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ILLIANA MARCELA HERMOSILLO JARAMILLO
ÉTUDE DES PROPRIÉTÉS RHÉOLOGIQUES DES GELS FAITS À PARTIR DE SYSTÈMES MIXTES
CHITOSANE-PROTÉINES
Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en sciences et technologie des aliments pour l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
DÉPARTEMENT DES SCIENCES DES ALIMENTS ET DE NUTRITION FACULTÉ DE SCIENCES DE L’AGRICULTURE ET DE L’ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC
2009 © Illiana Hermosillo, 2009
Résumé
La gélification de deux systèmes mixtes contenant des protéines (P) et du chitosane (CH) a
été étudiée par rhéologie. Les systèmes ont été : 1) un mélange d’isolat de protéines de
lactosérum (WPI) et CH, et 2) un mélange de gélatine bovine (Gb) et de CH. Les deux
systèmes ont été étudiés dans des milieux acides et alcalins à différentes concentrations de
polymères. Des gels avec des caractéristiques différentes ont été obtenus avec les deux
systèmes dans toutes les conditions étudiées. À concentrations élevées en protéines, le CH a
moins d’influence sur les gels formés. Les gels WPI-CH sont de couleur blanche et de
texture crémeuse à pH acides, tandis qu’ils sont translucides et élastiques à pH basique. Les
systèmes Gb-CH forment toujours des gels translucides, cependant la turbidité augmente à
pH 6. Ce travail a permis de comprendre l'effet des concentrations des polymères ainsi que
du pH et du type de protéine sur les propriétés rhéologiques des gels P-CH.
Abstract
The gelation of two mixed systems containing proteins (P) and chitosan (CH) has been
studied by rheology. The systems were: 1) a mixture of whey protein isolate (WPI) and CH,
and 2) a mixture of bovine gelatin (Gb) with CH. Both systems have been studied in acid
and alkaline environment at different polymers concentrations. Gels with different
characteristics have been obtained with the two systems in all conditions studied. Chitosan
has less influence on the gels at higher protein concentrations. The colour of the WPI-CH
gels was white with a creamy aspect at acid pH, whereas they were translucent and elastic
at alkaline pH. The Gb-CH systems always formed translucent gels; however the turbidity
increases at pH 6. The work presented in this document has allowed the understanding the
effect of the polymer concentrations as well as the pH and the type of protein on the
rheological properties of the P-CH gels.
Avant-propos
Les travaux présentés dans ce mémoire ont été réalisés au Centre de Recherche et de
Développement sur les Aliments (CRDA) d’Agriculture et Agroalimentaire Canada (AAC),
à Saint-Hyacinthe, sous la supervision du Dr. Sylvie Turgeon (INAF, Université Laval) et
du Dr. André Bégin (AAC). Cette recherche a été possible grâce à l’appui financier reçu du
Conseil des Recherches en Pêches et en Agroalimentaire du Québec (CORPAQ).
Je tiens à remercier ma directrice, Sylvie Turgeon, et mon co-directeur, André Bégin, pour
leur temps, leur encouragement, leur appui, leur patience et leur confiance pendant toute la
durée de mes études graduées, tant pour la réalisation des expériences que durant les cours
suivis.
Aussi, je voudrais remercier la Fondation des Gouverneurs pour son soutien financier au
cours de ma maîtrise.
Merci également à tous mes collègues du CRDA qui m’ont donné leur appui. Plus
particulièrement à Ali T. et Élise-Anick, pour leur temps et leur support pour l’utilisation
du rhéomètre. À Fleur, Élise et Pascal, pour toute leur aide apportée, spécialement pour la
révision de la rédaction de mes travaux en français. À Hélène Giroux pour m’avoir fourni
l’échantillon d’isolat de protéines de lactosérum et pour le prêt du viscosimètre. À Louis-
Philippe, Ana, Martin, Kim Anh, Sorayya, Ali K., Reza et tous les gens du CRDA qui
m’ont permis de mieux apprécier toute la durée de ce projet.
vv
A mis papás y hermanos por su apoyo y cariño incondicional, a Bety y Armando, y a mis
amigos... muchas gracias a todos por estar siempre presentes. Des remerciements spéciaux
à Juan Carlos, mon mari, pour ses encouragements, sa patience et sa présence, qui m’ont
aidé à arriver à la fin de ce projet.
Les résultats de ces travaux, présentés aux deux derniers chapitres de ce mémoire, ont été
rédigés sous forme d’article, soit :
Hermosillo, I., Turgeon, S.L. et Bégin, A. (2006). Rhéologie de gels mixtes protéines-chitosane, partie I : conditions acides.
Hermosillo, I., Bégin, A. et Turgeon, S.L. (2006). Rhéologie de gels mixtes
protéines-chitosane, partie II : conditions alcalines.
De plus, une affiche de recherche, qui a été présentée lors du 2e symposium de l’INAF
(Octobre, 2005), est incluse en annexe :
Hermosillo, I., Bégin, A. et Turgeon, S.L. (2005). pH system models for nutritional evaluation of protein-chitosan complexes. 2e symposium de l’INAF- Aliments fonctionnels et produits nutraceutiques: états et connaissances. Ste-Foy, Québec, Canadá.
Le premier auteur des articles est l’étudiante qui a effectué les travaux de recherche et
rédigé les textes. Le deuxième et le troisième auteur sont le co-directeur et la directrice de
ces travaux de recherche.
A Juan Carlos A Dalia (y a sus hermanitos)
Table des matières
Résumé................................................................................................................................... ii Abstract................................................................................................................................. iii Avant-propos .........................................................................................................................iv Table des matières ............................................................................................................... vii Liste de tableaux .....................................................................................................................x Liste de figures.......................................................................................................................xi Abréviations, symboles et formules chimiques .................................................................. xiii Introduction.............................................................................................................................1 Chapitre 1................................................................................................................................4 REVUE DE LITTÉRATURE.................................................................................................4
1.1. Description du chitosane..............................................................................................5 1.1.1. La chitine ..............................................................................................................5 1.1.2. Le chitosane ..........................................................................................................7
1.1.2.1. Gélification du chitosane .............................................................................10 1.2. Description des isolats de protéines de lactosérum ...................................................13
1.2.1 Les protéines du lactosérum ................................................................................14 1.2.1.1 La -lactoglobuline.......................................................................................15
Structure................................................................................................................15 1.2.1.2 L’-lactalbumine ..........................................................................................18
Structure................................................................................................................18 1.2.1.3 Les protéines mineures du lactosérum..........................................................20
1.2.2. Gélification des protéines du lactosérum............................................................21 Effet du temps et de la température de chauffage.................................................22 Effet de la concentration .......................................................................................23 Effet du pH et de la force ionique.........................................................................23
1.3 Description de la gélatine ...........................................................................................26 1.3.1 La gélatine............................................................................................................26 1.3.2. Gélification de la gélatine ...................................................................................29
1.4. Interactions protéines-polysaccharides ......................................................................32 1.4.1. Comportement en mélange des polysaccharides et des protéines ......................32 1.4.2. Influence du pH, de la force ionique et de la température ..................................36 1.4.3. Influence de la concentration et du ratio des biopolymères................................37
1.5. Gélification et gels de systèmes mixtes .....................................................................38 1.5.1. Définition de gel .................................................................................................38 1.5.2 Gélification de systèmes mixtes ..........................................................................40
1.6 État des connaissances ................................................................................................42 1.7. Concepts fondamentaux de rhéologie........................................................................46
HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS............................................................................................50 Chapitre 2..............................................................................................................................51
viii
RHEOLOGY OF PROTEIN-CHITOSAN MIXED GELS, PART I : ACID CONDITIONS...............................................................................................................................................51
2.1. Résumé.......................................................................................................................52 2.2. Abstract ......................................................................................................................53 2.3. Introduction................................................................................................................54 2.4. Experimental Procedure.............................................................................................56
2.4.1. Materials .............................................................................................................56 2.4.2. Preparation of single and mixed solutions..........................................................57 2.4.3. Rheological measurements .................................................................................58
2.4.3.1 WPI-CH system ............................................................................................58 2.4.3.2 Gb-CH system...............................................................................................59
2.4.4. Statistical method................................................................................................59 2.5. Results and discussion ...............................................................................................60
2.5.1. WPI-CH system ..................................................................................................60 2.5.1.1 Single polymer gel formation .......................................................................60
CH gel formation ..................................................................................................60 WPI gel formation ................................................................................................61
2.5.1.2. Mixed WPI-CH gel formation .....................................................................62 Frequency sweep...................................................................................................65 Visual aspects of mixed gels.................................................................................65 Cold gelation of WPI-CH systems........................................................................65
2.5.2. Gb-CH system.....................................................................................................66 2.5.2.1 Single polymer gel formation .......................................................................66
CH gel formation ..................................................................................................66 Gb gel formation...................................................................................................66
2.5.2.2 Mixed Gb-CH gel formation.........................................................................67 Frequency sweep...................................................................................................69 Effect on the setting and melting point .................................................................70
2.6. Conclusions................................................................................................................71 Chapitre 3..............................................................................................................................86 RHEOLOGY OF PROTEIN-CHITOSAN MIXED GELS, PART II : ALKALINE CONDITION. .......................................................................................................................86
3.1 Résumé........................................................................................................................87 3.2 Abstract.......................................................................................................................88 3.3 Introduction.................................................................................................................89 3.4 Experimental Procedure..............................................................................................91
3.4.1 Materials ..............................................................................................................91 3.4.2 Preparation of solutions .......................................................................................91 3.4.3 Preparation of mixed solutions ............................................................................92 3.4.4 Rheological measurements ..................................................................................92
3.4.4.1 WPI-CH gelation ..........................................................................................93 3.4.4.2. Gb-CH gelation............................................................................................93
3.4.5. Statistical method................................................................................................94 3.5 Results and discussion ................................................................................................94
3.5.1 WPI-CH system ...................................................................................................94 3.5.1.1 Single polymer gel formation .......................................................................95
ix
CH gelation ...........................................................................................................95 WPI gelation .........................................................................................................96
3.5.1.2 WPI-CH gelation ..........................................................................................96 3.5.2 Gb-CH system......................................................................................................99
3.5.2.1 Single polymer gelation ................................................................................99 CH gelation ...........................................................................................................99 Gb gelation..........................................................................................................100
3.5.2.2 Mixed Gb-CH gelation ...............................................................................100 3.6 Conclusions...............................................................................................................103
CONCLUSION GÉNÉRALE.............................................................................................113 Bibliographie ......................................................................................................................116 Annexe A ............................................................................................................................127 pH system models for nutritional evaluation of protein-chitosan complexes ....................127
Introduction.....................................................................................................................128 Materials and methods ....................................................................................................129 Results and discussion ....................................................................................................130
Gelatin-chitosan systems ............................................................................................130 WPI-chitosan ..............................................................................................................131 Rheology .....................................................................................................................133
Conclusions.....................................................................................................................135 References.......................................................................................................................136 Acknowledgements.........................................................................................................136
Annexe B ............................................................................................................................137 Tableaux ANOVA pour les paramètres rhéologiques G’’ (module de perte) et (delta) en conditions acides.................................................................................................................137 Annexe C ............................................................................................................................140 Tableaux ANOVA pour les points de gélification (Tg) et de fusion (Tm) du système Gb-CH en conditions acides. ....................................................................................................140 Annexe D ............................................................................................................................142 Tableaux ANOVA pour les paramètres rhéologiques G” (module de perte) et (delta) du système Gb-CH milieu alcaline. .........................................................................................142 Annexe E.............................................................................................................................145 Détermination du poids moléculaire et pI de la gélatine ....................................................145
x
Liste de tableaux
Tableau 1.1 Caractéristiques physiques des protéines de lactosérum .................................15 Table 2. 1 ANOVA of the storage modulus (G') with the WP-CH system in acid
conditions......................................................................................................................76 Table 2. 2 ANOVA of the storage modulus (G') with the Gb-CH system in acid conditions.
......................................................................................................................................83 Table 2. 3 Setting and melting points for the Gb-CH system at pH 4 and 6. The values are
the means of the replicates............................................................................................85 Table 3. 1 ANOVA for the G' modulus for the WPI-CH system in alkaline conditions (log
transformation applied)...............................................................................................105 Table 3. 2 ANOVA for the G' modulus for the Gb-CH system in alkaline conditions. ....108 Table 1 ANOVA for the loss modulus (G’’) for the WPI-CH system...............................138 Table 2 ANOVA for delta () for the WPI-CH system. ....................................................138 Table 3 ANOVA for the loss modulus (G’’) for the Gb-CH system. ................................139 Table 4 ANOVA for delta () for the Gb-CH system........................................................139 Table 5 ANOVA for the setting point (Tg) of the Gb-CH system.....................................141 Table 6 ANOVA for the melting point (Tm) of the Gb-CH system..................................141 Table 7 ANOVA for the loss modulus (G’’) for the WPI-CH system in alkaline
environment (log transformation applied). .................................................................143 Table 8 ANOVA for delta () for the WPI-CH system in alkaline environment (log
transformation applied)...............................................................................................143 Table 9 ANOVA for the loss modulus (G’’) for the Gb-CH system in alkaline
environment. ...............................................................................................................144 Table 10 ANOVA for delta () for the GB-CH system in alkaline environment. .............144
Liste de figures
Figure 1. 1 Structure de la cellulose et de la chitine .............................................................6 Figure 1. 2 Structure du chitosane ........................................................................................9 Figure 1.3 Variation de G' et G'' en fonction de la fréquence pendant la gélification d’une
solution de chitosane.....................................................................................................13 Figure 1.4 Modèle de la structure tertiaire de la -lactoglobuline.......................................16 Figure 1.5 Représentation de conformation des unités de -lg en fonction du pH..............17 Figure 1.6 Modèle de la structure tertiaire de l’-lactalbumine bovine ..............................19 Figure 1.7 Formation de gels fins et de gels agrégés ...........................................................24 Figure 1.8 Conformations des chaînes qui entraîneront la gélification de la gélatine.........30 Figure 1.9 Description du comportement des mélanges de biopolymères ..........................34 Figure 1.10 Diagramme de phases typique d’un mélange de protéines-polysaccharides....36 Figure 1.11 Types de gels formés avec un mélange de biopolymères.................................41 Figure 1.12 Déformation et contrainte qui montrent la réponse d’un solide idéal et d’un
liquide idéal...................................................................................................................47 Figure 1.13 Spectre mécanique des polysaccharides...........................................................49 Figure 2.1 Gelation profile of 1.25% chitosan following the temperature program used for
WPI-CH mixed systems at pH 4 and pH 6. ..................................................................72 Figure 2.2 Gelation profile of 10%WPI at pH 4. .................................................................73 Figure 2.3 Gelation profile of WPI-CH mixed systems: 4% WPI-1.25%CH at pH 4 and 7%
WPI-0.5% CH at pH 6. .................................................................................................74 Figure 2.4. Effect of chitosan on G’, G’’ and delta () in the WPI-CH acid systems at pH 4
and pH 6 at 20°C...........................................................................................................75 Figure 2.5 Graphic representation of the interaction WPI*CH: the main interaction, at pH 4
and at pH 6....................................................................................................................76 Figure 2.6. Graphic representation of the interactions WPI*pH and CH*pH. ....................77 Figure 2.7 Frequency sweep of the mixed gel 10%WPI-0.5%CH at pH 4. ........................77 Figure 2.8 Visual aspect of the WPI-CH gels......................................................................78 Figure 2.9 Gelation profile of chitosan following the temperature program used for Gb-CH
mixed systems at pH 4 and pH 6. .................................................................................79 Figure 2.10 Gelation profile of 5%Gb at pH 6. ...................................................................80 Figure 2.11 Gelation profile of Gb-CH mixed systems: 4%Gb-1.25%CH at pH 4 and
5%Gb-1.25%CH at pH 6. .............................................................................................81 Figure 2.12 Effect of chitosan on G’, G’’ and delta () in the Gb-CH acid systems at pH 4
and pH 6 at 15°C...........................................................................................................82 Figure 2.13 Graphic representation of the interaction Gb*CH: the main interaction, at pH 4
and at pH 6....................................................................................................................83 Figure 2.14 Frequency sweep of the mixed gel 5%Gb-1.25%CH at pH 6. .........................84 Figure 2.15 Visual aspect of the Gb-CH gels ......................................................................84 Figure 3.1 Gelation profile of 1.25%chitosan in alkaline conditions following the
temperature program used for WPI-CH mixed systems. ............................................104 Figure 3.2 Profile of WPI gelation in alkaline conditions. ................................................105 Figure 3.3 Effect of chitosan on G’, G’’ and delta () in the WPI-CH alkaline systems. .106 Figure 3.4 Gelation profile of the 7%WPI-1.25%CH mixed system in alkaline conditions.
....................................................................................................................................107
xii
Figure 3.5 Frequency sweep of the 7%WPI-1.25%CH gel in alkaline conditions............107 Figure 3.6 Visual aspect of the WPI-CH gels in alkaline conditions ................................108 Figure 3.7 Gelation profile of 1.25%chitosan in alkaline conditions following the
temperature program used for Gb-CH mixed systems. ..............................................109 Figure 3.8 Profile of Gb gelation in alkaline conditions....................................................109 Figure 3.9 Effect of chitosan on G’, G’’ and delta () in the Gb-CH alkaline systems.....110 Figure 3.10 Gelation profile of the mixed system 4%Gb-1.25%CH in alkaline conditions.
....................................................................................................................................111 Figure 3.11 Frequency sweep of the 4%Gb-1.25%CH gel in alkaline conditions. ...........111 Figure 3.12 Visual aspect of the Gb-CH gels in alkaline conditions.................................112 Figure 1. Glucosamine structure at pH<6 and pH>7 .........................................................128 Figure 2. Visual aspect of gelatin-chitosan gels. ...............................................................131 Figure 3. Visual aspect of WPI-chitosan gels. ...................................................................132 Figure 4. WPI-chitosan (10.5%:2.5%) gel formation (pH 4) followed by rheology. ........133 Figure 5. Gelatin-chitosan (8%:2.5%) gel formation (pH 4). ............................................134 Figure 6. Gelatin-chitosan (6%:2.5%)gel (pH 8.5) formation. ..........................................135
Abréviations, symboles et formules chimiques
AcH Acide acétique
AcNGlc Acétylglucosamine
Degré d’ionisation
-la -lactalbumine (protéine sérique)
-lg -lactoglobuline (protéine sérique)
BSA albumine de sérum bovin
CH Chitosane
C Concentration totale des polymères
Cgel Concentration critique de gélification
Angle de phase
DDA Degré de désacétylation (%)
DP Degré de polymérisation moyen
e électron-volt
G’ Module de conservation ou d’élasticité (storage modulus), Pa
G’’ Module de perte (loss modulus), Pa
Gb Gélatine type B (bovine)
H Heures
*| Viscosité dynamique, Pa.s
HCl Acide chlorhydrique
Igs Immunoglobulines, (protéines sériques)
IPL Isolat de protéines de lactosérum
KOH Hydroxyde de potassium
M Molarité (nombre de moles de soluté per litre de solution)
MW Poids moléculaire, Da
NaHCO3 Bicarbonate de sodium
NaOH Hydroxyde de sodium
NGlc Glucosamine non protoné
NGlcH+ Glucosamine protoné
NH4HCO3 Bicarbonate d’ammonium
P Protéine(s)
xiv
Pgel point de gélification
pI Point isoélectrique
pKa Constante d’ionisation
PM poids moléculaire
PS Polysaccharide(s)
ρQ Densité des charges
SH Group thiol
-S-S- Pont disulfure
t Temps (s)
T Température (°C)
Td Température de dénaturation (°C)
V volume molaire
fréquence (rad/s)
WPI Whey protein isolate
Introduction
Les protéines et les polysaccharides sont des polymères naturels importants qui ont des
applications tant alimentaires que non alimentaires. De nombreuses applications des
polysaccharides et des protéines sont reliées à leur capacité d’augmenter la viscosité des
solutions ou de formation des gels (Morris, 1995).
En mélange, les interactions protéines-polysaccharides jouent un rôle fondamental lors de
la formation de structures gélifiées ou lors de la formation de complexes en solution. Les
mélanges protéines-polysaccharides peuvent avoir plusieurs applications tant dans les
domaines médicaux, biotechnologiques, pharmaceutiques ou alimentaires (Schmitt et al.,
1998; Shahidi et al., 1999; Shu et Zhu, 2001; Berger et al., 2004). Tolstoguzov (1991)
mentionne que des polymères de natures différentes peuvent, grâce à des interactions
attractives, soit former des complexes solubles ou insolubles, ou grâce à des interactions
répulsives, soit co-solubles ou immiscibles (séparation de phases). Ces interactions
permettront la formation de systèmes aux caractéristiques physiques différentes.
Le chitosane est un polysaccharide cationique naturel constitué des copolymères
glucosamine et N-acétylglucosamine. Il y a peu d’information disponible sur les systèmes
mixtes protéine-chitosane pour des applications alimentaires. La plupart des études ont été
réalisées sur des gels à base de polysaccharides anioniques (e.g. pectine, alginate,
carraghénane) ou neutres (e.g. amidon, maltodextrine, locust bean gum) (Syrbe et al., 1994;
Alevisopoulos et al., 1996; Alves et al., 1999; Turgeon et Beaulieu, 2001; Fonkwe et al.,
2003; Zhang et Foegeding, 2003). Dans l’industrie alimentaire, le chitosane a été proposé
pour la récupération de sous-produits, pour la purification de l’eau, comme agent
hypocholestérolémiant et hypolipémiant, comme agent antimicrobien, pour la fabrication
de films et d’emballage comestibles (Arvanitoyannis et al., 1998; Georgiev Lalov et al.,
22
2000; Bégin et Van Calsteren, 1999; Ouattara et al., 2000; Pranoto et al., 2005; Zhou et al.,
2006). À cause de sa capacité de rétention d’eau élevée, il peut aussi être utilisé comme
agent épaississant et gélifiant (Shahidi et al., 1999; Knorr, 1982). L’utilisation du chitosane
dans la fabrication de gel est courante en médecine pour la formation d'implants pour la
libération contrôlée des médicaments et en biotechnologie pour l’immobilisation des
cellules et des enzymes. Dans les aliments, la production de gels de chitosane est encore au
stade d'étude et leur utilisation à grande échelle dépendra de leur acceptation internationale
comme ingrédient alimentaire. Par exemple, Benjakul et al. (2000) ont utilisé la chitine et
le chitosane pour la préparation de surimi et No et Meyers (2004) pour la fabrication de
tofu (Chang, et al., 2003).
Le chitosane est la forme partiellement ou totalement désacétylée de la chitine que l'on
retrouve dans les carapaces des animaux marins. De tous les déchets solides marins aux
États-Unis, entre 50 et 90% proviennent des carapaces des animaux marins. La quantité
annuelle des carapaces a été estimée aux environs de 5.12x106 tonnes métriques (Knorr,
1984; Shahidi et al., 1999). Il est donc important de trouver des applications à la chitine et
au chitosane dans différents secteurs. De plus, la chitine et le chitosane sont
biodégradables, biocompatibles, non toxiques et possèdent différentes propriétés
fonctionnelles intéressantes (Chang et al., 2003; Ravi Kumar, 2000). La capacité d’un
polymère à gélifier, à contrôler l'activité de l’eau, à absorber différents ingrédients
alimentaires sont quelques exemples de propriétés fonctionnelles intéressantes dans le
domaine alimentaire (Kinsella, 1976, cité par Clark et Lee-Tuffnell, 1986).
Dans ce travail, nous avons étudié les propriétés de gélification et de complexation du
chitosane avec des protéines alimentaires. Deux systèmes ont été étudiés: 1) un isolat de
protéines de lactosérum (IPL) mélangé à du chitosane (CH) et 2) un mélange de gélatine
bovine (Gb) et de CH. Ces deux protéines ont été choisies en raison de leurs propriétés
fonctionnelles et nutritionnelles et de leur point isoélectrique différent. Les paramètres
33
étudiés ont été l'influence du pH, de la concentration de chacun des polymères et de la
concentration totale en polymères en solution.
Les résultats obtenus ont permis de mieux comprendre la formation de gels mixtes à base
de protéine-polysaccharide cationique et aideront au développement d'applications
alimentaires à base de gels de chitosane et protéines.
Chapitre 1
REVUE DE LITTÉRATURE
1.1. Description du chitosane
Le chitosane est obtenu par traitement de la chitine en solution fortement alcaline. Le
chitosane, poly--(14)-D-glucosamine totalement désacétylé ou partiellement désacétylé,
est la forme désacétylée de la chitine. Les propriétés fonctionnelles de la chitine et du
chitosane varieront en fonction de leurs compositions chimiques et de leurs poids
moléculaires (No et Meyers, 1995). Dans cette section, nous ferons un survol rapide de la
chitine et de sa transformation en chitosane avant de discuter de la composition du
chitosane en relation avec ses propriétés de gélification
1.1.1. La chitine
La chitine, poly--(14)-N-acétyl-D-glucosamine totalement acétylé ou partiellement
désacétylé, est le deuxième biopolymère le plus abondant sur la planète, immédiatement
après la cellulose. Ces deux macromolécules sont similaires entre elles (Knorr, 1984; No et
Meyers, 1995) et ne diffèrent qu'au niveau de la substitution du C-2 des sucres. Le
groupement hydroxyle en position C-2 de la cellulose est, sur la chitine, remplacé par un
groupement acétamide (figure 1.1).
La production commerciale de chitine est faite à partir des carapaces d'animaux marins
(crabe, crevette, homard) qui contiennent sur une base sèche entre 20 et 30% de chitine.
Cependant, on la trouve aussi chez les insectes et les champignons (Knorr, 1982; Benjakul
et al., 2000). La teneur en chitine varie également en fonction des espèces, des conditions
de croissance et des saisons. Les caractéristiques physiques (poids moléculaires et leur
distribution de poids moléculaires) et chimiques (degré de désacétylation, pureté) varieront
également selon la source et les méthodes de préparation (No et Meyers, 1995).
6
O
H
OH
CH2OH
OH
H
H
H
H
O
H
OH
CH2OH
OH
H
H
H
H
O O
n
O
H
OH
OH
H
H
H
H
O
H
OH
OH
H
H
H
H
O O
O
H
OH
OH
H
H
H
H
O
NHCOCH3H
OH
CH2OH
H
H
H
H
O
H
OH
CH2OH
H
H
H
H
O O
nNHCOCH3
O
a)
b)
Figure 1. 1 Structure de la cellulose (a) et de la chitine (b) (Ravi Kumar, 2000).
L’isolement de la chitine à partir des carapaces se fait normalement en deux étapes : 1) la
déprotéinisation et 2) la déminéralisation (élimination du carbonate et phosphate de calcium
(Knorr, 1984)). Roberts (1992) présente de façon détaillée les procédés d'obtention de la
chitine et du chitosane, ainsi que l'effet de leurs variations sur les caractéristiques des
chitosanes obtenus.
La déprotéinisation est normalement réalisée par trempage des carapaces dans une solution
de NaOH (1-10%) à des températures élevées (65-100°C). Le temps de trempage peut
varier entre 0.5 à 12 h et dépendra du procédé et des caractéristiques recherchées. On peut
remplacer le NaOH par d'autres bases telles que le KOH (No et Meyers, 1995).
7
La déminéralisation s’effectue en solution de HCl (jusqu’à 10%) à la température de la
pièce pendant des temps variant entre 0.5 h et quelques jours selon les méthodes de
préparation.
La chitine obtenue peut alors être décolorée à l’aide de solvants organiques tels que de
l’éthanol, de l’éther, de l’acétone ou du chloroforme permettant d’obtenir une chitine de
couleur blanche. Le poids moléculaire du polymère variera entre 0.4 et 1.96 x 106 Da selon
l’espèce et la méthode de déminéralisation. La chitine est insoluble dans l’eau, les solutions
diluées de sel et la plupart des solvants organiques (No et Meyers, 1995).
1.1.2. Le chitosane
Commercialement, l'obtention du chitosane (figure 1.2) est faite par la désacétylation de la
chitine par trempage dans une solution concentrée de NaOH ou de KOH (40-50%) à
température élevée (100°C et plus). La concentration de la solution en alcali, la
température, les temps de réaction, la source et le traitement de la chitine affectent la
composition finale du chitosane et ses propriétés (Knorr, 1984; No et Meyers, 1995). Le
degré de désacétylation (DDA) peut être augmenté par le lavage du produit et le traitement
en solution alcaline répété deux ou plusieurs fois. Le DDA peut varier entre 56 et 99%, la
couleur de la poudre peut varier de blanc à brun roux et le poids moléculaire moyen peut
varier entre 0.12-1.5 x 106 Da (No et Meyers, 1995). En solution acide, les NGlc deviennent
protonés ( HNGlcNGlcH ). La concentration des différentes formes dépendra de la
concentration en ions d'hydrogène.
NGlcH
HNGlcKa (Éq. 1.1)
8
Le DDA est défini par rapport au contenu en glucosamine (NGlc) et en acétylglucosamine
(AcNGlc) par la formule:
NGlcHfNGlcfAcNGlcf
NGlcHfNGlcfDDA
(Éq. 1.2)
où f(AcNGlc), f(NGlc) et f(NGlcH+) sont respectivement les fractions molaires de
l'acétylglucosamine, du glucosamine non protoné et du glucosamine protoné et
1 NGlcHfNGlcfAcNGlcf . À cause de son importance pour la solubilisation
du chitosane, l'équilibre des formes protonées (NGlcH+) et non ionisées des NGlc dans le
chitosane (en fonction du degré de polymérisation, de la distribution des monomères et du
degré d'ionisation) a fait l'objet de nombreuses études (Roberts, 1992). Le pKa des
glucosamines contenus dans le chitosane varie entre 5.5 et 6.5 en fonction de la densité de
charges (ρQ) présentes sur le polymère. Par extrapolation à un degré de dissociation nul,
Domard (1987) a estimé un (pKa)0 de 6.5 pour les NGlc. ρQ est relié au degré d'ionisation
(α) et au DDA par les équations suivantes:
NGlcfNGlcHf
NGlcHf
(Éq. 1.3)
eV
DPDAQ (Éq. 1.4)
où V est le volume molaire du chitosane, DP le degré de polymérisation moyen du
chitosane et e est un électron-volt. La relation entre la densité de charges et le pH est
obtenue à partir de l'équation d'Henderson-Hasselbalch:
1
logpHpKa (Éq. 1.5)
Par réarrangement (Cho et al., 2005) et en introduisant 1.5 dans 1.4, on obtient
9
1101
apKpHQ e
V
DPDAe
V
DPDA (Éq. 1.6)
À αDDA<0.5, la solubilité du chitosane dépendra des propriétés du solvant (polarité du
solvant et concentration), DP et la densité de charges (ρQ) le long de la chaîne. En solution
aqueuse légèrement acidifiée (acides organiques ou minéraux) et à faible force ionique, le
chitosane est normalement soluble quand αDDA>0.5. À pH alcalin (pH>7), le chitosane est
normalement insoluble dans l’eau et dans les solvants organiques.
La capacité du chitosane à lier l’eau est plus élevée que celle de la chitine. Les différences
sont dues à la cristallinité de chaque produit, la capacité des groupes fonctionnels à
s'hydrater et à s'ioniser (Knorr, 1982; 1984). À cet égard, les groupes fonctionnels du
chitosane sont un groupe aminé libre (Knorr, 1982) et deux groupements hydroxyle aux
positions C-3 et C-6 (Shahidi et al., 1999).
Figure 1. 2 Structure du chitosane (Ravi Kumar (2000)).
La chitine et le chitosane ne sont pas encore permis aux États-Unis comme ingrédients
alimentaires, mais ils sont permis comme suppléments alimentaires. Il y a peu
d’information sur le métabolisme de la chitine et du chitosane chez l’humain (Knorr, 1984).
Des études récentes ont montré des caractéristiques et propriétés importantes du chitosane.
Il n’est pas dégradable par les enzymes digestives (Zhou et al., 2006). Il a la capacité de
NH2
O
H
OH
CH2OH
H
H
H
H
O
H
OH
CH2OH
H
H
H
H
O O
nNH2
10
réduire le cholestérol hépatique et l’absorption de gras en se combinant avec les sels
biliaires et les triglycérides (Thongngam et McClements, 2005). Cependant, par sa capacité
de réduire les lipides absorbés, il pourrait interférer avec l’absorption des vitamines
liposolubles et, par sa capacité à former des gels dans l’intestin, il diminuerait l’absorption
des vitamines hydrosolubles (Deuchi et al. , 1995).
1.1.2.1. Gélification du chitosane
Les gels de chitosane non réticulés sont considérés comme des gels physiques
thermoréversibles (Roberts, 1992). Dans les gels physiques, les interactions
macromoléculaires résultent d'interactions ioniques, de van der Waals ou de liaisons
hydrogène. La gélification du chitosane dépend de l'équilibre entre les interactions
hydrophobes et hydrophiles; les premières dépendent principalement du DDA et les
secondes du DDA et du degré de protonation. Moore et Roberts (1980a et b) ont observé,
par étude de réacétylation, que la solubilité du chitosane diminue progressivement avec
l'augmentation de l'acétylation et résulte finalement en la formation de gels non réversibles.
Ils ont démontré que la gélification commence quand le DDA se situe entre 25 et 50%.
Montembault et al. (2005) ont noté que la vitesse de gélification du chitosane augmente
avec le DDA. Vachoud et al. (1997) ont observé une augmentation de la vitesse de
gélification avec le poids moléculaire du chitosane.
La neutralisation ou l'écrantage ionique des charges des glucosamines permet également la
formation de gels physiques forts similaires aux gels covalents. À pH 4 et à faible force
ionique, les groupes glucosamine du chitosane sont complètement chargés et provoquent
l'expansion de la macromolécule par répulsions électrostatiques intramoléculaires. La
chaîne possède alors un haut niveau de rigidité. Desbrières (2002) a démontré qu'à une
force ionique de 0.1 M NaCl, le chitosane est complètement écranté et que la rigidité est
11
similaire aux conditions de neutralité. Cho et al. (2006a) ont démontré que la concentration
critique d'enchevêtrement qui est reliée à Cgel (concentration critique), diminue avec
l'augmentation de la force ionique. À 5% (p/p) chitosane, Hamdine et al. (2005a) ont
démontré qu'on pouvait former des pseudo gels par écrantage des charges du chitosane par
de fortes concentrations d'acides monovalents (HCl: 0.25M; acide lactique: 0.5M; acide
acétique: 1M). En utilisant des acides bivalents (acide sulfurique, acide phosphorique et
acide oxalique) et en augmentant la concentration du chitosane, il est possible de former des
gels à des pH supérieurs et à des forces ioniques plus faibles (Hamdine et al., 2005b). Il a
été proposé par Yamaguchi et al. (1978) que les zones de jonctions entre macromolécules
seraient de nature ionique et coopérative comme les zones de jonctions « egg box » que l'on
retrouve dans les gels d'alginate de calcium.
Chenite et al. (2001) ont étudié la gélification thermoréversible du chitosane à pH neutre
dans des tampons de β-glycérophosphate. La solution gélifie lors du chauffage et se liquéfie
lors du refroidissement. Cho et al. (2005) ont expliqué la formation de ces gels par le
changement de la constante de dissociation des glucosamines lors du chauffage. Une
augmentation de température résulte en une diminution de la constante de dissociation (Éq.
1.7) et résultera en une diminution de la protonation du chitosane qui provoquera sa
gélification.
12
12 aa pK
T
TpK (Éq. 1.7)
En changeant la concentration en polymère, la force ionique du tampon et la nature des
contres ions présents, il est possible de moduler la température de gélification (Chenite et
al., 2001). Cho et al. (2006b, 2006c) ont démontré que dans différentes conditions de
concentrations et de forces ioniques, les solutions gélifieront lors du chauffage et pourront
soit maintenir leur structure gélifiée après refroidissement ou revenir à l'état liquide. De
façon similaire, Hamdine et al (2005a) ont obtenu un gel faible en mélangeant une solution
12
acide peu tamponnée de chitosane avec du chitosane en poudre. Lors de la solubilisation de
la poudre, le chitosane devient protonné et le pH augmente graduellement entre 6.2 et 6.5. Il
se forme alors un gel.
Muzzarelli et al. (2003) ont étudié la formation de gels de différents sels de chitosane dans
des solutions alcalines (Éq. 1.8). L'utilisation de solutions saturées de bicarbonate
d’ammonium (NH4HCO3) est particulièrement intéressante car l'interaction des ions
carbonates avec les groupes aminés ralentit la vitesse de gélification du chitosane. Ce
ralentissement donne un temps suffisant pour créer, à pH alcalin, un gel homogène après
mélange d'une solution acide de chitosane avec une solution de bicarbonate.
4220342 NHNHCOChitHCONHNHChitCo (Éq. 1.8)
Montembault et al. (2005) ont étudié la gélification du chitosane par rhéologie dynamique.
Lors de l'analyse en balayage fréquence (Fig. 1.3) et avant le Pgel, ils ont observé que le
module de perte G''(ω) est supérieur au module de conservation G’(ω). En fait leurs
résultats suivent le comportement d'une solution enchevêtrée où la variation de G'(ω)~ωn'
et G''(ω)~ωn'' où n'>n''. Si Montembault et al. (2005) avaient poursuivi les mesures à des
fréquences plus élevées, G'(ω) serait devenu supérieur à G''(ω) et, à cause du manque de
liberté de déplacement causé par l'enchevêtrement, un pseudogel aurait été formé
(G'(ω)~G''(ω)~ω0) (Kavanagh et Ross-Murphy, 1998). Au Pgel (Fig. 1.3), les propriétés
visqueuses et élastiques de la solution varient de façon identique (G'(ω)~G''(ω)~ωn) sur
l'ensemble des fréquences tel que prédit par la théorie de percolation de De Gennes
(Forgacs et al., 2003). Le point auquel la valeur de n est identique pour G'(ω) et G''(ω) peut
être utilisé comme estimateur de Pgel. La solution est alors dans un état à la fois liquide et
solide. Après le Pgel, le module de conservation G'(ω) devient supérieur à G''(ω); G''(ω) et
G'(ω) deviennent alors rapidement constant (G'(ω)~G''(ω)~ω0). Les valeurs de G'(ω) et
G''(ω) au point de gélification étaient dépendantes de la concentration initiale de chitosane
13
et donc le Pgel du chitosane dépend non seulement du nombre critique de jonctions par unité
de volume mais est aussi fortement influencé par les conditions initiales d'enchevêtrement
(organisation moléculaire de la solution).
Le DDA, le degré de protonation, le PM, la concentration du polymère et les propriétés du
solvant (polarité et force ionique) détermineront les propriétés du gel, le pH de gélification,
la concentration et le temps de gélification ainsi que les propriétés mécaniques des gels
(Montembault et al., 2005). Après la gélification, on peut observer des phénomènes lents de
contraction du gel et de synérèse.
Après le point de gélification
Au point de gélification
Figure 1.3 Variation de G' et G'' en fonction de la fréquence pendant la gélification d’une solution de chitosane. (Montembault et al., 2005).
1.2. Description des isolats de protéines de lactosérum
Le lactosérum est le liquide obtenu après la séparation des caséines du lait pendant la
fabrication de fromage. Le lactosérum contient environ 0.6% de protéines lactosériques et
14
93% d’eau (Foegeding et al., 2002). Ces protéines sont de plus en plus valorisées pour leur
haute qualité nutritive comme supplément en alimentation humaine et comme ingrédient
fonctionnel dans divers produits. Les isolats de protéines de lactosérum (IPL) sont obtenus
par des techniques d’ultrafiltration ou d'échange d'ions et ils peuvent contenir jusqu'à 97%
de protéines (Mulvihill, 1992).
Les propriétés fonctionnelles intéressantes et l’excellente valeur nutritionnelle des protéines
sériques favorisent leur utilisation dans une large gamme d’aliments. Les principales
propriétés fonctionnelles de protéines du lactosérum sont la formation de films interfaciaux
pour la stabilisation d’émulsions et de mousses et la formation de réseaux pour la
fabrication de gels et de films comestibles (Foegeding et al., 2002). Ainsi, ces protéines
peuvent être utilisées comme agent de remplacement des œufs dans la fabrication de pain,
de gâteaux et de croissants. Elles sont aussi utilisées dans produits comme le yogourt, le
fromage et les vinaigrettes comme agents gélifiants et émulsifiants (Mulvihill, 1992).
1.2.1 Les protéines du lactosérum
Les protéines « majeures » du lactosérum sont la -lactoglobuline et l’-lactalbumine. Les
autres protéines, comme les immunoglobulines, la sérumalbumine et la lactoferrine sont
connues comme protéines « mineures » du lactosérum, car elles sont présentes en quantités
plus faibles (Cayot et Lorient, 1998). Les protéines du lactosérum sont très utilisées en
transformation alimentaire en raison de leurs propriétés fonctionnelles intéressantes. Elles
sont aussi bien reconnues pour leur excellente valeur nutritionnelle (Bryant et McClements,
1998). Quelques caractéristiques physiques des protéines de lactosérum sont présentées
dans le tableau 1.1.
15
Tableau 1.1 Caractéristiques physiques des protéines de lactosérum, d'après Bryant et McClements (1998); Cayot et Lorient (1998).
Protéine pI M.W
(kD)
Proportion
(%)
Td*
(°C)
Irréversibilité au-
delà de (°C)
-lactoglobuline 5.2 18.4 60 78 70
-lactalbumine 4.8-5.1 14.2 22 62 100#
Albumine de sérum 4.8-5.1 66.0 5.5 64 n.d.
Immunoglobulines 5.5-6.8 150-960 9.1 72 n.d.
Isolat de protéines
de lactosérum - - 77-88£ -
* Température de dénaturation. # À 65 °C, 90% de réversibilité. £ D’après Aguilera (1995).
1.2.1.1 La -lactoglobuline
La -lactoglobuline (-lg), la principale protéine du lactosérum, est une protéine globulaire.
On la trouve dans les laits de ruminants et monogastriques mais elle est absente dans les
laits humains et de rongeurs. Dans le lait bovin, sa concentration varie entre 2 et 4 g/L
(Cayot et Lorient, 1998). Malgré des études extensives, sa fonction biologique n’a pas
encore été précisée (Hambling et al, 1992). La -lg a la capacité de fixer les molécules
hydrophobes comme les acides gras, la vitamine A et les molécules aromatiques (Hambling
et al., 1992; Grzyb et al., 2006), suggérant un rôle de transporteur.
Structure
La séquence primaire de la -lg est constituée de 162 résidus d’acides aminés, deux ponts
disulfures et un groupe thiol libre (Roefs et Peppelman, 2000). Sa richesse en acides aminés
16
sulfatés lui procure son intérêt nutritionnel. Le group thiol (SH) présente la possibilité de
formation de ponts disulfure (-S-S-) inter et intramoléculaires, qui peuvent s’interchanger
pendant les changements de conformation dus aux modifications de pH et de température
(Bottomley et al, 1990). On dénombre 7 variants génétiques, A et B étant les plus fréquents.
La différence entre ces deux variants se trouve dans deux résidus d’acide aminé, le 64 et le
118. Le résidu 64 est l’aspartyle pour le variant A, et la glycyle pour le variant B. Dans le
cas du résidu 118, le variant A possède la valyle, et le variant B possède l’alanyle (Cayot et
Lorient, 1998).
La structure secondaire de la -lg est composée de 43-50% de feuillets , de 10-15%
d’hélices et de 15-20% de courbures . Les feuillets s'enroulent pour former un tonneau
en forme de cône aplati dont l'intérieur est hydrophobe (Figure 1.4)
Figure 1.4 Modèle de la structure tertiaire de la -lactoglobuline (Brownlow et al, 1997).
Cette structure est principalement stabilisée par des liaisons chimiques (-S-S-) grâce aux
deux ponts disulfures et au groupe thiol libre. Plusieurs régions peptidiques de la -lg sont
17
riches en acides aminés chargés positivement (arginine, histidine et lysine) ou négativement
(acide glutamique et asparagine) qui procurent à la protéine des charges à sa surface
(Brownlow et al., 1997).
-lgd’ se polymérise-lgi
2.0 3.7 4.6 5.1 8.0 9.0 pH
-lg (-lg ;-lg)’ (-lg ;-lg) -lgd
Association octa-unitaire
(-lg ;-lg ; … ; -lg)
Figure 1.5 Représentation de conformation des unités de -lg en fonction du pH, d’après Cayot et Lorient (1998). -lgd : unité de -lg dénaturée irréversiblement; -lgi : polymère de i unités de-lg associés par des ponts S-S; (-lg; -lg;…; -lg) : association des unités de -lg par interactions physicochimiques.
Grâce aux interactions non covalentes, la structure quaternaire de la -lg se présente sous
forme monomère, de dimère ou d'octamère selon les conditions de pH (Figure 1.5). Entre
pH 5.2 et 6.6 et donc au pH naturel du lait (environ 6.8), la -lg existe sous forme d’un
dimère (Cayot et Lorient, 1998). En dessous de pH 3.0 et au-dessus de pH 6.6, les
octamères ou les dimères se dissocient par répulsion électrostatique et la -lg est sous sa
forme monomérique. Entre pH 3.5 et 5.2, elles s'associent en octamère (quatre dimères
associés en tétramère). À des pH plus grands que 8.0, la -lg est dénaturée et perd la
18
majorité de sa structure secondaire, résultant en une augmentation de la réactivité des
groupes thiols qui favorisent l'agrégation intermoléculaire. Verheul et al., 1998).
1.2.1.2 L’-lactalbumine
L’-lactalbumine (-la) est une petite protéine globulaire (14 kD) compacte que l’on trouve
dans le lait à une concentration de 1 à 1.5 g/L. Elle est la deuxième protéine la plus
importante des protéines du lactosérum (Tableau 1.1). L’-la permet de fixer différents
cations, comme le calcium, le manganèse, le zinc, le sodium et le potassium (Brew et
Grobler, 1992).
Structure
La séquence primaire de l’-la est constituée de 123 résidus d’acides aminés et de 4 ponts
disulfures (Cys6-Cys120, Cys28-Cys111, Cys61-Cys77, Cys73-Cys91). Elle est riche en
lysine, leucine, thréonine, tryptophane et cystéine (Kinsella et Whitehead, 1989). Elle est de
forme elliptique et caractérisée par une cavité qui permet à un ion calcium (Figure 1.6)
d'être chélaté par 5 atomes d'oxygène de liaison peptidique (Lys79, Asp84) et des groupes
carboxyliques (Asp82, Asp97 et Asp 88). Il existe 2 variants génétiques dont la différence
se situe dans la nature du résidu 10; le résidu arginine (variant B) est remplacé par un résidu
glutamine (variant A) (Brew et Grobler, 1992; Cayot et Lorient, 1998). Au pH
physiologique, la structure secondaire consiste en 26% d’hélices , 14% de structures et
60% de structure désordonnée (Bottomley et al., 1990). Dans les conditions physiologiques,
l’-la sert de protéines de signal pour la galactosyltranferase qui permet soit la synthèse du
lactose, soit la synthèse du N-acétyllactosamine.
19
Figure 1.6 Modèle de la structure tertiaire de l’-lactalbumine bovine. La sphère rouge représente l’ion Ca2+. (Graveland-Bikker, 2005).
L’-la est insoluble à son point isoélectrique (entre pH 4 et 5). L'ion calcium est stable lors
de la précipitation isoélectrique et lors de la dialyse. Il ne peut être éliminé qu'aux pH
induisant de forts changements de conformation (pH inférieurs à 2.5 ou supérieurs à 9).
L'apo--la (-la sans ion) retient une forme compacte similaire à sa forme native quand le
pH retourne au pH physiologique mais la structure de la protéine est plus lâche. L'ion
calcium stabilise la protéine lors des traitements de chaleur; l’-la possédant une
température de dénaturation de 62oC et l’apo--la une température de 40oC. À pH 6.7, l‘-
la chauffée à 65oC retrouve 80-90% sa forme native lors du refroidissement alors qu'après
un traitement de chauffage de 10 à 30 minutes à 100oC, environ 40% de l’-la retournent à
la forme native lors du refroidissement. Lors de chauffage prolongé, les liaisons disulfures
intramoléculaires se transforment progressivement en liaisons intermoléculaires (Chaplin et
Lyster, 1986). Lors d’un chauffage à pH 3.0, les ions calcium sont libérés, la protéine se
déplie et devient fortement réactive par l'exposition de parties hydrophobes et de
groupements thiol. Cependant l'agrégation des protéines est en partie réversible lors d’un
réajustement à pH 5.2 si le traitement n'a pas été trop sévère (Kinsella et Whitehead, 1989).
20
1.2.1.3 Les protéines mineures du lactosérum
L’albumine de sérum bovin (BSA à partir de son nom en anglais) se trouve dans le lait à
une concentration de 0.1 à 0.4 g/L. Elle est constituée de 582 résidus d’acides aminés et est
structurée par la présence de 17 ponts disulfure intramoléculaires. Elle possède un seul
groupe sulfhydryle libre, situé au résidu 34 (Bottomley et al., 1990). Sa structure secondaire
est formée par 58 à 86% d’hélices , un maximum de 4% de feuillets et moins de 5% de
courbures . La structure de cette protéine est plus lâche que celle de la -lg et est
constituée de trois domaines.
De pH 4.3 à pH 8, la BSA est sous sa forme native. De pH 2.7 à 4.3, les trois domaines
gardent leur intégrité individuelle mais ne sont plus stabilisés entre eux, favorisant une
forme allongée de la protéine. À des valeurs de pH inférieures à 3, la protéine se déplie
complètement par répulsions électrostatiques. À pH supérieur à 8, la BSA adopte une
structure plus compacte mais très proche de sa forme native.
La BSA a la capacité de fixer des acides gras et des lipides et peut aussi servir comme
transporteur de métabolites physiologiques ou de médicaments (Cayot et Lorient, 1998). La
présence de lipides favorise la stabilité thermique de la BSA mais entre 40 et 50oC, la BSA
se déplie partiellement, augmentant l'exposition des résidus apolaires et facilitant les
interactions protéines-protéines (Kinsella et Whitehead, 1989). La température de
dénaturation thermique varie selon les études entre 60 et 80°C en fonction des conditions de
mesure. L'augmentation de la force ionique induit une dénaturation à des températures plus
élevées.
21
Les immunoglobulines (Igs) font partie du système de défense immunitaire du sérum et
sont produites en réponse à l’exposition à des antigènes étrangers. Elles sont secrétées par
tous les mammifères. Dans le lait, la concentration de ces protéines est de 0.4 à 1.0 g/L
mais peut être beaucoup plus importante pendant les premiers jours de lactation de l’animal.
Les Igs sont des protéines de haut poids moléculaire. Il y a 5 types d’Igs et tous ont une
structure de base similaire (formée de 4 sous-unités). Les différences se situent au niveau de
la séquence des résidus d’acides aminés et de la présence de parties glycosylées (Larson,
1992). Ces protéines sont très thermolabiles et leurs propriétés fonctionnelles n'ont pas
encore été déterminées.
La lactoferrine est constituée de 691 résidus d’acides aminés et 16 ponts disulfures. Elle ne
possède pas de group thiol libre. La lactoferrine est une glycoprotéine fixatrice de fer et elle
est actuellement le seul transporteur d’ion ferrique connu dans le lait.
1.2.2. Gélification des protéines du lactosérum
Les études sur la gélification des protéines globulaires ont été de grande importance pour
l’industrie alimentaire depuis plusieurs années. Selon Clark et Lee-Tuffnell (1986), une des
premières publications sur le sujet a été faite en 1935 par Astbury, Dickinson et Bailey.
Plusieurs articles de revue ont été réalisées sur la gélification de protéines sériques soit dans
le secteur scientifique soit dans le secteur commercial (Aguilera, 1995; Bottomley et al.,
1990; Boye et al., 1997; Foegeding et al., 2002).
Les protéines de lactosérum ont besoin de chaleur pour gélifier. La gélification comprend
plusieurs étapes : la dénaturation de protéines permettant l’exposition des groupements
réactifs (groupes hydrophobes et sulfhydryles), l’agrégation des protéines et la formation du
22
réseau gélifié sous forme de fibres ou d'amas d'agrégats (Oakenfull, 1987; Aguilera, 1995).
Les gels de protéines sériques sont formés à températures supérieures à 75°C (Vittayanont
et al., 2002). Il a été observé que la dénaturation des protéines globulaires commence entre
40 et 62°C, suivi d’une renaturation partielle à 65°C et finalement la dénaturation serait de
95% à 85°C (Aguilera, 1995). Dû à sa capacité de former un gel et à sa concentration
élevée dans le lactosérum, la -lg est la protéine de lactosérum qui contrôle la gélification
des isolats de protéines de lactosérum. La BSA et l'-la ont peu d'influence dû à leurs
faibles concentrations dans le lactosérum (Aguilera, 1995).
En mélangeant les différentes protéines du lactosérum (BSA, -lg et -la), Paulsson et al.
(1986) ont observé que la vitesse de formation de gel et la force des gels diminuaient selon
l'ordre BSA>-lg-la. Cependant le comportement global du gel dépendait de la protéine
en plus forte concentration. Plus le mélange contenait une forte proportion d'une des trois
protéines, plus les propriétés du gel résultant possédaient les caractéristiques d'un gel
composé de cette protéine.
La formation du gel et sa structure dépendent de plusieurs facteurs, comme la température,
le temps de chauffage, le pH et la force ionique (Errington et Foegeding, 1998). Les
principaux facteurs sont expliqués ci-dessous.
Effet du temps et de la température de chauffage
La structure du gel est fortement reliée au couple durée/température de chauffage de la
solution protéique. Plus la température est élevée, plus le temps de chauffage nécessaire
pour la formation du gel est court. La vitesse de chauffage modifie aussi la structure du gel
(Stading et al., 1993).
23
Effet de la concentration
La fermeté des gels de protéines sériques augmente avec l’augmentation de la concentration
protéique. À faibles concentrations, l’agrégation des molécules induit l’augmentation de la
viscosité et la formation d’un gel est possible au-delà d’une concentration minimale de
protéines. Cette concentration est la concentration critique de gélification. En augmentant la
concentration protéique, la vitesse de gélification est aussi plus élevée (Foegeding, 2006).
Effet du pH et de la force ionique
Les solutions de protéines sériques gélifiées par la chaleur peuvent former deux types de
gels: les gels filamenteux et les gels agrégés aussi appelés particulaires (Foegeding, 2006).
Ces deux structures dépendront des conditions d'exposition des groupements répulsifs et
attractifs (Figure 1.7).
Gels filamenteux : Quand les forces répulsives (électrostatiques, d’hydration et entropiques)
entre molécules sont plus fortes que les forces attractives (principalement hydrophobe et de
van der Waals), il n’y a pas (ou peu) d’agrégation des molécules, les gels obtenus sont
translucides. C’est le cas des protéines chauffées en conditions de forte répulsion protéique
(pH éloigné du pI et faible force ionique) (Bryant et McClements, 1998). Ce type de gel est
formé par les protéines dénaturées et agrégées en bandes longues, courbées et flexibles
(pH>6) ou fibrilles linéaires et rigides (pH<4) (Foegeding, 2006). Le gel translucide a une
meilleure capacité de rétention d’eau que les gels agrégés (Bottomley et al., 1990; Cayot et
Lorient, 1998 and Foegeding, 2006). Les mêmes observations ont été faites pour la
gélification de BSA (Clark et Lee-Tuffnell, 1986) pour laquelle les gels obtenus à pH
faibles sont opaques et, malgré leur rigidité, ils sont moins élastiques que les gels à pH
24
élevés qui sont plus clairs, faibles mais plus élastiques (l’élasticité a été déterminée par les
mesures de tan , par des tests rhéologiques). Paulsson et al. (1986) ont trouvé qu'à pH 6.6,
les gels de BSA produits par chauffage (95oC) sont fortement élastiques comparativement
aux gels de -lg qui possèdent, pour une même concentration, une nature plus visqueuse.
solution
protéines natives non agrégées
solution
protéines natives non-agrégées
solution visqueuse
formation des agrégés
solution visqueuse
formation des filaments
gel fin
associationde filaments
gel agrégé
associationd’agrégés
chauffage
chauffage
+ du sel 4<pH<7
du sel 4>pH>7
Figure 1.7 Formation de gels fins et de gels agrégés, d’après Bryant et McClements (1998).
Gels agrégés ou particulaires : Dans des conditions qui diminuent les répulsions
électrostatiques entre protéines (force ionique élevée ou pH proche du pI), les gels
thermiques obtenus sont de type agrégé ou particulaire (Foegeding, 2006). Ces gels sont
25
blancs et ressemblent à un caillé de lait. Ils contiennent des protéines non dénaturées; les
gels sont fragiles et peu élastiques et fortement sujets aux phénomènes de synérèse. Avec
l'augmentation de la force ionique, les agrégats formés sont plus gros résultant de la
diminution des répulsions électrostatiques entre les protéines, facilitant leurs interactions.
Cet effet de la force ionique et du pH est montré dans la figure 1.7 (Bryant et McClements,
1998). L’effet de la force ionique est aussi lié aux modifications du pH (Cayot et Lorient,
1998). Il faut noter qu’à pH 4, les protéines sont faiblement chargées et la force ionique
n'influence pas le temps de gélification. À pH 7, les protéines sont fortement chargées et la
gélification ne peut pas se produire à faibles forces ioniques. L’ajout du sel réduit la
concentration critique de gélification (Foegeding, 2006). Du point de vue cinétique, l'étape
d'agrégation est déterminante. Le diamètre des agrégats varie selon la vitesse de chauffage.
De manière générale, plus la vitesse est lente plus la taille des agrégats est importante. Les
gels formés seront alors plus denses et plus opaques.
Le pH influence également la formation et la redistribution de ponts S-S, facteur important
pour le type de gel obtenu. À pH>6.5, l’élasticité, la fermeté et la résistance à un chauffage
à haute température sont dues à la formation des ponts disulfure inter protéiques. Par contre,
dans les gels formés à pH 2.5 il n’y a pas de redistribution des ponts S-S et les gels sont peu
ou pas élastiques (Cayot et Lorient, 1998). Errington et Foegeding (1998) ont démontré
que la texture des gels peut être modifiée de cassante à élastique en augmentant la quantité
de ponts disulfure. De plus, les gels d’isolat de protéines sériques à pH 2.5, 3.0 et 7.0 sont
fragilisés quand les liaisons disulfures sont inhibées.
En résumé, les gels filamenteux (fine-stranded) sont translucides ou clairs parce que la
largeur de leurs agrégats n’est pas assez grande pour diffuser la lumière. Ils ont un réseau
moléculaire homogène et sont formés quand les forces de répulsion sont grandes. Alors que
les gels agrégés (particulate) sont opaques dû la taille des agrégats de particules qui
peuvent diffuser la lumière plus facilement. Ils sont formés quand les forces de répulsion
26
sont faibles (Bryant et McClements, 1998). Boye et al. (1997) ont fait une étude de
l’influence individuelle des facteurs ci-haut mentionnés sur la formation et les
caractéristiques de gels de protéines sériques. Ils ont aussi étudié l’influence interactive des
facteurs. La fermeté du gel et sa capacité à retenir l’eau augmentent avec la concentration
de la protéine, le temps et la température de chauffage. Les propriétés sensorielles des gels
de protéines sériques sont, donc, très dépendantes des paramètres de gélification. Le
contrôle de ces paramètres permet la formation du type de gel désiré.
1.3 Description de la gélatine
La gélatine est un hydrocolloïde utilisé dans une très grande variété d'applications. Dans
l'industrie pharmaceutique et photographique, elle est utilisée pour l’encapsulation et la
formation des films biodégradables. Dans l’industrie alimentaire, elle est utilisée comme
agent gélifiant, épaississant et stabilisant. Son nom est dérivé du latin gelatus, qui signifie
ferme ou gelé. En plus de ses propriétés fonctionnelles intéressantes, la gélatine est une
protéine digestible et possède une bonne valeur nutritionnelle (Poppe, 1999).
1.3.1 La gélatine
La gélatine est obtenue du collagène, le constituant protéique principal du tissu conjonctif
des animaux. Le collagène se retrouve dans les os, la peau, les tendons et les cartilages
(Balian et Bowes, 1977). L’unité de base du collagène est le tropocollagène qui est
constitué par trois chaînes en hélice arrangées en parallèle et enroulées (coiled) entre
elles (Ledward, 1986) pour donner une triple hélice. Le collagène de type I a deux chaînes
identiques (1) et une chaîne différente (2); il est nommé [1(I)]2 2. Les collagènes II et
III possèdent trois chaînes équivalentes [1 (II)]3 et [1(III)]3. D'autres types de collagènes
27
ont été identifiés, mais le type I et III sont les formes natives les plus communes dans la
nature (Johnston-Banks, 1990). Dans les zones régulières, les chaînes de collagène ont
normalement une séquence répétitive en acides aminés glycine-X-Y. X est habituellement
de la proline (Pro) et Y de l'hydroxyproline (Hyp).
Eastoe et Leach (1977) présentent la composition des gélatines issues de différentes sources
comme les mammifères, les amphibiens, les poissons et les animaux invertébrés. La
composition de la gélatine dépendra de la source et du traitement utilisé pour sa production.
Presque tous les acides aminés présents naturellement dans les protéines sont aussi
retrouvés dans la gélatine. Les exceptions sont le tryptophane (un acide aminé essentiel) et
la cystéine. Considérant le procédé de production, il y a deux types de gélatine, le type A
qui est obtenu par un prétraitement acide et le type B obtenu à partir d’un prétraitement
basique (Johnston-Banks, 1990 et Poppe, 1999).
Lors du procédé alcalin, les os sont déminéralisés par trempage dans une solution alcaline
qui peut être de la chaux (lime) ou de l’hydroxyde de sodium. L'étape de trempage peut
durer de 6 à 20 semaines. Ce prétraitement permet l'élimination de différentes substances et
détruit les liaisons intermoléculaires du collagène. Le collagène devient donc soluble dans
l’eau. La solution de trempage doit être renouvelée régulièrement pour enlever les
contaminants et pour maintenir le degré d’alcalinité nécessaire. En termes de durée, de
température et de concentration en acide (vs. en alcali), le procédé acide est moins fort que
le traitement alcalin. Il est appliqué aux formes de collagène jeunes et immatures comme la
peau du porc et les os frais. Les matériaux sont trempés dans une solution diluée (maximum
5%) d’un acide minéral comme l'acide chlorhydrique, sulfurique ou phosphorique et dure
entre 10 et 48 heures.
28
La gélatine dérivée de sources d'origine marine a été une solution particulièrement
intéressante comme source de remplacement des gélatines d'origine animale lors de la crise
de la vache folle. De plus, la production de gélatine de poisson permet de revaloriser les
déchets des transformateurs alimentaires de produits marins. Gómez-Guillén et al. (2002)
ont comparé les caractéristiques de gélatine des différentes sources marines. L’intérêt
commercial de ce type de gélatine est cependant faible car ces gélatines ont des
températures de gélification et de fusion faibles et, sur une base de concentration, la force
des gels produits est plus faible que ceux obtenus avec des gélatines conventionnelles. Les
différences dans les propriétés physiques des gélatines des mammifères et gélatines des
animaux marins sont dues à leur faible contenu en acides aminés de type imines (Pro et
Hyp) dans les gélatines de poissons (Ledward, 1986). Haug et al (2004 a) ont fait une étude
comparative des propriétés de ces deux types de gélatines. Ils ont remarqué l’importance
des acides imines dans la formation des structures et la stabilisation des réseaux de gels de
gélatine.
La composition en acides aminés est directement reliée au point isoélectrique (pI) de la
protéine. Dans le collagène, 35% des acides aminés sont de nature basique et confèrent à la
protéine naturelle un pI basique aux environs de 9.4. Dans des conditions drastiques de
prétraitement et d'extraction (acide ou alcaline), l'asparagine et la glutamine (acides aminés
dont les radicaux ne peuvent s'ioniser) peuvent être détruites ou être converties en acide
aspartique (pKradical: 3.9) ou en acide glutamique (pKradical: 4.07). Cette perte ou conversion
d'acides aminés résulte en une augmentation en acides aminés acides (chargés négativement
à pH 6.0) et provoquera une diminution du pI en proportion avec la quantité d'acides aminés
détruits ou convertis. Ainsi le pI d'une gélatine native pourra passer de 9.4 à 4.8 et le
contenu en acides aminés basiques Pro et Hyp variera entre 5 et 10%. Les gélatines ayant
été traitées à l'alcali (procédé très drastique) auront des pI entre 4.5 et 5.3, alors que les
gélatines ayant été traitées à l'acide (procédé moins drastique) auront des pI entre 6.0 et 7.5
(osséine) et entre 7 et 9.4 (peau de porc) (Eastoe et Leach, 1977; Johnston-Banks, 1990;
Poppe, 1999).
29
1.3.2. Gélification de la gélatine
La gélatine s’hydrate dans l’eau froide. Elle peut absorber entre 5 et 10 fois son volume en
eau mais ne se solubilise pas. Elle est soluble après un chauffage à des températures
supérieures à celle de la fusion des gels, normalement 40°C. À cette température la
molécule de gélatine est enroulée au hasard (random coil) avec certaine limitation de
rotation associée aux acides aminés chargés. Les solutions de gélatine forment des gels
transparents au refroidissement au dessous de leurs températures de point de fusion,
normalement 35°C. Selon le poids moléculaire, la concentration critique de formation de
gel pourra varier mais est généralement aux environs de 1%. Les gels de gélatine sont
thermiquement réversibles et le procédé peut être répété plusieurs fois. Le fait que ces gels
fondent dans la bouche les rend particulièrement désirables dans certains types des aliments
(Ledward, 1992).
Les gels de gélatine sont caractérisés commercialement par le ‘bloom strength’. Le bloom
strength est défini comme étant le poids mesuré en grammes (g) nécessaire pour faire
pénétrer, à une profondeur de 4 mm, un cylindre de 12.7 mm dans un gel de 6.67% (p/p) de
gélatine qui a maturé pendant 16 à 18 heures à 10°C. Si ces conditions sont modifiées, les
valeurs de force des gels varieront également. Le bloom des gélatines commerciales varie
entre 50 et 300 g ou bloom (Johnston-Banks, 1990; Poppe, 1999).
Le mécanisme de gélification de la gélatine implique une conformation de triple hélice des
régions riches en acides aminés imines (Pro et Hyp) des chaînes polypeptidiques. Ces
hélices sont formées en refroidissement et stabilisées par des liaisons hydrogène formées
entre les acides imines et les groupes C-H proches, par des attractions de type van der
Waals entre résidus imines inter-chaînes ou par une réorganisation de l’eau (Ledward,
30
1986; Haug et al, 2004a; Segtnan et Isaksson, 2004). Les zones de jonction sont
généralement formées par une seule triple hélice, cependant il a été observé que quelques
zones de jonction peuvent aussi être formées par plusieurs triples hélices arrangées
ensemble (Oakenfull et Scott, 1986). Malgré ces observations, il y a encore des débats sur
la cinétique et le mécanisme de gélification de la gélatine (Ledward, 1992). Selon Johnston-
Banks (1990) dans les gels formés avec des solutions diluées (inférieures à 0.5%) la
formation des zones de jonction sera unimoléculaire, alors qu’à concentrations supérieures
ces zones de jonction seront multimoléculaires (bi ou tri moléculaire). La figure 1.8
présente un schéma des différentes conformations de la gélatine lors de la gélification.
Rouleau au hasard
Triple hélice intra
Zones d’union bi moléculaire
Zones d’union tri moléculaire
Figure 1.8 Conformations des chaînes qui entraîneront la gélification de la gélatine, d’après Johnston-Banks (1990).
La gélification de la gélatine donne des gels non équilibrés, c'est-à-dire, la fermeté du gel
augmente avec l’augmentation du temps de maturation. Cette augmentation de fermeté avec
le temps est probablement due à la réorganisation, l’élargissement ou la formation de
nouvelles zones de jonction dans le réseau (Haug et al., 2004a; Ledward, 1986). Les zones
de jonction sont formées de plusieurs résidus d’acides aminés par chaîne et elles sont de
31
différentes grandeur et stabilité. Oakenfull et Scott (1986) présentent une méthode pour
estimer la longueur des zones de jonction. Ils ont trouvé que la moyenne du nombre de
résidus impliqués dans les zones d’union de la triple hélice pour un gel maturé à 15°C (la
concentration et le temps ne sont pas spécifiés dans ce document) est de 142.
Les caractéristiques du gel (fermeté, point de fusion et point de gélification) dépendent
fortement des caractéristiques de la gélatine utilisée (poids moléculaire, acides aminés et
dénaturation du collagène pour la manufacture de la gélatine) et des conditions
environnementales. Les points de gélification et de fusion des gels sont influencés par
plusieurs facteurs. Le point de fusion augmente avec l’augmentation de la concentration de
gélatine. L’ajout de sels aussi modifie les points de fusion et de gélification, ainsi que la
rigidité du gel. Quelques substances chimiques comme le KSCN, le LiBr, le CaCl2, l'urée et
les phénols interfèrent avec la formation des liaisons d’hydrogène, empêchant la formation
du gel (Boedtker et Doty, 1954; Johnston-Banks, 1990). Le temps de maturation influence
aussi ces propriétés. Plus le temps de maturation est long, plus le gel est fort et plus le point
de fusion est élevé. La fermeté des gels est peu modifiée par le pH entre 4 à 10. Cependant
elle diminue quand le pH est hors de ces valeurs. La température est un autre facteur qui
influence la fermeté de gel. Elle augmente avec la diminution de la température de
maturation, due à l’augmentation du nombre des zones de jonction ou l'allongement des
zones de jonction déjà existantes (Ledward, 1992). Le point de début de gélification
dépendra également du traitement mécanique et thermique appliqué à la solution de
gélatine.
L’histoire thermique du gel influence aussi ses caractéristiques. Une solution de gélatine
maintenue à une température inférieure mais proche de celle nécessaire pour la nucléation
donnera un gel faible avec peu de zones d’union. Cependant, ces zones de jonction seront
très stables car les chaînes impliquées dans ces jonctions sont assez flexibles pour arriver
elles-mêmes à la forme la plus stable (similaire à celle du collagène). Si la température du
32
gel est réduite, la formation de nouvelles zones de jonction et l'allongement de celles déjà
existantes donneront un gel plus fort. Ce gel sera plus fort qu’un gel formé aux mêmes
conditions mais sans la formation initiale du gel à température plus élevée (Ledward, 1986).
1.4. Interactions protéines-polysaccharides
Malgré la diversité et la quantité des constituants qui participent à la formation des
structures et des caractéristiques sensorielles des denrées alimentaires, on peut considérer
que la structure des aliments implique d'une part l'eau et les composés solubles et de l'autre
les colloïdes (polysaccharides, protéines et gras). On observe au niveau de chacun de ces
constituants une grande diversité en termes de composition chimique et physique. L'eau
contiendra un ensemble de petites molécules organiques et inorganiques qui détermineront
sa polarité, sa force ionique et son pH. Les polysaccharides et les protéines sont composés
de groupements hydrophobes, hydrophiles et, ionisables selon les conditions du milieu.
Dans un mélange de biopolymères, les différents phénomènes enthalpiques et entropiques
peuvent conduire à une séparation de phases ségrégative ou associative (complexation). Les
conditions de séparation de phases (mécanisme par nucléation ou décomposition spinodale)
et les paramètres de procédés (cisaillement, pression, vitessse de chauffage, etc.)
influenceront aussi la cinétique de gélification, les propriétés rhéologique et structurale des
gels (gels à phases séparées, gels couplés) (Turgeon et al., 2003).
1.4.1. Comportement en mélange des polysaccharides et des protéines
Lors de mélange de solutions contenants des polysaccharides et des protéines, l’équilibre
des interactions attractives et répulsives entre les constituants résultera en la formation de
complexes ou en leur séparation (Tolstoguzov, 1996). Dans un système aqueux, les
33
interactions entre macromolécules (protéines ou polysaccharides) peuvent être soit
répulsives, soit attractives. Elles peuvent être fortes et s’établir sur de longues distances
dans le cas de formes ionisées ou être faibles et s'établir sur de faibles distances dans le cas
des liaisons hydrogène, de van der Waals ou des liaisons hydrophobes. L'ionisation des
macromolécules dépendra de la nature des groupements ionisables (sulfatés, carboxyliques,
aminés) de leur environnement macromoléculaire et de la densité de charges, du pH, de la
force ionique et de la polarité de la solution. Les interactions sont dites répulsives quand
deux polymères différents de même charge et/ou neutre se repoussent. Ils ne peuvent
former de complexes macromoléculaires. Les interactions répulsives permettent d'obtenir
des concentrations élevées des deux biopolymères en solution et peuvent se produire à des
forces ioniques élevées (plus que 0.3). Les interactions sont dites attractives quand les
biopolymères sont de charges opposées et peuvent former un complexe par attraction
électrostatique. Elles se produisent à de faibles concentrations de l'un des deux polymères
quand l'autre est en excès et sont favorisées par les faibles forces ioniques (moins de 0.3).
Dans le cas des complexes associatifs (Tolstoguzov, 1991) :
1. Si la charge nette du complexe est différente de zéro, les complexes sont normalement
solubles (figure 1.9) dû à l’interaction des charges avec le solvant et les répulsions
électrostatiques entre complexes. Cette solubilité est également favorisée par le mouvement
brownien si la masse et la densité des complexes restent suffisamment petites.
2. Si la charge nette à la surface du complexe est zéro, les complexes s'agglomèrent et
deviennent insolubles (Schmitt et al., 1998). Ils formeront une phase riche en biopolymères,
alors que le solvant formera une phase dépourvue de biopolymères. Ce phénomène est
appelé coacervation lorsque les complexes ne précipitent pas mais demeurent en suspension
dans une phase liquide visqueuse. Il est possible d’observer cette phase en microscopie
optique par la présence de gouttelettes distinctes dans la solution.
34
Figure 1.9 Description du comportement des mélanges de biopolymères, C : concentration totale des polymères (Tolstoguzov, 2003).
Dans le cas des mélanges en conditions ségrégatives (molécules de mêmes charges ou
neutres), l'incompatibilité est généralement contrôlée par une concentration critique. Quand
le biopolymère dépasse une valeur critique, la co-solubilité des biopolymères est limitée et
deux phases se forment. Chacune des phases contient les deux biopolymères mais dans des
proportions différentes. Dans le cas des mélanges protéines et polysaccharides, leur
compatibilité (co-solubilité) est particulièrement rare malgré la bonne co-solubilité de leurs
monomères (sucres et acides aminés hydrophiles). Cette incompatibilité des biopolymères
résulte de la différence de pression osmotique autour des macromolécules. Deux polymères
différents, par rapport à leur géométrie ou à leur potentiel (charge) de surface, s'excluront
mutuellement dans une zone plus ou moins importante de leur surface. Le volume dit
« exclus » est une distance d'approche entre deux macromolécules où il sera nécessaire de
fournir de l'énergie supplémentaire pour permettre le rapprochement des biopolymères.
Interactions répulsives
-Macromolécules avec charges opposées
force ionique faible
-
-force ionique élevée
-
-
- Macromolécules neutres et/ou avec charges égales
Inter-biopolymère Incompatibilité
Biopolymères dans phases différentes
Complexes solubles
Complexes insolubles
Biopolymères dans la même phase
C < C seuil C > C seuil
Interactions attractives
35
Cette différence de pression osmotique entre le volume exclus et le restant de la solution
riche en biopolymères fera que les molécules, ayant la même pression osmotique à leur
surface, tendront à s'associer (Meyuhas et al., 1996; de Kruif et Tuinier, 2001; Tolstoguzov,
2003).
Un diagramme de phases typique se composera de 3 zones distinctes (a, c et e) délimitées
par les lignes binodales (gh) et de changement de phase (ef) (figure 1.10). À faibles
concentrations, l'association des biopolymères induite par la différence de pression
osmotique est faible et réversible (de Kruif et Tuinier, 2001) permettant la co-solubilité des
polymères (zone a). Les zones c et e correspondent à des séparations de phases mais avec
des phases de continuité différentes: la zone e a une phase continue riche en polysaccharide
alors que la zone c a une phase continue riche en protéines (figure 1.10 ). À partir d'une
concentration critique (ligne gh) d'un ou des deux polymères, la différence de pression
osmotique est suffisante pour causer l'agrégation irréversible et la séparation de phases. Ce
phénomène de déplétion dépendra également du poids moléculaire (Meyuhas et al., 1996),
de la conformation (Tolstoguzov, 2003), de la rigidité de la macromolécule et évidemment
des charges électrostatiques, de la force ionique, la polarité du solvant et de la température
des solutions (de Kruif et Tuiner, 2001). Dû au mouvement brownien, les macromolécules
linéaires possèdent par unité de volume de polymère un volume exclu plus grand que les
molécules globulaires (Tolstoguzov, 2003). Les changements de pH, de température, de
force ionique ainsi que la présence de sucre joueront également un rôle car ils résulteront en
des changements de conformation et de charge des polymères (changement de volume
exclus) et modifieront la cinétique de séparation de phases par les changements de viscosité
et de pression osmotique de la solution (Blijdenstein et al., 2004; de Kruif et Tuinier, 2001).
La plupart des protéines alimentaires peuvent former des complexes avec des
polysaccharides anioniques dans une solution si la valeur du pH est entre le point
isoélectrique des deux polymères (Dickinson, 1998). Ainsi, les charges de chaque polymère
36
sont opposées et l’attraction entre molécules rend possible la complexation. Le pH, la force
ionique, la charge, la concentration et le ratio des polymères ont un effet sur la formation
des complexes. Schmitt et al. (1998) ont fait une revue où ils expliquent la formation et les
caractéristiques des complexes protéines-polysaccharides, ainsi que des facteurs qui
influencent ce phénomène. Ces facteurs sont expliqués brièvement ci-dessous.
Figure 1.10 Diagramme de phases typique d’un mélange de protéines-polysaccharides (Adapté de Morris, 1990).
1.4.2. Influence du pH, de la force ionique et de la température
Le pH est un facteur important dans la formation des complexes car il affecte à la fois le
degré d’ionisation des groupes fonctionnels des biopolymères et la force ionique de la
solution. Par exemple, pour un polysaccharide anionique fortement chargé (pH>pKa), le
rendement maximal pour la formation de complexes s’obtient lorsque les protéines seront
chargées positivement (pH en dessous du pI de la protéine). Les deux biopolymères auront
des charges nettes de signes opposés et nous pourrons assister à une attraction maximale.
Pour un polysaccharide cationique tel que le chitosane (-NH3+), le rendement maximal en
formation de complexes sera lorsque le polysaccharide est chargé (pH<pKa) et que les
protéines portent des charges négatives (pH au dessus du pI de la protéine) (Williams et
Phillips, 1995). Ainsi Laplante et al. (2005) ont trouvé que les protéines de lactosérum
37
forment des complexes avec le chitosane à pH 5.5 et 6, c’est à dire au dessus du pI de ces
protéines (5.1).
Laplante (2003) a également étudié l’effet du pH, de la force ionique, de la concentration et
du ratio des polymères sur la formation des complexes et sur la stabilisation des émulsions
à l'aide de ces complexes. Si la force ionique est faible, les charges positives et négatives
des biopolymères sont pleinement exposées et la formation de complexes est possible.
Cependant, si la force ionique est élevée, les ions des électrolytes masquent les charges des
biopolymères, l’attraction entre biopolymères est réduite et la formation de complexes en
sera diminuée.
Les faibles températures favorisent la formation de ponts hydrogène, alors que les
températures élevées favoriseront la formation des liaisons covalentes (protéines-protéines)
et d’interactions hydrophobes en raison à l’exposition des sites hydrophobes des protéines
globulaires et aux changements dans la structure du polysaccharide. Le nombre et la
grosseur des complexes sont influencés par la température. Schmitt et al. (1998)
mentionnent que le nombre de complexes de protéines de lactosérum et de gomme
xanthane est plus élevé après traitement thermique (80°C pendant 20 min).
1.4.3. Influence de la concentration et du ratio des biopolymères
À une concentration élevée de biopolymères, le système présentera une séparation de
phases ségrégative due à la compétition entre les macromolécules pour le solvant et à l’effet
de volume exclus. Le ratio polysaccharide-protéine a aussi un rôle important dans la
formation de complexes. Quand un des biopolymères est en excès, les complexes auront
tendance à être plus solubles car les charges ne sont pas neutralisées.
38
1.5. Gélification et gels de systèmes mixtes
1.5.1. Définition de gel
La gélification est une propriété fonctionnelle importante des protéines et des
polysaccharides. La structure et les caractéristiques des gels dépendent de la nature des
biopolymères, de leurs interactions et de leur mode de fabrication. Il n’existe pas de
définition exacte d’un gel. Cette difficulté de définir des gels est en relation avec la
diversité de structure et leur complexité. Clark (1992) définit un gel comme une matière
formée d’un réseau insoluble et continu de particules ou de polymères qui contient une
phase liquide. Flory (1974) classe les gels en quatre catégories: 1) les structures lamellaires
bien ordonnées (ex: surfactants), 2) les réseaux de polymères désordonnés liés de façon
covalente, 3) les réseaux de polymères désordonnés formés par agrégation mais ordonnés
au niveau des jonctions (polysaccharides), 4) les structures désordonnées particulaires
(protéines). Kavanagh et Ross-Murphy (1998) considèrent que les structures des gels
peuvent aller d'une matrice stabilisée par des liaisons intermoléculaires covalentes (gels
chimiques) à une structure figée par enchevêtrement des macromolécules (gels physiques).
Les gels chimiques sont irréversibles. Ils ne fondent pas au chauffage, mais leur
caractéristique de gel peut être perdue par le bris des liaisons chimiques. Donc, il est
possible d’observer une fusion du gel en raison de la dégradation ou l’hydrolyse du
polymère, mais le système ne gélifiera pas de nouveau (Stainsby, 1980). Les gels de
protéines globulaires sont des gels chimiques. Dans les gels physiques, les liaisons résultent
d'interactions physiques (cristallisation, formation d'hélices ou de complexes) provenant de
liens de faible énergie telles que les liaisons hydrogène et les interactions électrostatiques
ou de van der Waals. Parce que la force de ces interactions est proportionnelle à la
température, les gels physiques sont également nommés gels thermoréversibles. Les gels de
gélatine et de chitosane sont des gels physiques. Les gels de protéines sériques et de la β-
lactoglobuline peuvent être à la fois considérés comme des gels chimiques car ils sont
stabilisés par des ponts disulfures et comme des gels physiques selon les conditions de
39
formation (Errington et Foegeding, 1998; Lowe et al., 2003). Les liaisons disulfures (liens
covalents) sont favorisées à pH élevés.
Pour former un gel physique, la concentration des polymères doit être supérieure à une
concentration critique (Cgel). Cette concentration diminue avec l'augmentation du pH de la
solution et, jusqu'à un seuil limite, avec l'augmentation du poids moléculaire (PM) (Rwei et
al., 2005). Au dessus de ce seuil, le PM n'influence plus Cgel. Montembault et al. (2005) ont
estimé ce seuil à 0.1% pour le chitosane (PM 500 kD, DDA: 5%; 220C, pH: 4.5, force
ionique 0.15M). En dessous de Cgel, les polymères formeront des suspensions d'agrégats et
éventuellement précipiteront ou floculeront. Lors de la gélification d'une solution, le point
critique auquel le réseau tridimensionnel apparaît est nommé point de gélification (Pgel).
Lors de la gélification d'une solution et avant le Pgel, la solution est liquide et la viscosité
augmente continuellement. Au Pgel, la viscosité est infinie et la force du gel augmente alors
constamment pour finalement atteindre un point d'équilibre. Selon les conditions
expérimentales, ce point peut être exprimé en termes de concentration, de temps, de
température ou de pH.
Après formation du gel, les propriétés des gels peuvent continuer d'évoluer. Ce
comportement résulte du réarrangement du réseau par dissociation des liaisons et création
de nouvelles liaisons. Selon le nombre de jonctions et leur longueur, les propriétés du gel
évolueront. Ainsi un gel ne pouvant former de longues zones de jonction sera plus élastique
et ne montrera pas de synérèse (Stainsby, 1980).
40
1.5.2 Gélification de systèmes mixtes
La gélification des systèmes mixtes, avec deux polymères, peut résulter en différentes
formes de réseaux. La figure 1.11 montre ces formes : a) un réseau gélifié formé de l’un des
polymères et le deuxième polymère ne forme pas de gel; b) des réseaux interpénétrés,
formés de deux ou plusieurs réseaux gélifiés indépendants; c) des réseaux avec séparation
de phases, formés par un mélange incompatible gélifié avant la séparation de phases
complète du système et d) des réseaux couplés où les deux biopolymères participent à la
formation d'une même matrice. La dernière forme est le résultat de l’association directe
entre deux biopolymères (Morris, 1998). Ainsi, les interactions attractives entre une
protéine et un polysaccharide, dues aux charges opposées de chaque polymère, peuvent
entraîner la formation d’un réseau couplé.
Dans le cas où le gel résulte de l’incompatibilité des polymères pour former un gel à phases
séparées et que les deux polymères forment des gels à des vitesses différentes (c'est-à-dire
quand le réseau gélifié d’un des polymères est presque complètement formé avant que le
deuxième polymère commence à gélifier), les propriétés mécaniques du gel mixte final
seront plus similaires à celles du gel du polymère qui se forme en premier (Morris, 1990).
La phase continue sera celle du composant avec le volume plus grand, alors que l’autre
polymère sera présent de façon dispersée dans la phase continue. Kasapis et al. (1993a, b, c,
d) ont fait une étude sur la gélification de la gélatine et la maltodextrine seules et en
mélange. Ces deux polymères gélifient à froid mais à des vitesses différentes. Un autre
exemple, avec des polymères qui gélifient en conditions différentes est le travail fait par
Ould Eleya et Turgeon (2000a et b) qui ont étudié la gélification de la -carraghénane qui
gélifie à froid et de la -lactoglobuline qui gélifie à chaud.
41
La gélification d’un système mixte est un peu différente quand seulement un des polymères
contribue à la formation de gel. Si le polymère gélifiant est la phase dispersée, on trouvera
des zones distinctes dans la phase continue non gélifié. Alors, que si le polymère gélifiant
est la phase continue, des zones de solution dispersées seront trouvées dans le système
gélifié. Dans ces deux cas, la non-gélification d’un des polymères diminue la fermeté du gel
de l’autre polymère.
Figure 1.11 Types de gels formés avec un mélange de biopolymères, (Williams et Phillips, 1995). a) un réseau gélifié formé de l’un des polymères, b) des réseaux interpénétrés, c) des réseaux avec séparation de phases, d) des réseaux couplés.
La plupart des applications des gels dans le secteur alimentaire sont obtenues avec plus
d’un agent gélifiant (deux ou plus biopolymères). L’application des gels mixtes dans
l’industrie alimentaire a plusieurs avantages. La gélification des mélanges de polymères
peut être inhibée ou renforcée; les caractéristiques rhéologiques et sensorielles (e.g. texture,
couleur, fermeté, capacité à la rétention de l’eau) des gels mixtes peuvent être très
différentes de celles des gels formés par un seul polymère (Oakenfull, 1987; Syrbe et al.,
(a) (b)
(c) (d)
(a) (b)
(c) (d)
42
1998). L’utilisation d’hydrocolloïdes dans les produits laitiers augmente la durée
d’entreposage en évitant, par exemple, la séparation du lactosérum ou des particules
dispersées de l’aliment (Syrbe et al., 1998). De plus, quelques constituants polymériques
qui ne peuvent pas former de gels séparément le font quand ils sont en mélange.
L’obtention d’un gel mixte plus fort que le gel des polymères séparés est possible, ou même
un gel mixte aussi fort à une concentration totale plus faible à laquelle les constituants
individuels ne peuvent pas gélifier (Morris, 1990, Laneuville et al. 2006). Toutes ces
options peuvent résulter dans l’élaboration d’une grande variété de produits avec des
caractéristiques très différentes.
1.6 État des connaissances
Les gels contenants plus d'un agent gélifiant peuvent résulter en la formation de trois
différents types de gels mixtes: réseaux interpénétrés, couplés et avec séparation de phases
(Turgeon et Beaulieu; 2001) selon les interactions existantes entre les polymères. Plusieurs
des études sur les interactions protéines-polysaccharides ont été réalisées avec des
polysaccharides anioniques ou neutres. Les premiers articles de synthèse ont été élaborés
par Tolstoguzov (1990, 1991, 1996, 2003). de Kruif et Tuinier (2001) ont présenté une
revue sur le comportement de phase de systèmes mixtes. Ils ont décrit la séparation de
phases ségrégatives et associatives basée sur l’entropie et l’enthalpie des systèmes. Parmi
les mélanges traités on retrouve les systèmes gélatine-dextran et -lg-gomme arabique. Une
autre revue a été présentée (Turgeon et al. 2003) sur les mécanismes de l’incompatibilité
thermodynamique (produit par entropie) et de la formation de complexes (produit par
entropie et enthalpie) des mélanges de protéines et polysaccharides. Kasapis (2008) a
présenté la morphologie et la fonctionnalité des gels à phases séparées en comparant les
taux de solides faibles et élevés (comme retrouvées en confiserie).
43
Plusieurs travaux de recherche des mélanges de protéines sériques et PS anioniques ont
rapporté la formation des gels avec séparation de phases. Ces types de gels ont été formés à
pH supérieur au pI des protéines avec carraghénane, pectine, dextran sulfaté et gomme
xanthane (Ould Eleya et Turgeon, 2000a et b; Beaulieu et al., 2001; Turgeon et Beaulieu,
2001; Zhang et Foegeding, 2003; Bertrand et Turgeon, 2007). La concentration totale du
polysaccharide, le pH, la force ionique, l'ajout des cations et la température ont été des
facteurs étudiés qui modifient le degré d'agrégation des protéines et les propriétés physiques
du gel formé. La formation de ce type de gel peut se produire aussi avec des
polysaccharides neutres. Tavares et al. (2003 et 2005), ont observé des gels biphasiques des
mélanges protéines sériques-galactomannanes à différents degrés de branchement.
D’autres travaux ont rapporté la formation des gels couplés à pH inférieur au pI des
protéines avec des protéines sériques et polysaccharides anioniques. Ould Eleya et Turgeon
(2000b) ont observé qu'à pH 4, le gel mixte -lg-carraghénane est plus ferme que les gels
biphasiques à pH 5-7. Le comportement rhéologique en fonction de la température des gels
mixtes est aussi différent. À pH 4, le comportement du gel couplé est semblable au gel
formé seulement par la protéine, cependant la fermeté est supérieure dans le gel qui contient
les deux polymères. À pH 5-7 le gel à phases séparées présente aussi un comportement
biphasique. Laneuville et al. (2006) ont étudié la formation d'un gel couplé de -lg-
xanthane à une concentration totale de biopolymères très faible (0.1%) sans l'application
d'un traitement pour dénaturer la protéine. À concentrations élevées des protéines les
complexes formés étaient plus gros et interrompaient le réseau gélifié. La stabilité
maximale du gel a été trouvée à un pH et ratio optimal, où il existait une équivalence
stœchiométrique de charges entre les molécules des polymères.
En ce qui concerne la gélatine, les effets de la vitesse de refroidissement, la température de
gélification, le pH et la concentration des PS sur la formation de gels mixtes gélatine-
gellane et gélatine-gomme de guar ont été rapportés par Fonkwe et al. (2003). Le
comportement de gélification a été semblable à celui de la gélatine. Des gels élastiques ont
44
été formés à faibles températures (0-4°C), alors qu'à température supérieure (10°C) les gels
formés ont été plus visqueux. À vitesses de refroidissement faibles (1-2°C/min), les
solutions ont gélifié plus rapidement qu'à vitesses plus élevées (4 et 8°C/min). L'ajout de
polysaccharides a augmenté la fermeté de gels; les gels mixtes contenant du gellane étant
plus fermes que les gels contenant de la gomme de guar. La présence des PS augmente la
température de gélification arrivant au point de gélification plus rapidement. Une
concentration de PS et pH optimal ont été estimés.
D’autres mélanges ont montré aussi la formation de gels à phases séparés avec des
propriétés similaires à celles des gels de gélatine. Khomutov et al. (1995) ont étudié le
mélange gélatine-amidon de pomme de terre. Ils ont trouvé que le réseau est formé
seulement par la gélatine, et que l'amidon a peu d'effet sur la température de gélification. de
Hoog et Tromp (2003) ont étudié le mélange gélatine-dextrane qui également formait des
gels à phases séparées. Kasapis et al. (1993a, b, c et d) ont étudié un mélange gélatine-
maltodextrine et ont rapporté aussi la formation de gels à phases séparés. Dans tous ces
travaux, la formation des gels se produisait avec une certaine interaction entre les
phénomènes de séparation de phases et de gélification du système, cette dernière pouvant
empêcher ou favoriser la séparation de phases. La structure finale du gel dépend des
vitesses relatives de séparation de phases et de gélification.
Des travaux sur les interactions des mélanges de gélatine avec de PS anioniques ont montré
la formation de complexes. Gilsenan et al. (2003) ont observé la formation de complexes de
gélatine-pectine à des pH très inférieurs au point isoélectrique de la gélatine, où la charge
positive de la gélatine permettait l'association avec la pectine. Ils ont trouvé que les liaisons
se font au long d'une petite région de charges positives de gélatine. Il semble que les
séquences gélatine-pectine n'ont pas la capacité de former une triple hélice. Michon et al.
(2002) ont trouvé que la gélatine et la -carraghénane peuvent former des complexes quand
la conformation du PS est enroulée ou en hélice selon le ratio des concentrations des
polymères.
45
Les mélanges de gélatine de poisson et de k-carraghénane ont été aussi étudiés (Haug et al.,
2004b). Les gels sont turbides dus à l’arrangement du PS. Il est possible que les gels soient
aussi formés par une structure bi-continue. La fermeté des gels du PS est maximale à 2%
gélatine avec KCl, alors que pour la même concentration de protéine, la fermeté est
minimale pour les gels sans sel ajouté et avec NaCl.
En ce qui concerne les PS cationiques, il a été trouvé que le CH peut former des complexes
avec la -lg qui peuvent être solubles et insolubles selon le pH (Guzey et McClements,
2006). Des tests de calorimétrie, de diffusion de la lumière, de mobilité électrophorétique et
de solubilité ont été faits pour caractériser les interactions -lg-CH en solution. À des
valeurs de pH auxquelles les deux polymères possèdent des charges similaires (pH 3 et 4),
ils ne forment pas de complexes ou les complexes formés sont solubles. À pH 6 et 7, quand
les polymères ont des charges opposées, ils interagissent entre eux et forment des
complexes insolubles.
Des mélanges de gélatine avec du CH ont été aussi étudiés. López-Caballero et al. (2005)
ont utilisé ce mélange pour enrober le poisson en vue d’améliorer sa conservation. Le
mélange gélifié était ferme, translucide, non adhésif et avait une surface uniforme et lisse.
D'autres mélanges protéines-CH ont aussi été étudiés. Chang et al. (2003) ont étudié l’effet
du CH sur les propriétés du tofu. Ils ont trouvé que l’ajout de 2%CH augmente la fermeté
du gel et sa vie d’entreposage. Le degré de désacétylation du CH et l’agent coagulant sont
aussi reliés aux propriétés du gel de tofu. Plus tard, No et Meyers (2004) ont rapporté aussi
l’effet du CH sur la fabrication de tofu. Ils ont étudié plusieurs facteurs tels que la
concentration de CH, son poids moléculaire, la température de gélification et la
concentration du solvant sur la vie d’entreposage, la fermeté et le goût du gel de tofu.
46
1.7. Concepts fondamentaux de rhéologie
La rhéologie est la science de la déformation et de l’écoulement de la matière (Daubert et
Foegeding, 1998). Elle étudie la façon à laquelle les matériaux réagissent aux forces
appliquées. Dans le secteur alimentaire, la compréhension de cette science est importante
pour l’optimisation du développement des produits, les procédés de production et la qualité
du produit final (Steffe, 1996). Le principe des tests de rhéologie est l’application d’une
force sur le matériel à étudier et la mesure de sa déformation et/ou sa résistance.
Quelques concepts sont importants. La contrainte () est définie comme la force appliquée
par unité de surface. Si la force est perpendiculaire à la surface, la contrainte est normale,
alors que si la force est parallèle à la surface, la contrainte est appelée cisaillement. La
déformation (, déformation à contrainte normale ou , déformation par cisaillement) est
une quantité sans dimension, et représente la déformation relative du matériel. Pour un
solide ou un liquide viscoélastique, les constantes de proportionnalité entre la contrainte et
la déformation sont le module élastique, E (contrainte normale) et le module de
cisaillement, G.
La rhéologie dynamique permet d’étudier le caractère viscoélastique d’une solution ou d’un
gel. On applique à l’échantillon une faible déformation de façon sinusoïdale et la contrainte
résultante est mesurée. Les modules G’ et G’’ sont les paramètres qui représentent le degré
relatif des comportements élastique et visqueux des matériaux viscoélastiques. Ils sont aussi
appelés module de conservation (G’) et de perte (G’’). G’ représente le caractère solide ou
élastique du matériel et G’’ représente le caractère liquide ou visqueux. La relation de
proportion entre G’’ et G’ est appelée l’angle de perte et est définie par :
'
'')tan(
G
G
(Éq. 1.9)
47
où est l’angle de phase.
Dans le système d'analyse en cisaillement dynamique, la contrainte doit être en régime
linéaire, c.-à-d. directement proportionnelle à la déformation (contrainte maximale et
déformation maximale).
Figure 1.12 Déformation et contrainte qui montrent la réponse d’un solide idéal et d’un liquide idéal, adapté d’après Daubert et Foegeding (1998).
Si les courbes sinusoïdales (déformation ou taux de déformation et de contrainte) sont
exactement en phase (angle de phase égal à zéro), on observe un comportement élastique
(solide Hookean idéal). Pour un liquide Newtonien idéal, la contrainte maximale est au
midi du cycle de la contrainte et la déformation à ce point est zéro (contrainte maximale et
déformation minimale). La contrainte et la déformation ne sont donc pas en phase (figure
1.12) et est égal à 90° (Daubert et Foegeding, 1998; Morris, 1995).
Déformation
= 0° =90° solide idéal liquide
idéal Contrainte
48
La figure 1.13 montre le spectre mécanique (valeurs de G’ et G’’ en fonction de la
fréquence de déformation ()) d’une solution de polysaccharides. On peut voir clairement
les différences des modules de conservation et de perte entre les différents systèmes en
fonction de la fréquence. Pour un gel (figure 1.13a), le module de conservation, G’, est
beaucoup plus grand que le module de perte, G’’; les deux modules (G’ et G’’) restent
constants sur toute la gamme de fréquences. Pour une solution diluée (figure 1.13c), G’’ est
plus grand que G’, mais leurs valeurs se rapprochent avec l’augmentation des fréquences.
Dans une solution concentrée (figure 1.13b), G’ est initialement inférieur à G’’. À une
fréquence caractéristique, les courbes des modules se croisent et G’ devient supérieur à G’’.
Cette intersection est connue comme le point de gélification. Pour les solutions diluées et
concentrées, les modules sont dépendants de la fréquence. La viscosité dynamique (*)
reste presque constante pour une solution diluée; elle diminue avec l’augmentation de la
fréquence dans le cas d’un gel et une solution concentrée.
La viscosité dynamique est définie par :
*
*G
(Éq.1.10)
où 22 '''* GGG (Éq.1.11)
Le spectre mécanique permet d'identifier les zones de déformation linéaire et non linéaire.
On peut aussi réaliser d'autres types de tests dynamiques. On peut réaliser un balayage en
fréquence (frequency sweep) où G’, G’’ et * sont mesurés en fonction de la fréquence (
à une température constante (figure 1.13). Le temps d'une oscillation reste constant mais
l'angle de déformation augmente ou diminue de façon constante. Dans la zone de
déformation linéaire, on peut ainsi analyser les temps de relaxation moléculaire. On peut
réaliser des tests de type balayage en température (temperature sweep) ou avec des histoires
thermiques particulières, les paramètres G’, G’’ et * sont alors mesurés à et déformation
constantes en fonction de l'accroissement ou de la diminution de la température. On peut
ainsi suivre les changements au niveau des interactions intra et inter moléculaires associées
49
avec la température. Les tests de balayage en temps (time sweep) permettent de suivre les
changements de type synérèse ou de nature conformationelle en fonction du temps à
température et fixes.
Figure 1.13 Spectre mécanique des polysaccharides (Morris, 1995).
G’
G’’
**
10
10
10
10
10
10
10
10
10
1010 10 10 10 10
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
-2 -1 0 1 2
G’’
G’
*
G’’G’
*
*
G’
G’’
10
10
10
10
10
10
10
10
10
1010 10 10 10 10
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
-2 -1 0 1 2
10
10
10
10
10
10
10
10
10
1010 10 10 10 10
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
-2 -1 0 1 2
G’’
G’
* *
G’’G’
* *
* *
G’
G’’
a. gel
b. solution concentrée
c. solution diluée
(rad s-1)
50
HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS
Le chitosane est déjà connu pour ses différentes propriétés fonctionnelles ainsi que ses
applications industrielles dans plusieurs secteurs. Cependant, l’application actuelle des gels
de chitosane est principalement dans le domaine de la médecine. Ce travail vise donc à
l’avancement des connaissances sur la formation des gels de chitosane en mélange avec des
protéines, pour le développement de gels qui pourraient être utilisés dans la fabrication
d’aliments, ainsi que dans les secteurs non-alimentaires.
Hypothèse de recherche
Les propriétés des gels de chitosane-protéines sont déterminées par la balance des
interactions (attractives et répulsives) entre la protéine et le polysaccharide impliquées dans
la formation du réseau.
Objectifs
Décrire le comportement du chitosane en présence des protéines. Deux systèmes ont
été étudiés : chitosane-isolat de protéines de lactosérum et chitosane-gélatine. Ces
deux systèmes ont été choisis pour connaître les différences du système chitosane-
protéine avec des protéines différentes, c'est-à-dire les globulaires et les fibrillaires.
Étudier l’effet de la concentration de chacun des polymères dans la gélification du
système et les caractéristiques rhéologiques du gel.
Étudier l’effet du pH dans la production et la caractérisation rhéologique des gels
des deux systèmes protéine-chitosane en condition acide et alcaline.
Chapitre 2
Rhéologie de gels mixtes protéines-chitosane,
partie I : conditions acides.
RHEOLOGY OF PROTEIN-CHITOSAN MIXED GELS, PART I : ACID CONDITIONS.
Hermosillo, I; Turgeon, S.L., and Bégin, A.
2.1. Résumé
La structure des gels formés avec des protéines (P) et des polysaccharides (PS) dépend des
interactions entre les polymères. L’influence du chitosane (CH), un PS cationique, dans la
gélification de deux P différentes à pH 4 et pH 6 a été étudiée par rhéologie à différentes
concentrations. Les P étaient l’isolat de protéines du lactosérum (IPL) et la gélatine (Gb). À
pH 4, le CH réduit la rigidité des gels IPL-CH et Gb-CH, alors qu’il augmente la rigidité
des gels IPL-CH à pH 6. Le système IPL-CH forme des gels blancs. Cette coloration est
due à l’agrégation des protéines ou à la formation des complexes avec le PS. Les gels Gb-
CH ont été translucides et la turbidité augmente à pH 6, probablement dû la formation des
complexes. Dans les deux systèmes, IPL-CH et Gb-CH, l’effet du chitosane sur les
propriétés des gels diminue avec l’augmentation se la concentration des P.
2.2. Abstract
The structure of proteins (P) and polysaccharide (PS) gels depends strongly on the polymer
interactions. The influence of chitosan (CH), a cationic PS, in the gelation of two different
P at pH 4 and pH 6 was studied by rheological measurements. The polymer concentration
was also varied. The two P were whey proteins isolate (WPI) and gelatine (Gb). It was
observed that at pH 4, CH decreased the firmness of the WPI-CH and Gb-CH gels, whereas
it increased in the WPI-CH gels at pH 6. White gels were formed with the WPI-CH
mixtures due to the P aggregation or to the complex formation with the PS. In the case of
the Gb-CH system, the gels were translucent increasing its turbidity at pH 6 probably due to
the complex formation. In both systems, WPI-CH and Gb-CH, the influence of the PS
decreased with the increase in P concentration.
2.3. Introduction
Proteins and polysaccharides are two of the most important ingredients in foodstuffs. Many
of their applications are connected to their capacity to increase the viscosity of the
solutions, to form gels and for the formation and stabilisation of emulsions and foams
(Morris, 1995). Gelation of protein-polysaccharide mixed systems is the functional property
of interest in this work. The capacity of a polymer to form a gel is very important in many
food applications. The structural matrix formed by the gelation of the mixed systems is
used in order to retain water, flavour, sugar, fat and others ingredients present in foodstuffs
(Clark and Lee Tuffnell, 1986; Kasapis, 2008) besides giving to the product the desired
mechanical properties.
Gelation of mixed systems formed by two polymers may result in the formation of different
types of networks that can be divided in two main groups: one gelling agent and two gelling
agents. The former will be a network formed by only one polymer entrapping the other
polymer in solution. In the latter case, when the two polymers gel, then the result could be
an interpenetrated network (the two polymers form networks independently but interlaced),
a phase separated network (when segregative conditions favour phase separation and the
system gels before separation into two phases is complete) or a coupled network (formed by
the attraction between polymers) (Williams and Phillips, 1995).
Protein-polysaccharide interactions play a major role in structure formation of mixed
systems. The network formed depends on the type of these interactions, which can be
modified by different factors like pH, ionic strength, polymer concentration and
temperature among others.
55
Many mixtures of anionic or neutral polysaccharides with various proteins have been
studied (Whey proteins: Zhang and Foegeding, 2003; Tavares and Lopes da Silva, 2003;
Ibanoglu, 2005; Lizarraga et al., 2006; Bertrand and Turgeon, 2007; gelatine: Fonkwe et
al., 2003; Rizzieri et al., 2003; Gilsenan et al., 2003; Haug et al., 2004b). Turgeon et al.
(2003) reviewed the interactions between proteins and polysaccharides, and de Kruif et al.
(2004) reviewed the complex coacervation of proteins with anionic polysaccharides.
The attraction between proteins and polysaccharides in solution is observed when the
polymers have opposite charges. The pH is the principal factor affecting the formation of
complexes because it modifies the ionisation degree of the functional groups of the
polymers. So, when the polysaccharide is cationic, as it is in our case, the pH of the solution
must be higher than the protein pI to promote the complex formation due to the opposite
charges of the polymers. When polymers are neutral or wear similar charges, segregative
conditions prevail and each polymer tends to phase separate. pH, ionic strength, polymer
structural characteristics (molecular weight, flexibility, etc.) can influence the behaviour of
protein and polysaccharide in mixture.
Interactions of cationic polysaccharides with proteins have been little studied. This work
aims to study interactions of two widely used proteins, whey proteins and gelatine with
chitosan. Chitosan (CH) is a unique cationic polysaccharide obtained from the deacetylation
of the chitin with hydrophilic zones rich in glucosamine and hydrophobic zones rich in N-
acetyl-glucosamine (Knorr, 1984; No and Meyers, 1995). This polysaccharide has
thickening, emulsifying and gel properties and is an antimicrobial agent (Shahidi et al.,
1999). It also has the capacity to decrease the hepatic cholesterol and fat absorption by its
ability to combine with bile salts and triglycerides (Zhou et al., 2006). All these properties
make of chitosan a very attractive polysaccharide and a better understanding of its
behaviour in mixture with proteins could widen its uses.
56
Whey proteins, composed of globular proteins are used in many food products for their
interesting functional and nutritional properties (Lowe et al., 2003). Gelatin (gelatine type
B: Gb) is a fibrous protein that gels when cooled after being dissolved in warm solutions. It
is widely used because of its capacity to form reversible gels that “melt in the mouth”,
which is a desirable characteristic in many food products (Ledward, 1992).
In order to understand and manipulate the applications of mixed gels in food products, it is
necessary to know and to understand the mechanical properties of the gel and the function
of each polymer in the structure formed. This may be achieved by the study of the
properties of the gel. The goal of this study was to investigate the rheological behaviour of
chitosan in the presence of two different proteins, at different polymer concentrations and
as a function of the pH.
2.4. Experimental Procedure
2.4.1. Materials
The whey protein isolate (BiPro) used was purchased from Davisco Foods Intl. Inc. (Le
Sueur, MN, USA). Its composition was of 71.24% -lactoglobulin (-lg) and 17.7% -
lactalbumin (-la). The gelatin was type B (bovine skin) 225 bloom, from American
Chemicals LTD, with a MW of 100 000 Da (estimated from the Mark-Houwink relation
according to Williams et al. (1954)). The chitosan used had a degree of deacetylation
(DDA) of 93.5% and was obtained from Les Pêcheries Marinard Ltée. (Rivière-au-Renard,
QC, Canada). All chemicals were analytical grade.
57
2.4.2. Preparation of single and mixed solutions
Stock solutions of proteins (P) were prepared by adding the powder to a 0.25M succinate
buffer at pH 4 and at pH 6. The solution was stirred gently for about 2h at room
temperature and then was stored overnight at 4°C to allow complete hydration of proteins.
WPI solutions were prepared at 8, 14 and 20% concentrations and 6, 8 and 10% for Gb
solutions. Stock solutions of CH (1 and 2.5%) were prepared by adding the powder to a
0.1M HCl. The polysaccharide (PS) was dissolved at room temperature overnight.
The P and CH solutions were mixed at room temperature at a 1:1 volume ratio and the pH
was adjusted either to 4 or 6 using 1M NaOH or 1M HCl. These pH values were chosen in
order to observe the effect of pH under and above the isoelectric point (pI) of proteins. The
WPI isoelectric point (pI) was considered the same as -lactoglobulin (around 5.2) (Bryant
and McClements, 1998 & Cayot and Lorient, 1998), which is the main protein and the
principal gelling agent in WPI. The Gb’s pI was 5.1, determined by ion exchange resins
(IR-120 cation and IRA-400 anion Amberlite exchangers) following the procedure detailed
by Janus et al. (1951).
In a preliminary study, different solvents (succinic acid, acetic acid, phosphoric acid,
malonic acid, maleic acid, malic acid and citric acid) were tested to dissolve the proteins
and also varying the polymer concentrations in order to choose the conditions to study.
Succinic acid was chosen over the different acid solutions tested because its pK’s allows to
study samples below and above the protein pI. Also, it did not induce coagulation when
mixing the P solution with the CH solution (phosphoric and citric acid did) and the buffer
was more efficient to control the pH.
58
The CH concentrations were chosen to cover a broad range of conditions from dilute to
concentrated. Regarding the P concentrations, they were chosen based on the samples that
showed more interesting results and to cover a wide range of conditions (e.g. smallest
concentration to form a gel and the highest concentration that allows to handle the
solutions).
2.4.3. Rheological measurements
The dynamic tests were performed with a TA Instrument rheometer (AR-1000 model) using
a cone-plate geometry. Storage (G’) and loss (G’’) moduli and delta () values were
recorded at a fixed frequency of 1 Hz. A solvent trap was used to avoid sample dehydration.
2.4.3.1 WPI-CH system
The WPI-CH solutions were tested with the following sequence of steps: 1) temperature
ramp at 20°C/min from 20 to 85°C, held at this temperature for 15 min; 2) the gel was
cooled at 10°C/min from 85 to 20°C, held at this temperature for 5 min. 3) a frequency
sweep from 0.1 to 10 Hz at 20°C. These sequences were realized at 0.5% of strain (within
the linear viscoelastic region and as used by Ould Eleya and Turgeon, 2000a and b &
Beaulieu et al. 2001). This was performed to observe the viscoelastic properties of the gel
at room temperature. All the sample measurements were replicated at least twice. The
remainder of each sample was stored at 4°C to observe any visual changes in the mixture.
59
2.4.3.2 Gb-CH system
For the Gb-CH solutions, the procedure was different because of the gelation characteristics
of the protein. So, the sequence for these solutions was: 1) temperature increase at
10°C/min from 20 to 50°C, this temperature was kept for 2-3 min to allow dissolution of
the protein; 2) the mixture was cooled at 2°C/min from 50 to 15°C and this temperature was
kept for 15 min 3) the sample was heated again at 10°C/min until 40°C and 4) cooled again
at 2°C/min until 15°C for 30 min; 5) a frequency sweep was performed from 0.1 to 10 Hz.
These sequences were at 0.2% of strain (within the linear viscoelastic region and as used by
Alevisopoulos et al. 1996). And 6) a strain sweep was performed for the Gb-CH samples
from 0.1 to 10% at 20°C. As well as for the WPI-CH samples, steps 5 and 6 were
performed on the gels to observe their viscoelastic properties at room temperature. The
cycle was repeated twice, in order to see the effect of CH in the thermo-reversibility of
mixed gels. Measurements were realized at least in duplicates. The remainder of each
sample was stored at 4°C for visual observation.
2.4.4. Statistical method
For each P system, a 3x3x2 factorial design was developed: three P levels (4%, 7% and
10% WPI, and 3%, 4% and 5% Gb), three CH levels (0%, 0.5% and 1.25%) and 2 pH
levels (4 and 6). Treatments were repeated at least twice. The statistical analysis was
performed for each experimental design (one for each protein), and the analysis of variance
(ANOVA) was computed to determine the effect of the three factors (%P, %CH and pH)
and their combinations on the G’, G” moduli and .
60
2.5. Results and discussion
This section discusses the results for each one of the systems studied (WPI-CH and Gb-CH
systems).
2.5.1. WPI-CH system
Rheological results of each individual component are presented first, followed by the
results of the mixtures.
2.5.1.1 Single polymer gel formation
CH gel formation
In order to know the behaviour of CH alone during the heat treatment, a sample of
1.25%CH was treated following the same cycle as for the WPI-CH and Gb-CH systems at
pH 4 and pH 6 (the results for the Gb-CH system are discussed later). Figure 2.1 shows the
profile of CH gelation at the conditions of the WPI-CH system. The polysaccharide did not
gel at pH 4, as can be seen in figure 2.1a where G’ never becomes greater than G’’ during
the heat treatment and (delta) was always around 80° (the setting point is observed when
is less than 45° and G’ becomes greater than G’’). At pH 6 (fig. 2.1b),chitosan profile was
complex. On heating, G’ decreased to values lower than 0,1 Pa at 65°C and increased up to
85°C and during the first 3 minutes of the holding time. G’ then decreased and remained
constant until the end of the heating period. On cooling, lower values were obtained in the
85-30°C range before a strengthening of the gel at 20°C. Chitosan presents hydrophobic
61
(-CH3) and hydrogen bonding favouring groups (-OH, -NH, and –C=O) and both types of
interactions could be involved in structuration of the system (Cho et al., 2005). Heating
promotes hydrophobic interactions while lower temperature favours hydrogen bonding.
Similarly, Cho et al. (2005), reported gel formation during heating for a chitosan-
glycerophosphate at neutral pH. The viscosity diminished up to approximately 65°C and
then increased steeply up to 90°C. The final G’ value after cooling was a decade lower,
forming a weak gel (G’ is over G’’ and is around 30°).
WPI gel formation
Figure 2.2 shows the gelation profile of the 10% WPI at pH 4. All the samples (varying
concentration at both pH) showed similar gelation profiles. At both pH, G’ was first smaller
than G’’. Then the moduli increased with the temperature, becoming higher G’ at the
gelation point. Another increase of the moduli was observed during cooling. This has been
also observed by Ould Eleya and Turgeon (2000a and b), Beaulieu et al. (2001) and
Vittayanont et al. (2002) in single and mixed protein gels. This increase is related to the
strengthening of hydrogen bonds and van der Waals forces between the proteins in the gel
since they are favoured by the decrease on the temperature. These molecular interactions
are also very important in the stabilization of the structures formed. According to Bryant
and McClements (1998), the increase in the strength of the gels already formed when
decreasing the temperature suggests that non-hydrophobic interactions play an important
role in determining the final gel strength while the hydrophobic interactions are responsible
for the initial stages of aggregation.
62
2.5.1.2. Mixed WPI-CH gel formation
Figure 2.3 presents the gelation profile of the 4%WPI-1.25%CH pH4 and 7%WPI-0.5%CH
pH6. In all the samples, the storage (G’) and loss (G’’) moduli increased during the heat
treatment. Upon cooling from 85°C to 20°C, another increase in the moduli was observed.
This increase can be attributed to the consolidation of some molecular interactions between
the proteins as explained in the previous section.
Figure 2.4 presents a bar graph of the last registered value of G’, G’’ and showing the
effect of the CH and WPI concentrations. The parameters are presented as a function of the
CH concentration for the different protein concentrations and pH. The differences among
samples observed for G’, G” and were statistically analyzed to determine their
significance. The ANOVA (table 2.1) shows the significant effects on G’ of each factor
after a log transformation of the data to reduce heterogeneity of variance. The WPI
concentration represents 58.3% of the total variance and 16.5% for the pH. The interaction
of these two factors was also significant, explaining 5.1% of the total variance. CH
concentration did not show a significant effect in the WPI-CH gels, representing only 0.2%
of the total variance, however the combination of this factor with WPI and with pH was
significant, mainly for CH*pH (11.4% of the total variance). Finally the triple interaction
effect WPI*CH*pH is also significant explaining 5.3% of the total variance. The interaction
effects between the factors are shown in figures 2.5 and 2.6. The WPI*CH interaction has
the greater effect at pH 4 (see figure 2.5 b). The curves at pH 6 are more similar (they are
almost parallel), which indicates a small interaction between the two factors. In the case of
the CH*pH (fig. 2.6b) the curves are not parallel indicating a strong interaction between the
factors and one can see that the differences between pH’s increase with the CH
concentration. As for the interaction of WPI*pH the differences increase with the decrease
in the protein concentration (fig. 2.6a).
63
The ANOVA for the G” modulus resulted with a similar tendency (see annexe B). CH is
not significant and the rest of the effects resulted to be significant at p<0.001 including the
triple interaction. However, in the case of CH was also significant whereas the double
interaction WPI*CH became significant only at p<0.05 and the triple interaction was not
significant.
Since the combination of G’, G” and is key in the determination of gel properties (the
main interest of this research) it is important to discuss and interpret the effects of the
different factors on G’, G” and combined.
As it can be seen from figure 2.4, at pH4, G’ and G’’ decreased and increased with CH
concentration in the gels with 4 and 7% of protein. This is an indication of reduction in the
strength (or firmness) of the gels due to the non-gelation of CH at pH4. However, the gels
with higher content of protein (10%) formed a stronger network being less influenced by
the addition of CH. At this pH, the two polymers in the system have a positive net charge,
so the complex formation is not possible, segregative conditions could favour a phase
separated gel. In this case, the type of the network must be the one in which only the
proteins gel and small portions of CH in solution are contained in the protein network. The
increase in the CH concentration disrupts the protein network (observed by the decrease in
G’ with the increase in the CH concentration, see fig. 2.4). However, this effect is reduced
with the increase in the WPI concentration. This shows the significant effect of the
WPI*CH interaction.
At pH6, G’ and G’’ increased with the CH concentration and remained fairly constant.
The increase in the moduli may be the result of either the gelation of CH or the possible
complex formation since at this pH the polymers have opposite net charge (protein
64
isoelectric point is 5.2, so WPI is negatively charged and CH has still some positive
charges). If this is the case, a coupled network could be formed.
Note that in general at both pH studied, the effect of CH is reduced with the increase in the
protein concentration. Also it can be noticed that G’ was higher at pH 6 than at pH 4 (which
explains the significance of the pH factor in the ANOVA), and while G’’ did not show a
clear tendency, was smaller at pH 6 than at pH 4. This indicates an increase in the
elasticity and strength of the gels with the pH at the same polymer concentration.
In all mixtures a crossing point between G’ and G” considered as the gelling point was
observed. The statistical analysis did not show significant differences on the gelling
temperature among the treatments (ANOVA not shown). This may be attributed to the
heating rate used (20°C/min), which was very high in order to decrease the impact of phase
separation in the mixture before gelation.
It should be also noted that a small decrease in the modulus was observed in the gelation
profile during the first minutes of the cooling step in all the WPI-mixtures at pH 6 (see fig.
2.3b). The decrease was more pronounced when increasing the CH concentration and
decreasing the P concentration, which is considered a CH effect since it was also observed
in the CH gelation profile (figure 2.1b). This effect is also observed in the mixed and CH
gels at pH 4 (see fig. 2.1a and 2.3a), however as seen before at pH 4 CH does not form part
of the gelled network. It is not possible to determine the type of gel obtained without
microscopic observations of the system. More research is needed in order to confirm or
better determine the structure of the gels.
65
Frequency sweep
After heat induced gelation of the systems, G’ remained larger than G’’ and |*| (dynamic
viscosity) decreased as a function of the frequency at 20°C in all the systems (figure 2.7).
The curves show a typical frequency sweep of a gel (Morris, 1995). Only 4%WPI-
1.25%CH showed a larger dependency on the frequency where G’’ was increasing faster
than G’ (figure not shown). The strength of the gel increased with the pH and the gels were
stronger at higher polymer concentration.
Visual aspects of mixed gels
After heating, the WPI-CH system formed white opaque, soft, creamy, yoghurt-like gels.
Whey proteins formed this kind of gel at pH between 4 and 7 and at high ionic strength
(Bottomley et al, 1990; Bryant and McClements, 1998 & Cayot and Lorient, 1998). The
WPI-CH gels owe its white colour to the globular structure of the protein and its
aggregation. They are known as particulate gels and are formed by aggregates that are big
enough for not allowing the scattering of the light (Bryant and McClements, 1998). At pH
6, this white coloration could also be related to complex formation between WPI
(negatively charged) and CH (positively charged). Figure 2.8 shows the visual aspect of the
WPI-CH gels at pH 4 and 6 prepared during the preliminary tests.
Cold gelation of WPI-CH systems
All the samples at pH 6 with 1.25%CH formed gels without heat treatment after a storage
period at 4°C. The time in which the gels were formed increased with the decrease in the
protein concentration. The mixed gels formed were turbid (and not white opaque as the heat
induced WPI-CH gels) and with a gelatin dessert-like appearance. This gelation could be
66
explained by the attraction of positive charges in the system (CH+ molecules or other
positive charges like H+) with negative charges on protein. An increase in pH with time was
observed to values between 7 and 8.5 (the higher the protein concentration the higher the
pH). This increase in the pH could indicate that some of the H+ was attached to the protein
and do not contribute to the acidity of the system. The OH- are free and increase the
alkalinity of the system making it more basic and favouring protein denaturation. The other
samples (with 0.5% CH) did not gel and showed phase separation within 24 hrs.
2.5.2. Gb-CH system
2.5.2.1 Single polymer gel formation
CH gel formation
Figure 2.9 shows the profile of 1.25%CH gelation at the conditions of the Gb-CH system
studied. As observed in figure 2.9a, the polysaccharide does not gel at pH 4, G’ never
becomes greater than G’’ during the heat treatment and (delta) is around 90°. At pH 6 CH
solution is liquid at room temperature. G’ diminished on heating to 50C°. During cooling,
the modulus increase and a gel is formed. The following heat-cool cycle soften the gel and
it gets back to its value at room temperature. This is a thermoreversible gel. As temperature
does not reach 85° C as in WPI systems, the heat strengthening effect was not seen.
Gb gel formation
Figure 2.10 shows the gelation profile of gelatin (5%Gb pH 6). In the figure, the
reversibility property of the gelatine gels with the temperature can be observed. This
67
property has previously been studied by other authors (Gómez-Guillén et al., 2002; Fonkwe
et al., 2003). During the heating stage the moduli G’ and G” decreased due to the
solubilization of the protein and increased during cooling until reaching the gelation point.
The temperature also modified which increased during heating, and then decreased during
cooling indicating gelation. During the second cycle the gel melted with the increase in the
temperature and was reformed after cooling. The same profile was observed for the Gb
gelation at pH 4 and the other concentrations (not shown).
2.5.2.2 Mixed Gb-CH gel formation
Figure 2.11 shows the gelation profile of the Gb-CH system. It was observed that at both
pH studied the mixed gels are thermoreversible, that is they have the property to melt and
gel depending on the temperature. This behaviour is principally related to gelatine and it
dominates the behaviour of all mixed gels (results not shown). This was repeated twice, as
defined by the repetition of the cycle, showing the melting characteristics during heating
and the regeneration of the gel upon cooling. Similar results have been observed in mixed
gels with gelatin studied by Alevisopoulos et al, (1996); Fonkwe et al, (2003) & López-
Caballero et al. (2005).
Figure 2.12 presents bar graphs of parameter values at 15°C after the second cycle. The
ANOVA for the Gb-CH system is shown in table 2.2 after a log transformation of the data.
Most of the variance comes from the main factors effects: 54.08%, 10.09% and 21.72% are
from Gb, CH and pH main factors respectively (all of them significant at p<0.001). From
the combinations of these factors, all the double interactions are significant. Gb*CH
explains 7.81% of the total variance (p<0.001) and the other two interactions explain less
than 2% of the total variance each. The triple interaction is not significant. For G” (see
annexe B), the Gb*CH interaction resulted less significant (p<0.05) than for G’ and the
other interactions were not significant at all. As for the delta ANOVA (annexe B), all the
68
effects were significant at p<0.001, except the Gb*pH interaction and the triple interaction
which were not significant.
The interaction effect Gb*CH is shown in figure 2.13. The curves are not parallel, which
indicates the significance of the interaction. The curves show that CH is more significant in
the weak gels (lower protein content) at both pH.
An interpretation of the data could be done as follows. From figure 2.12 it can be observed
that at pH 4, G’ increased with the protein concentration (for the same CH concentration),
whereas G’’ increased with the protein and CH concentration. Addition of chitosan resulted
in weaker gels at 3% Gb, while with higher Gb concentrations this effect is less
pronounced. is close to 45° at lower protein concentration, an indication of the formation
of a very weak gel, which in fact melted at room temperature. However, as Haug et al.
(2004 a) & Ledward (1986) explained, the Gb gels are dynamic gels and its properties
change with time. For such, it must be emphasized that these results are only for the
treatment done in this work, and the results could be very different (e.g. stronger gels) if the
cooling time were longer, or even if the cooling rate were slower. All the above, shows the
significance of the Gb and CH effects and its interaction effect.
At this pH (4), the two polymers have a positive net charge; no complex formation is
anticipated due to the repulsive electrostatic forces between them. In addition, since CH did
not gel under these conditions, the type of network should be one in which only gelatin
contributes to its formation and CH is the dispersed phase in solution.
69
At pH 6, the same tendency is observed as with pH 4, gel strength is reduced by the
addition of CH. However the changes were smaller probably due to the CH gelation or the
attractive interactions between polymers (Gb being negatively charged and CH having still
some positive charges). At this pH all the gels melted at temperatures higher than 30°C.
Here, the polymers have also opposite charges and, unless the ionic strength screened the
charges, the network formed could be coupled.
Comparing the three parameters for both pH, at pH 6 the moduli (G’ and G’’) are greater
than at pH 4, and is smaller. This shows that for the same polymer concentration the gels
are stronger at pH 6 (confirmed by the significance of the pH effect). Gel properties are
mainly directed by protein behaviour, Gb gels being stronger at pH 6. Similar to the WPI-
CH gels, the higher the protein concentration the smaller the effect of CH at both pH for the
Gb-CH system.
Frequency sweep
Figure 2.14 presents an example of a frequency sweep of a mixed Gb-CH gel at pH 6. G’ is
larger (and almost parallel) than G’’ and |*| decreases with frequency. This behavior is
characteristic of a gel system (Steffe, 1996). All the combinations of concentration and pH
tested resulted with this behaviour except those mixed gels at pH 4 with 3%Gb which
started to melt while increasing the temperature from 15°C to 20°C (results not shown). The
frequency dependence of this gel was apparent related to weaker gels.
Regarding the visual aspect of the system, before heating the Gb-CH solutions were
transparent, and the gelatine granules were still visible. Upon increasing the temperature the
system becomes transparent and after cooling it forms translucent, firm and elastic gels,
70
with the appearance of a gelatine dessert. This not-opaque coloration is due to the fibrous
structure of the protein; Gb forms fine stranded gels that do not scatter the light. Figure 2.15
shows the visual aspect of the Gb-CH gels at pH 4 and 6. The pictures were taken for the
preliminary tests. Addition of chitosan increased the turbidity of the system. At pH 4 this
could be related to phase separation due to segregative conditions. At pH 6, the turbidity of
the mixed gels increased compared to the ones at pH 4, attributed to the possible complex
formation between gelatin (negatively charged) and CH (positively charged).
Effect on the setting and melting point
Statistical analysis indicated that only the main factors pH and CH were significant at
p<0.001 for the setting point, explaining the 55.7% and 20.5% of the total variance
respectively (annexe C). However the effect of the interaction between these two factors is
not significant. In the case of the melting point, the ANOVA showed all the effects as
significant, where the 50.12% of the total variance results from the pH factor and the rest of
the effects explain between 4.59% and 11.09% of the total variance (annexe C). The values
for the melting and setting points are shown in table 2.3, where it can be seen that at pH 6
the system showed a higher setting and melting point. The lowest values were those for the
3%Gb-0.5%CH system at pH 4, which formed weak gels after about 30 min at 15°C and
melted at 20°C. At pH 4, the addition of CH decreased these points but they increased with
further increase of CH concentration. At pH 6, these values decreased with the increased in
CH concentration except at higher polymer (Gb and CH) content, in which the setting and
melting points increased or were not modified.
From these results, a phase-separated system is suggested at pH 4, where segregative
conditions prevail. At pH 6, attractive conditions could favour associative gelation.
However, the type of network suggested for the Gb-CH system must be verified as the ionic
71
strength (> 0.9 M) could interfere on its formation. The system could even be phase
separated at high ionic strength.
2.6. Conclusions
Mixed gels with different characteristics were obtained from two different P-CH systems
and varied conditions. The effect of addition of CH to the protein solutions varied with the
polymer concentrations and the pH. At pH 4, chitosan reduced the firmness of the mixed
gels, whereas at pH 6, it improved the strength for WPI-CH gels. It should be noted,
however, that the effect of CH was not statistically significant as a main factor, although the
combination between this factor and the others (WPI*CH, CH*pH and WPI*CH*pH) had
significant effects.
At both pH, the WPI-CH gels were white. At pH 4 this could be explained by protein
aggregation, whereas at pH 6, it could be the result of either protein aggregation or the
complex formation between WPI and chitosan. The gelation of WPI-CH at pH 6 was also
observed with no heat treatment, which resulted in different gels than the ones observed
with heat treatment.
In the case of the Gb-CH gels, the turbidity increased with the pH probably because of the
complex formation between the polymers at pH 6. However more research is necessary to
confirm the presence of these protein-polysaccharide complexes. The reversibility of the Gb
gels was affected by the addition of CH by modifying the setting and melting point. In all
cases the influence of CH on the mixed gels decreased with the increase in the protein
concentration, producing gels with similar characteristics to single Gb gels. In this system,
all factors (except the Gb*CH*pH) showed significant effects according to the ANOVA
72
results, although in different levels of significance. Addition of chitosan can be used to
modulate protein gels properties and the effect is dependent on the main factors studied (pH
and concentration). However, to clearly stated on the type of gels formed (phase separated
and coupled) the microstructure should be observed.
Figure 2.1 Gelation profile of 1.25% chitosan following the temperature program used for WPI-CH mixed systems at a) pH 4 and b) pH 6.
0.01
0.1
1
10
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
20
40
60
80
100
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
T
delta
0.01
0.1
1
10
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
20
40
60
80
100
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
T
delta
a)
b)
73
Figure 2.2 Gelation profile of 10%WPI at pH 4.
0.01
0.1
1
10
100
1000
10000
100000
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
T
delta
74
Figure 2.3 Gelation profile of WPI-CH mixed systems: a) 4% WPI-1.25%CH at pH 4 and b) 7% WPI-0.5% CH at pH 6.
0.01
0.1
1
10
100
0 250 500 750 1000 1250 1500
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
T (
°C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
T
delta
0.01
0.1
1
10
100
1000
10000
100000
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
T
delta
a)
b)
75
Figure 2.4. Effect of chitosan on G’, G’’ and delta () in the WPI-CH acid systems at pH 4 (left) and pH 6 (right) at 20°C.
1
10
100
1000
10000
100000
0 0.5 1.25%CH
G' (
Pa)
1
10
100
1000
10000
100000
0 0.5 1.25%CH
G' (
Pa)
1
10
100
1000
10000
100000
0 0.5 1.25%CH
G''
(Pa)
1
10
100
1000
10000
100000
0 0.5 1.25%CH
G''
(Pa)
0
5
10
15
20
25
30
0 0.5 1.25%CH
del
ta (
deg
rees
)
0
5
10
15
20
25
30
0 0.5 1.25%CH
del
ta (
deg
rees
)
%CH 0 0.5
%C H4%WPI 7%WPI 10%WPI
pH 4 pH 6
76
Table 2. 1 ANOVA of the storage modulus (G') with the WP-CH system in acid conditions.
Source of variation DF SS F value Repetition 1 0.0374 3.72 ns WPI 2 14.6442 731.26 *** CH 2 0.0381 1.90 ns PH 1 4.1479 414.25 *** WPI*CH 4 0.5753 14.36 *** WPI*pH 2 1.2933 64.58 *** CH*pH 2 2.8737 143.50 *** WPI*CH*pH 4 1.3357 33.35 *** Error 17 0.1702 Total 35 25.1161
Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (***)=p≤0.001, ns=not significant.
Figure 2.5 Graphic representation of the interaction WPI*CH: a) the main interaction, b) at pH 4 and c) at pH 6.
0
1
2
3
4
5
4 7 10
%WPI
log
(G') 0 % CH
0.5%CH
1.25%CH
0
1
2
3
4
5
4 7 10
%WPI
log
(G') 0 % CH
0.5%CH
1.25%CH
0
1
2
3
4
5
4 7 10
%WPI
log
(G') 0 % CH
0.5%CH
1.25%CH
a)
b) c)
77
Figure 2.6. Graphic representation of the interactions a) WPI*pH and b) CH*pH.
Figure 2.7 Frequency sweep of the mixed gel 10%WPI-0.5%CH at pH 4.
1
10
100
1000
10000
100000
1.00
1.26
1.58
1.99
2.51
3.16
3.98
5.02
6.32
7.94
9.94
Frequency (Hz)
G',
G''
(Pa)
1
10
100
1000
10000
|h*|
(P
a.s) G''
G'
|h*|
0
1
2
3
4
5
4 7 10
%WPI
log
(G') pH 4
pH 6
0
1
2
3
4
5
0 0.5 1.25
%CH
log
(G') pH 4
pH 6
a) b)
78
Figure 2.8 Visual aspect of the WPI-CH gels (preliminary tests) : a) pH 4 and b) pH6. WPI:CH ratio (%:%). 1)6.5:1.25, 2)6.5:0.5 3)5.25:1.25, 4)5.25:0.5, 5)4:1.25, 6)4:0.5.
1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6
a) b)
79
Figure 2.9 Gelation profile of 1.25% chitosan following the temperature program used for Gb-CH mixed systems at a) pH 4 and b) pH 6.
0.1
1
10
100
0 1000 2000 3000 4000 5000
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
20
40
60
80
100
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
T
delta
0.01
0.1
1
10
0 1000 2000 3000 4000 5000
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
20
40
60
80
100
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
) G''
G'
T
delta
a)
b)
80
Figure 2.10 Gelation profile of 5%Gb at pH 6.
0.01
0.1
1
10
100
1000
10000
0 1000 2000 3000 4000 5000
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
T
delta
81
Figure 2.11 Gelation profile of Gb-CH mixed systems: a) 4%Gb-1.25%CH at pH 4 and b) 5%Gb-1.25%CH at pH 6.
0.1
1
10
100
1000
10000
0 1000 2000 3000 4000 5000
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
20
40
60
80
100
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
T
delta
b)
0.01
0.1
1
10
100
1000
0 1000 2000 3000 4000 5000
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
20
40
60
80
100
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
|h*|
delta
a)
82
Figure 2.12 Effect of chitosan on G’, G’’ and delta () in the Gb-CH acid systems at pH 4 (left) and pH 6 (right) at 15°C (at the end of the second cycle).
1
10
100
1000
10000
0 0.5 1.25
%CH
G' (
Pa
)
1
10
100
1000
10000
0 0.5 1.25
%CH
G' (
Pa
)
1
10
100
1000
0 0.5 1.25
%CH
G''
(Pa
)
1
10
100
1000
0 0.5 1.25
%CH
G''
(Pa
)
pH 4 pH 6
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 0.5 1.25
%CH
de
lta
(d
eg
ree
s)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 0.5 1.25
%CH
de
lta
(d
eg
ree
s)
0 0.5 1 .2 53%Gb 4%Gb 5%Gb
83
Table 2. 2 ANOVA of the storage modulus (G') with the Gb-CH system in acid conditions.
Source of variation DF SS F value Repetition 1 0.0105 0.75 Gb 2 5.4648 193.72 *** CH 2 1.0198 36.15 *** pH 1 2.1948 155.61 *** Gb*CH 4 0.7892 13.99 *** Gb*pH 2 0.1838 6.52 ** CH*pH 2 0.1346 4.77 * Gb*CH*pH 4 0.0684 1.21 ns Error 17 0.2398 Total 35 10.1058
Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (*)=p≤0.05, (**)≤0.01, (***)= p≤0.001, ns= not significant.
Figure 2.13 Graphic representation of the interaction Gb*CH: a) the main interaction, b) at pH 4 and c) at pH 6.
0
1
2
3
4
3 4 5
%Gb
log
(G')
0%CH
0.5%CH
1.25%CH
0
1
2
3
4
3 4 5
%Gb
log
(G') 0%CH
0.5%CH
1.25%CH
0
1
2
3
4
3 4 5
%Gb
log
(G') 0%CH
0.5%CH
1.25%CH
a)
b) c)
84
Figure 2.14 Frequency sweep of the mixed gel 5%Gb-1.25%CH at pH 6.
Figure 2.15 Visual aspect of the Gb-CH gels (preliminary tests) : a) pH 4 and b) pH6. Gb:CH ratio (%:%) 1) 3:1.25, 2) 3:0.5, 3) 1.5:1.25, 4) 1.5:0.5, 5) 0.5:1.25, 6) 0.5:0.5.
1
10
100
1000
10000
1.00
1.26
1.58
1.99
2.51
3.16
3.98
5.02
6.32
7.94
9.94
Frequency (Hz)
G',
G''
(Pa)
1
10
100
1000
|h*|
(P
a.s) G''
G'
|h*|
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
a) b)
85
Table 2. 3 Setting and melting points for the Gb-CH system at pH 4 and 6. The values are the means of the replicates.
pH 4 pH 6 sample Tg (°C) Tm (°C) sample Tg (°C) Tm (°C)
3%Gb 22.05 31.5 3%Gb 27.57 35.52 3%Gb-0.5%CH 15* 20 3%Gb-0.5%CH 28.47 34.15 3%Gb-1.25%CH 15 21 3%Gb-1.25%CH 18.3 31.57 4%Gb 20.5 29.95 4%Gb 25.15 33.65 4%Gb-0.5%CH 15** 25.97 4%Gb-0.5%CH 23 33.525 4%Gb-1.25%CH 15** 28.25 4%Gb-1.25%CH 20.9 33.32 5%Gb 17.8 29.825 5%Gb 24.15 33.47 5%Gb-0.5%CH 15*** 28.875 5%Gb-0.5%CH 20.97 33.5 5%Gb-1.25%CH 15.1 29.65 5%Gb-1.25%CH 22.8 35.2 * The gel is formed after about 30 min. at this T. ** The gel is formed after 3-7 min, taking longer time at higher CH conc. *** The gel is formed after 1 min at this T.
Chapitre 3
Rhéologie de gels mixtes protéines-chitosane,
partie II : condition alcaline.
RHEOLOGY OF PROTEIN-CHITOSAN MIXED GELS, PART II : ALKALINE CONDITION.
Hermosillo, I., Bégin, A. and Turgeon, S.L.
3.1 Résumé
L’effet du chitosan (CH) sur la gélification de deux protéines (P), un isolat de protéines de
lactosérum (IPL) et la gélatine (Gb), a été étudié en conditions alcalines. Bien que les gels
mixtes aient été formés avant le traitement thermique dû la gélification immédiate du CH à
ces conditions, l’effet des P a été observé pendant le chauffage du système. Le CH diminue
la fermeté des gels IPL-CH, cependant ces gels sont plus élastiques que les gels d’IPL. Les
gels Gb-CH sont plus fermes que les Gb gels, mais ils ne sont pas thermoréversibles dû à la
gélification du CH qui empêche d’observer la réversibilité de la gélatine. Les gels IPL-CH
ont des propriétés rhéologiques plus proches des gels de CH, alors que les caractéristiques
des gels Gb-CH sont le résultat d’un type de synergie entre les polymères. Les gels mixtes
WPI-CH et Gb-CH sont plus élastiques que leurs homologues à pH acides.
3.2 Abstract
The effect of chitosan (CH) in the gelation of two proteins (P) -whey protein isolate (WPI)
and gelatin (Gb)- has been studied in alkaline conditions. Although the mixed solutions
gelled due to the immediate CH gelation before the heat treatment was applied, the P
influence was observed during heating. In the WPI-CH system, CH produced a decrease in
the gel strength. However these gels were more elastic than WPI gels. Gb-CH gels were
stronger than pure Gb gels, but no thermoreversibility properties were observed. The WPI-
CH gels have rheological characteristics that are more similar to those of pure CH gels,
whereas the Gb-CH gel characteristics were the result of some kind of synergism between
the polymers. The mixed gels WPI-CH and Gb-CH were more elastic than their
homologues at acid pH.
3.3 Introduction
The study of the interactions between proteins (P) and polysaccharides (PS) has been of
great interest in the food industry as well as in other applications such as biomedical,
biotechnology and pharmaceutics (Schmitt et al., 1998; Shahidi et al., 1999; Shu and Zhu,
2001; Berger et al., 2004). The interactions between the polymers can result in systems
with different characteristics. If the interactions are attractive, then the complex formation
between the polymers is possible. Incompatibility between the polymers is observed when
complex formation is inhibited by repulsive interactions (Tolstoguzov, 1991). This
phenomenon of incompatibility increases when the association between the molecules of
the same type is favoured (P-P and PS-PS) (Grinberg and Tolstoguzov, 1997).
Gelation of mixed systems formed by two gelling agents may result in the formation of
different types of networks. One type, an interpenetrated network, is formed when the two
polymers gel independently and constitute separate networks that are interlaced (Cairns et
al., 1987) and continuous throughout the sample. If there were some degree of demixing
just before gelation, not reaching a macroscopic separation, then the networks will result in
a phase-separated gel. A third type of network is the result of the attraction between the
polymers, forming a coupled network (Williams and Phillips, 1995). The type of network
depends on different factors such as the pH, the ionic strength, polymer concentration and
temperature among others.
Chitosan (CH) is a cationic glucosamine polysaccharide, derived from the deacetylation of
chitin (Knorr, 1984; No and Meyers, 1995). The pKa of the glucosamine varies between 6
and 6.5. As a result, CH charges vary with the pH and the molecule is completely neutral at
a pH higher than 7. Therefore, in alkaline solutions when CH is not charged, the effect on
90
the P gelation will be different than in acid conditions. So, at basic pH, even when the
proteins are negatively charged, no attraction between the polymers is possible.
Moreover, the low pKa value of the glucosamine makes CH soluble at low pH and
insoluble at high pH (Roberts, 1992). However, it has been possible to obtain CH gels at
basic pH. Muzzarelli et al. (2003) observed that when pouring a chitosan acetate solution
into a saturated NH4HCO3 solution, the polysaccharide did not precipitate as expected but
gelled at once. Chitosan presents hydrogen (-OH, -NH and –C=) and hydrophobic bonding
favouring groups -CH3. Thus, the gelation of alkali chitosan solutions can involve a
combination of charge neutralization, hydrogen bonding and hydrophobic interactions (Cho
et al., 2005).
In this study, we have applied a similar idea to obtain mixed protein-chitosan gels in
alkaline conditions. During preliminary tests, the protein and chitosan solutions were not
well mixed due to the fast gelation of chitosan in NH4HCO3. For this reason it was decided
to use NaHCO3 as an alternate carbonate salt to obtain mixed gels.
Whey protein isolate (WPI) and gelatin type B (Gb) were used in this study, which are
respectively globular and fibrous proteins that could interact in different ways with the
polysaccharide. It is known that whey proteins form gels that can be white (particulate) or
transparent (fine-stranded) depending on the pH and ionic strength (Bottomley et al., 1990;
Bryant and McClements, 1998 & Cayot and Lorient, 1998). At pH>8.5, the denaturation of
whey proteins occurs even without heating (Hambling et al., 1992 & Cayot and Lorient,
1998). Thus, in a basic environment, -lactoglobulin (main protein and principal gelling
agent of WPI) is completely unfolded and forms filamentous (fine-stranded) gels. Gelatin,
however, forms fine-stranded gels due to its fibrous structure.
91
The first part of this study was to investigate the P-CH interactions in acid conditions (pH4
and pH6). In this part, the objective is to study these interactions in an alkaline
environment, varying polymer concentration.
3.4 Experimental Procedure
3.4.1 Materials
WPI, called BiPro, was purchased from Davisco Foods Intl. Inc. (Le Sueur, MN, USA). Its
composition was 71.24% -lactoglobulin (-lg) and 17.7% -lactalbumin (-la). The
gelatine (Gb) was type B (bovine), 225 bloom American Chemicals LTD with a MW of
100 000 Da, as determined with the Mark-Houwink relation according to Williams et al.
(1954). Chitosan was obtained from Les Pecheries Marinard Ltée. (Rivière-au-Renard, QC,
Canada). Its deacetylation degree was 93.5%. All chemicals were of analytical grade.
3.4.2 Preparation of solutions
Stock solutions of proteins were prepared by adding the protein powder to a 0.4M NaHCO3
solution (final pH between 8 and 9). The solution was gently stirred for about 2h at room
temperature and then stored overnight at 4°C to allow complete hydration of the protein.
WPI solutions were prepared at 8%, 14% and 20% of concentration and gelatin solutions at
6%, 8% and 10%. A stock solution of CH was prepared by adding the chitosan powder to a
92
0.1M acetic acid (AcH) at 1 and 2.5%CH. The polysaccharide was dissolved at room
temperature overnight.
The WPI isoelectric point (pI) was considered the same as -lg (pI 5.2) (Bryant and
McClements, 1998 & Cayot and Lorient, 1998). The Gb pI was 5.1 and was determined by
ion exchange resins (IR-120 cation and IRA-400 anion Amberlite exchangers) following
the procedure obtained from Janus et al. (1951).
3.4.3 Preparation of mixed solutions
The protein and chitosan solutions were mixed at room temperature in a 1:1 ratio. The
resulting pH was between 8 and 9 and it was not adjusted because chitosan starts to gel
immediately after contact with the NaHCO3 solution. For this reason each mixed solution
was prepared right before the rheological test.
3.4.4 Rheological measurements
The dynamic tests were performed with a TA Instrument rheometer (AR-1000 model) using
a cone-plate geometry. The storage (G’) and loss (G’’) moduli, and delta () values were
recorded at a fixed frequency of 1 Hz. A solvent trap was used to avoid dehydration of the
samples.
93
3.4.4.1 WPI-CH gelation
The WPI-CH solutions were tested with the following sequence of steps: 1) temperature
ramp at 3°C/min from 20 to 75°C, held at this temperature for 5 min (at this pH the protein
is already denaturated, so it does not need a long period of time to form a gel); 2) the gel
was cooled at 5°C/min from 75 to 20°C keeping this temperature for 5 min until values
were constant; 3) a frequency sweep from 0.1 to 10 Hz at 20°C. This sequence was
programmed at 0.5% of strain (within the linear viscoelastic region and as used by Ould
Eleya and Turgeon, 2000 a and b, and by Beaulieu et al., 2001). This was performed to
observe the iscoelastic properties of the gel at room temperature. All the sample
measurements were replicated at least twice.
3.4.4.2. Gb-CH gelation
For the Gb-CH solutions, the procedure was different because of the gelation characteristics
of the protein. The sequence was as follows: 1) a temperature increase at 3°C/min until
reaching 50°C, keeping this temperature for 10 min; 2) the mixture was cooled at 2°C/min
until 15°C, held at this temperature for 30 min; 3) a frequency sweep from 0.1 to 10 Hz at
20°C. This sequence was programmed at 0.2% of strain (within the linear viscoelastic
region and as used by Alevisopoulos et al. 1996). This was realized to observe the
viscoelastic properties of the gel at room temperature. For these Gb-CH tests in alkali
solutions, the samples were not reheated since the gelation of CH in alkaline conditions did
not show to have reversibility properties neither in the single nor the mixed gel (see results).
All the sample measurements were replicated at least twice.
For both P-CH systems, the heating rate was kept slow in order to avoid bubble formation
by the release of CO2 that could interfere with the measurements.
94
3.4.5. Statistical method
For each P system, a 3x3 factorial design was developed: three P levels (4%, 7% and
10%WPI, and 3%, 4% and 5%Gb) and three CH levels (0%, 0.5% and 1.25%). Treatments
were repeated at least twice. The statistical analysis was done for each experimental design
(one for each protein), and the analysis of variance (ANOVA) was computed to determine
the effect of the main factors (%P, %CH) and their combinations on the G’ modulus.
3.5 Results and discussion
The results will be separated in two different sections for each protein system studied. Thus,
the first part will discuss the WPI-CH system and the second will focus on the Gb-CH
system.
3.5.1 WPI-CH system
Gelation of the individual components in alkaline conditions is discussed first followed by
the alkali mixed system.
95
3.5.1.1 Single polymer gel formation
CH gelation
CH starts gelling immediately after being in contact with the carbonate salt. Therefore, in
the gelation profile of figure 3.1, the storage modulus G’ is always greater than the loss
modulus G’’. Also, the reversibility of the gel with temperature is not observed. However,
in order to maintain the same sequence for the CH as was done for the P-CH systems, the
heat treatment was applied.
In alkaline solutions, above the CH pKa, the ionization of the CH molecule decreases.
According to Cho et al. (2005), the ionization of chitosan at pH around 6-7 is decreased
from 50% to values below 40%. At low levels of protonation, the solubility of the molecule
decreases and contributes to gelation with increasing temperature. Also, the increase in
temperature decreases intramolecular hydrogen bonding interactions and so the CH
molecules can unfold easily, favouring the hydrophobic bonding association between
molecules and promoting gelation (Cho et al., 2005). According to Roberts (1992), the
formation of hydrophobic bonds between the sequences of the N-acyle residues interferes in
the non-reversible CH gelation.
With regards to the rheological behaviour of CH, the minimum in the moduli curves is
probably due to the hydrophobic forces between the molecules, which are weakened by the
decrease in temperature. This effect of the decrease in G’ and G’’ was also observed by
Cho et al. (2005) on a CH--glycerophosphate gel.
96
WPI gelation
Protein gelation was also observed by rheology. Figure 3.2 shows the gelation profile of
WPI, at the beginning of the heat treatment G’ and G’’ values decreased because of the
reduction in the viscosity solution with the temperature before gelling. Then, G’ increased
with the increase in temperature and became larger than G” indicating the formation of a
gelled network. During cooling from 75°C to 20°C, the moduli continued to increase
reaching somewhat constant values during the holding time at 20°C. Similar profiles have
been observed previously in whey protein gels (Ould Eleya and Turgeon, 2000a and b, and
Beaulieu et al., 2001). This increase is related to the consolidation of hydrogen bonds and
van der Waals forces between the proteins in the gel (Bryant and McClements, 1998), since
they are favoured by the decrease in temperature.
3.5.1.2 WPI-CH gelation
Figure 3.3 presents a bar graph of the last registered value of G’, G’’ and showing the
effect of the CH and WPI concentrations in alkali conditions. The parameters are presented
as a function of the CH concentration for different WPI concentration. The differences
among samples observed for G’, G” and were analyzed to determine their significance.
The ANOVA for the WPI-CH system is shown in table 3.1, after a log transformation of the
data to reduce the heterogeneity of the variance. Most of the variance comes from the main
factor effects: 46.48 and 34.48% from WPI and CH respectively. The combination of these
factors explains 15.83% of the total variance. The error term represented 2.4% of the
variance. In the case of G”, the main effects of WPI and CH were significant at p<0.001
(52.89% and 35.62% of the total variance), and the interaction effect WPI*CH was
significant at p<0.01, explaining 8.80% of the variance. As for , the three factors
(including the interaction) were significant at p<0.001, explaining WPI the 31.75%, CH the
97
42.35 and WPI*CH the 24.01% of the total variance. The ANOVA for G” and are shown
in annexe D.
As observed from figure 3.3, the moduli first decreased with the addition of chitosan and
then increased when increasing the polysaccharide concentration indicating that the
characteristics of the mixed gels are strongly influenced by the polysaccharide (significant
effect as per the ANOVA for the moduli). G’, G’’ and values for CH gels at 1.25% are
1647 Pa, 52 Pa and 1.81° respectively. Comparing against the values of the mixed gels with
1.25%CH (e.g. 1579 Pa and 74 Pa for the G’ and G’’ respectively for the 4%WPI-
1.25%CH gel), they are closer to the CH gel values than to the P gel values (109 Pa and 11
Pa for the 4%WPI pure gel). is also modified, decreasing with the presence of CH in the
system. This indicates the formation of a more elastic gel with the addition of CH, even
when they are less strong than the pure P gel (as observed in the higher P concentrations).
The significant WPI effect is also observed through the change in the moduli and with the
WPI concentration.
Figure 3.4 shows the gelation profile of the 7%WPI-1.25%CH. As expected, the system is a
gel from the beginning of the rheological test due to the CH gelation. However, it is
possible to observe the effect of the protein in the mixture by the fast increase of G’ during
the increase in temperature. This indicates that the network formation of WPI is gelling
independently of the chitosan network, which is already formed. Then, when decreasing the
temperature, there is a minimum in the moduli, which is due the CH effect, as can be seen
on its gelation profile and was explained before. The subsequent increase in the strength of
the gel as the temperature decreases has been attributed to the consolidation of hydrogen
bonds and van der Waals forces between the proteins favoured by the decrease in the
temperature. This phenomenon has been observed previously in single protein gels as well
as in the study of some other mixed gels (Ould Eleya and Turgeon, 2000a and b; Beaulieu
et al., 2001 & part I of this study: acid conditions). Although hydrogen bonds are not so
98
important in the conformation and aggregation of globular proteins, they are important in
the stabilization of the structures already formed (Bryant and McClements, 1998). This
effect decreased with the P concentration and increased with the chitosan concentration. In
the samples with 10%WPI-1.25%CH is not noticeable, while in the sample 4%WPI-
1.25%CH it is remarkably clear (not shown).
Figure 3.5 shows the frequency sweep for the 7%WPI-1.25%CH gel in alkaline conditions.
G’ and G’’ curves are parallel, while |*| (dynamic viscosity) decreases with the frequency.
This is characteristic of gel systems (Steffe, 1996). The gels at other concentrations showed
similar mechanical spectrum. The pure protein gels were stronger; whereas the 1.25%CH
mixed gels were stronger than those with 0.5%CH for the same protein concentration.
At these conditions of alkalinity, CH is neutral and although WPI is negatively charged,
there is no attraction between them so there is no complex formation. Using isothermal
titration calorimetry, Guzey and McClements (2006) studied the interactions between -lg
and chitosan in aqueous solutions as a function of the pH. The enthalpy change decreased
from pH 6 to pH 7 due the inhibition of complex formation at pH 7. At this pH, although -
lg is negatively charged the attraction between the polymers is reduced since CH has
already lost most of its positive charge (pKa 6-6.5). CH is fully ionized below pH 3 and
fully neutral above pH 9 (Cho et al., 2005). Hence, according to the literature (Cairns et al.,
1987), all of this indicates the formation of either an interpenetrated or a phase separated
network, since both polymers gel independently and form separate networks.
As for the visual aspect of the system, all mixed gels WPI-CH were translucent (Fig. 3.6),
indicating the formation of fine-stranded gels and no complex formation. At this pH (the
final pH after gelation was between 8 and 9 for all the single and mixed gels), WP’s are
completely denatured (Cayot and Lorient, 1998) and form filamentous gels due to their
99
unfolded structure. The gels (single and mixed) are more similar to a gelatin dessert; they
are more elastic and not creamy.
Comparing with the results shown in the first part of this study (acid conditions), the
alkaline gels are less strong (smaller G’ values) at the same protein and polysaccharide
concentrations than the acid gels (with some exceptions at pH4), but they are more elastic,
as can be seen from the values, which are smaller in the alkaline gels. This decrease in the
rigidity of gels with the increase in pH is due the WPI, an effect that has been observed
before with whey proteins. Clark and Lee-Tuffnell (1986) observed that, in the gelation of
bovine serum albumin under different conditions of pH and salt levels, gels at acid pH were
more rigid but less elastic than the weaker alkaline gels.
3.5.2 Gb-CH system
3.5.2.1 Single polymer gelation
CH gelation
As observed in the CH profile for the WPI-CH cycle, the polysaccharide starts gelling
immediately after being in contact with the carbonate salt. Therefore, in the gelation profile
for the Gb-CH cycle applied (in figure 3.7), the storage modulus G’ is also greater than the
loss modulus G’’ from the beginning of the test and no gelling point nor reversibility is
observed. However, as it was done for the WPI-CH study, the heat treatment was still
applied to observe any possible temperature effect on the Gb.
100
The minimum in the moduli curves observed in the gelation profile of CH for the WPI-CH
cycle due to the decrease in temperature that weakens the hydrophobic forces between
molecules is not observed in the CH gelation profile with the Gb-CH cycle. The
hydrophobic effect is stronger at higher temperatures, therefore this decrease is only
observed in the WPI cycle since the sample was brought at higher temperatures than the Gb
cycle (75°C vs 50°C) (see figures 3.1 and 3.7)
Gb gelation
G’ is higher than G” at the beginning of the test due the thickness of the solution. During
the heat treatment the protein is dissolved and both G’ and G’’ decreased, G’ becoming
smaller than G’’ and remaining lower during the heat step. G’ increased when cooling and
became larger than G” indicating the formation of a gelled structure (Fig. 3.8). These
observations are in accordance with other authors that have also studied this protein alone
and in mixtures with polysaccharides (Gómez-Guillén et al., 2002; Fonkwe et al., 2003;
Haug et al., 2004 a and b; López-Caballero et al., 2005). The increase of with temperature
and the decrease during cooling when the gel is forming indicates the reversibility of the
gel.
3.5.2.2 Mixed Gb-CH gelation
Table 3.2 shows the ANOVA for the Gb-CH system. The main factors CH and Gb explain
39.5% and 15.7% of the total variance respectively. However the significant effect of Gb is
only at p≤0.05, whereas that for CH is at p≤0.01. The combination effect of these two
factors, Gb*CH, is also significant, representing 27.1% of the total variance (p≤0.05). The
error represented the 8.1% of the total variance. It is to note that the 5%Gb-1.25%CH
samples showed phase separation and in fact the replicate was lost, therefore the degrees of
freedom for the error term were reduced by a value of one in order to compensate the
101
missing value. The small significance on the effects, as well as the high effect of the error
term, could actually be attributed to this. In the case of G”, only the CH effect is significant
(see annexe D), explaining 53.54% of the total variance (p<0.01). As for , Gb and CH are
significant at p<0.01, representing 26.41 and 31.27% of the total variance.
As can be seen in the bar graph of the figure 3.9, G’ and G’’ increased with the increase in
CH concentration. was also modified, increasing with higher concentration of CH,
especially at low protein content. There seems to be some kind of synergism in the moduli
values, since they are higher than in the pure Gb and CH gels. For example for the 4%Gb-
1.25%CH, the G’ and G’’ values were 2947 Pa and 73.34 Pa compared to 595 Pa and 5.34
Pa for 4%Gb alone and 937 Pa and 27.59 Pa for 1.25% CH alone. All of this shows the
significance of the main effects for the three rheological parameters as well as the Gb*CH
interaction in the case of G’. This apparent synergism from the polymers in the rheological
measurements could actually be by the interactions between one of the macromolecules and
small ions (or molecules) introduced into the system (Morris, 1990).
Looking at the gelation profile of the Gb-CH mixed solution (figure 3.10); the system is
also gelled from the beginning of the test due to the instant gelation of CH. The small
decrease in the moduli during heating is related to the dissolution of the Gb. However,
chitosan is able to maintain the gel formed even when the gelatin solution is liquid. The
small decrease in the moduli during cooling may be produced by CH as observed also in the
WPI-CH system. Cho et al. (2005) have investigated the thermoreversibility of chitosan and
observed that the gel formed was not completely thermoreversible to the original solution
state, which is also observed in the pure CH gel of this study. On the other hand, Gb gels
during cooling (Ledward, 1992) and thus contributes to the strength of the mixed gel at
lower temperatures (Gómez-Guillén et al., 2002; Fonkwe et al., 2003). Therefore, the
mixed gels are not thermoreversible and, although the cycle was not repeated twice to
102
confirm the non reversibility, decreased during the heat treatment and remained low
during cooling, indicating the non reversibility of the mixed gels.
Similar to the WPI-CH gels, there is no complex formation since at this pH CH is not
charged and no attraction exists between the polymers even when Gb is negatively charged.
So, knowing that the two polymers gel independently and form separate networks, the type
of gel must be an interpenetrated network. However, as mentioned previously, the 5%Gb-
1.25%CH gelled as two separate phases. In fact, the outer part of the gel in the rheometer
plate was completely transparent (Gb gel) whereas the inside part was a little turbid (CH
gel). Gelatin, being liquid during heating, could have favored phase separation resulting in
the apparition of two disctinct phases. This could mean that we were probably over the
threshold total polymer concentration in the system, which caused the increase of the
polymer concentration in different phases due to the polymer incompatibility (Tolstoguzov,
2003). On the other hand this could also indicate that in the Gb-CH system in alkaline
solution the polymers are incompatible and the macroscopic separation was not stopped by
the gelation of the system due to the high protein concentration. Ledward (1994), in his
review, lists the main factors leading to phase separation, including the pH of the system,
which modifies the relative charges on the polymers. The macroscopic separation observed
in the 5%Gb-1.25%CH could have been favoured by the small heating rate applied. If this
is the case, the type of gel should be a phase-separated network.
Figure 3.11 shows the frequency sweep for the 4%Gb-1.25%CH gel in alkaline conditions.
G’ and G’’ are not dependent of the frequency and |*| (dynamic viscosity) decreases with
the increase in the frequency. According to Steffe (1996), this mechanical spectrum is
characteristic of a gel system. The other mixed gels showed similar results, the gels with
higher P and CH concentration being stronger.
103
Figure 3.12 shows the visual aspect of these filamentous gels. There was not a big
difference on its appearance between the pure and mixed gels, although the mixed Gb-CH
gels felt more plastic-like.
Lastly, comparing with the results in acid conditions (chapter II) of the Gb gels, the alkali
mixed gels are stronger and more elastic than the acid gels at the same protein and
polysaccharide concentration. The strength of the pure gelatin gels is little affected by the
pH in the range of 4 to 10, as seen in literature (Ledward, 1992). So, all the above indicates
that this increase in the firmness of the mixed alkaline gels is mainly because of the effect
of CH. The gels, however, are less elastic with the increase in CH concentration, as
indicated by the increase in the values.
3.6 Conclusions
The P-CH gels in alkali environment were gels of incompatible mixtures of polymers, since
the two of them gelled and formed independent networks to form the structure of the gel. In
the case of the WPI-CH system, chitosan gelled before the proteins and the gel properties
were similar to those of the pure chitosan gels rather than the pure protein gels as occurred
in the acid conditions (chapter II). All the factors in the ANOVA were significant for G’,
G” and , although at different levels of significance.
In the case of the Gb-CH system, in spite of the chitosan gelation before the gelatin, the
characteristics of the gels were the result of some kind of synergism between the networks
formed, as the mixed gels were stronger than the pure polymer gels at its respective
concentration. The 5%Gb-1.25%CH alkaline system separated in two different phases
before complete gelation, and the formed gel had a more transparent phase (Gb) than the
104
other (CH). This could have interfered in the determination of the significant values, which
most of them resulted with a low level of significance if any. In this system, the mixed gels
were stronger at these conditions than those at pH 4 and pH 6. In both systems, the P-CH
gels were more elastic (smaller values) in alkaline solutions than in the acid ones,
although the addition of CH to the Gb solutions made the Gb gels less elastic in acid and
alkaline conditions.
In general, the Gb gels are more elastic than the WPI gels in alkaline and acid conditions as
observed in the values, which are smaller, and in the strain sweeps that showed longer
linear viscoelastic region.
Figure 3.1 Gelation profile of 1.25%chitosan in alkaline conditions following the temperature program used for WPI-CH mixed systems.
1
10
100
1000
10000
025
050
075
010
0012
5015
0017
5020
0022
5025
00
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
20
40
60
80
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
)G''
G'
T
delta
105
Figure 3.2 Gelation profile of 7%WPI in alkaline conditions.
Table 3. 1 ANOVA for the G' modulus for the WPI-CH system in alkaline conditions (log transformation applied).
Source of variation DF SS F value Repetitions 1 0.0678 2.54 ns WPI 2 4.0752 76.28 ***CH 2 3.0227 56.58 ***WPI*CH 4 1.3880 12.99 ** Error 8 0.2137 Total 17 8.7674 Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (**)=p≤0.01, (***)=p≤0.001, ns=not significant.
0.01
0.1
1
10
100
1000
10000
025
050
075
010
0012
5015
0017
5020
0022
5025
00
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
20
40
60
80
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
T
delta
106
Figure 3.3 Effect of chitosan on G’, G’’ and delta () in the WPI-CH alkaline systems.
1
10
100
1000
10000
100000
0 0.5 1.25
%CH
G' (
Pa
)
1
10
100
1000
10000
0 0.5 1.25
%CH
G''
(Pa
)
0
5
10
15
20
25
30
0 0.5 1.25
%CH
de
lta
(d
eg
ree
s)
%CH 0 0.5
%C H4%WPI 7%WPI 10%WPI
107
gure 3.4 Gelation profile of the 7%WPI-1.25%CH mixed system in alkaline conditions.
Figure 3.5 Frequency sweep of the 7%WPI-1.25%CH gel in alkaline conditions.
1
10
100
1000
10000
0 500 1000 1500 2000Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
20
40
60
80
100
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
T
delta
1
10
100
1000
10000
1.00
1.26
1.58
1.99
2.51
3.16
3.98
5.02
6.32
7.94
9.94
Frequency (Hz)
G',
G''
(Pa)
1
10
100
1000
|h*|
(P
a.s) G''
G'
|h*|
108
Figure 3.6 Visual aspect of the WPI-CH gels in alkaline conditions (preliminary tests). WPI:CH ratio (%:%). 1)6.5:1.25, 2)6.5:0.5 3)5.25:1.25, 4)5.25:0.5, 5)4:1.25, 6)4:0.5.
Table 3. 2 ANOVA for the G' modulus for the Gb-CH system in alkaline conditions.
Source of variation DF SS F value Repetitions 1 1448671 8.38 * Gb 2 2343348 6.78 * CH 2 5915384 17.11 ** Gb*CH 4 4055603 5.87 * Error 7 1209841 Total 16 14972847
Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (*)=p≤0.05, (**)=p≤0.01.
1 2 3 4 5 6
109
Figure 3.7 Gelation profile of 1.25%chitosan in alkaline conditions following the temperature program used for Gb-CH mixed systems.
Figure 3.8 Profile of 4%Gb gelation in alkaline conditions.
0.01
0.1
1
10
100
1000
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
20
40
60
80
100
T (
°C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
T
delta
1
10
100
1000
10000
0 1000 2000 3000 4000
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
20
40
60
80
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
T
delta
110
Figure 3.9 Effect of chitosan on G’, G’’ and delta () in the Gb-CH alkaline systems.
1
10
100
1000
10000
0 0.5 1.25
% CH
G' (
Pa
)
1
10
100
1000
0 0.5 1.25
% CH
G''
(Pa
)
0
2
4
6
8
10
0 0.5 1.25
% CH
de
lta
(d
eg
ree
s)
0 0.5 1 .2 53%Gb 4%Gb 5%Gb
111
Figure 3.10 Gelation profile of the mixed system 4%Gb-1.25%CH in alkaline conditions.
Figure 3.11 Frequency sweep of the 4%Gb-1.25%CH gel in alkaline conditions.
1
10
100
1000
10000
0 1000 2000 3000 4000
Global time (s)
G',
G''
(Pa)
0
10
20
30
40
50
60
T(°
C);
del
ta (
deg
rees
)
G''
G'
T
delta
1
10
100
1000
10000
1.00
1.26
1.58
1.99
2.51
3.16
3.98
5.02
6.32
7.94
9.94
Frequency (Hz)
G',
G''
(Pa)
1
10
100
1000|h
*| (
Pa.
s) G''
G'
|h*|
112
Figure 3.12 Visual aspect of the Gb-CH gels in alkaline conditions (preliminary tests). Gb:CH ratio (%:%) 1) 3:1.25, 2) 3:0.5, 3) 1.5:1.25, 4) 1.5:0.5, 5) 0.5:1.25, 6) 0.5:0.5.
1 2 3 4 5 6
CONCLUSION GÉNÉRALE
Les travaux présentés visent l’étude du comportement du chitosane en présence de deux
protéines (des protéines de lactosérum et de la gélatine) dans la formation de gels mixtes.
Les deux mélanges étudiés ont permis la gélification de systèmes dans des conditions
différentes de pH et de concentrations de polymères, résultant dans la formation de gels
avec une variété des caractéristiques et propriétés tant rhéologiques que sensorielles (e.g.
couleur et texture).
L’effet du chitosane sur les systèmes étudiés dépend de la protéine, du pH et de la
concentration. Le chitosane ne gélifie pas à pH 4, tandis qu’à pH 6 il commence à gélifier,
formant un gel transparent très fragile. Cependant en conditions alcalines, il forme un gel
transparent, ferme et élastique.
De façon générale, dans le système avec des protéines sériques le caractère solide des gels
diminue avec l’ajout du chitosane à pH 4, alors qu’il augmente à pH 6. En condition
alcaline, le caractère solide des gels augmente avec la concentration en protéines pour une
même concentration de chitosane. Dans les systèmes mixtes contenant de la gélatine, à pH
4 et pH 6, le chitosane augmente le caractère visqueux des gels. À pH basique, cependant,
la fermeté de ces gels augmente avec la concentration en chitosane.
Les systèmes isolat de protéines de lactosérum-chitosane forment des gels blanc opaque à
pH 4 et pH 6, tandis qu’à pH basique ils forment des gels translucides. La coloration
blanche à pH acides peut être expliquée soit par l’agrégation de la protéine favorisée à pH
acide,soit par la formation de complexe à pH 6 où les polymères ont des charges opposées
114
et l’attraction entre eux est possible. Le caractère translucide des gels alcalins est relié à
l’obtention de gels filamenteux dans ces conditions qui favorisent la répulsion entre les
protéines (pH> pI). Les systèmes gélatine-chitosane forment toutefois des gels translucides
dans les trois conditions de pH étudiées car les deux polymères ont des structures linéaires
et forment, donc, des gels fins. À pH 6, cependant, ces gels sont plus turbides, pouvant
indiquer la formation des complexes entre la gélatine et le chitosane.
Ces différences dans l’apparence des gels sont le résultat des interactions entre les
polymères qui peuvent être répulsives ou attractives, et donc la formation des réseaux
gélifiés différents. Des types de réseaux (à phases séparées, couplés) pour les systèmes
étudiés ont été proposés, cependant plus de recherche est nécessaire, pour mieux identifier
les interactions et pouvoir déterminer plus précisément les réseaux.
Il est possible d’obtenir un gel sans chauffage à pH 6 dans le mélange protéines sériques-
chitosane après quelques jours d’entreposage à 4°C. Le temps de gélification dépend de la
concentration en protéines. Les gels à concentrations élevées de protéines gélifient plus vite
que les gels contenant moins de protéines. Ces gels étaient blancs et turbides à la différence
des systèmes gélifiés thermiquement qui étaient blancs et opaques. De plus, ils sont plus
élastiques et moins crémeux que les gels obtenus par chauffage.
La gélification du chitosane en conditions alcalines empêche d’observer la réversibilité de
la gélatine dans les gels mixtes. La thermoréversibilité a été observée seulement dans les
gels mixtes en conditions acides.
115
La gélification de ces systèmes avec des caractéristiques différentes favorise le
développement d‘applications très variées pour ces gels. Les gels blancs sont crémeux et
doux similaires l’aspect du yogourt ou du caillé du lait, tandis que les gels translucides sont
élastiques et fermes comme l’aspect du dessert de gélatine (jello).
Cette étude permet, donc, d’augmenter les connaissances sur les interactions entre le
chitosane et les protéines. Cependant, il est nécessaire de réaliser plus de recherche pour
obtenir une étude plus complète du comportement du chitosane en présence de protéines
pendant la gélification. D’autres facteurs tels que la force ionique, la présence d’autres
additifs (e.g. le sucre) et ingrédients (e.g. les lipides) doivent être aussi étudiés.
L’utilisation d’un rhéomètre à déformation contrôlée permettrait de préciser certaines
informations telles le point de gel. Pour certains systèmes, la répétitivité des résultats a été
difficile à obtenir.
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Annexe A
Systèmes modèles de pH pour l’évaluation nutritionnelle des
complexes protéine-chitosane.
pH system models for nutritional evaluation of protein-chitosan complexes
Hermosillo, I; Turgeon, S.L., and Bégin, A.
128
Introduction
Chitosan is a glucosamine polysaccharide (Fig. 1) produced by the deacetylation of chitin
and is not degradable by the digestive enzymes [1]. It has been found to decrease hepatic
cholesterol and fat absorption by combining to bile salts and triglycerides [2]. At the same
time, nutritional concerns have been expressed for its use in food. It could interfere with
absorption of fat soluble vitamins because of the decrease of fat absorbed and with
absorption of water soluble vitamins by gel formation in the intestine [3].
The effect of chitosan on gel formation in the small intestine and the possibility of
electrostatic complex formation at intestinal pH (6<pH<7.4) are not clear. In a normal diet,
gels can also be formed in the digestive system by other food components, and chitosan
could in fact have only a minor effect in a normal diet. Furthermore, the electrostatic
interactions of chitosan could be questioned at intestinal pH, chitosan being almost neutral
or only partially charged, since the pK of glucosamine varies between 6 and 6.5 (Fig. 1).
Figure 1. Glucosamine structure at pH<6 and pH>7
NH3+
O
H
O
CH2O
HH
HH
O
n
O
NH2
O
H
O
CH2O
HH
HH
O
n
O
pH<6 pH>7
129
The formation of complexes between chitosan and proteins could be affected by the protein
pI, the pH, the ionic strength, the concentration, and the ratio of the polymers in solution
[4]. In this work, we developed different types of mixed gels made of chitosan and proteins
at different pH found in the digestive tract from stomach to small intestine. These systems
would be suitable to study nutritional applications such as encapsulation or delivery system
in future studies using simulated digestion conditions (37°C with enzymes) The first
method uses the gel irreversibility of whey protein for studies under acidic and alkaline
conditions. The second method is based on gel reversibility of gelatin for the comparative
studies on liquid and gel systems. The third method is based on an innovating mechanism
of chemical neutralization using carbonate simulating the higher intestinal pH. All these
methods permit gel studies directly in dynamic oscillation rheometer.
Materials and methods
Tests tubes. For acid systems, chitosan (93.5 % DDA) was dissolved overnight in 0.1 M
HCl. Whey protein isolates (71,24% β-lactoglobulin, α-lactalbumin 17,7%) and gelatin
(bovine skin, MW 10 000) were dissolved in a 0.25 M succinate buffer. For the neutral and
alkaline systems, chitosan was dissolved overnight in 0.1 M acetic acid. Proteins were
dissolved in 0.5 M NaHCO3 solution (alkaline systems) and in deionized water (neutral
system) for which the pH was adjusted with 0.2 M NaOH. The isoelectric point (pI) of the
gelatin was determined by ion exchange resins (IR-120 cation and IRA-400 anion
Amberlite exchangers) and was 5.1. The pI of WPI was considered the same as the pI of β-
lactoglobulines (pI=5.1). The chitosan and the protein solutions (1:1 W/W) were mixed in
test tubes. The mixtures containing WPI were heated at 85°C in an oven until the gels were
formed. The mixtures containing gelatin were heated at 50°C until the gelatin was
completely dissolved and then cooled in a refrigerator overnight at about 1°C and left to
stand at room temperature for about 2h.
130
Rheological tests. The dynamic tests were performed in TA Instrument rheometer (AR-
1000N model) with a cone-plate geometry with deformation ranges <1%. The WPI-
chitosan solution was heated at 5°C min-1 up to 90°C, followed by a holding time of 15
min. The gel was then cooled at room temperature (cooling rate: 5°C min-1). The gelatin-
chitosan solutions were first heated at 55°C until G’ and G’’ remained constant. The
solution was then cooled at 15°C (cooling rate: 2°C min-1) to produce the gel (constant G’
value).
Results and discussion
Gelatin-chitosan systems
At pH 4, gelatin solutions form gels, chitosan is soluble, and both polymers have positive
charges. In all cases, mixed solutions of gelatin and chitosan formed gels. Tubes 1 and 3
(Fig. 2a), containing the higher chitosan concentrations, were turbid. This turbidity suggests
the appearance of small chitosan-rich phases embedded in the gelatin gel network or
complexes formation between gelatin and chitosan. The turbidity decreased at lower
chitosan concentrations (tube 5). Samples 2, 4 and 6 were less turbid which let us think that
there was less phase separation in the network. At pH 5, gelatin is almost neutral and forms
gels. Chitosan has a positive charge and is soluble. All samples were transparent (Fig. 2b),
so there is no phase separation or complex formation. At pH 6, gelatin is negatively charged
and forms gels. Chitosan is partially charged but is not soluble. At the highest
concentrations of chitosan (tubes 1, 3 and 5) (Fig. 2c), the solutions were very turbid
resulting from complex formation between gelatin (-) and chitosan (+). At pH 8.5, gelatin is
negatively charged and forms gels. Chitosan is neutral and also forms gels. All gels were
almost transparent (Fig. 2d), probably because of the formation of two interpenetrated
networks since chitosan is neutral and both polymers gel independently. The interaction
131
between chitosan and gelatin could also be suppressed by the high ionic force of the system
(0.5M NaHCO3).
Figure 2. Visual aspect of gelatin-chitosan gels a) pH ≈ 4, b) pH ≈ 5, c) pH ≈ 6, d) pH ≈ 8.5. Gelatin:chitosan :%) 1) 6:2.5, 2) 6:1, 3) 3:2.5, 4) 3:1, 5) 1:2.5, 6) 1:1.
WPI-chitosan
At pH 4, β-lactoglobulin (main WPI protein) is positively charged and produces white gels
because of their globular structure. Chitosan is also positively charged and is soluble. All
gel samples were white and no phase separation was observed (Fig. 3a). At pH 5, β-
lactoglobuline is at its isoelectric point and forms gels. Chitosan is positively charged and is
soluble. The resulting gels were again white with no phase separation (results not shown).
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
a) pH 4 b) pH 5
c) pH 6 d) Alkalin: 0.5 M NaHCO3 , pH 8.5
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
132
At pH 6, β-lactoglobulin is slightly negatively charged and still forms gels. Chitosan is
partially positively charged and is not soluble. Therefore complex formation occurred but
no phase separation was observed (Fig. 3b). At pH 7, β-lactoglobulin is positively charged
and chitosan is neutral and insoluble. Samples 2, 4 and 6 (low chitosan concentration)
showed phase separation (Fig. 3c). However, samples 1, 3 and 5 did not show phase
separation due to the high chitosan concentration. Probably the gel formation stopped the
process of phase separation. At pH 8.5, the gels were transparent (Fig. 3d). At this pH, β-
lactoglobulin unfolds and forms filamentous gels. Since chitosan also gels, the results
should be an interpenetrated network.
Figure 3. Visual aspect of WPI-chitosan gels a) pH ≈ 4, b) pH ≈ 6, c) pH ≈ 7, d) pH ≈ 8.5. WPI:chitosan ratio (%:%). 1)13:2.5, 2)13:1, 3)10.5:2.5, 4)10.5:1, 5)8:2.5, 6)8:1.
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
1 .2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
a) pH 4 b) pH 6
d) pH 8.5
133
Rheology
WPI-chitosan thermal gel formation. G’ increased during the heat treatment and remained
constants during cooling when the gel was already formed, showing the irreversibility of
the gel (Fig. 4). The gelification point decreased with the polymer concentration.
Gelatin-chitosan thermal gel formation. The moduli decreased with temperature
(solubilization of G and reduction of viscosity) and increased with cooling (Fig. 5). G’ was
first higher than G’’ due the high viscosity of the mixture, but became smaller when
heating. During cooling G’ became again higher than G’’ at the gelification point.
Figure 4. WPI-chitosan (10.5%:2.5%) gel formation (pH 4) followed by rheology.
Gelification point at 86°C
Temperature cycle
0,01
1
100
10000
0 20 40 60 80 100
Temperature (°C)
G',
G''
(Pa
) G’
G’’
134
Figure 5. Gelatin-chitosan (8%:2.5%) gel formation (pH 4).
Gelatin-chitosan alkaline gel formation. G’ decreased during the heat treatment
(solubilization of the gelatin) and increased during cooling, but again G’being always
higher than G’’ (Fig. 6). During the 2nd cycle, the moduli remained almost constant,
indicating the irreversibility of the gels in the alkaline system. The small reduction of G’
during heating in the 2nd cycle came from the melting effect of gelatin, however G’
remains almost constant because chitosan did not melt.
Temperature cycle
0,1
1
10
100
1000
0 10 20 30 40 50 60
Temperature (°C)
G',
G''
(Pa
)
G’
G
Gelification point at 19.4°C
135
Figure 6. Gelatin-chitosan (6%:2.5%) gel (pH 8.5) formation.
Conclusions
The protein-chitosan gels can be formed in different pH conditions (acid, alkaline and
neutral systems) representative of conditions found in the digestive tract. These systems
could be used for nutritional studies of vitamin liberation in digestive system simulators.
Depending on the interactions between the polymers and to visual characteristics, we
believe the gels formed could be coupled networks (transparent), interpenetrated networks
and/or phase separation networks (turbid and white). However, more investigation is
necessary to confirm this idea or to better identify the interactions and define the network.
The results obtained in this work give more advances in the knowledge of the interactions
between food proteins and chitosan for the formation of mixed gels of protein-chitosan
Temperature cycle (2 times)
10
100
1000
0 10 20 30 40 50
Temperature (°C)
G'.
G''
(Pa)
136
solutions, making possible the development of nutraceutical products and functional foods
using a protein-chitosan gel.
References [1] Zhou et al. (2006). Food Sci Technol LWB., 39(10), 1087.
[2] Thongngam M, McClements DJ (2005). Food Hydrocolloid, 19, 813.
[3] Deuchi et al. (1995). Biosc Biotech Biochem 59, 1211.
[4] Laplante S., Turgeon S.L., Paquin P. (2005). Food Hydrocolloids, 19, 721.
Acknowledgements The authors are gratefully acknowledged for the financial support received from Conseil des recherches en pêche et agroalimentaire du Québec (CORPAQ).
Annexe B
Tableaux ANOVA pour les paramètres rhéologiques G’’ (module de perte) et (delta) en conditions acides
13813
Table 1 ANOVA for the loss modulus (G’’) for the WPI-CH system.
Source of variation DF SS F value Repetition 1 0.0078 0.73 ns WPI 2 12.8376 599.57 *** CH 2 0.0402 1.88 ns PH 1 2.4661 230.36 *** WPI*CH 4 0.5224 12.20 *** WPI*pH 2 0.7743 36.16 *** CH*pH 2 2.0609 96.25 *** WPI*CH*pH 4 1.1573 27.03 *** Error 17 0.1820 Total 35 20.0486
Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (***)=p≤0.001, ns=not significant.
Table 2 ANOVA for delta () for the WPI-CH system.
Source of variation DF SS F value Repetition 1 0.0011 0.76 ns WPI 2 0.0548 18.72 *** CH 2 0.0532 18.15 *** PH 1 0.2019 137.85 *** WPI*CH 4 0.0257 4.39 * WPI*pH 2 0.0594 20.27 *** CH*pH 2 0.0649 22.15 *** WPI*CH*pH 4 0.0172 2.93 ns Error 17 0.0249 Total 35 0.5030
Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (*)=p≤0.0, (**)=p≤0.01 (***)=p≤0.001, ns=not significant.
13913
Table 3 ANOVA for the loss modulus (G’’) for the Gb-CH system.
Source of variation DF SS F value Repetition 1 0.0078 0.73 ns Gb 2 12.8376 599.57 *** CH 2 0.0402 1.88 ns PH 1 2.4661 230.36 *** Gb*CH 4 0.5224 12.20 *** Gb*pH 2 0.7743 36.16 *** CH*pH 2 2.0609 96.25 *** Gb*CH*pH 4 1.1573 27.03 *** Error 17 0.1820 Total 35 20.0486
Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (***)=p≤0.001, ns=not significant.
Table 4 ANOVA for delta () for the Gb-CH system.
Source of variation DF SS F value Repetition 1 0.0072 2.23 ns Gb 2 1.7705 273.35 *** CH 2 11.4242 1763.79 *** PH 1 0.5298 163.60 *** Gb*CH 4 0.6450 49.79 *** Gb*pH 2 0.0324 5.00 ns CH*pH 2 0.1453 22.44 *** Gb*CH*pH 4 0.0047 0.36 ns Error 17 0.0551 Total 35 14.6142
Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (***)=p≤0.001, ns=not significant.
Annexe C
Tableaux ANOVA pour les points de gélification (Tg) et de fusion (Tm) du système Gb-CH en conditions acides.
14114
Table 5 ANOVA for the setting point (Tg) of the Gb-CH system.
Source of variation DF SS F value Repetition 1 0.0034 1.83 ns Gb 2 0.0052 1.41 ns CH 2 0.0705 19.01 *** PH 1 0.1918 103.40 *** Gb*CH 4 0.0193 2.61 ns Gb*pH 2 0.0004 0.12 ns CH*pH 2 0.0098 2.64 ns Gb*CH*pH 4 0.0125 1.68 ns Error 17 0.0315 Total 35 0.3446
Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (***)=p≤0.001, ns=not significant.
Table 6 ANOVA for the melting point (Tm) of the Gb-CH system.
Source of variation DF SS F value Repetition 1 0.0003 2.77 ns Gb 2 0.0157 80.22 *** CH 2 0.0162 82.53 *** PH 1 0.0870 888.54 *** Gb*CH 4 0.0193 49.17 *** Gb*pH 2 0.0143 73.02 *** CH*pH 2 0.0113 57.50 *** Gb*CH*pH 4 0.0080 20.32 *** Error 17 0.0017 Total 35 0.1737
Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (***)=p≤0.001, ns=not significant.
Annexe D
Tableaux ANOVA pour les paramètres rhéologiques G” (module de perte) et (delta) du système Gb-CH milieu
alcaline.
14314
Table 7 ANOVA for the loss modulus (G’’) for the WPI-CH system in alkaline environment (log transformation applied).
Source of variation DF SS F value Repetition 1 0.0985 4.12 ns WPI 2 5.7116 119.49 *** CH 2 3.8466 80.47 *** WPI*CH 4 0.9508 9.95 ** Error 8 0.1912 Total 17 10.7987
Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (**)=p≤0.01, (***)=p≤0.001, ns=not significant.
Table 8 ANOVA for delta () for the WPI-CH system in alkaline environment (log transformation applied).
Source of variation DF SS F value Repetition 1 0.0010 1.02 ns WPI 2 0.1421 75.86 *** CH 2 0.1896 101.19 *** WPI*CH 4 0.1075 28.69 *** Error 8 0.0075 Total 17 0.4476
Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (***)=p≤0.001, ns=not significant.
14414
Table 9 ANOVA for the loss modulus (G’’) for the Gb-CH system in alkaline environment.
Source of variation DF SS F value Repetition 1 4377.35 3.98 ns Gb 2 1645.86 0.75 ns CH 2 24490.01 11.12 ** Gb*CH 4 7525.45 1.71 ns Error 7 7706.39 Total 16 45745.05
Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (**)=p≤0.01, ns=not significant.
Table 10 ANOVA for delta () for the GB-CH system in alkaline environment.
Source of variation DF SS F value Repetition 1 1.4225 3.63 ns Gb 2 8.3946 10.71 ** CH 2 9.9397 12.68 ** Gb*CH 4 9.2869 5.93 ns Error 7 2.7428 Total 16 31.7863
Symbols: DF=degrees of freedom, SS=sum of squares, F=Fisher ratio. Level of significance: (**)=p≤0.001, ns=not significant.
Annexe E
Détermination du poids moléculaire et pI de la gélatine
146
Détermination du poids moléculaire de la gélatine
quantité C (%) C (g/100 mL) t (s) t (moyenne) Écart type rel Ln (rel) Ln(rel)/C sp sp/C(mL) 0% (solvent) 0 85,66 85,67 0,014142136
85,68
10 mL Cmax 2% 2,2069 204,42 204,335 0,120208153 2,38514066 0,8692581 0,39388196 1,38514066 0,62764088204,25
+2mL 2M KSCN 0,83333333 1,839083333 170,25 170,28 0,042426407 1,98762694 0,68694143 0,37352382 0,98762694 0,53702131170,31
+2mL 2M KSCN 0,71428571 1,576357143 156,18 156,175 0,007071067 1,82298354 0,60047447 0,3809254 0,82298354 0,52207937156,17
+2mL 2M KSCN 0,625 1,3793125 145,18 145,195 0,021213204 1,69481732 0,52757496 0,38249125 0,69481732 0,50374177145,21
+2mL 2M KSCN 0,55555556 1,226055556 137,14 137,135 0,007071068 1,60073538 0,47046314 0,3837209 0,60073538 0,48997403137,13
+2mL 2M KSCN 0,5 1,10345 133,05 133,04 0,014142135 1,55293568 0,44014713 0,39888271 0,55293568 0,50109718133,03
Ln(hrel)/C sp/Cy 0,3539 0,391m 0,1138 -0,0033b 0,3539 0,391x 0 0
average y 0,37245
relation de Mark-HouwinkM= poids moléculaire
pour solutions de gélatine (Williams et al.,1954).K= 2,90E-04a= 0,62[] 0,37245M 103272,2977 D
103 KD
y = 0,1134x + 0,3539
R2 = 0,8553
y = -0,0035x + 0,391
R2 = 0,0243
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
C (g/100 mL)
ln(
rel)
/C
et
sp
/C
ln(hrel)/C hsp/C Linéaire (hsp/C) Linéaire (ln(hrel)/C)
relC
sp
Cc
c
lnlimlim 1
00
aKM
147
Détermination du pI de la gélatine
Une solution de gélatine de 1%concentration de solution a été passée par une mini colonne
de résines mixtes (2 ½ parties de la résine d’échange anionique Amberlite IRA 400 et 1
partie de la résine d’échange cationique Amberlite IR 120) (Janus et al., 1951). Le pH de la
solution de gélatine obtenue après le passage par la colonne est le pI.
Différentes fractions de gélatine ont été mesurées et la dernière a été considérée le pI de la
protéine.
solution pH
1 Eau millipore 6,5
2 Eau millipore (dernière fraction de 300 mL) 6,9
3 Gélatine 5,38
4 Gélatine 5,20
5 Gélatine 5,14
6 Gélatine 5,15
7 Gélatine 5,14
