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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD ETAPALAPA
DIVISION CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD
‘ I ACTIVIDAD DE LA AROMATASA EN CELULAS DE SERTOLI IN VITRO. EFECTO DE INSULINA, EGF Y TGF-P / /
S E R V I C I O S O C I A L QUE PARA OBTENEREL TITULO DE LIC. EN BIOLOGIA EXPERIMENTAL P R E S E N T A :
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MEXICO, D.F. 1994
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ESTE TRABAJO EmERIME9lTAL FUE REALIZADO EN EL LABORATORIO DE MECANISMOS DE REGULACION TESTICULAR
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD UNIVERSIDAD AUTONOMA METROFQLITANA - IZTAPALAPA
ASESORADO: M. EN B.E. ENRIQUE MENDIETA MARQUE2 PROF. TITULAR C, T. COMPLETO
AREA DE BIOLOGIA CELULAR DEPTO. CIENCIAS DE LA SALUD
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DEDICATORIA
Dedico este trabajo especialmente a mis padres, ya que sin sus esfuerzos y apoyo hacía mí me han ayudado a culminarunametamaSenlavida. Gracias.
A mi hermano Guillermo por todo lo que nos ayudb en los momentos m& dificiles de la familia.
A mi hermana Beatriz por su ayuda, comprensih y regaíios para que culmiwh satisfactoriamente la carrera.
A mis hermanos Armando, Luz María, Jaime y Juan Carlos por alentarme a seguir adelante.
Al Biol. Experimental J d Luis Shchez Acenjo por su cariÍío, comprensibn y ensdamis para alcanzar una meta d s .
Al grupo de trabajo del Lab. de Mecanismos de Regulacibn Testicular por sus consejos para culminar este trabajo.
Al M. en B. E. Enrique Mendieta Mhrquez por su paciencia, dedicacibn, comprernsibn y ayuda dados a lo largo de toda mi carrera y haberme dado mi formacibn en esta etapa de mi vida. Mil gracias.
A la M. en C. Elvira Gormilez Soto por todo el cariflo y comprensibn en los momentos díficiles para mí.
A mis amiga(o)s: Sandra Mayorga F., Alma Rosales, Claudia Femández, Sara Rodriguez, Rosa María Gutidrrez, Victoria Campos y Miguel Angel Carre6n. Gracias a ustedes por corn- vivencias y momentos a lo largo de la car re ra .
Al Círculo de Ciencias (CCH-N) por los estimulos, amistad dados para seguir adelante.
A mi gran amiga Edith Cortds bar be re^ por su apoyo, comprensih, confianza y porque ha estado siempre conmigo en las buenas y en las malas. Para ti todo mi cado.
Vero.
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3.1
3.2
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3 . 4 CUAblTIFICACIOH DEL E PRESEMTE E# LOB NED108 DE CULTIVO
PEBULTADOS
DI8CUSION
CONCLUSIONEB
7. BIBLIOOWIA
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l. IHTRODUCCIOM
En el transcurso del tiempo se han desarrollado diversas metodologías, en las cuales se ha tratado de demostrar que sustancias con actividad fisiol6gica como la Hormona Luteinizante (LH) y la Hormona Folículo Estimulante (FSH) y algunos factores de crecimiento puedan afectar la esteroidog6nesis.
Ademds de que en la actualidad se han implementado un mayor ntímero de t6cnicas que hacen posible dilucidar qué sustancias o molc5culas son las que estdn afectando este proceso y que 6rgano blanco posiblemente afecten-
La regulacidn hormonal de la aromatización testicular es llevada a cabo por la FSH y otros factores solubles (por ejemplo 3 9 , 5' ,Adenosin Monofosfato cklico (AMPc) Testosterona (T) etc. ) en celulas de Sertoli (CS) . La mayor actividad de la aromatasa se encuentra en l a s primeras etapas del desarrollo.
Debido a que se conoce relativamente poco acerca de cudles son los mecanismos intragonadales por los cuales se lleva a cabo esta regulacitjn, este proyecto intenta evaluar si factores solubles tales como insulina, factor de
transformaci6n beta (TGF-8) influyen en la actividad de la aromatasa de las CS.
I crecimiento 'epidermal (EGF) y factor de crecimiento y
l. 1 AX8ATOIIIEL DEL TS8TICUtO (fig 1)
El testlculo es una gldndula tubular Compuesta, rodeada de una gruesa cdpsula fibrosa, la t6nica albuglnea. En la cara posterior del 6rgan0, un engrosamiento del tejido conjuntivo penetra en la gldndula y forma el mediastino del testkulo. Unos delgados tabiques fibroses, llamados septula testis se extienden radialmente a partir del mediastino hasta la tdnica albugfnea, y dividen al drgano en unos 200 compartimentos piramidales, los lobulillos testiculares. Hacia la periferia, las septulas pueden ser incompletas, de tal manera que en ella se intercomunican los lobulillos, pero donde sus vertices se refinen en el mediastino, los lobulillos estdn separados completamente.
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Cada lobulillo est6 constituldo por uno o cuatro ttíbulos seminiferos sumamente retorcidos. Miden de 150 a 250 pm de dibmetro, 30 a 70 cm de largo, y son extremadamente tortuosos. Los túbulos seminlferos constituyen la parte exocrina del testlculo, que es una gldndula citwena, cuyo producto de secrecidn holocrina est6 formado por cdlulas completas, los espematozoides. En el vertice de cada lobulillo, los ttibulos seminlferos pasan repentinamente a transformarse en los ttibulos rectos que constituyen el primer segmento del sistema de conductos excretores. Estos, a su vez, se reúnen en la rete testis, un sistema plexiforme de espacios revestidos por epitelio, dentro del tejido conjuntivo del mediastino.
En la cara interna de la ttínica albuginea, el tejido conjuntivo denso cede su lugar a una capa miir laxa, provista de numerosos vasos sanguineos, la túnica vascular del testlculo. A partir de esta capa, un tejido conjuntivo de caracter semejante se extiende hacia adentro, para llenar todos los intersticios que hay entre l o s tClbulo6 seminfferos. Este contiene fibroblastos, macrófagos, celulas cebadas y c6lulas mesenquimales perivasculares, y ademSs contiene grupos de c6lulas intesticiales, llamadas tambiBn cBlulas de Leydig (CL) . Estas constituyen el tejido endocrino del teStiCUl0 (Bloom y Fawcett, 1990).
Fig 1. Esquema de la sistema ductual excretor
arquitectura del testfculo y del (Tomado de Bloom y Fawcett, 1990)
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Los tdbulos seminiferos estdn rodeados por una o varias capas de celulas adventiciales derivadas de elementos del tejido conjuntivo intersticial primitivo. La organizaci6n de esta envoltura varia de unas especies a otras. En los roedores corrientes de laboratorio, hay una capa única de celulas aplanadas y poligonales que se unen borde con borde para formar una ldmina epiteloide continua que rodea al ttibulo. En su ultraestructura, estas celulas tienen los rasgos caracteristicos del mtisculo liso y son contrdctiles y por ello se les llama c6lulas mioides o células contrdctiles peritubulares.
En el adulto, los ttibulos seminlferos estdn revestidos por un complejo epitelio estratificado, constituido por dos categorias principales de c4ilulas: las células de soporte ( C S ) y las celulas espermatogenicas o celulas germinales
morfol6gicamente: espermatogonias, espermatocitos primarios, espermatocitos secundarios, espermdtidas y espermatozoides, las cuales se asocian para constituir el ciclo de la espermatogénesis.
(CG) I que incluyen varios tipos distinguibles
Ademds de servir como soporte, las CS forman la barrera hematotesticular, nutren a las CG en desarrollo y sirven como un mediador de los efectos de andr6genos producidos en el intersticio. Tanto las CG como el compartimento intesticial producen una variedad de agonistas que pueden modular la actividad de las CS (Skinner, 1990).
1.1.2 COMPARTIIIIENTO IMTERSTICIAL
Las CL se localizan en los espacios angulosos situados entre los tortuosos tdbulos seminiferos. Los vasos sanguineos forman plexos peritubulares en los espacios intertubulares.
Las CL aparecen en grupos de tamafio variable, a veces estrechamente unidas a los vasos sanguSneos. Son ordinariamente de forma poliedrica irregular, de 14 a 20 pm de dibmetro, cuando estdn apretadas unas con otras; pero en la periferia de los grupos o cuando aparecen separadas, pueden ser alargadas o fusiformes (Bloom y Fawcett, 1990).
En la fig 2 se representa la disposici6n de CL y de CS y las fases de la espermatogenesis en el tdbulo seminifero. (Bloom y Fawcett, 1990)
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Fig 2. DISPOSICION DE LAS CS EN EL TESTICULO
1.2 FISIOLOGIA DEL TSSTICULO
El testiculo lleva a cabo dos funciones: una funcidn endocrina y una funci6n exocrina.
FUNCION ENDOCRINA: Reside fundamentalmente en las CL.. Estas sintetizan y liberan la hormona sexual masculina T, que es necesaria en una concentracidn local alta para mantener la espermatogenesis. En la actualidad se conoce la bioslntesis de andr6genos, asi como, el conjunto de intermediarios y los sistemas enzimdticos involucrados en sus transformaciones.
Esta via comienza por la formacidn de la pregnenolona (preg) a partir del colesterol (col) que es el primer paso considerado como parte de la vla esteroidogbnica. La producci6n de estas hormonas se encuentra agrupada a la via
4 en funci6n de la posicidn del doble enlace en el anillo A del ciclopentaperhidrofenantreno. Los intermediarios de esta v$a son progesterona (Prog), 1 7 4 hidroxiprogesterona (170HProg) y Androstendiona (A) .
Las enzimas de la v$a esteroidogdnica que catalizan la transformaci6n de Preg en T se encuentran localizados en la fracci6n citosdlica y en el reticulo endopldsmico liso (Mendieta, 1992).
Las CL no s610 producen ,andr6genos, sino tambien pueden producir prostanglandinas, opidceos y angiotensinas (Skinner, 1990).
Kelch y colaboradores demostraron la secreci6n de estradiol (E) testicular por humanos, simios, caninos y ratas, ya que la concentraci6n de este esteroide en la vena esperm6tica es mayore que en el plasma periferico (Payne et a1,1987; Saez et al, 1989).
El sitio de regulaci6n de la aromatizaci6n testicular ha sido estudiado por numerosos investigadores. Estudios in vitro desarrollados por De Jong y colaboradores indican que la aromatizaci6n ocurre en los túbulos seminíferos que en el tejido intersticial. Dorrington y cols reportaron que en ratas inmaduras, los principales sitios de aromatización son las CS; esta actividad es regulada por FSH y todos l o s factores capaces de incrementar la producci6n de AMPc, mientras que Pierrepoint y colaboradores indicaron que las CL son la fuente de estr6genos testicular en el hombre. Estudios por Pomerantz sobre los efectos de tratamientos in vivo de ratas inmaduras con FSH y LH sugieren que en las ratas muy jovenes, antes de los 18 días de edad, la aromatizaci6n es una funci6n de las CS y CL y que despues de 18 d€as de edad las CS no tienen la capacidad para la aromatizaci6n' estimulada por LH. Ademds el E desempeiia una funci6n mitogenica en ambos tipos celulares (Payne et al, 1987; Dorrington et al, 1978).
Muchos estudios sobre la regulaci6n del desarrollo de las CL por la LH en ratas inmaduras han sido diflciles de interpretar por el hecho de que adem68 de las CL, otras celulas tales como las Cs tambi6n se diferencian durante el desarrollo testicular. La maduraci6n de las CL puede depender grandemente del desarrollo de las CS o de otras CelUlaS testiculares (Rommerts et al, 1987).
Hay evidencias de que los tabulos eeminlferos ejercen un efecto regulador local sobre la estructura y funci6n de las CL, a traves de la producci6n de algunos peptido6 que modulan la produccidn de T por las CL (Verhoeven, 1992).
FUNCION EXOCRINA: Esta funci6n se realiza en los tfibulos seminiferos. para la formaci6n de CG (espermatoghesis), la cual depende de la T producida por las CL en respuesta a su estimulaci6n por la LH; a su vez, la FSH acttía sobre los ttibulos- seminxferos, ligdndose especif icamente a las CS. - La FSH aumenta en las CS la síntesis, entre otros polipeptidos de la protefna unidora de andr6genos (ABP) que es necesaria para mantener una concentraci6n elevada de T en el epitelio seminifero (Verhoeven, 1992).
1.2.1 EJE HIP~~O-HIPOPIBIS-TIBTICULO (Fig 4)
La FSH juega un papel central en la regulacien de la diferenciacibn de las CS y en el mantenimiento de su funcionamiento normal en las celulas de animales adultos. La uni6n de FSH a sus receptores membranales especff icos activa al sistema de adenilato ciclasa, lo que incrementa la concentraci6n intracelular de AMPc y activa la proteincinasa AMPc-independiente, desencadenando una cascada de eventos de fosforilaci6n protelca. La activaci6n de la adenilato ciclasa de las CS esta mediada por algunas proteinas Gs, y quiza tambien con la participación de proteinas del tipo Gi (Mendieta, 1992) (fig 3 ) .
La LH regula la divisi6n celular y maduración de las CL, pero los aspectos moleculares y celulares de estos efectos trdpicos son desconocidos. Se ha considerado que la actividad esteroidoghica de las CL depende de los efectos estimulantes de las hormonas, aplicados en esquemas tanto agudos como cr6nicos.La producci6n de T por las CL depende en primer lugar de la acci6n de la LH sobre las CL a travgs de la fijaci6n a receptores especif icos de la membrana plasmdtica induciendo can ello la formacih de AMPc y la activaci6n de las proteincinasas.
Fig 4. Eje Hipotalamo-hip6fisis-testiculo (Eckert y cols, 1990)
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Fig 3. Cascada de AMPc (Eckert, 1992)
La liberacien de las gonadotropinas por la hip6fisis esta regulada por un mecanismo de retroalimentacibn negativa. Los niveles elevados de T circulante suprimen la liberaci6n de LH, mientras que los niveles bajos de T producen una liberaci6n elevada de LH. La regulaci6n por retroalímentací6n de la FSH se piensa que implica un factor no esteroideo, llamado inhibina, que es secretada por las CS (Verhoeven, 1992). Las ínhibinas A y B son 2 heterodimeros que constan de una subunidad OtA y otra AB. Una proteina relacionada, la activina (las activinah; A y B son homodlmeros de las subunidades 0A y AB respectivamente), muestra un aumento en la secreci6n de FSH en cultivos de la hip6f isis y un aumento en los niveles de FSH en la circulaci6n in vivo. Tanto la activina como la inhibina actiran como reguladores paracrinos y / o autocrinos de la funcidn gonadal (Mather et al, 1990; Skinner et al, 1989)
Estas interacciones de las celulas del mismo o diferente compartimento permite que haya un intercambio de material e informacidn a traves de uniones intercelulares. Alternativamente, estas pueden interactuar por la secreci6n de sustancias que afectan la funcibn de celulas vecinas (Skinner, 1990).
Hay tres .tipos de interacciones conocidas:
AMBIENTALES. Son mediadas por componentes, como la matriz extracelular y moleculas de adhesión celular.
NUTRICIONALES. Transporte de metabolitos esenciales entre diferentes tipos celulares.
REGULATORIAS. Esta mediado por factores paracrinos Via una señal mediada por un receptor.
Las interacciones ambientales en el testXculo principalmente ocurren entre las CS y las células peritubulares (CP) . La citoarquitectura creada por las CS es esencial para el proceso de espermatogénesis y representa una importante interacción para la función del testiculo.
La interacción entre las CS y CP es mediada por un matriz extracelular compleja (membrana basal) entre estas celulas. Tanto las CS como las CP cooperan en la producción de componentes individuales de la matriz extracelular. Esta matriz provee integridad estructural para los tfibulos seminiferos asi como promueve la diferenciaci6n estructural de las CS. Esta interaccidn ambiental parece no regular la funcidn de las CS a un nivel molecular, pero pueden ser crxticos para el mantenimiento de la funci6n del testiculo y el proceso de espermatoggnesis (Verhoeven, 1992).
as interacciones nutricionales ocurren principalmente entre las CS y CG. La creacidn de una barrera hematotesticular por las CS requiere que los componentes esenciales (metabolitos energeticos, vitaminas y minerales) sean transportados a traves de o sintetizad'os por las CS y liberados a las CG en desarrollo secuestrados dentro del tbbulo.
Las cs in vitro poseen una alta tasa glucolltica y producen lactato y piruvato que puede ser detectado en los medios de cultivo. Este proceso es estimulado por la presencia de FSH y dibutiril AMPc (dbAMPc). Este fenómeno se ha interpretado como parte de la contribuci6n que FSH realiza al proceso de la espermatoghesis, ya que tanto el lactato como el piruvato producidos permiten que los espermatocitos paquitenos y las espermdtides redondas, incapaces de realizar glucblisis por si mismas, completen su diferenciacibn.
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Las interacciones r,egulatorias pueden ocurrir entre diferentes tipos celulares en el testiculo,
a. Interacci4n CP-CS. Las CP producen un factor paracrino no mitogbnico, PModS, el cual modula la funci6n de las CS y acttia a trav6s de una dnica seflal de trasducci6n por las CS para aumentar los niveles de 39 5, ,guanosin monofosfato cSclico (GMPc). Se ha postulado que las interacciones regulatorias entre CP y CS estdn mediados via PModS lo que puede ser esencial para el mantenimiento y control de la funci6n testicular. En este tipo de interacci6n tambi6n participan diferentes factores paracrinos potenciales tales como T G F M , TGF-S, entre otros (Skinner, 1990) ,
b. Interacciones entre compartimentos testiculares. Las CL son capaces de modular la actividad funcional de las CS a traves de su producci6n de T , la cual es captada por estas a trav6s de receptores especlf icos, lo que resulta en una estimulaci6n de la actividad de la RNA polimerasa y la sSntesis y secreci6n de ABP y transferrina (Sanborn et al, ”1980) ,
El concepto de que las CS pudieran a su vez influir sobre la actividad de las CL ha venido afirmdndose a partir de la determinaci6n de que dafios estructurales a secciones particulares de ttibulos seminiferos pueden afectar secundariamente la morfologia y capacidad esteroidogenica de las CL adyacentes, pero no de aquellas ubicados en regiones m6s lejanas (Aoki y Fawcett, 1978; Syed et al, 1986).
La diversidad de las respuestas evocadas por las CS sobre las CL parece ser debida a la diversidad de condiciones experimentales existente sobre los modelos utilizados por los diferentes grupos de inVeStigaCi611, en t6rminos de por ejemplo edad de los animales, composici6n de los medios de cultivo, etc (Rommerts et al, 1987).
En la siguiente figura (fig 5) se ilustran las posibles interacciones que se llevan a cabo entre las diferentes estirpes celulares en el testfculo ( Verhoeven, 1992).
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Fig 5. Interacciones llevadas a cabo entre las diferentes estirpes celulares en el testiculo.
102.3 EFBCTO DE FACTOR= HORSOHALBS EN LA FIBIOLOOIA DEL TESTICULO
El sistema reproductor masculino puede ser modulado por diversos factores hormonales tales como EGF, factores de crecimiento semejante a Insulina I y I1 (IGFs-I y 11), TGF-0, andrwenos, insulina, Factor de crecimiento de Fibroblastos (FGF) y somatomedina C, los cuales afectan tanto la actividad de aromatasas celulares, como la sintesis de proteinas especificas, en cultivos primarios de CS provenientes de animales inmaduros (Smith et al , 1990).
Los factores de crecimiento ejercen su efecto mitogenico por su interacci6n con receptores de superficie en celulas especificas. Muchos factores de crecimiento forman familias de mol6culas con estructuras semejantes que se unen a un receptor comiin. La uni6n de un factor de crecimiento a su receptor produce una cascada de eventos que incluye la fosforilaci6n de protehas, rompimiento de fosfatidilinositoles, flujo de iones y cambios en la expresi6n genetica (Heldin and Westermark, 19'89).
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El IGF-I es un Mptido de 70 aminodcidos el cual media muchos de los efectos que promueven el crecimiento regulado por la hormona de crecimiento (GH) . Existen evidenci,as que sugieren que el IGF-I puede estar involucrado en la regulacidn de la esteroidogenesis de las CL (Lin et al, 1990) . La deficiencia de GH est6 asociada con el retraso de la pubertad y la dhbil respuesta a la gonadotropina cori6nica humana (hCG) exbgena. Estos ' datos sugieren que la GH puede estar involucrada directa o indirectamente en el desarrollo y mantenimiento de respuestas gonadotr6picas de las CL.
Esto puede llevarnos a suponer que tanto CL como CS tienen receptores específicos a IGF-I y que este peptido modula la funcidn de ambos tipos celulares. Se ha mostrado que las CS tanto de rata como de cerdo secretan IGF-I. Estos hallazgos nos dan la pauta de que el IGF-I puede actuar como un amplificador autocrino o paracrino de la accidn de la gonadotropina ( Naville et al, 1990).
El transporte de glucosa y la producci6n de lactato por CS cultivadas son estimuladas por el IGF-I vla receptores específicos. Tambien se ha visto que a bajas concentraciones fisiol6gicas de insulina las CS son estimuladas. Por lo tanto la glucolisis y otras actividades bioquímicas de las CS pueden ser modificados tanto por IGF-I como por insulina (Oonk and Grootegoed, 1988).
Se ha determinado que la insulina aumenta la accidn de la FSH sobre celulas de la granulosa (que son andlogas a las CS) , ademds de que interactGa con una baja afinidad con los receptores para IGF-I. Al igual que en el caso de insulina, el IGF-I aumenta la actividad de la aromatasa inducida por FSH . En contraste con esto, EGF inhibe esta actividad inducida por FSH, pero cuando EGF e IGF-I estdn presentes se ha podido observar que hay un aumento en la proliferacien celular.
El TGF-B pertenece a una familia de polipeptidos que modulan el crecimiento y diferenciacibn de una amplia variedad de tipos celulares; entre estos factores se incluyen a la activina e inhibina entre otros (Kramr et al, 1991; How@ et al, 1989).
El TGF-0 se encuentra en varias isoformas (81 - 84) que son codificadas por genes relativamente cerrados, que pueden inhibir o estimular la proliferacibn, promover la formacidn de la matriz extracelular, afectar la diferenciaci6n celular y regular otras funciones celulares tempranas sobre la expresibn de diferentes genes. Se ha sugerido que este factor juega un papel importante en la embriog6nesis (Ohtsuki y Massague, 1992; Mckay y Danielpour, 1991).
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El TGF-A es una proteha hornodimerica de 25 kDa que acttía tanto autocrinamente como paracrinamente, que puede ser considerado como potente modulador de la accidn de 'las gonadotropinas sobre la esteroidogenesis testicular, ya que es secretado por el testiculo (Benahmed et al, 1989; Esposito et al, 1991) .
Estudios realizados con testículo de cerdo inmaduro ( 3- 4 semanas de edad) muestran que TGF-A1 antagoniza la acci6n sobre la actividad de la aromatasa y producci6n de lactato. Las concentraciones de TGF-A1 presentes en el testiculo no han sido atín determinadas. La concentraci6n de TGF-A1 requerida para inhibir la acci6n de la FSH sobre la actividad de la aromatasa de CS es consistente con el rango de la constante de disociación para receptores de alta afinidad a TGF-Al. Por lo tanto el efecto inhibitorio de la acci6n de TGF-A1 sobre la acci6n de las gonadotropinas se encuentra dentro de un rango de concentraci6n esperada bajo condiciones fisioMgicas, lo cual indica que hay probablemente una disminucidn en los niveles de AMPc que es el mediador para la actividad de la aromatasa (Morera et al; 1992).
TGF-A1 estimula en las CS la produccidn de lactato, un substrato de energía esencial para el desarrollo de las CG, y al mismo tiempo ejerce un efecto estimulante la toma de glucosa, la cual exhibe algunas caracteristicas especzficas comparadas a los efectos de insulina y FSH, ademds de que este mecanismo de producci6n de lactato parece estar relacionado con la insulina (Esposito et al, 1991).
Se ha reportado que en las CS, EGF estimula a la producci6n de lactato e inhibe la actividad de la aromatasa. Atín no ha sido bien definido el papel que juega en la fisiologla de las CL. Se ha visto que EGF inhibe la producci6n de esteroides inducida por hCG, tambien existe un efecto inhibitorio en la ausencia de LH y estimulatorio de EGF en presencia de gonadotropinas sobre la producci6n de esta hormona esteroidea (Sordoillet et al, 1991 y 1992).
Experimentos en cultivos de CS de ratas inmaduras y fracciones de tejido disectado han apoyado que las CS son la principal fuente de E testicular, y que la actividad de la aromatasa es relativamente baja en CS de ratas mayores de 20 dXas de edad. En ratas menores de 15 dXas de edad un aumento en el contenido de E testicular es sostenido con FSH, por lo cual se observa que la actividad de la aromatasa puede cambiar durante el desarrollo del testiculo.
Para conocer la respuesta especifica a la presencia de una hormona por alguna determinada estirpe celular, un modelo experimental dtil seria aquel que pudiera evaluar la actividad de la hormona o del factor en forma aislada de otras que pudieran estar presentes en el tejido. Esto ha llevado a tener la necesidad de tratar' de aislar y/o al menos enriquecer las diversas estirpes celulares que forman un 6rgano. Para obtener las estifpes celulares es necesario recurrir a procedimientos mecdnicos y/o enzimdticos para la separacidn celular, seguidos de gradientes de densidad. Este modelo experimental implica que ademds de aisladas las estirpes celulares, estas puedan mantenerse en condiciones adecuadas para responder a algunas pruebas o retos, pudiendo evaluar la respuesta o respuestas celulares durante periodos de incubaci6n hasta de 48 hrs (Herrera et al, 1988).
Los cultivos primarios juegan un papel fundamental en el estudio de la fisiologla celular. Despues de que una poblacidn celular es aislada, es preciso proporcionarle los medios que optimicen su funcionamiento, los cuales deben incluir un sustrato y suplementos adecuados; ademds deberdn considerarse los pardmetros de incubaci6n ( Temperatura, humedad, pH, concentracidn de CZ, y COA , etc,) Se ha encontrado que el medio minimo de Eagle (DME) puede ser dtil para el cultivo de las CL y CS (Garcla y Rodriguez, 1989).
103.1 CULTIVOS CCLWLARCB EN YEDXOS DEFIYIDOS
Anteriormente se habla sugerido que el papel del suero agregado para el desarrollo de las celulas de cultivo era el de proporcionar hormonas y factores de crecimiento indispensables; sin embargo, la eliminaci6n del suero ha permitido desarrollar un sistema completamente definido, al cual se le puede agregar hormonas o factores requeridos en condiciones de alta pureza y concentraciones perfectamente definidos, asi como otro factor que resulte indispensable. Por lo tanto resulta ventajoso para el estudio de los mecanismos de la regulaci6n endocrina intratesticular, el manejo de cultivos primarios de CL y CS en medios de cultivo definidos y sin suero,
Los cultivos primarios de las diferentes estirpes celulares del testiculo se han convertido en una metodología muy utilizada para el estudio de los diversos elementos de la fisiologSa gonadal. Mediante el aislamiento inicial de las celulas y su mantenimiento durante perPodos mds o menos prolongados en condiciones in vitro, diversos grupos de trabajo han podido analizar sus respuestas directas a hormonas, nutrientes u otros factores,
Sin embargo, resulta inevitable cuestionar si esta aproximaci6n experimental, en que las c6lulas son mantenidas en cultivo se asemeja a sus equivalentes presentes en el animal o en el 6rgano intacto. Pero independientemente, que las respuestas a esta pregunta depende de cada enfoque experimental particular que se emplee, los cultivos primarios parecen aportar una importante contribuci6n a procesos importantes en la fisiologfa testicular (Russell y Steinberger, 1989).
En consecuencia, la utilizaci6n de metodologfas simples y fdcilmente reproducibles para la obtencidn de fracciones enriquecidas en determinadas estirpes celulares del testiculo en animales adultos y normales, y su correspondiente evaluaci6n funcional una vez aisladas, permitir6 la validacidn de estos modelos celulares in vitro tanto para el estudio de las condiciones normales de funcionamiento gonadal como tambien para la determinacidn del efecto que diferentes factores end6genos y exdgenos presentan sobre éstas.
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Evaluar el efecto de diferentes factores solubles (Insulina, EGF y TGF-0) sobre la actividad de la aromatasa en CS in vi t ro .
OBJmIVOS PARTICULARES
', - Determinar la produccidn basal de Estradiol (E) en cultivos primarios de CS.
Todas las soluciones utilizadas fueron esterilizadas mediante ultrafiltraci6n, a traves de membranas de filtraci6n Millipore (MF) de 0.22 pm de didmetro de poro.
Se utilizaron ratas macho adultas normales de la cepa Wistar, de aproximadamente 90 días de edad, los cuales fueron sacrificadas por dislocaci6n cervical en grupos de 3 a 5 animales. LOS testículos se extirparon por vía abdominal y la sangre secuestrada en el 6rgano se elimin6 en la mayor cantidad posible mediante varios lavados con una soluci6n amortiguadora Krebs-Ringer pH 7.4, adicionada con glucosa al 0.2% (KRBG: 125 mM NaC1, 5mM KC1, 1.2 mM MgSOy , 35 mM Tris, 1mM NaHz POq ) y gentamicina al 0.05% en condiciones de esterilidad.
3.1 OBTt#CIO# DE LA ?RACCIO# ENRIQUECIDA EN C8 (BermCldez et al, 1988)
Los testículos fueron procesados como se mencion6 anteriormente para eliminar la sangre retenida y fueron descapsulados, para ser posteriormente tratados con una soluci6n de colagenasa (Sigma, tipo Ia) disuelta en KRBG a una concentraci6n final de lmg/ml en un volumen total de 7 m1 por cada par de testículos, y se incubaron en un bafio con agitacien periedica durante 18 minutos a 37OC.
La actividad de la colagenasa fue suspendida al agregar 15 m1 de una solucidn salina isot6nica (NaC1 al 0.9%) por diluci6n mezclando por inversi6n en 10 ocasiones y se dej6 sedimentar la suspensidn a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Posteriormente la suspensi6n tisular se filtr6 a traves de una malla esteril. de Nylon con un poro de entre 50-100 pm de didmetro; el remanente retenido en la malla (fracci6n tubular cruda), se trata posteriormente para la obtencien de cs.
17
La fracci6n tubular cruda retenida se fragment6 mecinicamente con un bisturS hasta obtener pedazos de aproximadamente 5 mm de. longitud, y se realiz6 una digestidn parcial con una solución de KRBG-pancreatina (Sigma) con una concentraci6n final de 0.2 mg/ml, durante 20 minutos a 28OC, con agitacien manual periddica cada 3 minutos. La actividad de la pancreatina fue suspendida por enfriamiento a 4OC durante 10 min. Posteriormente se decant6 el sobrenadante y la suspensidn celular se volvió a fragmentar mechicamente para desprender los grupos de celulas germinales embebidas en los fragmentos tubulares, pasdndola a traves de una aguja de calibre 20 ga. La suspensi6n se coloc6 despues sobre un gradiente discontinuo de WG-sacarosa (2 - 6 % en intervalos simetricos cada uno con un volumen de 5 ml) a 1 x g durante 30 min a 4OC. Una vez transcurrido este tiempo se recuperaron las fracciones correspondientes al 4% y 5% del gradiente de sacarosa por aspiración, la suspensión celular se filtre y sediment6 por centrifugaci6n a 1500 g durante 5 min a 4OC, para recuperar la fraccidn enriquecida de CS (Fig 6)
Testiculos Descapsulados
1 KRBG-Colagenasa (lmg/ml) 18 min, 37OC, c/agitacidn
Adici6n de NaCl 0.9% y dejar reposar a T Amb/10 min
I
1 Filtracien a traves de una malla de didmetro poro de 50-100 pm
Fraccidn Tubular Cruda
Fragmentacidn mechica y con KRBG-pancreatina (0.2 mg/ml) / 20 min, 28OC, c/agitaci6n
1 Suspensien de la actividad enzimdtica
por enfriamiento a 5OC / 10 min I
1
1 Fragmentacien mecdnica por agitaci6n violenta
y paso a traves de aguja calibre 20 ga
Sedimentaci6n a traves de un gradiente discontinQo de sacarosa en KRBG (2-62) /30 min a 4OC
1 Recuperaci6n de las Fracciones correspondientes al 4 y 5%
de sacarosa y filtraci6n a traves de una malla de didmetro de poro de 50-100 9x1
1 Centrifugacidñ a 1500 g a 4OC
1 Resuspensi6n del both celular
I Fig 6. Obtencidn de la Fracci6n Enriquecida de CS.
, . "
La pastilla celular se resuspendid en 5 m1 de medio Hybri-Max (Sigma) y se realiz6 un conteo en una c6mara Neubauer para ajustar la densidad final a 200,000 c&lulas/ml. Los cultivos celulares se realizaron en medios mlnimos sin adici6n de suero, vitaminas o cualquier otro factor que no sea el de reto. Las 'condiciones de cultivo incluyeron atmesfera aire-CQ, (95-52) a'37OC durante periodos de 36 hrs (Garcia y Rodriguez, 1989) .
Las CS se cultivaron en botellas de cultivo Nunc de pldstico y al momento de sembrarse se les agreg6 el factor de reto a tres diferentes concentraciones, ademds del grupo control como se observa a continuaci6n:
INSULINA
EGF
TGF-0
c 31 c32
10 ng/ml 25 ng/ml E-1 E-2
10 ng/ml 50 ng/ml T- 1 T-2
113
100 pg/ml 1-3
50 ng/ml E-3
100 ng/ml T-3
CONTROL sin adiciones
Al termin6 de este periodo fue recuperado el medio incubado en. tubos de centrifuga de pldstico est6riles y fueron congelados hasta la determinaci6n del esteroide (E) mediante inmunoanblisis especifico (RIA).
Se utili26 un RIA especifico para cuantificar el E presente en los medios condicionados de CS. La fuente de anticuerpos especlf icos fue suero de conejos, que se inmunizaron con antlgenos de los 19-hidroxiderivados de los esteroides, unido en forma de hapten0 a la albtímina serica bovina por medio de una mol6cula de dcido succlnico (Bermtídez et al, 1973).
El marcador radiactivo utilizado fue 'H -2,4,6-7-E con una actividad especsfica de 93.0 Ci/mmol, previamente purificado por cromatografia en capa.fina.
20
.. .".-" .- "". "
Tomando en consideraci6n las cantidades de los esteroides normalmente presentes en cultivos primarios de CS (Mendieta, 1992) , se eligió un rango de concentraciones de O a 50 O 0 0 pg para la curva patr6n del esteroide. Se parti6 de una soluci6n madre de concentraci6n de 1 mg/ml del esteroide puro disuelto en etanol absoluto; a partir de &st6 se prepararon las siguientes diluciones:
DILUCION I CONCENTRACION I 0.1 pglctl 11 1 pglctl I11 10 pg/ctl IV 100 pg/ctl V 1000 pg/ctl
La curva patr6n para E se preparó por duplicado de acuerdo a la sig tabla.
TUBOS CANT. MASA VOLUMEN SOLUCION (Pg) (PI)
1-2 Totales -"" ""-
5-6 1.0 10 I
7-8 2.5 25 I
9-10 5.0 5 I1
11-12 10.0 10 I1
13-14 25 25 I1
15-16 50 5
17-18 100 10
I11
I11
19-20 250 25 I11
21-22 500 5 IV
23-24 1000 10 IV
25-26 2500 25 IV
27-28 5000 5 V
29-30 10 O 0 0 10 V
31-32 25 O 0 0 25 V
33-34 50 O 0 0 50 V
I
De acuerdo a lo observado en la curva patr6n la diluci6n final utilizada del anticuerpo antiesteroide fue de 1:350.
Se prepare una mezcla dei esteroide marcado con 4 2 0 0 cpm por cada 100 pl de DME y el suero antiesteroide correspondiente. Se agregaron 500 pl de DME a cada tubo de la curva y 500 pl de cada una de las muestras experimentales a tubos que fueron marcados previamente para cada muestra. Posteriormente se les agreg6 100 p1 de la mezcla del esteroide marcado (E*) m6s el anticuerpo anti-E; fueron agitados vigorosamente todos los tubos e incubados a 4OC durante 18 hrs para que se lograr6 el equilibrio de la unidn del esteroide radiactivo a los sitios correspondientes de los anticuerpos.
Al final del periodo de incubaci6n se agregaron 200 pl de una suspensidn de carb6n activado-Dextr6n T-70 (0.625- 0.0625) a cada tubo para separar la fraccidn libre de la unida al anticuerpo, y se sediment6 el carb6n por centrifugaci6n a 3000 rpm/ 15 min a 4OC. El sobrenadante fue decantado (fracci6n unida) a viales de conteo; posteriormente se le aKadi6 5 m1 de una soluci6n de centelleo (Instagel) y se evalu6 su contenido de radiactividad en un espectrofot6metro de centelleo líquido Packard tri-Carb 3390, que en condiciones dptimas para conteo de tritio tiene una eficiencia del 51 %.
Las concentraciones de E para cada muestra se determin6 por interpolacidn en la curva patr6n correspondiente.
2 2
131 procedimiento de obtencidn de la fraccidn enriquecida permiti6 separar adecuadamente las CS del compartimiento tubular con una pureza aproximada de 7232. Las principales fuentes’ de contaminaci6n fueron espermbtides, espermatocitos primarios y secundarios, sin cdlulas intersticiales aparentes.
En las siguientes tablas y grdficas se muestran las concentraciones del E obtenidos en condiciones basales de incubacidn as1 como la producci6n en presencia de diferentes factores tales como Insulina, EGF y TGF-A a las diferentes dosis adicionadas a los medios de cultivo.
Todos las barras de las figuras muestran el promedio y desviaci6n estdndar de tres experimentos diferentes, y las tablas correspondiente incluyen ademdis el coeficiente de variaci6n (C.V.) expresado para cada uno de los tratamientos experimentales.
EFECTO DE INSULINA
El efecto de las diferentes concentraciones de insulina sobre la actividad de la aromatasa CS se encuentra representado en la Tabla I y la Fig 7. Se puede apreciar que la adici6n de insulina a cualquiera de las dosis utilizadas no tiene efecto alguno sobre la producci6n de E por CS en períodos de 36 hr de incubaci6n.
EFECTO DE EGF
La actividad de la aromatasa en presencia de EGF a 3 diferentes dosis tiende a verse incrementeada con respecto al control, pero de una manera no significativa (Tabla I1 y Fig 8). Cabe aclarar que los CV resultantes de las mediciones de las concentraciones de E al usar este factor de reto son tan grandes, que cualquier potencial afecte de EGF sobre la actividad de la aromatasa es imposible de apreciar.
EFECTO DE TGF-B
La producci6n de estradiol (pg / l @ C S ) en presencia de diferentes dosis de TGF-A se ilustra en la tabla I11 y la fig 9. Cabe aclarar que los CV resultantes de las mediciones de las concentraciones de E al usar este factor de reto son tan grandes, que cualquier potencial afecte de TGF-8 sobre la actividad de la aromatasa es imposible de apreciar.
2 3
I Los efectos relativos de las dosis mdxilaas de los
diferentes factores utilizados sobre la produccibn de E por CS se muestran en la fig 1 0 en terminos del porcentaje de i cambio con respecto al control. en esta figura podemos 1 apreciar que 1-3 y E-3 no tienen un efecto significativo en ! comparacibn al Dl4E y que posiblemente T-3 tenga un ligero efecto sobre el control, aunque este efecto no parece ser 1
significativo.
bl
TABLA1 TRATAMIENTO q cv
DME 4 8 6 . 5 f 4 7 . 9 9 . 8 4 1-1 4 7 3 . 7 f-67.9 1 4 . 3 0 1-2 4 7 7 . 6 5 4 7 . 0 9 . 8 5 1-3 4 7 4 . 7 f 5 0 . 4 1 0 . 6 2 """""""""""""""""-"""""""""""""
Sintesis de Estradiol (E) por fracciones enriquecidas en Celulas de Sertoli (CS) de ratas adultas normales, incubadas en presencia de insulina a diferentes dosis. (DME: control; 1-1: 1 0 pg/ml; 1-2: 5 0 pg/ml; 1-3 : 100 pg/ml).
DME 1 0 8 2 . 5 k 4 7 . 0 4 . 3 4 E-1 1 2 2 0 . 4 +-560.3 4 5 . 9 1 E-2 1 1 3 7 . 2 k 3 5 1 . 0 3 0 . 8 6 E-3 1 1 6 6 . 5 k 2 7 9 . 4 2 3 . 9 6 """"""""""""""""""""""""""""""-
Sintesis de' Estradiol (E) por fracciones enriquecidas en Cdlulas de Sertoli (CS) de ratas adultas normales, incubadas en presencia del factor de crecimiento epidermal (EGF) a diferentes dosis. (DME: control; E-1: 10 ng/ml; E-2: 2 5 ng/ ml; E.3 : 50 ng/ml) .
SINTESIS F: (m/J04CS), cv DME T-1 T-2 T-3
1 1 9 8 . 5 k 5 1 8 . 6 1 1 9 7 . 2 k-496.0 1 2 8 0 . 2 k 6 6 1 . 0 1 5 1 4 . 2 k 6 1 3 . 0
4 3 . 3 4 1 . 4 51.6 4 0 . 5
Sintesis de Estradiol (E) por fracciones enriquecidas en Celulas de Sertoli (CS) de ratas adultas normales, incubadas en presencia del factor de crecimiento y transformacibn f3 (TGF-R) a diferentes dosis (DME: control; T-1: 10 ng/ml; T-2: 50 ng/ml; T-3: 100 ng/ml).
24
EFECTO DE INSULINA
600.00
500.00
400 .O0 v) o CD
300.00 X W
200.00
100.00
0.00 I / / /
T
_ .
"
"
"
/
T
DME 1-1 1-2 1-3
I P s E l l 486.50 I 473.70 I 477.60 I 474.70
TRATAMIENTO
L ~~~ ~ ~
Fig. 7. Efecto de tres diferentes concentraciones de insulina sobre la síntesis de E por fracciones enriquecidas de CS cultivadas durante 36 hrs.
EFECTO DE EGF
1,400.00
1,200.00
1,000.00
cn o CD
800.00 O
X W 600.00 o, Q
7
400.00
200.00
o .o0 /
' I
DME E- 1 E-2 E-3
FgEwl 1,082.501 1,220.401 1,137.20 I 1,166.501
TRATAMIENTO
/
Fig. 8. Efecto de tres diferentes concentraciones de EGF sobre la síntesis de E por fracciones enriquecidas de CS cultivadas durante 36 hrs.
!
1,600.00
1,400.00
1 ,200 .o0
g 1,000.00
ca F o 800.00 X W
600.00
400.00
200.00
0.00
/
I '
I '
I '
IL
EFECTO DE TGF-O
/
/ / /
I-
_ " "
I
, ,
DME T- 1 T- 2 T- 3
I pgEmI 1,198.50 I 1,197.20 I 1,280.20 I 1,514.20 I
TRATAMIENTO 1 5 3 8 1 1
Fig. 9. Efecto de tres diferentes concentraciones de TGF-B sobre la slntesis de E por fracciones enriquecidas de CS cultivadas durante 36 hrs.
,r
I
EFECTO DOSIS MAXIMAS I
140.00
120.00
100.00
O m 80.00 -
W CI 60.00 8
40.00
20.0a
0.00
/
/ / / / / /
/ /
" " _
/ / / /
DME 13 E3 T3
1.1 100.00 I 97.57 I 107.70 I 126.30
TRATAMIENTO
Fig. 10. Efecto relativo de las dosis maximas de insulina, EGF y TGF-0 sobre la sCntesis basal de E en cultivos de CS mantenidos durante 36 hrs.
6. DI8Ctl81011
La la fracci6n enriquecida de la estirpe celular de CS, es comparable en cuanto a sus caracteristicas morfofuncionales de rata adulta normal en el modelo previamente utilizado por nuestro grupo de trabajo, el cual difiere en diversos aspectos,de otras fracciones utilizadas por diferentes investigadores (Bermbdez et al, 1988; Mendieta, 1992).
As€, por ejemplo el medio utilizado para los cultivos de las cOlulas es libre de suero, lo que lo hace diferente a los ocupados en otros trabajos disefiados para evaluar diversos aspectos de la funci6n biosintetica de las CS (Nakhla y Matter, 1984; Skinner y Griswold, 1980). Diversos investigadores han utilizado lineas celulares establecidas, sembradas sobre elementos de matriz extracelular ( Laminina, coldgena, etc.) lo que permite una mejor adhesividad y una citoarquitectura mds cercana a la existente in situ
, (Klinefelter y Ewing, 1988), mantiene a las celulas funcionales, incluso hasta por tres dias de incubaci6n, pero modifica algunas de sus funciones endocrinas de tal forma que los resultados obtenidos con nuestro modelo, no son totalmente comparables a otros que utilizan medios suplementados, o sustratos diferentes de pldstico (Russell y Steinberger, 1989).
Existe considerable evidencia de que las CS ejercen influencia sobre la funci6n de las CL. Se ha seaalado que existen dos candidatos probables que puedan ejercer dicha actividad moduladora sobre las CL : 1) factores que regulan la actividad de la adenilato ciclasa (Papadopoulos et al, 1986) y 2) factores de naturaleza esteroidogénica (E). La posibilidad de que el E sintetizado por las CS funcione como un regulador paracrino de la esteroidogenesis ha llevado a diversos autores a estudiar el efecto que diferentes factores hormonales presentan sobre la actiyidad de la aromatasa en las CS ( Borland et al, 1984; Bellve y Zheng,1989).
Como podemos observar en las tablas I y I1 en el modelo experimental que hemos utilizado no parece haber efecto alguno de insulina y EGF en las tres dosis utilizadas, pero con lo que respecta a TGF-8 a una concentracibn de 100 ng/ml (T-3) se observa ligero efecto estimulatorio; sin embargo , cuando es comparado con su control respectivo, no existe diferencia significativa alguna (p > O.l), probablemente debido a los valores observados de CV obtenidos para estas cuantificaciones.
Por otro lado la variacien porcentual generada por 3 dosis mdximas de cada factor con respecto al DME (control) . Muestran un aumento del 26 0 en el caso de T-3 (fig 10) y variaciones prdcticamente insignificativas para 1-3 y E-3. No hay datos comparativos en la literatura directamente .
25
- Los cultivos primarios de cs se obtuvieron de acuerdo a la metodologia descrita anteriormente, y las chlulas mantienen la capacidad esteroidoghnica normalmente reportada por diversos autores.
- Fue posible determinar la producci6n basal y estimulada de E de CS mediante RIA.
- Pueden sefialarse que diferentes dosis de insulina, EGF y TGF-R no afectan la producción de E y la actividad de la aromatasa en cultivos de CS bajo las condiciones de incubación utilizadas.
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