incorporado en las

formulaciones de los dentífricos; posteriormente fue incorporado en los colutorios como agente

antimicrobiano. La poca sustantividad del triclosán en boca puede ser aumentada mediante su

combinación con copolímeros de metoxietileno y ácido maleico. Lindhe demostró que la acción

antimicrobiana del triclosán se ve reforzada por el agregado de citrato de cinc y el copolímero

éter-polivinil metílico del ácido maleico. No se han observado efectos adversos importantes

con esta sustancia. Su toxicidad es baja y es altamente liposoluble.

El cloruro de cetilpiridinio es un compuesto de amonio cuaternario, tiene una moderada

actividad inhibitoria de la biopelícula. Reduce la biopelícula en un 35%. El cloruro de

cetilpiridinio se usa en una amplia gama de colutorios bucales antisépticos, habitualmente en

una concentración del 0.05%.

Negroni, M. (2009) cita a Roberts y Addy quienes demostraron que la sustantividad del cloruro

de cetilpiridinio es de a aproximadamente 3 horas y su eficacia puede ser incrementada

duplicando la frecuencia de enjuagues bucales a 4 veces por día. Según otros autores esto

aumenta los efectos colaterales.

El timol es un compuesto aromático de la familia de los fenoles. El timol se halla sobretodo

presente en solución en varios aceites esenciales vegetales, en particular en el del timo. En su

forma sólida el timol toma la forma de unos cristales sin color pero que libera un olor muy

26

acentuado. El timol forma parte de la composición de distintos medicamentos por su poder

antiséptico y antibacteriano.

Algunos colutorios poseen elevadas concentraciones de alcohol o poseen bajo pH, y pueden

producir efectos adversos sobre la superficie radicular, restauraciones y mucosa. La presencia

de alcohol en proporción de hasta un 5% en las formulaciones de clorhexidina parecía

aumentar la efectividad del producto, posiblemente por la estabilización de la mezcla y la

reducción del riesgo de contaminación del producto. Sin embargo, la formulación de la

clorhexidina sin alcohol es igualmente efectiva en el control de la biopelícula dental y la

reducción de la inflamación gingival. Se han observado alteraciones sobre la mucosa en

personas que han usado colutorios con cierta cantidad de alcohol, se ha descrito la aparición

de lesiones blancas en mucosa bucal asociadas al uso prolongado de colutorio con alcohol.

El etanol, tanto en colutorios comercializados como mezclado con agua puede inducir dolor

bucal, según la concentración y la frecuencia. Una elevada concentración de etanol, un valor

bajo de pH y otros ingredientes de los colutorios, como los edulcorantes y colorantes artificiales

y los agentes saporíferos, constituyen irritantes potenciales. Es recomendable que el

odontólogo reconozca el contenido alcohólico y pH de los colutorios, especialmente cuando

decide indiciar colutorio por largos períodos de tiempo. La tendencia es aplicar enjuagatorios

libres de alcohol. (Negroni, M. 2009).

En mención a los procesos microbiológicos Beech FW, Davenport RR (1971) han mencionado

los objetivos que se deben alcanzar para la preservación de cepas microbianas en los

laboratorios de microbiología son: que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos

70-80% de las células, que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan

contaminaciones durante el proceso de conservación, y que las células permanezcan

genéticamente estables.

Negroni, M. (2009) nombra los propósitos para la preservación de cepas viables en el

laboratorio de microbiología:

27

Mantenimiento de cepas para la identificación definitiva por un laboratorio de referencia.

Realización de pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos no habituales.

Fines didácticos

Realización de diversos trabajos de investigación.

Realización de estudios epidemiológicos en casos de brotes de infecciones nosocomiales,

o bien, en casos aislados de agentes etiológicos raros o potencialmente patógenos.

Por otra parte, indica que la preservación puede llevarse a cabo por diversas técnicas, pero las

más utilizadas son:

Para conservar las cepas durante corto plazo se utiliza la refrigeración

Para mantenerlas durante largos períodos se dispone de:

o Criopreservación: consiste en el congelamiento y el almacenamiento de células

vivas a muy bajas temperaturas. Comprende la congelación a -20-40°C a -70-90°C

(ultracongelación), así como a -130-195°C (termos con nitrógeno líquido)

Con el objeto de minimizar los daños que produce la congelación sobre las células

vivas se agregan distintos compuestos químicos a la suspensión celular; estos

compuestos se denominan crioprotectores y los más comunes son: leche

descremada, glicerol, sacarosa, etc., según el método de conservación empleado.

La temperatura de mantenimiento para las bacterias y hongos es de -60-70°C; en

estas condiciones el período de conservación supera los 10 años.

o Liofilización: consiste en la eliminación de agua y otros solventes a partir de una

solución congelada merced al proceso de sublimación (pasaje de un líquido

congelado directamente al estado gaseoso sin transitar por la fase líquida). Esto

permite conservar el material a temperaturas superiores a las requeridas para

mantener suspensiones congeladas y puede prescindirse de la cadena de frío; el

28

resultado es un producto estable y fácilmente rehidratable. Con este método puede

llegar a lograrse períodos de conservación de más de 20 años.

Liébana, J. (1995) hace referencia que los medios de cultivo deben cubrir todas las necesidades

nutricionales de los microorganismos. Esta es la razón por la que se debe incorporar una

mezcla equilibrada de los nutrientes necesarios para permitir su desarrollo y multiplicación in

vitro. Los medios de cultivo son líquidos cuando los nutrientes están en solución acuosa. Si a

un medio líquido se añade una sustancia gelificante, como agar, se obtiene un medio sólido.

Los componentes de los medios de cultivo son: agua, peptona, glúcidos, extracto de carne,

extracto de levadura, suero o sangre de caballo o carnero, líquido ascítico y vitaminas, cloruro

sódico, sales minerales y otras sustancias que los microorganismos sean incapaces de

sintetizar, agentes solidificantes, agar, gelatina, gel de sílice o silicagel.

A continuación hace mención de las condiciones que debe reunir un medio de cultivo:

Para promover el desarrollo microbiano, los medios de cultivo deben reunir ciertos

requisitos: contener nutrientes adecuados, poseer humedad suficiente, tener un pH

ajustado, estar estéril inicialmente.

En relación a las condiciones de los medios de cultivo también menciona la preparación que

deben llevar: en la mayoría de los casos, los distintos constituyentes se van añadiendo al agua

y, una vez disueltos mediante la aplicación de calor, se ajusta el pH al valor adecuado para el

medio, y se reparten en tubos o matraces, que posteriormente se esterilizan. Si se incorporan

al medio sustancias termolábiles, deben esterilizarse por filtración, o añadirse de forma

aséptica después de la esterilización del medio base por el calor. Los medios sólidos se vierten

en placas de Petri, en las que, al enfriarse, solidifican formando una superficie plana. En

cualquier caso, los medios deben conservarse en el frigorífico y en la oscuridad.

Negroni, M. (2009) hace referencia que sembrar un microorganismo es colocarlo en un

ambiente artificial oportuno para que realice su desarrollo, su metabolismo y su reproducción.

29

Las técnicas de siembra varían según el estado físico del medio o las necesidades gaseosas

de los microoganismos (aerobios, anaerobios, etc.). Una condición básica de la siembra es que

se realice bajo rigurosas reglas de asepsia, ya que es indispensable evitar el crecimiento de

bacterias del ambiente en cultivo.

La siembra tiene como finalidad el cultivo, que es el crecimiento de poblaciones microbianas

en un medio de cultivo bajo condiciones de laboratorio. Una de estas condiciones es la

temperatura de incubación, necesaria para brindarle a los microorganismos las condiciones

óptimas para su crecimiento in vitro. Los gérmenes tienen diferentes temperaturas de

desarrollo; la mayoría lo hace a 35°C. Las placas o tubos sembrados con muestras donde se

sospeche la presencia de bacterias anaerobias, independientemente del recipiente en la que

se genere esta atmósfera, deben incubarse al menos durante 48 horas entre los 35 y 37°C y

reincubarse durante 2 0 4 días más para permitir que los microorganismos de crecimiento

lento formen colonias. Luego de la inoculación y la incubación en el medio de cultivo, se

producirá en el lugar donde se depositan los microorganismos su multiplicación, la que se

traduce en la formación de una masa macroscópicamente visible denominada colonia, que es

un clon procedente de un mismo germen y a partir de la cual es posible realizar el aislamiento

y el trasplante.

Así mismo ha dicho que al sembrar el material originario de una muestra clínica por lo general

se obtiene un cultivo mixto (lo que contiene más de una clase de bacterias), del cual es

imprescindible separar los diferentes tipos de colonias para obtener cultivos puros o axénicos,

porque los cultivos mixtos proporcionan información de poca utilidad e incluso errónea. Sólo los

cultivos puros permiten realizar estudios sobre las propiedades bioquímicas (pruebas de

identificación o tipificación) y la sensibilidad a los antimicrobianos selectivos (antibiograma).

Por lo que ha nombrado las diversas técnicas de aislamiento existentes, las más empleadas se

apoyan en el uso de un medio de cultivo sólido, en el cual los microoganismos dan origen a

colonias separadas. Como cada colonia procede de una solo célula, cuando se tiene un

inóculo medido, se habla de unidades formadoras de colonias (UFC). Los métodos de

30

aislamientos más frecuentes son: siembra por agotamiento por estrías, siembra por

diseminación en superficie y siembra de diluciones seriadas

Siembra por agotamiento por estrías: se trata de un procedimiento simple y rápido de

agotamiento progresivo y continuo del inóculo (material microbiano no utilizado para sembrar

un medio de cultivo) sobre un medio sólido contenido en una cápsula de Petri. A medida que

se realizan estrías las bacterias pasan del asa al medio en un número cada vez menor, de

manera que las estrías iniciales proporcionan un crecimiento confluyente, mientras que a lo

largo de las últimas se desarrollan colonias bien aisladas. (Negroni, M. 2009)

Además, ha mencionado que el trasplante de un microorganismo consiste en sembrarlo en un

nuevo medio de cultivo a fin de perpetuar la especie aislada. Luego de realizar una siembra es

imprescindible proceder a la incubación a temperatura adecuada y durante el tiempo necesario

para favorecer el crecimiento de los microoganismos. Como los trasplantes requieren de la

existencia permanente de medios de cultivo, tiempo y mucho dinero, los laboratorios clínicos

recurren a métodos de conservación menos costosos, más efectivos y seguros, cuyo objetivo

es la preservación.

Por otro lado, refiere que para el cultivo de bacterias anaeróbicas deben utilizarse técnicas de

siembra que no son radicalmente diferentes de las convencionales, pero existe una diferencia

básica: todo el proceso debe efectuarse en ausencia de oxígeno, desde la selección,

recolección y transporte adecuado de las muestras clínicas hasta los cultivos, ya que estos

microorganismos pueden morir si son expuestos al oxígeno. La realización de algunos de los

pasos en forma incorrecta puede conducir a resultados erróneos y proporcionar una

información equivocada al profesional de la salud. Por eso, las siembras deben efectuarse de

inmediato, en medios frescos o prerreducidos. Si se desea conseguir condiciones de

anaerobiosis más estrictas que las anteriores, para la incubación de bacterias anaerobias

asociadas con enfermedades humanas existen diferentes sistemas, como por ejemplo: jarra de

evacuación-reemplazo, jarras anaerobias con generados de gas desechable, cámaras

anaerobias.

31

Por consiguiente dice que en la jarra de anaerobiosis con generador de gas desechable para

lograr una atmósfera anaeróbica la técnica se basa en el empleo de un sobre comercial con

dos tabletas, una de borohidrato sódico y otra de bicarbonato de sodio y ácido cítrico. Se

colocan las placas en el interior de la jarra junto con el sobre y se procede al cierre hermético

con la tapa donde se ubica el catalizador. También pueden incubarse con un simple frasco con

vela. Las placas y los tubos sembrados se colocan en el frasco, se enciende la vela y se cierra.

La vela reduce la concentración de oxígeno hasta un punto en que la llama se apaga. Esto

proporciona una atmósfera con una concentración cercana al 3% de CO2.

Medios de cultivo empleados:

El Agar Tripticasa de Soya es usado para el cultivo de una amplia variedad de

microorganismos. Éste agar está conforme a los requerimientos armonizados de las

Farmacopeas. En 1955, Leavitt et al. Descubrieron que el agar tripticasa de soya facilitaba el

crecimiento vigoroso de microorganismos aerobios y anaerobios. Es un medio para propósitos

generales, comúnmente conocido como agar de digerido de caseína de soya. Es una base

nutritiva, al cual se le puede adicionar una variedad de suplementos para mejorarlo. (neogen-

info@neogen.com, 2015)

La base de Agar Sangre se utiliza con sangre para el aislamiento y cultivo de una amplia

variedad de microorganismos exigentes. La base de agar sangre se complementa

normalmente con un 5-10% de sangre de oveja, conejo, caballo para uso en el aislamiento,

cultivo y la determinación de las reacciones hemolíticas de microorganismos patógenos

exigentes. Sin enriquecimiento, se puede utilizar como medio de comunicación de uso general.

(Brown. J, 1919)

En mención a la Tinción de Gram, Liébana, J. (1995) ha mencionado que es la más empleada

en el laboratorio microbiológico para la observación de bacterias, facilita la observación

microscópica y permite diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: grampositivas y

gramnegativas. Existen varias modificaciones de la técnica en general.

32

Emplea cristal violeta, solución de lugol (como mordiente), alcohol acetona y safranina como

contracolorante. Permite identificar los microorganismos grampositivos, que son violetas, de los

gramnegativos que se observan rojos.

Además, Negroni, M. (2009) dice que esta tinción se realiza a partir de un extendido

previamente fiado con el método de Koch, aplicando la siguiente técnica.

1. Cubrir la superficie del preparado con cristal violeta o violeta de genciana y dejar en

contacto durante 1 minuto (colorante primario).

2. Lavar con abundante agua.

3. Cubrir con lugol durante 1 minuto (mordiente).

4. Lavar con abundante agua.

5. Inclinar el portaobjeto y dejar de gotear el alcohol acetona hasta que el preparado deje de

perder color (decolorante).

6. Lavar con abundante agua.

7. Cubrir el preparado con fucsina básica durante 1 minuto (contracolor).

8. Lavar con abundante agua.

9. Dejar secar el preparado.

10. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.

Por lo que, la técnica se fundamenta en que la afinidad grampositiva o gramnegativa de las

bacterias que depende de la composición y estructura química de la pared celular. Al observar

el preparado con el microscopio, después de realizar los primeros cuatro pasos, todas las

bacterias se ven de color violeta, luego de aplicar el decolorante algunas bacterias conservan

el color, mientras que otras se decoloran. Las que mantiene el color violeta se denominan

grampositivas y las que pierden se llaman gramnegativas. Esto se debe a que el alcohol

acetona (decolorante) desorganiza la membrana externa de las bacterias gramnegativas

(constituida principalmente por lipoproteínas y lipopolisácaridos) y permite la salida del

decolorante primario, de modo que los microorganismos quedan desprovistos de color. Al

agregar el contracolor éstos tiñen de rojo.

33

Por otra parte, ha referido que los antibiogramas son estudios que se realizan in vitro y

permiten determinar la resistencia o el grado de sensibilidad de los microorganismos frente a

los diferentes antimicrobianos; en lo posible tratan de reproducir las condiciones en que se

encuentra el agente infeccioso dentro de los tejidos o los líquidos orgánicos. Pueden

emplearse diferentes pruebas de sensibilidad para determinar que antimicrobiano selectivo es

el más eficaz para combatir un determinado agente patógeno. Los métodos más conocidos de

antibiogramas para bacterias, en general son: dilución en agar, difusión en agar, dilución en

caldo.

Así mismo, explica el Método de difusión en agar: este método, que sufrió diferentes

modificaciones fue estandarizado por Kirby-Bauer en los Estados Unidos en 1966, representa

la prueba de susceptibilidad más ampliamente utilizada en bacteriología clínica, porque permite

obtener resultados bastante exactos mediante un método estandarizado, sencillo, de ejecución

rápida, económico y fácil de reproducir. Puede utilizarse como método cuantitativo,

semicuantitativo o cualitativo. El comité de expertos de la OMS publicó las normas para

efectuar algunas modificaciones al descrito por Bauer, de manera que los resultados sean

comparables en todas partes del mundo.

Las condiciones que debe reunir la cepa según Negroni, M. (2009) son: debe aislarse del

material en estudio, debe obtenerse en forma de cultivo puro y debe ser el agente etiológico de

referencia cuando existan dudas en el material que se usa.

Así mismo, se describe las cualidades de los discos de papel:

Deben tener un tamaño de 5-7mm y un espesor de 0.02mm.

Deben cargarse con una concentración de antimicrobiano selectivo de manera que se

obtenga una zona de inhibición no mayor de 40mm.

La cantidad de antimicrobiano selectivo que contiene cada disco debe ser justa, porque

una sobrecarga falsearía los resultados.

34

Deben mantenerse almacenados a temperaturas de 4°C o, según las instrucciones del

fabricante, para que no haya deterioro en la potencia de la droga.

Tiene que estar en un ambiente con sustancias desecadoras para evitar los vapores de

condensación al almacenarlos en el refrigerador.

Además, hace mención de las indicaciones para la preparación de las placas:

El medio deberá distribuirse uniformemente en la caja.

La altura del medio debe ser de 4mm para que pueda estandarizarse la difusión de la

droga, porque si se disminuyera el espesor de la capa de agar se obtendrían halos de

inhibición más amplios.

Y por último, describe la Técnica a utilizarse:

A partir de un cultivo puro del microorganismo que se va a estudiar, con un desarrollo de

18 horas en placa de agar, se toman 4 a 5 colonias y se les suspende en un tubo con agua

destilada o en un hidrolizado de soja y caseína.

Se incuba entre 2 y 5 horas, de manera de obtener una turbidez final equivalente al 0.5 de

la escala de Mc Farland, que corresponde a 10´8 UFC/mL.

Inmediatamente se sembrará una placa con agar correspondiente según la siguiente

técnica: se embebe un hisopo de algodón estéril en el inóculo, se elimina el exceso de

líquido contra las paredes del tubo y se aplica sobre la superficie del agar estriándolo 3

veces (debe asegurarse de cubrir perfectamente toda el área).

Se deja secar entre 3 y 5 minutos.

Con una pinza estéril de puntas finas se colocan sobre la superficie del agar sembrado con

discos individuales; éstos llevan impresa la abreviatura del antimicrobiano selectivo en el

cual se encuentran embebidos y la serie a la cual pertenecen.

Se deja la placa no menos de media hora a temperatura ambiente para que el disco

absorba agua del medio de cultivo y así permita la difusión radial del antimicrobiano

selectivo, lo que produce un gradiente de concentración; es decir, que cuanto más se aleje

35

del disco, menor será la concentración del antimicrobiano. Esta predifusión es necesaria

para disminuir una posible causa de error.

Luego se incuba durante 12 a 18 horas a 37°C; para esto se coloca la caja en posición

invertida en un ambiente con oxígeno. En lo posible debe evitarse la incubación en

presencia de anhídrido carbónico, ya que éste modificará el pH del medio, lo que afectará

la actividad del algunos antimicrobianos.

Una vez transcurrido dicho lapso, se procede a la medición y la interpretación de la zona

que circunda el disco, llamada halo de inhibición. Éste informa si el microorganismo es

sensible, resistente o intermedio. La falta de desarrollo alrededor del disco indica que la

bacteria es ¨S, sensible¨, al antimicrobiano selectivo, lo que significa que el antimicrobiano

puede utilizarse en dosis terapéuticas. El crecimiento del microorganismo alrededor del

disco indica que es ¨R, resistente¨ al antimicrobiano, por lo cual no debe emplearse. Existe

un tercer tipo ¨I, intermedia, cuando los diámetros de los halos son inferiores a ¨S¨ y

superiores a ¨R¨ que es la que exige la administración de dosis de antimicrobianos

superiores a los habituales para obtener una respuesta terapéutica favorable, siempre y

cuando no produzca efectos secundarios.

Como el tamaño de cada halo de inhibición depende de la sensibilidad de la cepa

antimicrobiana, de la velocidad de crecimiento del microorganismo, de la cantidad (carga) de

antimicrobiano selectivo presente en el disco, de la capacidad para difundir en el medio, etc.,

un halo más grande no siempre indica mayor actividad antimicrobiana.

Cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175:

Según Microbiologics los Microorganismos KWIK-STIK™ son preparaciones de cultivos madre

liofilizados de referencia que contienen una única cepa de un microorganismo. Estas

preparaciones de microorganismos están destinadas al uso en el control de calidad de medios

de cultivo, programas educativos o instructivos y aplicaciones industriales. Las preparaciones

de microorganismos pueden atribuirse a la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo

(ATCC®) u otras colecciones de cultivos de referencia auténticas.

36

La liofilización es un método bien documentado y recomendado para la conservación a largo

plazo de microorganismos. El uso de este material liofilizado ofrece resultados equivalentes a

los métodos tradicionales utilizados en la preparación, el almacenamiento y la sustentación de

colecciones de cultivos madre de referencia.

Los Microorganismos KWIK-STIK™ incorporan un método de liofilización informado por Obara

et. al., que utiliza un medio en suspensión que comprende gelatina, leche descremada, ácido

ascórbico, dextrosa y carbón. La gelatina sirve como vehículo para los microorganismos. La

leche descremada, el ácido ascórbico y la dextrosa protegen al microorganismo mediante la

preservación de la integridad de la pared celular durante la liofilización y el almacenamiento. El

carbón está incluido con el fin de neutralizar las sustancias tóxicas formadas durante el

proceso de liofilización.

Cada unidad de KWIK-STIK™ contiene un sedimento liofilizado de una única cepa de

microorganismos, un reservorio de líquido hidratante y un hisopo de inoculación. Cada

dispositivo está sellado dentro de una bolsa laminada que contiene una secante para evitar la

acumulación adversa de humedad. Los Microorganismos KWIK-STIK™ ofrecen una función

adicional. Cada preparación de microorganismos liofilizada es menor o igual a cuatro pases de

un cultivo de referencia. (www.microbiologics.com)

ATTC: American Type Culture Collection. RockVille, EU.

Cepas certificadas: es un material biológico de referencia certificado. La colección certifica que

suministra una determinada cepa, que es un cultivo puro, y que se han observado las

convenientes pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares correspondientes. Son cepas

con características fenotípicas y genotípicas definidas que son empleadas como control para

las determinaciones microbiológicas.

37

1.3 Trabajos previos realizados

De la Cruz y González (1997) realizaron un estudio en niños aplicándoseles un barniz de

clorhexidina comparándolo con aplicaciones tópicas de fluoruro de sodio en su actividad

antibacteriana sobre el Streptococcus mutans, obteniendo a 3 meses resultados similares entre

los barnices sin cambios significativos entre ellos. Este estudio evaluó dos agentes de esta

naturaleza: acetato de clorhexidina al 10% y fluoruro de sodio al 2% en solución acuosa, a

través de su capacidad para reducir el número de S. mutans. Esta evaluación se realizó

utilizando un método semicuantitativo antes, y 30 y 45 días después de la aplicación tópica

dental de los agentes mencionados, comparando los resultados obtenidos contra un grupo

control. Los resultados obtenidos al respecto del acetato de clorhexidina al 10% sólo fueron

estadísticamente significativos a 45 días después de la aplicación. Mientras que fluoruro de

sodio al 2% en solución acuosa disminuyó el número de s. mutans en cavidad oral a 30 y 45

días. Al ser comparados los tres grupos en estudio resultó que a 30 días el fluoruro de sodio al

2% presentó un mejor efecto antibacteriano, pero a 45 días ambos tratamientos

antibacterianos fueron equivalentes.

Camejo, M. (1999). Este estudio se realizó para establecer el efecto de tres enjuagues bucales

sobre el Streptococcus mutans. Siendo los compuestos de los enjuagues sanguinaria,

compuesto fenólico y gluconato de clorhexidina. Se realizó el aislamiento de S. mutans, se

prepararon cajas Petri con agar mitis salivarius, se colocaron los discos impregnados con cada

uno de los enjuagues. Los resultados demostraron que S. mutans no es sensible a sanguinaria

y compuesto fenólico pero si al gluconato de clorhexidina, formando un halo de inhibición de

8.2mm.

Petersson LG, Magnusson K, Andersson H, Almquist B, Twetman S (2000). Realizaron un

estudio donde los barnices de clorhexidina han demostrado su efectividad en la reducción de

los niveles de Streptococcus mutans en saliva. Estudios recientes reportan la efectividad del

barniz en 118 pacientes entre 13 y 14 años separados en dos grupos, uno utilizó el barniz de

38

clorhexidina y a otro grupo se le aplicó barniz de fluoruro, no encontrándose al final diferencias

significativas entre los dos barnices en la incidencia de caries proximal.

Aguilera, C., Romano E., Ramos N., Rojas L. (2011). Realizaron un estudio para demostrar la

sensibilidad in vitro del S. mutans a los compuestos; triclosán, cloruro de cetilpiridinio y

gluconato de clorhexidina presentes en 3 enjuagues bucales comerciales. La muestra estuvo

conformada por una cepa liofilizada de S. mutans la cual se sembró en placas Petri con agar

soya sobre los cuales fueron impregnados los discos con los compuestos antes mencionados.

Los resultados obtenidos demostraron que el S. mutans es sensible a todos los compuestos de

los enjuagues bucales, sin embargo hubo diferencia entre los halos de inhibición de cada

enjuague teniendo el triclosán un halo de 35mm, la clorhexidina 8mm y el cloruro de

cetilpiridinio 3mm.

Estudio publicado por la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Ecuador.

Peláez, P. (2014) ¨EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL TRICLOSÁN Y

CLORHEXIDINA SOBRE EL Streptococcus mutans (ESTUDIO IN VITRO)¨. El presente

estudio evaluó el efecto antimicrobiano de dos principios activos de los colutorios, el triclosán y

la clorhexidina, como tratamiento profiláctico ante el Streptococcus mutans. Para lo que

realizaron un antibiograma, para evaluar el efecto antibacteriano, obteniendo resultados

positivos para la clorhexidina con una media en sus halos de inhibición de 15.35mm de

diámetro, sin embargo, no se evidenció la presencia de halos de inhibición en el disco

contenido con triclosán.

39

2. JUSTIFICACIÓN

Se describe la caries dental como un proceso dinámico de desmineralización y

remineralización, producto del metabolismo bacteriano sobre la superficie dentaria, que con el

tiempo puede producir una pérdida neta de minerales y posiblemente, aunque no siempre,

resultará en la presencia de una cavidad. De las enfermedades infecciosas que afectan a los

seres humanos, la caries dental es probablemente la más prevalente. El Streptococcus

mutans es un habitante de la microbiota oral que constituye la primera causa de caries dental.

Actualmente se sabe que varios microorganismos se incluyen en la patogénesis de la caries

dental (Estreptococos del grupo mutans, Lactobacillus spp y Actinomyces spp) de los cuales,

Streptococcus mutans (S. mutans) es el agente más importante asociado a ella. En relación, a

la importancia del Streptococcus mutans en la caries dental y que no se han realizado estudios

sobre la efectividad de agentes antimicrobianos in vitro sobre él mismo, en la Facultad de

Odontología, se llevó a cabo este estudio sobre la sensibilidad del Streptococcus mutans

(ATCC) in vitro a barnices y colutorios de marca comercial de uso en odontología. También, es

importante hacer mención que los antecedentes bibliográficos revelan resultados positivos de

los colutorios a base de triclosán, clorhexidina, fluoruro y otros frente al Streptococcus mutans

y esto motivó aún más a la realización del presente estudio.

40

3. DETERMINACIÓN DEL PROBLEMA

3.1 Definición

¿La cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175) in vitro, es sensible a la acción de los

barnices de uso en odontología a base de Triclosán, Clorhexidina y Fluoruro de Sodio; ¿y los

colutorios, a base de Cloruro de Cetilpiridinio, aceites esenciales, fluoruros y Digluconato de

Clorhexidina?

3.2 Delimitación

El procedimiento de las muestras microbiológicas y manejo de la cepa de Streptococcus

mutans (ATCC 25175) se realizó con la autorización previa de coordinación durante los meses

de marzo y abril del año 2016, en las instalaciones del Instituto de Investigaciones Químicas,

Biológicas, Biomédicas y Biofísicas (I2QB3) de la Universidad Mariano Gálvez, ubicadas en la

3a. Avenida 8-20 zona 2 interior Finca El Zapote ciudad de Guatemala.

II. MARCO METODOLÓGICO

2.1 OBJETIVOS

2.1.1 Objetivo general

Determinar la sensibilidad del Streptococcus mutans (ATCC 25175) a 5 barnices y 7 colutorios

de marca comercial de uso en odontología: Estudio In Vitro.

41

2.1.2 Objetivos específicos

2.1.2.1 Evaluar in vitro el efecto inhibitorio de los barnices a base de Triclosán, Clorhexidina y

Fluoruros de sodio frente al Streptococcus mutans (ATCC 25175).

2.1.2.2 Evaluar in vitro el efecto inhibitorio de los colutorios a base de Cloruro de Cetilpiridinio,

aceites esenciales, Fluoruros y Digluconato de Clorhexidina frente al Streptococcus

mutans (ATCC 25175).

2.1.2.3 Determinar frente a que antimicrobiano utilizado en el estudio fue más sensible el

Streptococcus mutans.

2.2 TIPO DE ESTUDIO

Es un estudio experimental, en donde se evaluó el efecto inhibitorio del Streptococcus mutans

(ATCC 25175) con barnices de uso en odontología a base de Triclosán, Clorhexidina y

Fluoruro de sodio; y los colutorios, a base de Cloruro de Cetilpiridinio, aceites esenciales,

Fluoruros y Digluconato de Clorhexidina, es in vitro, desde el momento que el estudio no se

realizó en organismos vivos. Además, este estudio se realizó en un momento dado, durante los

meses de marzo y abril del 2016 y los resultados se obtuvieron en un solo corte de tiempo

(transversal) y los mismos se fueron obteniendo a medida que van sucediendo después de 48

horas (prospectivo). También, se considera un estudio analítico, porque se valora el efecto de

los barnices y colutorios sobre el Streptococcus mutans (ATCC 25175) con formación de un

halo de inhibición alrededor del disco de papel filtro. Asimismo, en el estudio se examinaron los

datos numéricamente a través de métodos estadísticos (cuantitativo).

42

2.3 DEFINICIÓN DE VARIABLES

2.3.1 Variable dependiente

Acción antimicrobiana in vitro sobre Streptococcus mutans (ATCC 25175)

2.3.2 Variable independiente

Compuestos antimicrobianos: barnices de Triclosán, Clorhexidina y Fluoruros y colutorios de

Cloruros de Cetilpiridinio, Fluoruros y Digluconato de Clorhexidina.

2.3.3 Variable de control

Control negativo: agua destilada.

2.4 HIPÓTESIS DEL ESTUDIO

2.4.1 Hipótesis nula

La cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175) in vitro, es igualmente sensible a la acción de

los barnices de uso en odontología a base de Triclosán, Clorhexidina y Fluoruro de sodio; y los

colutorios, a base de Cloruro de Cetilpiridinio, aceites esenciales, Fluoruros y Digluconato de

Clorhexidina.

2.4.2 Hipótesis alterna

La cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175) in vitro, NO es igualmente sensible a la

acción de los barnices de uso en odontología a base de Triclosán, Clorhexidina y Fluoruro de

sodio; y los colutorios, a base de Cloruro de Cetilpiridinio, aceites esenciales, Fluoruros y

Digluconato de Clorhexidina.

43

2.5 CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN

2.5.1 Criterio de inclusión

Cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175

Barnices de uso en odontología de marca comercial, conteniendo los siguientes principios

activos: Triclosán, Clorhexidina y Fluoruros, independientemente de la concentración.

Colutorios de uso en odontología de marca comercial, conteniendo los siguientes principios

activos: Digluconato de Clorhexidina, Cloruro de Cetilpiridinio, aceites esenciales y

Fluoruros, independientemente de la concentración.

2.5.2 Criterio de exclusión

En el presente estudio no se contemplaron criterios de exclusión por ser un estudio controlado

en el laboratorio con los estándares bien establecidos.

2.6 POBLACIÓN, MUESTRA Y MÉTODO DE MUESTREO

La población corresponde a la Cepa estandarizada de Streptococcus mutans ATCC 25175

adquirida por medio de Labtronic, S.A. distribuidor de Microbiologics y la muestra corresponde

a 5 barnices (5 repeticiones de cada uno) y 7 colutorios (5 repeticiones de cada uno) para

hacer una muestra de 60 unidades experimentales (cultivos en caja de Petri). Se utilizó el

método de muestreo por conveniencia para el estudio y se tomaron 5 barnices y 7 colutorios.

2.7 METODOLOGÍA

Para el desarrollo de este estudio se solicitó permiso al área de coordinación de la

Facultad de Odontología y así mismo al área del Instituto de Investigaciones Químicas,

Biológicas, Biomédicas y Biofísicas de la Universidad Mariano Gálvez; para trabajar

conjuntamente con el área de microbiología, siendo supervisado por una persona

capacitada, en este caso un químico biólogo.

44

Se elaboró un listado de todos los materiales por utilizar para cada procedimiento. Entre

estos materiales se necesitaba una cepa de Streptococcus mutans la cual se mandó a

traer ya que no se encontraba disponible dentro del cepario del I2QB3. Se adquirió por

medio de Labtronic S.A.

Al obtener la cepa de Streptococcus mutans, se recibió una capacitación sobre el

procedimiento a seguir para la manipulación de la cepa por parte de Labtronic con dos

químicos biólogos, previo al día de la manipulación de la cepa.

El primer día de trabajo en el laboratorio se debía preservar la cepa de Streptococcus

mutans por lo que Labtronic mandó a dos químicos biólogos a darnos la demostración

sobre cómo debíamos realizar el procedimiento para poder preservar correctamente la

cepa.

Se procede a realizar el mantenimiento de la cepa liofilizada de Streptococcus mutans, se

inició en un agar no selectivo, como el agar tripticasa de soya o agar sangre de carnero.

No se debe usar caldo. En este caso se empezó con el agar sangre de carnero. No se

realizaron pruebas en la placa de granulación original, esta es la placa en la cual se inició

el gránulo liofilizado. Los microorganismos que crecen en esta placa no están

completamente revividos.

Se utilizaron microorganismos frescos, se seleccionaron colonias aisladas para la prueba.

Los microorganismos exigentes tienen períodos de supervivencia más reducidos que las

bacterias aeróbicas. Por lo cual se crearon subcultivos cada varios días.

Procedimiento para preservación de cepa liofilizada ATCC 25175:

Resiembra I

Se dejó la bolsa KWIK-STIK™ (cepa liofilizada) sin abrir para que se equilibrara a

temperatura ambiente. Se abrió la bolsa por la muesca y se retiró la unidad KWIK-STIK™.

Se tiró de la lengüeta para retirar la etiqueta y se colocó en la placa del cultivo principal o

el registro de control de calidad.

45

Se apretó (una sola vez) la ampolla en la parte superior de KWIK-STIK™ (justo por debajo

del menisco de líquido de la ampolla) situado en la tapa para liberar el líquido hidratante.

Se sujetó en posición vertical y se golpeó sobre una superficie dura para facilitar el flujo de

líquido a través del eje hacia la parte inferior de la unidad que contiene el sedimento. Se

dejó que el líquido hidratante fluyera a través del eje del hisopo y hacia la parte inferior de

la unidad que contiene el sedimento.

Presionado en la parte inferior de la unidad, se trituró el sedimento en el líquido hasta que

la suspensión del sedimento fuera homogénea.

DE INMEDIATO, se saturó bien el hisopo en el material hidratado y se transfirió a un medio

de cultivo con agar sangre de carnero.

Se inoculó la placa del cultivo principal haciendo rodar el hisopo con suavidad sobre un

tercio de la placa.

Con un asa estéril, se crearon inóculos para facilitar el aislamiento de colonias.

Se utilizó un método de desecho de riesgo biológico adecuado para desechar KWIK-

STIK™.

DE INMEDIATO, se incubaron 10 placas de agar sangre de carnero del cultivo principal

inoculado a la temperatura y las condiciones adecuadas para los microorganismos. Se

incubaron a 37°C durante 48 horas en jarras de anaerobiosis. Se realizaron lecturas de las

colonias a las 24 y 48 horas.

Por último, se realizó la caracterización de la cepa de Streptococcus mutans; después de

la lectura de 48 horas. Las colonias se observaron redondas, blancas, regulares,

cremosas, uniformes, de borde regular (macroscópicamente). Se procedió hacer la tinción

de Gram, la cual indica si son bacterias Gram positivas o Gram negativas, en este caso se

realizó para probar la teoría. Los microorganismos tornaron moradas que es el color

característico de las bacterias Gram positivas. Microscópicamente de observaron en

cadena y racimos de bordes regulares y color morado.

Procedimiento para siembra de cepa de S. mutans:

46

Resiembra II

Después de haber preservado la cepa es decir de haber revivido los microorganismos se

procedió a hacer la segunda resiembra de Streptococcus mutans ya que para hacer las

pruebas del estudio en concreto no se pueden utilizar las cajas de Petri originales ya que

fueron las placas en donde se inició el gránulo liofilizado, en éstas los organismos que

crecen no están completamente revividos.

Se escogieron colonias aisladas y frescas con un asa en argolla esterilizada con calor

(mechero o incinerador) de las cajas de Petri iniciales y se colocaron en nuevas placas de

agar sangre mediante la técnica de siembra por agotamiento por estrías. La resiembra se

hizo en 10 cajas de Petri.

Después de haber realizado la resiembra, se colocaron las cajas de Petri en jarras de

anaerobiosis y se llevaron a la incubadora a 37°C de 24 a 48 horas. A las 48 horas se

colocaron en refrigeración para detener el crecimiento.

Resiembra III

Más adelante se realizó una tercera resiembra para tener colonias más frescas de

Streptococcus mutans, siguiendo los procedimientos anteriormente mencionados.

Se escogieron las colonias más brillantes y frescas con un asa esterilizada con calor y se

sembraron en agar tripticasa de soya mediante la técnica de siembra por agotamiento por

estrías. Se realizó en 10 cajas de Petri.

Luego se colocaron las cajas de Petri en jaras de anaerobiosis y se llevaron a la

incubadora de 24 a 48 horas. A las 48 horas se colocaron en refrigeración.

47

Técnica de difusión en disco

En este procedimiento se utilizaron 12 diferentes materiales para probar la inhibición del

Streptococcus mutans frente a ellos. Los cuales son:

BARNICES COMPOSICIÓN

Barniz 1 Flúor 5% y Triclosán

Barniz 2 Clorhexidina 1% y Timol 1%

Barniz 3 Fluoruro de sodio 5%

Barniz 4 Fluoruro de sodio 5%

Barniz 5 Fluoruro de sodio 0.1%

En el inicio del procedimiento del método de difusión en disco, se empezó con pruebas de

control tomando 3 cajas de Petri de cada producto dental (barnices) siendo un total de 15

cajas.

El día de la observación de los halos de inhibición de las primeras cajas de Petri, se

realizaron las otras cajas; tomando 5 cajas para cada producto dental, siendo un total de

60 cajas.

COLUTORIOS COMPOSICIÓN

Colutorio 1 Digluconato clorhexidina 0.12% y fluoruro potásico 0.061%

Colutorio 2 Cloruro de cetilpiridinio 0.05% y fluoruro 0.061%

Colutorio 3 Cloruro de cetilpiridinio 0.05% y fluoruro 0.061%

Colutorio 4 Aceites esenciales

Colutorio 5 Fluoruro sódico 0.05%

Colutorio 6 Fluoruro potásico 0.0765%

Colutorio 7 Fluoruro sódico 0.05%

48

En este procedimiento se trabajó bajo campana de flujo laminar para la siembra por

agotamiento por difusión, en el cual se tomaron colonias aisladas y frescas de las placas

de agar tripticasa de soya resembradas anteriormente; se tomaron de 3 a 5 colonias y se

suspendieron en un tubo con solución salina estéril al 0.85% lo cual corresponde a una

turbidez de 0.05 en la escala de Mc Farland, y se comparó con el estándar de Mc Farland.

Inmediatamente se sembró una placa con agar, se embebió un hisopo de algodón estéril

en el inóculo, se eliminó el exceso de líquido contra las paredes del tubo y se aplicó sobre

la superficie del agar estriándolo 3 veces. (comúnmente conocido como estriado en tapate)

Con una pinza estéril de puntas finas se colocaron, sobre la superficie del agar sembrado

con discos individuales. Se colocaron 2 discos del producto dental en cada caja de Petri y

un disco con agua destilada para control positivo.

Se dejó la placa no menos de media hora a temperatura ambiente para que el disco

absorbiera agua del medio de cultivo y así permitiera la difusión radial del antimicrobiano

selectivo.

Luego se colocaron en jarras de anaerobiosis y se incubaron durante 24 horas a 37°C.

Una vez transcurrido dicho lapso, se procedió a la medición e interpretación de la zona que

circunda el disco, llamada halo de inhibición. Este halo nos proporciona la reacción del

Streptococcus mutans frente a los distintos productos dentales utilizados.

Los resultados obtenidos se analizaron y se tabularon.

Se emitieron los resultados y las recomendaciones correspondientes.

Se elaboró el informe final y se entregó a las autoridades para su revisión y aprobación.

49

III. MARCO OPERATIVO

3.1 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

MESES ENERO FEBRERO MARZO ABRIL MAYO JUNIO

Semanas 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

Recopilación de datos

+ +

Solicitud de cepa de S. mutans

+

Entrega de cepa de S. mutans

+

Solicitud de acceso a instalaciones de I2QB3

+

Entrega de cronograma

+

Capacitación de parte de Labtronic S.A.

+

Realización de trabajo de campo

+ + + + + + + +

Organización, análisis y tabulación de datos

+ + + + + +

Elaboración de informe final

+

50

3.2 PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN

En el presente estudio se utilizó el programa Excel, en donde se almacenaron y procesaron los

valores de los halos de inhibición (en mm), se elaboraron tablas y gráficas. Y para saber si

existía diferencia entre el efecto inhibidor de los diferentes barnices y colutorios a base de

clorhexidina, triclosán, aceites esenciales, cloruro de cetilpiridinio y fluoruros en el crecimiento

del Streptococcus mutans (ATCC 25175), se utilizó el estadístico análisis de varianza ANOVA

(técnica de prueba de hipótesis de tipo paramétrica), en el mismo se comparó la varianza que

hay entre todas la repeticiones con la que hay entre el promedio de los grupos. También, se

utilizó la Prueba de Diferencia Significativa Honesta (DSH) de Tukey, para crear intervalos de

confianza para todas las diferencias en parejas entre las medias, es decir la diferencia entre los

antimicrobianos que formaron halos de inhibición.

IV. MARCO ADMINISTRATIVO

4.1 Recursos humanos

Estudiante-investigador

Asesor de estudio

Revisor

Estadista

4.2 Recursos materiales

Equipos:

Campana de flujo laminar

Incubadora

Refrigeradora

51

Instrumentos:

Caja Petri

Jarra de anaerobiosis

Pinzas estériles

Mechero

Tubos de ensayo

Gradilla

Asas

Incinerador

Pizeta con cloro

Pizeta con alcohol

Materiales:

Discos de papel filtro estériles

Guantes

Mascarilla

Hisopos estériles

Sustancias:

Barnices

Colutorios

Agua destilada

Agar sangre de carnero

Agar tripticasa de soya

Sobre de cepas liofilizadas de Streptococcus mutans ATCC 25175

52

Materiales e instrumentos para la eliminación o desecho de muestras microbiológicas:

Autoclave

Bolsas rojas

Recipientes herméticos para material descartable

Cuarto de depósito de desechos contaminados

4.3 Presupuesto

No. Materiales Cantidad Total

1 Barniz #1 1 214.97

2 Barniz #2 1 157.50

3 Barniz #3 1 1567.00

4 Barniz #4 1 50.00

5 Barniz #5 1 25.00

6 Colutorio #1 1 33.25

7 Colutorio #2 1 35.85

8 Colutorio #3,4,5,6,7 (muestras médicas) 5 0.00

9 Cepa ATCC 25175 Streptococcus mutans 1 662.50

10 Cajas Petri con agar Tripticasa de Soya 85 472.60

11 Agar Mitis Salivarius 1 1500.00

12 Fotocopias 100 30.00

13 Reproducción de material 300.00

TOTAL 5,048.67.00

53

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

R1 R2 R3 R4 R5 PromedioHalo

s d

e in

hib

ició

n (

mm

)

Sustancia aplicad-repetición

Halos de Inhibición en cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175

Barniz 1 Barniz 2

V. INFORME FINAL

5.1 RESULTADOS

El análisis de los resultados se realizó evaluando la inhibición de crecimiento bacteriano in vitro

de Streptococcus mutans, mediante el uso de barnices de Triclosán, Clorhexidina y Fluoruro de

sodio; y colutorios de Cloruro de Cetilpiridinio, aceites esenciales, Fluoruros y Digluconato de

Clorhexidina

Tabla 1

Halos de Inhibición en cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175 después de la

aplicación de barnices de Triclosán, Clorhexidina y fluoruro de sodio

Fuente: Elaboración propia con los datos obtenidos del estudio

Barniz 1: fluoruro/triclosán; Barniz 2: clorhexidina 1%/timol 1%; Barniz 3 y 4: fluoruro de sodio 5% (de diferente

casa comercial) y Barniz 5: fluoruro de sodio 0.1%

Gráfica 1

Fuente: Elaboración propia con los datos obtenidos del estudio

Barniz 1: fluoruro/triclosán; Barniz 2: clorhexidina 1%/timol 1%

Sustancia aplicada

repetición

Diámetro del halo de inhibición (mm)

Presenta No presenta

Barniz 1 Barniz 2 Barniz 3 Barniz 4 Barniz 5

Agua destilada (control

negativo)

R1 4 4.5 0 0 0 0 R2 3 5 0 0 0 0 R3 3.5 5.5 0 0 0 0 R4 4 6 0 0 0 0 R5 4 8 0 0 0 0

Promedio 3.7 5.8 0 0 0 0

54

Figura 1

(a) Halos de inhibición de las 5 repeticiones del Barniz 1 (fluoruro / triclosán) (b) Barniz 2:

clorhexidina 1%/timol 1%; (c y d) Barniz 3 y 4: fluoruro de sodio 5% (de diferente casa comercial) y

(e) Barniz 5: fluoruro de sodio 0.1%

a. a.

b. b.

c. c.

55

Interpretación de tabla y gráfica 1

Se observa que, de los 5 barnices utilizados, solamente el barniz 1 (flúor/triclosán) y 2 (clorhexidina

1%/timol 1%) presentaron halo de inhibición con un promedio de 3.7 y 5.8 mm, respectivamente

para el Streptococcus mutans, y no se formaron halos de inhibición con los barnices 3,4 (fluoruro

de sodio 5%) de diferentes casas comerciales y 5 (fluoruro de sodio 0.1%).

d. d.

e. e.

56

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

R1 R2 R3 R4 R5 Promedio

Halo

s d

e in

hib

ició

n (

mm

)

Sustancia aplicada (repetición)

Halos de Inhibición en cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175

Colutorio 1 Colutorio 2 Colutorio 3

Tabla 2

Halos de Inhibición en cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175 después de la aplicación de colutorios Cetilpiridinio, aceites esenciales, fluoruros y Digluconato de

Clorhexidina.

Sustancia aplicada

repetición

Diámetro del halo de inhibición (mm)

Presenta No presenta

Colutorio 1

Colutorio 2

Colutorio 3

Colutorio 4

Colutorio 5

Colutorio 6

Colutorio 7

Agua destilada (control

negativo)

R1 5 3.5 3 0 0 0 0 0 R2 6 4 3.5 0 0 0 0 0 R3 8 4.5 4 0 0 0 0 0 R4 8.5 5 4 0 0 0 0 0 R5 9 5 4.5 0 0 0 0 0

Promedio 7.3 4.4 3.8 0 0 0 0 0 Fuente: Elaboración propia con los datos obtenidos del estudio

Colutorio 1: Digluconato de Clorhexidina 0.12%/fluoruro 0.06 %; Colutorio 2: Cetilpiridinio/fluoruro 0.012 %; Colutorio 3:

Cetilpiridinio 0.05%; Colutorio 4: aceites esenciales (eucalipto, mentol, timol) y Colutorio 5: fluoruro sódico 0.05% Colutorio

6: fluoruro potásico 0.07% y Colutorio 7: fluoruro sódico 0.05 %

Gráfica 2

Fuente: Elaboración propia con los datos obtenidos del estudio

Colutorio 1: Digluconato de Clorhexidina 0.12%/fluoruro 0.06 %; Colutorio 2: Cetilpiridinio/fluoruro 0.012

%; Colutorio 3: Cetilpiridinio 0.05%;

57

Figura 2:

(a) Halos de inhibición de las 5 repeticiones del Colutorio 1: Digluconato de Clorhexidina

0.12%/fluoruro 0.06 %; (b) Colutorio 2: Cetilpiridinio/fluoruro 0.012 %; (c) Colutorio 3: Cetilpiridinio

0.05%; (d) Colutorio 4: aceites esenciales (eucalipto, mentol, timol) y (e) Colutorio 5: fluoruro sódico

0.05% (f) Colutorio 6: fluoruro potásico 0.07% y (g) Colutorio 7: fluoruro sódico 0.05 %

a. a.

b. b.

c. c.

58

d.

.

d.

d.

e.

.

d.

e.

.

d.

f.

.

d.

f.

.

d.

g.

.

d.

g.

.

d.

59

0

2

4

6

8

10

1 2 3 4 5 6

Halo

s d

e in

hib

ició

n (

mm

)

Sustancia aplicada- repetición

Efecto Inhibitorio de 3 colutorios y 2 barnices de uso en odontología en cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175

Colutorio 1 Colutorio 2

Colutorio 3 Barniz 1

Barniz 2 Agua destilada (control negativo)

Interpretación de tabla y gráfica 2

Se observa que, de los 7 colutorios utilizados, solamente el colutorio 1 (Digluconato de

Clorhexidina 0.12%/fluoruro 0.06 %), colutorio 2 (Cetilpiridinio / fluoruro 0.012 %) y colutorio 3

(Cetilpiridinio 0.05%) mostraron efectividad inhibitoria frente a Streptococcus mutans, formando

halos de inhibición con un promedio de 7.3, 4.4 y 3.8 mm, respectivamente, no así los colutorios

4,5,6 y 7 no inhibieron el crecimiento del Streptococcus mutans, no formándose halos de inhibición.

Tabla 3

Efecto Inhibitorio de 3 colutorios y 2 barnices de uso en odontología en cepas de

Streptococcus mutans ATCC 25175 relacionado con forma farmacéutica y concentración.

Fuente: Elaboración propia con los datos obtenidos del estudio

Colutorio 1: Digluconato de Clorhexidina 0.12%/fluoruro 0.06 %; Colutorio 2: Cetilpiridinio/fluoruro 0.012 %; Colutorio 3:

Cetilpiridinio 0.05%; Barniz 1: flúor/triclosán; Barniz 2: clorhexidina 1%/timol 1%

Gráfica 3

Sustancia aplicada

repetición

Diámetro del halo de inhibición (mm)

Presenta

Colutorio 1 Colutorio 2 Colutorio 3 Barniz 1 Barniz 2

Agua destilada (control

negativo)

R1 5 3.5 3 4 4.5 0 R2 6 4 3.5 3 5 0 R3 8 4.5 4 3.5 5.5 0 R4 8.5 5 4 4 6 0 R5 9 5 4.5 4 8 0

Promedio 7.3 4.4 3.8 3.7 5.8 0

60

Interpretación de tabla y gráfica 3

Se observa que el Streptococcus mutans (ATCC 25175) fue sensible a los cinco productos,

independientemente del principio activo y de la forma farmacéutica, demostrado con la formación

del halo de inhibición alrededor de cada compuesto.

Mostraron la mayor actividad inhibitoria, sobre el Streptococcus mutans (ATCC 25175); con un halo

de inhibición de 7.3 a 5.8 mm, respectivamente el colutorio 1 (Digluconato de Clorhexidina

0.12%/fluoruro 0.06 %) y el barniz 2 (clorhexidina 1%/timol 1%). En orden creciente en relación al

diámetro del halo de inhibición, el orden es el siguiente: colutorio 2 (Cetilpiridinio/fluoruro 0.012 %)

4.4 mm, colutorio 3 (Cetilpiridinio 0.05%) 3.8 mm y barniz 1 (fluoruro/triclosán) 3.7mm.

61

5.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Los resultados de investigación, fueron obtenidos a través del Análisis de Varianza ANOVA

para la prueba de hipótesis y la Prueba de Diferencia Significativa Honesta (DSH) de Tukey

para identificar cuál de los compuestos antimicrobianos utilizados en el estudio fue el más

efectivo frente a la cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175) con un nivel de significancia

del 5% equivalente a un nivel de confianza de 95%. La prueba de Tukey se utilizó porque se

aceptó la hipótesis alterna, que dice: (¨La cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175) in

vitro, NO es igualmente sensible a la acción de los barnices de uso en odontología a base de

Triclosán, Clorhexidina y Fluoruro de Sodio; y los colutorios, a base de Cloruro de Cetilpiridinio,

aceites esenciales, Fluoruros y Digluconato de Clorhexidina¨). Existe diferencia significativa

entre los barnices y colutorios con resultados positivos para el halo de inhibición, asimismo,

existe diferencia significativa entre los barnices y entre los colutorios con respuesta positiva

para los halos de inhibición. Por lo que los resultados demuestran que la actividad frente a la

cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175) a barnices y colutorios de marca comercial de

uso en odontología es positiva únicamente para los barnices identificados como 1 y 2 (tabla 1)

y a los colutorios identificados con los números 1, 2, 3. Los que a su vez presentan la mejor

actividad in vitro, por lo que se acepta la hipótesis alterna, como se mencionó con anterioridad.

En términos generales se demostró la variación entre parejas independientemente de la forma

farmacéutica, siendo la diferencia entre barniz 1 y colutorio 1; colutorio 1 y colutorio 2; colutorio

1 y colutorio 3, sobrepasando el valor de la Diferencia Significativa Honesta (2.13); lo que

indica que sí existe diferencia estadísticamente significativa en cuanto a la sensibilidad del

Streptococcus mutans (ATCC 25175). (Anexo 33).

Cabe mencionar la comparación con otros estudios similares como el de Aguilera, M. (2011)

quien determinó la sensibilidad in vitro de S. mutans a los colutorios con Digluconato de

Clorhexidina 0.12% y con Cloruro de Cetilpiridinio 0.05; obteniendo un halo de inhibición para

la Clorhexidina de 8mm y para el Cetilpiridinio de 3mm similares a los observados en este

estudio. El de Camejo, M. (1999) quien determinó la sensibilidad de S. mutans a la

62

Clorhexidina, obteniendo un halo de inhibición de 8.2mm similar al halo de inhibición del

Gluconato de Clorhexidina observado en este estudio. Refiere que la clorhexidina está indicada

principalmente para personas con prevalencia de caries (S. mutans) y se sugiere tener uso

adecuado de la misma ya que provoca tinciones en las piezas dentales con el uso prolongado.

Y el de Peláez, P. (2014) donde obtuvieron halos de inhibición alrededor de los discos

impregnados con clorhexidina pero no para los discos impregnados con triclosán.

Otros estudios similares como el de De la Cruz y Gonzáles (1997) y Petersson, LG (2000)

donde ambos realizaron un estudio utilizando barnices de clorhexidina y barnices de fluoruro

de sodio, aplicando los barnices en pacientes niños. Demostrando su actividad antimicrobiana

sobre el Streptococcus mutans, obteniendo resultados similares entre los dos barnices. Lo que

coincide con los resultados obtenidos en este estudio con los discos impregnados con barniz

de clorhexidina, a pesar de que este estudio fue in vitro, los resultados fueron similares. Sin

embargo, para los discos impregnados con barnices de fluoruro difiere con los resultados

obtenidos en este estudio, ya que el S. mutans no fue sensible al fluoruro.

El resultado obtenido con el compuesto Flúor/Triclosán coincide con otros resultados de

estudios previos con colutorios, a pesar de que en este estudio se utilizó el triclosán en forma

de barniz. Aguilera, M. (2011) demostró que el S. mutans fue sensible al colutorio de triclosán

obteniendo un halo de inhibición alrededor del disco impregnado.

63

5.3 CONCLUSIONES

5.3.1 Se aceptó la Hipótesis alterna porque el Streptococcus mutans (ATCC 25175), no

mostró la misma sensibilidad frente a todos los agentes antimicrobianos.

5.3.2 El Streptococcus mutans (ATCC 25175), mostró in vitro sensibilidad al barniz 1

(fluoruro/triclosán) y barniz 2 (clorhexidina 1%/timol 1%) presentaron halo de inhibición

con un promedio de 3.7 y 5.8 mm, respectivamente. Y no mostró sensibilidad frente a

los barnices 3, 4 (fluoruro de sodio 5%) y barniz 5 (fluoruro de sodio 0.1%).

5.3.3 El Streptococcus mutans (ATCC 25175), mostró in vitro sensibilidad al colutorio 1

(Digluconato de Clorhexidina 0.12%/fluoruro 0.061%), colutorio 2 (Cloruro de

Cetilpiridinio/Fluoruro 0.012%) y colutorio 3 (Cloruro de Cetilpiridinio 0.05%), formando

halos de inhibición con un promedio de 7.3, 4.4, 3.8 mm, respectivamente. No

mostrando sensibilidad a los colutorios 4, 5, 6, y 7.

5.3.4 El Streptococcus mutans (ATCC 25175), in vitro fue más sensible al colutorio (1) de

Clorhexidina 0.12% + Fluoruro 0.061%.

64

5.4 RECOMENDACIONES

5.4.1 Realizar otros estudios in vitro e in vivo en donde se pueda verificar la autenticidad de

los resultados obtenidos en este estudio sobre el crecimiento de Streptococcus mutans

y Lactobacillus acidóphillus.

5.4.2 Se recomienda hacer un estudio in vivo comparando los colutorios más utilizados por

los pacientes que asisten a las clínicas de la Facultad de Odontología de la

Universidad Mariano Gálvez de Guatemala, frente al Streptococcus mutans.

5.4.3 Continuar con este estudio utilizando barnices de fluoruro y enjuagues de fluoruro para

corroborar la acción antimicrobiana sobre el Streptococcus mutans.

65

5.5 BIBLIOGRAFÍA

5.5.1 Aguilera, M., Romano, E., Ramos, N., Rojas, L. (2011). Sensibilidad del Streptococcus

mutans a tres enjuagues bucales comerciales (Estudio In Vitro). ODOUS CIENTIFICA.

Vol. 12 No. 1.

5.5.2 Beech FW, Davenport RR (1971) Isolation, purification and maintenance of yeasts. En:

Methods in Microbiology, Vol. 4. Academic Press, London, pp.153-182.

5.5.3 Brown, J. H. (1919). The use of blood agar for the study of streptococci. NY Monograph

No. 9. The Rockefeller Institute for Medical Research.

5.5.4 Camejo, M. (1999). Sensibilidad In Vitro de Streptococcus mutans a Sanguinaria,

Compuesto Fenólico y Clorhexidina. Acta odontológica. Volumen 37 N°2.

5.5.5 De la Cruz D, González Huerta NC. (1997). Efecto antibacteriano de aplicación tópica

dental de acetato de clorhexidina y fluoruro de sodio sobre nivel de S. mutans en

escolares de 8 a 10 años; 4:227-23.

5.5.6 Dirección de Salud y Bienestar Municipal. Estudiantes con mejor salud bucal/ Jornada

de fluorización y control de placa dentobacteriana. (2009). Recuperado el 20 de Agosto

de 2009, de: http://rejvisa.muniguate.com/index.php/ac/6161-fluorización

5.5.7 Ivoclar Vivadent. (s.f.) Recuperado de: http://www.ivoclarvivadent.co/es-co/

5.5.8 Liébana, J. (1995). Microbiología Oral. Madrid: Interamericana Mc Graw-Hill

5.5.9 Microbiologics. KwikStick. (s.f.). Recuperado de: www.microbiologics.com

66

5.5.10 Negroni, M. (2009). Microbiología Estomatológica Fundamentos y Guía Práctica.

Buenos Aires: Médica Panamericana.

5.5.11 Neogen Corporation. Agar de Soja Tríptico. (2015) (s.f.). Recuperado el 6 de Diciembre

del 2015, de: neogen-info@neogen.com

5.5.12 Neogen Corporation. Blood agar base. (2011) (s.f.). Recuperado el 3 de Febrero del

2011, de: neogen-info@neogen.com

5.5.13 Organización Mundial de la Salud. Salud bucodental. Nota informativa N°318. (2012).

Recuperado en Abril de 2012, de: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs318/es/

5.5.14 Peláez Cruz, P. V. (2014). ¨Evaluación del Efecto antimicrobiano del Triclosan y

Clorhexidina sobre el Streptococcus mutans (Estudio In Vitro)

5.5.15 Petersson LG, Magnusson K, Andersson H, Almquist B, Twetman S. (2000). Effect of

quarterly treatments with a clorhexidine and fluoride varnish on approximal caries in

caries-susceptible teenagers; 34:140-3

5.5.16 Schawartz, Richard S., Summitt, James B., William Robbins, J., Dos Santos, José.

(1999). Fundamentos en odontología operatoria. (pp. 51). Colombia: Actualidades

Médico Odontológicas Latinoamérica, C.A.

5.5.17 Suárez, E., Boj, J., & Hernández, M. (2011). Caries dental en el niño. En J. Boj, M.

Catalá, C. García, A. Mendoza, & P. Planells, Odontopediatría. La evaluación del niño

al adulto joven (págs. 211-223). Madrid: Médica Ripano.

67

5.5.18 Universidad Mariano Gálvez de Guatemala. I2QB3. (s.f.). Recuperado de:

https://i2qb3.umg.edu.gt/quienes-somos/#historia

68

5.6 Anexos

Anexo 1. Carta de permiso para uso de instalaciones autorizada por I2QB3

69

Anexo 2. Instalaciones I2QB3 UMG

70

Anexo 3. Mantenimiento de cepa de Streptococcus mutans.

71

Anexo 4. Pasos para preparación de microorganismos.

72

Anexo 5. Preservación de cepa ATCC 25175 Streptococcus mutans

a. y b Instrumentos para desinfección e inoculación. c. cajas Petri con agar sangre de

carnero. d. rotulación primera siembra de S. mutans. e. rotulación cajas Petri. f. cepa

liofilizada de Streptococcus mutans.

a. b.

c. d.

e. f.

73

a. y b. apertura de cepa de Streptococcus mutans. c. saturación del hisopo en el material

hidratado. d. trasferencia al medio de cultivo agar sangre de carnero. e. desinfección de

asa en mechero. f. luego se pasa en tubo con solución salina.

a. b.

c. d.

e. f.

Anexo 6. Siembra de cepa de Streptococcus mutans en agar sangre de carnero.

74

a. b.

c. d.

e. f.

a. estriamiento de cepa de s. mutans. b. c. d. saturación del hisopo en el material hidratado e

inoculación de agar sangre co hisopo saturado. e. esterilización de asa en mechero. f. estriamiento

de microoganismos en medio de cultivo.

Anexo 7. Método de siembra por agotamiento por estrías.

75

Anexo 8. Colocación de cajas Petri en jarras de anaerobiosis.

a. b.

c. d.

e. f.

a. b. c. preparación de cajas de Petri para colocarlas en jarras de anaerobiosis. d. cajas

Petri en jarras de anaerobiosis. e. f. colocación de cajas de Petri en jarras de

anaerobiosis simulada.

76

a.

b.

c. d.

e. f.

a. b. colocación de candela para jarra de anaerobiosis simulada. c. d. incubadora. e. f.

colocación de jarras de anaerobiosis en incubadora para crecimiento de s. mutans a 37°C por

48 horas.

b.

e.

Anexo 9. Colocación de cajas de Petri en jarras de anaerobiosis simuladas y colocación en incubadora.

77

c. d.

e. f.

a. Observación de crecimiento de Streptococcus mutans a las 24 horas. b. observación de

crecimiento de s. mutans a las 48 horas. c. materiales a utilizar para caracterización de s.

mutans. (Tinción de Gram) d. observación de colonias de s. mutans. e. toma de colonias

frescas del agar sangre de carnero. f. colocación de colonias en portaobjetos.

Anexo 10. Observación de colonias de Streptococcus mutans.

78

a. Colocación de colonias en portaobjetos. b. y c. esterilización de asa con calor. d.

colocación de asa en solución salina. e. y f. finalización de colocación de colonias en

portaobjetos.

a. b.

c. d.

e. f.

Anexo 11. Realización tinción de Gram.

79

a. b.

c. d.

a. b.

a. y b. colocación de portaobjetos en gradilla para secado de colonias. c. d. y e. fijación de

colonias con calor. f. colocación de portaobjetos para inicio de tinción de Gram.

c. d.

e. f.

Anexo 12. Colocación de portaobjetos para proceso de secado.

80

a. b.

c. d.

e. f.

a. Colorantes para tinción de Gram. Cristal violeta, lugol, alcohol acetona, safranina. b.

colocación de cristal violeta en portaobjetos. c. se deja actuar el colorante durante 1 minuto.

d. y e. lavado de colorante de los portaobjetos. f. colocación de lugol en portaobjetos.

Anexo 13. Aplicación de colorantes en portaobjetos.

81

a. b.

c. d.

e. f.

a. Se deja actuar el lugol durante 1 minuto. b. lavado de colorante. c. y d. colocación de

alcohol-acetona. e. y f. lavado de colorante.

Anexo 14. Lavado de colorantes.

82

a. b.

c. d.

e. f.

a. Colocación de safranina. b. se deja actuar durante 1 minuto el colorante. c. lavado de colorante. d.

y e. observación de tinción morada en los microorganismos de los portaobjetos. f. observación de

microorganismos en microscopio de aumento.

Anexo 15. Aplicación de colorantes.

83

a. b.

c. d.

e. f.

a. b. c. d. observación de microoganismos en microscopio de aumento. e. y f. tinción de

gram en s. mutans. los microorganismos se tiñeron de morado, lo cual indica que son

bacterias Gram positivas. Cocos Gram + en racimos y en cadena.

Anexo 16. Caracterización de cepa de Streptococcus mutans.

84

a. b.

c. d.

e. f.

a. y b. Colocación de cajas de Petri con agar sangre de carnero para 2da. Resiembra de Streptococcus

mutans en campana de flujo laminar. c. rotulación de cajas Petri. d. colonias de s. mutans de 1ra.

Resiembra. e. toma de colonias frescas de 1ra. Resiembra. f. método de agotamiento por estrías.

Anexo 17. Preparación de cajas Petri con agar sangre de carnero para resiembra II.

85

a. b.

c. d.

e. f.

a. Método de agotamiento por estrías. b. y c. esterilización de asa con calor en

incinerador. d. y e. estriamiento en cajas Petri. f. colocación de cajas Petri con 2da.

Resiembra en incubadora por 48 horas a 37°C.

Anexo 18. Siembra por agotamiento por estrías.

86

a. b.

c. d.

e. f.

a. Observación de colonias de s. mutans. a las 24 horas. II Resiembra. b. observación de colonias de

Streptococcus mutans. a las 48 horas. II Resiembra. c. y d. preparación de cajas Petri con agar

tripticasa de soya para resiembra III. e. observación de colonias de s. mutans a las 24 horas.

resiembras III. f. observación de colonias de Streptococcus mutans a las 48 horas. Resiembra III.

Anexo 19. Observación de colonias de Streptococcus mutans de resiembra II.

87

Anexo 20. Técnica difusión de disco.

a. b.

c. d.

e. f.

a. Limpieza y desinfección de campana de flujo laminar. b. luz ultravioleta para desinfección de

área. c. apertura de cajas Petri con resiembra III para precipitación de Mc Farland. d. colocación

de asa en incinerador. e. toma de colonias de resiembra III. f. colocación de colonias en tubo con

solución salina para comparación con estándar de Mc. Farland.

88

Anexo 21. Preparación turbidez de Mc Farland e inoculación de Streptococcus mutans.

a. b.

c. d.

e. f.

a. Comparación con turbidez de Mc Farland. b. y c. apertura de cajas Petri con agar tripticasa de

soya para elaboración de técnica de difusión en disco. d. introducción de hisopo en turbidez de

Mc Farland. e. y f. siembra por agotamiento por difusión.

89

Anexo 22. Preparación de cajas Petri para aplicar productos dentales.

a. b.

c. d.

e. f.

a. Pinzas estériles. b. discos de papel filtro estériles. c. toma de disco de papel filtro con pinzas.

d. se colocan los discos en el producto dental para empaparlos. e. colocación de discos de

papel filtro empapados con barniz. f. colocación de discos de papel filtro con solución salina

como control negativo.

90

a. b.

c. d.

e. f.

a. Colocación de discos de papel filtro en barnices para empaparlos. b. c. d. y e. colocación de

discos de papel filtro en agar (técnica de difusión de disco. f. colocación de caja Petri en

incubadora durante 24 horas a 37°C.

Anexo 23. Colocación de discos impregnados con productos dentales.

91

a. b.

c. d.

e. f.

a. y b. colocación de caja Petri con discos de papel filtro en incubadora a 37°C por 24 horas. c.

comparación de halos de inhibición de barniz #3 con barniz #5, solo el barniz #3 inhibió al

streptococcus mutans. d. e. y f. cajas Petri con barniz #5, s. mutans no fue susceptible a éste

barniz. (3 peticiones)

Anexo 24. Colocación de cajas Petri en incubadora/ resultados obtenidos.

92

a. b.

c. d.

e. f.

a. b. y c. cajas Petri con barniz #2, Streptococcus mutans no fue susceptible a éste barniz.

(3 repeticiones) d. e. y f. cajas Petri con barniz #3, s. mutans si fue susceptible a éste

barniz formando halos de inhibición con un promedio de 5.8mm. (3 repeticiones)

Anexo 25. Observación de susceptibilidad del Streptococcus mutans ante los productos dentales.

93

a. b.

c. d.

e. f.

a. Incubadora. b. preparación de cajas Petri con agar tripticasa de soya para siembra por agotamiento

por difusión. c. y d. cajas Petri con barniz #1, Streptococcus mutans si fue susceptible a éste barniz,

formando halos de inhibición con un promedio de 3.7mm (5 repeticiones). e. y f. cajas Petri con

barniz #2, s, mutans no fue susceptible a éste barniz. (5 repeticiones)

Anexo 26. Observación de resultados después de incubación.

94

a. b.

c. d.

e. f.

a. y b. cajas Petri con barniz #4, Streptococcus mutans no fue susceptible a éste barniz. (5

repeticiones). c. y d. cajas Petri con barniza #5, s mutans no fue susceptible a éste barniz (5

repeticiones). e. y f. preparación de materiales para siembra por agotamiento por difusión para

colutorios.

Anexo 27. 0bservación de susceptibilidad de Streptococcus mutans ante productos dentales.

95

a. b.

c. d.

e. f.

a. y b. Gradillas con tubos con turbidez de Mc Farland, hisopos estériles, caja Petri con resiembra III.

c. turbidez estándar de Mc Farland. d. caja Petri con resiembra III. e. caja Petri con colutorio #1, s.

mutans si fue susceptible a éste colutorio, formando halos de inhibición con un promedio de 4.4mm.

(5 repeticiones) f. caja Petri con colutorion#2, Streptococcus mutans no fue susceptible a éste

colutorio (5 repeticiones).

Anexo 28. Preparación turbidez de Mc Farland/observación de resultados.

96

a. b.

c. d.

e. f.

a. Caja Petri con colutorio #3, S. mutans no fue susceptible a éste colutorio (5 repeticiones). b. caja Petri

con colutorio #4, s. mutans no fue susceptible a éste colutorio (5 repeticiones). c. caja Petri con colutorio

#5, S. mutans no fue susceptible a éste colutorio (5 repeticiones). d. caja Petri con colutorio #6, S.

mutans si fue susceptible a éste colutorio, formando halos de inhibición con un promedio de 7.3 mm (5

repeticiones). e. caja Petri con colutorio #7, S. mutans si fue susceptible a éste colutorio, formando halos

de inhibición con un promedio de 3.8 mm (5 repeticiones). f. caja Petri con barniz #3, S. mutans si fue

susceptible a éste barniz, formando halos de inhibición con un promedio de 5.8 mm (5 repeticiones).

Anexo 29. Observación de resultados.

97

Anexo 30. Resultados.

Caja Petri con barniz #1, Streptococcus mutans si fue

susceptible a éste barniz, formando halos de inhibición con un

promedio de 3.7 mm (5 repeticiones)

Cajas Petri con microorganismos para desechar.

98

Anexo 31. Regla microbiológica (para medir halos de inhibición).

Anexo 32. Apoyo microbiológico.

99

Anexo 33. Análisis estadístico

Comparación entre colutorios

Comparación entre barnices

En el análisis de Varianza ANOVA, se utilizó un alfa = 0.05

PRUEBA DE TUKEY

La Prueba de Tukey se utilizó porque se rechazó la Hipótesis nula y se aceptó la alterna, y para

identificar al compuesto que fue más efectivo sobre el Streptococcus mutans (ATCC 25175), con

un nivel de significancia de 0.05, es decir con el 95% de confianza. En la siguiente tabla se

muestran los promedios de los halos de inhibición para cada uno de los barnices y colutorios

ANÁLISIS DE VARIANZA

Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F

Entre grupos 47,1 4 11,775 10,28384279 0,000108511 2,866081402

Dentro de los grupos 22,9 20 1,145

Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza

Colutorio 1 5 36,5 7,3 2,95

Colutorio 2 5 22 4,4 0,425

Colutorio 3 5 19 3,8 0,325

ANÁLISIS DE VARIANZA

Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F

Entre grupos 35,03333333 2 17,51666667 14,2027027 0,0006862 3,885293835

Dentro de los grupos 14,8 12 1,233333333

Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza

Barniz 1 5 18,5 3,7 0,2

Barniz 2 5 29 5,8 1,825

ANÁLISIS DE VARIANZA

Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F

Entre grupos 11,025 1 11,025 10,88888889 0,010861578 5,317655063

Dentro de los grupos 8,1 8 1,0125

Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza

Barniz 1 5 18,5 3,7 0,2

Barniz 2 5 29 5,8 1,825

Colutorio 1 5 36,5 7,3 2,95

Colutorio 2 5 22 4,4 0,425

Colutorio 3 5 19 3,8 0,325

100

Barniz 1 Barniz 2 Colutorio 1 Colutorio 2 Colutorio 3

4 4.5 5 3.5 3

3 5 6 4 3.5

3.5 5.5 8 4.5 4

4 6 8.5 5 4

4 8 9 5 4.5

3.7 5.8 7.3 4.4 3.8

Existe diferencia significativa en cuanto a que los barnices y colutorios no tienen igual efecto

inhibitorio sobre el Streptococcus mutans (ATCC 25175), mostrando variación entre las parejas

barniz 1 y colutorio 1; colutorio 1 y colutorio 2, y colutorio 1 y colutorio 3, sobrepasando el valor de

la Diferencia Significativa Honesta (2.13). Lo que indica que si hay diferencia estadísticamente

significativa en cuanto a la sensibilidad del Streptococcus mutans (ATCC 25175). Como se observa

en la siguiente tabla.

Barniz 1 Barniz 2 Colutorio 1 Colutorio 2 Colutorio 3

Barniz 1 -2.1 -3.6 -0.7 -0.1

Barniz 2 -1.5 1.4 2

Colutorio 1 2.9 3.5

Colutorio 2 0.6

Colutorio 3

101

Anexo 34. Carta de donación de agar Mitis Salivarius y cepa de Streptococcus mutans ATCC

25175 a I2QB3

102

Anexo 35. Donación de agar Mitis Salivarius y cepa de Streptococcus mutans a directora técnica

de I2QB3.

103

Anexo 36. Certificado de análisis de cepa de Streptococcus mutans.

104

105

Anexo 37. Vale de pedido de cepa de Streptococcus mutans.

106

Anexo 38. Carta autorizada por I2QB3 para el uso de instalaciones de laboratorio.