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Indice
Resumen ........................................................................................................................ 4
Abstract ........................................................................................................................... 5
Introducción .................................................................................................................... 6
Capítulo I: Revisión Bibliográfica.............................................................................. 8
1.1 Características y síntesis del UC-244 .................................................................... 8
1.2 Materias primas de la síntesis de UC-244........................................................... 10
1.3 Importancia y utilización del UC-244 .................................................................... 12
1.4 Fungicidas................................................................................................................. 13
1.5 Arácnidos .................................................................................................................. 14
1.6 Aspectos fármaco-toxicológicos de la molécula del UC-244 ........................... 15
1.7 Diseño de experimentos......................................................................................... 16
1.8 Fundamento de las técnicas analíticas ................................................................ 18
1.9 Estudió cinético ........................................................................................................ 23
1.10 Parámetros de validación .................................................................................... 27
Capítulo II: Parte Experimental ................................................................................ 31
2.1 Reactivos y Equipamiento...................................................................................... 31
2.2 Métodos empleados ................................................................................................ 31
2.3 Estudio cinético de la degradación del UC-244.................................................. 32
2.4 Validación de la técnica analítica .......................................................................... 33
1
2.4.1 Preparación de la curva de calibración ......................................................... 33
2.4.2 Determinación de la precisión ......................................................................... 33
2.4.3 Exactitud ............................................................................................................. 34
2.4.4 Límite de detección ........................................................................................... 34
2.4.5 Límite de cuantificación.................................................................................... 34
2.4.6 Especificidad ...................................................................................................... 34
2.5 Influencia de diferentes factores en el proceso de síntesis.............................. 35
2.6 Influencia de diferentes factores en el proceso de purificación ....................... 36
Capítulo III: Análisis y discusión de los resultados ........................................... 38
3.1 Selección de la longitud de onda de máxima absorción ................................... 38
3.2 Selección de la fase móvil para la cromatografía de capa delgada................ 38
3.3 Estudio cinético de la degradación del UC-244.................................................. 39
3.4 Validación de la técnica .......................................................................................... 41
3.4.1 Linealidad ........................................................................................................... 41
3.4.2 Precisión ............................................................................................................. 43
3.4.3 Exactitud ............................................................................................................. 44
3.4.4 Límites de detección y de cuantificación ....................................................... 44
3.4.5 Especificidad ...................................................................................................... 45
3.5 Diseño de experimentos......................................................................................... 47
3.5.1 Influencia de diferentes factores en el proceso de síntesis ....................... 47
2
3.5.2 Influencia de diferentes factores en el proceso de purificación................. 49
Conclusiones ....................................................................................................53
Recomendaciones ............................................................................................54
Bibliografía ........................................................................................................55
Anexos ...............................................................................................................59
3
Resumen En este trabajo se desarrolla una técnica analítica que combina la
Espectrofotometría UV-VIS con una separación previa mediante la
Cromatografía de Capa Delgada, para la determinación cuantitativa de la pureza
de crudos del 1-(fur-2-il)-2-nitroprop-1-eno, comúnmente conocido como UC-
244. Se determinan algunos parámetros de validación tales como linealidad,
precisión, límite de cuantificación y especificidad. También se inicia el estudio de
las mejores condiciones de obtención del proceso de síntesis y purificación del
principio activo nombrado, mediante diseño de experimentos. Se realiza un
estudio cinético para determinar su estabilidad bajo las condiciones del
procedimiento de análisis.
Palabras claves:1-(fur-2-il)-2-nitroprop-1-eno, espectrofotometría UV-VIS,
cromatografía de capa delgada.
4
Abstract
In this work it is developed a combined analytic technique, of UV-VIS
Spectrophotometry with a previous separation of Thin Layer Chromatography, for
the quantitative determination of the purity of raw of the 1-(fur-2-il)-2-nitroprop-1-
eno and some validation parameters like linearity, precision, limit of
quantification and specificity have been determined. It is also begon the study of
the best conditions of the synthesis and purification processes of the noted active
principle by means of experimental design. It is also carried out a kinetic study to
determine their stability under the analytical procedure conditions.
Key words: 1-(fur-2-il)-2-nitroprop-1-eno, UV-VIS spectrophotometry, thin layer
chromatography.
5
Introducción El Centro de Bioactivos Químicos trabaja en compuestos que presentan
marcada actividad biológica. Entre los principios activos que se sintetizan a
partir del furfural, está el 1-(fur-2-il)-2-nitroprop-1-eno, más conocido como UC-
244, el que presenta propiedades garrapaticidas, fungicidas y bactericidas, de
las cuales se estudian importantes aplicaciones.
Para darle cumplimiento a la misión del CBQ de desarrollar a ciclo completo
principios activos, se necesita implementar técnicas analíticas que permitan
determinar la pureza del compuesto.
Entre las diferentes técnicas analíticas que se pueden encontrar para este fin se
tienen: Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC), Cromatografía de
Gases (GC), y Polarografía Diferencial de Pulso (PDP), pero ellas requieren de
un equipamiento costoso y en algunos casos de difícil mantenimiento, por lo que
se recurre a otras técnicas más factibles como la Potenciometría, la
Cromatografía de Capa Delgada o la Espectrofotometría UV-VIS. Con la finalidad de su posterior producción, se necesita optimizar los procesos
de síntesis y de purificación de este principio activo, mediante la aplicación del
diseño experimental, procedimiento que permite determinar la influencia de las
diferentes variables y encontrar las condiciones más favorables para su
ejecución.
6
Problema científico El Centro de Bioactivos Químicos ha obtenido un compuesto a partir del furfural
denominado 1-(fur-2-il)-2-nitroprop-1-eno, que presenta aplicaciones en
medicina humana, animal y vegetal del cual no se han estudiado las mejores
condiciones de obtención ni se cuenta con una técnica analítica para su
cuantificación.
Hipótesis Es posible el desarrollo de una técnica combinada de cromatografía de capa
delgada y espectrofotometría UV-VIS para la cuantificación de la pureza del UC-
244, así como alcanzar las mejores condiciones en los procesos de síntesis y
purificación de este principio activo.
Objetivos generales
• Desarrollar una técnica combinada CCD-Espectrofotometría UV-VIS, para la
cuantificación de la pureza de los crudos del UC-244.
• Obtener las mejores condiciones de síntesis y purificación del UC-244.
Objetivos específicos
• Seleccionar la fase móvil óptima para el desarrollo del cromatograma en
CCD.
• Determinar la longitud de onda de trabajo.
• Realizar un estudio cinético preliminar de la degradación del UC-244.
• Determinar la linealidad, la precisión, la especificidad y los límites de
detección y cuantificación del método analítico combinado propuesto.
• Aplicar la técnica analítica a la cuantificación de crudos del proceso de
síntesis del UC-244 y al producto purificado.
• Determinar las mejores condiciones para la síntesis y la purificación del UC-
244.
7
Capítulo I: Revisión Bibliográfica 1.1 Características y síntesis del UC-244
El UC-244 es un principio activo que forma parte de la familia de derivados
nitrovinilfuránicos, de los cuales se han sintetizado y caracterizado algunos
productos.
En estudios realizados a este principio activo se han determinado su estructura y
características:
Nombre químico (según IUPAC): 1-(fur-2-il)-2-nitroprop-1-eno.
Masa molar: 153 g/mol.
Fórmula global: C7H7O3N.
En estado cristalino es un sólido de olor penetrante y de color amarillo. Tiene la
capacidad de sublimar. (Ugalde, M. 1992-93). Funde entre 47 y 49 oC, es
prácticamente insoluble en agua y muy soluble en solventes orgánicos polares.
Se descompone a la luz tomando colores en las tonalidades del carmelita oscuro
al negro. Posee elevada reactividad con solventes nucleofílicos, la que se
cataliza por la luz.
Características espectroscópicas:
Infrarrojo
γc =c 1635 cm-1
γNO2 1500 y 1340 cm-1
γC-O-C 1270 cm-1
γc =c 760 cm-1
γC-H del CH3 2930 cm-1
8
En el ultravioleta visible las bandas de máxima absorción se hayan corridas
hacia longitudes de onda mayores producto de transiciones Π- Π* y n- Π*
fundamentalmente. (Delgado, 1993).
En el UC-244 a medida que aumenta la polaridad del solvente hay un
desplazamiento batocrómico de la banda de absorción.
Influencia de la polaridad del solvente en la posición del máximo de absorción:
Solventes UC-244 λ (nm)
n- heptano 331.0
Éter de petróleo (70 – 100 οC ) 331.2
Ciclohexano 332.8
Tetracloruro de carbono 338.5
Éter dietílico 339.6
Metanol 348.0
Etanol 349.6
Es de suponer que es una transición Π- Π*; esta asignación esta hecha sobre la
base del conocimiento de que estas transiciones dan lugar a bandas intensas
que pueden aparecer en el ultravioleta cercano o visible si hay presente
instauraciones conjugadas y al hecho de que las bandas originadas por este tipo
de transición pueden tener corrimiento batocrómico cuando la polaridad del
solvente aumenta. (Delgado, 1993).
El UC-244 se sintetiza a partir del furfural y el nitroetano, en presencia de
catalizadores (generalmente se utiliza isobutilamina, aunque se han obtenido
buenos resultados con otros como el óxido de aluminio). En todo caso se sigue
una reacción de condensación según Knoevenagel.
9
Mecanismo de reacción:
1.2 Materias primas de la síntesis de UC-244 Furfural, o furfuraldehído: Aldehído orgánico líquido, de fórmula C5H4O2, que se obtiene por la destilación
con ácido clorhídrico o sulfúrico del salvado de la cascarilla de arroz y otros
productos ricos en pentosas. El grupo de compuestos al que pertenece el
furfural se denominan furanos. El furfural, en estado puro, es un líquido aceitoso
incoloro, con un olor a almendras agrias, que expuesto al aire se vuelve pardo
rojizo. Tiene un punto de ebullición de 161,7 °C. Industrialmente se emplea para
refinar el disolvente utilizado en la elaboración del caucho o hule sintético y del
nylon; en la fabricación de resinas para plásticos y revestimientos metálicos.
También es un componente de los insecticidas, de los embalsamamientos y de
los líquidos desinfectantes. Ciertos furfurales sensibles a la luz se usan en
litografía.
10
Nitroetano El nitroetano es solamente uno de la familia de químicos llamados
"nitroparafinas". Es un líquido incoloro, aceitoso, con olor característico.
A continuación se relacionan algunas de sus propiedades:
Fórmula general:
C2H5NO2/CH3CH2NO2
Masa molar: 75.1 g/mol
Punto de ebullición: 114°C
Punto de fusión: -50°C
Densidad relativa (agua = 1): 1.053 g/cm3
Solubilidad en agua: moderada (4.5 mL/100 mL a 20°C)
Presión de vapor (a 20°C) : 2.08 kPa
Punto de inflamación: 28°C
Temperatura de auto ignición: 414°C
Límite de explosividad: 4.0 % en volumen en el aire
Puede estallar por calentamiento rápido a altas temperaturas. Con álcalis
fuertes, ácidos o combinación de aminas y óxidos de metales pesados se
forman compuestos inestables frente al choque. En combustión, formación de
gases tóxicos (dióxido de nitrógeno). La sustancia se descompone al calentar
intensamente por encima de 300°C, produciendo humos tóxicos (óxidos de
nitrógeno) que irrita los ojos, la piel y el tracto respiratorio, además de causar tos
y dolor de cabeza. La exposición podría causar disminución de la conciencia.
Isobutilamina
La isobutilamina es un líquido incoloro a temperatura ambiente, de olor
característico. Algunas de sus propiedades principales se relacionan a
continuación:
Temperatura de ebullición: 68-69 °C
Temperatura de fusión: -85 °C
Densidad relativa (agua = 1): 0.7
11
Solubilidad en agua: miscible.
Presión de vapor, a 18.8°C: 13.3 kPa
Densidad relativa de vapor (aire = 1): 2.5
Entre sus propiedades se destaca que por combustión, forma gases tóxicos y
corrosivos, incluyendo monóxido de carbono y óxidos de nitrógeno. La disolución
en agua es moderadamente básica. Reacciona violentamente con oxidantes. La
sustancia es corrosiva para los ojos, la piel y el tracto respiratorio. Es corrosiva
por ingestión. La inhalación de la sustancia puede originar edema pulmonar,
cuyos efectos pueden aparecer de forma no inmediata. Si bien no se ha
encontrado en la literatura algún riesgo específico y directo de esta amina, se
conoce que su reacción con nitritos produce nitrosoaminas, sustancias
cancerígenas que aumentan el riesgo de cáncer de esófago y estómago
(Catálogo General Panreac, 2001).
1.3 Importancia y utilización del UC-244
Por presentar propiedades acaricidas se ha comprobado que ataca la sarna
psoróptica y sarcóptica, garrapatas ninfas, metaninfas y adultas, así como frente
a la fasciola hepática. También se ha demostrado su actividad antinflamatoria,
aspecto que le confiere múltiples usos e importancia terapéutica.
Este compuesto esta aún bajo estudio, pero según ensayos realizados se ha
demostrado su gran eficacia en la eliminación y el control de plagas muy dañinas
como son una especie de coleópteros que ataca las gallinas ponedoras
(Rodríguez, R. 1994). Otro insecto que ataca también es la mosca, aunque el
G-0, sustancia también sintetizada en el Centro de Bioactivos Químicos, es más
efectivo.
El UC-244 ataca a los ácaros que tan perjudiciales son para los granos. Los
estudios revelan que en el caso del ácaro del ajo del género Rhizoglyphus, al ser
aplicado el compuesto al 25%, no afecta la brotación de la semilla ni el
desarrollo posterior de la planta (Salazar, E. 1996). Los granos almacenados
son generalmente los más afectados por esta plaga, sin embargo el UC-244
controla bastante ésta en el arroz de los almacenes. Sus vapores matan el
12
Zabrotes Subfasciatus en el frijol Caupri, no afectan la posterior germinación de
este y produce un efecto residual que protege al grano durante 30 días
aproximadamente. Tampoco afecta su utilización como sustrato para el
desarrollo de hongos trichederma sp y beauveria bassiana e impide el desarrollo
de los entomopatógenos cultivados sobre estos sustratos. La harina
almacenada también es atacada por los gorgojos a los que los vapores del
compuesto eliminan con eficacia en una semana, incluyendo sus larvas. .
(Machado, R.).
Saucedo, 2004; ha reportado estudios sobre la efectividad del UC 244 para el
control de plagas de almacén en el cultivo del sorgo (Sorghum bicolor) Los
insectos plagas a los cuales se les estudió el efecto del producto, fueron del
género Sitophilus spp (Sitophilus oryzae, Sitophilus zea mais y Sithophilus
granarius), así como Rhizoperta dominica (polilla de las harinas).
Los resultados parciales obtenidos demuestran un efecto de repelencia y letal
sobre los insectos, con mayor acción a partir de los 10 días en los insectos del
género Sitophilus spp
Se estudió el efecto sobre el pienso industrial del insecto plaga Rhizoperta
dominica (Polilla de los cereales), mediante el producto UC 244 (en forma
sólida), presentándose un efecto letal a los 12 días.
1.4 Fungicidas
Los fungicidas son sustancias tóxicas que se emplean para impedir el
crecimiento o para matar los hongos y otras enfermedades perjudiciales que
atacan los animales y las plantas. La mayoría de los fungicidas de uso agrícola
se fumigan o espolvorean sobre las semillas, hojas o frutas para impedir la
propagación de la enfermedad.
La mixtura de Burdeos, desarrollada en 1882 y compuesta de cal muerta y
sulfato de cobre, fue el primer fungicida eficaz, durante muchas décadas fue
empleado en una gran variedad de plantas y árboles frutales. Los fungicidas de
hoy, mucho más variados, se emplean de un modo más selectivo, para combatir
enfermedades en plantas específicas.
13
Otros fungicidas de uso común son los compuestos orgánicos de mercurio,
eficaces en el tratamiento de las semillas antes de la siembra; y los
ditiocarbamatos, compuestos que contienen azufre y se aplican en una gran
variedad de cultivos, árboles y plantas ornamentales. Por lo general todos estos
compuestos utilizados en la prevención y el combate de plagas son altamente
tóxicos y la mayoría presenta metales pesados en su estructura, los que son
altamente perjudiciales tanto para el hombre como para los animales las plantas
y el medio ambiente en general.
1.5 Arácnidos
Término que se aplica al escorpión, la araña, el opilión, el ácaro, la garrapata y
algunos otros animales invertebrados. Por lo general, los arácnidos son
carnívoros y terrestres; el registro fósil sugiere que estuvieron entre los primeros
animales en vivir en tierra firme, tal vez a comienzos del período devoniano,
hace casi 400 millones de años. Hoy existen una 60.000 especies, agrupadas en
11 órdenes y dentro de estas esta la garrapata (Encarta, 2000).
Garrapata:
Este es el nombre común de unos arácnidos de mayor tamaño que los ácaros
que son parásitos del ganado vacuno, los perros, las aves, los reptiles y algunos
otros animales, incluido el ser humano. Viven en los bosques o entre la
vegetación densa. La garrapata tiene un cuerpo similar al del ácaro con una piel
correosa y cuatro pares de patas terminadas en garra. Las piezas bucales
consisten en un órgano par de anclaje, llamado rostro, cubierto de garfios
curvados hacia atrás, equivalente a un 'labio maxilar' o a los pedipalpos de otros
arácnidos, y un par de mandíbulas afiladas que se deslizan hacia atrás y hacia
adelante a lo largo de dos canales longitudinales presentes en el rostro. La
garrapata se fija sobre la piel de un animal, la perfora y le succiona sangre. Las
garrapatas transmiten varias enfermedades al hombre a través de su mordedura
o de sus excrementos. En cuanto a la clasificación científica de las garrapatas
se consideran pertenecientes al orden Acari
14
Las garrapatas, de mayor tamaño que los ácaros, succionan sangre y transmiten
agentes patógenos como protozoos, virus y bacterias; pueden tener varios
huéspedes en su ciclo vital. (Encarta, 2000)
1.6 Aspectos fármaco-toxicológicos de la molécula del UC-244
Los estudios farmacológicos que sustentan, desde el punto de vista científico, el
empleo de la molécula UC-244 en el campo de la terapéutica se refieren a sus
acciones antinflamatoria y acaricida fundamentalmente. La actividad
antinflamatoria de esta molécula ha sido demostrada mediante ensayos
farmacológicos desarrollados en el Departamento de Farmacia de la Universidad
Central “Marta Abreu” de Las Villas (UCLV) (Loy 1998), así como en el Centro de
Química Farmacéutica (CQF) de la Habana (Caveda 1991).
Por otra parte la acción acaricida se determinó por el Grupo de Parasitología de
la Estación Nacional Experimental de Parasitología (ENEP) y el Grupo de
Parasitología del Centro de Bioactivos Químicos (CBQ) de la UCLV, (Cordobés
1993, Olazábal 1991).
Los estudios toxicológicos de esta molécula la clasifican como de toxicidad
moderada, ya que su dosis letal media oral (DL50) es de 561,6 y 448 mg/kg. de
masa corporal (m.c.) para ratas Wistar de sexo macho y hembras
respectivamente. El criterio técnico toxicológico no considera esta molécula con
limitaciones para ser empleada como medicamento, puesto que en este rango
es común encontrar la inmensa mayoría de los medicamentos. En estudios
desarrollados en la Universidad de Leipzig, Alemania, se demostró que el
órgano diana en caso de intoxicación aguda por sobredosis es el hígado, donde
se produce la biotransformación de la molécula (Pérez 1988). En estudio
subcrónico de 90 días de aplicación por vía oral la molécula de UC-244 a ratas
de laboratorio Wistar no se apreciaron efectos tóxicos a la dosis más baja y sí se
apreció un aumento de los niveles plasmáticos de las enzimas AlAT y fosfatasa
alcalina (FA) para el resto de las dosis. Estos aumentos enzimáticos sin daños
celulares marcados, indican que las dosis relativamente altas, no ejercen un
considerable efecto tóxico para la vía y especie estudiada (Pérez 1988).
15
En lo referente al contacto con estructuras oculares, piel y mucosa se debe
evitar el contacto de la sustancia pura, así como en concentraciones altas por
ser muy irritante (Pérez 1988).
Estudios teóricos basados en las características electrónicas moleculares de los
grupos nitros en compuestos furiletilénos, han demostrado acción mutagénica
atribuida a la presencia del grupo nitro en el anillo furánico, donde se favorece
la reducción del mismo. Sin embargo, en el UC-244 estos grupos no son
susceptibles a sufrir la reducción antes referida y por tanto la acción mutagénica
no se manifiesta marcadamente (Estrada 1994).
El desarrollo de una molécula nueva es un largo y costoso camino, en el cual
muchas no llegan a la meta anhelada, la salida al mercado farmacéutico. El UC-
244 debe completar su ruta crítica para el desarrollo de medicamentos y a
medida que se cumplimenten los requisitos regulatorios, será posible ampliar
los criterios de efectividad terapéutica e inocuidad. Hasta el momento, esta
molécula muestra perspectivas en la terapéutica y no existen limitaciones
toxicológicas que invaliden su posible uso en algunos campos de la industria
farmacéutica.
1.7 Diseño de experimentos
Consideraciones generales acerca del diseño experimental.
El diseño experimental es el procedimiento de selección del número de vías y
condiciones suficientes y esenciales para dar solución a un problema planteado
con la precisión requerida, brindando un error en la determinación de los efectos
de interés mucho menor que otro método.
Es frecuente que los químicos necesiten enfrentarse a numerosos problemas
relacionados con la realización de experimentos más o menos costosos y
complejos con el objetivo de obtener información sobre el sistema en estudio.
Muchos son los ejemplos que pueden citarse al respecto: la síntesis de una
reacción, las condiciones de realización de un experimento, la influencia de
factores sobre las propiedades químico-físicas de un producto, y otras. En la
mayoría de estos problemas químicos, se investiga cómo influyen diferentes
16
condiciones de realización sobre una propiedad o característica del sistema
investigado.
Los métodos de diseño de experimentos permiten sistematizar la forma de
realización de las corridas experimentales y obtener la máxima información
posible con la mínima cantidad de experimentos.
La importancia de un diseño de experimental radica en que disminuye, de forma
considerable, la inversión de tiempo, de recursos materiales y humanos, estudia
la variación simultánea de las variables determinantes del proceso, utiliza un
aparato matemático que formaliza muchas acciones de los experimentos
(planificación, preparación y realización) y brinda estrategias claras luego de
tomar decisiones sustentadas a partir de cada serie de experimentos.
En Química y Tecnología Química, el diseño experimental se utiliza
fundamentalmente en dos direcciones:
• Para el estudio de los mecanismos de procesos complejos y de las
propiedades de sistemas multicomponentes.
• Para la optimización de los procesos y de las propiedades de los sistemas
multicomponentes.
Para realizar un diseño de experimentos es necesario conocer el objeto de
investigación, para lo cual se establece un método cibernético que consta de los
parámetros de optimización y de los factores.
Un parámetro de optimización debe ser: efectivo desde el punto de vista
investigativo, de naturaleza universal, cuantitativo y expresado mediante un valor
único así como efectivo estadísticamente. (Fernández. 2003).
Algunos conceptos generales relacionados con el diseño factorial experimental:
Factor: Las variables independientes que influyen o pueden influir sobre el
proceso investigativo determinado son conocidas con el nombre de factores.
En un proceso químico los factores pueden ser: la temperatura, la presión, el pH,
la concentración de un reactivo, el tiempo de reacción, etc. Las variables son
designadas con la letra x, o sea: x1, x2,...xn, correspondientes a los factores 1,
2,... n respectivamente.
Función respuesta: Cuando se realiza un experimento, los resultados se
17
expresan a través de una o más variables dependientes, por ejemplo en
Química: el rendimiento de una síntesis, la pureza de un reactivo que se obtiene
o se purifica, el coste de un proceso de síntesis, entre otros. Estas propiedades
que generalmente constituyen el blanco u objeto de estudio, son conocidas
como función respuesta y se representan con la letra Y.
La función respuesta es función de los factores y puede expresarse como:
y = f(x1, x2,...., xn)
Nivel del factor: Es el valor que puede tomar un factor; y el conjunto de factores
que condicionan una vía.
Superficie de nivel: La forma geométrica de la función respuesta como función
de los factores, es conocida como superficie de nivel.
Espacio factorial: Se denomina así al espacio comprendido por los ejes del
sistema de coordenadas en que se representan los valores de los factores
(Fernández. 2003).
1.8 Fundamento de las técnicas analíticas
En este centro se cuenta con equipamiento fundamentalmente para
determinadas técnicas analíticas como son: Cromatografía Líquida de Alta
Resolución (HPLC), Cromatografía de Gases (GC), y Polarografía Diferencial
de Pulso (PDP). Las dos primeras rápidas y de gran sensibilidad pero
demasiado costosas para pequeñas industrias además de que las impurezas del
UC-244 pueden obstruir la columna; y la tercera sencilla, confiable y rápida pero
en el centro sólo se cuenta con un equipo dedicado a la investigación, es decir la
fábrica como parte del control de la calidad no cuenta con esas técnicas para su
aplicación.
De acuerdo con su estructura, es decir por la presencia de un grupo nitro el que
permite reacciones de oxidación-reducción; el UC-244 también se pudiera
determinar por potenciometría.
Una técnica de separación sencilla es la cromatografía de capa delgada (CCD),
la que se puede combinar con las anteriormente mencionadas para la
optimización del proceso de análisis, lo que la hace más selectiva.
18
Se busca con este trabajo montar una técnica sencilla, no demasiado costosa y
que se pueda realizar en el centro con los aditamentos y reactivos con los que
cuenta este.
Cromatografía de capa delgada La cromatografía comprende un grupo de métodos de separación variada e
importante que permite al científico separar, identificar y determinar compuestos
afines en mezclas complejas que no podrían separarse de otra manera. La
cromatografía de capa delgada constituye un método de separación
eminentemente físico en el cual los componentes a separar se reparten entre
dos fases no miscibles, una de las cuales es la fase o lecho estacionario, que es
un sólido finamente dividido diseminado como una capa delgada sobre un
soporte rígido de cristal, de plástico o de aluminio de gran desarrollo superficial y
la otra es un fluido que pasa a lo largo del lecho estacionario. A esto podría
añadirse que la velocidad de migración de cada componente es función de la
distribución de equilibrio de ambas fases (la estacionaria y la móvil).
El instrumental usado es sencillo y barato, presenta alta sensibilidad y gran
rapidez. La excelente nitidez y la alta sensibilidad obtenida por este método; así
como la amplia gama de adsorbentes y eluyentes existentes permiten la gran
adaptabilidad del método y la reproducibilidad de sus resultados, lo que hace
que sea adecuado para muchos propósitos analíticos (Randerath, 1969).
La sustancia a separar, disuelta, se aplica a una distancia de 1 a 2 cm del borde
inferior de la placa. Después de la selección del disolvente o mezcla de éstos, se
colocan las placas en una cámara de separación adecuada que lo contiene; la
atmósfera de la cámara deberá estar previamente saturada de éste.
Las diferentes sustancias que componen la muestra serán arrastradas por el
eluyente con velocidades diferentes, formándose manchas. Esto se produce por
equilibrios de adsorción, reparto, intercambio iónico o combinación de éstos.
Después que el frente del eluyente ha recorrido cerca del 70% de la superficie
se saca la placa de la cámara y se procede a su secado y revelado en caso
necesario.
19
Como una medida de la velocidad de desplazamiento se refiere el valor del Rf
de la siguiente forma:
Rf = D1/D2
D1: distancia del centro de la mancha al origen.
D2: distancia del frente del eluyente al origen.
Debido a las variaciones de Rf producidas por diferentes causas y no siempre
controlables, es recomendable correr en el mismo cromatograma una muestra
de patrón si es posible.
El valor de Rf depende de muchas variables que deben tenerse en cuenta en la
elaboración y valoración del cromatograma para la obtención de resultados
reproducibles, algunas de estas variables son: calidad y naturaleza del
disolvente, espesor de la capa de soporte, actividad de esta, volumen de
muestra aplicada, temperatura, humedad relativa, tiempo de desarrollo del
cromatograma y volumen de la cámara.
El comportamiento del cromatograma depende tanto del solvente como del
medio de oclusión; se necesita hacer una cromatografía radial para tener
información previa sobre el poder de elución de la fase móvil.
Si los componentes de la muestra no se logran separar totalmente se utiliza
entonces una cromatografía bidimensional.
Espectrofotometría directa UV-VIS. Cuando sobre una especie molecular incide energía radiante, la misma absorbe
radiación sólo en regiones específicas del espectro, esta energía esta
cuantizada, lo que conduce a una banda de absorción a la longitud de onda de
la energía involucrada.
La región UV se divide en dos sub-regiones, la llamada UV al vacío o lejana,
que se extiende desde 100 a 200 nm y la correspondiente al cercano de 200 a
350 nm. La región visible se extiende desde 350 hasta 780 nm. Los espectros
UV en estado líquido se determinan utilizando cubetas de cuarzo y a longitudes
de onda superiores a los 350 nm se pueden sustituir por cubetas de vidrio. En el
ultravioleta lejano hay gran absorción de oxígeno y nitrógeno, por lo que se
20
necesita un material óptico especial y detectores especiales, además en él
absorben los solventes más comunes lo que hace más compleja su selección.
En el ultravioleta cercano absorben determinados grupos funcionales y requiere
de cubetas de cuarzo pues el vidrio absorbe fuertemente en esta región. En el
visible absorben fundamentalmente las insaturaciones conjugadas.
Las bandas de absorción que presentan los compuestos orgánicos en las
regiones UV- VIS se asocian comúnmente con transiciones electrónicas en la
capa de valencia. Estas bandas de absorción son transiciones de tipo Π- Π*, que
pueden ser muy intensas (permitidas) o débiles (prohibidas); o n- Π* que son
generalmente prohibidas y por tanto serán débiles.
Siempre que sea posible se deben usar solventes apolares en el estudio de los
espectros en disolución, ya que en los solventes polares las bandas n- Π*
pueden llegar a desaparecer. En particular esto sucede en los compuestos en
que las bandas n- Π* precedidas por bandas intensas Π- Π*.
Las principales características de una banda de absorción son: posición,
intensidad y forma.
La posición viene dada por la longitud de onda, cuya energía es la requerida
para la transición electrónica según la condición de Bohr.
La intensidad de una banda de absorción puede expresarse como la
absortividad molar en el máximo (∈máx.), depende de la probabilidad de
interacción entre los fotones de la radiación y el sistema electrónico de la
molécula.
La forma de las bandas depende del número e intensidad relativa de los
componentes vibracionales de una transición electrónica. (Delgado, M. 1992-93).
La utilización de la espectroscopía UV en análisis cualitativo es limitada porque
las bandas de absorción tienden a ser anchas y por lo tanto carecen de detalles,
no obstante se obtiene buena información sobre la presencia o ausencia de
sustancias en las que pueden tener lugar las transiciones ya expuestas, las que
pueden ser cuantificadas mediante sus señales.
21
El cumplimiento de la Ley de Lambert – Beer es la base de los métodos de
análisis cuantitativos, la cual establece que la absorción de una solución es
proporcional a la concentración del soluto.
Esta ley se expresa como:
A= a b c
Donde:
a: absortividad.
b: camino óptico.
c: concentración. (Para que la absortividad sea ε la conc. debe ser molar)
El comportamiento de una sustancia respecto a esta ley debe comprobarse
construyendo un gráfico de absorbancia como función de la concentración.
En ocasiones los sistemas varían su absorbancia en forma no lineal a altas
concentraciones ocurriendo desviaciones de dicha ley. Existen varias causas
que provocan estas desviaciones, entre las que se encuentran: falta de
monocromaticidad de la radiación empleada, asociaciones moleculares del
soluto a altas concentraciones, ionización del soluto, fluorescencia, pobre
transmisión del solvente, entre otras.
Esta técnica puede ser aplicada para determinar un componente en presencia
de impurezas activas en UV si ambas presentan máximos de absorción con una
diferencia aproximada de 100 nm (Skoog, 1997; Skoog, 1990; Willard, 1991).
Método combinado de CCD – Espectrofotometría UV Según (Heftmann, 1967) y (Randerath, 1969) el método se basa en puntear en
la placa cromatográfica cantidades conocidas de la muestra y desarrollar el
cromatograma en el sistema de solventes seleccionado. Una vez revelado el
cromatograma se recorta el área de la mancha y se extrae con un solvente
adecuado. Posteriormente se lee la solución en el espectrofotómetro e
interpolando la absorción de la muestra en la curva de calibración de un patrón o
comparando con una muestra patrón tratada de la misma manera se obtiene su
concentración (Skoog, 1990; Skoog, 1997; Willard, 1991). (Torres, 2003).
22
1.9 Estudió cinético
En (Levinne, 1991) se plantea que la cinética química, también denominada
cinética de las reacciones, estudia las velocidades y mecanismos de las
reacciones químicas. Un sistema reactivo no está en equilibrio, por lo que las
cinéticas de las reacciones no se consideran parte de la termodinámica, pero es
una rama de la cinética. Las aplicaciones de la cinética de la reacción son
numerosas. En las síntesis industriales de las sustancias, las velocidades de
reacción son tan importantes como las constantes de equilibrio.
Para la determinación de las ecuaciones cinéticas a partir de los datos
experimentales, según una ecuación cinética de la forma: λβα ]...[][][ LBAkr =
Generalmente, en primer lugar, se obtienen los órdenes α, β, λ, y luego la
constante k.
Existen métodos para la determinación de los órdenes de reacción, estos son:
Método de las fracciones vida.
Método de Powell.
Método diferencial de la velocidad inicial.
Método diferencial de velocidades en el tiempo
Método integral analítico.
Método integral gráfico.
1. Método de las fracciones de vida
Este método se aplica cuando la ecuación de velocidades (ecuación cinética)
tiene la forma de v= k[A]n .
Si se considera el tiempo necesario para la transformación del 50%, t1/2 , es que
se utiliza con frecuencia en los estudios cinéticos.
( )[ ] AN
n
kAnt 1
0
1
2/1 12
−
−
−= , para n≠1 (1)
[ ] [ ] AKeAA −= 0 , t1/2=0.6936kA para n=1. (2)
Nótese que son válidas para todos los valores de n excepto 1. En particular,
estas ecuaciones se aplican para n=0, n=1/2, n=3/2.
23
Si n=1, t1/2 es independiente de [A]0, si n≠1la ecuación (1) representada en forma
logarítmica:
( ) ( ) [ ]0
1
2/1 log11
12loglog Ankn
tA
n
−−−
−=
−
Una representación de log t1/2 frente a log [ ]0A debe brindar una línea recta. De
pendiente (n-1). Este hecho también es válido para n=1. Para usar el método se
representa en función de t para un experimento dado. A continuación se
escoge cualquier valor de [ , supongamos
[ ]A
]A [ ]A , y se encuentra el punto de [ ]A
se ha reducido a 1/2 , el intervalo entre estos dos puntos es t[ ]A 1/2 para la
concentración inicial [ ]A 0. Entones, se repite el procedimiento partiendo de otra
[ ]A 0,1 inicial, y determinando un nuevo valor de t1/2 para esta concentración. Tras
repetir este proceso varias veces se representa log t1/2 frente al logaritmo de las
correspondientes concentraciones iniciales y se determina la pendiente.
Si se usan los datos de un solo experimento, la reacción debe ocurrir hasta un
alto porcentaje de su extensión. Una mejora en este sentido se consigue
mediante el empleo de otras fracciones de vida, tα, definido como el tiempo
requerido para que se reduzca a α [ ]0A [ ]0A . (Para la semirreacción, α =1/2.) Si
v=k [ ]A n esto indicaría que una presentación de log tα frente a log es una
línea recta de pendiente (n-1). Un valor adecuado de α es 0.75 (t
[ ]0A
1/4).
2. Método de Powell:
Este método se aplica cuando la ecuación cinética tiene la forma v= k [ ]A n .
Definimos los parámetros adimensionales α y φ como:
[ ][ ]0A
A≡α , (1) y (2) [ ] tAk n
A1
0−≡φ
α es la fracción de A sin reaccionar.
Entonces de las ecuaciones (1) y (2):
[ ][ ] [ ] ( ) tknAAA
An
n
11 10
1
0
−+=⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ −−
para n≠1
Sustituyendo = 1/2 [[ ]A ]A 0 y t=1/2, obtenemos como semirreacción:
24
( )[ ] A
n
n
kAnt 1
0
1
2/1 12
−
−
−= , para n≠1
2- [ ][ ] tkAA
A−=0
ln
Se transforma en:
( )φα 111 −=−− nn , para n≠1
φα −=ln , para n=1
Para un valor de n dado, hay una relación fija entre α y φ en cada reacción de
orden n. Estas ecuaciones se usan para representar α frente a log φ, las cuales,
para valores típicos de n, dan una serie de curvas genéricas. A partir de los
datos de un experimento cinético, se representa α frente log t en papel
transparente, usando escalas idénticas a la de las presentaciones genéricas.
(De ordinario, el papel de gráficos puede hacerse translucido mediante la
aplicación de una pequeña cantidad de aceite. Alternativamente, se puede
realizar una transparencia de las curvas genéricas en una máquina
fotocopiadora que reduzca copias exactamente del mismo tamaño que el
original.) Puesto que el log φ se diferencia de log t en [ ]( )10log −n
A Ak , que es
constante para cada experimento de la curva experimental quedara desplazada
a lo largo del eje horizontal, y respecto a la curva genérica, en una cantidad
constante. Se desplaza la curva experimental hacia delante y atrás (mientras se
mantienen superpuestos los ejes horizontales log φ y log t de las
representaciones genéricas y experimental) hasta que coincida con una de las
curvas genéricas. Este procedimiento da el valor de n. El método de Powell
requiere de inversión previa del tiempo necesario para hacer las curvas
genéricas, pero una vez que estas se han preparado, el método es rápido, fácil y
agradable de usar.
3. Método diferencial de la velocidad inicial:
Se basa en evaluar la velocidad inicial para varios experimentos a diferentes
concentraciones iniciales del reactivo. Este es un método diferencial lo que
quiere decir que en el mismo se utilizan las ecuaciones diferenciales:
0V
25
( ) ( )003 )( Akcdt
AdcV n=−
=
y en el cual se representa gráficamente una data de concentración y tiempo,
obteniéndose una serie de curvas donde la pendiente de la recta tangente a
tiempo cero es igual a la velocidad inicial de la reacción la θtanV =0 , luego se le
aplica la función logaritmo a la ley diferencial de velocidades:
( )00 lnlnln AcnkV +=
Si se gráfica vs. lnc(A), se obtiene de la pendiente de la recta el orden de
reacción verdadero.
0lnV
4. Método diferencial de velocidades en el tiempo:
Se utilizan en este método las ecuaciones diferenciales. El mismo consiste en
usar una curva cinética y determinar la velocidad a distintos tiempos de reacción
(pendiente de la curva a diferentes tiempos).
Si la ecuación:
( )Akcv n= , se aplica logaritmo:
( )Acnkv lnlnln +=
de una gráfica lnv vs. lnc(A), se obtiene de la pendiente de la recta el orden n
(orden temporal) y el mismo puede afectar el orden.
5. Método integral analítico:
Consiste en sustituir la data experimental de c vs. t en la ecuación sospechada y
comprobar si la constante de velocidad, k, se mantiene constante o no. Si se
mantiene la k constante, ésta será el orden de la reacción, si hay tendencia al
aumento o disminución progresiva ese no será el orden de la reacción. La
constante k en la mayoría de los casos no da los valores constantes, debido a
los errores experimentales en las determinaciones.
6. Método integral gráfico:
Consiste en linealizar las ecuaciones integrales y representar las diferentes
funcionalidades de la concentración respecto al tiempo, en el caso de la mayor
correlación, pues de ese orden será la reacción.
26
1.10 Parámetros de validación
Para realizar la cuantificación de los crudos del proceso de producción hay que
contar con una técnica analítica previamente validada para garantizar resultados
confiables.
La necesidad de aplicar una validación se resume en:
• Proporciona un alto grado de confianza al método analítico y a la calidad
de los resultados.
• Permite un alto conocimiento de las características del funcionamiento del
método analítico.
• Hace posible el cumplimiento de las normas establecidas. (Castro, 1989).
Los métodos analíticos a utilizar deben ser prácticos, es decir si son fáciles de
aplicar; idóneo y fiable.
Criterios numéricos para seleccionar métodos analíticos (Castro, 1989; Skoog,
1997).
• Linealidad
• Precisión
• Exactitud
• Sensibilidad
• Especificidad
Linealidad: Es la capacidad de un método analítico de obtener resultados linealmente
proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un
intervalo definido. El ensayo puede efectuarse tanto sobre soluciones patrón del
analito como sobre muestras problemas que tengan concentraciones crecientes
del analito. El intervalo lineal dinámico del sistema instrumental debe ser más
amplio que el intervalo de las concentraciones a estudiar. El número de
soluciones patrón puede estar comprendido entre 3 y 10 y el intervalo de
concentraciones se seleccionara de acuerdo a las cantidades de analito
esperadas en la muestra.
27
Si se supone que la concentración del analito puede variar ampliamente los
patrones deberán abarcar todo el rango de concentraciones previsto. El
tratamiento estadístico se realiza por el coeficiente de correlación (r) y ensayos
de linealidad (Castro, 1989).
Precisión: La precisión es el grado de concordancia entre los valores de una serie repetida
de ensayos analíticos efectuados sobre una muestra homogénea. Expresa la
capacidad que tiene el método de dar resultados semejantes cuando se aplican
repetidamente en una muestra. La precisión mide el error aleatorio, o
indeterminado de un análisis. Los parámetros de calidad de la precisión son la
desviación estándar absoluta, desviación estándar relativa, coeficiente de
variación y varianza. En estas ecuaciones un valor razonable para la constante
es k=3. Estos se definen a continuación:
desviación estándar absoluta, s 1
)(1
2
−
−=
∑=
n
xxs
N
ii
desviación estándar relativa, RSD xsRSD =
desviación estándar de la media, sm n
ssm =
coeficiente de variación, CV %100×=xsCV
varianza, s2
Dentro de la precisión se incluyen: Repetibilidad: es la medida de la precisión de un método efectuado en las
mismas condiciones, sobre la misma muestra, por un mismo analista, en el
mismo laboratorio con los mismos equipos y reactivos efectuando estos análisis
en un corto intervalo de tiempo. (Castro, 1989)
28
El ensayo se efectúa sobre una serie de porciones de una muestra homogénea
que se analiza independientemente desde el principio hasta el fin bajo las
mismas condiciones. El número de repeticiones del análisis deberá ser superior
a 5 y la concentración del analito suele ser similar a la declarada. Para este tipo
de ensayos se realizan 6 determinaciones de la sustancia de interés al 100% del
nivel normal de procedimiento, se calcula la media aritmética (x), la desviación
estándar (s), el coeficiente de variación (cv), tomando como criterio que el
coeficiente de variación debe ser menor o igual al 3%. ( Castro, 1989)
Reproducibilidad: es la medida de la precisión de los resultados de un método
analítico efectuados sobre una misma muestra pero en condiciones diferentes.
Cuando la medida se realiza en laboratorios diferentes se habla de precisión
ínter laboratorios.
Para este tipo de estudio al igual que para la repetibilidad se recomienda hacer 6
determinaciones de la sustancia de interés al 100% del nivel normal del
procedimiento y calcular el coeficiente de variación siguiendo el criterio de que el
mismo sea igual o menor que el 5% para las técnicas o métodos analíticos.
Robustez: evalúa los efectos de pequeños cambios en las condiciones
operacionales del análisis sobre la fiabilidad del método analítico. Demuestra
experimentalmente el grado de afectación del proceso analítico por las
variaciones de factores que son sospechosos de alterar el método.
Exactitud: Es el grado de concordancia entre el valor hallado en el análisis con
el valor verdadero e indica la capacidad del método analítico para dar resultados
lo mas próximo posible al valor verdadero. Si la diferencia entre el valor hallado y
el verdadero es pequeña la exactitud es buena. Una diferencia grande significa
que la exactitud es inadecuada y revela la existencia de errores determinados
que deberían corregirse. Cuando se utiliza el método de patrón interno, que se
añade en las primeras fases de preparación de la muestra, la exactitud se ve
poco afectada, pues aunque se introduzcan perdidas a lo largo del análisis la
29
relación entre el analito y el patrón interno se mantiene constante. Al seleccionar
el estándar interno debe tenerse en cuenta no afectar la selectividad del método. Estadísticamente suele efectuarse un test de student para la determinar si el
valor medio hallado y el valor considerado verdadero no difieren
significativamente para un grado de probabilidad determinado.
Límite de detección y cuantificación: Estos parámetros se relacionan con la cantidad de analito requerida para dar un
resultado cualitativo o cuantitativo confiable. El límite de detección es la menor
concentración (cl), o cantidad de analito detectable confiable dado por un
procedimiento analítico. El límite de cuantificación es la menor concentración o
cantidad de analito en una muestra que puede ser determinada con aceptable
precisión y exactitud bajo condiciones experimentales establecidas. (Castro,
1989.; Agüero, 1997).
La determinación de estos límites se realiza cuando el nivel inferior del rango del
método analítico se acerca a los límites de detección o cuantificación como
sucede en el caso de impurezas y productos de degradación.
Selectividad y especificidad: Se define como la capacidad de un método analítico para medir exacta y
específicamente el analito, sin interferencia de impurezas, producto de
degradación, compuestos relacionados o excipientes que puedan estar
presentes en la matriz de la muestra. Otros autores diferencian ambos términos
y así consideran la selectividad como la capacidad de detectar un analito en una
muestra que puede ser determinada con aceptable precisión y exactitud bajo
condiciones experimentales establecidas.
La determinación de estos límites es laboriosa por lo que solo se realiza cuando
el nivel inferior del rango del método analítico se acerca a los límites de
detección o cuantificación.
30
Capítulo II: Parte Experimental 2.1 Reactivos y Equipamiento
Reactivos químicos: Etanol técnico clase A, cloroformo (p.a.), éter de petróleo, isobutilamina, furfural,
nitroetano y carbón activado.
Utensilios y medios de medición: Balanza analítica Sartorius.
Placas cromatográficas Merck de silicagel 60 sobre aluminio 6 x 2.5 cm.
Microjeringuilla Hamilton 88000 de 5μL.
Espectrofotómetro UV-VIS Marca Zuzi UV-4200.
Cubetas de cuarzo de 6 mm.
Papel negro
Pipeta graduada de 5 mL y 10 mL
Pipeta aforada de 5 mL
Matraces aforados de 10, 25, 50 y 100 mL.
2.2 Métodos empleados
Preparación del patrón de UC-244 Se realiza la síntesis del UC-244 a partir de furfural, nitroetano y utilizando como
catalizador la isobutilamina. Posteriormente se filtra el producto crudo que ha
sido cristalizado a baja temperatura. Luego se disuelve en etanol calentando y
se agrega carbón activado para eliminar impurezas, se filtra y se deja
recristalizar a bajas temperaturas. El proceso de recristalización se repite tres
veces. Se le determinó la temperatura de fusión, encontrándose esta entre los
47.6 y 49 oC, lo que se encuentra acorde a lo señalado en la literatura. La
pureza determinada por el Método de Kjeldahl es de 99.62 % (realizada en el
Centro Provincial de Higiene y Epidemiología de Villa Clara).
31
Método combinado de CCD – Espectrofotometría UV-VIS Este método se basa en la combinación de la capa delgada con las mediciones
espectrofotométricas. Se prepara una muestra y se corre en una placa
cromatográfica, con el objetivo de eliminar las posibles impurezas, luego se pasa
a la medición de la absorbancia en el espectrofotómetro a la longitud de onda de
máxima absorción determinando la concentración de UC-244 presente en la
muestra en una curva de calibración.
Selección de la longitud de onda de máxima absorción
Se registra el espectro de una disolución de UC-244 de concentración 10 mg/L
en la región UV-VIS y se selecciona λmáx.
Selección de la fase móvil para la cromatografía de capa delgada Se prepara una solución de UC-244 de aproximadamente 5 ppm, se aplica la
mancha en las placas y se corren estas. Las fases móviles probadas se señalan
a continuación. En todos los casos se tomó en cuenta la forma de la mancha al
correr y el Rf.
Fases móviles ensayadas:
Éter de petróleo.
Éter de petróleo–metanol (1:1).
Éter de petróleo–etanol (2:1).
Éter de petróleo–cloroformo (1:1).
Éter de petróleo–cloroformo (2:1).
Cloroformo–etanol (1:1).
Cloroformo–etanol (2:1).
2.3 Estudio cinético de la degradación del UC-244
Para determinar la cinética de degradación se procede como se describe a
continuación. Se pesan aproximadamente 0.01g de UC-244 patrón y se enrasa
32
con etanol en un matraz de 50 mL. De esta solución se toma una alícuota de 5
mL y se lleva a un matraz de 100 mL con el mismo solvente. Esta muestra se
dividió en dos porciones una de las cuales se cubre adecuadamente de la luz y
la otra se deja expuesta. Luego se realizan lecturas de absorbancia cada 5
minutos por un período de media hora, posteriormente se aumentan los
intervalos de lectura hasta completar un tiempo total de tres horas y media a
TPEA.
Se utiliza el Método Integral Gráfico para determinar el orden de reacción
mediante la dependencia del logaritmo natural de la absorbancia vs tiempo de
registro. También se obtiene la dependencia del porcentaje de degradación del
UC-244 en disolución vs tiempo.
2.4 Validación de la técnica analítica
2.4.1 Preparación de la curva de calibración
Se pesa en balanza analítica 0.5 g de UC-244, se disuelve en etanol y se enrasa
en un matraz de 25 mL. De esta disolución se toman alícuotas de 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10 mL y se enrasan en volumétricos de 10 mL. De estas soluciones se aplican 5
μL en la placa; luego de desarrollado el cromatograma se recorta y se eluye la
mancha de color amarillo perteneciente al UC-244 en 5 mL de etanol y se
procede a realizar la lectura de la absorbancia a 350 nm.
2.4.2 Determinación de la precisión
Repetibilidad: Se pesa 0.5 g de UC-244, se disuelve en etanol y se enrasa en un matraz de 25
mL. De este se toma una alícuota de 8 mL y se lleva a un matraz de 10 mL.
Luego se cromatografían 5 μL, se recorta la mancha, se eluye en 5 mL de etanol
y se procede a realizar la lectura de la absorbancia a 350 nm.
Se realizan réplicas de este ensayo.
33
Reproducibilidad: Se realiza el mismo procedimiento anterior en días diferentes por dos analistas
también diferentes pero manteniendo las mismas condiciones.
Se realizan réplicas de este ensayo con cada analista y en cada día.
2.4.3 Exactitud
La exactitud del método fue comprobada evaluando el porcentaje de recobro en
muestras de UC-244 sobre tres puntos de la curva, cuya pureza fue determinada
por el Método de Kjeldahl, es de 99.62 %. Se le calcula el coeficiente de
variación y se aplica el test t de student como criterio para su aceptación.
2.4.4 Límite de detección
Se realiza un estudio de la concentración mínima con la que resulta detectable la
mancha correspondiente al UC-244 en el cromatograma. Para ello se puntean
alícuotas de 5 μL de disoluciones de concentraciones entre 0,2 y 1 mg/L, a fin de
apreciar visualmente la coloración mínima detectable para proceder a la elución
completa de la mancha.
2.4.5 Límite de cuantificación
Se realiza el mismo procedimiento que para la curva de calibración tomando
alícuotas desde 1 hasta 6 mL. Luego de determinar las concentraciones, por
interpolación en la curva de calibración, se determinan los coeficientes de
variación para la serie de réplicas obtenida. Se calcula el porcentaje de
recobrado y se selecciona la mínima concentración en la cual se cumplen los
criterios de aceptación establecidos para la precisión y para la exactitud del
método (Castro, 1989). Este valor se adoptará como límite de cuantificación del
método analítico.
2.4.6 Especificidad
Para determinar si la longitud de onda seleccionada puede considerarse
específica en las condiciones de la técnica, se registran los espectros UV-VIS de
UC-244 purificado y crudo que han sido sometidos a la separación
34
cromatográfica en capa delgada, así como sin separación previa. Además se
obtienen los registros de las posibles impurezas tales como furfural, nitroetano,
isobutilamina, cloroformo, éter de petróleo y de una mancha de composición
desconocida, utilizando como solvente etanol.
2.5 Influencia de diferentes factores en el proceso de síntesis
Se aplica un diseño factorial fraccionado 26-3 que consta de 8 experimentos para
seleccionar las mejores condiciones de síntesis del principio activo. Las 6
variables seleccionadas, así como los niveles estudiados se muestran en la tabla
1. La matriz del diseño se presenta en la tabla 2. Las funciones respuestas
seleccionadas para evaluar este diseño son: el rendimiento analítico de la
síntesis y la pureza de los crudos del UC-244. El diseño ha sido ajustado para la
obtención de 0.5 moles del producto.
Tabla 1: Factores y niveles del diseño fraccionado 26-3 aplicado al proceso de
síntesis del UC-244.
Variables Significado Nivel inferior
Nivel superior
Nivel medio Incremento
X1 Nitroetano (mL) 42.8 53.52 48.16 5.36 X2 Isobutilamina (mL) 0.8 1.5 1.15 0.35 X3 etanol (mL) 0 20 10 10 X4 Tiempo contacto (min.) 1 1.5 1.25 0.25 X5 Temperatura (0C) 120 130 125 5 X6 Tiempo reacción (h) 4 4.5 4.25 0.25
Contrastes: X4= X1 X2 X5=X1X2X3 X6=X1X3
35
Tabla 2: Matriz del diseño 26-3 aplicado a la síntesis.
X1 X2 X3 X4 X5 X6
Exp. NE IBA ETOH t. cont Temp t. reacc.
1 -1 -1 -1 +1 -1 +1
2 +1 -1 -1 -1 +1 -1
3 -1 +1 -1 -1 +1 +1
4 +1 +1 -1 +1 -1 -1
5 -1 -1 +1 +1 +1 -1
6 +1 -1 +1 -1 -1 +1
7 -1 +1 +1 -1 -1 -1
8 +1 +1 +1 +1 +1 +1
Leyenda:
NE- nitroetano, IBA- isobutilamina, ETOH- etanol, t cont.-tiempo de contacto, Temp.-
temperatura, t .reacc.-tiempo de reacción
Para evaluar el diseño se realizaron réplicas de cada experimento, así como del
nivel medio.
La técnica de espectrofotometría UV-VIS con cromatografía de capa delgada
desarrollada se aplicó en la cuantificación de la pureza de crudos procedentes
del diseño experimental, lo que permitió evaluar sus resultados y obtener la
ecuación estimada para la función respuesta, así como encontrar las mejores
condiciones de la síntesis.
2.6 Influencia de diferentes factores en el proceso de purificación
Se desarrolla un diseño factorial fraccionado 25-2 que consta de 8 experimentos
para seleccionar las mejores condiciones de la purificación del principio activo.
La matriz del diseño, así como las variables estudiadas y sus niveles se
muestran en las tablas 3 y 4. Las funciones respuestas seleccionadas para
evaluar este diseño son: el rendimiento analítico de la purificación y la pureza del
UC-244 purificado.
36
La materia prima empleada para la realización de estos experimentos fue
obtenida mediante una réplica efectuada a una escala superior (2 moles).
Tabla 3: Factores y niveles del diseño fraccionado 25-2 aplicado al proceso de
purificación del UC-244.
Variables Significado Nivel inferior
Nivel superior
Nivel medio
X1 carbón activado (g) 2.0 3.5 2.75 X2 ETOH (mL) 30 50 40 X3 Temperatura (oC) 60 70 65 X4 tiempo de contacto (min.) 15 20 17.5 X5 veloc. de agitación (rpm) 150 300 225
Contrastes: X4= X1 X2 X5=X1X2X3
Tabla 4: Matriz del diseño 25-2 aplicado a la purificación.
X1 X2 X3 X4 X5
Exp. c.activ. ETOH Temp. t.cont. v.agit.
1 -1 -1 -1 +1 -1
2 +1 -1 -1 -1 +1
3 -1 +1 -1 -1 +1
4 +1 +1 -1 +1 -1
5 -1 -1 +1 +1 +1
6 +1 -1 +1 -1 -1
7 -1 +1 +1 -1 -1
8 +1 +1 +1 +1 +1
Leyenda:
c.actv.-carbón activado, ETOH- etanol, t.cont.-tiempo de contacto, Temp.-temperatura,
v.agit.-velocidad de agitación
Para evaluar el diseño se realizaron réplicas de cada experimento.
La técnica de espectrofotometría UV-VIS con cromatografía de capa delgada
desarrollada se aplicó en la cuantificación de la pureza de los puros procedentes
del diseño experimental.
37
Capítulo III: Análisis y discusión de los resultados. 3.1 Selección de la longitud de onda de máxima absorción
A continuación se muestra el espectro realizado para el UC-244 con el objetivo
de encontrar la longitud de onda de máxima absorción, siendo esta de 350 nm.
Espectro UC-244
0
0.2
0.4
0.6
200 300 400 500λ (nm)
Abs
Figura 1 Espectro de UC-244.
Mientras que las materias primas que dan origen a este principio activo, furfural,
Isobutilamina y nitroetano tienen su longitud de máxima absorción en 270, 440
y 210 nm, respectivamente. (Anexo 3).
Lo que permite iniciar el desarrollo de la técnica y la determinación de algunos
parámetros de validación.
3.2 Selección de la fase móvil para la cromatografía de capa delgada
Se realiza la corrida de la placa en todos los solventes propuestos, lo que se
muestra en la siguiente tabla, la cual refieren la forma de la mancha y su Rf. El
desarrollo de los cromatogramas se muestra en el Anexo 2.
38
Tabla 5: Resultados de la separación de UC-244 purificado en CCD.
Solventes para la fase móvil Rf Resultado
Éter de petróleo. 0 No corre la mancha.
Éter de petróleo –metanol (1:1). ___ Los solventes no son miscibles.
Éter de petróleo – etanol (2:1). ___ No es buena la separación, presencia de cola
Éter de petróleo –cloroformo (1:1). 0.71 Resolución aceptable
Éter de petróleo –cloroformo (2:1). 0.50 La resolución mejora
Cloroformo- etanol (1:1). 1 Corre con el frente del solvente
Cloroformo- etanol (2:1). 1 Corre con el frente del solvente
La fase móvil Éter de petróleo–cloroformo (2:1) es la que mejores resultados
proporciona, por lo que es la seleccionada para el desarrollo de los
cromatogramas.
3.3 Estudio cinético de la degradación del UC-244
En este estudio cinético se utiliza el Método Integral Gráfico para determinar el orden
de reacción. En la figura 2 se muestra la dependencia del porcentaje de degradación
del UC-244 en función del tiempo, en condiciones de exposición a la luz y en
ausencia de esta, con disoluciones de concentración 10 mg/L en etanol.
39
Cinética de degradación
020406080
100
0 100 200 300 400 t (min)
% degradación
Protegido de la luzExpuesto a la luz
Figura 2. Degradación del UC-244 en función de tiempo
Se observa que a los 60 minutos (tiempo aproximado que dura el desarrollo de
la técnica analítica para la determinación del producto), se ha degradado
aproximadamente el 32 % del UC-244 en presencia de la luz. El proceso
degradativo en el intervalo de tiempo estudiado resulta ser significativo; por lo
que se recomienda la protección de las muestras durante el desarrollo de la
técnica analítica.
Sin embargo la degradación en la oscuridad es prácticamente nula. Por esto se
ajustaron las condiciones experimentales de tal manera que la luz incidente
sobre el UC-244 desde la toma de la muestra hasta su determinación final fuera
mínima. Cubriendo con papel negro todos los recipientes de cristal tales como
los matraces, la cámara cromatográfica o utilizando recipientes ámbar, por tanto
se hace un estudio del porcentaje de degradación en las condiciones de trabajo
resultando que no es significativo, o sea que está en el orden de los errores
experimentales, lo cual se demuestra por el valor del coeficiente de variación
obtenido, igual a 0.76 %, valor que cumple con el criterio de aceptación
estadístico.
La figura 3 muestra que la degradación del UC-244 cumple con una ley de
velocidad de primer orden con constante de velocidad de 5.10-3 min-1 a TPEA.
40
Orden de reacción.y = -0.005x + 0.0145
R2 = 0.9919
-2-1.5
-1-0.5
00.5
0 100 200 300 400
t (min)
ln Abs
Protegido de la luzExpuesto a la luz
Figura 3. Dependencia del ln absorbancia en función del tiempo.
3.4 Validación de la técnica
3.4.1 Linealidad
En la figura 4 se muestra la curva de calibración obtenida con un patrón de UC-244.
Curva de calibración
conc (ppm)
Abs
4 6 8 10 120.39
0.59
0.79
0.99
1.19
Figura 4. Curva de calibración de UC-244
Ecuación de la curva de calibración: Abs = -0.0813882 + 0.119031*Conc
Coeficiente de correlación: 0.9960.
41
En la tabla 6 se muestran los valores de absorbancia para cada concentración y
los factores respuesta (y/x).
Tabla 6. Resultados del estudio de linealidad en la determinación de UC-244.
conc Abs1 Abs2 Abs3 Abs4 f1 f2 f3 f4
4 0.399 0.404 0.403 0.428 0.09967 0.10096 0.10075 0.106979
5 0.509 0.499 0.499 0.552 0.101719 0.09976 0.0998 0.110378
6 0.596 0.623 0.607 0.634 0.099254 0.103792 0.101167 0.105646
7 0.72 0.732 0.765 0.771 0.102775 0.10453 0.109286 0.110121
8 0.865 0.858 0.889 0.108039 0.10725 0.111103
9 0.971 0.966 1.023 1.012 0.107803 0.10729 0.113667 0.112422
10 1.106 1.119 1.129 0.110512 0.111855 0.1129
Se determina el coeficiente de variación de los factores respuestas siendo este 4,47
%, el cual es menor que el 5%, que es el criterio de aceptación para este parámetro;
por lo que la técnica es lineal.
Tesis de linealidad de la pendiente:
texp > ttabulada (α = 0.05 y n = 24)
56.1329>> 2.064 (Se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alternativa
m≠0).
Límites de confianza: 0.1190 ± 0.0044
Este valor indica que la probabilidad de ser m ≠0 es elevada, superior al 99.9%. Tesis de Proporcionalidad del intercepto:
texp < ttabulada (α = 0.05 y n = 24)
-5.3847< 2.064 (Se acepta la hipótesis nula b=0). Límites de confianza:
-0.0814 ± 0.0312
El intervalo de confianza incluye al cero por tanto se cumple la condición de
proporcionalidad.
42
3.4.2 Precisión
En la tabla 7 se muestran los resultados de repetibilidad realizados con un
patrón de UC-244.
Tabla 7. Resultados de repetibilidad
Masas (g) réplicas Abs Conc (ppm) % UC-244 1 0.821 7.58 94.67 2 0.794 7.35 91.84
0.5005
3 0.815 7.53 94.04 1 0.792 7.34 91.65 2 0.810 7.49 93.53
0.5004
3 0.814 7.52 93.95 C.V.= 1.34 % para la repetibilidad
En la tabla 8 se muestran los resultados de reproducibilidad realizados con un
patrón de UC-244.
Tabla 8: Resultados de reproducibilidad
Analistas réplicas Día 1 Abs
Conc. (ppm)
%UC-244 Día 2 Abs
Conc. (ppm)
%UC-244
1 0.818 7.56 94.39 0.811 7.50 93.70 2 0.852 7.84 97.96 0.776 7.20 90.02 3 0.824 7.61 95.02 0.809 7.48 93.49 4 0.832 7.67 95.86 0.751 6.99 87.40 5 0.858 7.89 98.59 0.819 7.56 94.54
1
6 0.862 7.93 99.01 0.805 7.45 93.07 1 0.825 7.61 95.15 0.804 7.44 92.98 2 0.845 7.78 97.25 0.799 7.40 92.45 3 0.844 7.77 97.14 0.809 7.48 93.50 4 0.842 7.76 96.93 0.848 7.81 97.60 5 0.854 7.86 98.19 0.799 7.40 92.45
2
6 0.827 7.63 95.36 0.781 7.25 90.56 CV= 3.10 % para la reproducibilidad. Se obtienen coeficientes de variación para repetibilidad y reproducibilidad
menores que el 3% y el 5 % respectivamente que son los criterios de
aceptación, por tanto el método es preciso.
43
3.4.3 Exactitud
Los resultados de la evaluación de la exactitud a diferentes niveles entre 4 y 10
ppm de UC-244 se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 9 Resultados del estudio de la exactitud.
Concentración Teórica
5 ppm 7 ppm 10 ppm
99.12 96.10 99.67 97.48 97.58 100.81
% de Recobro
97.52 101.58 101.69 %de Recobro
Medio 98.04 98.42 100.72 Coef. Variación 0.95 2.88 1.01
T de student exp. 3.57 0.95 1.24 T de student tab. 4.303
Como se observa los valores de la texp < ttab. en los niveles de concentración
ensayados. Asimismo los valores de los porcentajes de recobro cumplen los
criterios de aceptación (97-103 %).
3.4.4 Límites de detección y de cuantificación
En el caso de esta técnica combinada de cromatografía de capa delgada con
espectrofotometría UV-VIS, la mancha en la placa se puede observar hasta una
concentración de 0.4 ppm aproximadamente, por debajo de la cual ya no se
aprecia la coloración amarilla del UC-244, y por lo tanto resulta muy imprecisa su
elución de la placa; este valor de concentración se considera como la
concentración mínima detectable (Límite de detección). (Anexo 1).
El límite de cuantificación del principio activo para la técnica combinada se
encuentra en 4 ppm, valor por debajo del cual no cumple simultáneamente, con
los criterios de aceptación de la precisión (< 5%) y de la exactitud (97-103 %), lo
que se muestra en las siguientes tablas.
44
Tabla 10: Precisión de la técnica en las cercanías del límite de cuantificación.
Tabla 11: Porcentaje de recobro en las cercanías del límite de cuantificación.
Réplicas 1ppm 2ppm 3ppm 4ppm 5ppm 6ppm
1 1.397856 2.011142 3.044486 4.035824 4.959953 5.690855
2 1.322245 2.044746 3.120096 4.07783 4.875942 5.917687
3 1.490269 2.254776 2.674834 4.069429 4.875942 5.783268
CV (%) 5.99601 6.27677 8.086422 0.547334 0.989084 1.967512
Réplicas 1ppm 2ppm 3ppm 4ppm 5ppm 6ppm
1 139.67 100.48 101.40 100.81 99.12 94.77
2 132.17 102.20 103.96 101.90 97.48 98.59
3 149.03 112.74 89.16 101.74 97.52 96.39
%Rec. medio 140.29 105.14 98.17 101.49 98.04 96.58
3.4.5 Especificidad
El método espectrofotométrico por sí sólo no es específico para la determinación
de UC-244; esto se demuestra por la diferencia de las intensidades de absorción
a la λmáx. entre los espectros obtenidos, cuando se combina con CCD y cuando
se mide directo sin la previa separación en la placa (Figura 5).
espectros de UC-244
00.20.40.60.8
200 250 300 350 400 450 500
λ (nm)
AbsUC-244cromatografiado
UC-244 sincromatografiar
Figura 5. Espectros UV.VIS del UC-244
45
También se pueden observar en la figura 6 la absorción de las posibles
impurezas presentes, en la zona de trabajo, alrededor de 350 nm. Obsérvese
específicamente la pequeña absorción debida a la impureza X, la que ha sido
eluida del cromatograma de separación de un crudo de UC-244 y que se
mantiene alrededor de la línea de aplicación en el cromatograma, la que se
amplía para su mejor observación en la figura 7
Espectros
00.20.40.60.8
11.2
200 250 300 350 400 450 500λ (nm)
Absfurfuralisobutilaminaéter de petroleonitroetanoimpureza Xpuro crompuro sin cromcrudo cromcrudo sin crom
Figura 6: Espectro de impurezas.
Ampliación de espectros
00.020.040.06
300 350 400λ (nm)
Absfurfuralisobutilaminanitroetanoimpurezas x
Figura 7: Ampliación de los espectros de las impurezas en el rango de 300-
400 nm.
46
De aquí se infiere que resulta necesaria una separación previa, utilizando la
Cromatografía de Capa Delgada. El espectro de la mancha eluida en etanol presenta
un máximo de absorción bien definido en 350 nm correspondiente al compuesto, con
lo que queda demostrado la especificidad de la señal del UC-244 después de
efectuada la separación por CCD. (Ver Anexo 4).
3.5 Diseño de experimentos
3.5.1 Influencia de diferentes factores en el proceso de síntesis
Los resultados obtenidos al evaluar las funciones respuestas % de rendimiento
de síntesis y % de pureza de los crudos obtenidos al aplicar la matriz del diseño
26-3 se presentan a continuación.
Tabla 12: Resultados obtenidos al aplicar el diseño factorial fraccionado 26-3 en la síntesis del principio activo.
Exp. Masa
promedio
(g)
% Rendimiento
promedio/teóri
ca
% Pureza
promedio.
Masa
analítica
(g)
% Rend.
analítico
1 38.60 50.47 94.70 36.56 47.80 2 29.22 38.19 92.91 27.15 35.48 3 60.63 79.26 91.84 55.69 72.79 4 49.02 64.08 90.79 44.51 58.16 5 0 0 0 0 0 6 3.42 4.47 88.74 3.04 3.97 7 40.70 53.20 88.53 36.03 47.10 8 42.83 55.98 82.39 35.29 46.13 Nota: masa teórica = 76.5 g
Los resultados estadísticos aparecen en el Anexo 5. De la tabla de análisis de
varianza del % de rendimiento crudo respecto a las variables estudiadas se
deduce que ninguno de sus coeficientes son significativos ya que p>0.05 para
todas ellas.
47
Los valores de las variables correspondientes el experimento con mejores
resultados son los siguientes:
Variable signo Valores Nitroetano (mL) - 42.8
Isobutilamina (mL) + 1.5 etanol (mL) - 0
Tiempo contacto (min.) - 1.0 Temperatura (0C) - + 120 ó 130
Tiempo reacción (h) + 4.5 En el caso de la temperatura pudiera estar en el nivel inferior porque no existen
diferencias significativas entre ambos niveles. Además puede ser simplificado el
modelo al eliminar la temperatura por tener una p-value de 0.9846.
Para el rendimiento de los crudos se obtiene la ecuación de regresión siguiente:
Rend = 43.2063 - 14.7937*ETOH + 19.9238*IBA - 2.52625*NE - 0.57375*t. Cont + 4.33875*t. Reacc + 0.15125*Temp
C.C. = 0.9425
Los resultados estadísticos al evaluar la función respuesta % de pureza
aparecen en el Anexo 5. De la tabla de análisis de varianza del % de pureza
respecto a las variables estudiadas se deduce que ninguno de sus coeficientes
son significativos ya que p>0.05 para todas ellas.
Los valores de las variables correspondientes al experimento con mejores
resultados son los siguientes:
Variable signo valores Nitroetano (mL) + 53.52
Isobutilamina (mL) + 1.5 etanol (mL) - 0
Tiempo contacto (min.) - 1 Temperatura (0C) - 120
Tiempo reacción (h) + 4.5 Para la pureza del crudo se obtiene la ecuación de regresión siguiente:
% Pureza = 78.7375 - 13.8225*ETOH + 9.65*IBA + 9.97*NE - 11.7675*t. Cont + 10.68*t. Reacc - 11.9525*Temp
C.C. = 0.8678
48
Al realizar la síntesis en las mejores condiciones seleccionadas de acuerdo a la
función respuesta % de Rendimiento, se obtienen los siguientes resultados.
Tabla 13: Síntesis realizadas en las mejores condiciones del diseño.
Réplica Masa (g) % de rend. % de pureza
1 61.30 80.13 89.56
2 60.63 79.26 91.24
Promedio 60.97 79.70 90.40
Como se aprecia, los rendimientos están alrededor del 80 % y una pureza de 90
%, valores que resultan aceptables en esta etapa de estudio.
Al continuar las investigaciones se decide escalar a 2 moles la síntesis con el
objetivo de garantizar la cantidad de materia prima necesaria para desarrollar el
estudio de la purificación.
Tabla 14: Resultados del escalado.
Masa (g) % de rend. % de pureza
179 58.50 85.93
3.5.2 Influencia de diferentes factores en el proceso de purificación
Los resultados obtenidos al evaluar las funciones respuestas % de rendimiento
de purificación y % de pureza de los puros obtenidos al aplicar la matriz del
diseño 25-2 , se presentan a continuación.
49
Tabla 15: Resultados obtenidos al aplicar el diseño factorial fraccionado 25-2 en la purificación del principio activo.
Los resultados estadísticos aparecen en el Anexo 6. De la tabla de análisis de
varianza del % de rendimiento del puro respecto a las variables estudiadas se
deduce que ninguno de sus coeficientes son significativos ya que p>0.05 para
todas ellas.
Exp. Masa de
crudo
Masa de puro
% Rendimiento
purif./masa crudo
Pureza.
1 10.0014 7.8521 78.50 93.38
2 10.0004 5.7338 57.34 86.88
3 10.0046 7.7766 77.73 88.19
4 10.0011 7.4179 74.17 91.45
5 10.0003 6.8632 68.63 88.08
6 10.0016 6.8763 68.75 87.75
7 10.0012 6.7420 67.41 89.62
8 10.0045 7.1524 71.49 90.52
Los valores de las variables correspondientes el experimento con mejores
resultados son los siguientes.
Variable signo valores carbón activado (g) - 2
ETOH (mL) + 50 Temperatura (oC) - 60
tiempo de contacto (min.) + 20 veloc. de agitación (rpm) - 150
Para el rendimiento del puro se obtiene la ecuación de regresión siguiente:
% Rend. Purif. = 70.7525 - 1.4575*agit. + 1.9475*EtOH - 2.3175*m C.act + 2.4475*t. cont. - 1.6825*Temp.
C.C.= 0.5931
Los resultados estadísticos al evaluar la función respuesta % de pureza
aparecen en el Anexo 6. De la tabla de análisis de varianza del % de pureza
50
respecto a las variables estudiadas se deduce que ninguno de sus coeficientes
son significativos ya que p>0.05 para todas ellas.
Los valores de las variables correspondientes el experimento con mejores
resultados son los siguientes.
Variable signo valorescarbón activado (g) - 2
ETOH (mL) + 50 Temperatura (oC) - 60
tiempo de contacto (min.) + 20 veloc. de agitación (rpm) - 150
Para la pureza del puro se obtiene la ecuación de regresión siguiente: % Pureza = 89.4838 - 1.06625*agit. + 0.46125*EtOH - 0.33375*m C.act + 1.37375*t. cont. - 0.49125*Temp.
C.C = 0.8554
Dada la pureza elevada con que entra el crudo al proceso de purificación, no
resulta satisfactoria la obtenida después del mismo (debe ser superior a 99 %),
tomando en cuenta los resultados de los experimentos del diseño, aunque es de
señalar que en todos ellos mejora la pureza del principio activo.
Teniendo en cuenta la eficiencia experimental del proceso de síntesis (79.70%) y
del proceso de purificación (70.75%), se encuentra que la eficiencia total del
proceso es de 56.52%.
51
52
Conclusiones
1-La técnica de Espectrofotometría UV-VIS combinada con una separación
previa de Cromatografía de capa delgada, empleando como fase móvil Éter
de petróleo – cloroformo (2:1), resultó ser lineal, exacta y específica. Su
límite de cuantificación se encuentra en 4 ppm y su límite de detección en 0.4
ppm.
2-Los estudios cinéticos evidencian que el proceso degradativo que ocurre
en presencia de luz se rige por una ley cinética de primer orden, con una
constante de velocidad de 5.10-3 min.-1 a una temperatura de 25 oC. Por ello
deben protegerse las disoluciones de UC-244 durante la realización de los
procedimientos de análisis.
3-La técnica combinada CCD-UV es un método analítico idóneo para el
control del proceso de producción del UC-244 y de su pureza, no aplicado
hasta el momento para estos fines.
4-Se desarrolla un procedimiento de obtención del UC-244 a escala de
laboratorio, alcanzándose purezas superiores al 90 %, donde se logra el 80
% de rendimiento de UC-244 en síntesis (base crudo), un 71 % en el
rendimiento de la purificación y un 57 % de rendimiento total del proceso, no
alcanzados hasta este momento.
53
Recomendaciones
1. Continuar los estudios de los factores y niveles que intervienen en el
proceso de purificación con el objetivo de elevar la pureza del UC-244.
2. Realizar la determinación analítica teniendo en cuenta los resultados
del estudio cinético y del proceso de degradación del UC-244.
3. Realizar estudios de posibles impurezas indeterminadas, que pudieran
aparecer producto de reacciones colaterales en la síntesis.
4. Realizar estudios sobre la influencia de otros factores sobre la cinética
del proceso degradativo.
54
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58
Anexos Anexo 1: Cromatograma desarrollado para la selección del límite de detección.
Nota : Concentración en ppm.
59
Anexo 2: Cromatogramas para la selección de la fase móvil.
60
Anexo 3: Espectro de las materias primas de síntesis.
espectro del furfural
00.5
11.5
200 250 300 350 400
λ (nm)
Abs
Espectro del nitroetano.
00.05
0.10.15
0.20.25
200 300 400
λ (nm)
Abs
Espectro de Isobitilamina.
00.00050.001
0.00150.002
0.0025
0 200 400 600
λ (nm)
Abs
61
Anexo 4: Cromatograma desarrollado.
62
Anexo 5: Análisis diseño de síntesis. Multiple Regression Analysis ----------------------------------------------------------------------------- Dependent variable: Rend ----------------------------------------------------------------------------- Standard T Parameter Estimate Error Statistic P-Value ----------------------------------------------------------------------------- CONSTANT 43.2063 6.25375 6.90885 0.0915 ETOH -14.7937 6.25375 -2.36558 0.2546 IBA 19.9238 6.25375 3.18589 0.1936 NE -2.52625 6.25375 -0.403958 0.7556 t. Cont -0.57375 6.25375 -0.091745 0.9418 t. Reacc 4.33875 6.25375 0.693784 0.6139 Temp 0.15125 6.25375 0.0241855 0.9846 ----------------------------------------------------------------------------- Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Model 5130.96 6 855.159 2.73 0.4264 Residual 312.875 1 312.875 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 5443.83 7 R-squared = 94.2527 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 59.7687 percent Standard Error of Est. = 17.6883 Mean absolute error = 6.25375 Durbin-Watson statistic = 1.0 The StatAdvisor --------------- The output shows the results of fitting a multiple linear regression model to describe the relationship between Rend and 6 independent variables. The equation of the fitted model is Rend = 43.2063 - 14.7937*ETOH + 19.9238*IBA - 2.52625*NE - 0.57375*t. Cont + 4.33875*t. Reacc + 0.15125*Temp Since the P-value in the ANOVA table is greater or equal to 0.10, there is not a statistically significant relationship between the
63
variables at the 90% or higher confidence level. The R-Squared statistic indicates that the model as fitted explains 94.2527% of the variability in Rend. The adjusted R-squared statistic, which is more suitable for comparing models with different numbers of independent variables, is 59.7687%. The standard error of the estimate shows the standard deviation of the residuals to be 17.6883. This value can be used to construct prediction limits for new observations by selecting the Reports option from the text menu. The mean absolute error (MAE) of 6.25375 is the average value of the residuals. The Durbin-Watson (DW) statistic tests the residuals to determine if there is any significant correlation based on the order in which they occur in your data file. Since the DW value is less than 1.4, there may be some indication of serial correlation. Plot the residuals versus row order to see if there is any pattern which can be seen. In determining whether the model can be simplified, notice that the highest P-value on the independent variables is 0.9846, belonging to Temp. Since the P-value is greater or equal to 0.10, that term is not statistically significant at the 90% or higher confidence level. Consequently, you should consider removing Temp from the model. Gráficos de LSD:
Gráfico de LSD Volumen de Etanol.
ETOH
Rend
-1 1-60
-20
20
60
100
140
64
Gráfico de LSD Temperatura.
Temp
Rend
-1 1-40
-10
20
50
80
110
140
Gráfico de LSD Volumen de Isobutilamina.
IBA
Rend
-1 1-60
-20
20
60
100
140
180
Gráfico de LSD Volumen de Nitroetano.
NE
Rend
-1 1-40
-10
20
50
80
110
140
65
Gráfico de LSD tiempo de contacto.
t. Cont
Rend
-1 1-40
-10
20
50
80
110
140
Gráfico de LSD tiempo de reacción.
t. Reacc
Rend
-1 1-50
-20
10
40
70
100
130
Multiple Regression Analysis ----------------------------------------------------------------------------- Dependent variable: pureza ----------------------------------------------------------------------------- Standard T Parameter Estimate Error Statistic P-Value ----------------------------------------------------------------------------- CONSTANT 78.7375 10.895 7.22694 0.0875 ETOH -13.8225 10.895 -1.2687 0.4249 IBA 9.65 10.895 0.885727 0.5385 NE 9.97 10.895 0.915099 0.5282 t. Cont -11.7675 10.895 -1.08008 0.4755 t. Reacc 10.68 10.895 0.980266 0.5063 Temp -11.9525 10.895 -1.09706 0.4706
66
----------------------------------------------------------------------------- Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Model 6231.87 6 1038.64 1.09 0.6143 Residual 949.608 1 949.608 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 7181.48 7 R-squared = 86.777 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 7.43886 percent Standard Error of Est. = 30.8157 Mean absolute error = 10.895 Durbin-Watson statistic = 1.0 The StatAdvisor --------------- The output shows the results of fitting a multiple linear regression model to describe the relationship between pureza and 6 independent variables. The equation of the fitted model is pureza = 78.7375 - 13.8225*ETOH + 9.65*IBA + 9.97*NE - 11.7675*t. Cont + 10.68*t. Reacc - 11.9525*Temp Since the P-value in the ANOVA table is greater or equal to 0.10, there is not a statistically significant relationship between the variables at the 90% or higher confidence level. The R-Squared statistic indicates that the model as fitted explains 86.777% of the variability in pureza. The adjusted R-squared statistic, which is more suitable for comparing models with different numbers of independent variables, is 7.43886%. The standard error of the estimate shows the standard deviation of the residuals to be 30.8157. This value can be used to construct prediction limits for new observations by selecting the Reports option from the text menu. The mean absolute error (MAE) of 10.895 is the average value of the residuals. The Durbin-Watson (DW) statistic tests the residuals to determine if there is any significant correlation based on the order in which they occur in your data file. Since the DW value is less than 1.4, there may be some indication of serial correlation. Plot the residuals versus row order to see if there is any pattern which can be seen.
67
In determining whether the model can be simplified, notice that the highest P-value on the independent variables is 0.5385, belonging to IBA. Since the P-value is greater or equal to 0.10, that term is not statistically significant at the 90% or higher confidence level. Consequently, you should consider removing IBA from the model.
Gráfico de LSD Temperatura.
Temp
pureza
-1 1-80
20
120
220
320
Gráfico de LSD Volumen de Etanol.
ETOH
pureza
-1 1-80
20
120
220
320
68
Gráfico de LSD Volumen de Isobutilamina.
IBA
pureza
-1 1-70
-20
30
80
130
180
230
Gráfico de LSD Volumen de Nitroetano.
NE
pureza
-1 1-70
-20
30
80
130
180
230
Gráfico de LSD tiempo de contacto.
t. Cont
pureza
-1 1-80
20
120
220
320
69
Gráfico de LSD tiempo de reacción.
t. Reacc
pureza
-1 1-80
20
120
220
320
70
Anexo 6: Análisis del diseño de purificación. Multiple Regression Analysis ----------------------------------------------------------------------------- Dependent variable: Rend. ----------------------------------------------------------------------------- Standard T Parameter Estimate Error Statistic P-Value ----------------------------------------------------------------------------- CONSTANT 70.7525 2.62651 26.9378 0.0014 agit. -1.4575 2.62651 -0.554919 0.6347 EtOH 1.9475 2.62651 0.741478 0.5356 m C.act -2.3175 2.62651 -0.882349 0.4707 t. cont. 2.4475 2.62651 0.931845 0.4498 Temp. -1.6825 2.62651 -0.640584 0.5874 ----------------------------------------------------------------------------- Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Model 160.871 5 32.1743 0.58 0.7291 Residual 110.377 2 55.1885 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 271.248 7 R-squared = 59.3078 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 0.0 percent Standard Error of Est. = 7.42889 Mean absolute error = 3.3675 Durbin-Watson statistic = 3.409 The StatAdvisor --------------- The output shows the results of fitting a multiple linear regression model to describe the relationship between Rend. and 5 independent variables. The equation of the fitted model is Rend. = 70.7525 - 1.4575*agit. + 1.9475*EtOH - 2.3175*m C.act + 2.4475*t. cont. - 1.6825*Temp. Since the P-value in the ANOVA table is greater or equal to 0.10,
71
there is not a statistically significant relationship between the variables at the 90% or higher confidence level. The R-Squared statistic indicates that the model as fitted explains 59.3078% of the variability in Rend.. The adjusted R-squared statistic, which is more suitable for comparing models with different numbers of independent variables, is 0.0%. The standard error of the estimate shows the standard deviation of the residuals to be 7.42889. This value can be used to construct prediction limits for new observations by selecting the Reports option from the text menu. The mean absolute error (MAE) of 3.3675 is the average value of the residuals. The Durbin-Watson (DW) statistic tests the residuals to determine if there is any significant correlation based on the order in which they occur in your data file. Since the DW value is greater than 1.4, there is probably not any serious autocorrelation in the residuals. In determining whether the model can be simplified, notice that the highest P-value on the independent variables is 0.6347, belonging to agit.. Since the P-value is greater or equal to 0.10, that term is not statistically significant at the 90% or higher confidence level. Consequently, you should consider removing agit. from the model. Gráficos de LSD
Gráfico de LSD Masa de Carbón ActivadoRend.
m C.act-1 157
62
67
72
77
82
87
72
Gráfico de LSD Velocidad de agitaciónRend.
agit.-1 157
62
67
72
77
82
87
Gráfico de LSD TemperaturaRend.
Temp.-1 157
62
67
72
77
82
87
73
Gráfico de LSD Tiempo de contactoRend.
t. cont.-1 157
62
67
72
77
82
87
Gráfico de LSD Volumen de EtanolRend.
EtOH-1 157
62
67
72
77
82
87
Multiple Regression Analysis ----------------------------------------------------------------------------- Dependent variable: pureza ----------------------------------------------------------------------------- Standard T Parameter Estimate Error Statistic P-Value ----------------------------------------------------------------------------- CONSTANT 89.4838 0.550717 162.486 0.0000 agit. -1.06625 0.550717 -1.93611 0.1925 EtOH 0.46125 0.550717 0.837545 0.4904 m C.act -0.33375 0.550717 -0.606028 0.6061 t. cont. 1.37375 0.550717 2.49448 0.1301 Temp. -0.49125 0.550717 -0.892019 0.4665 ----------------------------------------------------------------------------- Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Model 28.7164 5 5.74327 2.37 0.3232 Residual 4.85263 2 2.42631 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 33.569 7 R-squared = 85.5443 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 49.4051 percent Standard Error of Est. = 1.55766 Mean absolute error = 0.61625
74
Durbin-Watson statistic = 0.78016 The StatAdvisor --------------- The output shows the results of fitting a multiple linear regression model to describe the relationship between pureza and 5 independent variables. The equation of the fitted model is pureza = 89.4838 - 1.06625*agit. + 0.46125*EtOH - 0.33375*m C.act + 1.37375*t. cont. - 0.49125*Temp. Since the P-value in the ANOVA table is greater or equal to 0.10, there is not a statistically significant relationship between the variables at the 90% or higher confidence level. The R-Squared statistic indicates that the model as fitted explains 85.5443% of the variability in pureza. The adjusted R-squared statistic, which is more suitable for comparing models with different numbers of independent variables, is 49.4051%. The standard error of the estimate shows the standard deviation of the residuals to be 1.55766. This value can be used to construct prediction limits for new observations by selecting the Reports option from the text menu. The mean absolute error (MAE) of 0.61625 is the average value of the residuals. The Durbin-Watson (DW) statistic tests the residuals to determine if there is any significant correlation based on the order in which they occur in your data file. Since the DW value is less than 1.4, there may be some indication of serial correlation. Plot the residuals versus row order to see if there is any pattern which can be seen. In determining whether the model can be simplified, notice that the highest P-value on the independent variables is 0.6061, belonging to m C.act. Since the P-value is greater or equal to 0.10, that term is not statistically significant at the 90% or higher confidence level. Consequently, you should consider removing m C.act from the model.
75
Gráficos de LSD.
Grafico LSD Temperatura
Temp.
pureza
-1 186
88
90
92
94
Grafico LSD Velocidad de agitación
agit.
pureza
-1 186
88
90
92
94
Grafico LSD Tiempo de contactopureza
85
87
89
91
93
95
t. cont.-1 1
76
77
Grafico LSD Masa de carbón activado
m C.act
pureza
-1 186
88
90
92
94
Grafico LSD Volumen de Etanol
EtOH
pureza
-1 186
88
90
92
94
Anexo 7: Peligrosidad de los reactivos de trabajo. Furfural.
La sustancia polimeriza bajo la influencia de ácidos o bases, con peligro de
incendio o explosión por encima de 60 οC. Reacciona violentamente con
oxidantes. Ataca a muchos plásticos. Irrita los ojos, la piel y el tracto respiratorio,
también puede afectar al hígado. Limite de exposición 7.9 mg/m3 (piel).
Nitroetano.
Por encima de 28°C pueden formarse mezclas explosivas vapor/aire y emite
humos tóxicos(dióxido de nitrógeno). La sustancia irrita los ojos, la piel y el tracto
respiratorio. La exposición podría causar disminución de la consciencia. El límite
de exposición es de 100ppm.
Isobutilamina.
Por combustión, forma gases tóxicos y corrosivos, incluyendo monóxido de
carbono y óxidos de nitrógeno. La disolución en agua es moderadamente
básica. Reacciona violentamente con oxidantes. La sustancia es corrosiva para
los ojos, la piel y el tracto respiratorio. Corrosivo por ingestión. La inhalación de
la sustancia puede originar edema pulmonar. Los efectos pueden aparecer de
forma no inmediata. Se recomienda vigilancia médica.
Cloroformo.
En contacto con superficies calientes o con llamas esta sustancia se
descompone formando humos tóxicos e irritantes (cloruro de hidrógeno,
fosgeno, cloro). La sustancia se descompone lentamente bajo la influencia del
aire y la luz. Reacciona violentamente con bases fuertes, oxidantes fuertes,
algunos metales, tales como aluminio, litio, magnesio, potasio, sodio y acetona,
originando peligro de incendio y explosión. Ataca al plástico, al caucho y a los
recubrimientos. La sustancia irrita los ojos y puede causar efectos en el corazón,
el hígado, el riñón y en el sistema nervioso central, dando lugar a una pérdida
del conocimiento. Los efectos pueden aparecer de forma no inmediata. Se
78
recomienda vigilancia médica. El contacto prolongado o repetido con la piel
puede producir dermatitis. Esta sustancia es posiblemente carcinógena para los
seres humanos. Limite de exposición 49 mg/m3
Eter de petróleo.
Este compuesto es fácilmente inflamable, por lo que se debe conservar en
lugares ventilados y alejado de llamas. Puede causar cáncer y daños
pulmonares. No se deben verter sus desechos por el desagüe.
79
