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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
CARRERA DE ODONTOLOGÍA
Aceite esencial de la hierba luisa al 100% y su efectividad de inhibición en bloques
de resina acrílica contaminados con cándida albicans; estudio in vitro.
Proyecto de Investigación presentado como requisito previo a la Obtención del Título
de Odontóloga
Autor: Burbano Peñafiel Vanessa Aracely
Tutor: Dr. Garrido Villavicencio Pablo Rubén
Quito, Octubre 2016
ii
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Vanessa Aracely Burbano Peñafiel, con C.I. 0401440730 en calidad de autora del
trabajo de investigación: Aceite esencial de la hierba luisa al 100% y su efectividad de
inhibición en bloques de resina acrílica contaminados con cándida albicans; estudio
in vitro, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a hacer uso del contenido total o
parcial que me pertenecen, con fines estrictamente académicos o de Investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes a la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador realizar la digitación y
publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a lo
dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
Vanessa Aracely Burbano Peñafiel
C.C. 0401440730
iii
INFORME FINAL DE APROBACIÓN DE TESIS
Yo Dr. Pablo Rubén Garrido Villavicencio en mi calidad de tutor del trabajo de titulación,
modalidad Proyecto de Investigación, elaborado por VANESSA ARACELY
BURBANO PEÑAFIEL; cuyo título es: ACEITE ESENCIAL DE LA HIERBA
LUISA AL 100% Y SU EFECTIVIDAD DE INHIBICIÓN EN BLOQUES DE
RESINA ACRÍLICA CONTAMINADOS CON CÁNDIDA ALBICANS; ESTUDIO
IN VITRO, previo a la obtención del Título de Odontóloga: considero que el mismo
reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y microbiológico.
Para ser sometido a la evaluación por parte del tribunal examinador que se designe, por
lo que lo Apruebo, a fin de que el trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de
titulación determinado por lo Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, al 01 de Julio del 2016
Dr. Pablo Rubén Garrido Villavicencio
DOCENTE – TUTOR
C.C. 1311645095
iv
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/ TRIBUNAL
Tribunal constituido por: Dr. Roberto Zurita, Dr. Eddy Álvarez y Dr. Jaime Luna
Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la obtención del
Título de Odontóloga presentado por la Sta. Vanessa Aracely Burbano Peñafiel.
Con el título:
“Aceite esencial de la hierba luisa al 100% y su efectividad de inhibición en bloques de
resina acrílica contaminados con cándida albicans; estudio in vitro”. Aprobado
Emite el siguiente veredicto:
Quito, 07 de Octubre del 2016
Para constancia de lo actuado firman:
Nombre Apellido Calificación Firma
Presidente del tribunal Dr. Roberto Zurita 16 ……………………..
Vocal 1: Dr. Eddy Álvarez. 16 ……………………..
Vocal 2: Dr. Jaime Luna 18 .…………………….
v
DEDICATORIA
A Dios, quien me ha dado la vida y una hermosa familia, me ha Bendecido
abundantemente y me ha permitido culminar con éxito esta etapa de formación
profesional.
A mis padres, Lidia y Moisés, quienes son mi vida entera, mi pilar fundamental, apoyo
incondicional, guía constante, por estar a mi lado en cada momento y por ser mi
motivación constante para alcanzar mis metas.
A Jacqueline, que más que mi hermana es mi amiga, que con su apoyo, su ejemplo, sus
consejos y palabras constantes de aliento me enseña a luchar por mis anhelos.
A mi ángel en el cielo, William, por ser mi compañero fiel, por cuidarme, protegerme y
guiarme con su luz en cada paso dado a lo largo de la Carrera.
Con amor:
Vanessa
vi
AGRADECIMIENTO
A Dios, por ayudarme a mantener de pie ante cualquier circunstancia.
A los docentes de la Facultad de Odontología de la Universidad Central del Ecuador,
por brindarme sus conocimientos y ser parte de mi formación profesional.
De manera especial A mi Tutor Dr. Pablo Garrido, por su paciencia y ayuda en la
realización de ésta Investigación.
A la Mg. Lorena Mejía por la orientación y el apoyo durante la parte experimental de la
presente investigación.
Al Dr. Stahl Ullrich por su ayuda en la Obtención del Aceite esencial de Hierba luisa.
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
DERECHOS DE AUTOR .......................................................................................................... ii
INFORME FINAL DE APROBACIÓN DE TESIS ............................................................... iii
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/ TRIBUNAL ..........................................iv
DEDICATORIA .......................................................................................................................... v
AGRADECIMIENTO ................................................................................................................vi
INDICE DE TABLAS DE RESULTADOS .............................................................................. xi
ÍNDICE DE ILUSTRACIONES ............................................................................................... xii
ÍNDICE DE ANEXOS .............................................................................................................. xiii
RESUMEN ................................................................................................................................. xiv
ABSTRACT ................................................................................................................................ xv
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 1
CAPITULO I ............................................................................................................................... 3
1. PROBLEMA ........................................................................................................................ 3
1.1. Planteamiento Del Problema ...................................................................................... 3
1.2. Justificación ................................................................................................................. 4
1.3. Objetivos ...................................................................................................................... 7
1.3.1. General: ................................................................................................................ 7
1.3.2. Específicos: ........................................................................................................... 7
1.4. Hipótesis ....................................................................................................................... 8
CAPITULO II .............................................................................................................................. 9
2. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................... 9
2.1. FITOTERAPIA ........................................................................................................... 9
2.1.1. Plantas Medicinales Aromáticas ........................................................................ 9
2.1.1.1. HIERBA LUISA .............................................................................................. 9
2.1.1.1.1. Nombre científico y nombres comunes .......................................................... 9
2.1.1.1.2. Origen ............................................................................................................... 9
2.1.1.1.3. Descripción Botánica ..................................................................................... 10
2.1.1.1.4. Taxonomía...................................................................................................... 10
2.1.1.1.5. Obtención del aceite esencial de Hierba Luisa............................................ 11
2.1.1.1.6. Composición del Aceite esencial de Hierba Luisa ...................................... 12
2.1.1.1.7. Usos Terapéuticos .......................................................................................... 13
2.1.1.1.8. Mecanismo de Acción del Aceite Esencial de Hierba luisa ........................ 14
2.2. CANDIDA ALBICANS ............................................................................................ 14
viii
2.2.1. Prevalencia ............................................................................................................. 15
2.2.2. Patogenia ............................................................................................................ 15
2.2.3. Morfología Celular ............................................................................................ 16
2.2.4. Enzimas .............................................................................................................. 17
2.2.4.1. Proteasas ........................................................................................................ 17
2.2.4.2. Fosfolipasas .................................................................................................... 18
2.2.4.3. Lipasas ............................................................................................................ 18
2.2.5. Adhesión ............................................................................................................. 18
2.2.6. Formación de Biopelícula ................................................................................. 19
2.2.6.1. Definición: ...................................................................................................... 19
2.2.6.2. Biopelícula de Candida albicans .................................................................. 19
2.2.7. Quorum sensing (QS) ........................................................................................ 20
2.2.8. Mecanismos de defensa contra Candida albicans .......................................... 20
2.2.9. Candidiasis o Candidosis .................................................................................. 21
2.2.9.1. Definición ....................................................................................................... 21
2.2.9.2. Factores Predisponentes ............................................................................... 21
2.2.9.2.1. Factores Locales: ........................................................................................... 21
2.2.9.2.2. Factores Generales: ....................................................................................... 21
2.2.9.3. Clasificación de Candidiasis Oral ................................................................ 21
2.2.9.3.1. Candidiasis Eritematosa crónica ................................................................. 22
2.2.9.3.1.1. Definición ................................................................................................... 22
2.2.9.3.1.2. Clínica ......................................................................................................... 22
2.2.9.3.1.3. Clasificación ............................................................................................... 22
2.2.9.3.1.4. Etiopatogenia ............................................................................................ 24
2.2.9.3.1.5. Tratamiento de la Estomatitis Subprotésica y cuidado de las Prótesis 25
2.3. PRÓTESIS DENTALES........................................................................................... 26
2.3.1. Definición ........................................................................................................... 26
2.3.2. Tipos de prótesis ................................................................................................ 26
2.3.2.1. Prótesis Total o completa .............................................................................. 26
2.3.2.2. Sobredentaduras ............................................................................................ 26
2.3.3. Materiales Utilizados para Base de Prótesis ................................................... 27
2.3.3.1. Resinas Acrílicas ............................................................................................ 27
2.3.3.1.1. Clasificación ................................................................................................... 27
2.3.3.1.1.1. De acuerdo con el método de procesado .................................................. 27
2.3.3.1.1.2. De acuerdo con el tipo de curado ............................................................. 28
2.3.3.1.1.2.1. Resinas Termopolimerizables para Base de Prótesis ............................ 28
ix
a. Etapas de la manipulación ........................................................................................ 28
b. Composición ............................................................................................................... 29
c. Características y Propiedades .................................................................................. 29
CAPITULO III .......................................................................................................................... 30
3. DISEÑO METODOLÓGICO .......................................................................................... 30
3.1. Lugar y tipo de Investigación ................................................................................... 30
3.1.1. Tipo de investigación ............................................................................................... 31
3.2. Población del Estudio ................................................................................................ 31
3.2.1. Universo.............................................................................................................. 31
3.2.2. Tipo de Muestra ................................................................................................ 31
3.2.3. Unidades de Estudio .............................................................................................. 31
3.3. Criterios de Inclusión y Exclusión ........................................................................... 32
3.3.1. Criterios de Inclusión ........................................................................................ 32
3.3.2. Criterios de Exclusión ....................................................................................... 32
3.4. Operalización de las Variables ................................................................................. 33
3.5. Materiales y Método .................................................................................................. 34
3.5.1. Materiales ........................................................................................................... 34
3.5.2. Muestras de Resina Acrílica ............................................................................. 35
3.5.3. Obtención del Aceite esencial de Hierba luisa ................................................ 36
3.5.3.1. Recolección de la materia prima .................................................................. 36
3.5.3.2. Extracción del aceite esencial de Hierba luisa o Cymbopogon citratus al
100% 36
3.5.4. Cepa Bacteriana ................................................................................................ 37
3.5.5. Preparación de los Medios de Cultivo ................................................................. 38
3.5.6. Preparación de Probetas a ser utilizadas ............................................................ 39
3.5.7. Preparación de Cajas Petri ..................................................................................... 40
3.5.8. Incubación ................................................................................................................ 44
3.5.9. Lectura de los Resultados ....................................................................................... 45
3.5.10. Eliminación de Desechos ....................................................................................... 45
CAPITULO IV .......................................................................................................................... 46
4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO .............................................................................................. 46
4.1. RESULTADOS .......................................................................................................... 46
4.2. DISCUSIÓN ............................................................................................................... 51
CAPITULO V ............................................................................................................................ 53
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .............................................................. 53
5.1. Conclusiones .............................................................................................................. 53
x
5.2. Recomendaciones ...................................................................................................... 54
BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................... 55
ANEXOS .................................................................................................................................... 62
xi
INDICE DE TABLAS DE RESULTADOS
Tabla 1 Índice de Coeficiente Fenólico ......................................................................... 47
Tabla 2 Valor medio de las colonias formadas por tiempo de exposición para el grupo de
Agua Destilada ............................................................................................................... 49
Tabla 3 Resultados de la prueba de Kruskal Wallis ...................................................... 50
Tabla 4 Resultados de la prueba U Mann Whitney ....................................................... 50
xii
ÍNDICE DE GRAFICOS
Ilustración 1: Planta de Hierba Luisa ............................................................................ 10
Ilustración 2: Extracción por arrastre de vapor ............................................................. 12
Ilustración 3: Colonias de Candida albicans ................................................................. 15
Ilustración 4: Morfogénesis de Candida albicans ......................................................... 17
Ilustración 5: Formación de biopelícula de Cándida albicans ...................................... 19
Ilustración 6: Petequias en Tejido Palatino................................................................... 23
Ilustración 7: Áreas eritematosas difusas en mucosa palatina ...................................... 23
Ilustración 8: Lesión inflamatoria ubicada en la línea del paladar ............................... 24
Ilustración 9: Bloques de resina acrílica ....................................................................... 36
Ilustración 10: Obtención del aceite esencial de hierba luisa mediante destilación a vapor
de agua ............................................................................................................................ 37
Ilustración 11: Cepa ATCC 10231 de Candida albicans en Agar Nutritivo BHI ......... 37
Ilustración 12: 9% de Bacto agar en polvo ................................................................... 38
Ilustración 13: Colocación del Bacto Agar ................................................................... 39
Ilustración 14: Frascos con Hipoclorito de sodio al 0,1%, Agua destilada y Aceite
esencial de hierba luisa al 100% ..................................................................................... 40
Ilustración 15: Probetas contenidas en cada sustancia Hipoclorito de sodio al 0.1%, Agua
destilada y Aceite esencial de Hierba Luisa al 100% ..................................................... 40
Ilustración 16: Rotulación de Cajas Petri ...................................................................... 41
Ilustración 17: Cajas petri rotuladas y autoclavadas ..................................................... 41
Ilustración 18: Colocación de las respectivas sustancias en cada frasco ...................... 42
Ilustración 19: Comprobación de temperatura del medio de cultivo TSS+Bacto Agar 42
Ilustración 20: Colocación de las probetas contaminadas con C. albicans en cada caja
Petri ................................................................................................................................. 43
Ilustración 21: Colocación del Medio de Cultivo TSB+Bacto Agar ............................ 43
Ilustración 22: Cajas petri con medio de cultivo TSB+Bacto Agar gelificado ............ 44
Ilustración 23: Incubación de cajas petri por 24 horas ................................................. 44
Ilustración 24: Conteo de colonias en cajas Petri ......................................................... 45
Ilustración 25: Ausencia de Crecimiento de la levadura después de 8 horas de sumersión
del Bloque de resina acrílica en aceite esencial de hierba luisa al 100% ....................... 45
Ilustración 26: Almacenamiento del material contaminado previo a ser autoclavado . 46
xiii
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1: Certificación de Cepa de Candida albicans .................................................... 62
Anexo 2: Aprobación del Estudio por parte del Comité de Bioética de la Facultad de
Odontología de la Universidad Central del Ecuador ...................................................... 63
Anexo 3: Certificado de Aprobación por el Subcomité de Ética de Investigación en Seres
Humanos de la Universidad Central del Ecuador del Anteproyecto de Investigación. .. 65
Anexo 4: Certificado para Ingresar al Laboratorio de la Facultad de Ingeniería Química
de la Universidad Central del Ecuador ........................................................................... 66
Anexo 5: Certificado para Realizar la parte Experimental de la Investigación ............. 67
Anexo 6: Autorización para el Ingreso al Laboratorio de Microbiología de la Universidad
San Francisco de Quito ................................................................................................... 68
Anexo 7: Renuncia del Ingeniero Juan Túquerres a los derechos de autoría del Trabajo
de Investigación .............................................................................................................. 69
Anexo 8: Certificado de traducción del resumen ........................................................... 70
xiv
TEMA: “Aceite esencial de la hierba luisa al 100% y su efectividad de inhibición
en bloques de resina acrílica contaminados con cándida albicans; estudio in vitro”.
Autora: Burbano Peñafiel Vanessa Aracely
Tutor: Dr. Garrido Villavicencio Pablo Rubén
RESUMEN
Este trabajo tiene como objetivo determinar la efectividad de inhibición del aceite
esencial de Hierba luisa al 100% en bloques de resina acrílica contaminados con Cándida
albicans ATCC® 10231, es un estudio de tipo experimental in vitro, se empleó la técnica
de Coeficiente fenólico para determinar la efectividad inhibitoria del aceite esencial de
hierba luisa al 100% para lo cual se utilizó triplicado para cada tiempo y se tomó como
control positivo al hipoclorito de sodio al 0,1% y como control negativo agua destilada.
De lo que se obtuvo como resultado que el aceite esencial de Hierba luisa al 100%
presenta su efecto inhibitorio de los bloques de resina acrílica contaminados con Candida
albicans al estar en inmersos 8 horas sobre esta sustancia. Por lo que se concluye que el
aceite esencial de hierba luisa al 100% presenta efecto inhibitorio sobre cepas de Candida
albicans independientemente de la técnica utilizada.
PALABRAS CLAVES: CYMBOPOGON CITRATUS, CÁNDIDA ALBICANS,
BLOQUES DE RESINA ACRÍLICA.
xv
TITLE: “Inhibitory effectiveness of 100% lemon verbena oil extract against
candida albicans strains cultured in acrylic resin blocks. in vitro study.”
Author: Burbano Peñafiel Vanessa Aracely
Tutor: Dr. Garrido Villavicencio Pablo Rubén
ABSTRACT
This study aims to determine the effectiveness of inhibition of essential oil of lemon
verbena at 100% in blocks of contaminated with Candida albicans ATCC® 10231 acrylic
resin, is an experimental study in vitro technique phenol coefficient was used to determine
the inhibitory effectiveness of lemongrass essential oil to 100% which was used in
triplicate for each time was taken as positive control sodium hypochlorite and 0.1%
distilled water as a negative control. What it was obtained as a result that the essential oil
of lemon verbena 100% presents its inhibitory effect of acrylic resin blocks contaminated
with Candida albicans to be immersed eight hours on this substance. So it is concluded
that the essential oil of lemon verbena presents 100% inhibitory effect on Candida
albicans strains regardless of the technique used.
KEYWORDS: CYMBOPOGON CITRATUS/ CANDIDA ALBICANS/ ACRYLIC
RESIN BLOCKS
INTRODUCCIÓN
A lo largo de los años la mayoría de las personas han desconocido la adecuada manera de
mantener y cuidar sus prótesis. Ha sido necesario recomendar la limpieza diaria para evitar
la acumulación de placa, cálculo y pigmentaciones.
Estos depósitos no sólo pueden constituir problemas en lo que a la estética y halitosis se
refiere, sino también contribuyeron a irritaciones e infecciones como candidiasis y
estomatitis subprotésica en la mucosa adyacente siendo el ente etiológico responsable
Candida albicans en un 94% de los casos, aunque también pueden estar presentes otros
patógenos inespecíficos como mencionó (Pavatina, 2003).
Un alto porcentaje de pacientes portadores de dentaduras postizas a lo largo del tiempo han
sido afectados por candidiasis oral en forma de estomatitis subprotésica la misma que desde
tiempos antiguos ha sido una de las infecciones más comunes en humanos. Las prótesis al
permanecer en boca impiden el efecto de autoclisis o autolimpieza que ejerce la lengua y la
saliva sobre la cavidad oral, lo que condiciona a que hongos y bacterias que habitualmente
conviven en la cavidad oral aumenten su número y pasen de ser saprofitos a patógenos.
(Banabé, 2004).
Los problemas de salud, el elevado costo y la resistencia de los microorganismos a los
medicamentos sintéticos han llevado al aumento del uso de la medicina tradicional que cada
vez está siendo más aceptada en la sociedad para tratar enfermedades, es así, como el
conocimiento de la efectividad antimicrobiana de las plantas medicinales ocupa un lugar
preponderante como una de las medicinas alternativas del presente y futuro que garantiza
eficacia, seguridad y bajos costos, siempre y cuando sean usadas en forma adecuada
(Fonnegra R. &., 2007).
La alta incidencia de Candidiasis en pacientes adultos portadores de prótesis, hace que surja
este tema de investigación ya que la gran mayoría de pacientes por su falta de conocimiento
de la manera de desinfectar y mantener sus prótesis, han contribuido a que esta patología se
exacerbe con el tiempo; en el mercado hay muchos productos químicos que sirven para este
fin pero al investigar sobre las plantas naturales abundantes que existen en nuestro país
encontramos que ciertos aceites esenciales naturales contribuyen a la desinfección de las
prótesis siendo estos de bajo costo y de fácil empleo, por lo tanto el presente trabajo busca
determinar la efectividad de inhibición del aceite esencial de Hierba luisa al 100% en bloques
2
de resina acrílica que simularán a las prótesis dentales contaminadas con Cándida albicans
ATCC® 10231, con la finalidad de que a futuro el aceite esencial de hierba luisa, sea
recomendado a los pacientes para que sin ningún tipo de problema puedan desinfectar sus
prótesis dentales. O a su vez sea utilizado en la fabricación de nuevos desinfectantes en base
a esta investigación.
3
CAPITULO I
1. PROBLEMA
1.1. Planteamiento Del Problema
En la Cavidad Oral pueden presentarse un sin número de lesiones de tipo traumático,
tumoral, neoplasias, tanto benignas como malignas, así como también son frecuentes las
infecciones de tipo bacteriano, viral, parasitario y micótico, siendo el agente etiológico más
común en el último tipo de infecciones antes mencionadas, la Cándida albicans, como
menciona (Cavalcanti, 2011). Este hongo comensal en boca está presente entre un 25% a un
50% en individuos adultos y niños sanos, pero estos valores aumentan de un 60% a 100%
en pacientes portadores de prótesis dentales, según (Pires, 2002).
Como afirma (Sapp, 2005), al ser una infección oportunista la candidiasis se presenta en el
tejido oral cuando existen factores predisponentes apropiados, entre los que menciona: es
tener una saliva ácida producida por el consumo elevado de carbohidratos, favoreciendo a
crear un medio ambiente apropiado para que la cándida colonice fácilmente, xerostomía, uso
nocturno de prótesis dentales, ajuste incorrecto de prótesis dentales y la relación incorrecta
de los maxilares que va de la mano con una mala oclusión, mala higiene bucal, personas con
transtornos inmunológicos, tratamiento antibiótico prolongado, tratamiento esteroideo,
deficiencias de hierro, ácido fólico y vitaminas, son factores que contribuyen a la
implantación y evolución de este tipo de infección.
Para (De la Rosa, 2012), y par (Cawson, 2009) a, la estomatitis subprotésica es una patología
de tipo inflamatorio de la mucosa que se encuentra en contacto con la prótesis dental, se
presenta de preferencia en el paladar duro como un área roja en la mucosa que soporta la
prótesis y en la mucosa del maxilar inferior no se presenta de esta manera la inflamación, ya
que es una mucosa más móvil que permite una lámina de saliva bajo la prótesis, pero sí
puede asociarse con una queilitis angular que es el síntoma más evidente.
El simple hecho de portar la prótesis ya es un factor predisponente para la patología, debido
a que la prótesis va a impedir el efecto de auto limpieza que realiza la lengua y la saliva
sobre la cavidad oral, como consecuencia las bacterias y hongos que conviven en la cavidad
oral aumenten su número y pasen de ser saprofíticos a ser patógenos debido al ambiente
4
cerrado, más anaerobio, entre la prótesis colocada en la boca y la mucosa. (Barata & Durán,
2002).
Las prótesis dentales desde tiempos antiguos han sido elaboradas con resina de
polimetilmetacrilato. Sobredicho sustrato la Cándida Albicans fue capaz de generar una
matriz extracelular diferente a la que generan sobre otra superficie.
(Baillie GS, 2000). Esta matriz extracelular llamada biofilm o biopelícula, estuvo
conteniendo menos proteínas e hidratos de carbono y más glucosa y galactosa que cuando la
Cándida crece en condiciones normales como lo ha descrito (Chandra J, 2001). Estas
diferencias explican, que el biofilm presente mayor resistencia a los tratamientos
farmacológicos anti fúngicos y no sean capaces de eliminar la Cándida en dichas condiciones
como mencionó (Mukherjee Pk, 2003).
La mayoría de las personas portadoras de prótesis desconoce la manera adecuada del
mantenimiento de las mismas, por lo que es necesaria una limpieza diaria para evitar el
acúmulo de biofilm, cálculo y pigmentaciones en dichas prótesis y por ende evitar problemas
estéticos, posteriores patologías como la halitosis, estomatitis subprotésica, entre otras.
Actualmente existen varias sustancias químicas que han sido comprobadas para la
desinfección de los aparatos protésicos pero en nuestro medio existe una infinidad de plantas
naturales que al igual que las sustancias químicas contribuyen a la desinfección de las
prótesis siendo estos una alternativa económica para el buen mantenimiento de las mismas,
es por esto que el presente estudio pretende comprobar la efectividad de inhibición del aceite
esencial de Hierba luisa al 100% en bloques de resina acrílica contaminados con Cándida
albicans ATCC® 10231 con la finalidad de que a futuro este aceite pueda ser utilizado a
futuro como desinfectante de las prótesis dentales.
1.2. Justificación
La aparición de especies patógenas con alta resistencia clínica e in vitro hacia numerosos
fármacos, interacciones, biodisponibilidad insuficiente y una alta toxicidad de los
antifúngicos tradicionales, sobre todo en pacientes adultos inmunodeprimidos y que reciben
numerosos fármacos, ha impulsado la búsqueda de nuevas alternativas con productos
naturales que sean eficientes, de bajo costo y fáciles de conseguir, tal es el caso del aceite
5
esencial de hierba luisa, para el tratamiento de infecciones micóticas oportunistas por
Cándida Albicans ATCC® 10231 que es considerada la infección más común en nuestro
medio; y siendo Ecuador un país con mucha biodiversidad, es nuestra responsabilidad
investigar, vincular y convertir el conocimiento de los recursos biológicos en compuestos o
productos útiles en beneficio de nuestra sociedad
Hierba luisa (Cymbopogon citratus) es una planta autóctona de la India, crece bien en el
clima tropical del sudeste asiático y en Latinoamérica, así como también en climas
subtropicales. (Green, 2007).
Los componentes del Aceite Esencial de la hierba luisa que se encuentran en mayor son los
monoterpenos, geranial (41,8%) y neral (34,9%) que constituyen una mezcla de
esteroisómeros conocida como citral (76,7%) y los componentes menoritarios fueron:
terpenos como el limoneno (2,42%), mirceno (0,46%); alcoholes como el farnesol, geraniol
(5%), nerol (2,20%), linalol; aldehídos como: citronellal (0,37%); cetonas, esteres, como el
acetato de nerilo y acetato de geranilo (1,95%) y compuestos aromáticos. (Romero M. ,
2004) (Skaria, 2007).
(Rojas, 2010), Encontró que el aceite esencial de hierba luisa presenta propiedades benéficas
como: antioxidantes, antiinflamatorias, tranquilizantes pero sobre todo antifúngica
principalmente contra Cándida albicans. La actividad antimicrobiana del aceite esencial de
Cymbopogon citratus fue comprobada por (Silva, 2014), para los siguientes
microorganismos, Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Escherichia coli (ATCC
8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) y levadura Cándida albicans (ATCC 10231)
en donde se comprobó que el aceite de Hierba luisa tiene un efecto antifúngico contra la
levadura de Cándida Albicans.
El “65%” de los pacientes portadores de dentaduras completas fueron afectados por
candidiasis oral en forma de estomatitis subprotésica la misma que desde tiempos antiguos
ha sido una de las infecciones más comunes en humanos tal como describió (Banabé, 2004).
Los aparatos protésicos estando contaminados por Cándida albicans y en relación directa
con la mucosa palatina provocaron que ésta cambie su aspecto clínico en tres grados
fundamentales. (Moreira E., 1989).
6
El tratamiento se fundamentó en la eliminación de los factores locales, por lo que
recomendó retirar las prótesis por largos periodos de tiempo, higienizarlas, utilizar
enjuagatorios bucales y una terapia con antifúngicos. (Campo, 2000).
El uso del método mecánico no es suficiente para remover el biofilm de las dentaduras pues
hay que combinarlo con el uso de desinfectantes tal como lo menciona (Mohonen, 1998); y
si es que mediante este método son empleados de manera exagerada o con una técnica
incorrecta puede causar daños a las prótesis, teniendo efectos como manchas persistentes y
distorsión de los ganchos afectando su capacidad retentiva en caso de ser prótesis removible,
de igual manera son ineficaces en pacientes con limitación motora, ya que la remoción
efectiva del Biofilm requiere de cierto grado de destreza manual, la cual está reducida en
adultos mayores. Sin embargo, tiene como ventaja de ser de uso sencillo y económico
(Haggard, 2002).
La alta incidencia de Candidiasis en pacientes adultos portadores de prótesis hace que surja
este tema de investigación ya que la gran mayoría de pacientes por su falta de conocimiento
de la manera de desinfectar y mantener sus prótesis, han contribuido a que esta patología se
exacerbe con el tiempo. En el mercado hay muchos productos químicos que sirven para este
fin pero al investigar sobre las plantas naturales abundantes que existen en nuestro país
encontramos que ciertos aceites esenciales naturales contribuyen a la desinfección de las
prótesis siendo estos de bajo costo y de fácil empleo, por lo tanto el presente trabajo busca
determinar la efectividad de inhibición del aceite esencial de hierba luisa al 100% en bloques
de resina acrílica que simularán a las prótesis dentales contaminados con Cándida Albicans
ATCC® 10231 y colocados en cajas Petri con agar nutritivo durante 5min, 10min, 15min y
8 horas y observando los resultados del crecimiento o inhibición de colonias en el Agar
nutritivo después de 24 horas, la parte práctica de la presente investigación se la realizó con
muestras mediante triplicado para cada Sustancia (Aceite esencial de Hierba luisa al 100%,
hipoclorito de sodio al 0,1% que es el control positivo y Agua destilada que es el control
negativo) y utilizando la Técnica de Coeficiente Fenólico, con la finalidad de que a futuro
el aceite esencial de Hierba luisa al 100%, sea recomendado a los pacientes para que sin
ningún tipo de problema puedan desinfectar sus prótesis dentales.
7
1.3. Objetivos
1.3.1. General:
Determinar la efectividad de inhibición del aceite esencial de Hierba luisa al 100% en
bloques de resina acrílica contaminados con Cándida albicans ATCC® 10231.
1.3.2. Específicos:
Establecer el número de colonias formadas por los bloques de resina acrílica
contaminados con la levadura de Cándida albicans ATCC® 10231 en el agar nutritivo.
Analizar la media en la efectividad antimicótica del aceite esencial de Hierba luisa al
100% a los 5min, 10 min, 15 min y a las 8 h de inoculada la Cándida albicans ATCC®
10231 en los bloques de resina acrílica.
Comparar los resultados obtenidos.
8
1.4. Hipótesis
El aceite esencial de Hierba Luisa al 100% tiene un efecto inhibitorio sobre los bloques de
resina acrílica contaminados con Cándida albicans ATCC® 10231 estando en contacto con
este durante 8 horas continuas, mediante la técnica de coeficiente fenólico que será realizada
en el Laboratorio de la Universidad San Francisco de Quito, periodo 2016.
9
CAPITULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1. FITOTERAPIA
Es la ciencia que estudia la utilización de los productos de origen vegetal con fines
terapéuticos, ya sea para prevenir, atenuar o curar alguna patología. Las plantas han sido
utilizadas desde tiempos antiguos para el tratamiento de enfermedades, las mismas que
presentan efectos fisiológicos múltiples debido a la presencia de más de un principio activo
(Hernández, 2005).
2.1.1. Plantas Medicinales Aromáticas
Son vegetales aromáticos considerados como recurso ya que en sus órganos poseen
sustancias que son usadas terapéuticamente ya sea para prevenir o para curar enfermedades
y de esta manera reestablecer la salud perdida. (Muñoz F. , 2002)
2.1.1.1. HIERBA LUISA
2.1.1.1.1. Nombre científico y nombres comunes
La hierba luisa es una planta medicinal aromática que posee grandes propiedades
medicinales, su nombre científico es Cymbopogon citratus (DC) Stapf. Dentro de los
nombres más comunes de la Hierba Luisa tal como detalla, (Fonegra, 2007) son: en la Región
Amazónica es llamada patchuli; en Cuba, caña de limón; en Costa Rica, México y Nicaragua,
zacate limón, té limón, zacate té; En España, caña de limón, caña santa, hierba de la
calentura, hierba limón, limoncillo, malojillo; en Estados Unidos, lemongrass; en Venezuela,
malojillo criollo. Por otro lado (Lopera & Pelaéz, 2005) afirma que: en Colombia es
conocida como Limonera y en Panamá, paja de limón.
2.1.1.1.2. Origen
Hierba limón (Cymbopogon citratus) es una planta originaria de la India, Asia Suroriental y
África, crece bien en clima tropical y subtropical. (Green, 2007)
(Vida, 2006) Afirmó: que Cymbopogon citratus es bien conocida en las regiones Sur y
Sureste de Brasil, es muy utilizada en los ornamentos y las prácticas medicinales.
10
2.1.1.1.3. Descripción Botánica
La hierba luisa (Cymbopogon citratus) es una planta herbácea, mediana, es terrestre,
perenne, crece entre 0,5 a 2m de altura, su aroma penetrante a limón tiene su origen en el
citral, ya que es el principal componente de su aceite esencial. Sus hojas son arrosetadas en
la base de la planta, son largas, lineales cuando son jóvenes y erguidas cuando son antiguas
(Fonnegra R. &., 2007). Y entre 1 y 2c.m. de ancho (Vallecillo, 2004) .
Poseen textura seca y quebradiza, Tienen los bordes ásperos llenos de cerdas (parecidos al
filo de un serrucho), que al manipular la planta cortan, (Green, 2007). De acuerdo a las
condiciones locales varía el color de la planta. Requiere para su crecimiento la presencia de
luz. Tienen un peciolo corto y sus hojas son lanceoladas, con una inervación central muy
saliente por su envés, de los que parten casi perpendicularmente numerosas inervaciones
secundarias. Florece cuando ha crecido en un clima propicio y no ha sido cortada por varios
años, se agrupan sobre las espigas terminales de los tallos, son pequeñas, blancas por fuera
y violáceas por su interior. Según (Muñoz F. , 2002).
(Epenyong, 2014) Revela que las principales características de la hierba luisa y su valor han
venido tomando fuerza a través de la historia, y es una muy buena opción para tomar en
cuenta para un tratamiento natural por su sabor a limón y por su olor y color agradables.
2.1.1.1.4. Taxonomía
La taxonomía de esta planta medicinal fue descubierta por el científico Stapf, quien
identifico a esta planta como Cymbopogon citratus, determinando que:
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Liliopsida
Ilustración 1: Planta de Hierba Luisa Fuente: Cantón Mira, Provincia del
Carchi
Elaborado por: Autora Vanessa
Burbano
11
Orden: Poales
Familia: Poaceae
Género: Cymbopogon
Especie: citratus Stapf
2.1.1.1.5. Obtención del aceite esencial de Hierba Luisa
El aceite esencial de hierba luisa es obtenido mediante la extracción por arrastre de vapor
de agua, es un método muy antiguo y sencillo empleado para la obtención de aceites
esenciales a partir del material vegetal fresco. Los aceites esenciales al ser sustancias
volátiles e insolubles en el agua pueden ser arrastradas por una corriente de vapor de agua.
(Lamarque, 2008)
La destilación por arrastre de vapor es un procedimiento el cual se basa en aprovechar las
diferentes temperaturas de ebullición de cada sustancia; la muestra vegetal generalmente
fresca y cortada en trozos pequeños, es encerrada en una cámara inerte y sometida a una
corriente de vapor de agua sobrecalentado, la esencia así arrastrada es posteriormente
condensada, recolectada y separada de la fracción acuosa. Se utiliza a nivel industrial
debido a su alto rendimiento, la pureza del aceite obtenido y porque no requiere tecnología
sofisticada (Bagué, 2012). Como se observa en la imagen de la destilación por arrastre de
vapor de otra planta medicinal como es la menta utilizando la misma técnica de extracción
para obtener el aceite esencial de Hierba luisa. (Ilustración 2)
12
2.1.1.1.6. Composición del Aceite esencial de Hierba Luisa
De acuerdo a la literatura, por lo general los componentes de los aceites esenciales se
almacenan en todas las partes de la planta pero con mayor frecuencia en las flores, semillas,
hojas y frutos. En el caso de la hierba luisa el aceite esencial está presente en sus hojas entre
un 25 a 35%, de las cuales es extraído mediante destilación por arrastre de vapor (Ocampo,
2008) (Romero M. , 2004).
(Mendoza, 2010) En su estudio sobre la composición química y actividad acaricida del aceite
esencial de cymbopogon citratus, identificó 18 compuestos que representan el 97,4% de los
componentes del aceite esencial de hierba luisa, dentro de los componentes que se
encuentran en mayor porcentaje son los monoterpenos geranial (41,8%) y neral (34,9%)
dichos compuestos son una mezcla de esteroisomeros conocida como Citral constituyendo
de esta manera el 76,7% del aceite obtenido. Por su parte los componentes que se encuentran
en menos porcentaje fueron los terpenos: limoneno (2,42%), mirceno (0,46%); alcoholes
como el farnesol, geraniol (5%), nerol (2,20%), linalol; aldehídos como el citronellal
(0,37%); cetonas, esteres, como el acetato de nerilo y acetato de geranilo (1,95%) y
compuestos aromáticos. (Romero M. , 2004) (Skaria, 2007).
Ilustración 2: Extracción por arrastre de vapor
Fuente: Tomado de:
http://quimicaorgancia1alejandraaguilar.blogspot.com/2012/
02/practica-3-destilacion-por-arrastre-de.html
13
(Epenyong, 2014) Acerca de la composición del aceite esencial de la hierba luisa, menciona
que está compuesto por electrolitos y minerales como (Na, K, Ca, Cu, Mg, Mn, Se, P, Fe y
Zn), vitaminas (folato, niacina, piridoxina, riboflamina y vitaminas A y E), macronutrientes
(carbohidratos y proteínas), razón por la cual este aceite es responsable de un margen amplio
de acciones terapéuticas.
2.1.1.1.7. Usos Terapéuticos
Cymbopogon citratus (DC.) Stapf, muestra un infinito número de aplicaciones y se usa
popularmente por la gente en muchos países. En Brasil, por ejemplo, se utiliza
frecuentemente en la medicina popular como reconstituyente digestivo, anti-tos ferina,
efectiva contra los resfriados, con un analgésico, anti-hermético, anti cardiopático, anti-
inflamatoria de conducto urinario, diurético, efecto antiespasmódico, diaforético y
antialérgico. (Negrelle, 2007)
Según (Vallecillo, 2004), el uso de zacate limón es muy antiguo, ha sido usado en la
perfumería, medicina, para aromatizar aerosoles, desinfectantes y jabones. Por su rápido
crecimiento y por ser un material vegetativo que se adapta a varias condiciones, es de gran
utilidad para la conservación de los suelos.
De acuerdo al estudio realizado por (Peeyush, 2013) sobre el aceite esencial de Cymbopogon
citratus sobre la mosca doméstica, se pudo comprobar que este tipo de aceite es un excelente
insecticida para el control de la mosca doméstica. Además (Maizura, 2007) reportó en un
estudio in vitro que el aceite esencial de Cymbopogon citratus tiene actividad contra la
bacteria Escherichia coli. Igualmente varios estudios han demostrado que el aceite esencial
de Cymbopogon citratus tiene actividad anti-Leishmania. (Machado, 2012)
Por otra parte en Asia esta misma especie se lo utiliza como ingrediente en la cocina, por la
semejanza de su sabor y olor con el del limón.
Cymbopogon citratus tiene acción fungicida contra patógenos del maíz y del sorgo
(Fandohan, 2008)
Por vía externa el aceite esencial de Cymbopogon citratus, se utiliza en gargarismos, ya sea
para anginas o para faringitis; así también por su efecto antiinflamatorio ya conocido, se lo
14
usa en cataplasmas. Se lo utiliza en afecciones dolorosas como, reumatismos, neuralgias,
entre otras. (Berdonces, 2007).
2.1.1.1.8. Mecanismo de Acción del Aceite Esencial de Hierba luisa
Para (Epenyong, 2014), el sin número de componentes como el citral, beta mirceno, linalol
y geraniol presentes en el aceite esencial de hierba luisa son los responsables de la actividad
antifúngica, de igual manera comenta que el linalool provoca reducción en el tamaño de la
célula, así como también germinación anómala del hongo. Por lo tanto está claro que esta
actividad va a llevar a la inhibición del hongo cándida albicans tanto en células que se están
formando como en células ya formadas, dicha actividad también ha sido asentada para cepas
de dermatofitos como, Trychopyton Metagrophytes, Trichophyton Rubrum Aspergillus
Fumigatus, Espidemophyton Floccosum y Microsporum Gypseum.
El mecanismo de acción del Citral que es el principal componente del aceite esencial de
Hierba luisa contra la Candida albicans se podría dar por 3 posibles vías: aumentando la
permeabilidad de la pared celular a iones pequeños, afectando la estabilidad estructural de
la pared celular y desestabilizando el empaquetamiento de la bicapa lipídica, cualquiera de
estos tres efectos produce la muerte en la célula. (Maguna, Romero, & Garro, 2006)
2.2. CANDIDA ALBICANS
Los hongos del genero Candida son levaduras, tienen un modo de desarrollo unicelular.
Nueve de las 150 especies del género candida, se consideran patógenas para el hombre,
siendo la especie de candida con mayor prevalencia la C. albicans, C. guilliermondii, C,
Krusei, C. parapsilosis, C, tropicalis, C. pseudotropicalis, C. lusitaniae, C. dubliniensis y C.
glabrata. Pero desde el punto de vista médico odontológico la especie más patógena es
Candida Albicans. (Ceccotti E. S., 2007)
Candida es una levadura con habilidad para producir filamentos, es un hongo dimorfo, en
cultivos o en tejidos proliferan en forma de levaduras ovales gemantes de 3 a 6 µm de
diámetro, forman seudohifas. (Arenas, 2008) (Brooks, 2014)
15
Como menciona (Negroni, 2009) Esta dentro del reino de los Hongos, pertenece a la división
Deuteromycota, a la clase Blastomicetes, a la familia Cryptococcaceae, al género Cándida y
a la especie Albicans siendo la más frecuente y virulenta. Es un hongo polimórfico ya que
su morfología puede ser levaduriforme o crecer como hongo filamentoso formando hifas
verdaderas. La Candida Albicans se desarrolla sin dificultad en los cultivos habituales para
bacterias y hongos como el agar glucosado de Sabouraud en el cual crecen las colonias en
las primeras 24h a 48h de incubación a una temperatura óptima entre 25ª a 37ºC, colonias
blandas, brillantes, cremoso con olor a levadura. (Lim C. R., 2012) (Brooks, 2014).
2.2.1. Prevalencia
En la Cavidad oral de los individuos sanos están presentes con frecuencia especies de hongos
que son considerados como residentes normales de la microflora oral tal es el caso de la
candida albicans que está presente entre un 35% y un 55% en individuos sanos, así como
también son miembros de la flora normal de la piel en un 25 a 50%, la mucosa de la vía
gastrointestinal y tracto genital femenino en un 13%. La Candida vive en equilibrio con otros
microorganismos del cuerpo humano, pero cuando tiene lugar una alteración de la inmunidad
del huésped, este comensal inofensivo comienza a proliferar y ocurre un cambio a un estado
patógeno de dicha especie. (Saap, 2005) (Marsh, 2011)
2.2.2. Patogenia
La infección por Candida Albicans se produce cuando el huésped presenta factores
predisponentes como: xerostomía, saliva ácida, tabaquismo, trastornos inmunológicos,
Ilustración 3: Colonias de Candida albicans
Fuente: Tomado de:
http://www.microbiologyinpictures.com/candida-albicans.php
16
tratamiento antibiótico, tratamiento con corticoesteroides, deficiencias de hierro y vitaminas,
dietas ricas en carbohidratos, diabetes mellitus, radio y quimioterapia, embarazo, SIDA,
desajustes del sistema inmunitario especialmente en recién nacidos y ancianos. (Saap, 2005)
Como menciona (Castrillón, 2005, pág. 13), “Existen diversos factores potenciales de
virulencia, como la morfología celular, la actividad enzimática extracelular, el cambio
fenotípico y los factores de adhesión, que favorecen la formación de biopelícula”.
2.2.3. Morfología Celular
Candida albicans puede cambiar su morfología de levadura, redonda u ovoide
(blastoconidia) a filamentosa y elongada (hifa y pseudohifa), otorgándole mayor virulencia,
capacidad de evadir el sistema inmune y de suprimir la respuesta proinflamatoria del
hospedero. (Lim C. R., 2012).
Como menciona (Murray, 2009) desde el punto de vista morfológico, las levaduras son
células que se reproducen por gemación o fisión de modo que la célula progenitora desprende
una porción de sí misma para producir una célula hija, las mismas que se alargan y forman
seudohifas. Las levaduras por lo general son unicelulares y producen colonias redondeadas,
pálidas o mucoides en las placas de agar, pero por otra parte las formas miceliales son
microorganismos pluricelulares formados por estructuras tubulares semejantes a hebras lo
que corresponde a las hifas, el conjunto de hifas conforman una estructura llamada micelio.
La morfogénesis se da cuando hay transición de levaduras (unicelulares) y la forma de
crecimiento filamentosa del microorganismo, esta conversión de la forma unicelular de
levadura al crecimiento filamentoso es esencial para la virulencia de Cándida albicans
(Castrillón, 2005).
Los procesos de cambios de morfología se dan gracias a la inducción de genes específicos
de hifas (HSGs), así como SAP 4, 5 y 6, HWP1, ALS3 y ALS8; y a los sistemas de quorum
sensing. (Huang, 2012)
La forma filamentosa de crecimiento tiene mayor penetración de células o tejidos, pero las
hifas son las que abren la brecha entre las barreras titulares gracias a que en su punta hay
secreción de enzimas degradadoras de proteínas, componentes celulares y lípidos, penetra
fácilmente en sustratos sólidos y tejidos. (Hube, 2001) (Castrillón, 2005)
17
En la colonización de la mucosa en individuos sanos las que predominan son las levaduras
pero las hifas se hacen presentes cuando las defensas del huésped bajan. En el estado
temprano de la colonización se producen las hifas a diferencia de las levaduras que se
observan en tejidos necróticos justo cuando las hifas en su crecimiento se revierten por el
suero a forma de levadura, y las proteínas se degradan por proteinasas in vivo e infiltran
tejidos haciéndolos necróticos. (Castrillón, 2005)
2.2.4. Enzimas
Son consideradas como determinantes de virulencia en Candida, porque son capaces de
romper polímeros responsables de nutrir al hongo e inactivar las moléculas útiles en la
defensa del organismo. Las principales enzimas extracelulares responsables de la
patogénesis de Candida son: proteasas, fosfolipasas y lipasas. (Castrillón, 2005)
2.2.4.1.Proteasas
En la actualidad se han identificado 10 genes que codifican para Candida, durante el
desarrollo hifal se expresan tres genes (SAP4, SAP5 Y SAP6) responsables de la invasión
del epitelio oral y daño tisular. Exactamente no se conoce el papel de estas enzimas en la
virulencia, pero la capacidad de degradar las proteínas extracelulares de la matriz del
huésped es un factor obvio como la destrucción de las proteínas del huésped implicadas en
la defensa contra la infección. (Marsh, 2011)
Ilustración 4: Morfogénesis de Candida albicans
Fuente: Microbiología de Burrows
18
2.2.4.2. Fosfolipasas
Responsables de hidrolizar los fosfolípidos en los ácidos grasos. De acuerdo al tipo de enlace
éster hay cuatro clases de fosfolipasas (PLA, PLB, PLC, PLD). Pero la PLB1, secretada en
la punta de las hifas, es necesaria para la invasión y virulencia, puesto que hidroliza las
uniones de éster de glicerofosfolípidos de la membrana celular del huésped. (Castrillón,
2005) (Marsh, 2011)
2.2.4.3.Lipasas
Son codificadas por una familia de genes de al menos diez miembros (LIP1-LIP10). La
expresión de estos genes depende del estado de infección, más que de la localización del
órgano. (Castrillón, 2005)
2.2.5. Adhesión
El primer paso para la colonización de Candida albicans a células del hospedador o a
biodispositivos y el posterior desarrollo de la infección está dado por la Adherencia. (Noumi,
2010)
La primera fase de este procedimiento es no específica, se basa principalmente en las fuerzas
de atracción y repulsión, destacando la hidrofobicidad de las superficies, iniciando la
colonización. Luego se establecen interacciones especificas entre las proteínas que se
encuentran en la pared celular, las mismas que actúan como adhesinas, y los receptores de
las células epiteliales (Vidotto, 2003).
Las Adhesinas se define como una biomoléculas que causan la adherencia de Candida
albicans a las células del huésped o a sus ligandos específicos, así tenemos: Existen
diferentes tipos de adhesinas en Candida, como Als, Hwp1p, Int1p y Mnt1p. Entre las
proteínas de Candida albicans que se unen a varias proteínas de la matriz extracelular de las
células de mamífero, son: la fibronectina, laminina, fibrinógeno y colágeno tipo I y IV.
(Chaffin, 1998)
El Polímero extracelular sintetizado por las levaduras de Cándida albicans está compuesto
por 65 a 82% de carbohidratos (principalmente manosa), 7% de proteínas, 0,5% de fósforo
y 1,5 % de glucosamina; éste polímero aumenta la capacidad de las levaduras de adherirse a
19
las superficies inertes, incluyendo el acrílico de las prótesis dentales. Por lo tanto, la adhesión
puede estar dada tanto por proteínas, como por carbohidratos (Mc Courtie, 1985).
2.2.6. Formación de Biopelícula
2.2.6.1. Definición:
La biopelícula es una comunidad de microorganismos unidos de manera irreversible a una
superficie, la cual contiene matriz exopolimérica, mostrando propiedades fenotípicas
distintas, las mismas que permiten el aumento de resistencia a los agentes antimicrobianos
y la protección a las defensas del hospedador. (Kumamoto, 2002) (Donlan, 2002)
2.2.6.2. Biopelícula de Candida albicans
Para su formación consta de varios procesos, tales como: “la adhesión inicial de las células
de levadura, seguida por la germinación y formación de microcolonias, filamentación,
desarrollo de monocapa, proliferación y maduración” (Castrillón, 2005, pág. 21)
La formación de la biopelícula in vitro se manifestará en tres fases: una temprana, de 0 a 12
horas; intermedia, de 12 a 30 horas y una madura, de 38 a 72 horas. (Douglas, 2002)
La estructura de la biopelícula después de 48 horas de incubación consiste en una red de
levaduras, hifas y pseudohifas. Cuando Cándida albicans crece en un medio líquido o en
agar, no se observa la mezcla de levaduras, hifas y matriz extracelular, es decir, la
morfogénesis se da cuando existe el contacto con la superficie, debido a que, la células de la
capa basal adquiere un papel importante en el anclaje de la biopelícula a la superficie. El
incremento en la resistencia a los agentes antimicrobianos y a la respuesta inmune son las
principales consecuencias de la formación de la biopelícula. (Douglas, 2002).
Ilustración 5: Formación de biopelícula de Cándida albicans
Fuente: Castrillón, 2005.
20
Los posibles mecanismos de resistencia de la biopelícula hacia los fármacos son:
Restricción a la penetración a través de la matriz de la biopelícula.
Cambios fenotípicos que ocasionarán la disminución del crecimiento, como también,
limitación de nutrientes, ocasionando cambios en la cubierta celular, afectando de
ésta manera la susceptibilidad de hacia los agentes antimicrobianos.
Expresión de los genes de resistencia, al ser inducidos debido al contacto con la
superficie. (Ramage, 2001)
2.2.7. Quorum sensing (QS)
Sirve para la comunicación entre las células y el ambiente de su entorno, sea físico o químico.
Se desarrolla un comportamiento de tipo cooperativo, debido a que los sistemas que son
regulados por Quorum sensing, permite a Cándida albicans relacionarse entre sí. (Kruppa,
2008)
Entre los compuestos que son considerados como moléculas de Quorum sensing en Cándida
albicans están el triptofol, que sirve como bloqueador de la filamentación; el tirosol, que es
el encargado de promover y el Farnesol que es una sustancia autorreguladora morfogenética,
lo que quiere decir que es una molécula lipofílica localizada en las membranas celulares del
huésped que provoca alteración en la fluidez de la misma, permitiendo la creación de una
puerta de entrada a la invasión de Cándida. (Kruppa, 2008)
2.2.8. Mecanismos de defensa contra Candida albicans
El tegumento intacto es uno de los mecanismos de defensa existentes contra Cándida, es
decir, cuando la mucosa o piel se encuentran alteradas, se vuelven susceptibles a ser
afectadas. Los linfocitos polimorfonucleares son capaces de dañar a las pseudohifas,
fagocitan y destruyen blastosporas. La ingestión y posterior destrucción de hongos, está dada
por la acción de monocitos y eosinófilos. (Ceccotti E. S., 2007)
La mieloperoxidasa (MPO), el sistema ion superóxido y el peróxido de hidrógeno (H2 O2)
de los monocitos y neutrófilos, son los responsables de la destrucción a nivel intracelular de
Cándida albicans, es decir que “la MPO reacciona con el H2 y O2 proveniente de las células
fagocitarias activadas por contacto con partículas extrañas, formando un complejo enzima-
sustrato con una fuerte capacidad oxidativa” (García, 1998). Por otro lado las proteínas
21
catiónicas, con similitud a la quimiotripsina al realizar proteolísis ejecutan acción
anticándida. Opsoninas como la IgG, entre otras, permiten el aumento en la velocidad con
la que los neutrófilos realizan la ingestión de Cándida. La opsonización además está dada
por el C3b, debido a que se fija principalmente a las blastosporas de Cándida (Ceccotti E.
S., 2007)
2.2.9. Candidiasis o Candidosis
2.2.9.1.Definición
Es una micosis primaria o secundaria, producida por levaduras endógenas y oportunistas del
género Candida, en la mucosa oral la especie más patógena es Candida albicans. (Arenas,
2008)
2.2.9.2.Factores Predisponentes
2.2.9.2.1. Factores Locales:
Entre los que encuentra: la xerostomía, uso de prótesis mucosoportadas o de aparatos de
ortodoncia falta de higiene oral, perdida de dimensión vertical, uso exagerado de antisépticos
orales, lesiones erosivas de la mucosa bucal, lesiones queratinizadas, tabaquismo y lengua
escrotal.
2.2.9.2.2. Factores Generales:
Diabetes, Leucemia, linfomas, canceres diseminados, anemias, embarazo, uso de
antibióticos, uso de sulfamidas, tetraciclinas, doxiciclina, aminoglucósidos, los corticoides
y fármacos antineoplásticos, Hipotiroidismo, hiperparatiroidismo, deficiencia de hierro
transtornos endócrinos, enfermedades inmunosupresoras primarias o adquiridas como el
SIDA, recién nacidos y los ancianos.
2.2.9.3. Clasificación de Candidiasis Oral
Según Marsh clasifica en cuatro tipos de Candidiasis orales primarias:
Pseudomembranosa
Eritematosa Aguda
22
Hiperplásica crónica
Eritematosa crónica (Marsh, 2011, pág. 169)
2.2.9.3.1. Candidiasis Eritematosa crónica
2.2.9.3.1.1. Definición
Este tipo de Candidiasis Oral Primeria es también denominada, estomatitis protésica o
subprotésica, candidiasis atrófica crónica o Estomatitis relacionada con Candida, es una
inflamación crónica que se detecta frecuentemente en los pacientes portadores de prótesis.
(Preti G. B., 2008) (Basker, 2011). El diagnóstico es básicamente clínico, basándose en la
identificación de las lesiones en donde se encuentra una superficie poco queratinizada,
eritematosa, y edematizada con áreas hiperplásicas de aspecto granular, que está muy bien
delimitada y presenta el mismo límite que la prótesis que porta el paciente. (Brevis, 2008)
2.2.9.3.1.2.Clínica
Se presenta como una lesión inflamatoria generalizada de tejido atrófico y puntos
blanquecinos diseminados que se desprenden fácilmente, comúnmente en el paladar. Su
localización principalmente es por debajo de las dentaduras protésicas superiores en
pacientes adultos. Áreas de erosión superficial y petequias son las características específicas
en las etapas iniciales; la sensación de quemazón continua en el área afectada es la principal
molestia, está acompañada por queilitis angular. La Candidiasis puede afectar también la
lengua caracterizándose por presentar un aspecto liso y rojo carnoso debido a la ausencia de
papilas filiformes, adelgazamiento generalizado del epitelio y a inflamación excesiva del
tejido conjuntivo. (Bascones, 2004) (Sapp, 2005)
2.2.9.3.1.3.Clasificación
De acuerdo al aspecto clínico este tipo de candidiasis presenta tres variedades:
23
Tipo I: Inflamación localizada mínima, que se caracteriza por un eritema puntiforme.
(Preti G. B., 2008) (Álvarez, 2012)
Tipo II: Se caracteriza por presentar una inflamación generalizada, mucosa color
rojo brillante con “áreas eritematosas difusas que pueden cubrirse total o
parcialmente por un exudado blanco-grisáceo” (Noguera, 2006, pág. 21)
Tipo III: Lesión inflamatoria ubicada en la línea del paladar, se constituye de una
mucosa gruesa con patrón papilar o nodular (Preti G. B., 2008).
Ilustración 7: Áreas eritematosas difusas en mucosa
palatina
Fuente: Ríos, 2014.
Ilustración 6: Petequias en Tejido Palatino
Fuente: Ríos, 2014.
24
2.2.9.3.1.4. Etiopatogenia
Los principales factores considerados dentro de la etiopatogenia de la Estomatitis
subprotésica son:
a) Trauma protético: El uso constante de la prótesis se considera como una agresión
no fisiológica mecánica para el tejido subyacente, donde el estímulo patógeno para
la producción de una irritación tisular está dado por los efectos de presión, empuje y
tracción de la prótesis, en especial cuando existe un desajuste de la misma,
acompañado de hábitos inadecuados de utilización .
b) Higiene de la prótesis: la biopelícula formada en la superficie de la prótesis puede
cambiar el ecosistema bucal, produciendo modificaciones que permiten el
crecimiento y desarrollo de microbiología patógena. (Noguera, 2006)
c) Reacciones alérgicas e irritación: Las reacciones alérgicas se dan principalmente
debido a que, después del procesado, permanecen en las prótesis pequeñas cantidades
de éstos materiales.
La diferenciación de una reacción alérgica de reacciones producidas por otras causas
se basa en que, al retirar el alérgeno, la reacción desaparece dentro de 24 horas,
además de presentar los síntomas y signos típicos de alergia como son: tejidos color
rojizo, edema, escozor y ardor. (Sheldon, 1982).
Ilustración 8: Lesión inflamatoria ubicada en la línea
del paladar
Fuente: Ríos, 2014.
25
d) Infección candidiásica: Cándida albicans pasa de ser un microorganismo comensal
a patógeno en la cavidad oral, lo que permite el desarrollo de la infección. La Cándida
inicialmente forma hifas que le sirven para adherirse y colonizar huésped y prótesis,
posteriormente se transforma en levadura-micelio y produce enzimas hidrolíticas
para penetrar en los tejidos, los cuales producen una respuesta inflamatoria. Más
tarde, se produce la invasión vascular y diseminación a otros tejidos (Sapp, 2005).
Entre las causas con menor incidencia para el desarrollo de la estomatitis protésica, si
bien son los factores sistémicos como:
Enfermedades degenerativas o medicamentos que disminuyan la respuesta
inmunológica, como Antibióticos de amplio espectro, o inmunosupresores que
disminuyan la respuesta inflamatoria, como los corticoides, favorecen la
colonización por hongos de la mucosa oral y facilitan el desarrollo de la estomatitis.
Alteraciones nutricionales: Las carencias nutricionales, como déficit de hierro o
vitaminas están ligadas a alteraciones en el recambio celular, y reparación de
epitelios, por lo que se deberá tener en cuenta sobre todo en pacientes ancianos,
donde se produce con frecuencia desequilibrios nutricionales.
Xerostomía, frecuente en ancianos, por la edad y por los múltiples medicamentos
que toman, pierde la capacidad antimicrobiana de la saliva.
Dietas ricas en carbohidratos, favorecen el mecanismo de adhesión del factor
patógeno de los hongos a la superficie de la mucosa oral. (Aguirre, Zamacona, &
Kutz, 2006)
2.2.9.3.1.5. Tratamiento de la Estomatitis Subprotésica y cuidado de las Prótesis
Como medida preventiva se recomienda el cepillado regular de las prótesis y la remoción de
la misma durante la noche manteniéndola seca. (Preti G. B., 2008)
En caso de desajuste de la prótesis, habrá que tenerse en cuenta que mientras este desajuste
no se elimine difícilmente va a remitir en su totalidad la estomatitis. En el caso de que
existiera alergia a alguno de los componentes de la prótesis, evidentemente habría que
sustituirlo por otro producto.
Los poros del metacrilato de las prótesis dentales sirven como reservorio para Candida
albicans lo que provoca una reinfección de la mucosa, por lo antes mencionado es de vital
importancia eliminar Candida albicans, mediante el cepillado de la prótesis, de haber dientes
26
remanentes y lengua después de cada comida y antes de acostarse, así como la utilización de
diferentes agentes químicos durante la noche a tal fin. Este sería el primer paso como
profilaxis para evitar el desarrollo de la estomatitis y como coadyuvante al tratamiento una
vez instaurada.
Por otro lado se aconseja la utilización de un gel o barniz de miconazol en la parte interna
de la prótesis mientras se la lleva puesta, el paciente deberá quitársela y limpiarla para aplicar
el miconazol tres veces al día, hasta que la inflamación desaparezca y Candida albicans haya
sido eliminada lo que sucede entre 1 y 2 semanas. (Cawson, 2009)
2.3. PRÓTESIS DENTALES
2.3.1. Definición
La prótesis dental consiste en la reposición o rehabilitación de las piezas dentales perdidas
por dientes artificiales, con el fin de restaurar y mantener las funciones, masticatoria,
fonética y estética facial, así como también recuperar el bienestar del paciente. (McGivney
& Carr, 2004) (Preti, y otros, 2008)
2.3.2. Tipos de prótesis
Según (Palma, 2007), a las Prótesis Dentales las clasifica en:
2.3.2.1.Prótesis Total o completa
El objetivo de estás Prótesis es la reposición de los dientes en personas edéntulas totales, ya
sea en una sola arcada o en las dos, se asientan sobre la mucosa directamente. Se compone
de una base que tiene la función de soporte y estructura de los dientes.
2.3.2.2. Sobredentaduras
Es una Prótesis Total que aprovecha para mejorar el apoyo, retención y estabilidad los
dientes residuales o los implantes osteointegrados. Este tipo de prótesis tiene la gran ventaja
de que al estar presentes en boca los dientes residuales, el hueso alveolar no sufre ningún
proceso de reabsorción ósea.
27
2.3.2.3. Prótesis Parcial
Es el tipo de Prótesis Dental que sustituye uno o varios Dientes, así tenemos:
2.3.2.3.1. Prótesis Parcial Fija
Son aquellas prótesis que pueden sustituir a un diente mediante la el tratamiento con coronas
o a más dientes mediante el tratamiento con puentes fijos.
2.3.2.3.2. Prótesis Parcial Removible
Son Prótesis que pueden ser retiradas por el paciente, sustituyen a uno o más dientes, cuentan
con una placa de metal o de resina acrílica de termocurado que se apoya sobre la mucosa.
Pueden ser por tanto, dentosoportadas, dentomucosoportadas o mucosoportadas.
2.3.2.4. Prótesis Mixtas
Son aquellas prótesis que combinan prótesis fija con prótesis removible, quedando las dos
retenidas.
2.3.3. Materiales Utilizados para Base de Prótesis
2.3.3.1.Resinas Acrílicas
Las resinas acrílicas son plásticos derivados del etileno, que contiene un grupo vinilo, las
más utilizadas en Odontología son las derivadas del ácido acrílico y del ácido metacrílico.
La unión de ésteres obtenidos de dichos ácidos con la unión a radicales (etilo, metilo, fenilo)
dan como resultado los monómeros de dichas resinas: acrilato de metilo y metacrilato de
metilo. Se expenden en forma de líquido y polvo, el líquido contiene metilmetacrilato no
polimerizado y el polvo, resinas de polimetilmetacrilato prepolimerizada, en forma de
pequeñas perlas. (Anusavice, 2004) (Cova, 2010)
2.3.3.1.1. Clasificación
Según (Cova, 2010) las resinas acrílicas pueden clasificarse desde varios puntos de vista:
2.3.3.1.1.1. De acuerdo con el método de procesado
Reina procesada en muflas con yeso o silicona
28
Resinas procesada con microondas
Resinas procesadas con lámparas de luz visible
Resinas Fluidas
2.3.3.1.1.2. De acuerdo con el tipo de curado
Resinas de Autocurado:
Resinas de Termocurado
Resinas de Fotocurado
2.3.3.1.1.2.1. Resinas Termopolimerizables para Base de Prótesis
Para la fabricación de casi todas las Bases Protésicas se utiliza materiales
termopolimerizables, cuya energía térmica para su polimerización se obtiene mediante un
baño de agua en el cual es necesario dejar hervir la mufla con el aparato protésico a 65º C
por 1-2h o utilizando también un horno microondas.
a. Etapas de la manipulación
La preparación de la mezcla se hace uniendo el monómero (líquido) y el polímero (polvo)
se hace con una proporción de 3:1 en un recipiente de vidrio que debe mantenerse cerrado
con la finalidad de evitar la evaporización del monómero evitando de esta manera la
formación de porosidades granulares al finalizar la polimerización.
Arenosa: consistencia de la mezcla es granulosa o áspera
Correoso: la característica de esta etapa es el ser filamentosa o glutinosa. Material
cuando se toca puede pegarse.
Pastoso: Masa es pastosa, no es demasiado pegajosa, no se adhiere a la espátula, es
la etapa ideal para llevar el material a la cámara de moldeo anteriormente preparada.
Elástica: la masa rebota cuando es comprimida o es estirada.
Endurecimiento final: la mezcla aparece muy seca y es resistente a la deformación
mecánica. (Anusavice, 2004) (MaytaAli, 2012)
29
b. Composición
Al igual que la mayoría de resinas acrílicas, está constituida por polvo y líquido como antes
había mencionado.
Polvo (polímero)
Esferas pre polimerizadas de polimetilmetacrilato
Peróxido de Benzoílo: en pequeña cantidad, es el responsable del comienzo del
proceso de polimerización por lo que es el iniciador
Líquido (monómero)
Es Metilmetacrilato predominantemente no polimerizado
Hidroquinona, en pequeñas cantidades, actúa como inhibidor.
Dimetacrilato de glicol, actúa como agente de entrecruzamiento, se añade al
líquido para formar una estructura reticular dando lugar a una gran resistencia a
la deformación
c. Características y Propiedades
Estabilidad dimensional
El metacrilato de metilo al polimerizar tiene un contracción de un 6% a 7%, pero en la tica
al colocar la mezcla en un recipiente rígido la contracción reduce a un 0.2% a un 0.5% para
un correcto ajuste en la boca. (Anusavice, 2004)
Al colocar la prótesis en Boca, intervienen dos propiedades: absorción y solubilidad. La
absorción de agua se da lentamente, de manera que a los diecisiete días queda saturada
dándole flexibilidad, por el contrario cuando se le deja secar a la prótesis se produce
deshidratación y disminución de volumen. Los polímeros acrílicos son insolubles en los
líquidos que entran en contacto con la cavidad oral. (Cova, 2010)
Porosidad y Superficie
Diversas equivocaciones en el procesado y manipulación de la mezcla del polímero (falta de
homogeneidad en el proceso de polimerización, presión inadecuada, vaporización del
30
monómero por aumento de temperatura), conlleva a la aparición de poros, lo que causa
dificultad en la limpieza. (Serrano, 2002)
Los mecanismos de fijación de la placa bacteriana a la superficie son los siguientes:
Formación de una película orgánica
Fijación directa de los organismos a la superficie.
Penetración o anclaje mecánico en los defectos de la superficie.” (Serrano, 2002, pág.
12)
Propiedades Mecánicas
El polimetacrilato de metilo es un material frágil y relativamente rígido, su resistencia a la
tracción es de 55 megapascal (Mpa) y la compresión 76 Mpa con deficiente resistencia al
impacto lo que facilita las fracturas. (Vega del Barrio, 1996)
Estética
El polimetacrilato de metilo es transparente, lo que provee un color similar con las
estructuras orales mediante la incrementación de pigmentos rosados. (Vega del Barrio,
1996)
Densidad
Las resinas acrílicas para bases de prótesis deben ser poco densos, para que estas no pesen
demasiado. La densidad de los polímeros acrílicos se sitúa en 1.18 gr/cm3. (Vega del Barrio,
1996)
CAPITULO III
3. DISEÑO METODOLÓGICO
3.1. Lugar y tipo de Investigación
La presente investigación fue realizada en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad
San Francisco, en el mes de Junio del presente año.
31
3.1.1. Tipo de investigación
Estudio Experimental de Tipo Microbiológico: Ya que es un estudio in vitro, que será
realizado en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad San Francisco, bajo
condiciones de control.
Estudio Transversal: El presente estudio fue realizado en aproximadamente Tres
semanas del mes de Junio del presente año.
3.2. Población del Estudio
3.2.1. Universo
La efectividad inhibitoria del aceite esencial de la hierba luisa al 100% se valoró a través
de la reacción que mostraron las cepas de Candida albicans, hongos oportunistas que
forman parte de la flora normal de la cavidad bucal.
3.2.2. Tipo de Muestra
Se aplicó selección aleatoria no probabilística por conveniencia.
3.2.3. Unidades de Estudio
Se empleó el aceite esencial de Hierba luisa al 100% extraído en uno de los
Laboratorios de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del
Ecuador. Se tomó como control positivo al Hipoclorito de sodio al 0,1% y como
control negativo el agua destilada.
Se trabajó con bloques de resina acrílica de 25mm de ancho, 25 mm de largo y 3mm
de espesor, con una de sus superficies totalmente pulida y la otra superficie rugosa,
ya que estos son representación de las prótesis dentales.
La cepa de Cándida albicans ATCC® 10231 fue obtenida a través de la importadora
MEDIBAC.
32
3.3. Criterios de Inclusión y Exclusión
3.3.1. Criterios de Inclusión
Probetas (Bloques de resina acrílica de termocurado, color rosado).
Deben presentar medidas de 25 mm de ancho, 25 mm de largo y 3 mm de grosor
Forma cuadrada y Bordes rectos.
Las probetas deben tener toda una superficie totalmente pulida y la otra rugosa como
las prótesis dentales.
Aceite esencial de Hierba luisa al 100% fue obtenido en uno de los Laboratorios de
la Facultad de Ingeniería Química por el Docente Dr. Stahl Ullrich.
Todas las probetas deben estar contaminadas con cepas de Cándida albicans ATCC®
10231.
Cepas de Cándida Albicans ATCC® 10231 puras que no hayan tenido contacto con
ningún tipo de reactivo ni medicamento.
Cepas de Cándida Albicans ATCC® 10231 que estén activadas y en su fase
logarítmica.
Cepas de Cándida Albicans que hayan tenido entre tres y cuatro pases en medio
nutritivo líquido, a partir de la activación de la cepa.
3.3.2. Criterios de Exclusión
Probetas contaminadas con otro tipo de microorganismo que no sea Cándida
Albicans ATCC® 10231
Aceite esencial de Hierba luisa que su concentración no sea al 100%
Aceite esencial de Hierba luisa al 100% que haya estado expuesto a la luz solar
y que no haya sido almacenado en frasco ámbar.
Aceite esencial de Hierba luisa contaminado con algún tipo de microorganismo.
Hipoclorito de sodio (control positivo) a una concentración diferente al 0.1%
Cajas Petri y probetas que no hayan sido sometidas al proceso de autoclavado.
33
3.4. Operalización de las Variables
VARIABLES DEFINICIÓN VARIABLE ESCALA DE
MEDICIÓN
INDICADOR
DEPENDIENTE
Efecto
Inhibitorio
Es la capacidad de impedir el
crecimiento de la Cepa de
Cándida Albicans ATCC®
10231 que está contaminando a
las Probetas (bloques de resina
acrílica), al sumergir en Aceite
esencial de Cymbopogon citratus
al 100% y luego colocado cada
bloque en sus respectivas cajas
petri con TSB+Bacto Agar, luego
de 24h se evaluarán los
resultados de crecimiento o
inhibición de colonias de
Cándida albicans ATCC®
10231.
Nominal
Cuantitativa
UFC/ml
Formación
de Colonias
INDEPENDIENTE
Aceite esencial de
Hierba Luisa al
100%
Sustancia que tiene la capacidad
de evitar el crecimiento o
provocar la muerte de la cepa de
Cándida Albicans ATCC®
10231 gracias al citral que es el
principal componente del Aceite
esencial de Hierba luisa al 100%.
Será obtenido mediante la técnica
destilación por arrastre de vapor
mediante la cual se separan
sustancias orgánicas insolubles
Nominal
Aceite esencial
hierba luisa
100% a los 5
min
Aceite esencial
hierba luisa
100% a los 10
min
Aceite esencial
hierba luisa
100%
34
3.5. Materiales y Método
3.5.1. Materiales
Aceite esencial de Hierba Luisa 100% puro
Cepas de Cándida Albicans ATCC® 10231.
Caldo de cultivo TSB (Tryptic Soy Broth).
Bacto Agar
Bloques de resina acrílica de termocurado de 25mm de ancho, 25mm de largo y 3mm
de grosor
Equipos de Laboratorio de Ingeniería Química
Estufa
Hidrodestilador
Vaso Florentino
Computador
Cámara digital
Balanza
Termómetro
Cronometro
Frasco de Vidrio color Ambar
Equipos y materiales de Laboratorio de Microbiología
en agua y ligeramente volátiles,
de otras no volátiles como resinas
o sales inorgánicas.
Aceite esencial
hierba luisa
100% a los 15
min
Aceite esencial
hierba luisa
100% a las 8h
35
Probeta de 1 litro
Mechero de Bunsen
Balanza
Micropipeta
Vaso de precipitados
Cajas Petri
Pipeta de 1 y 5 ml
Tubos de ensayo
Pinzas
Vasos de Precipitación
Vasos plásticos con tapa hermética
Agua destilada
Hipoclorito de sodio
Estufa
Autoclave
Incubadora
Refrigeradora
Microondas
Matraz Erlenmeyer
Utilería: mandil, gorra, guantes, cuchillo, fundas plásticas, servilletas, libreta de
apuntes.
3.5.2. Muestras de Resina Acrílica
Los 36 dispositivos de acrílico de termocurado usados en el presente estudio se adquirieron
del Laboratorio dental Mafla, en donde fueron fabricados mediante un proceso similar al
enmuflado de una prótesis total, con medidas de 25mm de ancho, 25mm de largo y 3mm de
grosor, con una de sus superficies totalmente pulida y la otra rugosa es decir sin pulir. Para
poderlos utilizar los bloques de resina son sometidos al proceso de autoclavado por 15 min
a una temperatura de 121 ºC.
36
3.5.3. Obtención del Aceite esencial de Hierba luisa
3.5.3.1. Recolección de la materia prima
La recolección de la materia prima se realizó a partir de plantas frescas. Se recolectó
aproximadamente 20 kg de hojas de Hierba luisa con sus respectivos talluelos, esto fue
realizado en el Cantón Mira, Provincia del Carchi en horas de la mañana.
3.5.3.2. Extracción del aceite esencial de Hierba luisa o Cymbopogon
citratus al 100%
La materia prima fue trasladada al Laboratorio 302 de la Facultad de Ingeniería Química de
la Universidad Central del Ecuador, en donde fue lavada, secada y desinfectada, para luego
las hojas ser secadas por tres horas en estufa a 60ºC.
Para la obtención del Aceite esencial de Hierba luisa se utilizó la técnica de destilación por
arrastre de Vapor ya que esta técnica es la más conocida para la extracción de aceites
esenciales de diversas plantas medicinales.
Se utilizó un equipo de destilación como se puede observar en la Ilustración 9, en donde se
mantuvo una temperatura de 25 º C a 30 º C con la finalidad de evitar pérdidas de aceite
esencial por volatilización. Se realizó tres destilaciones cada una con una duración de 3h, se
utilizó 20 kg de hojas frescas de hierba luisa cortadas en trozos pequeños en cada operación,
Ilustración 9: Bloques de resina acrílica
Fuente: Laboratorio Dental Mafla
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
37
el aceite con el agua fueron recibidos en un vaso florentino en donde se logra la separación
física por el principio de diferencia de densidades, el aceite decantado fue envasado en un
frasco de vidrio color ámbar, finalmente se obtuvo un total de 300 ml de aceite esencial.
3.5.4. Cepa Bacteriana
La cepa de Candida albicans ATCC® 10231 fue obtenida mediante la empresa MEDIBAC,
revitalizada en caldo TSB (Typtic Soy Broth) durante 48h a 36 ºC. Para posteriormente ser
sembrado en Agar Nutritivo BHI y ser utilizada la cepa luego de 72h cuando esta esté en la
fase logarítmica, fase ideal para su uso.
Ilustración 11: Cepa ATCC 10231 de Candida
albicans en Agar Nutritivo BHI
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la
Universidad San Francisco de Quito
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
Ilustración 10: Obtención del aceite esencial de hierba luisa
mediante destilación a vapor de agua
Fuente: Laboratorio de la Facultad de Ingeniería Química de la
Universidad Central del Ecuador
Elaborado: Autora Vanessa Burbano
38
3.5.5. Preparación de los Medios de Cultivo
Se preparó el medio nutritivo TSB (Tryptic Soy Broth) de acuerdo a las indicaciones del
fabricante 30 g de polvo en 1L de agua; después de realizar los cálculos, se procedió a pesar
18g de polvo y se colocó en 600ml de Agua destilada, esto para dos frascos y se agitó para
conseguir homogenizar la preparación.
Por otro lado se pesó el Agar Bacto agar que ayudará a gelificar el medio de cultivo, de
acuerdo a las recomendaciones del fabricante se debe tener en cuenta que 1,5g de polvo
deberá ser disuelto en 100ml de agua destilada; se hicieron los respectivos cálculos y se
determinó que hay que preparar 9g de Bacto agar para cada frasco con medio Nutritivo TSB
se agita hasta que la mezcla quede totalmente homogénea.
Se rotuló cada frasco contenido con TSB + Bacto Agar y se envió autoclavar por 15min a
una temperatura de 121ºC.
Ilustración 12: 9% de Bacto agar en polvo
Fuente: Laboratorio de la Universidad San Francisco
de Quito
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
39
Luego de ser autoclavados los frascos con el medio TSB + Bacto agar estos serán guardados
en la estufa a hasta el momento de ser utilizados.
3.5.6. Preparación de Probetas a ser utilizadas
Se procedió a tomar tres frascos de boca ancha autoclavados previamente, y junto al mechero
de Bunsen encendido, se pipeteó y colocó 2ml en cada uno de los frascos con las respectivas
sustancias; en el primer frasco se pipeteó 20ml de aceite esencial de Hierba luisa o
Cymbopogon citratus al 100%, en el segundo frasco 20ml de Hipoclorito de Sodio al 0,1%
y en el tercero 20ml de Agua destilada, luego con una pinza estéril se colocó en cada uno de
los frascos 12 bloques de resina acrílica auto clavados, una vez colocados los bloques se
procederá a pipetear 2µl de cepa de Cándida Albicans ATCC® 10231 igual en cada uno de
los frascos y se procederá agitar suavemente.
Ilustración 13: Colocación del Bacto Agar
Fuente: Laboratorio de la Universidad San Francisco de
Quito
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
40
3.5.7. Preparación de Cajas Petri
El procedimiento se realizó por triplicado utilizando la Técnica de Coeficiente fenólico.
Una vez colocados los bloques se procederá a pipetear 2µl de cepa de Cándida Albicans
ATCC® 10231 igual en cada uno de los frascos y se procederá agitar suavemente.
A los 5 min. De colocada la cepa de Cándida albicans en cada uno de los frascos con las
respetivas sustancias, aceite esencial de Hierba luisa al 100%, Hipoclorito de sodio al 0.1%
Ilustración 15: Probetas contenidas en cada sustancia
Hipoclorito de sodio al 0.1%, Agua destilada y Aceite
esencial de Hierba Luisa al 100%
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la Universidad
San Francisco de Quito.
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
Ilustración 14: Frascos con Hipoclorito de sodio al 0,1%, Agua
destilada y Aceite esencial de hierba luisa al 100%
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la Universidad San
Francisco de Quito.
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
41
(control negativo) y el agua destilada (control positivo). Se tomarán del Primer frasco
(Hierba luisa) con una pinza estéril tres bloques de resina acrílica auto clavados y se los
colocará cada uno en su respectiva caja petri previamente rotulada, el procedimiento se
repetirá para todos los bloques de las 2 sustancias restantes, posterior a este paso, se colocará
en las 12 cajas petri el agar nutritivo (medio de cultivo TSB + Bacto agar) el cual debe estar
a una temperatura de 40ºC, cubriendo las ¾ partes de la caja petri, tapamos y dejamos reposar
un momento hasta que el agar nutritivo gelifique. Todo el procedimiento se realizará junto
al mechero encendido para evitar contaminación. Al paso de 10 min. De colocada la Cándida
Albicans en los tres frascos, repetimos el procedimiento antes descrito y después de 15 min
de igual manera, todo el procedimiento se lo realizará para las tres sustancias, se espera hasta
que el agar nutritivo haya gelificado completamente.
Ilustración 16: Rotulación de Cajas Petri
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la
Universidad San Francisco de Quito.
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
Ilustración 17: Cajas petri rotuladas y autoclavadas
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la Universidad San Francisco de
Quito.
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
42
Ilustración 18: Colocación de las respectivas sustancias en cada
frasco
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la Universidad San
Francisco de Quito.
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
Ilustración 19: Comprobación de temperatura del medio de
cultivo TSS+Bacto Agar
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la Universidad
San Francisco de Quito.
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
43
Ilustración 20: Colocación de las probetas
contaminadas con C. albicans en cada caja Petri
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la
Universidad San Francisco de Quito.
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
Ilustración 21: Colocación del Medio de Cultivo
TSB+Bacto Agar
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la
Universidad San Francisco de Quito.
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
44
3.5.8. Incubación
Luego de que el TSB+ Bacto Agar haya gelificado, se procedió a dejar en incubación las 24
probetas previamente rotuladas, a 36 ºC por 24 horas y el frasco con el agar nutritivo sobrante
fue guardado en la estufa hasta volverlo a utilizar luego de 8 horas.
Después de 8 horas de que se colocó la Cándida albicans en los frascos, se realizó todo el
procedimiento descrito anteriormente de igual manera para las 3 sustancias, se esperó a que
el agar nutritivo gelifique, una vez gelificado se dejó en incubación por 24 horas a 36 ºC.
Ilustración 23: Incubación de cajas petri por 24
horas
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la
Universidad San Francisco de Quito.
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
Ilustración 22: Cajas petri con medio de cultivo
TSB+Bacto Agar gelificado
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la
Universidad San Francisco de Quito.
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
45
3.5.9. Lectura de los Resultados
Después de 24 horas de colocadas las cajas Petri en la incubadora, se procedió a recolectar
los resultados, contando en cada caja Petri el número de colonias que han crecido con ayuda
del contador de colonias para facilitar el trabajo. Se registró los resultados en la tabla
previamente elaborada.
3.5.10. Eliminación de Desechos
Una vez que se terminó de realizar el procedimiento, se procedió a desechar las muestras
que al estar contaminadas deben ser Autoclavadas a 121 °C durante 15 min. Antes de ser
Ilustración 24: Conteo de colonias en cajas Petri
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la
Universidad San Francisco de Quito.
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
Ilustración 25: Ausencia de Crecimiento de la levadura después de 8 horas de sumersión
del Bloque de resina acrílica en aceite esencial de hierba luisa al 100%
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la Universidad San Francisco de Quito.
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
46
llevados al Almacén Temporal de los R.P.B.I., una vez autoclavadas todas las cajas Petri, el
contenido es colocado en fundas negras bien cerradas y desechadas de manera normal
evitando de esta manera el daño a la salud del personal del laboratorio y personal sanitario.
Por otra parte se debe lavar las cajas Petri y todo el instrumental utilizado.
CAPITULO IV
4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
4.1. RESULTADOS
4.1.1. Análisis de Resultados
Tomando como referencia los resultados suministrados por el Laboratorio de Microbiología
de la Universidad San Francisco de Quito, mediante informe técnico, se organizó dicha
información en una base de datos en SPSS 22 de la casa IBM ®, en la que se hizo constar el
número de probetas (bloques de resina acrílica), el grupo al que perteneció esa probeta y el
tiempo de inmersión al que fue sometida la muestra (36 probetas) para descontaminación.
Los resultados se muestran en las siguientes tablas y gráficas:
Ilustración 26: Almacenamiento del material
contaminado previo a ser autoclavado
Fuente: Laboratorio de Microbiología de la Universidad
San Francisco de Quito.
Elaborado por: Autora Vanessa Burbano
47
Para el uso del aceite esencial de hierba luisa se observó un nivel de contaminación
moderado, que creció con el tiempo (hasta los 15 minutos) pero para las 8 horas
(480minutos) ya no se presentó colonia alguna, es decir se evidenció desinfección total de
los bloques de resina acrílica.
Con fines didáctico-explicativos se procedió a estimar el valor medio de las colonias
formadas para los grupos de aceite esencial de hierba Luisa al 100% y agua destilada,
considerando para este propósito que el número de colonias formadas en la probeta signada
como 4 se fijará en 1000 (Probeta con colonias Incontables).
En forma general se observó que en el grupo control positivo (hipoclorito) no se formaron
colonias del microorganismo para ninguno de los tiempos, en el control negativo (agua
destilada) el nivel de contaminación fue alto, con cierta estabilidad en el número de colonias
formadas a los distintos tiempos.
Nº Cajas
Petri
Grupo
5 minutos 10 minutos 15 minutos 480 minutos
1 Hierba Luisa 5 32 114 0
2 Hierba Luisa 34 53 60 0
3 Hierba Luisa 46 13 62 0
4 Agua 743 710 610 incontables
5 Agua 902 656 570 548
6 Agua 661 670 625 720
7 Hipoclorito 0 0 0 0
8 Hipoclorito 0 0 0 0
9 Hipoclorito 0 0 0 0
Tabla 1 Índice de Coeficiente Fenólico
Fuente: Investigación
Elaborado por: Ing. Juan Túquerres
48
Grupo
Estadístico
5
minutos
10
minutos
15
minutos
480
minutos
Hierba
Luisa Media 28,3 32,7 78,7 0,0
Agua
destilada Media 768,7 678,7 601,7 756,0
La tabla anterior indica el valor medio del número de colonias observadas, se notó una alta
dispersión de los valores dentro de cada grupo y para un tiempo de inmersión determinado.
Además se observó una tendencia interesante para la Hierba Luisa el número de colonias
formadas aumentaba en el transcurso del tiempo hasta los 15 minutos, luego decreció hasta
llegar a 0 colonias formadas al cabo de 8 horas.
5 minutos 10 minutos 15 minutos 480 minutos
28,332,7
78,7
0,0
Hierba Luisa
Tabla3. Valor medio de las colonias formadas por grupo y tiempo de exposición
Fuente: Investigación
Elaborado por: Ing. Juan Túquerres
Tabla 2. Valor medio de las colonias formadas por grupo y
tiempo de exposición
Fuente: Investigación
Elaborado por: Ing. Juan Túquerres
49
Para Hierba Luisa los valores fueron de 28,3 ufc/ml a los 5 minutos, 32,7 ufc/ml a los 10
minutos, 78,7 ufc/ml a los 15 minutos y 0 ufc/ml (cero) a las 8 horas.
Nº
Grupo
5 minutos
10 minutos 15 minutos
480
minutos
4 Agua 743 710 610 1000
5 Agua 902 656 570 548
6 Agua 661 670 625 720
Media 768,7 678,7 601,7 756,0
En este grupo se observó también una alta dispersión de los resultados, especialmente para
los 5 y 480 minutos.
Valor medio de las colonias formadas por tiempo de exposición para el grupo de control
negativo (Agua Destilada).
Para el agua destilada los valores referenciales fueron 768,7 ufc/ml a los 5 minutos, 678,7
ufc/ml a los diez minutos, 601,7 ufc/ml a los 15 minutos y 756 ufc/ml a las 8 horas. Estos
5 minutos 10 minutos 15 minutos 480
minutos
768,7678,7
601,7
756,0
Agua destilada
Tabla 4 Valor medio de las colonias formadas por
tiempo de exposición para el grupo de Agua Destilada
Fuente: Investigación
Elaborado por: Ing. Juan Túquerres
50
valores fueron mucho más altos que los valores registrados para el grupo experimental
(Hierba Luisa), pero parecen muy similares (casi constantes) a lo largo del tiempo.
Se empleó la Prueba De Kruskal Wallis para comprar las ufc/ml formadas dentro de cada
grupo en los distintos tiempos de evaluación.
Adicionalmente, se desarrolló la prueba no paramétrica de U Mann Whitney para cada uno
de los 4 tiempos experimentales en la comparación del número de colonias formadas entre
los dos grupos del aceite esencial de Hierba luisa al 100% y del Agua destilada, obteniéndose
las siguientes significancias:
Estadístico 5minutos 10 minuto 15 minutos 8horas
Significancia ,049 ,049 ,049 ,037
Para todos los tiempos de comparación, se determinó una significancia p<0,05, con lo que
se pudo inferir que existe diferencia significativa en el número medio de colonias formadas
entre los dos grupos, por lo que se concluye que el uso de hierba luisa es más efectivo que
de no usar algún agente bactericida.
Estadístico
Hierba Luisa
Agua
destilada
Chi-cuadrado 23,86 3,86
gl 3 3
Significancia ,000 ,010
Tabla 2 Resultados de la prueba de Kruskal Wallis
Fuente: Investigación
Elaborado por: Ing. Juan Túquerres
Tabla 3 Resultados de la prueba U Mann Whitney
Fuente: Investigación
Elaborado por: Ing. Juan Túquerres
51
4.2. DISCUSIÓN
Han sido varios los investigadores que se han centrado en evaluar la actividad inhibitoria in
vitro del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf, como (Alzamora L. M., 2001),
quien al realizar su investigación sobre la eficacia antifúngica de los aceites esenciales entre
ellos el aceite esencial de hierba luisa contra bacterias y hongos, obtuvo que el aceite esencial
de hierba luisa es efectivo contra Candida albicans, coincidiendo con la presente
investigación en donde el aceite esencial de hierba luisa al 100% es efectivo para inhibir las
cepas de Candida albicans que están contaminando los bloques de resina acrílica, por lo que
a pesar de utilizar diferentes metodologías el responsable de inhibir a la Candida albicans es
el Citral componente principal del aceite esencial de hierba luisa.
En su Investigación (Chamba, 2015), evalúo el efecto antifúngico producido por el aceite
esencial de “Cymbopogon citratus” (hierba luisa), “Origanum vulgare” (orégano) sobre
“Candida albicans”, encontrando un efecto antifúngico del orégano y de la hierba luisa sobre
Cándida albicans, en comparación con la nistatina, además los mejores resultados fueron
obtenidos por la hierba luisa utilizando la Técnica de Kirby Bauer a comparación con la
presente investigación que se utilizó la técnica de coeficiente fenólico se obtuvo igual
eficacia del aceite esencial de hierba luisa al 100%.
La presente investigación concuerda con (Aguilar, 2013) en donde al igual se demostró que
tanto el aceite esencial como el extracto etanólico son activos frente a Candida albicans el
cual desde una concentración de 50% presenta una buena actividad contra este hongo,
mientras que para el extracto etanólico se requiere usar una concentración al 100%.
Rojas et al. (2010), realizó un estudio para determinar la acción antibacteriana y antifúngica
de plantas medicinales siendo la hierba luisa parte de esta investigación, los resultados
obtenidos muestran un efecto inhibidor de agentes patógeno, demostrando a su vez la
versatilidad que tiene hierba luisa al actuar contra bacterias, hongos y en este caso parásitos,
en esta investigación realizada los resultados concuerdan con lo mencionado anteriormente
deduciendo que la hierba luisa si posee efecto antifúngico sobre cepas de Cándida albicans.
52
Abe et al (2003) demostraron en un trabajo investigando sobre el componente encontrado en
un porcentaje mayor como es el citral el cual hace mencionar sobre la actividad fungicida
que posee la hierba luisa entre uno de ellos está el efecto inhibitorio en el crecimiento de
levaduras de cándida albicans, y pues de acuerdo a lo investigado efectivamente es el citral
el componente principal y el responsable de la inhibición de las cepas de Candida albicans.
53
CAPITULO V
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. Conclusiones
Al realizar la evaluación de efectividad inhibitoria del aceite esencial de hierba luisa al
100% se determinó que tiene un gran poder antifúngico y podría ser utilizado como
bactericida al estar en contacto 8 horas el bloque de resina acrílica con el aceite esto se
da debido al trabajo que ejerce el citral que es el principal componente del aceite en la
pared celular de la cándida albicans.
Se analizó después de 24 horas de incubación de las cajas Petri la formación de colonias
de Candida albicans en donde se pudo observar que: el aceite esencial de hierba luisa al
100% al estar en contacto 5 min se formaron 5, 34 y 46 ufc/ml en cada caja petri; a los
10 min 32, 53 y 13 ufc/ml; a los 15 min 114, 60 y 62 ufc/ml y a las 8 horas no existió
ufc, lo que explica que la actividad antimicótica del aceite esencial de hierba luisa esta
dado gracias al citral que es el principal componente de dicho aceite, como han
mencionado varios autores.
Existe una diferencia importante en los niveles medios del número de colonias formadas
entre ambos grupos. Para Hierba Luisa los valores fueron de 28,3 a los 5 minutos, 32,7
a los 10 minutos, 78,7 a los 15 minutos y 0 (cero) a las 8 horas. En tanto que para el agua
destilada los valores referenciales fueron 768,7 a los 5 minutos, 678,7 a los diez minutos,
601,7 a los 15 minutos y 756 a las 8 horas. Determinando de esta manera que el Aceite
esencial de Hierba Luisa si contribuye a la desinfección de los bloques de Resina acrílica.
Según los resultados obtenidos se demostró que existe diferencia significativa en el
número medio de colonias formadas entre los dos grupos del aceite esencial de hierba
luisa al 100% y del agua destilada que sirvió como control negativo, por lo que se
concluye que el uso de hierba luisa es efectivo como agente antifúngico para la Candida
albicans contenida en los bloques de resina acrílica.
54
5.2. Recomendaciones
Se recomienda para futuras investigaciones con aceite esencial de hierba luisa al
100% se haga la experimentación tomando la muestra de Candida albicans de
pacientes con estomatitis subprotésica ya que estas especies son más agresivas
que las que podemos conseguir aisladamente.
Realizar para futuras investigaciones la comparación del aceite esencial de
Hierba luisa al 100% con el aceite esencial de orégano al 100% para la
desinfección de las prótesis dentales contaminadas con Candida albicans.
Comparar la actividad antifúngica del aceite esencial de hierba luisa al 100%
extraído artesanalmente con el aceite esencial de hierba luisa al 100% comercial
sobre cepas de Candida albicans.
55
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Vidotto, V. M. (2003). Adherence of Candida albicans and Candida dubliniensis to buccal
and vaginal cells. Rev Iberoam Micol., 20, 52.
62
ANEXOS
ANEXO 1: Certificación de Cepa de Candida albicans
63
ANEXO 2: Aprobación del Estudio por parte del Comité de Bioética de la Facultad de
Odontología de la Universidad Central del Ecuador
64
65
ANEXO 3: Certificado de Aprobación por el Subcomité de Ética de Investigación en Seres
Humanos de la Universidad Central del Ecuador del Anteproyecto de Investigación.
66
ANEXO 4: Certificado para Ingresar al Laboratorio de la Facultad de Ingeniería Química
de la Universidad Central del Ecuador
67
ANEXO 5: Certificado para Realizar la parte Experimental de la Investigación
68
ANEXO 6: Autorización para el Ingreso al Laboratorio de Microbiología de la Universidad
San Francisco de Quito
69
ANEXO 7: Renuncia del Ingeniero Juan Túquerres a los derechos de autoría del Trabajo de
Investigación
70
ANEXO 8: Certificado de traducción del resumen
![Uso de resina acrílica no preenchimento de cavidade orbital após … · 2019. 11. 18. · compreendem o hemangioma (HA), o hemangiossar-coma (HSA) [5,7,13] e o angioceratoma [2]](https://img.pdfslide.us/doc/110x75/60e391244b65161b107fa99d/uso-de-resina-acrlica-no-preenchimento-de-cavidade-orbital-aps-2019-11-18.jpg)
