Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi ...rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/16546/1/Vilanova-Gisbert-Eugenio.pdf · APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA A LA SÍNTESIS

Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980

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UNIVERSIDAD DE ALICANTE

FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

FAGULTAB DE glEKSWS-BIBUOTECA UNIVERSIDAD BE ALICANTE

N.o REGJSTíE-.„..£.£JL_ FHOHA^2;.£a.Dpro.....„„

OÜU, „ . _ SIGNATURA ¿ E & L ¿ = — 13

ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE TIROSINASA

INMOVILIZADA. PROPIEDADES Y APLICACIONES.

R. M

Memoria presentada para optar al grado de

Doctor en Ciencias, Sección de Quúnicas,

por

EUGENIO VILANOVA GISBERT

Alicante, Mayo 1980



IDAD DE MURCIA

AD DE MEDICINA

RA D E B I O Q U Í M I C A

Los Doctores José Antonio Lozano Teruel, Catedrático

y Director del Departamento Interfacultativo de Bio

química de la Universidad de Murcia, y José Luis Ibo

rra Pastor, Profesor Adjunto de Bioquímica,

CERTIFICAN: Que los trabajos experimentales corres

pondientes a la Memoria titulada: "Actividad Tirosi-

na hidroxilasa de Tirosinasa inmovilizada. Propieda

des y Aplicaciones", han sido realizados por D. Euge

nio Vilanova Gisbert, bajo nuestra dirección, y a

nuestro juicio reúne las condiciones adecuadas para

ser presentada y juzgada por el Tribunal correspon

diente para aspirar al grado de Doctor en Ciencias,

Sección de Químicas.

Murcia, 9 de Junio de 1980

Fdo. José A. Lozano Teruel Fdo. José Luis Iborra Pastor

Catedrático de Bioquímica Profesor Adjunto de Bioquímica



La presente Memoria, forma parte de la

línea general de investigación que en el Departamento de Bio

química de la Facultad de Ciencias y del Colegio Universita

rio de Medicina de Alicante, se viene desarrollando sobre Bio

química en fase sólida, y en concreto sobre la inmovilización

de enzimas en soportes sólidos, así como sus aplicaciones bio

químicas, industriales y analíticas.

Este trabajo está realizado bajo la codirec-

ción de los Drs. D. José Luis I borra Pastor y D. José Anto

nio Lozano Teruel, a quienes agradezco su orientación y ayu

da. Así mismo a los compañeros del Departamento por la a-

yuda prestada y el ambiente de trabajo, especialmente a Dña.

Ma. del Rosario Blanes Torreblanca por su eficaz colaboración

en los estudios con soportes de nylon.



- I -

Í N D I C E

Pág.

LISTA DE ABREVIATURAS Vil

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO DEL TRABAJO. 1

2 ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE TIROSINASA SOLU

BLE. COMPARACIÓN CON DÓPA OXIDASA. 4

2.1. Características generales de la actividad tirosina hidroxilasa.

de tirosinasa. 5

2.2. Comportamiento frente a la extracción y purificación. 11

2.3. Cinética, perfil pH-actividad y estabilidad a la reacción. 16

2.3.1. Cinética. 16

2.3.2. Perfiles pH-actividad. 20

2.3.3. Estabilidad a la reacción. 21

3. CARACTERÍSTICAS DE LOS SOPORTES Y REACTORES

UTILIZADOS EN LA INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA. 23

3.1. Elección del método y soporte de inmovilización. 24

3.2. Enzacryl-AA. 26

3.3. Soporte CPG-AA. 28

3.4. Derivados de nylon. 30

3.5. Reactores y metodología de estudio de las enzimas 38

inmovilizadas.

3.5.1. Reactor de baño agitado (STR). 38

3.5.2. Reactor de baño agitado continuo (CSTR). 39

3.5.3. Reactor de columna con lecho empaquetado (PBCR). 40

3.5.4. Reactor tubular (TR). 41



INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE

TIROSINASA EN ENZACRYL-AA Y EN CPG-AA. 41

4 .1 . Rendimiento de inmovilización en Enzacryl-AA 42

4.2. Inmovilización de tirosinasa en CPG-AA. Comparación

con tirosinasa de champiñón. 49

4.3. Estudio de las condiciones óptimas de ensayo de la acti

vidad tirosina hidroxilasa del Enzacryl-AA-IME. 52

4.4. Comportamiento cinético del Enzacryl-AA-IME. 56

4.5. Efecto del ascorbato y de la hidracina sobre las actividades

del SE y del IME. 58

4.5.1. Efecto del ascorbato y de la hidracina en la forma

ción de dopacromo. 59

4.5.2. Efecto del ascorbato y la hidracina sobre el consumo

de oxígeno. 61

4.5.3. Consumo de ascorbato en la reacción. 65

INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE

PROTIROSINASA EN ENZACRYL-AA 69

5.1. Activación de protirosinasa. 70

5.1.1. Efecto de la tripsina sobre la actividad tirosina

hidroxilasa de protirosinasa soluble. 72

5.1.2. Activación de protirosinasa por inmovilización.

Efecto de la tripsina sobre Enzacryl-AA-IMP. 74

5.2. Rendimientos de inmovilización de protirosinasa en

Enzacryl-AA. 76

5.3. Comportamiento cinético del Enzacryl-AA-IMP. 79

ESTABILIDAD DE LOS DERIVADOS ENZACRYL-AA-IME,

ENZACRYL-AA-IMP y CPG-AA-IME. 82

6.1. El fenómeno de la inactivación de la tirosinasa por la

actuación. 83

6.2. Estabilidad al almacenamiento. 86



-III-

6.3. Actividad de los reactores con gel-IME y estabilidad de

de la reacción a largo tiempo. 87

6.4. Influencia de varios factores sobre la estabilidad y acti-

actividad del IME. 94

6.4.1. Efecto de la fuerza iónica y del pH. 94

6.4.2. Efecto de la temperatura. 96

6.4.3. Efecto del ascorbato y de la hidracina. 98

6.5. Factores que afectan especialmente a reactores de

columna empaquetada. 100

6.5.1. Efecto de la concentración de oxi'geno. 100

6.5.2. Efecto de la concentración de sustrato. 102

6.5.3. Efecto de la velocidad de flujo volumétrico y

de la velocidad lineal. 104

6.6. Comparación de los resultados obtenidos con otros

intentos de estabilización de tirosinasa por inmovilización. 107

7. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES DE TIROSINASA EN

GELES DE NYLON MODIFICADO. 110

7.1. Rendimientos de inmovilización. 110

7.2. Comportamiento de lod geles-ny Ion-I ME a tiempos

largos de reacción.. 113

7.3. Efecto de la cantidad de protei'na sobre la inmovilización 116

7.4 Estabilidad al almacenamiento. 117

7.5 Perfiles pH-actividad. 118

7.6. Propiedades cinéticas de los geles-nylon-IME. 119

8. APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA A

LA SÍNTESIS DE L-DOPA. 120

8.1. Criterios de comparación de la producción de distintos

reactores y soportes. 121

8.2. Producción de L-dopa en reactores con Enzacryl-AA-IME.

Efecto del tipo de reactor. 126



-IV-

8.2.1. Producción en reactores de baño agitado (STR). 126

8.2.2. Producción en reactor continuo de baño agitado

(CSTR). 127

8.2.3. Producción en reactor de columna empaquetada

(PBCR) 128

8.3. Producción de L-dopa con CPG-AA-IME. Efecto de la

porosidad del soporte. 130

8.4. Producción de L-dopa en reactores con geles-nylon-IME. 132

INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA EN TUBOS Y EN

MEMBRANAS DE NYLON. 137

9.1. Inmovilización en tubo de nylon 138

9.1.1. Rendimiento de inmovilización 138

9.1.2. Propiedades cinéticas del tubo-IME 139

9.1.3. Estabilidad al uso continuo e intermitente del

tubo-IME. Posibilidades anah'ticas. 140

9.2. Inmovilización en membranas de nylon. 143

9.2.1. Rendimiento de inmovilización en función de

la cantidad de protema. 143

9.2.2. Estabilidad al almacenamiento. 144

APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA EN

MEMBRANA DE NYLON A UN ELECTRODO DE ENZIMA. 146

10.1. Diseño de un electrodo de tirosinasa. 149

10.2. Respuesta ti'pica del electrodo de enzima y criterios de

medida. 149

10.3. Efecto de la agitación, de la presencia de ascorbato

y del t ipo de sustrato sobre la respuesta del electrodo. 150

10.4. Efecto del volumen y de la concentración sobre la

respuesta del electrodo de enzima. 152

10.5. Efecto de la actividad enzimática de la membrana

sobre la respuesta del electrodo de enzima. 154



-V

10.6. Interpretación de la respuesta del electrodo. 155

10.7. Fatiga del electrodo con el número de ensayos. 157

10.8. Dependencia de la respuesta del electrodo con la

concentración de sustrato. 161

10.9. Aplicación del electrodo a la determinación de

muestras de L-tirosina y L-dopa. 164

CONCLUSIONES. 166

MÉTODOS EXPERIMENTALES. 170

12.1. Obtención de enzima. 170

12.1.1. Extracción de protirosinasa. 170

12.1.2. Purificación de protirosinasa. 171

12.1.3. Activación de la protirosinasa. 172

12.1.4. Criterio de homogeneidad. Electroforesis en gel

de poliacrilamida a pH 4,3. 172

12.2. Preparación de soportes. 174

12.2.1. Enzacryl-AA y CPG-AA. 174

12.2.2. Preparación de polvo de nylon 174

12.2.3. Modificación de membrana y tubo de nylon. 174

12.2.4. Preparación de nylon alquilamina (NAQA). 175

12.2.5. Preparación de nylon parcialmente hidrolizado (NH). 175

12.2.6. Preparación de nylon-bencidina (NB) 176

12.2.7. Preparación de nylon poliisonitrilo (NPI). 176

12.2.8. Preparación de nylon poliarilamina (NPAA) 177

12.3. Inmovilización de tirosinasa. 177

12.3.1. Inmovilización a soportes con grupos arilamina

activados con ácido nitroso. 177

12.3.2. Inmovilización a soportes con grupos alquila-

mina activados con glutaraldehido. 178

12.3.3. Inmovilización sobre NPI activado con acetal-

dehido. 179



12.4. Determinación de protema.

12.5. Determinación de ascorbato. 180

12.6. Determinación de oxigeno disuelto. 181

12.7. Determinación de L-dopa. 181

12.8. Determinación de la actividad enzimática. 182

12.8.1. Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa 18

soluble. 182

12.8.2. Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa

inmovilizada. 183

12.8.3. Actividad dopa oxidasa de tirosinasa. 184

12.8.4. Determinaciones con el electrodo de tirosinasa

inmovilizada. 184

13. BIBLIOGRAFÍA. 186



-VII-

ABREVIATURAS.

Act

Act

IME

R

A c t R o ActSTR- ActPBCR

Act. sust.

CM

CM/Phe

CPG-AA

CPG-AA-IME

C R

CSTR

Ef. acop.

L-dopa

E

Enzacryl-AA

Enzacryl-AA-IME

fP

gel-IME

gel-nylon-IME

H20/P¡

IME (IMP)

IME

m

Actividad estándar del derivado inmovilizado (U/mg gel-IME)

Actividad del IME en las condiciones reales de un determinado reactor (U/mg gel-IME).

Actp para condiciones iniciales.

Actp en el t ipo de reactor que se indica.

Fracción de actividad sustrai'da de la disolución de enzima que se aplica al proceso de inmovilización.

Disolucón de enzima purificada por cromatografía en CM-Se-phadex.

Disolución de enzima purificada por cromatografi'a en CM-Se-phadex y posteriormente en Phenyl-Sepharosa.

Soporte de vidrio de poro controlado con grupos arilamina.

Enzima inmovilizada en CPG-AA activado con ácido nitroso.

Capacidad de reacción del reactor.

Reactor continuo de baño agitado.

Eficacia de acoplamiento, fracción de actividad manifestada por el IME respecto a la sustrai'da de la disolución.

L-3,4-Dih¡drox¡fenilalanina.

Enzima

Soporte de poliacrilamida con grupos arilamina.

Enzima inmovilizada en Enzacryl-AA activado con ácido nitroso.

Factor de purificación.

Enzima inmovilizada en soporte con forma de gel.

Enzima inmovilizada en soporte de nylon con forma de gel.

Extracto estándar de enzima (ó proenzima) de epidermis de rana, obtenido de forma selectiva con tanpón fosfato, después de una extracción previa con agua (Método: 12.1.1)

Enzima (proenzima) inmovilizada.

Cantidad de enzima inmovilizada, en unidades estándares (U).

Masa de gel-IME (g ó mg), longitud de tubo-IME (cm) ó superficie.de membrana-IME (cm^).

membrana-IME Enzima inmovilizada en soporte con forma de membrana.



http://superficie.de

-VIII-

NAQA

NAQA-IME

NB

NB-IME ó NB-glut-IME

NB-nitroso-IME

NH

NH-IME

NPAA

NPAA-IME

NPI

NPI-IME

NPI-acético-IME

P

P

PBCR

Phe

Pi

P ' T

Q

q

rglobal

rinm

rprot

rpur

S

SE (SP)

STR

Soporte de nylon con grupos alqilamina obtenido por ruptu-no hidroh'tica de grupos amida del nylon.

Enzima inmovilizada en NAQA activado con glutaraldehido.

Soporte de nylon-bencidina.

Enzima inmovilizada en NB activado con glutaraldehido.

Enzima inmovilizada en NB activado con ácido nitroso.

Soporte de nylon parcialmente hidrolizado.

Enzima inmovilizada en NH activado con glutaraldehido.

Soporte de nylon-poliarilamina.

Enzima inmovilizada en NPAA activado con ácido nitroso.

Soporte de nylon-poliisonitrilo.

Enzima inmovilizada en NPI activado con acetaldehido.

Enzima inmovilizada en NPI activado con acético/acetaldehido.

Producto de reacción.

Parámetro que indica las unidades estándar de IME utilizadas por litro de disolución sustrato procesado a lo largo de la vida de uso del reactor (U/1).

Reactor de columna con lecho empaquetado.

Enzima purificada por cromatografi'a en Phenyl-Sepharosa.

Extracto enzimético obtenido de epidermis de rana por extracción directa con tampón fosfato.

Producción específica total del reactor a lo largo de su vida de uso (mol ó g de dopa/Ude IME.

Velocidad de flujo volumétrico en reactores continuos (ml/h).

Parámetro que indica la masa de gel-IME (g ó mg) utilizada por litro de disolución sustrato procesado en el reactor a lo largo de su vida de uso.

Rendimiento del proceso global de purificación e inmovilización.

Rendimiento de inmovilización.

Rendimiento de unión de proteína en la inmovilización.

Rendimiento del proceso de purificación.

Sustrato.

Enzima (proenzima) soluble.

Reactor de baño agitado.



-IX-

Tiempo (min, h).

Tiempo de semiinactivación (h).

Reactor de tubo.

Tiempo de residencia normalizado (min/U).

Tiempo total o vida de uso del reactor (h).

Enzima inmovilizada en soporte con forma de tubo.

Velocidad lineal del fluido de un reactor continuo (cm/h)

Velocidad de consumo de oxígeno (°/Q de C^ /min) .

Volumen del reactor (mi, I).

Volumen de sustrato (mi, I).

Volumen total de sustrato procesado a lo largo de la vida de uso del reactor.

Factor de conversión; fracción de sustrato transformado en producto.

Factor de conversión medio del producto obtenido a lo lar go de la vida de uso del reactor.



1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO DEL TRABAJO.



-2-

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO DEL TRABAJO.

La inmovilización de enzimas es una técnica que consiste en

la fijación física o química de las moléculas de protei'na a la estructura de un

soporte insoluble en agua. Este campo de la Biotecnología empezó a tomar auge

en la década de los sesenta y viene desarrollándose durante los últimos años (Mos

bach,1976), abriendo amplias posibilidades para el futuro de la tecnología de en

zimas (Thomas, 1979a; 1979b). Gracias a este desarrollo se ha conseguido aplicar

dicha tecnología a procesos industriales (Pitcher, 1975; Weetall, 1977; Tramper,

1979), y a sistemas analíticos (Guilbault, 1979; Hornby et al. 1977; Sundaram,

1979). También se vienen aplicando ampliamente para estudios bioquímicos, co

mo por ejemplo, sobre la naturaleza funcional de subunidades aisladas ( Chan,

1976), sobre cambios conformacionales (Gabel y Kasche, 1976), y especialmen

te la simulación in vitro de enzimas que en su estado natural se encuentran a-

sociadas a estructuras celulares particuladas, mediente la inmovilización a mem

branas artificiales reconstituidas (Broun, 1976; Vieth, 1979).

La tirosinasa es un sistema enzimático que presenta activida

des tirosina hidroxilasa y dopa oxidasa y cuya estructura y función se viene

estudiando en nuestro Departamento, en coordinación con el Departamento de

Bioquímica de la Universidad de Murcia. Este sistema enzimático presenta una

serie de problemas, tanto desde el punto de vista de la expresión de su activi

dad, como de su aplicación a la tecnología de inmovilización de enzimas. Así,

bajo el aspecto bioquímico, en epidermis de anfibios se extrae en forma de

proenzima que se activa por luz, temperatura y enzimas proteolíticas (Barisas y

McGuire, 1974; Mikkelsen et al., 1975), muestra histéresis (García Carmona.1980),

un equilibrio asociación-disociación y otras propiedades características (Ferragut,

1980 ). Desde el punto de vista biotécnológico, la tirosinasa es una enzima que

presenta limitaciones de transferencia de materia, debido entre otros factores a

la baja solubilidad de los sustratos y a su inestabilidad ocasionada por los pro

ductos y otros factores.

Hay una evidencia bibliográfica de inmovilización de tirosina-



-3-

sa de champiñón, como intentos de estabilización de la enzima (Wykes et al.,

1971; Letts y Chance, 1974), sin llegar a conseguir la suficiente estabilidad que

permitiera su uso continuado. También Schiller y Liu (1976) y Schiller et al.(1978),

inmovilizaron tirosinasa de champiñón para la determinación potenciométrica de

fenoles en aguas residuales. Aunque este sistema resultó sensible desde el pun

to de vista anali'tico, perdía drásticamente la actividad, lo que impedía su uso

repetitivo.

En nuestro caso, la enzima objeto de estudio fué la de epi

dermis de rana. En nuestro Departamento se ha estudiado la interacción de esta

enzima con soportes sólidos para cromatografía de afinidad (Iborra et al. 1976;

Cortés, 1978) y mediante la técnica de inmovilización, se han analizado los e-

fectos microambientales de diferentes soportes en la actividad dopa oxidasa (I-

borra et al. 1977; Manjón, 1978), la activación por inmovilización de la activi

dad dopa oxidasa de la proenzima (Iborra et. al., 1979), la expresión de la

actividad de las subunidades y la estructura cuaternaria por entrecruzamiento

(Ferragut, 1980). Así mismo, se ha aplicado la técnica de fotooxidación con

colorantes inmovilizados para analizar propiedades estructurales y funcionales de

la actividad dopa oxidasa (Llorca, 1980)

Los objetivos del presente trabajo están centrados en la acti

vidad tirosina hidroxilasa de la enzima. En primer lugar se pretende el análi

sis de las características generales de la actividad tirosina hidroxilasa de la tiro

sinasa inmovilizada en diferentes soportes sólidos, en comparación con las

propiedades de la enzima soluble , con el fin de conseguir un sistema con

mayor estabilidad de la enzima. Por otra parte, al mejorar los procedimientos

de inmovilización y de estabilización de esta enzima suicida (García Carmona,

1980), se pretende ampliar las posibilidades de aplicación a la síntesis de L-do-

pa, por su interés farmacológico, así como la utilización del sistema inmoviliza

do para fines analíticos, entre ellos un electrodo de enzima.



2. ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE TIROSINASA

SOLUBLE. COMPARACIÓN CON DOPA OXIDASA.



-5-

ACTIVIPAD TIROSINA HIDROXILASA DE T1ROSINASA SOLUBLE.

COMPARACIÓN CON DOPA OXIDASA.

2 .1 . CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA ACTIVIDAD TIROSINA

HIDROXILASA DE TIROSINASA.

El sistema enzimático tirosinasa (E.C. 1.14.18.1), con el

nombre recomendado de monofenol monooxigenasa (Comission Biochemical No-

menclature, 1972), incluye a enzimas presentes en especies de toda la escala filo-

genética (Pomerantz, 1963 ; Horowitz et al., 1970; Miller et al., 1970; Burnet,

1971; Padrón et al., 1974; Pomerantz y Murphy, 1974; Mikkelsen y Triplett,

1975 ; Hughes y Pnce, 1975 ; Abramowitz y Chavin, 1978; Nishioka et al. 1978).

Tienen propiedades distintas según la fuente, siendo común en todos los casos

ser cuproproteínas no azules y catalizar la oxidación de monofenoles y/o difeno

les (Gunsalus, 1974). El proceso general, que en su función biológica se asigna

a la tirosinasa de origen animal es el siguiente (Pomerantz y L i , 1970).

°2 H2° HO 1 / 2 o 2 H2o O

HO-(Cg>-R > {. H 0 J g ^ . R \ ^ Q a > ~ ^ _ R AH2 (1) A ^ ' { 2 ) ^ ^

L t i r o s i n a L-dopa dopaquinona M- &

siendo A H 2 un cofactor dador de electrones. Le siguen reacciones no enzimáti-

cas que dan lugar a la formación de dopacromo (Nicolaus, 1968) y éste

lentamente, se emplea en la formación de pigmentos de melaninas. La reacción

(1) es la que propiamente define la actividad tirosina hidroxilasa y la (2) a la

actividad dopa oxidasa (Pomerantz, 1966). Las expresiones de acividad cresolasa

y catecolasa, que también se emplean para indicar ambas funciones de la enzima,

se refieren normalmente al proceso global, fácilmente observable, de formación

de dopacromo y consumo de oxígeno que tiene lugar cuando se parte de L-ti-

rosina o de L-dopa como sustratos, respectivamente.



-6-

La enzima de epidermis de rana es una glicoproteína con

0,75 % de carbohidratos y con estructura oligomérica, que mantiene un equi

librio de asociación-disociación de monómero-tetrámero en la forma nativa de

proenzima y monómero-dimero en la forma activada con tripsina, siendo aproxi

madamente de 70.000 daltons el peso molecular del monómero (Ferragut, 1980),

La conversión de proenzima a enzima implica un desplegamiento de la cadena

polipepti'dica (Iborra et al. 1978, Ferragut, 1980) y alcanzar una conformación

más estable (Galindo,1976, Manjón,1978; García Carmona, 1980). La interacción

con soportes de afinidad hidrofóbica han demostrado el carácter hidrófobo de

la tirosinasa y ha permitido su purificación(Cortés, 1978).

En presencia de ascorbato, con L-dopa como sustrato, El- Ba-

youmi y Frieden (1957) observaron que no se formaba dopacromo y se produ

cía la oxidación de ascorbato, la cual Fling et al. (1963) observaron que se da

ba a dos veces la velocidad de formación de dopacromo en ausencia de ascor-

bato.Se interpretó por una rápida reducción de la dopaquinona formada, al

reaccionar con el ascorbato, según el siguiente esquema de reacciones:

no E

dehidroascorbato L>14'1 « W L-ascorbato

AH,

L-tirosina >

(1)

dopacromo

(4) I noE

leucodopacromo no E

(D,(2),(3),(4),(5)

En presencia de ascorbato las reacciones (4) y (5) no se dan

y el balance global con L-dopa como sustrato daría:

Oo •+" ascorbato -> dehidroascorbato (6)



-7-

Mientras que con L-tirosina sen'a:

L-tirosina + ascorbato L-dopa -+- dehidroascorbato > (7)

-f- 3/2 0 2 + A H 2 + H 2 0 - I - A

Aunque el balance global de la reacción (7) es la conversión de L-tirosina a L-

dopa, no representa la reacción propia de la actividad hidroxilante de L-tirosina

sino el proceso conjunto de las reacciones (1), (2) y (3). Además,por otro lado

hay que tener en cuenta que el ciclo formado por las reacciones (2) y (3) de

termina la existencia de un cortocircuito que daría lugar a la oxidación neta

de ascorbato como consecuencia de la acumulación de L-dopa formada. Esto

último, es equivalente a considerar la reacción real en presencia de ascorbato

como la suma de la reacción (7) y n veces la reacción (6)

El estudio de la actividad tirosina hidroxilasa está condicio

nado a los métodos de medida que se pueden aplicar, de los cuales los más ca

racterísticos son los siguientes:

a) Medida espectrofotométrica del dopacromo formado. Dado que en este caso se

mide el producto final, para considerarlo como medida de la actividad tirosina hi

droxilasa es necesario que la hidroxilación de tirosina sea la etapa limitante del

mecanismo.

b) Medida polarográfica o manométríca del oxígeno consumido en la reacción. Co

mo en el caso anterior implica una medida del proceso global y no puede emplear

se correctamente en presencia de ascorbato, pues la existencia del cortocuito for

mado por las reacciones (2) y (3) implican un consumo de oxígeno no relaciona

do directamente con la actividad de hidroxilación de tirosina.

c) Medida radiométrica del 3 HOH formada a partir de L-tirosona-3,5-3H, según el

siguiente mecanismo aceptado (Pomerantz, 1966):

' H n n n u HO ^ ^ ,COOH

N H 2 + A + 3HOH j 0 f ^ N H 2 +AH2+02 >;§) r

H ° J, 3H (8)



-8-

En este método se está midiendo solamente la etapa de hidroxilación de la L-

tirosina, independiente de las posteriores acciones de oxidación de la L-dopa

formada. Constituye pues, un método óptimo para distinguir la actividad tirosi-

na hidroxilasa de las demás reacciones, enzimáticas o no, que acompañan al sis

tema de reacción. Aunque es muy sensible, la laboriosidad del método pone li

mitaciones a su utilización.

d) Medida colorimétrica de la L-dopa acumulada en la reacción en presencia de

ascorbato. Este método fué el empleado a lo largo de este trabajo como métof

do estándar ( descrito en 12.7), en base al método original de Arnow (1937a),

modificado por nosotros. Su aplicación es sencilla, rápida, reproducible y lineal

con la concentración de enzima, y dado que parte de nuestro objetivo era la

síntesis de L-dopa, el método nos dio una medida apropiada. Las dificultades

de su uso para estudio de mecanismos de las reacciones de la tirosinasa, radi

can en que no se está midiendo simplemente la conversión de L-tirosina a L-

dopa, sino un conjunto de reacciones que incluirían las etapas de mecanismos

más complejos, como los de las reacciones (1), (2) y (3). Pomerantz (1966),

observó que con tirosinasa de mamíferos, la velocidad de hidroxilación de tiro-

sina, medida radiométricamente, era la misma en presencia que en ausencia de

ascorbato, e igual que la de acumulación de L-dopa en presencia de ascorbato

midiendo por el método de Arnow. Esto implicaba que la actividad tirosina hi

droxilasa no se afecta en si misma por la presencia de ascorbato, al menos en

términos de velocidad inicial.

Otra propiedad característica de la actividad hidroxilasa

de tirosinasas es la existencia de un periodo de retardo o también llamado de

inducción, que ha dificultado aún más el estudio de esta actividad. Ha sido en

contrado en tirosinasa de mamíferos (Pomerantz, 1964), de insectos (Seybold

et al., 1975) y de epidermis de rana (García Carmona, 1980).Los requerimientos,

de cofactores para la inducción de la enzima demamíferos ha sido estudiada por

Pomerantz y Warner (1967) y por Hearing et al. (1978 a), llegando a la conclu

sión de que el producto de hidroxilación de la L-tirosina, la L-dopa, es el más

eficaz cofactor, el cual actuando como dador de electrones (AH2) elimina el pe

ríodo de retardo. De acuerdo con esto la estequiometría de las reacciones (1) y

(2) quedaría como sigue(Pomerantz y Warner, 1967):



-9-

L-tirosina

L-dopa Tirosinasa

-* L-dopa

HoO

-» dopaquinona (9)

La disminución del período de retardo con la concentración de L-dopa inicial

se aprecia tanto midiendo la actividad por la formación de dopacromo, como

por el método radiométrico, e igualmente lo hace el aumento de la concentra

ción de enzima. La concentración de sustrato L-tirosina aumenta los períodos

de retardo. Estos hechos y otros factores que afectan al período de retardo

sugieren a Garci'a Carmona que la enzima posee un comportamiento por el que

se le puede asignar la propiedad de histéresis en el sentido definido por Frieden

(1970), y lo interpreta en función de la existencia de un equilibrio de dimeri-

zación lento en que la forma dimérica de la enzima sería la forma funcional-

mente activa, la cual se formaría más rápidamente por la presencia de L-dopa

Con el esquema de reacciones (9), el proceso en presencia

de ascorbato, suponiendo que su efecto fuera simplemente la reducción de la

dopaquinona a L-dopa, sería el siguiente:

L-Tirosina

L-dopa

-* L-dopa

•+ H 2 0 ascorbato dehidroascorbato

t dopaquinona -"""" ^^~**>* L-dopa

(10) lo que daría una estequiometría global de:

L-tirosina + 0«-

ascorbato

L-dopa + H 2 0

-+- dehidroascorbato (11)



-10-

Una característica d« la tirosinasa que afecta notablemente a

los objetivos del trabajo que se presenta en esta Memoria es la inactivación por

la actuación. La estabilidad de una enzima en su actuación catalítica puede cuan-

tificarse por los valores del tiempo de semiinactivación ( t j ,2 ) , definido como el

tiempo necesario para que a lo largo de su actuación, la actividad de la enzima

se redujera a la mitad de su valor inicial. La actividad dopa oxidasa, medida por

la formación de dopacromo por método espectrofotométrico, manifiesta valores

de t1 / 2 de 4 minutos (Manjón, 1978). La actividad tirosina hidroxilasa, seguida por

el método radiométrico, en ausencia de ascorbato y por lo tanto dándose la

formación de dopacromo, dio valores semejantes de t j , 2 , entre 4 y 5 minutos.

Sin embargo en presencia de ascorbato en el medio de reacción, no se observó

pérdida significativa de actividad durante 10 minutos de reacción (García Carmo-

na, 1980). De las características cinéticas del proceso de inactivación, García Car

mona dedujo que el proceso de inactivación partía de un intermediario Enzima—

-sustrato o Enzima—producto del mecanismo del proceso catalítico. Si el efecto

del ascorbato fuera simplemente la reducción de dopaquinona a L-dopa, la anu

lación de la inactivación por el ascorbato demostraría que la especie que se i-

nactiva es un complejo E-P, o de lo contrario habría que admitir que el ascor

bato puede unirse a algún centro de la enzima, desviando el proceso catalítico

por otro mecanismo; esto últ imo estaría en consonancia con el efecto de cofac-

tor que el ascorbato ejerce respecto al período de retardo. Por otro lado la in

movilización de la enzima a soportes sólidos, proporcionó un espectacular aumen

to de la estabilidad a la actuación de la actividad dopa oxidasa, llegando a va

lores de t j , 2 de 150 minutos pon el soporte Enzacryl-AA (Iborra et al. 1977,

Manjón, 1978). Esto sugiere que en el proceso de inactivación estaba implicado

algún cambio conformacional, y que la rigidez que confiere a la estructura de

la proteína la unión covalente al soporte, dificulta ese cambio conformacional.

La inmovilización de la enzima a soportes ¡nsolubles y su ac

tuación en presencia de ascorbato, se emplearán en este trabajo para intentar u-

na alta estabilización de la actividad hidroxilasa de la tirosinasa, a fin de permi

tir su aplicación a los fines indicados anteriormente como objetivos del trabajo.



-11-

En las secciones siguientes del presente capítulo se analizarán

los resultados obtenidos en la purificación de la actividad tirosina hidroxilasa so

luble y de algunas propiedades cinéticas, en relación con la actividad dopa oxi

dasa de la misma proteína

2.2. COMPORTAMIENTO FRENTE A LA EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN.

El procedimiento general de obtención de la enzima consistió

en la extracción de la proteína de epidermis de rana por su solubilización en

presencia de una fuerza iónica apropiada. Posteriormente se purificó por croma

tografía de intercambio iónico en CM-Sephadex, seguido de cromatografía de in

teracción hidrofobica con Phenyl-Sepharosa. La enzima se obtuvo con este proce

dimiento en forma de proenzima, pasándola a la forma activa mediante trata

miento con tripsina (Método: 12.1.3.).

La extracción de tirosinasa se realizó por homogenl zación de

la epidermis de rana con disolución de tampón fosfato pH 7,0, de concentración

apropiada para proporcionar la fuerza iónica deseada. Cuando se empleó como

medio de extracción agua destilada, se extrajo proteína sin ninguna actividad t i

rosina hidroxilasa ni dopa oxidasa. El incremento de la concentración de fosfato

proporcionó un ligero aumento de la cantidad de proteína y actividad extraída,

pero con una menor actividad específica, siendo prácticamente idénticos los com

portamientos de la actividad hidroxilasa y dopa oxidasa (Fig. 1). Así pues, cuan

do se deseó una extracción lo más selectiva posible, resultó más apropiado el

tratamiento con agua y posterior extracción en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0.

Este sistema de extracción selectiva, fué el empleado como método estándar

(Método: 12.1.1.) y el extracto así obtenido se le denominó extracto H20/P¡.

La extracción directa con fosfato 0,1 M pH 7,0 (extracto P¡) proporcionó ma

yor concentración de proteínas propias del entorno natural de la enzima, aproxi

mación que se utilizó en algunas experiencias posteriores. En la Tabla 1 se

muestran los resultados obtenidos de una experiencia tipo, de los dos sistemas

de extracción, y como puede observarse existió un paralelismo entre el compor

tamiento a la extracción de la actividad tirosina hidroxilasa y la actividad dopa

oxidasa.



-12-

F O t F A T O ( M |

Fig. 1. Extracción de tirosinasa de epidermis de rana a diversas con

centraciones de fosfato. Cada extracción se realizó por ho-

mogenización de 20 mg de epidermis liofilizadas por mi de

tampón fosfato, pH 7,0.

Tabla 1

Actividad tirosina hidroxiiasa y dopa oxidasa en una extracción a partir de

epidermis.

Sistema

de

extracción

P¡

H 2 0

H20/P¡

Protei'na

(mg/ml)

0,53

0,43

0,20

Tirosina

U/ml

0,23

0,00

0,17

hidroxiiasa

U/mg

0,43

—

0,86

fP

1.0

—

2,0

dopa

U/ml

2,2

0,0

1.7

oxidasa

U/mg

4,0

—

8,7

fP

1.0

—

2,2

fp: factor de purificación respecto al extracto P¡



-13-

En las diversas extracciones llevadas a cabo con distintas

muestras de epidermis, se observó siempre una relación constante de 10 +0,6

unidades de dopa oxidasa extraída por unidad de tirosina hidroxilasa. Este he

cho apoya el supuesto de que la misma proteína fuera responsable de ambas

actividades enzimáticas. El valor de la relación dopa oxidasa/tirosina hidroxilasa

fué menor (alrededor de 6 ) en extractos almacenados durante 30 días a 5°C,

lo cual nos indicó que la inactivación por el almacenamiento afectó más a la

actividad dopa oxidasa que a la tirosina hidroxilasa.

La interacción de extractos de proenzima con el soporte car

gado negativamente CM-Sephadex dio un mismo perfil de elución para las activi

dades tirosina hidroxilasa y dopa oxidasa (Fig. 2). Los resultados obtenidos indi

caron que el método fué útil para la purificación de la proenzima. La igualdad

en el comportamiento de elución fué un dato más a favor de que la misma

proteína era responsable de las dos actividades enzimáticas.

En nuestro Departamento se había demostrado anteriormente

la afinidad de la proteína con actividad dopa oxidasa por los grupos fenilos del

Fig. 2. Cromatografía en CM-Sephadex de un extracto hÔ/Pj de

proenzima. Para 250 mi de extracto H 20/Pi (0,61 U T.H./ml,

5,1 U D.O./mg) se empleó 1 g de CM-Sephadex. Columna de

3x30 cm. Q=30 ml/h.



-14-

soporte hidrofóbico Phenyl-Sepharosa (Iborra et al., 1977; Cortés, 1978). En ba

se a ello, se aplicó la cromatografía en columna con dicho soporte a extractos

de protirosinasa y de tirosinasa activada en columna de tripsina-sepharosa, así

como a protirosinasa purificada previamente por intercambio iónico con CM-Se-

phadex. Los comportamientos de elución fueron muy semejantes en todos los

casos para las dos actividades ensayadas, tanto respecto a los volúmenes de elu

ción como en los factores de purificación obtenidos. Un perfil de elución carac

terístico de esta cromatografía de interacción hidrofóbica se muestra en Ja

Fig. 3. La cromatografía en Phenyl-Sepharosa resultó útil como técnica

de purificación en sí misma y como etapa de purificación concatenada con la

cromatografía de intercambio iónico en CM-Sephadex.

Fig. 3 Cromatografía de afinidad hidrofóbica en Phenyl-Sepha

rosa de proenzima purificada previamente por CM-Sepha

dex. Aplicadoa 10 mi de disolución de proenzima (3,2

U T.H./mg y 36 U D.O./mg). Columna con 3 mi de

Phenyl-Sepharosa. Q=12 ml/h.



-15-

En la Tabla 2 se muestran los resultados de aplicar los mé

todos de purificación a un extracto de tirosinasa. Puede observarse que la puri

ficación de un extracto HoO/P¡ con CM-Sephadex dio semejantes factores de pu

rificación que con Phenyl-Sepharosa, aunque con mayor rendimiento en este últi

mo. El procedimiento global de purificación, consistente en una extracción selec

tiva hÔ/Pj, seguido de interacción con CM-Sephadex y finalmente cromatogra

fía en Phenyl-Sepharosa, proporcionó una preparación que se le denominó como

protirosinasa purificada CM/Phe. Se consiguieron preparaciones con actividades es

pecíficas de 6-8 U T.H./mg, que representaron factores de purificación de 30-40

respecto al extracto P¡ y se obtuvieron con rendimientos de recuperación de ac

tividad del 60-80 % .

Tabla 2

Purificación de las actividades tirosina hidroxilasa y dopa oxidasa de protirosinasa

Etapa de

purificación

Extracto P¡

H20/P¡

CM-Sephadex (*)

Phenyl-Sepharosa

CM/Phe (**)

(*)

s

dopa

oxidasa

(U/mg)

2,6

6,5

34,0

35,1

70,0

tirosina

hidroxilasa

(U/mg)

0,23

0,60

3,59

3,45

7,36

fP

1.0

2,6

15,6

15,0

32,0

rpur

100

91

65

81

61

(*) Aplicado a extracto H20/P¡

(**) Proceso global de purificación: extracción

l-Ô/Pj, cromatografía CM-Sephadex y cro

matografía Phenyl-Sepharosa.

fp factor de purificación referido a la

actividad tirosina hidroxilasa de ex

tracto P¡

r-yj/endimiento del proceso de purifica

ción respecto a tirosina hidroxilasa.

Una muestra de protirosinasa purificada se sometió a electrofo-

resis catiónica de pH 4,3 en gel de poliacriiamida (Método: 12.1.4.). La tinción de

las bandas de proteínas con azul Comassie dio un electroforetograma con una úni

ca banda de proteína (Rf 0,12) Los densitogramas indicaron una homogeneidad de

la preparación de un 95 % de pureza. Cuando se incubaron geles con L-dopa o



-16-

con L-tirosina independientemente, en presencia de tripsina, se observó la tinción

de la banda de protei'na en cada uno de los geles, lo que demostró que tanto

la actividad dopa oxidasa como la tirosina hidroxilasa coincidi'an en la misma

banda.

Asi' pues, con los resultados expuestos, quedó confirmado que

la tirosinasa es responsable de las dos actividades tirosina hidroxilasa y dopa oxi

dasa.

2.3. CINÉTICA, PERFIL pH-ACTIVIDAD Y ESTABILIDAD A LA REACCIÓN

Con el fin de comparar las propiedades de la tirosinasa inmo

vilizada con las de la propia enzima soluble, se realizó un análisis de las propie

dades más significativas, relacionadas con la afinidad de la enzima por su sustra

to, pH óptimo e inactivación con la actuación.

2.3.1. CINÉTICA.

Se estudió la cinética de la reacción de hidroxilación de L-ti

rosina, catalizada por tirosinasa en presencia de ascorbato, midiendo la velocidad

de síntesis de L-dopa (Método: 12.8.1.). La concentración de L-dopa formada

fué lineal en un tiempo de reacción de 0-20 minutos (Fig. 4 ) . En las condicio

nes de trabajo empleadas, no se apreció la existencia del periodo de retardo men

cionado anteriormente. A concentraciones de ascorbato de 1,5 mM, García-Carme

na (1980) ha observado que en, extractos de tirosinasa de epidermis de rana, se

elimina casi completamente el período de retardo. En nuestro caso, con concen

traciones de ascorbato empleadas (2,5 mM) eliminaron prácticamente el periodo

de retardo en las condiciones de medida utilizadas. Sin embargo, Pomerantz (

1966) y Hearing et al. (1978) encontraron que con tirosinasa de mamíferos las

concentraciones elevadas de ascorbato no evitaban totalmente el período de re

tardo, al menos en las condiciones de ensayo empleadas por ellos. Además, la

concentración de ascorbato empleada evitó eficazmente la oxidación de L-dopa

a dopaquinona, lo que se comentará más adelante en relación con la enzima in

movilizada.



-17-

5 10

TIEMPO ( min )

Fig. 4.

Actividad tirosina hi-

droxilasa de tirosinasa.

Concentración de L-dopa

formada con el tiempo

de reacción, para distin

tas concentraciones de

L-tirosina.

Asi' mismo la velocidad de reacción fué lineal con la cantidad

de enzima presente en el medio de reacción, como puede apreciarse en la Fig. 5,1o

que confirma el origen enzimático de la reacción y la validez del método de medi

da de actividad empleado.

Fig. 5.

Variación de la actividad

tirosina hidroxilasa con

la cantidad de enzima a-

plicada.

VOLUMEN DE EXTRACTO i/^X)



-18-

Cuando se calcularon los valores de los parámetros cinéticos

K M y V de la enzima en distintos estados de purificación, por medio de la

representación de Lineweaver-Burk (Fig. 6-A), se obtuvieron unos valores de K M

de 1,95 mM cuando se empleó extracto H20/P¡, valor que se incrementó has

ta 2,85 mM cuando se utilizó enzima purificada CM/Phe. Este incremento del

valor de K M con la purificación sugiere que la tirosinasa pierde afinidad por la

L-tirosina al eliminar proteínas del medio. Por ello en los estudios posteriores

de inmovilización de tirosinasa en soportes sólidos se tuvo en cuenta el estado

de pureza de la tirosinasa empleada, como posible variable determinante de las

propiedades del sistema.

De los parámetros cinético K M y V m se dedujo la curva de

Michaelis teórica (Fig. 6-B). Si se compara esta curva teórica con los puntos ex-

%

(nwi

1

400

300

200

100

y -¿U

•

»

•

•

r

^ ^

A

/

K

• /" yS 30

20

V 10

(n M /m ¡n )

i

•

l

/

B

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1L 2

«

/

^

>l.

4

^^mmmm

•

y

—

i

s »

y

% 10

< n M > 1

1

1/S ( mW1 )

Fig. 6. Cinética de la actividad tirosina hidroxilasa de extracto H20/P¡.

A) Representación de Lineweaver-Burk

B) Representación de la curva teórica de Michaelis (v frente a S), para

los valores de KM=1.95 mM y de Vm=0,031 mM/min, calculados de

la representación A. Con flechas se indican los valores de K M y so

lubilidad de la L-tirosina.



-19-

perimentales obtenidos, se observa que es muy forzado deducir un comporta

miento de Michaelis con estos resultados, pues la solubilidad máxima de la L-tir-

rosina de 2,5 mM (Merck Index, 1968), está en la zona de valores de K^ cal

culados (1,96 y 2,5 mM). De hecho si los valores experimentales de v frente a

S, para concentraciones de L-tirosina de entre 0 y 1 mM, se ajustan a una rec

ta se obtienen coeficientes de correlación superiores a 0,99. Asi' pues, en la mi

tad del rango de trabajo, la actividad tirosina hidroxilasa responde a una cinéti

ca de seudoprimer orden.

De esta forma, la solubilidad de la L-tirosina es un factor li

mitante de la máxima actividad manifestable por la enzima. Como condiciones

estándar para medida de actividad tirosina hidroxilasa y para su utilización en la

síntesis de L-dopa, se ha empleado disolución saturada de L-tirosina (2,5 mM),

lo que significa respecto al sustrato condiciones no saturantes de la enzima.

El valor de K^ que se obtuvo en presencia de ascorbato, en

base a la medida de acumulación de L-dopa y con el empleo de tirosinasa no

purificada ( K ^ 1,96 mM), coincide aproximadamente con el obtenido por Gar

cía Carmona (1980), empleando el método radiométrico de Pomerantz. Esto es

as¿ tanto en presencia como en ausencia de ascorbato ( K ^ 1,9 mM). Además,

los valores obtenidos de V m a x y de velocidad de reacción medida por este mé

todo no variaron con la presencia de ascorbato, indicando que la velocidad de

conversión de L-tirosina a L-dopa no se vio afectada por la presencia de ascor

bato, al menos en términos de velocidad inicial.

Con el método espectrofotométrico basado en la medida del

dopacromo formado, en ausencia de ascorbato, García Carmona obtuvo un va

lor de K^ de 1,56 mM con sustrato L-tirosina y de 2,46 con sustrato L-dopa

y obteniendo una relación de recambio o turnover ( V m a x , j 0 p a / V m a x tir) ^ e

7,14. De estos datos puede deducirse que para las condiciones de concentracio

nes de sustratos empleadas en los métodos estándar de medida de actividad, la

velocidad ae reacción, para la actividad tirosina hidroxilasa con una concentra

ción de L-tirosina de 2,5 mM, sería:

v t i r - 2 - 5 v max. tir = 0,616 V m a x t i r

1,56+ 2,5



-20-

y para la actividad dopa oxidasa con L-dopa 10,15 mM:

'dopa = 1 0 - 1 5 Vmax. dopa

2 , 4 6 + 10,15 ° - 8 0 5 Vmax dopa

teniendo en cuenta que Vmax dopa/V m a x t ¡ r =7,14, se deduce que:

vdopa _ °.805 V

"tir

maxdopa = 0.805

O-6 1 6 Vmax tir ° ' 6 1 6

9,33

Este valor de 9,33, representa la razón de actividad dopa oxidasa respecto a la

de tirosina hidroxilasa que se deducen de los datos cinéticos obtenidos por Gar

cía Carmona, valor cercano al de 10 —0,6 , obtenido en nuestro caso para la

relación de actividad dopa oxidasa respecto a tirosina hidroxilasa de diferentes

extractos recién obtenidos (Sección 2.2.), relación que como se ha indicado an

tes disminuyó con el almacenamiento. Esta similitud de resultados confirma la

validez de los diferentes métodos utilizados para medida de actividad enzimatica.

2.3.2. PERFILES pH-ACTIVIDAD.

Los perfiles pH-actividad de la actividad tiroxina hidroxilasa,

se desplazaron muy ligeramente hacia pH alcalino con la purificación, lo que in-

1.0 -

< >

O 0.5 < O > p u < • Purificado CM/Ph«

0 Extracto H20/P¡

_l

Eniayc* *n P¡-0,o6 M

I 1

• Purificado CM/Ph» o Extracto H20/Pj

Enwyot «n P¡ - 0,10 M

Fig. 7.

Perfiles pH-actividad.

Efecto de la purificación y

de la fuerza iónica.

pH PH



-21-

dicó la existencia de efectos protefna-protefna en las propiedades de la enzima,

hecho que se habi'a observado también en las propiedades cinéticas. Sin embar

go la variación en la fuerza iónica apenas influyó en la forma de los perfiles

pH-actividad (Fig. 7).

2.3.3. ESTABILIDAD A LA REACCIÓN.

Para estudiar la estabilidad de la tirosinasa a la reacción con

sustrato L-tirosina, en presencia de ascorbato, se trató la enzima con sustrato y

se dejó reaccionar, midiéndose la concentración de L-dopa formada con el tiem

po ( Fig. 8-A). Las curvas derivadas (Fig. 8-B), expresan la disminución de la ve-

Fig. 8

Pérdida de actividad ti-

rosina hidroxilasa con

la actuación. Efecto del

estado de purificación.

A) Concentración de L-

-dopa formada con el

tiempo de reacción.

B) Disminución de la

velocidad de reacción

con el tiempo.(Derivada

de las curvas A).

<3> extracto Pi; o, extracto

hÔ/Pi; purificado CM;

purificado Phe; pu

rificado CM/Phe.

20 40 60

T I E M P O { m m , )

80 100



-22-

locidad de reacción con el tiempo, deducie'ndose de ellas unos valores de tiem

pos de semiinactivacion de t j , 2 = 35-40 minutos y no se apreciaron diferencias

significativas, en este sentido, para enzima en distintos estados de purificación.

Estos valores fueron notoriamente superiores a los encontrados para la actividad

tirosina hidroxilasa, en ausencia de ascorbato, cuando se midió la actividad por

la formación de dopacromo y para la actividad dopa oxidasa ( 4-5 minutos)

(Garci'a Carmona, 1980; Manjón, 1978), Este hecho indica que el proceso de

inactivación con la actuación puede estar relacionada con los productos de oxi

dación de la L-dopa.



3. CARACTERÍSTICAS DE LOS SOPORTES Y REACTORES

UTILIZADOS EN LA INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA.



-24-

3. CARACTERÍSTICAS D E L O S S O P O R T E S Y R E A C T O R E S E M P L E A D O S

EN LA INMOVILIZACIÓN DE T1ROSINASA.

El término Enzima Inmovilizada (IME), ha sido recomendado

(Commission Biochemical Nomenclatura, IUPAC-IUB, 1974) para describir todas

las preparaciones en las que la enzima es retenida de alguna forma dentro de

los confines limitados de un polímero que actúa como soporte. Una IME es con'

siderada como una forma de enzima modificada, en contraposición con la enzi

ma nativa. Por la forma de inmovilización se clasifican en dos grupos:

a) Ocluidas, que incluyen a las incluidas en una matriz de un polímero y a las

que han sido microencapsuladas.

b) Enlazadas, que incluyen a las adsorbidas y a las unidas covalentemente a ur

soporte insoluble en agua

Las enzimas unidas al soporte covalentemente, se consideran

inmovilizadas por métodos químicos y en los demás casos por métodos físicos.

3.1. ELECCIÓN DEL MÉTODO Y SOPORTE DE INMOVILIZACIÓN.

A la hora de elegir un soporte para la inmovilización de una

proteína hay que considerar una serie de factores dependientes de la naturaleza

del soporte y del método de unión. Así, en la inmovilización por adsorción la

enzima puede alterar sus propiedades por el microambiente eléctrico que le pro

porciona el soporte; en las ocluidas los reactivos para polimerizar el soporte ó

formar microcápsulas pueden afectar químicamente a la enzima, pero por lo ge

neral, la inmovilización por métodos físicos deja la enzima más intacta que los

métodos químicos. En éstos, la unión covalente de la enzima al soporte impli

ca una modificación química de la molécula proteica, que puede afectar drásti

camente a su estructura y actividad enzimática, especialmente si en la unión

intervienen grupos del centro activo o que sean importantes en el mantenimien

to de la conformación activa.

Sin embargo, la inmovilización covalente ofrece grandes ven-



-25-

tajas por la estabilidad de la unión enzima-doporte. Gracias a ella, la conforma

ción de la estructura de la enzima se mantiene más ri'gida que en estado solu

ble por la unión a la estructura del soporte sólido. Asi' es frecuente que la inmo-

movilización covalente de enzimas, aumente la estabilidad de las mismas, tanto

en el almacenamiento como en su actuación (Iborra et al., 1977), aunque pue

de ir acompañado de pérdida notoria de actividad (Srere, 1976). Conseguir un

sistema de inmovilización de una enzima que le proporcione gran estabilidad con

mínimas pérdidas de actividad, es abrir un camino para la aplicación tecnológi

ca de dicha enzima.

En nuestro caso, para la inmovilización de tirosinasa, se op

tó por la unión covalente con el fin de aumentar la estabilidad de la enzima

y minimizar el problema de su inactivación por la actuación.

Actualmente, en la bibliografi'a pueden encontrarse una gran

variedad de métodos y soportes para la inmovilización covalente de enzimas.

(Mosbach, 1976). Los soportes pueden ser de formas fi'sicas diversas como: ge-

les, granulos, membranas, mallas, películas, tubos, etc. Pueden tener una estruc

tura más o menos porosa. Están constituidos químicamente por un esqueleto

covalente o matriz como agar, agarosa, celulosa, colágeno, sílice, alúmina, etc.

Normalmente los soportes se modifican químicamente para disponer de grupos

funcionales reactivos ( aldehidos, alquilaminas, arilaminas, imidoésteres, cianuro,

anhídrido, carboxilato, etc.). El acoplamiento de la enzima al soporte requiere

en primer lugar, la activación del soporte y a continuación el uso, o no, de un

reactivo de acoplamiento (carbodiimidas, dialdehidos, diimidoés'teres, etc.).

El soporte y método de unión más apropiado en cada caso,

dependerá de las características de la enzima y de la finalidad de su utilización.

La elección de un sistema de inmovilización está determinada por:

a) La naturaleza de la enzima: su fuente de obtención, estado de purificación,

forma funcional (monomérica u oligomérica, proenzima o enzima, etc), con

formación, cantidad y disposición de grupos funcionales para su unión al

soporte, etc.

b) La naturaleza del soporte: su estado físico, su porosidad, su resistencia me

cánica, su hidrofilicidad, su esqueleto estructural y el tipo y densidad de

grupos funcionales disponibles para el acoplamiento de la enzima, así como



-26-

el microambiente que el soporte proporciona a las moléculas de enzima.

c) El método de unión: técnica de trabajo, reactivos de activación y/o de aco

plamiento, proporción relativa de cantidad de protema respecto al soporte,con

centración de protei'na, y condiciones generales de trabajo (temperatura, pH,

fuerza iónica, agitación, etc.).

Para la inmovilización de tirosinasa se optó por emplear co

mo soportes: Enzacryl-AA, CPG2¡rciacj-Arylam¡na (CPG-AA) y derivados de nylon.

El Enzacryl-AA se decidió utilizar porque este soporte había dado los mejo

res resultados, en nuestro Departamento, para la actividad dopa oxidasa de

la tirosinasa inmovilizada (Manjón, 1978). El soporte CPG-AA se empleó es

pecialmente por las ventajas mecánicas que ofrecía, entre las que cabe desta

car su mayor porosidad que implica menores problemas difusionales. La ra

zón principal de emplear derivados de nylon para inmovilizar tirosinasa fué

la gran versatilidad que ofrece tanto en la forma del soporte como en los

métodos de inmovilización, dado que puede encontrarse en diversas formas

físicas como: granza convertible en polvo o gel, tubos capilares, membranas,

etc. Además son de muy bajo costo en comparación con la mayor parte

de los soportes normalmente empleados, lo que facilita sus aplicaciones in

dustriales. Los derivados de nylon se prepararon buscando que fueran de fá

cil y sencilla preparación y utilización y en algunos casos para que fueran

soportes con un microambiente semejante al suministrado por los otros sopor

tes anteriormente citados y que habían dado buenos resultados.

A continuación se describen las características de estos so

portes empleados, las modificaciones químicas que se han realizado sobre e-

llos y los métodos de acoplamiento enzima-soporte empleados.

3.2. ENZACRYL-AA

El Enzacryl-AA es un derivado de poliacrilamida que po

see grupos funcionales arilamina (Fig. 9) (Mosbach et al. 1976). Se suministra

comercialmente por Koch Light Lab. Se sintetiza por copolimerización de

acrilamida y p-aminoacrilanilida, entrecruzando con N.N'-metilenbisacrilamida. El

copolímero formado es reducido por tratamiento con iones t i tanio(l l) , dando



-27-

f H - C r V - C H - C U f - C H - C H ^ C H - C H f - C H — C H j CONHt |

NH-CO

I

NH-CO

CONH

CONHt

C H - C H r C H - C H r - C H - C H í - C H - C H r - CH—CH¿"

ÓONHt CONHi CONHi

CONH N H t :

Fig. 9. Esquema del esqueleto estructural de Enzacryl-AA.

Los grupos reactivos del soporte están encuadrados por líneas de puntos.

lugar a grupos arilamina (Barker et al., 1970), a través de los cuales puede rea

lizarse el acoplamiento de la enzima.

La activación del soporte puede realizarse: a) Por diazotación

con ácido nitroso para dar grupos diazo (Epton et al. 1976). b) A través

de la formación de un isotiocianato por tratamiento con tiofosgeno (Manecke,

1970; Epton et al., 1976). En esta Memoria se empleó Enzacryl-AA activado

por diazotación con ácido nitroso (Método: 12.3.1), con el cual el acoplamiento

de la proteína implica principalmente a los residuos de L-tirosina de la misma,

aunque también pueden participar en menor extensión el núcleo imidazol de la

histidina y el indol del triptófano. El esquema de las reacciones de acoplamien

to se indican en la Fig. 10.

El Enzacryl-AA es un soporte hidrofílico, que suministra un

microambiente de grupos hidrofóbicos aromáticos a la enzima, mediante los gru

pos arilamina libres que quedan después de unir a la enzima. Su forma física

es la de partículas finamente divididas y en las especificaciones del suministra

dor se indica que su uso más conveniente es en suspensiones con agitación, lo

que prevee de los problemas de flujo y de difusión que pueden darse por su

utilización en columnas de lecho empaquetado.



-28-

Fig. 10. Esquema de la inmovilización de enzima sobre soportes

con grupos arilamina por diazotación con ácido nitroso.

Método de inmovilización aplicado a los soportes: Enza-

cryl-AA, CPG-AA, NB y NPAA.

3.3. SOPORTE CPG-AA

El soporte CPG-AA, que también se encuentra disponible co-

mercialmente (Corning-Pierce), es un derivado de vidrio de poro controlado (ta

maño de poro 550 A), que contiene grupos arilamina (Fig. 11) y cuya prin

cipal aplicación es la inmovilización de protei'nas (Weetall, 1976).

KO-Sí-ÍC^VNH-CO-^-NHt

Fig. 11. Grupo funcional del CPG-AA



-29-

El vidrio poroso (CPG) se prepara a partir de borosilicato y

puede recubrirse con óxido de circonio (CPGz¡rciad) Para mejorar sus propieda

des mecánicas y su resistencia a pHs superiores a 7. A partir de él, se pueden

obtener una gran variedad de soportes. Asi', el vidrio poroso al tratarlo con ami-

nopropiltrietoxisilano conduce a un soporte con grupos propilamina (Filbert,

1975) que, por tratamiento posterior con cloruro de p-nitrobenzoilo y subsi

guiente reducción con hiposulfito sódico, da lugar a un soporte que contiene los

citados grupos arilamina.

Sobre este soporte se pueden inmovilizar enzimas aplicando

los mismos procedimientos descritos antes para el Enzacryl-AA. Asi', pueden unr-

se por activación del CPG-AA con tiofosgeno (Weetall, 1969a; Pierce, 1980) o

con ácido nitroso (Weetall, 1969a. 1969b; Weetall y Baun, 1970; Weibel y

Bright, 1971). En este trabajo se ha empleado la activación con ácido nitroso

para la inmovilización de tirosinasa al CPG-AA (Método: 12.3.1) y le correspon

de el mismo esquema de reacciones de la Fig. 10.

Los soportes derivados de vidrio poroso ofrecen las siguientes

ventajas en su utilización:

* Poseen alta resistencia mecánica, permitiendo altas presiones de

operación y altas velocidades de flujo (Filbert, 1975).

* Es co'modamente manejable y separable de las disoluciones

por simple decantación.

* Su volumen no se altera por los cambios del medio.

* Puede usarse en sistemas de operación continua durante largo

tiempo

* La porosidad del soporte minimiza los problemas difusionales

La inmovilización de tirosinasa en este soporte con los mismos

grupos funcionales que el Enzacryl-AA, pero con mejores propiedades mecánicas

y mayor porosidad, permitirá comparar el efecto del t ipo de soporte sobre las

propiedades de la tirosina inmovilizada, especialmente en su aplicación en colum

na en donde estos factores son más determinantes.



-SO

S A DERIVADOS DE NYLON

La denominación de nylon se aplica a una serie de polímeros

lineales, consistentes unidades repetidas de grupos metileno unidos mediante en

laces amidas secundarias.Son pues, poliamidas, y los diferentes tipos son designa

dos de acuerdo con el número de átomos de carbono de sus unidades monomé-

ricas. Así, por ejemplo:

nylon-6 CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH

nylon-6,6 NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)4-CO- •

nylon-6,10 NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)8-CO

nylon-11 CO-(CH2)10-NH-CO-(CH2)10-CO

Los grupos amidas permiten la formación de enlaces de hidró

geno intercadenas. Estos enlaces pueden darse también con el agua del medio, lo

que le confiere un carácter hidrofíiico y es una característica idónea para la in

movilización de enzimas, ya que proporciona un microambiente en el cual la en

zima puede manifestar su actividad y permitir que sea estable (Hornby y Golds-

tein, 1976).

El nylon es un material termoplástico que se caracteriza por

su resistencia mecánica y dureza superficial. Puede estirarse y orientarse en frío,

lo que produce un gran aumento de la resistencia del material y la posibilidad

para la fabricaciónde diversas formas del mismo (Martínez, 1972). Así el nylon

puede obtenerse comercialmente en las siguientes formas físicas:

a) Granza. Es la forma en que se obtiene como materia prima (BASF, BAYER)

a partir de la cual se obtienen las diferentes formas comerciales de nylon.

b) Polvo o gel de nylon. Puede obtenerse fácilmente en el laboratorio a partir

de granza, por medio de formar suspensiones con CI2Ca/metanol y poste

rior precipitación en agua. (Método: 12.2.2). En nuestro caso hemos elegido

para este fin nylon-6 que, junto con el nylon-6,6, es el más hidrofílico y

además es el más utilizado para la inmovilización de enzimas (Goldstein et

al. 1974a).

c) Tubo capilar. En este trabajo se utilizó tubo de nylon-6 (nylon estándar),



-31-

de diámetro interior de 1 mm, aunque también existen el mercado de nylon-11

ó 12 (nylon flexible), y diámetros variables de 0,25 a 8 mm (Portex, Hythe,

Kent, U.K.).

d) Membranas o mallas de nylon. Pueden encontrarse bajo una gran variedad

de tamaño de poro, grosor del hilo, o forma de estar tejido. En nuestro

caso , se utilizó membrana NY10HD, de 10 mieras de tamaño de poro

(ZBF, Switzerland).

e) Otras formas como películas, hilo, etc., no utilizadas en este trabajo.

El nylon tiene pocos grupos funcionales libres.de forma que

debe ser modificado qui'micamente para generar centros potencialmente reactivos

que puedan interaccionar covalentemente con las moléculas de enzima. Hornby

y Goldstein (1976) clasifican los tipos de modificaciones del nylon en tres gru

pos, que a continuación se describen:

1) MÉTODOS QUE IMPLICAN RUPTURA DEL ENLACE AMIDA DE LA

POLIAMIDA.

Los grupos alquilamina liberados en estos métodos, se uti l i

zan para el acoplamiento de las moléculas de enzima. La ruptura del enlace

puede realizarse, por ejemplo, con N,N-dimet¡l,l,3-propanod¡am¡na, que uniéndo

se al grupo carbonilo del enlace amida del nylon, lo desplaza y deja libreuun

grupo amina (Fig. 12), dando lugar a un derivado de nylon con grupos alquila-

mina (NAQA). También puede realizarse la liberación de grupos amino por una

hidrólisis controlada de enlaces amida con un tratamiento con CIH, con lo que

se obtiene un derivado de nylon parcialmente hidrolizado (NH).(Fig. 12). Tanto

el NAQA como el NH, han sido preparados en este trabajo (Métodos: 12.2.4 y

12.2.5) y ambos soportes se activaron por tratamiento con un reactivo bifuncio-

nal como el glutaraldehido (Método: 12.3.2.) que se une a los grupos aminos li

bres del soporte y por otro lado se enlaza posteriormente con los grupos amino:

de la molécula de enzima (Fig. 13).

En el caso del NH, el soporte proporciona a la enzima in

movilizada un microambiente con carga negativa debido a los grupos carboxilo

liberados en la hidrólisis de los grupos amida del nylon. El soporte NAQA su-



http://libres.de

-32-

N.N-dimetil,l,a-propanodiamina

H (nyion) C-N— n 0

r$l-—C=0

NH

(C 'H¿ ¿H+ (NAQA)

/ v CH, CH,

ClH/HaO

-C=0 r^N-

(NH)

Fig. 12. Métodos de preparación de derivados de nylon que implican ruptura del enlace amida. Esquema de las reacciones de preparación de los soportes NH y NAQA.

Nr< glutaraktehido N N CH

CHO

NHl

m

DE

N n

CH

i * CH N N L

Fig. 13. Esquema de la inmovilización de enzima (E) a soportes de nylon con grupos aminos libres por activación con glutar-aldehido. Aplicado a los soportes NH, NAQA y NB.



-33-

ministra un microentorno cargado positivamente, proporcionado por la amina

terciaria del reactivo que provoca la ruptura no hidroh'tica. Ambos métodos son

sencillos en su aplicación y permitieron en este trabajo disponer de dos sopor

tes con microentornos de cargas opuestas.

También se han sugerido sistemas de inmovilización al NH,

a través del grupo carboxilo (Sundaram, 1977a), unos basados en la conversión

de un anhi'drido mixto y otros en la condensación con grupos amino mediante

carbodiimidas. Este último tiene el inconveniente de que provoca inactivación

de la enzima por reacciones de entrecruzamiento entre las propias moléculas de

enzima. Sin embargo este procedimiento ha sido empleado por Daka y Laidler

(1978) para unir bencidina a grupos carboxilo del NH (Fig.14). De esta forma

el soporte de nylon-bencidina (NB) así obtenido tiene dos grupos aminos distin

tos utilizables para la innovilización de enzima por activación con glutaraldehido

bajo el mismo esquema de reacciones de la Fig. 13. Otra característica del so

porte NB así obtenido es que a la enzima inmovilizada le proporciona un mi-

croambiente neutro, a diferencia de los anteriores. Este sistema de inmovilización

se ha aplicado en este trabajo a la tirosinasa, y además hemos derivado un pro

cedimiento de inmovilización por diazotación semejante al empleado con los so

portes con grupos arilamino como el Enzacryl-AA, CPG-AA y NPAA y que se

ajustaría al esquema de reacciones indicado en la F¡g.10

— « — — — — _ _ _ — _ _ _ — _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

CONH ( nylon )

HCl/H-0

COOH fi3N ( NJJ )

I Ibencidina

— C0NH-^¡H^>-NH3 rt-N ( N B )

Fig. 14. Preparación de NB



-34-

2) MÉTODOS BASADOS EN O-ALQUILACIÓN

Estos métodos se basan en la activación del nylon por for

mación de una sal de imidato, por tratamiento con sulfato de dimetilo (Sunda

ram y Apps, 1977) o con tetrafluorborato de trietiloxonio en diclorometano

(Sundaram et al. 1979). A partir de esto se puede unir la enzima directamente

a través de sus grupos aminos, u obtener derivados alquilaminas o hidrazidas de

nylon (Sundaram e Igloi, 1979). No obstante no se han utilizado en este trabajo.

3) MÉTODOS BASADOS EN N-ALQUILACIÓN

Goldstein et al. (1974a) diseñaron un procedimiento de inmo

vilización en el cual, después de una hidrólisis parcial para generar pares de gru

pos carboxilo y amino sobre la superficie del nylon, provocaban una reacción

de cuatro componentes empleando 1,6-diisocianohexano y acetaldehido. Con esto,

daban lugar de nuevo a la formación del enlace amida, pero ahora N-sustitui'da

y con un grupo funcional isonitrilo. (Fig. 15-A)

El nylon poliisonitrilo (NPI), lo hemos empleado en este tra

bajo para la inmovilización de tirosinasa a través de los grupos aminos de la pro-

tei'na y también a través de la participación de los grupos carboxilos, según el

esquema de reacciones de la Fig. 15-B.

El NPI puede transformarse en un derivado poliarilamino por

tratamiento con p.p'-diaminodifenilmetano (Hornby y Goldstein, 1976) según el

esquema de reacciones de la Fig. 16.

El nylon-poliarilamina (NPAA), se ha empleado para la inmo

vilización de tirosinasa a través de residuos tirosina de la protema según el mis

mo esquema de reacción que se había aplicado para la inmovilización sobre

Enzacril-AA, CPG-AA y NB (Fig. 10).

Tanto el NPI como el NPAA aportan a la enzima inmoviliza

da un microambiente neutro, aunque de distinto carácter, alifático en el NPI y

aromático en el NPAA. Ambos se caracterizan por poseer un largo brazo entre

el esqueleto del soporte y los grupos reactivos de unión a la enzima, especial

mente el NPAA.



-35-

•CONH (nylon)

CLryôl

COÓ" r^N

l •CON-

I CH-CH, I

CO

NH

(NPIWCH^ N n c

B

n •CH5C00*

• CHjCHO

( N P I )

N

e

Fig. 15. Nylon poiiisonitrilo (NPI). A)Preparación. B)lnmov¡l¡zac¡ón de enzima.

Nr COO*

CHjCHO

NH 1

S° CH-CH,

N-CO

/ X

— f NPI)

¡J 'OOC-CH, C •

CH,CHO

NH

CO I F°

(NPAA)

C Hf C H - N - ^ - C H . - ^ N H ,

Fig. 16 Preparación de nylon poiiariiamina (NPAA) a partir de NPI.



-36-

En la Tabla 3 se resumen los soportes y métodos que se han

aplicado en este trabajo para la inmovilización de tirosinasa. Se han utilizado sie

te soportes distintos, cinco de ellos derivados de nylon, preparados por nosotros

y de los cuales el NH y el NB se aplicaron tanto en forma de gel como en tu

bos y membranas, y los otros dos obtenidos comercialmente.

Los cuatro soportes que contenían grupos funcionales arilami-

na (Enzacryl-AA, CPG-AA, NPAA y NB) se activaron por diazotacion con ácido

nitroso formando una sal de diazonio, sobre la cual se acopló posteriormente la

enzima. La aplicación de estos sistemas de inmovilización venía sugerida por los

buenos resultados que para la actividad dopa oxidasa, había dado la inmoviliza

ción de tirosinasa en Enzacryl-AA. .La carga eléctrica que el soporte aporta al

microambiente es nula, excepto en el caso de NB, en que la inestabilidad de

las sales de diazonio alquílicas hace que, al menos parte de los grupos amino

se conserven aportando carga positiva.

El glutaraldehido se ha empleado como reactivo bifuncional

para la activación de los soportes con grupos alquilamina (NH, NAQA) y tam

bién con el NB que contiene grupos alquilamina y arilamina. En cada uno de

estos tres casos, el soporte aporta carga eléctrica distinta. Además hay que seña

lar que en este método de unión, se elimna la carga positiva de los grupos ami

no de la enzima que se unen al soporte a travás del glutaraldehido.

El acoplamiento de la enzima al NPI con acetaldehido en

presencia o no de acético, se caracteriza, a diferencia de los demás métodos em

pleados, en que no hay una activación previa del soporte, sino que los reactivos

de acoplamiento están presentes durante el tiempo de interacción del soporte

con la disolución de enzima. En los dos métodos de unión al NPI, el soporte

no aporta carga eléctrica y se bloquean grupos amino de la enzima, y en ausen

cia de acético también grupos carboxilo.

Así pues se han aplicado nueve sistemas de inmovilización

de tirosinasa sobre soportes en forma de gel y dos de ellos se han empleado

también con tubos y membranas. Con todo ello se han ensayado diferentes con-



-37-

diciones respecto a varios parámetros determinantes del sistema de inmoviliza

ción como son: porosidad del soporte, carga eléctrica del microambiente, me

canismo de acoplamiento, grupo de unión de la enzima, estado físico del so

porte etc. También se han estudiado otras variables del sistema de inmoviliza

ción relacionadas con la naturaleza de la enzima como: forma funcional (pro

enzima o enzima), estado de purificación, cantidad de protei'na aplicada, fuen

te (champiñón, epidermis),etc, con lo que se han estudiado las principales va

riables que pueden afectar a la inmovilización de tirosinasa.

Tabla 3

Resumen de los soportes y métodos de unión aplicados a la inmovilización de

tirosinasa.

Soporte

Enzacryl-AA

CPG-AA

NPAA

NB

NB

NH

NAQA

NPI

NPI

Activación

nitroso

nitroso

nitroso

nitroso

glutaraldehido

glutaraldehido

glutaraldehido

acetaldehido/ acético

acetaldehido

Grupo de unión

de la enzima (*)

- A r - O H ,

- A r - O H ,

- A r - O H ,

- A r - O H ,

- N H 2 .

- N H 2 ,

- N H 2 .

- N H 2 ,

- N H 2 , -COOH,

Tir

Tir

Tir

Tir

Lis

Lis

Lis

Lis

Lis

Asp, Glu

Carga del

soporte

nula

nula

nula

nula

(+)

nula

—

+

nula

nula

Denominación

del IME

Enzacryl-AA-IME

CPG-AA-IME

NPAA-IME

NB-nitroso-IME

NB-IME

NH-IME

NAQA-IME

NPI-acético-IME

NPI-IME

(*) Grupo de unión preferente. No se excluye unión a otros grupos.

( +- ) Carga parcialmente positiva



-38-

3.5. REACTORES Y METODOLOGÍA DE ESTUDIO DE LAS ENZIMAS

INMOVILIZADAS.

Tanto para el estudio de sus propiedades, como para aplicar

una enzima inmovilizada a fines industriales o analíticos, se requiere llevar a ca

bo la reacción enzimática propia de ella, para lo cual se ha de conseguir la in

teracción de la enzima con los sustratos. Con enzima inmovilizada en forma de

gel-IME, esta interacción puede hacerse con agitación de la disolución, de las

partículas de gel-IME, o de ambas a la vez; también por paso de la disolución

sustrato a través de un lecho de gel-IME estático; o por simple difusión de los

sustratos sin ninguna agitación. Según la técnica experimental utilizada, estamos

ante un tipo distinto de reactor.

Las propiedades del IME, especialmente la actividad manifes

tada, la estabilidad a la reacción, la aplicación a la síntesis del producto de re

acción, dependerán del proceso de transferencia de materia que será función del

tipo de reactor empleado y de las condiciones de trabajo de éste. Así pues, pa

ra determinar la actividad del IME, es necesario diseñar un reactor estándar, res

pecto al cual definir la unidad de actividad del derivado IME y su comparación

con las unidades de actividad de la enzima soluble.

El comportamiento cinético del IME puede variar respecto a

la enzima soluble, pero además la afinidad aparente por el sustrato se verá muy

afectada por los problemas de difusión externa (difusión desde la disolución a

las inmediaciones de la partícula), según el tipo y condiciones del reactor. En

reactores con fuerte agitación las limitaciones de difusión externa pueden elimi

narse, pero pueden permanecer las limitaciones de difusión interna (de la super

ficie de la partícula al centro activo de la enzima) y éstas ya no dependerán

tan claramente del tipo de reactor, sino que serán en gran medida intrínsecas

al sistema Soporte-Enzima (Goldstein, 1976). En presencia de limitaciones difu-

sionales, para una enzima michaeliana, la ley cinética se puede expresar de la

forma siguiente (Engasser y Horvath, 1973):

V ' = > ? - ( V m a x - S / ( K M + S ) ) (10)



-38-

en donde: V es la velocidad real de reacción y

el factor efectividad definido como V 7 V c i n , en donde V d n sena

la velocidad de reacción en ausencia de limitaciones difusionales

De esta ecuación se pueden obtener varias formas linealizadas,

pero la representación de los valores experimentales no responde normalmente

a una linea recta debido a la dependencia de ^ con la concentración de sustra

to (Goldstein, 1976).

A continuación se describen los tipos de reactores, sus carac

terísticas y la metodología con que se han empleado en las operaciones experi-

mentales de esta Memoria.

3.5.1. REACTOR DE BAÑO AGITADO ( STR )

En este tipo de reactor, todo el volumen de sustrato a pro

cesar (VS) , se hace interaccionar con el IME, por medio de una fuerte agitación.

En la Fig. 17 puede observarse el esquema del montaje empleado para el STR.

aire

0

/

2

• •

• •

• •

R

o • • * * o

V •

• •

AM

1

í

r1 T

\

Fig. 17. Esquema de montaje del

reactor de baño agitado(STR).

AM Agitador magnético

BM Barra magnética

R Reactor T Fluido de termostatización

• Partículas de gel-IME o de membranas-I ME troceadas.

9 Burbujas de aire



-39-

En el reactor STR, la IME se encuentra en las condiciones

más semejantes a la enzima en forma soluble (SE), por lo que es el idóneo

para el diseño de un reactor estándar de medida de actividad de la IME. Será

asi' mismo el más útil para el análisis de sus propiedades generales y la compa

ración con la SE (Vieth et al. 1976). Los problemas difusionales en este reactor

están minimizados por la agitación ( Lil ly et al. 1974; Lil ly y Dunnil, 1976).

Para la reacción catalizada por tirosinasa, se aseguró el sumi

nistro de oxigeno necesario por burbujeo de aire. Para seguir el curso de la re

acción se tomaron pequeñas alícuotas a distintos tiempos y se determinó en

ellas la concentración de producto (L-dopa) acumulado.

3.5.2. REACTOR DE BAÑO AGITADO CONTINUO (CSTR).

Un reactor de baño agitado en régimen continuo (CSTR), se

ha utilizado con un montaje como el de la Fig. 18Una característica del CSTR

atr«

°2

BP

JL fci

- • • «

D 0 CF O O

AM J Fig. 18. Esquema de reactor de baño agitado continuo (CSTR).

AM, a gitador magnético BP, bomba peristáltica. CF, colec

tor de fracciones. P, disolución producto R. reactor. S, di

solución sustrato. T, fluido de termostatización. • , partícu

las de gel-IME. o, burbujas de aire.



-40-

es que el volumen del reactor es mucho menor que el del volumen procesado

a lo largo de la vida de uso de la IME ( V p > ^ V g ) . En este reactor hay mí-

nimos problemas difusionales gracias a la agitación, pero en él los fenómenos

de inhibición por el producto son más notables, dado que , una vez alcanzado

un régimen estacionario, la concentración de producto en contacto con la enzi

ma es en todo momento y en todo el volumen del reactor igual a la del fluido

de salida (Lil ly y Dunnil, 1976).

En nuestro caso, el suministro de oxigeno a la reacción estu

vo garantizado por un burbujeo constante del reactor. El curso de la reacción

se siguió recogiendo el eluido del reactor con un colector de fracciones y mi

diendo la concentración de L-dopa en cada una de las fracciones recogidas en

un determinado tiempo.

3.5.3. REACTOR DE COLUMNA CON LECHO EMPAQUETADO (PBCR)

En este caso la disolución sustrato se hace pasar a través de

una columna conteniendo gel-IME empaquetado. En la Fig 19 se muestra el es

quema del sistema empleado para un PBCR. Tiene la ventaja de ser un sistema

continuo y de que se evitan al máximo los fenómenos de inhibición por el pro

ducto, pero es el que presenta más problemas difusionales por el empaquetamien

to y por la mínima agitación (Pitcher, 1975). La posibilodad de funcionamiento

continuo y de automatización, hace que junto con otros reactores de flujo con

tinuo (lecho fluidificado, CSTR, etc), sea el más memcionado para aplicaciones

¡ndusyriales ( Vieth y Venkatasubramanian, 1974c, Weetall, 1975, Vieth et al.

1976). Es el sistema más característico para analozar la estabilidad de la IME

para la reacción a largo tiempo. Es el sistema que emplea menor volomen de

reactor por unidad de volumen de disolución procesada. Con soportes y condi

ciones de trabajo sin problemas difusionales es tan eficaz como el STR respec

to a su capacidad catalítica y tiene a su favor el que permite sistemas continuos

y automatizados, además normalmente en PBCR la vida de uso de la IME es

mayor. Sin embargo, con limitaciones difusionales o de baja solubilidad de algún

sustrato puede dar bajos rendimientos de cara a usus industriales; por ejemplo,



-41-

1

s

o 1

p 1

aire

°2

Hffll II 0 o i

FO ] o (¡F o o

Fig. 19. Esquema de montaje para reactor en columna con

lecho empaquetado (PBCR) y para reactor tubular

(TR).

BP, bomba peristáltica. CF, colector de fracciones.

FO, frasco de oxigenación. P, disolución producto

R, reactor S, disolución sustrato. T, fluido de

termostatización.

una limitación para reacciones como la de la tirosinasa que requieren oxígeno,

es que sólo se suministra el oxígeno disuelto en la disolución de sustrato

Al igual que en CSTR, el curso de la reacción de la tirosi

nasa en este reactor, se siguió recogiendo fracciones a tiempos definidos en el

eluído del reactor y determinando la concentración de producto formado.

3.5.4. REACTOR TUBULAR (TR)

Con el mismo esquema de montaje que el del PBCR mos

trado en la Fig. 19, se ha empleado en este trabajo enzima inmovilizada sobre

la pared interior de tubo de nylon de 1 mm de diámetro. Ofrece respecto al

PBCR la facilidad de manejo y mínimos problemas de flujo y de difusión. En

la bibliogrfía viene mencionado especialmente para usos analíticos (Sundaram,

1977a) y para aplicaciones médicas (Sundaram 1977b).



4. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE

TIROSINASA EN ENZACRYL-AA Y EN CPG-AA.



-42-

4. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE TIROS1NASA EN

ENZACRYL-AA Y CPG-AA.

En el presente capítulo se estudiará la actividad tirosina hi-

droxilasa de tirosinasa inmovilizada en Enzacryl-AA y CPG-AA. Se analizarán

las propiedades generales, haciendo especial incapié en el estudio del rendimien

to del proceso de inmovilización y de las condiciones óptimas para la manifes

tación de la actividad, su comportamiento cinético y el efecto del ascorbato y

la hidracina sobre la reacción catalítica.

4.1. RENDIMIENTO DE INMOVILIZACIÓN EN ENZACRYL-AA

La estabilización por la inmovilización, de la actividad de un

sistema enzimático, suele ser una de las propiedades que se argumentan para

destacar la aplicación industrial de las enzimas inmovilizadas (Weetall, 1975a;

Chibata y Tosa, 1976). Sin embargo es frecuente que la enzima inmovilizada

manifieste una menor actividad que la enzima soluble (Ollis y Datta, 1976). En

este caso, sólo está justificada su aplicabilidad si el aumento de la estabilidad

supera con creces la pérdida de actividad, lo que llevaría consigo una disminu

ción de los costos de preparación de la enzima (Weetall, 1973).

Cuando se establece un nuevo método de inmovilización o

la aplicación de un método ya existente a una enzima, es habitual que en los

mismos se haga referencia tanto a la cantidad de proteína unida al soporte

(Axén et al., 1967, 1969; Weston y Avrameas, 1971) como a la actividad ma

nifestada por el derivado IME (Cho and Bailey, 1979; Caldwell et al., 1976a,

1976b). Además ha sido recomendada la especificación concreta de estos da

tos, así como el de la actividad específica de la enzima soluble y la cantidad

de ésta utilizada por gramo de soporte seco en la inmovilización (Comission

Biochemical Nomenclature, 1974). A partir de los datos anteriormente expues

tos, puede deducirse el porcentaje ó fracción de actividad recuperada en forma



-43-

de derivado inmovilizado, lo que es una característica significativa del sistema

de inmovilización utilizado (Axén y Ernback, 1971; Goldstein et al., 1974; Sun-

daram y Apps, 1977; Brown et al. 1978; Drobnik et al., 1979).

Los parámetros que se han utilizado en el estudio del com

portamiento de la tirosinasa en el proceso de inmovilización son los siguientes:

1) Rendimiento de unión de proteína (rp r o t ) , obtenido a partir de la diferen

cia de protei'na existente en la disolución antes (prot¡) y después (protr) de la

inmovilización:

rprot = (P ro t¡ - P r o V P roti < 1 1 )

Esta determinación indirecta de la protei'na unida es muy u-

tilizada por su sencillez (Gabel y Axén, 1976). También se han aplicado méto

dos de determinación directa sobre el IME. Asi', se han empleado la determina

ción de aminoácidos después de hidrólisis del IME (Axén et al., 1967), medida

radiométrica de la enzima unida marcada radiométricamente (Lartigue, 1975) y

otros métodos, de los que Gabel y Axén (1976) hacen una recopilación.

2) Actividad sustraída de la disolución de enzima soluble como consecuencia

de la reacción de inmovilización, calculada según:

Actividad sustraída = (SE¡ — SEr) SE¡ (12)

siendo SE¡ y SEr la actividad de enzima soluble en unidades estándar (U) tota

les antes y después de la inmovilización.

3) Actividad estándar del IME (Act||^g), que se expresó en unidades de activi

dad manifestada por unidad de soporte seco cuando se ensayó según el método

estándar (Método: 12*8*2). Se calculó por:

ActjjñE r * M E / m (13)

siendo, IME la actividad total (U ó mU) manifestada por una cantidad m de so

porte con enzima inmovilizada; m se expresó en g ó mg de peso seco para

gel-IME, en cm £ para membrana-IME y en cm lineal para tubo-IME

4) Eficacia de acoplamiento (Ef. acop.), término definido por Pitcher (1975),

como la fracción de actividad que manifiesta el IME respecto a la sustraída de



-44-

la disolución. Se calculó por:

Ef. acop. = IME /(SE¡ - SEr) (14)

5) Rendimiento de inmovilización (r¡n m ) . Parámetro que indica el rendimiento con

que la actividad enzimática de la enzima soluble utilizada es recuparada en forma

de derivado inmovilizado y que se calculó por la razón de la actividad mani

festada por el IME en relación a la de la enzima soluble según :

r inm = IME /SE j = " i -Act | M E / V E S -Act E S ¡ (15)

siendo: V E g el volumen de disolución de enzima soluble tratada con una cantidad

m de soporte, cuyo derivado IME dio una actividad estabdar Act|(^|E ; el térmi

no ActgE¡ representa la actividad de la disolución inicial de enzima soluble em

pleada por unidad de volumen.

La capacidad de un soporte para retener proteínas viene li

mitada por la densidad de grupos funcionales reactivos de éste y por factores

estéricos (Weetall, 1975b), factores determinados por la naturaleza del soporte

y de la protei'na. Así, cuando el Enzacryl-AA, activado por el método del áci

do nitroso, se trató con cantidades crecientes de tirosinasa activa, la actividad

tirosina hidroxilasa del IME aumento de forma lineal con la cantidad de proteí

na aplicada, hasta que alcanzó una saturación para cantidades superiores a 80

mg /g gel (Fig. 20). El r ¡ n m fué máximo mientras no se alcanzó dicha satura

ción del soporte ( r ¡n m=0,78), a partir de la cual descendió. En base a estos

resultados se puede concluir que existió una cantidad óptima de proteína en

la disolución a inmovilizar, que permitió obtener derivados inmovilizados con

alta actividad y conservando los valores máximos posibles del rendimiento de

inmovilización. Estas cantidades máximas de proteína empleadas, están incluso

por enzima de los valores establecidos por la firma suministradora ( 20-50 mg/

g gel; Koch-üght, 1977).

A continuación se analizó el efecto de la pureza de la tiro

sinasa en el rendimiento de inmovilización a Enzacryl-AA, con el f in de obser

var si la interacción con las proteínas presentes en el extracto afectaban a la

preparación del IME.



-45-

!

o <

<

80

60

40

20 .

"s.

•v»

">o

x .

75

bü

25

£

<

> O 5 Z

O 1-z UJ

i 5 z ce

? I l

50 100

P R O T E I N A T R A T A D A ( mg/j gel )

Fig. 20. Efecto de la cantidad de proteína sobre el rendimiento de inmo

vilización de tirosinasa en Enzacryl-AA. Cada ensayo de inmovi

lización consistió en el tratamiento de 20ml de extracto de t i -

rosinasa(0,85 U/mg) con concentraciones de ésta para conseguir

la cantidad de proteína indicada por las abeisas de los puntos

experimentales.

Los resultados obtenidos en las medidas de la actividad y

protema en las disoluciones antes y después de la inmovilización están expresa

dos en la Tabla 4. Se observa que en todos los casos ensayados, el porcentaje

de actividad sustraída de la disolución fué casi total y bastante mayor que el

de proteína unida al soporte. Este hecho paracía indicar una unión preferente

de la proteína con actividad tirosina hidroxilasa frente a las proteínas contami

nantes, lo que se pone de manifiesto por la relación actividad sustraída/rprot,

parámetro que proponemos como medida de la especificidad de unión de una

proteína al soporte. La causa de esta especificidad de unión podría justificarse

por la naturaleza y contenido de los residuos de aminoácidos de la tirosinasa.

Así, la inmovilización de proteínas sobre Enzacryl-AA por medio de la diazota-

ción de sus grupos arilamina, suele implicar fundamentalmente a los residuos

de tirosina de la proteína (Goldstein et al., 1970; Meirose, 1971); el contenido

de tirosina en la tirosinasa de epidermis de rana está dentro de los valores ñor-



-46-

Tabla 4

Inmovilización en Enzacryl-AA de tirosinasa en distintos estados de purificación.

Resultados obtenidos de las medidas de actividad y protei'na de las disoluciones

de enzima antes y después de la inmovilización. Se aplicaron 50 U de SE por

gramo de Enzacryl-AA liofilizado.

Estado

Etapa

P¡

H20/P¡

CM

Phe

CM/Phe

de purificación

Act. esp.

(U/mg)

0,23

0,50

2,02

1,84

3,46

SE rprot

0,45

0,41

0,65

0,60

0,59

Actividad

sustraída

0,98

0,98

0,99

0,95

0,98

Act. sust rprot

2,2

2,4

1,5

3,0

1,7

males de las proteínas globulares, alrededor del 4 % (Barisas y McGuire,1974;

Mikkelsen y Triplett, 1975). Por lo tanto, en base a la composición de tirosina

de la proteína, no se puede deducir una unión preferente de la tirosinasa al En

zacryl-AA con respecto a otras posibles proteínas presentes en la disolución.

Por otra parte, la pérdida de actividad de la disolución de enzima

por el tratamiento de inmovilización, se puede atribuir no sólo a su mayor o

menor unión al soporte, si no también a la posible desnaturalización por la in

teracción con el soporte.

Al medir la actividad de los derivados de Enzacryl-AA-IME obte

nidos de distintos estados de purificación, manifestaron entre un 73 y 88 %

de la actividad que se había sustraído de la disolución (Ef. acop, 0,73—0,88)

Tabla 5. Dado que la actividad sustraída de la disolución fué casi del 100 %

los rendimientos de inmovilización fueron valores sólo ligeramente inferiores a

los de eficacia de acoplamiento ( r ¡ n m = 0,72—0,86).

Cabe resaltar el hecho de que el IME manifestó on 72—86 ô

de la actividad del SE tratado, cuando sólo el 32—65 % de proteína se unió



-47-

Tabla 5

Rendimiento de inmovilización (r¡n m) y eficacia de acoplamiento (Ef. acop.) de

tirosinasa a Enzacryl-AA para distintos estados de purificación. Se trataron 50 U

por gramo de Enzacryl-AA en iguales condiciones que los resultados expresados

en la Tabla 4.

Etapa de

purificación 'pur

A c t | M E

(U/g gel) Ef. acop. 'inm

'inm rprot

r¿obal (r r ) 1 pur ' inm'

0,86

0,62

0,43

0,55

0,35

H20/P¡

CM

Phe

CM/Phe

1,0

0,86

0,52

0,70

0,47

43

36

42

44

38

0,88 0,86 1,9

0,73 0,72 1,8

0,82 0,81 1,3

0,83 0,79 1,3

0,75 0,73 1,2

al soporte. Al calcular la actividad específica del IME, como U/mg de protei'na,

se observó que aumentó con respecto a la del SE en un factor superior a 1. Es

te factor es igual a la relación r ¡ n m / rp r o t calculada en la Tabla 5. Este hecho,

aparentemente sorprendente, hizo sugerir de nuevo la idea de una unión selecti

va, más preferente de la tirosinasa al soporte que de las demás proteínas pre

sentes en la disolución. Con esta interpretación, la relación citada debería ser

mínima para los estados más purificados. De hecho, para el más purificado fué

1,9, y 1,2 para la disolución de SE menos purificada.

Estos valores superiores a 1, también cabrían interpretarse en

función de una sobreactívación de la enzima por su unión al soporte. Efectiva

mente; la enzima utilizada para Ja inmovilización se preparó a partir de protiro-

sinasa que, después del proceso de purificación correspondiente, había sido acti

vada por paso a través de una columna de tripsina-sepharosa, lográndose prácti

camente la misma activación que la alcanzada con tripsina soluble; sin embargo,

dado que la actividad específica de la tirosinasa aumentó con la inmovilización,

se puede sugerir que la unión de la enzima al soporte provocó una sobreacti-

vación , como si el tratamiento con tripsina no hubiera logrado toda la activi-



-48-

dad potencial de la proenzima. La razón de esta sobreactivación podn'a basarse

en el hecho de que se está estabilizando una estructura más desplegada de la

enzima, al inducir a los restos de tirosina a ordenarse al exterior de la estruc

tura proteica, por la unión de los mismos a los grupos diazotados del soporte

y por la interacción de los residuos apolares con el microambiente hidrofóbico

y aromático que proporcionan los grupos arilamina del Enzacryl-AA. Esta inter

pretación está en la li'nea de lo establecido hasta ahora para la conversión de

proenzima a enzima activa. De hecho, en base a las propiedades termodinámicas

de la desnaturalización térmica, se ha sugerido que la tirosinasa activa está en un

estado más desordenado y más estable que la protirosinasa, tanto estudiando la

actividad dopa oxidasa (Galindo, 1976) como con la actividad tirosina hidroxila-

sa (García Carmona, 1980). Por otro lado, los cambios en los espectros de fluo

rescencia apoyan la sugerencia de que la enzima se encuentra en una conforma

ción más desplegada (Iborra et al. 1978) y que los restos de tirosina están or

denados más al exterior en la enzima que en la proenzima (Manjón, 1978). Ade

más estas interpretaciones serian coherentes con la mayor hidrofobicidad mani

festada por la enzima en la interacción con soportes hidrofóbicos (Iborra et al.,

1976; Cortés, 1978).

Tal como se observa en la Tabla 5, los rendimientos de in

movilización fueron similares para los distintos estados de purificación de la en

zima y las diferencias observadas no guardaron ninguna relación definida con el

grado de purificación. Por otro lado, el rendimiento global del conjunto de los

procesos de purificación e inmovilización (•'global = rpur ' rinm' fueron mayores

para los estados menos purificados, dependiendo su valor más del r_ur que del

rinrrr De estos resultados se deduce que para aplicaciones industriales de la t i

rosinasa inmovilizada no parece necesaria su previa purificación.

En la próxima Sección se compararán los resultados aquí'

expuestos con los obtenidos en la inmovilización de protirosinasa en Enzacryl-

-AA, enzima en CPG-AA, así como los obtenidos con tirosinasa de champiñón

y se compararán con los obtenidos por otros autores. Por otro lado, el efec

to del estado de purificación sobre la estabilidad a la actuación y en el com

portamiento en reactores a largo tiempo se analizará en el Cap. 6.



-49-

4.2. INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA EN CPG-AA. COMPARACIÓN CON

TIROSINASA DE CHAMPIÑÓN.

El CPG-AA posee grupos funcionales arilamina, al igual que

el Enzacryl-AA, pero por su diferente esqueleto estructural y sus propiedades

físicas, cabría esperar algunas diferencias en las propiedades de la enzima inmo

vilizada sobre él. Así, cuando se aplicó a ambos soportes la misma cantidad de

enzima, con el Enzacryl-AA se obtuvieron derivados inmovilizados con Act||y|g

de 35-45 U/g gel, mientras que con CPG-AA de 15-25 U/g gel (Tabla 6). De

estos valores se deduce que los rendimientos de inmovilización fueron menores

para la obtención del CPG-AA, lo que se atribuyó a una menor densidad de

grupos funcionales del soporte. Sin embargo la modificación química provocada

a la enzima fué semejante que en la obtención de Enzacryl-AA-1 ME, pues los

valores de eficacia de acoplamiento obtenidas fueron semejantes. Así mismo, las

propiedades cinéticas y el perfil pH-actividad fueron similares. Así pues, el En-

zacryl-AA-IME y el CPG-AA-IME resultaron derivados de tirosinasa de propieda

des generales muy parecidas. Las principales diferencias entre ambos están rela

cionadas con las óptimas propiedades mecánicas del CPG-AA,que determinó no

tables diferencias en el comportamiento, en reactores con IME funcionando

durante largo tiempo, especialmente en reactores de columna empaquetada, lo

que se analizará más adelante en relación con su aplicación a la síntesis de L-

-dopa(Cap. 6 y 8).

La tirosinasa de champiñón, que es activa en su estado na

tivo, es tal vez la tirosinasa más estudiada y la única que se encuentra disponi

ble comercíalmente. Además es la fuente de enzima utilizada en los pocos in

tentos anteriores de inmovilización de tirosinasa (Wykes et al. 1971; Letts y

Chase, 1974; Schiller y Liu, 1976; Schiller et al. 1978), aparte de lo realizado

en nuestro Departamento con tirosinasa de epidermis de rana. En este trabajo, se

inmovilizó tirosinasa de champiñón en las mismas condiciones que con tirosinasa

de epidermis a f in de comparar. Para ello se trataron 50 mU de enzima con

CPG-AA en las condiciones indicadas en la Tabla 6. La tirosinasa de champí-



-50-

Tabla 6

Comparación de los resultados de inmovilización de tirosinasa de epidermis de

rana en CPG-AA y Enzacryl-AA, y con tirosinasa de champiñón en CPG-AA

y en fibras de colágeno. La tirosinasa de epidermis de rana, para inmovilizar so

bre Enzacryl-AA y CPG-AA, fué extracto HÔ/Pj activado por paso por colum

na de tripsina-sepharosa. La tirosinasa de champiñón para acoplar a CPG-AA

fué obtenida de Sigma (U.S. A. ). Los valores dados para la inmovilización de

tirosinasa de champiñón en membranas de colágeno están calculados a partir de

los resultados indicados por Letts y Chase (1974).

Soporte:

Fuente de enzima:

Act. esp. del SE (U/mg) :

Enzacryl-AA CPG-AA

epid. rana epid. rana

0,85

Enzima tra-tada(mU/mg gel): 50

Fracción de actividad sustraída: 0,97

0,85

50

'prot 0,51

Act||y|E(mU/mg gel): 35

Efic. acopl.: 0,72

'¡nm •

r¡

0,70

i n m / r prot (*)= 1 - 3 7

membranas de CPG-AA colágeno

(Letts y Chase, 1974)

champiñón champiñón

0,05

50

0,25

88 mU/cm 2

0,61

0,39

21

0,68

0,42

1,08

0.08

0,06

2,4

0,60

0,05

0,83

0,25

0,41

1,14 mU/cm2

0,053

0,013

0,031

(*) Esta razón es igual a la razón: Act esp. I ME / Act. esp. SE

ñon dio muy bajos rendimiento de inmovilización (r¡nm=0,05) en comparación

con tirosinasa de epidermis de rana((r¡nm=0,42). Asi', la baja actividad recupera

da en el derivado inmovilizado, respondió a que la enzima se unió en baja pro

porción al soporte, lo que pudo comprobarse por la razón de protei'na unida

(rp r o t=0,06) y por la fracción de actividad sustraída de la disolución de SE uti-



-51-

lizada( (Act. sust.=0,08), que fueron muy inferiores a los obtenidos con tirosina

sa de epidermis de rana. Estos hechos se interpretaron en función de las activi

dades especi'ficas de las disoluciones de enzima utilizadas, ya que las preparacio

nes de tirosinasa de champiñón, obtenida comercialmente, dieron una actividad

especi'f ica muy inferior (0,05 U/mg) a las de rana obtenidas por nosotros (0,2 U/

/mg en extractos P¡; 7-10 U/mg en purificado CM/Phe), habiéndose empleado

para estas experiencias extracto HÔ/Pj. Tal como se describió anteriormente para

el Enzacryl-AA,( Fig. 20, cap.4.1), cuando se aplica una cantidad de proteína

muy superior a la máxima capacidad del soporte, éste se satura y da bajos r ¡ n m .

Sin embargo, de la actividad sustraída de la disolución, el 60 % se manifestó

en el derivado IME (ef. acop.=0,6), lo que representó una eficacia de acoplamien

to cercana a la obtenida con epidermis de rana. Así pues, aunque la cantidad

de proteína en las disoluciones de tirosinasa de champiñón limitó el rendimiento

de inmovilización de su actividad al CPG-AA, la eficacia de acoplamiento obte

nida, demostró que el efecto de la modificación química producida en la enzi

ma por la unión covalente al CPG-AA, fué del mismo orden que con la enzima

de rana. De todo ello se deduce, que las limitaciones del uso de tirosinasa de

champiñón no vienen determinadas por las características químicas de las molé

culas de enzima ni por el método de inmovilización que fué apropiado, sino

por el alto contenido de proteína de las preparaciones de enzima.

Letts y Chase (1974) obtuvieron muy bajos valores de r ¡ n m

al inmovilizar tirosinasa de champiñón en membranas de colágeno ( r ¡ n m = 0,013).

La actividad específica del derivado IME que obtuvieron fué muy inferior a la

del SE (Act esp. IME/Act esp. SE = •'¡nrrAprot = 0,031), lo que los autores lo

atribuyeron a la unión menos preferente de la tirosinasa que de otras proteí

nas, en base a que la razón o rendimiento de proteína unida al colágeno fué

superior a la fracción de actividad sustraída de la disolución ( r p r o t = 0 , 4 1 ; Act.

sust.= 0,25); sin embargo el valor de ésta última, no puede justificar tan bajos

valores de r ¡ n r n , y de actividad específica de la proteína inmovilizada. Por otro

lado, a partir de los datos reseñados por los autores, puede deducirse un valor

de eficacia de acoplamiento muy pequeño (ef. acop. = 0,053), lo que representa

que sólo el 5,3 % de la actividad sustraída de la disolución se manifestó en el



-52-

derivado inmovilizado. Por lo tanto, en este caso las limitaciones vienen impues

tas por el propio método de inmovilización, que disminuyó drásticamente la efi

cacia catalítica de la enzima al inmovilizarla. Dado que la inmovilización la reali

zaron por oclusión en el colágeno, que es un método físico, no hubo modifica

ción química de la enzima y por lo tanto, la disminución de la actividad sólo

pudo ser debida al microambiente que proporcionaba el soporte y/o a limitacio

nes difusionales. La importancia que tuvieron estas últimas lo prueba el hecho

de que la actividad que observaron en reactor de flujo continuo fué un orden

de magnitud inferior a la reseñada en la Tabla 6. Además cuando intentaron

aumentar la estabilidad de la unión de la enzima al soporte tratando el IME

con glutaraldehido y otros reactivos bifuncionales, la modificación química pro

ducida disminuyó aún más la actividad del IME.

Cabe resaltar pues, que ¡a inmovilización covalente de la tiro-

sinasa de epidermis de rana en Enzacryl-AA y en CPG-AA dio resultados muy

superiores respecto a los rendimientos de inmovilización y eficacias de acopla

miento que lo publicado anteriormente con tirosinasa de champiñón, e incluso

con esta última la alta eficacia de acoplamiento al CPG-AA demostró que con

preparaciones más purificadas de enzima podrían obtenerse mejores rendimien

tos de inmovilización. Con todo ello se ha logrado pues dar un paso adelante en

la aplicabilidad de la tirosinasa inmovilizada.

4.3. ESTUDIO DE LAS CONDICIONES ÓPTIMAS DE ENSAYO DE LA A C

TIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DEL ENZACRYL-AA-IME.

Dado que las enzimas pueden modificar notoriamente sus pro

piedades por la inmovilización (Vieth y Venkatasubramanian, 1974b), fué necesa

rio analizar las condiciones óptimas para la expresión de la actividad de la tiro

sinasa inmovilizada. En este apartado se expresan el efecto de la fuerza iónica,

pH y temperatura sobre la actividad.

En primer lugar se estudió el perfil pH-actividad,. para el En-



-53-

zacryl-AA-IME preparado con enzima purificada y activada, en el intervalo de

pH 6 a 8 a dos fuerzas iónicas distintas suministradas por tampón fosfato 0,05

M y 0,10 M, y se compararon con el de la enzima soluble purificada de la

misma forma Para las dos fuerzas iónicas analizadas, el pH óptimo se desplazó

muy ligeramente (0,3 unidades de pH) hacia pH alcalino con respecto al SE.

Los desplazamientos hacia zonas más básicas de pH están en consonancia con

lo esperable según. Katchalski et al (1971) para soporte de naturaleza polielec-

trolitica con una ligera carga negativa. El tramiento matemático se basa en la

consideración de una distribución de Maxwell-Boltzman para la concentración

H entre la parti'cula de gel-IME y el medio:

a u / a „ x t = exp z i e I ^ (15) de donde se deduce: H k T

z i el V pH = pH¡ - p H e x t = p H o p t S E - P H o p t | M E = 0,43 —¡^ 06 )

siendo: ajj y a^xt la actividad de H en el medio interior y exterior al gel;

z, la carga del ion; e, la carga eléctrica elemental; Y el potencial electrostático

en el dominio de la partícula de gel-IME; k, la constante de Boltzman; T la t

temperatura absoluta; pH¡ y pH e x^ , los pHs del medio interno y externo de la

partícula; p H o p j g E y pHO D j |(^£ , los pHs óptimos del SE eelME. En nuestro

caso con pH = — 0 , 3 , conduciría a un valor de ^ =—18 mV, valor sólo m

muy ligeramente negativo en comparación — 50-150 mV esperable de la teoría

de polielectrolitos ionizados (Goldstein, 1976). Así, el valor d e ^ obtenido no

es significativo, ni atribuíble a que el soporte esté cargado e influya en la ex

presión de la actividad con el pH. De hecho la actividad dopa oxidasa de la

misma enzima en este soporte (Manjón, 1978) dio también un ligero desplaza

miento del pH hacia pH ácido.

El efecto de la fuerza iónica sobre la actividad del Enzacryl-

-AA-IME, se determinó a diferentes fuerzas iónicas suministradas por distintas

concentraciones del tampón fosfato de pH 7,0 utilizado (entre 0,02 y 0,36 M).

La actividad del IME aumentó ligeramente al disminuir la fuerza iónica (Fig.22)

Este hecho está en consonancia con la hidrofobicidad manifestada por la enzima

(Cortés, 1978) y fué semejante al observado con la actividad dopa oxidasa. Da-



-54-

1.0 < >

< _ i UJ

ce Q <

ü <

0,5

A Enzacryl-AA-IME

OSE

FOSFATO 0.05 M

6 7 8

PH

á Enzacryl AA IME

• SE

FOSFATO 0,1 M

—» i

7

pH

Fig. 21

Perfiles pH—actividad del

Enzacryl-AA-IME. Compa

ración con SE a dos fuer

zas iónicas.

F U E R Z A I Ó N I C A

Fig. 22. Efecto de la fuerza iónica sobre la actividad del Enzacryl-AA-IME.

Ensayos a pH 7,0 y T 25°C.



-55-

do que la forma activa de la enzima es una conformación desplegada, la dismi

nución de la fuerza iónica favorecerá ese desplegamiento, pues al disminuir la

concentración de iones en el medio hace más favorable termodinámicamente la

interacción de los residuos hidrofi'licos con el entorno acuoso. Por otro lado,el

uso de tampón menos polar como tris-fosfórico en lugar de fosfato, condujo a

un ligero incremento de la actividad del IME, al igual que el ocasionado por a-

dicíón de 1 % de acetona. Este ligero aumento de la actividad es significativo de

que un ambiente hidrofóbico favorece la conformación activa de la enzima. De

todo esto se deduce que el uso del IME es preferible realizarlo a fuerzas ióni

cas bajas, con una concentración de fosfato mínima necesaria para asegurar una

capacidad reguladora suficienteepara mantener el pH dentro de los valores reco

mendables.

En general con la inmovilización, las enzimas aumentan su

estabilidad térmica, ya que la unión al soporte incrementa la resistencia a per

der la conformación activa (Barker y Epton, 1970). Asi', se ha observado que

muchas enzimas al inmovilizarlas, se incrementa la temperatura óptima a la cual

manifiestan máxima actividad (Gabel y Kasche, 1976), aumentando además la

resistencia al tratamiento térmico, llegándose incluso a activación de algunas en

zimas por cortos tratamientos térmicos previos a. la medida de actividad (Knigts

y Light, 1974; Manjón, 1978). Los efectos del tratamiento térmico sobre la t i

rosinasa se han estudiado para la actividad dopa oxidasa, tanto de la proenzima

y enzima soluble (Galindo, 1976), como de la enzima inmovilizada sobre Enza-

cryl-AA (Manjón, 1978), habiéndose encontrado un aumento notable de la resis

tencia térmica en esta última. Garci'a Carmona (198)) lo hizo sobre la actividad

tirosina hidroxilasa de protirosinasa y tirosinasa solubles, obteniendo un resultado

comparable al de dopa oxidasa. En nuestro caso se ha analizado el efecto de la

temperatura sobre la actividad tirosina hidroxilasa manifestada por Enzacryl-AA-

-IME, encontrándose que a 25 °C la enzima manifestó un máximo de actividad

(Fig. 23).

De los resultados obtenidos en este apartado, se dedujo que

las condiciones de pH 7,0, fosfato 0,1 M, temperatura 25 °C, eran condiciones

idóneas para la utilización de Enzacryl-AA—IME, con la ventaja de ser las mis-



-56-

Fig. 23

Variación de la acti

vidad tirosina hidroxi-

lasa de Enzacryl-AA-

-IME con la tempe

ratura de ensayo.

20 40 60 80

TEMPERATURA DE ENSAYO (°C)

mas condiciones óptimas de ensayo para la enzima soluble. En el Cap. 6.4 se a-

nalizará el efecto de estos factores sobre la estabilidad del Enzacryl-AA-IME pa

ra su actuación a largo tiempo.

4.4. COMPORTAMIENTO CINÉTICO DEL ENZACRYL-AA-IME

Las propiedades cinéticas de las enzimas inmovilizadas suelen

alterarse con respecto a sus homologas solubles por las siguientes causas:

1) La modificación química covalente, los efectos esféricos ó las fuerzas electros

táticas y las interacciones hidrofóbicas que el soporte ejerce sobre la enzima pue

den afectar a su conformación. En ausencia de otros efectos, se obtendría la de

nominada velocidad de reacción intn'nseca del IME (Engasser y Horvath, 1976), de

lo que se deducen los correspondientes parámetros cinéticos intrínsecos.

2) Los efectos de partición pueden determinar la existencia de concentraciones di

ferentes en el microambiente que rodea a la enzima y el macroambiente de la di-

E

LU

ü <



-57-

solución. Estos efectos, en ausencia completa de problemas difusionales, pro

porcionaba la llamada velocidad inherente del IME.

3) Las resistencias difusionales internas y externas provocan un gradiente

de concentraciones entre el micro y el macroambiente de la enzima. Las

externas son fácilmente suprimibies con las condiciones ae agitación del reac

tor (Lil ly et al., 1974). La limitación difusional interna puede disminuirse

también por la agitación y por la disminución del tamaño de partícula o

de espesor de membrana del IME, pero en parte pueden considerarse inhe

rentes al propio derivado inmovilizado. Para unas condiciones reales, con

sus correspondientes limitaciones difusionales, se obtendrá la velocidad de

reacción efectiva. La relación entre Ve fec./ Vinh es el denominado factor

efectividad (Engasser y Horvath, 1976).

En nuestro caso para analizar la cinética de la actividad tiro-

sina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada, se aplicó la técnica de baño fuerte

mente agitado, tal como se describe para el método estándar de medida de ac

tividad del IME (Método: 12.8.2). En estas condiciones las limitaciones difusiona

les se redujeron al mínimo, pudiéndose afirmar que se midió la velocidad de reac

ción inherente y por lo tanto se determinaron los parámetros cinéticos denomi

nados inherentes. Se compararon las diferencias de comportamiento en función

del estado de purificación de la muestra de tirosinasa que se inmovilizó.

Se observaron cinéticas de primer orden para los derivados de

Enzacryl-AA-IME obtenidos con tirosinasa bajo la forma de extracto P¡, extracto

H2O/PJ y purificado CM (Fig. 24). Sin embargo los derivados Enzacryl-AA-IME

obtenidos a partir de tjro-sinasa purificada Phe y CM/Phe mostraron una cinética

con parcial saturación; a partir de ellos se dedujeron los parámetros cinéticos co

rrespondientes por la representación de Lineweaver-Burk (Fig. 25). De las abcisas

de los puntos de corte de las rectas de dicha figura, se calcularon los valores

de KJ J 2,7 mM y 2,0 mM. Estos valores fueron del mismo orden que los obte

nidos con enzima soluble y figuran expresados, junto con las constantes cinéticas

de velocidad, en la Tabla 7. A pesar de todo, en ningún caso se llegó a una sa

turación completa de la velocidad de reacción respecto al sustrato, debido a la

baja solubilidad de la L-tirosina (0,453 g/l ó 2,5 mM, en agua a 25 °C, Merck



4 s * . 8

<

o o

A '

1,0 1,5 2,0

L- T I R O S I N A ( mM )

Fig. 24. Cinética del Enzacryl-AA-IME para distintos estados de purificación de la enzima.

%

(min . j»M''

Ss

0,3

) 0.2

0.1

i 0

_y^Ô

• 5 1,0

« 1,5

• 2,0

<• CM/Ph*

1/S (mM1)

Fig. 25. Representación de Lineweaver-Burck de la cinética de los derivados de Enzacryl-AA-IME preparados con ti-rosinasa purificada Phe y CM/Phe.



-58-

4.5. EFECTO DEL ASCORBATO Y DE LA HIDRACINA SOBRE LAS ACTI

VIDADES DEL SE Y DEL IME.

En el capítulo 2.1 ya se ha comentado que en presencia de

de ascorbato y de tirosinasa de champiñón, EI-Bayoum¡ y Frieden (1957) obser

varon que el catecol no se oxidaba a la quinona correspondiente, pero sí dio

un consumo de ascorbato. Igual fenómeno se observó con tirosinasa de Neuros-

pora utilizando L-dopa ó L-tirosina como sustrato (Sussman, 1961). La oxidación

de ascorbato podía ser detectada a 265 nm y se podía considerar como una

manifestación de la actividad de tirosinasa; incluso este método es utilizado ac

tualmente como criterio de medida de actividad en preparados comerciales de

tirosinasa de champiñón (Sigma, 1980). La estequimetría de las reacciones de

oxidación en presencia de ascorbato, fueron estudiadas en tirosinasa de Neuros-

pora por Fling et al. (1963) y sugirieron que la dopaquinona formada por oxi

dación enzimática de L-dopa, era reducida no enzimáticamente por ascorbato

para dar de nuevo L-dopa, en lugar de oxidarse no enzimáticamente a dopacro-

mo (Horowitz et al., 1970). Otros reductores como el ferrocianuro producen

un efecto semejante al ascorbato (Sussman, 1961).

Por otra parte, la h id rae ¡na y derivados manifiestan una inhi

bición de la melanogenesis en diferentes etapas. Así, el ácido hidracinoflorético

(AHP) y otros ácidos con grupos hidroxifenólicos manifiestan inhibición compe

titiva respecto a la formación de dopacromo, como análogos de la L-tirosina

(Fourche et al., 1977). Sin embargo disoluciones de AHP, de L-tirosina, y mez

clas de L-tirosina y AHP, en presencia de tirosinasa de champiñón, consumen

oxígeno a velocidades comparativamente semejantes, lo que implica que en rea

lidad actúan como sustratos, cuyos productos oxidados no pueden ciclarse para

dar las formas indólicas coloreadas de la forma con que la L-dopa lo hace a

dopacromo (Fourche et al.,1978). La fenilhidracina y los derivados como el áci

do o-hidracinobenzoico y p-hidrazinobenzoico, además de ser inhibidores de la

melanogenesis son también inhibidores del consumo de oxígeno, pero de tipo no

competitivo, lo que parece un fenómeno general debido, según afirma Fourche

et al. (1977), al grupo N ^ - NH2, lo cual se haobservado con el derivado más



-59-

simple, el sulfato de hidracina. Lerner et al. (1971), habi'an observado anterior

mente que la fenilhidracina mostraba inhibición no competitiva e irreversible

con muchas catecolasas vegetales, incluyendo la tirosinasa de champiñón; inhi

bición que aumentó con el tiempo de incubación y que requirió oxi'geno, pe

ro que fué independiente de la presencia de fenoles. Sin embargo la fenilhidra

cina estimulaba la oxidación enzimática de p-cresol y por lo tanto la actividad

cresolasa.

La hidracina ha sido también utilizada por Patel y Okun

(1977) como agente reductor para evitar la oxidación de L-dopa formada a par

tir de L-tirosina por tirosinasa de champiñón y por peroxidasa de rábano, con

tal de demostrar la posibilidad de hidroxiláción de L-tirosina por peroxidasa; el

empleo de hidracina en lugar de ascorbato viene justificado por los autores pa

ra evitar la oxidación no enzimática de la L-tirosina que el ascorbato parece ca

talizar en presencia de peróxidos , favorecida por la presencia de los iones me

tálicos Cu+ 2 y Fe+ 2 (Bezssonoff y Leroux, 1946; Udenfriend et al., 1954).

4.5.1. EFECTO DEL ASCORBATO E HIDRACINA EN LA FORMACIÓN DE

DOPACROMO.

En nuestro caso, hemos analizado el efecto del ascorbato y

de la hidracina sobre las actividades de la tirosinasa de epidermis de rana, tan

to en forma soluble como inmovilizada. La acumulación neta de L-dopa, obte

nida por oxidación enzimática de L-tirosina en presencia de ascorbato, ha sido

expuesta anteriormente cuando se estudió la cinética de la actividad tirosina h¡-

droxilasa de tirosinasa (Cap.2). En ausencia de ascorbato, la tirosinasa catalizó

la formación de dopacromo, tanto si se partió de L-tirosina como de L-dopa

como sustratos; la reacción se siguió espectrofotométricamente a 475 nm y el

comportamiento fué semejante para enzima soluble (Fig. 26) e inmovilizada

(Fig. 27). Utilizando la misma concentración para ambos sustratos (2,5 mM),

la velocidad de formación de dopacromo fué, con L-tirosina, aproximadamente

el 30 % que con L-dopa, siendo con L-tirosina prácticamente constante en el

tiempo de reacción ensayado (5 min), mientras que con L-dopa decayó rápida-



-60-

0,10 9 Sir. inhibidores A Hrdractna ' mW O Ascorbato 1 mM

S L TIROSINA

2 4 6

T I E M P O ( min )

Fig. 26

Efecto del ascorbato y la hidra-

cina sobre la formación de do-

pacromo con SE. 100 I de

extracto de SE con 3 mi de

disolución sustrato (L-tirosina

o L-dopa 2,5 mM).

0,3 # Sm inhibidores

¿ Hidracina t mM

O Ascorbato 1 mM

Fig. 27.

Efecto del ascorbato y la hi-

dracina sobre la formación de

dopacromo con Enzacryl-AA-

-IME. 8 mg gel-IME en 20 mi

de disolución sustrato (L-tiro

sina ó L-dopa 2,5 mM).

2 4 6

T I E M P O ( min )



-61-

mente.

La presencia de ascorbato((l mM) provocó una completa in

hibición de la formación de dopacromo, tanto con L-tirosina como con L-dopa.

y el efecto inhibidor fué semejante con SE que con Enzacryl-AA-IME. Con hi-

dracina el fenómeno observado fué similar, salvo que permaneció una ligera acti

vidad residual. Por otro lado, con ascorbato o con hidracina la tirosinasa catali

zó la formación de L-dopa a partir de L-tirosina, como ya se ha indicado en el

Cap. 2; por lo tanto el proceso impedido fué la conversión neta de L-dopa a

dopacromo.

4.5.2. EFECTO DEL ASCORBATO Y LA HIDRACINA SOBRE EL CONSUMO

DE OXIGENO.

En este apartado se analiza el consumo de oxi'geno en las

reacciones catalizadas, por tirosinasa en presencia de ascorbato y de hidracina con

tal de, en primer lugar, tratar de conocer el papel que pueden desempeñar estos

agentes reductores, y en segundo lugar, de averiguar hasta qué grado se requiere

un suministro de oxigeno en reactores con tirosinasa inmovilizada.

Aunque en presencia de ascorbato o de hidracina no hay oxi

dación neta de la L-dopa, sin embargo no parece que, en principio, se modifique

notablemente el mecanismo de acción de la tirosinasa si tenemos en cuenta los

siguientes hechos observados con extractos solubles de tirosinasa:

1) La velocidad de reacción , medida como formación de ^HOH a partir de L-

-tirosina-3,5- H en presencia o en ausencia de ascorbato es la misma que la de

formación de dopacromo en ausencia de ascorbato (Pomerantz, 1964, 1966).

2) Las propiedades cinéticas de de la actividad tirosina hidroxilasa obtenidas en

presencia de ascorbato midiendo la formación de L-dopa (Cap. 2), fueron seme

jantes a las determinadas en ausencia de ascorbato, tanto siguiendo la formación

de dopacromo, como con el método radiométrico (García Carmona, 1980).

La oxidación de L-tirosina a dopacromo, probablemente con

L-dopa como intermediario, comportó un consumo de oxi'geno de 12,5 U.O./min



-62-

bajo las condiciones expresadas en la Tabla 8-A; la presencia de ascorbato o

de hidracina impidió la oxidación de la L-dopa formada con la correspondien

te acumulación de esta, sin embargo, en este caso, la velocidad de consumo de

oxi'geno ( V Q ) fué muy superior (20,5 y 25,0 U.O./min). Este hecho puede

explicar la afirmación realizada por Lerner et al. (1974) de que la fenilhidracina

y ascorbato estimulaba la oxidación enzimática de p-cresol en vegetales, dado que

estos autores medi'an la actividad mediante el consumo de oxi'geno.

Con sustrato L-dopa, que dio lugar a una velocidad de formación

de dopacromo 3,2 veces superior que con L-tirosina, dio una V Q ? 1,7 veces su

perior que al utilizar L-tirosina (21,0 U.O./min, Tabla 8-B). Si la V 0 2 fuera 1,6

veces superior, corresponden'a proporcionalmente al hecho de que con L-dopa só

lo hay una etapa de oxidación. Por lo tanto las diferencias entre L-tirosina y L-

-dopa como sustratos respecto de las velocidades de consumo de oxi'geno y de

formación de dopacromo, parecen cumplir relaciones coherentes estequiométrica-

mente cuando la reacción se lleva acabo en ausencia de ascorbato. Cuando a la

reacción con L-dopa se le añadió ascorbato o hidracina, la V 0 2 aumentó unas

2 veces (40 — 45 U.O./min.). Con este hecho se confirma claramente que la pre

sencia de ascorbato no detuvo simplemente la reacción correspondiente a la acti

vidad dopa oxidasa, sino que provocó otra reacción oxidativa con una velocidad

de consumo de oxigeno incluso superior. Esta reacción podn'a impedir la oxida

ción de L-dopa por uno de los siguientes mecanismos:

A) Por la existencia de una reacción oxidativa que compita con la catálisis en

zimática de la oxidación de L-dopa; esto implican'a una interacción del agente

reductor con la molécula de enzima actuando como dador de electrones. El efec

to del reductor podría ser , en este caso, semejante al asignado a otras hidroxi-

lasas que contienen Cu , como por ejemplo la tirosina hidroxilasa adrenal

y la dopamina-i3-hidroxilasa ( Gunsalus, 1974) que participan en la biosi'ntesis de

catecolaminas; en ellas, el sustrato es monooxigenado a expensas de oxígeno mo

lecular, al mismo tiempo que el Cu es oxidado a Cu + ¿ ; el cofactor reductor,

lleva a cabo la reducción del Cu+^ a la forma reducida original de Cu , inicián

dose de nuevo el ciclo catalítico y no son absolutamente específicas respecto al

reductor.



-63-

Tabla 8

Consumo de oxígeno, en presencia y ausencia de ascorbato o hidracina, en las

reacciones de oxidación de L-tirosina y L-dopa catalizadas por extractos solubles

de tirosinasa. Ensayos control realizados en ausencia de enzima o de sustrato.

Condiciones de ensayo

L-tirosina (mM)

A 2,5 2,5 2,5

B

— —

C 2 . 5 2,5 2,5 2,5 2,5

— — — — —

D

— — — — —

L-dopa (mM)

—

— —

2,5 2,5 2,5

—

— — — —

2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

—

— — — — —

Enzima (mU/ml)

33,5 33,5 33,5

33,5 33,5 33,5

—

— — — —

— — — — —

—

33,5 — —

33,5 33,5

Ascorbato (mM)

—

10 —

—

10 —

—

5

10 — —

—

5 10 — —

—

—

10 —

10 —

Hidracina (mM)

—

—

10

—

—

10

—

— —

5 10

— — —

5 10

—

— —

10 —

10

Vrk °2

(U.O./min)

(*)

12,5 20,5 25,0

21,0 40,0 45,5

0,0 1,7 2,2 0,6 2,6

0,0

1.7 2,6 0,6

1.2

0,0 0,0 0,5 0,0 1.3 1.3

(*) U.O. = Unidad de cantidad de oxi'geno consumido, que se definió como la cantidad del 1 % del oxigeno disuelto en 1 mi de disolución saturada con aire atmosférico ( O2 ~ 0,26 mM )

A) Ensayos con L-tirosina B) Ensayos con L-dopa C) Controles sin enzima

D) Controles sin sustratos



-64-

B) Por existencia de una reacción en que el ascorbato o la hidracina actuase

reduciendo a un producto de oxidación de L-dopa, regenerando ésta; esto ¡m-

plican'a que en realidad no se habn'a detenido la acción enzimática de la tirosi-

nasa como dopa oxidasa. Sen'a la interpretación dada por Fling et al (1963), de

la reducción de la dopaquinona obtenida por la oxidación enzimática de la L-

-dopa. La formación de estas quinonas ha sido observada en algunas fenolasas

vegetales en las que la quinona es el producto final de oxidación de sus sustra

tos específicos. Con tirosinasas de animales y otras que emplean L-tirosina como

sustrato, la formación de dopaquinona como producto de reacción enzimática es

hasta ahora una suposición, dado que el dopacromo es el producto realmente

observado. Se han iniciado trabajos para la detección de esta dopaquinona (Gar

cía Carmona y García Cánovas, 1980).

En ausencia de enzima, pero en presencia de ascorbato o de hi

dracina se obtuvieron valores mínimos de V 0 2 de 0,2 — 2,6 U.O./min, en las

condiciones de la Tabla 8-C, lo que implica que el sistema L-tirosina/ascorbato

ó el L-dopa/ascorbato son sólo muy lentamente oxidables, pero lo suficiente pa

ra detectarse la formación de L-dopa de forma no enzimática, lo que pudo com

probarse dejando L-tirosina en presencia de ascorbato o de hidracina durante 24

horas a temperatura ambiente y determinando la concentración de L-dopa formada

alcanzando concentraciones dé 0,07 mM. Es conocido que las radiaciones U.V.

favorecen la conversión no enzimática de L-tirosina a L-dopa, mecanismo al que

se le asignó, originalmente, la oxidación de L-tirosina a L-dopa en el proceso

de la pigmentación de la piel (Arnow, 1937b).

Igualmente hubo un ligero consumo de oxígeno (1,3 U.O./min) en

el sistema enzima/reductor en ausencia de sustrato (Tabla 8-D).

Con enzima inmovilizada se observó el comportamiento sorprenden

te, respecto al consumo de oxígeno, que está expresado en la F¡g.28; después de

15 horas de funcionamiento continuo de un reactor empaquetada con Enzacryl-

AA-IME y sin reciclaje del sustrato, se perdió el 70 %de la capacidad catalítica

de conversión de L-tirosina a L-dopa en presencia de ascorbato, sin embargo, el

consumo de oxígeno no sólo no disminuyó, sino que aumentó con el paso de



-65-

< a. O

0,3

0,2

0,1

_ 0,0

•

disolución

sustrato

1

/ » i 1 1

tampón fosfato

i

^--'"""""l ~"~"--- ^ J

" V ^ ^ . ^^""V.

^ ^ ^ Í 1 1

100

80

60

40

20

3 d O

o s z> V) z o o o z UJ o X o o

0 5 10 15

T I E M P O (horas)

Fig. 28. Oxígeno consumido y L-dopa formada en un reactor de columna empaquetada (PBCR). Medidas de L-dopa y oxi'geno a la salida del reactor. Disolución sustrato suministrada: L-tirosina, 2,5 mM; ascorbato, 2,5 mM; fosfato 0,1 M, pH 7,0; saturada de aire a 25°C.

la disolución sustrato a través de la columna; el consumo de oxígeno desapare-:

ció cuando se sustituyó la disolución sustrato por disolución tampón. Esto pare

ce indicar que el citado consumo de oxígeno pueda ser debido a una interac

ción del ascorbato con el oxígeno en presencia de la enzima inmovilizada.

4.5 3. CONSUMO DE ASCORBATO EN LA REACCIÓN

Cuando se ensayaron las actividades tirosina hidroxilasa y dopa

oxidasa de tirosinasa se observó que la concentración de ascorbato, medida es-

pectrofotométricamente a 265 nm, decreció con el tiempo de reacción (Fig.29),

hasta que se alcanzó una concentración mínima, a partir de la cual sa inició un

incremento de la absorbancia por formación de dopacromo.

Cuando se utilizó L-dopa como sustrato, la concentración de

ascorbato disminuyó linealmente con el tiempo, y la velocidad de consumo del as

corbato (Vasc) fué proporcional a la cantidad de enzima aplicada. Sin embargo

con L-tirosina, la desaparición de ascorbato no cumplió las mismas leyes de va-



Extracto (mi)

-66-

Fig. 29.

Consumo de ascorbato en la

reacción catalizada por tiro-

si nasa soluble.Efecto del tipo

de sustrato y de la cantidad

de enzima.

Ensayos con 3 mi de disolución

Sustrato (S) 2,5 mM,

Ascorbato inicial, 0,125 mM

4 6 8 10

T I E M P O ( min )

0,8

LO ce

o z < CC O tfí 00 <

0,4

0,0

S = L-tirosina

_l_ J .

1 2

T I E M P O

Fig. 30.

Consumo de ascrobato en

la reacción catalizada por

Enzacryl-AA-IME.

4 mg gel-IME en 5 mi de

disolución de sustrato re-

ciclando a través de cubeta

de flujo del espectrofotó-

metro.

Sustrato 2,5 mM

Ascorbato inicial, 0,125 mM.

( min )



-67-

riación, no pudiéndose relacionar directamente con la cantidad de enzima apli

cada , aunque si' existió una mayor velocidad de consumo de ascorbato al au->

mentar la cantidad de enzima. El comportamiento de la enzima respecto al con

sumo de ascorbato no se modificó sensiblemente con el uso de enzima inmovi

lizada en Enzacryl-AA, dando curvas de ascorbato frente a tiempo del mismo

tipo (Fig. 30),

Para analizar el significado de las curvas de consumo de as

corbato con sustrato L-tirosina, se representó la variación de la velocidad de

consumo de ascorbato con el tiempo (Fig. 31). Se observó que la V a s c aumen

taba linealmente con el tiempo de reacción, al igual que lo haci'a la concentra

ción de L-dopa formada. Este resultado indicó que la velocidad de consumo de

ascorbato debi'a estar relacionada con la concentración de L-dopa formada en

I D U

_ 100

i

5 o t -< S 50 ce O 8 < _J

T 1

.

• •

S t

" ^ > ^ s ^ • ^•v. * \ •

\ •

\ • • X.

* X ^w

y J T X • / X

• V ^ ^ X • J^ ^

* J*

_ J 1 1 1 i

\ \ \ \ \

* •

-

1 . 1 - „ 2 4 6

T I E M P O ( rnin. )

80

ao

. 30

. 20

z 4 0 <

\ •

- 20 j

1

¡ 8 <

O 10 i

(O

Fig. 31. Variación de la velocidad de consumo de ascorbato con el tiempo de

reacción en presencia de L-tirosina. Comparación con la concentración

de L-dopa formada con el tiempo. Condiciones de ensayo: las de la

Fig. 29 para 200yt f de enzima y con sustrato L-tirosina.



-68-

S 0,20

1

O 5 0,15 CQ CC O ü C/3 < o 0,10

D z O O Q 0,05 < u O O

> 0,0

/ L-dopa

[ ^ ^ ~ ^ ^ L-tirosina

í 1 i

Fig. 32.

Efecto de la concentración

de sustrato sobre la veloci

dad de consumo de ascorba-

to con Enzacryl-AA-IME.4

4 mg de gel-IME en 10 mi

de disolución sustrato con

teniendo ascorbato 0,125

mM. Para sustrato L-tirosi-

V a s c fué medida como va

lor medio en el intervalo

de 1 a 2 minutos de reac

ción.

1 2

S U S T R A T O ( m M )

cada momento. Esta afirmación se confirmó cuando se estudió el efecto de la

concentración de los sustratos sobre la velocidad de consumo de ascorbato em

pleando Enzacryl-AA-IME (Fig. 32), resultando lineal con la concentración de

L-dopa.



5. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE

PROTIROSINASA EN ENZACRYL-AA.



-70-

5. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE PROTIROSINASA

EN ENZACRYL-AA.

En este capítulo se pretende analizar el efecto de la unión

de protirosinasa al Enzacryl-AA sobre la manifestación de la actividad tirosi-

na hidroxilasa de la proenzima inmovilizada (Enzacryl-AA-1MP), ya que existía

el antecedente de la activación parcial de la actividad dopa oxidasa por la u-

nión covalente a soportes sólidos (Iborra et al, 1979). Así mismo se estudian

las propiedades generales del Enzacryl-IMP, cuando este derivado fué posterior

mente activado por tratamiento con tripsina soluble, y de su comparación con

las propiedades manifestadas por el Enzacryl-AA-IME, en el que la activación

con tripsina fué previa a su inmovilización, se dedujo la forma de proteína apro

piada para la inmovilización de tirosinasa.

5.1. ACTIVACIÓN DE PROTIROSINASA.

Purvis y Depstedt (1957) fueron los primeros en estraer la

tirosinasa de epidermis de Rana Pipiens añadiendo tripsina antes de la homoge-

neización, e interpretaron que la tripsina actuaba solubilizando las células y favo

reciendo la liberación de tirosinasa. Posteriormente se consideró que, en su estado

nativo, se encontraba como proenzima (McGuire, 1970; Barisas et al. 1973; Ben-

son y Triplett, 1974), ya que los extractos solubles de ésta(SP) no manifestaban

actividad dopa oxidasa. Miller et al (1970) aislaron y detectaron oxidasas de L-

-tirosina, dopamina y L-dopa de Rana pipiens, que en piel y ovario eran casi i-

nactivas para L-tirosina y L-dopa, siendo activadas por tratamiento con tripsina.

Hasta el presente se han descrito varios procedimientos de activación de la tiro

sinasa de epidermis de rana:

1) Interacción con tripsina o con otras enzimas proteolíticas (Barisas y McGuire,

1974; Lozano et al. 1975). La activación con tripsina es más eficaz y la activi

dad conseguida viene considerándose como el 100 % de la actividad de la en-



-71-

zima. La activación por paso de las disoluciones de protirosinasa a través de co

lumna con tripsina inmovilizada en Sepharosa (Iborra et al. 1976; Manjón, 1978)

es la técnica utilizada sistemáticamente en este trabajo (Método: 12.1.2).

2) La activación por la acción de la luz que ha sido observada con protirosinasa

(Mikkelsen y Triplett, 1975), se atribuye a una molécula cromófora constituyen

te de la protei'na que al ser extrai'da con acetona la desensitiza. Este fenómeno

puede estar implicado en el mecanismo natural de activación de tirosinasa, para .

desencadenar la pigmentación de la piel como respuesta al tratamiento solar.

3) El tratamiento térmico también provoca parcial activación (Lozano et al, 1975),

asi' como el envejecimiento (Galindo, 1976).

4) La inmovilización a determinadas soportes sólidos por unión covalente provocó

la activación de protirosinasa (Manjón, 1978; Iborra et al. 1979) como consecuen

cia de la modificación química producida en la molécula de proenzima.

5) Miller et al (1970) mencionan que por incubación con L-tirosina a 0°C tam

bién hay una activación de la protirosinasa de epidermis. Este constituye el úni

co antecedente localizado de activación por el sustrato

Los estudios realizados en nuestro laboratorio, sugieren que

la activación transcurre a través de un cambio conformacional provocado por u-

na excitación luminosa, térmica ó por una modificación química covalente. Ese

cambio conformacional se ha comprobado que consiste en un desplegamiento de

la estructura tridimensional; diversos tipos de resultados lo confirman: los cam

bios en el espectro de fluorescencia (Manjón, 1978, Iborra et al. 1978), el com

portamiento frente a cromatografía hidrofóbica (Cortés, 1978), la mayor accesibi

lidad del centro activo a fotosensibilizadores inmovilizados específicos (Llorca,

1980) y así como de los puentes disulfuro a la acción del ditiotreitol (Iborra et

al. 1978; Ferragut, 1980). Por otro lado, estudios de desnaturalización térmica,

han demostrado que la forma activa desplegada es una forma más estable termo-

dinámicamente ((Galindo, 1976; García Carmona, 1980). Por lo tanto el proce

so de activación es un proceso espontáneo por transición a un estado más desor

denado, y las distintas formas de desencadenar el proceso proenzima —ênzima,

lo hacen proporcionando la energía de activación (caso de la luz, temperatura e



-72-

inmovilización) o aportando un mecanismo catalítico de menor energía de acti-

vación (catálisis por tripsina, inducción por el sustrato).

Una posible explicación para la más eficaz activación con

tripsina sería que ésta rompe elgún enlace peptídico y de esa forma libera la

conformación de la proenzima, permitiendo así la transconformación espontánea

a la estructura de enzima activa, más desordenada y estable. Además no se han

observado diferencias significativas en los valores de peso molecular de protirosi-

nasa y tirosinasa que indicaran la liberación de algún péptido, y la expresión de

la actividad viene acompañada por una dimerización de las cadenas polipeptídi-

cas desplegadas (Ferragut, 1980).

5.1.1. EFECTO DE LA TRIPSINA SOBRE LA ACTIVIDAD TIROSINA HI

DROXILASA DE PROTIROSINASA SOLUBLE.

La protirosinasa no manifestó actividad dopa oxidasa, en las

condiciones del ensayo estándar, en presencia de su sustrato L-dopa, si no se

activaba previamente con tripsina ó alguno de los métodos de activación ya ci

tados (Galindo, 1976). Sin ambargo con L-tirosina, en presencia de ascorbato,

se detectó actividad tirosina hidroxilasa por formación de L-dopa, después de un

periodo de inducción (Fig. 33). Para las condiciones de ensayo, este periodo

de inducción fué de unos 5-10 minutos. La velocidad de formación de L-dopa

con la SP fué máxima al cabo de unos 15 minutos de reacción y alcanzó el

50 % de la que manifestó la SE desde el primer momento. Cuando la proen

zima se trató durante 5 minutos con tripsina, bajo las condiciones de ensayo ex

presadas en la Fig. 33 , no se observó la existencia de dicho periodo de induc

ción y además la actividad manifestada fué notablemente superior y más estable

a lo largo del tiempo de reacción.

Estos resultados están de acuerdo con lo establecido anterior

mente de que la activación de la proenzima puede realizarse por un cambio con-

formacional, que puede conducir a diferente estado de agregación de la proteí

na, y que es inducible todo ello por el sustrato L-tirosina.



-73-

400-

A

< Q.

10 20

TIEMPO (min)

Fig. 33.

Efecto del tratamiento con

tripsina de protirosinasa so

luble. 2 0 0 ^ 1 de SP purifi

cada, se trataron con 40/U

de tripsina (lmg/ml) duran

te 5 minutos a 25 °C y se

midió la formación de L-do-

pa después de la adición de

5 mi de disolución sustrato

(L-tirosina 2,5 mM, ascorbato

5,0 mM, en fosfato 0,1 M

pH 7,0)

Esta inducción por el sustrato L-tirosina fué observada por

Miller et al. (1970) en epidermis de Rana pipiens cuando incubó disolución de

proenzima con L-tirosina 1 mM, durante 160 minutos a 0°C. Igualmente en la

purificación por cromatografía de afinidad en tirosina-sepharosa de protirosinasa,

al eluir con L-tirosina la proenzima adsorbida, se observó un ennegrecimiento

del soporte; este hecho se puede interpretar en base a que la L-tirosina soluble

activaba a protirosinasa adsorbida por su interacción con el centro activo, mien

tras que la L-tirosina inmovilizada no lo hacía (Cortés, 1978).



-74-

5.1.2. ACTIVACIÓN DE PROTIROSINASA POR INMOVILIZACIÓN. EFECTO

DE LA TRIPSINA SOBRE ENZACRYL-AA-IMP.

La protirosinasa inmovilizada en Enzacryl-AA por el método

del ácido nitroso manifestó actividad tirosina hidroxilasa después de un perio

do de retardo sin necesidad de tratamiento con tripsina. Esto indicó que ha

bía una inducción de la actividad provocada por el sustrato al igual que suce

dió con el SP, pero con la salvedad de que al cabo de 30 minutos de reac

ción se llegó a alcanzar el 100%de la actividad del IMP que había sido tra

tado con tripsina. Así pues la modificación química producida por la inmovi

lización condujo a que la protei'na adoptara una conformación más favorable

a la inducción por el sustrato y por lo tanto más próxima a la forma activa.

Es equivalente a afirmar que la inmovilización produjo una parcial activación

de la proenzima. Esto es coherente con el hecho observado por Iborra et al.

(1979), de que la L-dopa no induci'a actividad dopa oxidasa en las condicio--.

nes normales de ensayo, sin embargo manifestó actividad después de inmovili

zarla covalentemente.

F¡g.34.

Efecto del tratamiento con

tripsina sobre el Enzacryl-AA-

IMP. 4 mg de gel-IMP lio-

filizado, se trataron con 0,5

mi de tripsina (1 mg/ml) du

rante 15 minutos, y se midió

la formación de L-dopa des

pués de la adición de 5 mi

de disolución sustrato (L-tiro-

sina 2,5 mM, ascorbato 5 mM

fosfato 0,1 M pH 7,0).

T I E M P O (min)



-75-

Para explicar el mecanismo por el que la inmovilización pro

vocó la activación parcial de la tirosinasa se debe tener en cuanta que:

1) La inmovilización de la protei'na sobre Enzacryl-AA se realiza fundamental

mente a través de los residuos tirosina de la proteína ( Goldstein et al., 1970;

Melrose, 1971).

2) En el proceso de activación se exponen más residuos de tirosina al medio,

como lo juatifican los espectros de fluorescencia de proenzima y enzima (Iborra

et al. 1978).

3) Es frecuente que la inmovilización covalente provoque cambios conformacio-

nales (Zaborsky, 1973), y en el método empleado para la inmovilización de tiro

sinasa sobre Enzacryl-AA, es probable que ese cambio se produzca en el sentido

de un desplegamiento de la estructura que hiciera accesibles a los residuos de t i

rosina para su unión al soporte. De hecho, se han observado desplazamientos

en la longitud de onda de emisión de fluorescencia al inmovilizar proenzima en

sepharosa 4B (Iborra et al. 1979) en el mismo sentido que el observado en el

proceso de conversión de proenzima a enzima (Iborra et al. 1978). El desplega

miento producido, se estabilizaría por los enlaces covalentes formados con el so

porte y por los que se formarían en la interacción de la enzima con el micro-

ambiente del soporte.

Junto con los cambios conformacionales favorables a la acti

vación que se produjeran por la unión al soporte, habrá de tenerse en cuanta

que el azar estadístico pudo producir modificaciones desfavorables para la acti

vación en una fracción de moléculas de proteína; dada la rigidez provocada por

los enlaces al soporte sólido, estas moléculas de conformación "equivocada" no

responderán al tratamiento con tripsina, ni a la inducción por ei sustrato, por

lo que quederían definitivamente inactivables para su función catalítica. Además

la activación provocada por inmovilización y por inducción por el sustrato no

deben tener las mismas características que que la activación con tripsina, pues

como se verá después, cuando se activó SP en columna de tripsina-sepharosa

y la SE recogida se inmovilizó sobre Enzacryl-AA, el I ME obtenido manifestó

muy distinto comportamiento que cuando se inmovilizó como proenzima, y el



-76-

Enzacryl-AA-IMP obtenido se activó luego por tratamiento con tripsina soluble.

5.2. RENDIMIENTOS DE INMOVILIZACIÓN DE PROTIROSINASA EN

ENZACRYL-AA.

Para el estudio del rendimiento de inmovilización y eficacia

de acoplamiento de protirosinasa en Enzacryl-AA, se siguió la misma sistemáti

ca que se aplicó con tirosinasa descrita en el cpi'tulo anterior, salvo que en

este caso, para la determinación de actividad de la proenzima soluble (SP¡ y

SPr) e inmovilizada (IMP), se trató previamente con tripsina soluble (Método:

12.1.3).

Se observó que la fracción de actividad sustraída de la di

solución de proenzima, fué mayor que la de protei'na unida al soporte, por

lo que la relación Act. sust./rp^ fué en todos los estados de purificación

utilizados superior a 1 (Tabla 9); esto, al igual que en la inmovilización de

enzima, se interpretó en función de una posible unión selectiva o de una i-

nactivación de la proenzima no unida al soporte. Además, la actividad sustraí

da de la disolución de proenzima (0,66 — 0,72) fué menor que lo obtenido

con enzima (0,98), lo que podría relacionarse con la menor densidad de resi

duos de tirosina en la superficie de la molécula de proenzima que de enzima.

La eficacia de acoplamiento de la protirosinasa fué muy in

ferior (0,30 — 0,36) a las obtenidas con enzima (0,88 — 0,75), lo que determinó

unos bajos valores de rendimiento de inmovilización y del proceso global de

purificación e inmovilización (r¡nmxrpur)- La razón r ¡ n m / r_ r o t fué inferior a 1

lo que indicó que la actividad específica de la proteína inmovilizada fuá infe

rior a la de la disolución de protirosinasa original, a diferencia de lo ocurrido

con la inmovilización de la enzima

Los menores valores de la eficacia de acoplamiento, determinados

por la baja actividad manisfestada por el gel-IMP, pueden asignarse a la resistencia



-77-

Tabla 9

Comparación de los rendimientos de inmovilización de protirosinasa y tirosinasa

en Enzacryl-AA.

Forma de fracción Act. sust. r . 'inm

enzima rprot Act. sust. r r ¡ n m r pur x rinm

prot rprot

IMP de

extracto P¡ 0,24 0,66 2,7 0,20 0,83 0,20

IMP de purificado CM/Phe 0,58 0,72 1,2 0,26 0,43 0,14

IME de extracto P¡ 0,45 0,98 2,2 0,86 1,90 0,86

IME de purificado CM/Phe 0,59 0,98 1,7 0,73 1,20 0,35

del IMP a adquirir la conformación más activa, como consecuencia de la ma

yor rigidez que le proporciona a la enzima la unión al soporte; asi' a pesar del

tratamiento con tripsina empleado para la medida de actividad del IMP, la acti

vidad manifestada por éste fué muy inferior a la obtenida cuando se activó an

tes la proenzima soluble y se inmovilizó después en forma de enzima activa.

Otra confirmación de que el Enzacryl-IMP no ha alcanzado

la conformación desplegada más activa, a pesar del tratamiento con tripsina, fué

el comportamiento de la actividad del IMP con la temperatura de ensayo y su

comparación con la del Enzacryl-AA-IME (Fig. 35). Con el Enzacryl-AA-IME, la

temperatura de máxima actividad, en las condiciones del método estándar, fué

de unos 25°C; por enzima de esta temperatura el IME manifestó menor activi

dad, indicando con ello una inactivación por la mayor agitación térmica. Sin em

bargo, a pesar de que la proenzima soluble es menos estable a la desnaturaliza

ción térmica (Galindo, 1976; Garci'a Carmona, 1980), la temperatura de máxima



-78-

actividad del IMP fué superior, próxima a 40 °C. Esto sugiere que la mayor a-

gitación térmica favorece cambios hacia conformaciones más desordenadas y des

plegadas que se aproximaron a la conformación más activa, mientras que el IME

que se encuentra en una conformación óptima, el aumento de temperatura con

duce a conformaciones menos activas.

=5 60

O)

E

c 1 o E

40 -

a < o > £ 20

ü <

20 40 60

TEMPERATURA ( °C )

Fig. 35. Comparación del efecto de la temperatura sobre

la actividad de Enzacryl-AA-IMP activado con tripsina r i

y de Enzacryl-AA-IMP.Actividad medida por la L-dopa formada en 10 minutos de ensayo.



-79-

5.3.- COMPORTAMIENTO CINÉTICO DEL ENZACRYL-AA-IMP.

Cuando se analizó el comportamiento cinético del derivado

Enzacryl-AA-IMP activado con tripsina soluble, la si'ntesis de L-dopa ocurrió sin

existencia de un periodo de retardo apreciable, y con un crecimiento lineal de

la concentración de L-dopa con el tiempo, dentro de los primeros 20 minutos

de reacción, para todas las concentraciones de L-tirosina utilizadas (Fig. 36).

Cuando se realizó la representación de la velocidad de reac

ción frente a la concentración de sustrato (Fig. 37), al igual que lo obtenido

con los Enzacryl-AA-IMe preparados con tirosinasa poco purificada (Cap. 4.3),

que puede asociarse a un aumento del valor de KM,, valor no determinado por

causa de la baja solubilidad de la L-tirosina y que se refleja en una menor afi-

0 5 10 15

TIEMPO DE REACCIÓN (min)

Fig. 36. Formación de L-dopa catalizada por Enzacryl-AA-

IMP activado con t-ipsina para diferentes concentra

ciones de sustrato L-tirosina. 4 mg de Enzacryl-AA-

IMP activado 15 min. con 0,5 mi tripsina (1 mg/ml)

5 mi disolución sustrato conteniendo ascorbato 2,5 mM.



-80-

o. |§ o> E c 1 "5 E

z o ü ü < LU

ce tu O O < Q ü O _l LU >

1,0 2,0

T I R O S I N A (mM)

Fig. 37. Cinética de primer orden del Enzacryl-AA-IMP tratado con

tripsina. Velocidad medida por la formación de L-dopa en

las condiciones de ensayo expresadas en la Fig. 36.

nidad de la proenzima activada por su sutrato L-tirosina.

Todos los derivados Enzacryl-AA-IMP obtenidos a con proen

zima a distintos estados de purificación manifestaron una cinética de primer or

den. Las constantes cinéticas obtenidas fueron similares entre sí, salvo la corres

pondiente a la proenzima purificada por CM-sephadex, y que correspondió con

el hecho de que la proenzima purificada por este método dio un mayor rendi

miento de purificación. La mayor actividad manifestada en esta caso por el IMP

no puede interpretarse sólo por el grado de pureza del proenzima, ya que con

proenzima más purificada (CM/Phe), se obtuvo un valor de K" inferior. Por lo

tanto, la diferencia pudo corresponder a que se eliminara un tipo de proteínas.



-81-

Tabla 10

Constantes cinéticas de primer orden del Enzacryl-AA-IMP

Proenzima

purificada

por

extracto P¡

extracto H20/P¡

purificado CM

purificada Phe

purificada CM/Phe

Un di'a de

K

(min"')

9,1

9,2

17,4

8,3

11,4

almacenamiento

K'

(min"'-lit-g"

11,4

11,5

21,8

10,4

14,2

')

30 dias de a

K

(min"1)

8,5

7,3

12,2

5,9

6,2

Imacenamiento

K'

(min*1 -lit-g"1)

10,6

9,1

15,3

7,4

7,8

Cuando se midieron las mismas constantes de velocidad des

pués de 30 di'as de almacenamiento (liofilizado, a — 30°C), se observó que ha-

bi'an disminui'do en todos los casos, manifestando una pérdida de actividad por

el almacenamiento. Esta pérdida fué máxima para el caso con proenzima más

purificado (CM/Phe) que perdió un 45 % de actividad. Sin embargo, en el caso

de proenzima menos purificada (P¡), las pérdidas fueron sólo de un 7 % (Ta

bla 10).

Como resumen de este capítulo, podemos afirmar que la in

movilización de protirosinasa en Enzacryl-AA provocó en la protei'na cambios

conformacionales en el sentido de un acercamiento hacia la forma activa de

la enzima, pero que los rendimientos de inmovilización fueron menores que

cuando se inmovilizó tirosinasa previamente activada con tripsina-sepharosa. Por

ésto, y por la pérdida de sus propiedades catalíticas con el almacenamiento, la

inmovilización de protirosinasa ofrecía pocas ventajas para aplicaciones posteriores.



6. ESTABILIDAD DE LOS DERIVADOS ENZACRYL-AA-IME,

ENZACRYL-AA-IMP y CPG-AA-IME.



-83-

6. ESTABILIDAD DE LOS DERIVADOS ENZACRYL-AA-IME, ENZACRYL-

-AA-IMP y CPG-AA-IME.

En el presente capi'tulo se pretenden analizar aquellas propie

dades de la tirosinasa inmovilizada en Enzacryl-AA y CPG-AA, relacionadas con

su capacidad de utilización durante largo tiempo. Asi', la estabilidad al almacena

miento, estabilidad de la reacción catali'tica, en función del tipo de reactor, esta

do de purificación de la enzima inmovilizada, condiciones de pH, temperatura,

fuerza iónica, etc.; al igual que otros factores que afecten especialmente al uso

del IME en reactores de columna, como la P Q , , la velocidad de flujo volumétri

co y la velocidad lineal, etc.

6.1. EL FENÓMENO DE LA INACTIVACIÓN DE LA TIROSINASA POR LA

ACTUACIÓN.

Es característico y conocido desde hace tiempo que las tiro-

sinasas de diversas fuentes sufren el fenómeno de su rápida inactivación con la

actuación con sus sustratos (Nelson y Dawson, 1944; Shimao, 1962; Horowitz

et al., 1970) y por lo tanto es la principal dificultad para su aplicación con f i

nes analíticos, terapéuticos o industriales (Wykes et al. 1971).

Se ha observado que la melanización produce un efecto de

inactivación de tirosinasa (Seiji y Fitzpatrick, 1960; Seiji y Fukuzawa, 1972) y

que la tirosinasa se une a la melanina formada como producto de oxidación de

L-dopa por la tirosinasa, con lo que la inactivación parece estar relacionada con

la propia melanización (Seiji y Miyazaki, 1971). Shimao et al. (1974), estudian

do el proceso de inactivación, dedujeron que la inactivación dependía de la con

centración de enzima presente y que la unión de los productos a la enzima no

parece jugar un papel importante en el mecanismo; y puesto que la unión co

nocida de las melaninas es posterior a ia reacción de inactivación de ésta, dedu

cen que la inactivación que la inactivación se debía a un bloqueo de los centros

activos de la enzima con los intermediarios quinoideos. De hecho Wood e Ingra-



-84-

ham (1965) observaron la incorporación de radioactividad a la protei'na cuando

emplearon 1- C-fenol como sustrato de tirosinasa de champiñón, habiendo su

gerido la posibilidad de que la nueva quinona formada pueda, antes de dejar el

centro activo, llevar una reacción de Mitchaell con un grupo amino libre de la

enzima, como se da en la ciclación de la dopaquinona formada para dar dopa-

cromo. Sin embargo Lerch (1978) no encontró incorporación de radioactividad

empleando C-fenol con tirosinasa de Neurospora crasa, mientras que sí detec

tó, por análisis de aminoácidos, la pérdida de un residuo de histidina que podrí-

a explicar la inactivación de la enzima; además especula que algún intermediario

generado en el ciclo catalítico pueda atacar al residuo de histidina.

Los diversos mecanismos cinéticos sugeridos (Ingraham, 1954,

1955; Laidler y Burting, 1973; Shimao et al. 1974), suponen la formación de

enzima inactiva a partir de un intermediario del proceso catalítico. Sin embargo,

no llegan a conclusiones reales, en unos casos por haber aplicado en el trata -

miento la suposición de un estado estacionario que en realidad no existió por

la inactivación de la enzima, o en otros por la dificultad de resolución de las

ecuaciones diferenciales planteadas.

En base al tratamiento matemático desarrollado por Varón

(1979) de la teoría de los compartimentos, García Carmona (1980) ha deduci

do los parámetros cinéticos del proceso de inactivación de la actividad tirosina

hidroxilasa de tirosinasa de epidermis de rana, según el esquema:

E +- S ^ = i ES > EP + P'

I I > E + Q (16)

E i

concluyendo que el fenómeno de inactivación se ajusta bien a una cinética de

primer orden, lo que apoyaría una inactivación a través de un intermediario,

dentro del concepto de enzima suicida (Abeles y Maycock, 1976), en que la i-

nactivación depende del número de veces que la enzima actúa y es indepen -



-85-

diente de la concentración de sustrato.

Los tiempos de semiinactivación (ty2)> obtenidos midiendo

la actividad tirosina hidroxilasa por el método radiometrico de Pomerantz (1964),

dio valores de 4 - 5 minutos (Garci'a Carmona, 1980), semejantes a los obteni

dos por nosotros siguiendo la formación de dopacromo, y del mismo orden que

los obtenidos para la actividad dopa oxidasa (Manjón, 1978). En presencia de

ascorbato, y midiendo la concentración de L-dopa formada a partir del sustrato

L-tirosina, durante estos tiempos de reacción e incluso superiores (unos 20 mir.

ñutos, observamos que la reacción transcurría sin pérdida apreciable de la activi

dad (Cap. 2.3), lo que también ha sido observado por García Carmona (1980)

midiendo por el método radiometrico, indicando que en presencia de ascorbato

el mecanismo puede discurrir por otro camino. El papel del ascorbato debe estar

relacionado con la eliminación rápida de algún intermediario que podría acelerar

su transformación a la forma inactiva (E¡). Por ello no hay que descartar, como

se ha comentado anteriormente, una interacción entre la enzima y ascorbato. Sin

embargo, aún en presencia de ascorbato hay una inactivación con t-^n del o r

den de 30 a 90 minutos, que aumentaron al disminuir la concentración de en

zima. Por otro lado, la inmovilización de tirosinasa de epidermis de rana en En-

zacryl-AA aumentó la estabilidad a la reacción de la actividad dopa oxidasa con

valores de t - j ^ de unos 150 minutos en reactores de columna (Iborra et a l . ,

1978). Esto demostró que en el proceso de inactivación existe algún efecto con-

formacional que es parcialmente impedido por la mayor rigidez de la estructura

de la enzima inmovilizada.

Así pues las causas de la inactivación de la tirosinasa por su

actuación no están totalmente aclaradas. En nuestro caso, las experiencias lleva

das a cabo se realizaron para encontrar condiciones óptimas de máxima estabili

dad a fin de abrir posibilidades de aplicación de la enzima tirosinasa y de en

contrar nuevos puntos de vista respecto al problema de su inactivación.



-86-

6.2. ESTABILIDAD AL ALMACENAMIENTO.

Para asegurar una aplicabilidad de una enzima inmovilizada

es necesario que posea una suficiente estabilidad al almacenamiento (Smiley y

Straridberg, 1972). La inmovilización de enzimas, por lo general, suele aumen

tar la estabilidad de éstas al almacenamiento, especialmente por acoplamiento co-

valente (Johnson, 1979; Klemes y Citri, 1979).

Para estudiar la estabilidad al almacenamiento de los derivados

Enzacryl-AA-IME, Enzacryl-AA-IMP y CPG-AA-IME, se almacenaron a — 30 °C

muestras liof¡tizadas, protegidas de la luz y con ambiente seco proporcionado

por gel de si'lice, y se midió la actividad tirosina hidroxilasa con el tiempo de

almacenamiento a porciones diferentes de derivado.

Se observó que el Enzacryl-AA-IME, durante 90 días de al

macenamiento conservó prácticamente inalterada su actividad, sin embargo con

IMP, en el mismo tiempo, perdió más del 50 % de actividad (Fig.38). La ma :

yor estabilidad de la tirosinasa inmovilizada como enzima activa que como pro

enzima, puede guardar relación con las interpretaciones dadas anteriormente res

pecto a la estabilidad conformacional de las dos formas de tirosinasa. Igualmente

el derivado CPG-AA-IME liofilizado mantuvo prácticamente inalterada su actividad

durante 30 di'as; una muestra almacenada durante 120 di'as conservó el 80 %

de la actividad.

Asi' pues, los derivados de enzima inmovilizada mantuvieron

suficiente estabilidad al almacenamiento como para que ésta no limitara su apli

cabilidad, no siendo asi' el derivado de proenzima; ni los extractos solubles de

proenzima que almacenados a 5 °C perdieron el 70 % de actividad, en 60 día?,

y con enzima, en las mismas condiciones, perdió el 50 % en 55 días. En las

demás experiencias de esta Memoria, dada la pérdida de actividad, los derivados

inmovilizados de proenzima, se utilizaron sólo dentro de 15 di'as desde su pre

paración.



-87-

100

¿ 7 5

RE

LATI

VA

8

< c >

> , - •

\ o

• T

' '

• Enzacryt-AA-IME

Enzscryl-AA-IMP

' « 30 60 90 120 160

T I E M P O DE A L M A C E N A M I E N T O ( d i n )

Fig. 38. Estabilidad al almacenamiento de Enzacryl-AA-IME e IMP.

Ensayos realizados con alícuotas tomadas de muestras lio-

füizadas y almacenadas en ambiente seco a — 30 °C.

6.3. ACTIVIDAD DE LOS REACTORES CON GEL-IME Y ESTABILIDAD DE

LA REACCIÓN A LARGO TIEMPO.

Cuando una enzima inmovilizada se emplea en un determina-

do reactor, para decidir si el sistema es utilizable para funcionamiento a largo

tiempo es necesario conocer las siguientes variables:

a) La actividad que el gel-IME manifiesta en las condiciones del reactor (Actp).

Esta va a depender de la naturaleza del gel-IME, del tipo de reactor y de las

condiciones de trabajo. Bajo las condiciones de un reactor determinado objeto

de estudio, la actividad manifestada por el IME puede variar notablemente res

pecto a la manifestada con el método o reactor estándar (Act |^ j^) . Por ello se

empleó el término actividad del reactor (Actp), entendida como la actividad ma

nifestada por gramo de gel-IME, en las condiciones del reactor en estudio. Como



-88-

la actividad del reactor vana con el tiempo de uso, el valor de Actp 0 se refie

re en principio, al momento de máxima actividad, que para los reactores STR

fué a tiempo inicial y para los reactores continuos (CSTR y PBCR), fué el va

lor máximo que se obteni'a una vez alcanzado el estado estacionario. El concep

to de Capacidad de reacción del reactor (Cp), empleado para describir la capa

cidad catalítica total de éste (Vieth y Venkatasubramanian, 1976), vendría dado

por: C R = m • ActR (17)

b) La estabilidad de la reacción a tiempo largo. Para su determinación se empló como

criterio el tiempo de semiinactivación (t-j/?)' definido como el tiempo transcurri

do para disminuir la Actp hasta la mitad de su valor máximo.

En las Figs. 39, 40 y 41 se indican ejemplos del comporta

miento del Enzacryl-AA-IME a largo tiempo en reactores de baño agitado (STR),

en reactores de baño agitado continuo (CSTR) y en columna empaquetada (PBCR),

Fig. 39

Comportamiento del Enzacryl-AA-

IME a largo tiempo en reactor

de baño agitado (STR). Se repre

senta concentración de L-dopa a-

cumulada en el reactor con el

tiempo, para las condiciones de

p (Unidades estándar de gel-IME

por litro de disolución sustrato

procesada) que se indican.



-89-

T I E M P O ( hr )

40. Comportamiento del Enzacryl-AA-IME a lo largo del tiempo en reactor continuo de baño agitado (CSTR). m = 4 mg de gel-IME de Act||YjE = 45 mU/mg gel a las velocidades de flujo (Q) indicadas en cada caso.

T I E M P O

41. Comportamiento del Enzacryl-AA-IME a largo tiempo enreactor

de columna empaquetada (PBCR). m = 4 mg de gel-IME de A c t ^

Act|Mp.=-45 mU/mg gel, para las condiciones de velocidad de flu

jo indicadas.



-90-

respectivamente. Para poder estudiar de forma comparable la actividad y estabi

lidad de los derivados inmovilizados en los distintos reactores, se ensayó la ac

tividad en condiciones idénticas, no sólo de los factores ambientales (pH, T, PQ?>

concentraciones, etc.), sino también respecto al valor del parámetro p del reactor,

definido como la cantidad de enzima inovilizada, expresada en unidades estándar

de actividad, utilizada por unidad de volumen total de sustrato procesado a lo

largo da la vida de uso del reactor, y que se calculó por:

p=ME_ = m

vA c t I M E ( u / l ) ( 1 8 )

siendo V§ el volumen de sustrato procesado en el tiempo total de uso del

reactor ( t j ) .

Para un reactor dei tipo STR:

Vg = V p (volumen del reactor) (19)

Para reactores continuos:

V s = Q t T (20)

En reactores STR, t j se tomó como el tiempo necesario para consumir la activi

dad del gel-IME, y en reactores de flujo como el tiempo que tardó la Actp en

reducirse al 10-20 7ode su valor inicial (valor residual límite).

Como se observa en las citadas Figs. 43-45, el parámetro del

reactor, p, condiciona la actividad del gel-IME en los distintos reactores, o bien

directamente o a través del valor de la velocidad de flujo Q.

En la Tabla 11 se compara la actividad manifestada (Actp)

y la estabilidad a la reacción (t<|/«), de los reactores STR, CSTR y PBCR en

igualdad de condiciones respecto a p. Con ello, las diferencias observadas para

un mismo reactor, dependerán fundamentalmente del tipo de soporte y para

un mismo soporte, del t ipo de reactor. En STR la actividad manifestada por

los derivados inmovilizados varió bajo las mismas proporciones que los valores

de r ¡ n m ; este paralelismo respondió a que en el método estándar de medida

de actividad del gel-IME (Método: 12.8.2), empleado para determinar r ¡ n m el en

sayo se realiza en un reactor de baño agitado, aunque bajo otras condiciones.



-91-

Tabla 11

Actividad (Actp ) y estabilidad (t-\/7) de los derivados IME en varios reactores.

Proenzima o enzima inmovilizada a partir de un extracto l-Ô/Pj.

Forma

de

enzima

SE

Enzacryl-AA-IMP

Enzacryl-AA-IME

CPG-AA-IME

rinm <«>

—

0,26

0,72

0,41

Act R o (U/g gel)

STR

—

18

45

25

(¡i),

CSTR

—

14

40

22

(üi)

PBCR (iv)

—

4

10

18

h/2

STR

0,7

1,5

4,2

6,0

(h)

(üi)

CSTR

—

—

6,5

—

PBCR (iv)

—

5,7

12,0

16,0

(i) Actividades medidas en las condiciones de los métodos estándares (Métodos: 12.8.1. y 12.8.2.), habiéndose preparado el IME (P) son SE/m=50 U/g soporte

(ii) Actividad máxima inicial manifestada por el reactor (üi) Valores obtenidos para condiciones de parámetro del reactor p= 2 U/1 (iv) Con disolución sustrato saturada con aire.

En PBCR el Enzacryl-AA-IME y el Enzacryl-AA-IMP manifes

taron mucha menos actividad que en STR, siendo la razón ActpgQp/ActgjR

de 0,22 para Enzacryl-AA-IME y para Enzacryl-AA-IMP, mientras que con el soporte

de vidrio poroso, el CPG-AA-IME, esa razón fué de 0,72, indicando que este caso la

capacidad de reacción del derivado en el PBCR es más cercana al STR, que en

el caso del Enzacryl-AA-IME

La menor actividad manifestada en PBCR que en STR se in

terpretó en función de las limitaciones inherentes al reactor en estudio:

a) Deficiencia de oxígeno, que sólo es aportado a la columna por el disuelto

en la propia disolución sustrato que abastece al reactor; el consumo de oxigeno

está potenciado por la presencia de ascorbato, como se indicó anteriormente. La

influencia de esta limitación estuvo minimizada en los reactores de baño STR y



-92-

CSTR, pues la agitación restituía el oxi'geno consumido a partir del aire burbujea

do en la disolución (Van suijdam et al. 1978).

b) Limitaciones por difusión de los sustratos , determinadas por el grado de em

paquetamiento de la columna y de la mínima agitación de la disolución, sólo

debida a la velocidad de circulación del fluido. Esta limitación fué menor en CP

CPG-AA-IME, gracias a la mayor porosidad del soporte; en este caso la limitación

más significativa fué la del oxi'geno, con lo cual la actividad manifestada en

PBCR, aún no llegando a la alcanzada en STR (72 % ) , se acercó más que en

el caso del soporte de poliacrilamida.

Como también se observa en la Tabla 11 , la estabilidad de

la reacción y por lo tanto la vida de uso del reactor, también varió notable

mente con la forma de tirosinasa, el tipo de soporte y el tipo de reactor. La

estabilidad a la reacción en reactores STR, medida por los t - j /_ , fué en todos

los casos mayor para la tirosinasa inmovilizada que soluble (0,7 h), mayor cuan

do se inmovilizó como enzima activa que proenzima (4,2 y 1,5 en Enzacryl-AA),

y algo mayor con CPG-AA como soporte que con Enzacryl-AA (6 y 4,2 h).

La estabilidad a la reacción de los derivados I ME mejoró en reactores CSTR y

fué máxima en ensayos utilizando el reactor PBCR, alcanzando valores de hasta

19 horas y conservando en algunos casos el 30 %de actividad después de 30

horas de funcionamiento continuo de reactor de columna.

La mayor estabilidad de los derivados inmovilizados en PBCR

respecto a STR y CSTR, se interpretó en función de los siguientes factores:

a) Menores efectos de inhibición por la acumulación del producto L-dopa, cuya

concentración forma un gradiente a lo largo del reactor y es asi' elui'do de es

te, mientras que en los reactores de baño, especialmente en CSTR , su acumu

lación provocó una disminución de la actividad manifestada por el reactor. En la

Fig. 42 puede apreciarse el efecto inhibidor de la Actp de concentraciones ini

ciales de L-dopa añadidas al reactor, con la correspondiente pérdida de la pro

ductividad del mismo. En un reactor de baño discontinuo, el producto L-dopa

permanece en el reactor, aumentando su concentración con el tiempo y por lo



III

~S

O)

< >

I

40

30

O 20 <

10

0

-93-

0)

a o •o

o E E

- 4 = Z O o ü O o ce

0 0,2 0,4 L-DOPA INICIAL (mM)

Fig. 42. Efecto de la concentración de L-dopa añadida sobre la acti

vidad inicial y sobre la producción en STR.

t T = 12 horas; p = 1,7 U/1

I

tanto su efecto inhibidor es creciente a lo largo del tiempo de uso del reactor

y será más notorio cuanto mayor sea la actividad enzimática que se aplique al

reactor; esto sen'a una razonable explicación de la rápida pérdida de actividad

en STR por el uso dando menores t-j/2 °.ue los demás tipos de reactores. En

el reactor de baño continuo CSTR, el producto es eliminado continuamente, por

lo que no se produciría alta acumulación de L-dopa y asi' la velocidad de inacti

tivación fué menor que en STR, pero por otro lado, dada la agitación del CSTR,

en todo el espacio del reactor actuaba el efecto inhibidor de una concentración

de L-dopa igual a la de salida limitando la Actp desde los momentos iniciales.

En PBCR se establece un gradiente de concentración de L-dopa, de forma que

sólo en las últimas capas del lecho de gel-IME sufrían los efectos de una con

centración igual a la de salida. Asi' pues, los valores de t - j ^ observados experi-

mentalmente, no corresponden exactamente a la inactivación de la enzima, sino



-94-

que interviene además la inhibición competitiva provocada por la acumulación

de producto, deteniendo la reacción enzimática, especialmente en los reactores

de baño.

b) Ausencia de turbulencia que puede provocar efector de desnaturalización

en los reactores de baño agitado y que es mi'nima en PBCR.

c) La menor actividad manifestada en PBCR, determina que también son proba

blemente menores los fenómenos de inactivación por reacciones secundarias pro

pias de la actuación de la enzima. Esta afirmación adquiere coherencia si se ad

mite que el mecanismo de inactivación de la enzima parte de un intermediario

del ciclo catali'tico, con lo que la velocidad de inactivación dependen'a del nú

mero de veces que la enzima es utilizada, por unidad de tiempo, para el proce

so catalítico, y de la probabilidad de que el mecanismo se desvi'e hacia la reac

ción de inactivación. De hecho, es significativo que los valores de t - ] ^ son me

nores en los reactores en que la enzima manifiesta más su actividad. Así en los

reactores de baño, dado que el IME manifiesta mayor actividad que en los reac

tores de columna, conllevarán en general una mayor producción de L-dopa a lo

largo de su vida de uso, a pesar de sus bajos valores de t^/2 •

6.4. INFLUENCIA DE VARIOS FACTORES SOBRE LA ESTABILIDAD Y

ACTIVIDAD DEL IME.

6.4.1. EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA Y DEL pH

La influencia del pH y de la fuerza iónica del medio sobre

la vida de uso del IME y su productividad, se estudió determinando t-j/2 y 'a

producción de L-dopa en un reactor de columna empaquetada.

Las variaciones de la fuerza iónica se suministraron con con

centraciones de tampón fosfato comprendida entre 0,02 y 0,50 M (Tabla 12).

En este intervalo no se observó una variación definida de los valores de t-j/2

con la fuerza iónica, sin embargo la productividad disminuyó ligeramente con el



-95-

Tabla 12

Efecto de la fuerza iónica sobre la estabilidad a la reacción y productividad

Reactor PBCR, 2 mg de gel-IME, Q = 7,5 m i /h .

Fosfato

(M)

0,02

0,05

0,10

0,15

0,20

0,50

*1/2

. (h)

10,0

8,5

9,5

9,5

9,0

8,8

Producción de L-dopa

en 12 h. (yii moles)

7,0

7,0

6,5

6,5

5,7

5,5

Tabla 13

Efecto del pH sobre la estabilidad a la reacción y productividad de Enzacryl-AA-IME

Reactor PBCR, 2 mg gel-IME, Q = 7,5 ml/h.

pH t ' i / 0 Producción de L-dopa

en 12 h. (/timóles)

6,0 8,0 5,1

6,5 9,5 7,9

7,0 11,5 8,0

7,5 12,5 7,5

8,0 9,5 6,1

*1/2

( h )

8,0

9,5

11,5

12,5

9,5



-96-

aumento de la concentración de fosfato, en consonancia con lo observado ante

riormente en el efecto de la fuerza iónica sobre la actividad del IME (Cap. 4.3).

Las variaciones del pH comprendidas entre 6,0 y 8,0 suminis

tradas con tampón fosfato 0,1 M, tampoco produjeron drásticas variaciones en

los valores de t^ /^ , que fueron máximos para pH 7 — 7,5. La productividad tam

bién fué máxima a estos valores de pH, disminuyendo notablemente para pH in

ferior a 6,5 y superior a 7,5, como consecuencia de la pérdida de actividad en

estas condiciones de pH (Cap. 4.3), tal como puede apreciarse en la Tabla 13.

Asi' pues de estos factores, especialmente el pH es el que

puede afectar en mayor grado a la actividad y por lo tanto a la productividad

del IME, mientras que la vida de uso del IME se altera sólo ligeramente dentro

de los márgenes de fuerza iónica y pH ensayados.

6.4.2. EFECTO DE LA TEMPERATURA

La actividad manifestada por el IME frente a temperatura, me

medida por el método estándar alcanzó un máximo a 25 °C (Cap. 5.2). Dicho

método estándar está referido en términos de velocidad inicial, en el que se em

plean tiempos cortos de reacción y con reactor en condiciones de alto valor del

parámetro p. .Para tiempos largos de reacción y con reactores de valores bajos de

p (volumen grande de disolución sustrato procesada), el efecto de la temperatu

ra sobre la estabilidad y actividad del Enzacryl-AA puede apreciarse en las ex

periencias representadas en la Fig. 43, para reactores STR y PBCR.

Se observó que en STR un aumento de la temperatura por

enzima de 20 °C fué en detrimento de la producción total. Asi' por ejemplo a

37 °C, temperatura que dio aproximadamente la misma actividad estándar que

a 20 °C condujo en STR a un comportamiento diferente; durante las primeras

horas de funcionamiento mostró algo más de actividad a 37 °C, pero a las 2 h

perdi'a rápidamente actividad y a las 3 h la producción de L-dopa estaba deteni

da, mientras que a 20 °C necesitó unas 7 h para la pérdida total de actividad,



-97-

0 4 8 12 16

T I E M P O ( h )

Fig. 43. Efecto de la temperatura sobre el comportamiento

a largo tiempo de Enzacryl-AA-IME en STR y PBCR.

m = 4mggel-IME; V s = 50 míen STR; Q = 5 ml/h

en PBCR.

consiguiendo aproximadamente el doble de producción que a 37 °C. La mayor

actividad a 37 °C durante las 2 primeras horas, puede interpretarse por las mi

mismas razones que determinan la Ley de Arrenhius (mayores energías de coli

sión y más rápida disusión de sustratos y productos}, y la rápida inactivación

posterior por desnaturalización térmica.

Sin embargo, en PBCR a lo largo de 15 horas de funciona

miento, a 20 °C manifestó aproximadamente un 30 ^ menos de actividad que

a 37 °C, lo que debe estar realcionado con los fenómenos de difusión, dado

que es uno de los factores limitantes del Enzacryl-AA-IME en PBCR. Por enzi

ma de 45 °C no mostró prácticamente actividad, tanto en STR como en PBCR.

después de 30 minutos de funcionamiento.

El comportamiento con la temperatura de la tirosinasa inmo-



-98-

vilizada indicó que una temperatura comprendida entre 18 y 25 C es una tem

peratura idónea para su utilización en STR y de 20 a 37 °C en PBCR, siendo

25 °C la temperatura que normalmente se empleó para ambos tipos de reactores

6.4.3. EFECTO DEL ASCORBATO E HIDRACINA

El uso de hidracina como reductor para prevenir la oxidación

de L-dopa, provocó un ligero aumento de la producción de L-dopa, conrespecto

al uso de ascorbato, tanto en reactor de baño como de columna (Fig. 44).

No obstante a lo largo del presente trabajo se ha seguido utilizando el ascorr

bato como agente reductor. Por otro lado, concentraciones de ascorbato entre

1 y 10 mM no mostraron diferencias significativas sobre la actividad inicial ni

12

LU 8

"33 D>

o> o E 4 E

< a. O O

•

0 4 8 12 16

T I E M P O (h)

Fig. 44. Comportamiento a largo tiempo del Enzacryl-AA-IME

en presencia de ascorbato y de hidracina como re

ductor. m = 4 mg gel-IME; V s = 50 mi en STR; Q =

5,2 ml/h en PBCR.



-99-

.C _

2 CM , 3 "

II

15

10

5

0

•

-

o

« i _

o

í

1

"

»

O

•

» 4 6 8

A S C O R B A T O ( mM )

10

Fig. 45. Efecto de la concentración de ascorbato sobre la

actividad y estabilidad del Enzacryl-AA-IME.

Reactor PBCR; m = 2 mg gel-IME; Q = 5,0 ml/h

sobre la estabilidad de la reacción. Asi' por ejemplo , en PBCR el Enzacryl-

-AA-IME mostró valores de t - j / 2 muy semejantes (Fig. 45), por lo que no se

apreciaron diferencias notables en la productividad del reactor. Asi' pues la

concentración de ascorbato no resultó un factor determinante de la producti

vidad de los reactores, siendo sólo necesaria la precaución de que la concen

tración del ascorbato sea lo suficiente alta para que en el tiempo de residen

cia de la disolución sustrato en el reactor, el ascorbato no sea consumido to

talmente, pues en ese momento empezaría a darse la oxidación de L-dopa a

dopacromo (Cap. 4.5).



-100-

6.5. FACTORES QUE AFECTAN ESPECIALMENTE A REACTORES DE

COLUMNA EMPAQUETADA.

6.5.1. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE OXIGENO.

La velocidad de consumo de oxigeno que se da en las reac

ciones catalizadas por la tirosinasa en presencia de ascorbato (Cap. 4.5), sugirió

que una de las razones de la menor productividad del PBCR respecto al STR,

podn'a ser una deficiencia del oxígeno necesario para la reacción. En STR éste

problema no existió dado que el oxígeno consumido por la reacción era repues

to por nuevo oxígeno atmosférico burbujeado y que se disolvió gracias a la a-

gitación. En PBCR el único oxígeno disponible fué el aportado por la disolución

que abastece al reactor.

Que la concentración de oxígeno era un factor limitante de

la productividad del PBCR se demostró al sustituir una disolución sustrato satu

rada por burbujeo con aire atmosférico ( P Q 9 0-21 atm) por una disolución sa

turada con oxígeno (Fig. 46) La concentración de L-dopa en el eluído, y por

tanto la productividad del PBCR, aumentó notablemente al introducir la disolu

ción saturada de oxígeno, y disminuyó de nuevo al utilizar la disolución original

saturada de aire.

Se comparó la productividad de dos reactores PBCR, uno ali

mentado con disolución saturada con oxígeno y otro con aire (Fig. 47). Cuando

el flujo fué suficientemente alto y por lo tanto el tiempo de residencia pequeño

( tpiu 0,48 min.mg gel), hubo poca diferencia en la productividad de ambos

reactores, lo que indicó que en estas condiciones, la disolución saturada de aire

suministró casi todo el oxígeno que requería el reactor. Sin embargo a flujos

lentos, en el tiempo de residencia del sustrato en el reactor, el oxígeno de la

disolución saturada con aire no fué suficiente para abastecer el necesario en la

reacción; con ello la deficiencia de oxígeno limitó notablemente la actividad ma

nifestada por el I ME en el reactor. Así en el ejemplo de la Fig. 47 a Q 4 ml/h

con un tp|y| de 1,8 min-mg gel, la actividad inicial del reactor con disolución

saturada de oxígeno fué 2,6 veces que con saturación por aire.



-101-

Fig. 46. Efecto de la concentración de oxígeno en la actividad de un

reactor de columna. m = 4 mg gel-IME; Q = 7 ml/h. Las fle

chas indican el momento en que se inicia el suministro de

disolución sustrato saturada de oi'geno ó aire.

Fig. 47.

Influencia del oxígeno en

un reactor PBCR, en rela

ción con la velocidad de

flujo (Q).

m = 4 mg Enzacryl-AA-IME

10 15

T I E M P O (h)



-102-

6.5.2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO (L-TIROSINA).

Ya se ha indicado (Cap. 5.1.) que la interacción de la L-tiro-

sina con la protirosinasa provocaba tanto de la forma soluble como del deriva

do IMP. Si el derivado favoreció el paso a la conformación activa, también po

dría ser que las variaciones en la concentración del sustrato modificaran la esta

bilidad del IME en el mismo sentido. Para ello se realizaron determinaciones de

*1/? y c 'e ^ c t R e n P^CR, para concentraciones de L-tirosina comprendidas

entre 0,25 y 2,5 mM.

La estabilidad a la reacción, medida por los tiempos de semi-

inactivación, disminuyó con la concentración de L-tirosina, en contraposición al

hecho de que el sustrato pudiera estabilizar la conformación de la proteína en

su forma activa (Fig. 48). La actividad máxima inicial, sí aimentó con la con-

I I o <

I 0,5 1,0 1,5 2,0

L - T I R O S I N A ( m M )

ce z

[•2 e i

8 -c a.

- 1 -

LO _

Fig. 48. Efecto de la concentración de sustrato L-tirosina sobre

la actividad, estabilidad y producción de L-dopa en

PBCR.

m = 4 mg gel-IME; Q = 5ml /h .



-103-

centración de sustrato y como consecuencia la producción de L-dopa. La actividad

del IME medida por el método estándar, en STR, dio una respuesta casi lineal con

la concentración de sustrato y con el empleo de enzima purificada dio K^ de

2,7 mM. Sin embargo en estos ensayos en PBCR la actividad aumentó con la

concentración de sustrato con tendencia a la saturación al aumentar la concen

tración del sustrato. Una representación de Lineweaver-Burk de éstos valores

dio un valor de K^ de 0,47 mM, , lo que da un valor de 5,7 para la rela

ción K|y|(PBCR)/K|y|(STR), que al estar muy alejado del valor 1,0, normalmente

se considera indicativo de existencia de limitaciones difusionales en el reactor

PBCR (Ngo et al. 1979). Pero en nuestro caso la saturación de la actividad

con la concentración del sustrato observada, también puede interpretarse tenien

do en cuanta que al aumentar la actividad con la concentración de sustrato, au

mentó no solo la velocidad de síntesis de L-dopa, sino también la velocidad de

consumo de oxi'geno; asi' se llega a situación de deficiencia de oxi'geno que limi

ta la actividad manifestada por el IME en PBCR, aparte de los efectos de limi

taciones por difusión. Desde esta punto de vista pierde sentido real los valores

de K^ calculados para este sistema.

A pesar de que los valores de t* /_ disminuyeron con la con

centración de sustrato, dado que aumentó la actividad manifestada por el IME,

la producción de L-dopa a lo largo de 18 foras de uso continuo del reactor au

mentó con la concentración de sustrato; este aumento fué pequeño por enzima

de S 1 mM. Este comportamiento sugirió que la disminución de estabilidad a

la reacción y por lo tanto los valores de t - j / ^ , no fué consecuencia de un efec

to inestabilizador del sustrato; más bien parece haber una realación entre la acti

vidad manifestada por el IME y la inactivación por el uso, de forma que a una

velocidad alta de la reacción catalizada por el IME, le correspondió una mayor

velocidad de inactivación. Esto equivale a afirmar que la inactivación no depen

dió sólo del tiempo de uso del IME, sino también del número de veces que ca

da centro activo ha sido utilizado. Esto sería coherente con el mecanismo de i-

nactivación en el cual un intermediario del proceso catalítico iniciase una reac

ción secundaria de inactivación, tal como se ha descrito anteriormente (Sec. 6.1),

y que tiene una determinada probabilidad de ocurrir cada vez que una molécula



-104-

de sustrato es transformada en producto.

6.5.3. EFECTO DE LA VELOCIDAD DE FLUJO VOLUMÉTRICO (Q) Y DE

LA VELOCIDAD LINEAL (u).

La velocidad de flujo volumétrico puede afectar al comporta

miento del IME en PBCR en base a que éste determina dos variables:

1) La velocidad de suministro de sustratos, especialmente el oxígeno, lo que pue

de limitar la Actp si Q no es lo suficiente elevado para para suministrar la de

manda de oxígeno de la reacción. El efecto de la concentración de oxígeno ya

ha sido analizada anteriormente en relación con Q (Secc. 6.5.1.).

2) La velocidad lineal (u , cm/h) de avance del fluido (calculada por u=Q/A,sien

do A la superficie transversal de la columna) puede afectar a los fenómenos de

difusión interna y externa. Para analizar la importancia de este factor, se deter

minó la actividad, estabilidad y producción de L-dopa, en reactores PBCR, bajo

condiciones en las que la velocidad lineal fuera la única variable del sistema. Pa

ra ello, se tomaron varios reactores de columna que poseían distintas dimensio

nes de altura y diámetro (Fig.49-A), en los que se empaquetó la misma cantidad

de gel-IME (4 mg) y por lo tanto el mismo volumen de lecho (30 mm ), y

fueron alimentados con disolución sustrato a la misma velocidad de flujo volumé

trico (Q = 6 ml/h), de forma que los reactores estuvieran en las mismas condicio

nes respecto a los distintos parámetros determinantes del reactor (Vp, Q, tpjyj,

p, q, etc.), pero a una velocidad lineal diferente en cada reactor.. Este tipo de

experiencias han sido sugeridas (Pitcher, 1975), como método sencillo y práctico

de demostrar la existencia de problemas difusionales; de forma que si la activi

dad del IME aumenta con u corresponde a la existencia de limitaciones por di

fusión.

La actividad máxima inicial manifestada por el reactor y la

producción de L-dopa aumentó con la velocidad lineal (Fig.49-B), lo que demos

tró que en PBCR la difusión de los sustratos fué uno de los factores que limi-



-105-

0 = 2 mm 3 mm 6 mm 10 mm

Fig.49-A.. Dimensiones relativas de reactores en columna con

lecho empaquetado, Formas cih'ndricas. Se represen

ta una sección longitudinal.

IZZZ3 lecho de gel-IME

O)

!

H1 ? i

3 ~4 5 6 7 8 910 M

VELOCIDAD LINEAL (cm/h)

Fig. 49-B. Efecto de la velocidad lineal en PBCR .

m = 4 mg Enzacryl-AA-IME; Q = 6 ml/h

Ensayos en reactores con dimensiones va

riables (Fig. 49).



-106-

taron la acitividad del IME. Asi' pues, respecto a la productividad del reactor,

resultó más ventajoso utilizar un reactor PBCR con una altura mucho mayor

que el diámetro, aunque dichas columnas tienen el inconveniente de que requie

ren altas presiones para mantener el flujo del fluido de alimentación.

En general, el aumento de Q proporcionó condiciones que fa-

favorecieron a una mayor capacidad de reacción del reactor y por lo tanto una

mayor cantidad de producto formado en un determinado tiempo, sin embargo

el volumen de sustrato procesado fué mucho mayor y el producto formado que

dó con menor concentración de L-dopa. En la Tabla 14 se dan los resultados

experimentales obtenidos en el efecto de Q sobre el comportamiento del IME

en PBCR. Se observó que efectivamente, la actividad inicial del reactor (Actpl

aumentó con Q, pero por otro lado, disminuyó la estabilidad a la reacción, lo

que pudo apreciarse por los valores de t-|/_ que disminuyeron de 13,5 a 5 ho

ras al aumentar Q de 2,9 a 70 ml/h; sin embargo el aumento de la Actp fué

suficiente para compensar sobradamente la pérdida de actividad ocasionada, con

lo que la producción finalmente obtenida en 15 horas de funcionamiento con

tinuo (Pr-j-) fué 4 veces superior con Q 70 ml/h que a 2,9 ml/h, pero con el

inconveniento de que a valores altos de Q el producto obtenido se recogió en

un volumen mayor y por lo tanto con bajo factor de conversión medio (X=

L-dopa formada/L-tirosina inicial), según puede apreciarse en la misma Tabla 14.

Que los valores de t-|/£ disminuyeran al aumentar Q podría

atribuirse a:

a) Mayores efectos mecánicos sobre la enzima, dado que al aumentar Q , aumen

ta la velocidad lineal del fluido con la mayor probabilidad de inactivación por

turbulancia, arrastre de subunidades, eliminación de cobre, etc.

b) Más inactivación por un mayor uso, dado que al aumentar Q aumenta la

Actp , favoreciendo la posibilidad de las reacciones secundarias que parten del

intermediarios del ciclo catalítico, según el mecanismo de inactivación que se ha

descrito anteriormente.



-107-

Tabla 14

Efecto de la velocidad de flujo (Q), sobre el comportamiento del IME en PBCR

m = 4 mg Enzacryl-AA-IME de 45 U/mg. Columna de 3 mm de diámetro.

Q

(ml/h)

Acto «o

(mU/mg gel)

l1/2

( h )

PrT en 15 h. X

(mg dopa/mg gel) ' ' ° '

2,9

5,0

13,2

70,0

7,2

9,2

17,6

46,7

13,5

10,0

8,5

5,0

0,68

0,98

1,6

2,6

6,2

5,2

3,2

1,0

6.6. COMPARACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON OTROS IN

TENTOS DE ESTABILIZACIÓN DE TIROSINASA POR INMOVILIZA

CIÓN.

Al comparar lor resultados obtenidos con otros intentos ante

riores de estabilizar la actividad de tirosinasas, cabe destacar que se ha consegui

do mayor estabilidad de la enzima al almacenamiento y a su utilización conti

nuada, acompañado de mayores rendimientos de inmovilización.

Asi' Wykes et al. (1971) inmovilizó tirosinasa de champiñón

sobre DEAE-celulosa activada con 2,4-dicloro-6-amino-S-triazina, a fin de estabili

zar la actividad tirosina hidroxilasa, que midió por la formación de L-dopa en

presencia de ascorbato. El derivado inmovilizado que obtuvo perdió el 20 % de

actividad después de un di'a de almacenamiento a 15 °C. En cuanto a la estabi

lidad a la actuación sólo menciona que en 24 horas en un reactor de flujo, ha-

bi'a perdido el 75 % de la actividad trabajando a baja temperatura (15 °C) y



-108-

con sustrato L-tirosina a concentración por debajo de la saturación (1,6 mM),

condiciones en las cuales la estabilidad lograda se hizo a consta de infrautilizar

la actividad de la enzima; además no menciona los rendimientos de inmoviliza

ción alcanzados. Por otro lado, el trabajo de estos autores representa la prime

ra sugerencia de la aplicación de la tirosinasa inmovilizada a la si'ntesis de L-do

pa.

El otro intento significativo es el de Letts y Chase (1974)

que inmovilizaron tirosinasa de champiñón por atrapamiento en membranas. De

los resultados que publicaron puede deducirse que la oclusión de la enzima en

las membranas de colágeno, se consiguó con una eficacia de coplamiento del

12,4 % lo que condujo rendimientos de inmovilización muy bajos, de 0,7 a

3,1 % según se ensayase en reactor de flujo ó de baño. La estabilidad lograda

aumentó respecto a la enzima soluble, Dero sólo hasta valores de t-¡/2 de unas

2-3 horas; la modificación por entrecruzamiento con adipimidato aumento los

tiempos de semiinactivación a 3-4 horas, y con gíutaraldehido a unas 8-10 horas,

pero en este caso con una pérdida de actividad por la modificación del 70 % .

Asi' la estabilización lograda de la tirosinasa no logró compensar los bajos rendi

mientos de inmovilización, de cara -a su utilización para la producción de L-dopa.

Schiller et al. (1976) y Schiller y Liu (1978), al inmovilizar

tirosinasa de champiñón por atrapamiento en gel de poliacrilamida para usos ana

líticos, obtuvieron un derivado IME que perdi'a el 53 % de la actividad en 19

días de almacenamiento, y del que no especifican eficacia de acoplamiento ni

el rendimiento de inmovilización alcanzado. No estudiaron la estabilidad al uso

continuo, pero perdió el 40 % de la actividad después de utilizarse en 4 en

sayos repetidos discontinuos de 15 minutos cada uno.

Madhosing y Sundberd (1974) mencionan la inmovilización de

tirosinasa sobre agarosa activada con BrCN, para su utilización como soporte de

cromatografía de afinidad para detectar proteínas inhibidoras de tirosinasa en

champiñón, pero no mencionan la actividad ni la estabilidad del derivado de t i -

rosina-agarosa obtenido.



-109-

En nuestro caso, habiendo obtenido con tirosinasa de epider

mis de rana, derivados inmovilizados con altos rendimientos de inmovilización,

de hasta 90 % , que implica un alto aprovechamiento de la actividad del IME

respecto a la del SE en reactores de baño, y una estabilidad que proporciona

valores de t-|/_ próximos a 20 horas en reactores de flujo, podemos considerar

que se ha dado un paso adelante en las posibilidades de aplicación de tirosinasa

inmovilizada a procesos industriales y a usos anah'ticos.



7. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES DE TIROSINASA EN

GELES DE NYLON MODIFICADO.



-110-

7. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES DE TIROSINASA EN GELES DE

NYLON MODIFICADO.

Tirosinasa purificada y activada con tripsina-sepharosa, se in

movilizó sobre geles de nylon modificado aplicando los métodos descritos ante

riormente (Cap. 3). De la comparación de los rendimientos de inmovilización ob

tenidos y del comportamiento de los derivados IME en reactores de baño y de

columna, se seleccionaron aquellos que condujeron a mejores resultados; de éstos,

se estudiaron algunas propiedades caracten'sticas, como perfil pH-actividad, cinéti

ca, estabilidad al almacenamiento, efecto de la cantidad de protei'na, etc.. Todo

ello con vistas a las aplicaciones que se describen en los Capi'tulos 8 a 10.

7.1. RENDIMIENTOS DE INMOVILIZACIÓN.

Para estudiar los rendimientos de inmovilización, se trató ca

da derivado modificado de nylon con una determinada cantidad de disolución

de enzima, y se analizó el comportamiento frente a la inmovilización con la mis

ma sistemática utilizada para el estudio del Enzacryl-AA-IME.

Se observó que, en general, el rendimiento de protema unida

al gel fué menor que el de actividad manifestada por el gel-IME (Tabla 15). Es

te hecho determinó que la actividad específica del IME respecto a protema au

mentara respecto a la de la enzima soluble en un factor que vino dado por el

valor de la relación ' , ¡ n m / rD ro t * ' ° c ' u e û e esPec¡a 'mente notorio en el deriva

do NB-glut-IME que manifestó el 110 °/o de la actividad de la enzima soluble,

mientras que sólo se unió el 35 % de la protema nativa. Esto significó que la

unión de la enzima al soporte produjo una activación de ésta, de forma semejan

te a lo observado anteriormente con Enzacryl-AA.

El derivado NPAA-IME se obtuvo por las mismas reacciones

de acoplamiento que para el Enzacryl-AA-IME y proporciona igualmente un mi-



-111-

Tabla 15

Rendimientos de inmovilización en geles de nylon-6 modificado.

Disolución de enzima utilizada: 0,181 U/ml; act. esp. 4,89 U/mg de protei'na.

Cantidad de enzima tratada: SEj/m = 10 U/g de gel

derivado

gel-IME

NH-IME

NAQA-IME

NPI-acético-IME

NPI-IME

NPAA-IME

NB-glut-IME

NB-nitroso-IME

A c t | M E

(U/g)

6,6

7,6

3,7

3,3

9,3

11,0

5,0

rprot

0,33

0,54

- ( * )

- ( * )

0,76

0,35

0,43

Efic.

acopl.

0,85

1,60

0,43

0,44

0,99

1,42

1,56

rinm

0,66

0,76

0,37

0,33

0,93

1,10

0,50

r inm/rp r o t

2,00

1,41

—

—

1,22

3,14

1,16

(*) Los reactivos de acoplamiento interfieren la medida de protei'na en la disolución residual.

croambiente eléctricamente neutro; de hecho, al igual que en Enzacryl-AA se ob

tuvieron altos valores de r ¡ n m y la sobreactivación producida por la inmoviliza

ción pudo interpretarse también por un desplegamiento de la estructura favoreci

do por la unión de residuos de tirosina al soporte.

En el caso de NB-glut-IME, el soporte también aporta un mi-

croambiente neutro, a diferencia de los otros derivados activados glutaraldehido

que proporcionan carga negativa (NH-IME) ó positiva (NAQA-IME). Además el

NB-glut-IME posee en su estructura grupos hidrófobos aromáticos aportados por

la bencidina; estos hechos pueden interpretar los altos valores de r ¡ n m obtenidos.

En este caso, la sobreactivación no puede interpretarse, como se ha realizado con

el Enzacryl-AA y con el NPAA, por un desplegamiento consecuente de la unión

al soporte de residuos que estuvieran ocluidos en la estructura de la enzima. Es

to es asi porque la unión se realizó fundamentalmente a través de residuos de



-112-

I . I

Fig. 50 Esquema por el que la inmovilización a soporte activado con glu-

taraldehido puede provocar un mayor desplegamiento de la confor

mación de la enzima en su unión a residuos de Usina.

——{glutaraldehido; — o residuos de Usina; E enzima; CA centro activo

N matriz del soporte derivado de nylon.

lisina, que están localizados en la superficie de la proteína. Sin embargo, dado

que el nylon es un soporte poco poroso, la unión de la enzima fué superficial

y se puede esperar una modificación de la conformación de la proteína de la

forma expresada en la Fig. 50.

Los bajos rendimientos obtenidos con los derivados de NPI,

pueden ser debidos a que los reactivos de acoplamiento estuvieron en contacto

con la disolución de enzima, provocando un bloqueo de los residuos de aminoá

cidos de la enzima. En los demás casos, la activación del soporte se realizó pre

viamente a la interacción del soporte con la disolución de enzima.

Para la preparación de NH-IME, NB-glut-IME y NAQA-IME,

la activación del soporte fué por tratamiento con glutaraldehido como reactivo

bifuncional, obteniéndose derivados IME activos con elevados rendimientos; sin

embargo cuando se ha empleado el glutaraldehido como reactivo para entrecru-

zamiento de la enzima con albúmina (Manjón, 1979), la enzima se inactivo ca-



-113-

s¡ por completo. En el mismo sentido se comportó cuando Letts y Chase (1974,

entrecruzaron con glutaraldehido tirosinasa de champiñón que había sido ocluida

en membranas de colágeno; el tratamiento redujo la actividad a una tercera par

te.

Los menores r ¡ n m obtenidos en la unión de la enzima sobre

NB activado con nitroso que en la obtención de NB-glut-IME y que NPAA-IME,

puede atribuirse a la carga neta positiva que proporcionó el soporte al microam-

biente de la enzima.

7.2. COMPORTAMIENTO DE LOS GELES-NYLON-IME A TIEMPOS LARGOS

DE REACCIÓN.

Se estudió el comportamiento de los geles-IME tanto en STR

como en PBCR, para seleccionar el sistema de inmovilización que era más idó

neo para su utilización a tiempos largos.

Cuando en reactores STR se ensayaron para producción de

L-dopa con las mismas cantidades de gel-IME por unidad de volumen de sustrato

(q — 1 mg/ml), se observó (Fig. 51) que a lo largo del tiempo, la reacción se

detuvo llegando a unas concentraciones finales de L-dopa que fueron máximas

en los casos de NPAA-IME, NB-glut-IME y mínimas para NB-nitroso-IME y para

los derivados de NPI. Esto era esperable en función de los rendimientos de in

movilización y actividad mostrada por cada uno de los derivados.

Al determinar la productividad en STR de los geles-IME al

cabo de 6 horas de utilización con las mismas unidades de actividad inicial por

volumen de sustrato procesado (p = 4 mU/ml), las diferencias de comportamiento

fueron debidas a las diferencias en la estabilidad con el uso de los distintos de

rivados. Así las mayores concentraciones de L-dopa final se obtuvieron con NB-—

-glut-IME, NPAA-IME y NH-IME (Tabla 16), Así pues, éstos fueron los derivados

que en reactor STR dieron mayor estabilidad y que manifestaron mayor activi

dad, con lo cual la producción de L-dopa por mg de gel fué notoriamente supe-



-114-

0,8

0,6

0,4

0,2 l i i i

_ - -^ NB^kit-IME

t N H I H F

«NPI IME

- * NPI acéticolME

i

20 40 60 900 T I E M P O ( min )

Fig. 51 . Comportamiento de los geles-nylon-IME en STR.

q = 1 mg gel/ml de sustrato.

Tabla 16

Productividad de los geles-nylon-IME en STR

p = 4 U de IME/litro de sustrato; t-|- = 6 horas

GEL- IME

gel-IME

NB-glut-IME

NPAA-IME

NH-IME

NPI-acético-IME

NPI-IME

NB-nitroso-IME

NAQA-IME

L-DOPA

(mM)

0,41

0,39

0,37

0,32

0,31

0,28

0,22

Producción en

mo)/U de

102

98

92

79

77

71

56

IME

6 horas

mol/mg gel

1,02

0,82

0,55

0,27

0,23

0,36

0,38



-115-

rior a los restantes de la serie; dado que en la inmovilización se habi'a aplicado

en todos los casos la misma cantidad de enzima soluble, son también éstos deri

vados los que permitieron un mayor aprovechamiento en la utilización de la en

zima.

El comportamiento en reactor PBCR de los distintos deriva

dos se expresa en los datos de la Tabla 17. A diferencia de lo obtenido en STR,

el NPAA-IME dio en PBCR una menor actividad que los demás derivados, lo que

pudo ser debido a que, por sus características físicas mostró mayor empaqueta

miento con mayores problemas difusionales. La mayor actividad la mostraron los

derivados NB-glut-IME y NH-IME, que a su vez fueron los más estables a la re

acción dando mayores valores de t^/~ (11 y 8,5 horas, respectivamente). Por e-

llo fueron los que condujeron a una mayor producción de L-dopa después de

15 horas de funcionamiento. El hecho de que el NB-glut-IME sea más estable

que los otros dos derivados acoplados también con glutaraldehido((NH-IME y

NAQA-IME), puede interpretarse en relación con que en el NB-glut-IME el so-

Tabla 17

Actividad, estabilidad (t- j /J y productividad de los geles-nylon-IME en PBCR

m = 10 mg gel-IME; Q = 5 ml/h.

gei-IME

NB-glut-IME

NAQA-IME

NH-IME

NB-nitroso-IME

NPAA-IME

*1/2 ( h )

11.0

7,0

8,5

3,5

6,5

A c t R o

(U/g gel)

2,17

1,97

2,04

1,90

1,43

Producción en 12 horas

(m mol dopa/g gel )

1,15

0,75

0,83

0,61

0,57



-116-

porte es neutro, mientras que en el NH-IME y en el NAQA-IME los soportes a-

portan cargas negativas y positivas, respectivamente. El NB-nitroso-IME dio baja

producción, debido a su rápida inactivación (t-|/« 3,5 h.), a pesar de dar alta

actividad inicial en el PBCR.

Como resumen, los geles que se consideraron de mejor com

portamiento fueron: 1) el NB-glut-IME, que tanto en STR como en PBCR dio

alta estabilidad, actividad y productividad. 2) el NH-IME que dando un nivel me

medio en su comportamiento en ambos reactores, ofreció la ventaja de que su

preparación es la menos laboriosa. 3) el NPAA-IME dio buenos resultados en

STR, pero no en PBCR, lo que junto con el hecho de que su preparación es

muy laboriosa, limitan lias posibilidades de su utilización.

7.3. EFECTO DE LA CANTIDAD DE PROTEINA SOBRE LA INMOVILIZA

CIÓN.

Para estudiar la capacidad de unión de los soportes NB y NH,

para la obtención de los derivados NB-glut-IME y NH-IME, que fueron los selec

cionados para su uso posterior, se trataron con cantidades crecientes de protei'na

y se midió la actividad manifestada por los geles-IME obtenidos. Se observó que

para el NH-IME se alcanzó antes la saturación del soporte que en el caso de

NB-glut-IME (Fig. 5 2 ) , lo que debe ser debido a la existencia de mayor número

de grupos funcionales en el soporte NB. A cantidades bajas de protema no hay

apenas diferencia de comportamiento entre ambos soportes, dado que están muy

por debajo de las cantidades necesarias para saturarlo.

De estos resultados se deduce que, las cantidades óptimas de

enzima aplicada para conseguir alta actividad en el gel-IME, pero sin pérdida de

rendimiento de inmovilización, son de unas 10 U/g gel para el NH-IME y de

20 U/g gel para el NB-glut-IME, con la preparación de enzima purificada utiliza

da, lo que correspondió a 1,53 y 3,07 mg de protei'na/g gel.



-117-

30 r— • 1

0 I i i i J • •

0 20 40 60

P R O T E I N A ( U d e SE/g gel)

Fig. 52 Efecto de la cantidad de proteína sobre la inmovilización

en NH y NB. Enzima purificada CM/Phe con actividad es

pecífica de 6,5 U/mg de protei'na.

7.4. ESTABILIDAD A L ALMACENAMIENTO.

Para estudiar cómo se comportaban los derivados NH-IME y

NB-glut-IME con el almacenamiento, una porción de gel se guardó en frigorífico

(5 °C) suspendida en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0, y otra se liofilizó y alma

cenó en congelador (—30 °C), y se midió la actividad en pequeñas porciones

tomadas a distintos tiempos. (Fig. 53)

Se observó que, tanto el NH-IME como el NB-glut-IME su

frían una notoria pérdida de actividad por el proceso de liofilización, pero se

mantenía la actividad residual estable al menos durante 60 días. En cambio los

geles suspendidos en tampón fosfato experimentaban una pequeña pérdida de ac

tividad con el tiempo, lo que fué algo más notorio con el NH-IME que con el

NB-glut-IME. Normalmente, en la realización de los trabajos de esta Memoria,

los preparados de nylon-gel-IME se almacenaron en frigorífico suspendidos en tam

pón fosfato.



-118-

20

T I E M P O ( di» )

NB-glut-IME (Pi.5°C)

40 60

Fig. 53. Estabilidad al almacenamiento del NH-IME y del NB-glut-IME

P¡: suspendido en tampón fosfato a 5°C

L: liofilizado y conservado a —30°C

7.5. PERFILES pH-ACTIVIDAD.

Cuando se comparó la variación de la actividad con el pH

para varios derivados inmovilizados en los soportes de nylon, se observó en ge

neral muy ligeros desplazamientos del pH óptimo hacia pH alcalino, y que au

mentó la estabilidad a los cambios del pH con respecto a la enzima soluble, es

pecialmente con NH-IME y NPAA-IME, en que la actividad sufre sólo pequeñas

variaciones entre pH 6,0 a 8,0. Los ligeros desplazamientos del pH óptimo ob

servados, no son significativos a la hora de interpretar los efectos de la concen

tración de H en la actividad del IME.

De los resultados obtenidos se optó por el pH 7,0, como va

lor óptimo para la utilización de los derivados de gel-nylon-IME, valor igual al

que se veni'a utilizando con la enzima soluble y con la enzima inmovilizada en

Enzacryl-AA y en CPG-AA.



-119-

7.6. PROPIEDADES CINÉTICAS DE LOS GELES-NYLON- IME.

Para el estudio de la propiedades cinéticas de los derivados

inmovilizados se utilizó, al igual que con Enzacryl-AA, el reactor de baño agita

do, en las condiciones del método estándar de medida de actividad (Método: 12.

8.2). Se analizó la cinética para NH-IME, NPAA-IME y NB-glut-IME. Los datos

experimentales de v frente a S, se ajustaron también a una ecuación de primer

orden (Tabla 18). El hecho de que la actividad responda proporcionalmente a la

concentración del sustrato, puede proporcionar algunas ventajas de cara a las a-

plicaciones anah'ticas de estos derivados inmovilizados de enzima en nylon.

Tabla 18

Cinética Cinética de primer orden de los geles-nylon-IME

Ecuación ajustada: v = k-S -f- b; k' = k/q , siendo q = m / V g (mg gel/ml)

k x lO 3 bx lO 3 k' r gel-IME

(min ) (mM/min) (min • g gel • mi)

NH-IME

NPAA-IME

NB-glut-IME

9,6

13,6

16,4

2,1

2,4

3,5

2,4

3,4

4,1

0,996

0,994

0,908

r: coeficiente de correlación.



8. APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA A LA

SÍNTESIS DE L-DOPA.



-121-

8. APLICACIÓN DE LA TIROSIIMASA INMOVILIZADA A LA SÍNTESIS DE

L-DOPA.

El compuesto L-dihidroxifenilalanina, conocido como L-dopa

ó levodopa es un fármaco que se ha utilizado y sigue empleándose en el tra

tamiento de la enfermedad de Parkinson (Van Woert, 1976). También se ha su

gerido entre otras, su aplicación a determinados cánceres de piel por la toxicidad

selectiva que muestra la L-dopa sobre células de melanoma (Wick et al. 1977 )

y también en procesos de desarrollo infantil (Chakmakyan et al. 1973) y en tra

tamientos de enfermedades afectivas (Costa y Gessa, 1977). Por ello, en la actua

lidad existen varios métodos de si'ntesis qui'mica, bajo diversas patentes comercia

les (Merck Index, 1978). En nuestro caso, hemos estudiado la capacidad de re

actores con tirosinasa inmovilizada para la si'ntesis de L-dopa a partir de L-tiro-

sina, en presencia de ascorbato. El desarrollo de un método bioqui'mico para la

si'ntesis de este fármaco, estuvo encaminada tanto hacia la posibilidad de su apli

cación industrial, como hacia la implantación del sistema inmovilizado en seres

vivos, para la si'ntesis in situ de L-dopa

8.1. CRITERIOS DE COMPARACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE DISTINTOS

REACTORES Y SOPORTES.

La producción de L-dopa se estudió en los reactores de baño

agitado (STR), de baño agitado continuo (CSTR) y de columna de lecho empa

quetado (PBCR), utilizando los derivados de tirosinasa inmovilizada Enzacryl-AA-

-IME, CPG-AA-IME, NB-glut-IME y NH-IME, en cada uno de los anteriores reac

tores. Todos los ensayos para un determinado gel-IME se realizaron con muestras

del mismo, obtenidas a partir de una misma preparación de <ME, e inmovilizada

inmediatamente después de la purificación del extracto de tirosinasa.. Además todas las

experiencias se realizaron dentro de un intervalo de tiempo lo suficientemente cor*

to, como para que de acuerdo con lo expresado para la estabilidad al almacena

miento, no se dieran cambios significativos en las propiedades del gel-IME. Asi'



-122-

pues los resultados para un determinado gel-IME se obtuvieron en condiciones

perfectamente comparables. La disolución sustrato que se procesó en todos los

casos estaba constitui'da por: L-tirosina 2,5 mM, L-ascorbato 2,5 mM en tampón

fosfato 0,1 M pH 7,0, sin adición de otros aditivos y a una temperatura de 25°C.

Para poder comparar la producción de L-dopa en los reactores

con geles-IME de distintos soportes, se optó por no expresar la cantidad de gel-

-IME en unidades de masa (g ó mg), sino en unidades estándar de actividad en-

zimática (U), medidas por el método estándar (Método: 12.8.2). Asi', IME repre

sentó la cantidad en U de gel-IME aplicad a a un reactor y que se calculó por

IME = m- A c t , M E (2D

siendo m la masa en gramos de gel-IME utilizada, y Act||y|£ la actividad están

dar del mismo en U/g gel. Por otro lado, dado que los reactores de gel- IME

perdían actividad con el tiempo, la productividad del reactor (producto sintetiza

do por unidad de tiempo) disminuía paralelamente con la actividad manifestada

por el gel -IME en el reactor (Actp), cuya estabilidad a la reacción a largos

tiempos ya se ha analizado (Cap. 6 y7) y se cuantifico según los valores de t - j / -

Por todo ello, para espresar de forma cuantitativa la producción de un reactor

a lo largo de su vida de uso, se empleó el término Producción específica (Pr )

para indicar la cantidad de L-dopa sintetizada en un tiempo t por unidad

estándar de gel-IME y se expresó en mol dopa/U ó g dopa/U, y el de Produc

ción específica total ( Pr j ) para la producción específica en el tiempo total ó

vida de uso del reactor ( ty). Para t j se adoptó en STR el tiempo necesario pa

ra agotar la actividad y en PBCR el tiempo en que la Actp se redujera al 15%

de la Actp . El valor de Pr-j- obtenido para un determinado reactor, en unas

determinadas condiciones, nos indicó el grado de aprovechamiento o el rendimien

to en la utilización del IME para la síntesis de L-dopa, y teniendo encuenta el

rendimiento de inmovilización, se puede calcular la productividad del IME respec

tó a la cantidad de SE utilizada para su preparación. Para expresar el rendimien

to de utilización del sustrato L-tirosina, se empleó el factor de conversión (X)

definido por la fracción de L-tirosina transformada en L-dopa y calculada por:

X = (dopa)/(tir)Q (22)



-123-

y el denominado factor de conversión medio (X) como el del volumen de sus

trato total (Vgj ) procesado por el reactor en el tiempo ty .

Todos los datos necesarios para calcular Pr-|- y X de un reac

tor se obtuvieron a partir de la medida experimental de las concentraciones de

L-dopa en las disoluciones producto, de las características conocidas del gel-IME

utilizado y de las condiciones impuestas al reactor. Asi' para calcular la produc

ción específica se empleó la definición operativa:

Pr = dopa t /m • A c t | M E (23)

y la dopa sintetizada en un tiempo t , dopat , se cálculos

En STR por:

dopat = (dopa)t • M • Vg (24)

siendo, (dopa)t la concentración molar de L-dopa en el reactor en el tiempo t;

M el peso molecular de la L-dopa y Vg el volumen de sustrato en el reactor.

En reactores continuos (CSTR y PBCR) por:

n n d°Pat = 2 1 ((d°Pa)f ' Q - Atf j = Q 2 1 ((dopa)f • Atf ) (25)

1 1

siendo: f una fracción individual eluída del reactor y n el número de fracciones

eluídas en el tiempo t; (dopa)f la concentración de L-dopa en la fracción f;

Atf en tiempo empleado en eluir dicha fracción; Q el caudal o flujo volumétri

co, constante a lo largo del proceso.

El factor de conversión en el tiempo t se calculó

en STR por:

X = (dopayí tir )Q (26)

y en reactores continuos por:

X = (dopa)t / (tir )Q (27)

siendo la concentración media de L-dopa obtenida en tiempo t: n

y (dopa)f 1 (28)

(dopa)1



-124-

Dado que existi'a una inhibición por el producto, era espera-

ble que la cantidad de gel-IME afectase a la producción, en el sentido de que

una mayor cantidad de gel-IME por unidad de volumen de sustrato procesado,

acumulase mayor concentración de producto, con el correspondiente detrimento

de la actividad manifestada por el IME. Además con una mayor velocidad de

consumo de los sustratos dará condiciones de menor concentraciones de éstos,

especialmente del oxígeno en PBCR. Por todo ello, en el estudio de la produc

ción de un determinado reactor, se empleó como variable definitoria de las con

diciones del reactor el parámetro p que se ha definido anteriormente como las

unidades estándar de gel-IME empleadas por litro de disolución sustrato procesa

do en el tiempo ty . Asi' mismo se indicó anteriormente cómo afectaban las va

riaciones de este parámetro a la actividad y estabilidad del IME en los distintos

reactores (Cap. 6.2).

Para comparar la producción de dos tipos de reactores distin

tos ( p. ej. STR y PBCR) ó dos reactores iguales con distintos derivados IME

(p. ej. Enzacryl-AA-IME y CPG-AA-IME en STR), es necesario que ambos reac

tores están en condiciones que podamos considerar "equivalentes". En nuestro ca

so se consideró que dos reactores estaban en condiciones operativas equivalentes

cuando teni'an el mismo valor del parámetro p, De esta forma, a igualdad de p,

las diferencias observadas en la producción específica, se atribuyeron al efecto

del tipo de reactor ó a los efectos microambientales del tipo de soporte. Para

ello, especialmente al comparar diferentes derivados IME, fué necesario que la

producción se expresase en términos de cantidad de dopa sintetizada por unidad

estándar de IME, tal como se ha definido Pr y Pr-p

El resultado del estudio de un determinado reactor en unas

determinadas condiciones estuvo resumido en los valores de la Producción especí

fica total (Prj) y del factor de conversión medio o final (X) obtenidos. Ambas

magnitudes pueden relacionarse con el valor de p impuesto al reactor, tenien

do en cuenta lo siguiente:

<*epat (dTpa) t - V ST ' M

p r = : = 1 (g dopa/U) (29) IME IME



-125-

y siendo que: X • = (dopa) t / ( t j r ) y que : p = IME/V S T según (18),

se deduce que:

X - ( t i r ) - M PrT = - (30)

-3 y por lo tanto: para ( tir )Q 2,5xlO~J M y M 197 dalton se obtiene:

(31)

Asi' pues el valor de p determina directa y necesariamente

el valor de la razón Pr-p / X, pero los valores concretos de estas magnitudes de

penderán del tipo de reactor y del soporte.

En unos ejes de coordenadas en los que se representen los

valores de P r j en ordenadas, frente a X en abcisas, los puntos del plano que

toman un determinado valor de p, y por lo tanto un determinado valor de la

razón P r j / X , forman lineas rectas para cada valor de p que convergen al cen

tro de coordenadas (isoli'neas de p ó I meas iso-p). Esto permitió hacer represen

taciones en el plano P r j — X como los de las Figs. 55 a 59, en las que cada

punto experimental representa una experiencia con un reactor que produjo la ca

cantidad de L-dopa expresada como P r j en ordenadas, con el factor de conver

sión medio X dado en abcisas, cuando el reactor se sometió a las condiciones

de trabajo que corresponden al valor de p que se expresa por la proximidad

a las i meas iso-p. Estas representaciones con tres variables tuvieron una coheren

cia impuesta por la relación teórica que existi'a entre P r j , X y p, y sirvieron de

comparación de la capacidad de producción de L-dopa de la tirosinasa inmovili

zada en los diferentes soportes y funcionando en los distintos reactores que se

han estudiado, lo que se analizará én las siguientes Secciones de este Capi'tulo



-126-

8.2. PRODUCCIÓN DE L-DOPA EN REACTORES CON ENZACRYL-AA-IME.

EFECTO DEL TIPO DE REACTOR.

8.2.1. PRODUCCIÓN EN REACTORES DE BAÑO AGITADO (STR).

Se ensayaron a microescala reactores STR, utilizando en todos

los casos la misma cantidad de gel-IME (m = 4 mg) de la misma Act||y|£ (45

U/g gel), y con volúmenes variables de sustrato, lo que determinó valores varia

bles de p.

Se observó que la concentración final de L-dopa obtenida, y

por lo tanto X, aumentó con el valor de p, mientras que la producción especí

fica total obtenida (Pty) disminuyó al aumentar p (Fig. 54), lo que fué debi

do a que la capacidad catalítica disminuyó notablemente con el aumento de p

P ( U/1 )

Fig. 54. Variación de la producción (Pr-¡-) y conversión (X) con

las variaciones del parámetro p del rector STR con En-

zacryl-AA-IME.



-127-

Estos datos se representaron en la Fig. 55 bajo la forma de Pr-j- frente a X

en vistas a la comparación con otros reactores. La curva de Producción-Conver

sión indicó que si se pretende un alto rendimiento en la utilización del sustrato,

habrá que utilizar reactores que den alta conversión, lo que puede conseguirse

con altos valores de p; en estas condiciones la Prj es baja y por tanto se obtie

ne un bajo rendimiento en la utilización de la enzima. La elección entre condi

ciones que den un mejor rendimiento en el uso del sustrato o de la enzima, de

penden de la finalidad de la aplicación, y si esta es la síntesis industrial de L-

-dopa, dependerá de los costos correspondientes.

8.2.2. PRODUCCIÓN EN REACTOR CONTINUO DE BAÑO AGITADO (CSTR).

Se empleó un reactor t ipo, con un volumen de reactor V p de

10 mi conteniendo 4 mg de Enzacryl-AA-IME, siendo el V p mucho menor que

el volumen total de sustrato procesado V g j . La concentración de L-dopa en el

eluído del reactor aumentó inicialmente con el tiempo de reacción, hasta alcan

zar un estado estacionario, a partir del cual fué disminuyendo, debido a la pér

dida gradual de actividad del IME (Cap. 6.2).

Al igual que en STR, el aumento de p condujo a obtener

concentraciones mayores de L-dopa en el eluído y por tanto mayor conversión

de producto, disminuyendo la producción específica. Para un mismo valor de p,

los valores de Pr j y X fueron inferiores en CSTR que en STR (Fig. 55). En

este tipo de reactor el efecto inhibidor por el producto L-dopa, fué un factor

limitante de la producción, dado que al estar agitado la concentración de L-db-

pa fué en todo el volumen del reactor y en cada instante, la del producto de

salida, que sólo disminuyó con la pérdida de actividad del gel-IME. En STR, la

concentración de L-dopa sólo fué alta sólo fué alta después de que el reactor

funcionara durante laro tiempo y se hubieran producido grandes cantidades de

L-dopa y en el reactor PBCR se estableció un gradiente a lo largo del reactor.

Por ello, la producción de un CSTR sólo se acercó la la de un STR para con

diciones de muy bajos valores de conversión.



-128-

o. 120 -

< h-O » - S? < s ü —

ü UJ O. co UJ

ü ü O O ce a.

<3> • o

so Q. O

O)

E

20 40

P O R C E N T A J E DE C O N V E R S I Ó N

Fig. 55. Curvas de Producción-Conversión ( Prj—X ) de L-dopa en reactores

con Enzacryl-AA-IME.

8.2.3. PRODUCCIÓN EN REACTOR DE COLUMNA EMPAQUETADA (PBCR).

Microcolumnas de 3 mm de diámetro interior, conteniendo

5 mg de Enzacryl-AA-IME de 45 U/g gel, se emplearon como reactores tipo

de PBCR. Reactores con distintos valores de p se consiguieron sometiendo los

reactores a diferentes valores de velocidad de flujo Q. Conocida la existencia

de problemas de suministro de oxigeno (Cap. 6.5.), se estudiaron reactores PBCR

con sustrato saturado de aire y de oxígeno.



-129-

A) PBCR con sustrato saturado de aire

Se observó que para bajos valores de Q y por lo tanto para

altos valores de p, proporcionó mayores concentraciones de L-dopa en elui'do.A-

sf, al igual que en los reactores de baño, aumentó el procentaje de conversión,

pero fué en detrimento de la productividad. Las curva de Pry—X obtenida con

PBCR con disolución saturada de aire (Fig. 55) sugirió la existencia de un valor

h'mite de X y que además resultó muy bajo con respecto a los valores máxi

mos de conversión observados con los otros reactores (menor del 11 % en PB

CR , 70 % en STR y 45 % en CSTR).

Este h'mite de conversión se consideró debida fundamentalmen

te a la deficiencia de oxi'geno a que se sometió el sistema cuando se trabajó a

flujos lentos; el tiempo de residencia del sustrato fué elevado y la reacción ca

talizada consumió casi completamente el oxi'geno disuelto. Para flujos elevados,

valores bajos de p, el oxigeno se convirtió en un factor menos limitante y la ca

cantidad de L-dopa sintetizada fué mayor, pero eluyó del reactor a menor con

centración. Por otro lado, incluso a valores altos de Q la producción fué infe

rior a la observada en los otros reactores en las mismas condiciones, por loque

otros factores limitantes , como problemas difusionales, como consecuencia del

empaquetamiento del gel-IME en la columna influyeron en la obtención de me

nores rendimientos.

B) PBCR con disolución sustrato saturada de O^

Comparando la diferencia de comportamiento al saturar la di

solución de sustrato con O? puro (PQ 1 atm) en lugar de con aire atmosféri

co (PQ 0,21 atm), se observó que para un mismo valor de p dio mayor pro

ducción y conversión (Fig. 55), especialmente en condiciones de valores altos

de p, Asi' pudieron obtenerse factores de conversión de hasta 30 % .

De todas formas, en PBCR la producción fué menor que en

los otros tipos de reactores, por lo que su utilización para síntesis de L-dopa

sólo estan'a justificada cuando lo que se pretenda sea mantener un nivel de con-



-130-

centración de L-dopa en un fluido durante largo tiempo y no una máxima pro

ducción.

En resumen, desde el punto de vista de la producción y si

guiendo el criterio de las curvas Pry—X con respecto al parámetro p, podemos

afirmar que el orden de eficacia de los diferentes tipos de reactores fué el de

STR >CSTR'> PBCR y este último mejor con disolución saturada con O2 que

con aire.

Una discusión más detallada de los factores que limitaron la

producción en los distintos reactores se hará al final del capítulo en comparación

con los resultados obtenidos con CPG-AA-IME. y con los geles-nylon-IME.

8.3. PRODUCCIÓN DE L-DOPA CON CPG-AA-IME. EFECTO DE LA POROSI

DAD DEL SOPORTE.

Como se vio anteriormente (Cap. 6.2), la estabilidad de la t i -

rosinasa en CPG-AA fué algo superior a la observada en Enzacryl-AA-IME en un

factor de 1,4 -1,5 veces, tanto en STR como en PBCR. Por otro lado, la activi

dad del Enzacryl-AA-IME. en reactores PBCR fué muy inferior que en STR, cum

pliéndose que A c t p B C R o = 0 , 2 1 - A c t ^ ^ , mientras que con CPG-AA-IME fué

ActpRpD = 0,72. Act PBQRQ para unas condiciones determinadas de ensayo (p =

2 U/1). Con ello, aunque el CPG-AA-IME retuvo menos actividad que el Enza

cryl-AA-IME en la inmovilización ( Act^pQ.|jv1£ / Act | rn z a c ry|_|ME = 0,55), la

columna empaquetada manifestó 1,8 veces más actividad que con Enzacryl-AA-

-IME. Estas diferencias de comportamiento se interpretaron como debidas funda

mentalmente a la porosidad del CPG-AA, en el cual quedaron minimizadas las

limitaciones difusionales.

Estas propiedades determinaron las diferencias observadas cuan

do se empleó CPG-AA-IME para la síntesis de L-dopa, con respecto al Enzacryl-

AA-IME. En la Fig. 56 se dan las curvas Pry—X obtenidas con los reactores



-131-

STR, CSTR y PBCR con disolución saturada de aire. La diferencia más signifi

cativa respecto al uso de Enzacryl-AA-IME, es que las curvas P r T - X del reactor

de columna se acercan más al comportamiento del reactor de baño. Por ello,

mientras en STR el comportamiento es muy semejante con ambos soportes, en

PBCR resultó más eficaz el empleo de CPG-AA como soporte.

P O R C E N T A J E D E C O N V E R S I Ó N

Fig. 56. Producción de L-dopa en reactores con CPG-AA-IME.

Curvas Pr-y - X.



-132-

8.4. PRODUCCIÓN DE L-DOPA EN REACTORES CON GELES-NYLON- IME.

Los derivados de nylon que habi'an sido seleccionados por su

mejor comportamiento respecto a rendimientos de inmovilización y por la esta

bilidad de la reacción a latgo tiempo (Cap.7), se ensayaron para producción de

L-dopa.

En reactor de baño STR, se estudió la capacidad de síntesis

de L-dopa de los derivados NPAA-IME, NB-glut-IME y NH-IME. Desde el punto

de vista de las curvas de P i y - X se apreció que la capacidad de síntesis fué

del mismo orden que lo observado anteriormente para el Enzacryl-AA-IME y el

CPG-AA-IME (Fig. 57)

1,0 2.0. • 3.0 . •

J L 10 30 50

C O N V E R S I Ó N ( XxlOO)

Fig. 57. Curvas Pr j — X en reactores STR con geles-nylon-IME.

Ensayos con 10 mg gel-IME y Vg variable para dar los

valores de p que se indican.

1 0 ( -

O.

< H O H <

O LU O. (/i Ul

o o D O O CC OL

0,5.'

UJ

I 60 0) "O

(0 Q. O •o O)

E

20

Ü¿



-133-

En el reactor de columna PBCR no se aplicó el derivado

NPAA-IME, ya que había dado muy baja actividad en este reactor. El deriva

do NB-glut-IME dio en PBCR mayor producción específica que el NH-IME como

consecuencia de la mayor estabilidad a la reacción, especialmente para bajos valo

res de p, ya que para altos valores de p ambos estaban limitados por el sumi

nistro de oxígeno. (Fig. 58).

H i -

0.

<

O

< ü

O LU O. w LU

O O

O o CE O.

LU

LL. —

"O

ra o. o

•o

O)

E

120 .

Q2 0.5 p (U/1)

80

40

NH-IME V

Ü - ; L

. \ NB-glut-IME

\ o

•

1

\

1,0

2.0

4,0

12 16 20 24

PORCENTAJE DE CONVERSIÓN (Xx 100)

Fig. 58. Curvas P r j - X en reactor PBCR con geles-ny Ion-I ME

Ensayos con 10 mg del-IME y condiciones variables de Q.



-134-

Cuando se comparó las curvas Pr-j- — X para los reactores

STR y PBCR con un mismo gel-IME, por ejemplo NH-IME en la Fig. 59, se

observó que efectivamente en PBCR la productividad fué menor que en STR, co

como consecuencia de las limitaciones que ya se han comentado para este tipo

de reactores. Ahora bien, las citadas curvas, indican que la producción con los

geles-nylon-IME aplicados en PBCR fué del mismo orden que con CPG-AA-IME

y por lo tanto mayor que con Enzacryl-AA-IME; lo que fué especialmente cier

to con NB-glut-IME a bajos valores de p. Esto no era debido a la estabilidad

de la reacción, dado que los geles de nylon-IME dieron menores t - j / j que el En-

zacryl-AA-IME, sino que puede relacionarse con el hecho de que la razón de

Actpg£R / Ac t j j f p fué mayer con íos geles-nylon-IME, lo que debe encontrar ex

explicación en la existencia de menores limitaciones difusionales que en el caso

del Enzacryl-AA-IME.

<

O H < ü

O ui o. CO LU

ü O => O O ce o.

100

_ 8 0 UJ 2 0) "0| Z3\&

( m

g

dopa

/

20

-

~ •'

&

: o.s

V i /

. 'ó \

• • • ' . • ' • •

»

. ' l ,0

T »

\

• ' ^ ^ ^

PBCR

• '

. 2 , 0

•

,. , 1

. • ' 3,0

• • 4,0

. . • ' 6,0

STR

, , t 20 40 60

PORCENTAJE DE CONVERSIÓN ( X x 100)

Fig. 59. Curvas PrT - X en reactores STR y PBCR con NH-IME.



-135-

Como resumen de este capítulo, en base a la comparación de

las curvas de Producción — Conversión para los reactores estudiados, tanto con

Enzacryl-AA-IME (Fig. 55) como con CPG-AA-IME (Fig. 56) y con los derivados

de geles-nyIon-I ME (Fig 57 a 59), respecto a la producción de L-dopa con reac

tores de tirosinasa inmovilizada podemos decir que:

1) En todos los tipos de reactores y con los diferentes soportes, se aumenta la

producción al disminuir el valor de p, pero en este caso disminuye el factor de

conversión. La elección entre una mayor producción (mayor rendimiento en el

uso del IME) o un mayor factor de conversión (mejor rendimiento de aprove- .

criamiento del sustrato), puede depender de la finalidad a la que se aplique el

reactor.

2) El reactor de baño agitado, no modificó apenas su comportamiento al modi

ficar la porosidad del soporte y resultó más eficaz que los demás tipos de reac

tores. En reactor de columna empaquetada con empaquetada con Enzacryl-AA-IM

-IME dio muy baja productividad que mejoró saturando la disolución sustrato

con C>2- El comportamiento descrito por las curvas de Producción-Conversión se

acercó más a la del baño agitado cuando se utilizó un soporte de mayor tama

ño de poro, como ef CPG-AA, ó que no fuera poroso y por lo tanto la unión

de la enzima al soporte fuera superficial, como en el caso de. los geles-nylon; esto

se debe a que en ambos casos disminuyen las limitaciones difusionales respecto

al caso del Enzacryl-AA.

Los factores que limitaron el rendimiento de los reactores

en los procesos de transferencia de masa fueron principalmente:

a) Acumulación de producto. Dado que existe un efecto de inhibición por la

acumulación de L-dopa, en todos los reactores disminuyó la productividad cuan

do se aplicaron condiciones para dar altos factores de conversión. En CSTR, e's-

te factor fué más determinante que por ejemplo en STR, porque en él la con

centración de L-dopa fué en todo el volumen y en todo el tiempo de uso del

reactor, la del flujo de salida, dando menor producción que en STR, aunque

en el CSTR no había tampoco problemas difusionales ni de suministro de C>2-



-136-

b) Problemas de difusión. Fueron especialmente importantes en PBCR, como con

secuencia del empaquetamiento y la falta de agitación. Los problemas difusiona-

les dismunuyeron su importancia con el uso de CPG-AA y de soportes de nylon

por sus características de porosidad. Para un mismo flujo, cuando se aumentó

la velocidad lineal diaminuyendo la sección de paso del reactor, se mejoró ligera

mente la eficacia del reactor. En STR la producción fué semejante con los dife

rentes soportes ya que no hubo problemas difusionales gracias a la agitación.

c) Suministro de oxígeno. El proceso catalizado por la tirosinasa consume oxíge

no, por lo que en el reactor PBCR sin más oxígeno que el aportado por la pro

pia disolución de sustrato, se tienen serios problemas de rendimientos a pesar de

dar mayores t - j / ? que en los demás tipos de reactores.

d) La inactivación por el uso. La pérdida de actividad del IME a lo largo del

tiempo de funcionamiento del reactor, limitaron la productividad de acuerdo con

lo expuesto anteriormente respecto a la estabilidad de la reacción medida por lo

los valores de t - | / „ .

La acumulación de las limitaciones b y c, hicieron a los reac

tores de lecho empaquetado los menos productivos, aunque su vida de uso fuera

mayor, por lo que su utilización sólo estará justificada para aplicaciones en los

que se pretenda mantener un nivel de L-dopa en un fluido durante largo tiem

po. Así por ejemplo en aplicaciones para investigaciones fisiológicas o terapéuti

cas.



9. INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA EN TUBOS Y

MEMBRANAS DE NYLON.



-138-

9. INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA EN TUBOS Y MEMBRANAS DE

NYLON.

Los métodos de inmovilización seleccionados en el estudio

con los geles de nylon (NH y NB activados con glutaraldehido) por dar majores

resultados y por la sencillez de su preparación, se aplicaron a otras formas f ísk .

cas de nylon, como tubos capilares y membranas o mallas. Se intentó aplicar

estos derivados inmovilizados con fines analíticos en la realización de un electro

do de enzima para la determinación de sustratos de la enzima.

9.1. INMOVILIZACIÓN EN TUBO DE NYLON

9.1.1. RENDIMIENTO DE INMOVILIZACIÓN.

En la inmovilización de tirosinasa sobre la superficie inteeior

de tubo de nylon, resultó significativo que el rendimiento de inmovilización fue

ra mayor en la preparación del tubo NH-IME que en la del NB-IME (Tabla 19)

contrariamente a lo ocurrido con los geles-IME (Cap.7.1). La explicación de es

te hecho podría atribuirse al propio proceso de preparación del gel-IME y del

tubo-IME que se diferencian entre sí en el tratamiento físico-químico previo a

la modificación química. Así, para la preparación del gel de nylon, éste se sus

pendió en una disolución de ClCa anhidro al 20 % en metanol y luego se pre

cipitó en medio acuoso como partículas finas de gel (Método: 12.2.2). Sin em

bargo el tratamiento en eJ caso de tubo fué más suave puesto que la disolución

de ClCa contenía también agua (18,6 % de ClCa y 18,6 % de H2O en me

tanol), con lo cual no se llegaba a disolver, sino simplemente sufría un efecto

superficial de hinchamiento y de aumentar el carácter amorfo de la superficie.

En esta diferencia de tratamiento es en lo único en que podría basarse las di

ferencias entre gel y tubo.



-139-

Tabla 19

Rendimiento de inmovilización en tubo de nylon

Enzima tratada: SE/m = 10 mU/cm de tubo.

Tubo de 1 mm de diámetro.

Tipo de activado ^ c t I M E

nylon con (mU/cm) r ' n m

NH glutaraldehido 9,6 0,96

NB glutaraldehido 6,0 0,60

9.1.2. PROPIEDADES CINÉTICAS DEL TUBO-IME

Para estudiar el comportamiento cinético, se midió la activi

dad a distintas concentraciones de sustrato por el método estándar (Método:

12.5.2) en el cual el sustrato se recicló a través del tubo-IME a alta velocidad

de flujo para garantizar la ausencia de problemas difusionales y de suministro

de oxi'geno para la reacción.

Al igual que en geles-IME, respondió a una cinética de seu-

doprimer orden (Fig.60). Realizando una representación de Lineweaver-Burk de

las inversas de velocidad y la concentración de sustrato, se obtuvo un valor de

K|y| de 4,7 mM, valor lo suficientemente superior a la concentración de suistra-

tQ?que permite la solubilidad de la tirosina, como para dudar seriamente de

su significación..

El hecho de que la actividad del tubo-IME respondiera de

forma lineal con la concentración de sustrato, sugirió la posibilidad del uso

del sistema tubo-IME para fines analíticos de determinación de sustratos espe

cíficos de la enzima.



6

4 . / • /

(mU/cm) j /

2 ¡" / i '

!" •

O * ' ' -J ' ' — O 1 2

L-TIROSINA (mM)

Fig. 60. Cinética de seudoprimer orden del tubo NB-IME.

9.1.3. ESTABILIDAD A L USO CONTINUO E INTERMITENTE DEL TUBO-

-IME. POSIBILIDADES ANALÍTICAS.

Las posibilidades del uso de las enzimas inmovilizadas en tu

bo de nylon para métodos analfticos, ya fueron sugeridas por Hornby et al.

(1973) de cara a análisis automáticos. Sundaram (1977a) hace una revisión de

las enzimas inmovilizadas en tubo de nylon que se han utilizado para análisis

de metabolitos en sistemas bilógicos. Recientemente se han descrito métodos a-

coplados a un analizador automático para la determinación de glucosa en suero

empleando glucosa deshidrogenasa inmovilizada en tubo de nylon (Sundaram et

al., 1979); asi* como creatinina y creatina mediante el uso de creatinasa acopla

da a piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa (Sundaram e Igloi, 1979). Tam

bién se ha aplicado el sistema de tubo-IME para la determinación de urea en la

orina y suero, por medio de un sencillo sistema de acoplamiento del tubo-IME

a una micropipeta de émbolo (Sundaram yJayarama, 1979). Este sistema deno-



-141-

minado " Impette" por Sundaram (1979), evita el costoso empleo de un anali

zador automático para determinaciones de rutina.

Pensando en estas posibilidades se ha estudiado la estabilidad

del tubo-IME a la reacción para uso continuo a lo largo del tiempo o para u-

so repetitivo con cortos tiempos de reacción.

Cuando se ensayó a largo tiempo se observó que la veloci

dad de inactivación era mayor que la que dio el gel-IME preparado por el mis

mo procedimiento (Fig. 61). Este hecho cabe interpretarse en función de que

la inmovilización en tubo de nylon es más superficial y por lo tanto, la enzi

ma está expuesta a los fenómenos de desnaturalización mecánica más en el tu

bo que en el gel. Esta inactivación limitó enormemente la posibilidad de uti l i

zación del sistema para un análisis continuo de un sustrato de la enzima.

s 0,3 E

< a. 0,2; O O

i

0,1 ¡

0,0 0 5 10 15

T I E M P O ( horas )

Fig. 61 Estabilidad del tubo-NB-IME al uso continuo. Compara

ción con gel-NB-IME. Ensayos con 0,16 U de gel ó tu

bo -IME a Q 5,2 ml/h.



Se analizó también el efecto de la interacción de pequeñas

muestras de sustrato (1 mi) durante periodos cortos de tiempo (10 min.) y de

forma intermitente sobre la actividad del tubo-IME. Al término de cada ensa

yo el tubo-IME se lavó con disolución de tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 du

rante 5 minutos y se reutilizó en el siguiente ensayo. Se observó suficiente

estabilidad durante al menos 9-10 ensayos, salvo una notable pérdida de activi

dad en el primer ensayo en el tubo-NH-IME (Fig. 62). Esta pérdida de activi

dad en el primer ensayo puede ser debida a la eliminación de enzima que no

estuviese unida covalentemente al soporte. La posibilidad de aplicación de la

tirosinasa inmovilizada entubo de nylon dependió de la obtención de un siste

ma idóneo de almacenamiento, ya que después de almacenarlo durante cinco

di'as en tampón fosfato en nevera a 5 °C, no sólo habi'a perdido más del 50

% de actividad, sino que la estabilidad del I ME al uso intermitente decayó

notablemente.

—m. I-i 1 1 1 • I

2 4 « S 10

NUMERO DE ENSAYOS

Fig. 62. Estabilidad del tubo-IME al uso intermitente.Los ensayos

de actividad se realizaron al di'a siguiente de su prepara

ción según método estándar (12.8.2).



-143-

9.2. INMOVILIZACIÓN EN MEMBRANAS DE NYLON.

Se inmovilizó tirosinasa sobre membranas de nylon modifi

cadas como NB y NH activadas con glutaraldehido, con el f in de obtener mem

branas sensibles a los sustratos específicos de la tirosinasa para aplicaciones

analíticas.

9.2.1. RENDIMIENTO DE INMOVILIZACIÓN EN FUNCIÓN DE LA CANTI

DAD DE PROTEINA.

En experimentos en los que se aplicó hasta 65 mU de en

zima purificada, no se logró saturar toda la capacidad de unión del soporte.

La actividad manifestada por las membranas-IME obtenidas fué aproximadamen

te proporcional a la cantidad de protema ¡nicialmente presente en la disolución

de inmovilización (Fig. 63). Los rendimientos de inmovilización que pueden de-

20 40 60

PROTEINA TRATADA ( mU/ cm2 )

Fig. 63. Efecto de la cantidad de proteína sobre la actividad mani

festada por las membranas-IME.



-145-

berse a la menor porosidad, rugosidad y carácter amorfo del material que constituye el

tejido o malla de las membranas de nylon, en comparación con el del gel de nylon, lo que

se reflejaría en una menor protección de la estructura de la enzima inmovilizada.

En el Capítulo siguiente se analizará la aplicación de estas

membranas de nylon con tirosinasa inmovilizada para la determinación analítica de sus

sustratos por medio de un electrodo de enzima.



10. APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA EN MEM

BRANA DE NYLON A UN ELECTRODO DE ENZIMA.



-147-

10. APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA EN MEMBRANA

DE NYLON A UN ELECTRODO DE ENZIMA.

Una de las aplicaciones analíticas de las enzimas inmoviliza

das son los electrodos de enzima. Un electrodo de enzima- se define básicamen

te como la unión de una enzima y un sistema electroquímico. La enzima in

movilizada en un soporte insoluble en agua se acopla a un electrodo selectivo

de iones que puede medir la desaparición de un sustrato ó el aumento de la

concentración de uno de los productos de la reacción catalizada por la enzima.

La sustancia a medir difunde en la capa de la enzima del electrodo, producien

do o consumiendo una sustancia electroactiva, la cual se detecta por el elec

trodo. El potencial o la corriente producida es una función de la concentración

de la sustancia detectada.

Updike y Hicks (1967) fueron los primeros en" emplear un

electrodo con glucosa oxidasa inmovilizada en gel de poliacrilamida y fijada

sobre un electrodo de oxígeno. A partir de entonces se han desarrollado dife

rentes electrodos de enzima para la detección de sustratos y metabolitos (Guil-

bault y Lubrano, 1973, 1974a, 1974b; Clark, 1972; Clark y Clark, 1973), ba

sados fundamentalmente en métodos amperométricos.

En la bibliografía se ha sugerido el uso de tirosinasa para

la determinación analítica de L-t¡rosina en muestras fisiológicas de suero y ori

na. Así Kumar y Christian (1976) mencionan el empleo de tirosinasa soluble

de champiñón para la determinación de L-tirosina, basado en la velocidad de

consumo de oxígeno midiendo éste con un electrodo de Clark. Schiller y Liu

(1976) utilizaron la tirosinasa inmovilizada en gel de poliacrilamida para la de

tección de fenoles y compuestos relacionados, en efluyentes industriales y a-

guas residuales mediante medidas espectrofotométricas de la velocidad de reac

ción, y más tarde Schiller et al. (1978) describieron el empleo del mismo sis

tema, acoplado a un electrodo de platino para la medida potenciométrica fren

te a un electrodo de calomelanos como referencia. Aunque el método fué muy



-148-

Ar

Cat.

El

Fig. 65. Detalle del electrodo de enzima. An, conexión al ánodo de Ag. Cat, conexión al cátodo de Pt. BE, bloque del electrodo. M-PTFE, membrana de teflóm. M-NY-IME, membrana de nylon con enzima inmovilizada. Ar, arandela de goma. El, electrolito.

Fig. 66. Esquema general del electrodo de enzima. E, electrodo de oxigeno. S, disolución de sustrato. BM, barra magnética. AM, agitador magnético. T, fluido de termostatización. UE, unidad electrónica. R, registrador.



-149-

sensible, la enzima asi' inmovilizada fué muy inestable al uso y al almacena -

miento y no permitía el uso repetitivo del electrodo de enzima.

10.1. DISEÑO DE UN ELECTRODO DE TIROSINASA.

Se diseñó y construyó un electrodo de enzima basado en

tirosinasa inmovilizada por unión covalente a las membranas de nylon modifi

cadas como NB y activadas con glutaraldehido. La membrana de NB-IME se

acopló posteriormente a un electrodo de Clark, el cual es sensible a las con

centraciones de oxígeno. La reacción enzimática de la tirosinasa lleva consigo

un consumo de oxi'geno, por lo que era de esperar una respuesta del sistema

al interaccionar con los sustratos especi'ficos de la enzima.

El esquema del montaje del electrodo de enzima diseñado

se describe en las Figs. 65 y 66.

10.2. RESPUESTA TÍPICA DEL ELECTRODO DE ENZIMA Y CRITERIOS

DE MEDIDA.

En la Fig. 67 se muestra la respuesta característica que dio

el electrodo de enzima en su interacción con una disolución de sustrato. Para

cuantificar esta respuesta se adoptaron los siguientes criterios de medida de la

actividad:

A) Pendiente máxima. Representa el valor máximo de velocidad de consumo

de oxígeno a lo largo de la duración del ensayo. Esto viene a coincidir con

la velocidad inicial, una vez que se ha superado un corto periodo de retardo,

el cual en la mayor parte de los casos no era detectable.

B) Porcentaje de oxígeno consumido a un tiempo fijo, por ejemplo 36 D 60

segundos. La medida por este método pudo hacerse con más precisión que en

el caso anterior.



-150-

100

* - 80 O Q

| 60 co Z O Ü 40 O

z LU

O 20 >< O

o

_ » ( O j l «n i

• t-1 •*<

O] ipimniHg i l - M m

20

z LU C?

60 >< O

80

100 0 1 2 3

T I E M P O ( min. )

Fig. 67. Respuesta del electrodo de enzima con el tiempo.

Criterios de medida. (Ver texto).

C) Porcentaje de oxígeno consumido a largo tiempo, una vez alcanzado el es

tado estacionario. Este criterio, en principio, parece el más adecuado, pero tie

ne el inconveniente de una mayor duración del ensayo, lo que implica una

mayor fatiga del electrodo.

10.3. EFECTO DE LA AGITACIÓN, DE LA PRESENCIA DE ASCORBATO

Y DEL TIPO DE SUSTRATO SOBRE LA RESPUESTA DEL ELECTRO

DO.

Para comprobar en qué grado influían los fenómenos de

transferencia de masa con limitaciones difusionales sobre la respuesta del elec

trodo, se comparó la diferencia de respuesta que dio el electrodo en ensayos,

realizados en iguales condiciones, pero unos con agitación magnética de la di

solución y otros sin ella. La agitación dio respuestas con menor velocidad ini

cial y menor consumo de oxígeno para alcanzar el estado estacionario ( Fig.

68). Este hecho sugirió la presencia de fenómenos de difusión externa en la

actividad del electrodo. Respecto a la presencia de ascorbato, tanto al utilizar



Fig. 68. Efecto de la agitación, de la presencia de ascorbato y del

tipo de sustrato sobre la respuesta del electrodo de enzima.

Sustrato 1 mM, ascorbato 2,5 mM



-152-

L-tirosina como L-dopa, la respuesta fué más intensa respecto a la velocidad

lineal y al oxi'geno consumido para alcanzar el estado estacionario. Este hecho

era esperable dado que el ascorbato es a su vez oxidado por el sistema de re

acciones que se dan en presencia de tirosinasa (Cap. 4.5). También se observó

que a igualdad de concentraciones de los dos sustratos empleados, la respuesta

fué notoriamente más intensa con L-dopa que con L-tirosina. Esto fué cohe

rente con el hecho de que la actividad dopa oxidasa sea mayor que la acivi-

dad tirosina hidroxilasa.

Dadas estas diferencias de comportamiento, a la hora de es

tudiar las propiedades analíticas del electrodo pareci'a conveniente analizar cada

una de estas condiciones de ensayo.

10.4. EFECTO DEL VOLUMEN Y DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRA

TO SOBRE LA RESPUESTA DEL ELECTRODO DE ENZIMA.

Si la velocidad de difusión de oxígeno a la membrana fue

ra mucho mayor que la velocidad de la reacción enzimática, el oxígeno esta

ría en equilibrio de difusión en el exterior e interior de la membrana, en cu

yo caso la respuesta del electrodo respondería a las variaciones de concentra

ción de oxígeno de la disolución. Si esto fuera así, dos ensayos realizados con

la misma membrana y en las mismas condiciones consumirían la misma canti

dad de oxígeno por unidad de tiempo; si en uno de ellos se emplease un vo

lumen mayor de muestra, el consumo de oxígeno sería menor en términos de

concentración, y por lo tanto la intensidad de respuesta del electrodo también

sería menor. Sin embargo, se observó que al aumentar el volumen del medio

de 1 a 4 mi, no se producía una disminución de la señal registrada, tanto res

pecto a velocidad inicial como al oxígeno consumido a un determinado tiempo

Esto significó que los equilibrios de difusión son más lentos que la velocidad

de reacción y que por lo tanto se está midiendo solamente la concentración

local de oxígeno en las inmediaciones de la membrana, que son las inmedia

ciones del electrodo.



-153-

Por otro lado, al variar la concentración del sustrato la res

puesta del electrodo varió proporcionalmente (Fig. 69). Esto sugirió que verda

deramente podía aplicarse el sistema para la determinación de L-tirosina y L-

-dopa con fines analíticos, dado que era propiamente un electrodo que respon

día a la concentración y es específico para los sustratos propios de la enzima.

La validez como sistema analítico dependerá de la precisión, exactitud, sensibi

lidad, fatiga, etc., características que se analizarán a continuación.

ESCALA DE TIEMPO ( " 1 min.

< )

Fig. 69. Variación de la respuesta del electrodo de tirosinasa con la concen

tración de sustrato. L-tirosina a la concentración indicada en presen

cia de ascorbato 2,5 mM. El origen de cada curva representa el tiem

po inicial para cada ensayo.



-154-

10.5. EFECTO DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA MEMBRANA SO

BRE LA RESPUESTA DEL ELECTRODO DE ENZIMA.

La respuesta del electrodo aumentó con la actividad enzimá-

tica de la membrana utilizada de forma aproximadamente proporcional con

los distintos criterios de medida (Fig. 70). Esto demostró que, por un lado la

respuesta del electrodo es realmente un fenómeno dependiente de una actividad

enzimática y que por lo tanto es un verdadero electrodo de enzima, y por otro

lado indicó que la sensibilidad del electrodo podía aumentarse empleando mem

branas con más actividad enzimática.

o 9-°

¡ I

6 W 15

ACTIVIDAD MEMBRANA ( mU/cmM

Fig. 70. Efecto de la actividad enzimática sobre la

respuesta del electrodo de tirosinasa.



-155-

10.6. INTERPRETACIÓN DE LA RESPUESTA DEL ELECTRODO.

Es difícil interpretar el mecanismo que se da en un electro

do de enzima debido normalmente a los fenómenos de superficie que se dan

por lo general en los electrodos especi'ficos. Las caracten'sticas de la respuesta

del electrodo indican que son tres los fenómenos que intervienen y que se es

quematizan en la Fig. 71 y que se describen a continuación:

1) Difusión del oxígeno y del sustrato de la disolución a la membrana de en

zima. En la velocidad de este proceso influye la concentración de sustrato en

la disolución. La concentración de oxígeno inicial no afectó a la diferencia de

respuesta en los diferentes ansayos, ya que en todos los casos se empleó diso

luciones saturadas de aire en las mismas condiciones.

2) La reacción en zimática catalizada por la tirosinasa que consiste en la oxi

dación de un sustrato específico de ella. La velocidad de esta reacción depende

de la concentración de sustrato y va acompañada de la correspondiente veloci

dad de consumo de sus inmediaciones, y le seguirá una difusión de los produc

tos de reacción hacia el exterior (disolución de sustrato).

3) Difusión del oxígeno a través de la membrana de teflón del electrodo de

Clark. El oxígeno que difunde es el que se encuentra en las inmediaciones de

la membrana de enzima dando una respuesta polarográfica que es electrónica

mente traducida por el aparato que la registra como porcentaje de concentra

ción de oxígeno respecto a la disolución blanco con que se ajusta el aparato.

La combinación de estos procesos da como consecuencia

una respuesta que depende de la concentración de sustrato que puede explicar

se de la siguiente forma:

La concentración de oxígeno detectada en las inmediaciones

de la membrana depende fundamentalmente de la velocidad de reacción enzi-

mática que lo consume y de los equilibrios de difusión que lo incorporan a

partir de la disolución. Estos equilibrios son más lentos que la reacción enzi-

mática, como se ha confirmado anteriormente. Por lo tanto, ante la presencia



ÁNODO

CÁTODO

ÁNODO

0 2 + 2 H20 + (4 e )

electrolito (BrK)

I ME • H20

membrana de

nylon IME y

m

-\-—X }2ext

>ext ext

DISOLUCIÓN DE

ENSAYO

Fig. 71. Interpretación de la respuesta del electrodo de enzima.

Las flechas de trazo grueso indican el sentido neto de

flujo. S, sustrato. P, producto de reacción. IME, tirosi-

nasa inmovilizada en la membrana de nylon. ext, en la

disolución externa, m, en las inmediaciones de la enzima

situada en la membrana de nylon. i, intensidad de co

rriente registrada. Potencial dé polarización del electro

do: 0,8 voltios.



-157-

de sustrato, la reacción enzimática disminuirá la concentración de oxígeno en

la membrana a una velocidad inicial que depende de [a concentración del pro

pio sustrato. Conforme la concentración de oxígeno disminuyó con el tiempo,

la velocidad de difusión de éste desde la disolución hacia la membrana aumen

tó. Así, el balance neto fué que la concentración de oxígeno detectada en la

membrana disminuyó a una velocidad cada vez más lenta, hasta alcanzar una

situación de estado estacionario, en que la velocidade de incorporación de

oxígeno por difusión y la de consumo por la reacción enzimática fueran iguales.

Así, la concentración de oxígeno alcanzó un valor final estacionario, cuyo

valor fué menor cuanto mayor fué la concentración de sustrato en la disolu

ción, tal como se observó en la Fig. 69.

10.7. FATIGA DEL ELECTRODO CON EL NUMERO DE ENSAYOS.

Para estudiar las posibilidades analíticas de un electrodo

hay que tener en cuenta la fatiga de éste, es decir, la pérdida de actividad con

su uso. Si la fatiga es muy pequeña, el electrodo puede calibrarse inicialmente

y después utilizarse para hacer determinaciones hasta que la pérdida de activi

dad por el uso sea como máximo del mismo orden que el error admisible del

método. Si la pérdida de actividad en cada ensayo es próxima al error admi

sible, sólo podría utilizarse el electrodo para fines analíticos, si previamente

se estudia la fatiga por el uso y en cada ensayo se le aplica el factor de co

rrección correspondiente.

En nuestro caso se ha analizado la pérdida de actividad con

el número de ensayos utilizando L-tirosina ó L-dopa como sustratos, en presen

cia y ausencia de ascorbato y aplicando los distintos criterios de medida de la

respuesta del electrodo.

Con sustrato L-tirosina, los valores experimentales de activi

dad relativa representados frente al número de ensayos se ajustaron a una rec

ta (ejemplo en Fig. 72). El valor de la pendiente ( m ) de ésta recta, nos



-158-

indicó la pérdida de respuesta por ensayo. Como puede verse en la Tabla 20,

el valor de la pendiente de la recta no varió notablemente al aplicar los dis

tintos criterios de medida ó las condiciones, como la presencia ó ausencia de

ascorbato. Cabe señalar que cuando se empleó como criterio de medida el oxi'-

geno consumido a un tiempo fi jo, en general se obtuvieron coeficientes de co

rrelación superiores a los otros dos criterios de valoración de la respuesta del

electrodo.

A l medir la respuesta del electrodo con sustrato L-dopa, las

curvas obtenidas se ajustaron a una ecuación de segundo grado, obteniéndose

curvas de pérdida de actividad (fatiga), como la representada en la Fig. 73. En

éste caso a diferencia de lo ocurrido con L-tirosina, en ausencia de ascorbato

las pérdidas de respuesta fueron mucho mayores, lo que se puede observar si

se comparan los valores de los coeficientes de primer grado ( —b ) obtenidos

en la Tabla 21. También fueron bastante distintos según el criterio de medida

empleados.

Esta pérdida de respuesta del electrodo debe atribuirse a la

pérdida de actividad de la enzima inmovilizada en la membrana. Por ello, cada

membrana fué utilizada generalmente para 15 ensayos como máximo, y en to

dos los casos el valor obtenido se dividió por la actividad relativa correspon

diente al número de ensayo. Este valor se calculó según las condiciones de tra

bajo con los valores de las Tablas 20 y 21.



-159-

Tabla 20

Fatiga del electrodo por el número de ensayos para sustrato L-tirosina.

Ecuación de la recta ajustada: *x _ b — m x ActQ

Actx, respuesta del electrodo en el ensayo número x.

Act0 , respuesta inicial del electrodo.

Criterio de

medida

A

A

B

B

B

L-tirosina

(mM)

1,0

1.5

1,0

1,5

1,0

ascorbato

(mM)

2,5

2,5

2,5

2,5

—

b

0,94

0,98

0,98

1,06

1,01

m

0,015

0,016

0,017

0,018

0,013

r

0,900

0,737

0,967

0,910

0.895

coeficiente de correlación.

E N S A Y O S

Fig. 72. Fatiga del electrodo de enzima por el uso con sustrato

L-tirosina (1 mM con ascorbato 2,5 mM). Criterio B.



-160-

Tabla 21

Fatiga del electrodo de enzima con el número de ensayos para sustrato L-dopa

Acuación ajustada: A c t x = c — b x H- a x*

Actr

x, número de ensayo. Actx, actividad en el ensayo x, ActQ actividad inicial.

Criterio de L-dopa ascorbato

medida (mM) (mM) a -10

A

A

B (36 seg)

B (36 seg)

B (60 seg)

B (60 seg)

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

1,13

0,93

1,08

1,02

1,01

1,00

0,100

0,035

0,065

0,031

0,060

0,018

41,0

3,9

9,7

-- 1.9

5,2

- 7 , 5

Fig. 73.

Fatiga del electrodo de enzi

ma por el uso con sustrato

L-dopa (2,5 mM con ascorba

to 2,5 mM). Criterio B.

NUMERO DE EXPERIENCIAS



-161-

10.8. DEPENDENCIA DE LA RESPUESTA DEL ELECTRODO CON LA

CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO.

Como ya se ha mencionado anteriormente, la respuesta del

electrodo varió con la concentración de sustrato. Cuantificando la respuesta pa

ra cada uno de los criterios de medida sugeridos, se observó que la respuesta

fué lineal para cada uno de los sustratos en función de la concentración de

éste. Con el criterio basado en la medida del consumo de oxígeno a un tiem

po fi jo, las medidas fueron más precisas, lo que puede observarse en la Tabla

22, si se comparan los valores de los coeficientes de correlación de las curvas

de calibrado, obtenidas en la aplicación de los distinto criterios de medida

utilizados. En las Fig 74 y 75 se muestran dos ejemplos de curvas de calibra

do del electrodo con el criterio de medida a un tiempo f i jo, para los sustra

tos L-tirosina y L-dopa respectivamente.

Tabla 22

Calibrado del electrodo para los distintos criterios de medida de la respuesta.

Ensayos con L-tirosina variable ( 0 -2 ,5 mM) y ascorbato 2,5 mM.

Ecuación ajustada: Act = b + m x

Criterio de b m r

medida

1,19 0,599 0,949

9,40 26,3 0,992

24,2 32,0 0,969

r, coeficiente de correlación.

A) Velocidad inicial

B) Oxi'geno consumido en 36 seg.

C) Oxígeno consumido al alcanzar el estado estacionario



-162-

Fig. 74.

Calibrado del electrodo de

enzima con sustrato L-tiro-

sina. Ensayos con ascorba-

to 2,5 mM. Ecuación ajus

tada:

y = 9 , 0 4 + 27,7 (L-tir)

(r = 0,990)

Fig. 75.

Calibrado del electrodo de

enzima con sustrato L-do-

pa. Ensayos con ascorbato

2,5 mM. Ecuación ajustada:

y . 0,04 + 44,0 (L-dopa)

( r= 0,991)



-163-

La presencia de ascorbato en el medio de medida, condujo

a un consumo de oxigeno mayor que en ausencia del mismo pero que fué de

bido a una mayor respuesta del blanco. Aparentemente, parece más idóneo tra

bajar sin ascorbato, ya que la curva de calibrado convergía asi' al centro de

coordenadas, (Fig. 76). Sin embargo se propone la realización de los ensayos

en presencia de exceso de ascorbato, pues cabe la posibilidad de que en mues

tras biológicas a las que se le aplicase el método contengan ascorbato u otro

agente reductor equivalente, y de no tenerlo en cuenta ¡nterferería en el com

portamiento del electrodo de tirosinasa. Otra razón para utilizar ascorbato fué

que en la interacción con L-dopa, la fatiga del electrodo fué menor en los

ensayos en presencia de ascorbato. Además la precisión de las medidas fué su-

parior con ascorbato, como lo demuestra los mayores coeficientes de correlación

obtenidos

80 -

40 -

o z

x O C 20 c s 3 V) Z O

-

-

-

-

o/

1

o

•

o

. . . 1 —

con ascorbato /

/ o

JO

~s sin ascorbato • j7

i i

o

o

•

i

0,5 1,0 1,5 2,0 2.5

T I R O S I N A I m M I

Fig. 76.

Influencia del ascorbato sobre

la ley de respuesta-concentra

ción del electrodo de enzima.

Ecuación ajustada:

Con ascorbato 5 mM

y = 17,5 + 18,5(L-tirosina) r = 0,993

Sin ascorbato:

y = 0,0 + 17,5(L-tirosina) r = 0,985



-164-

10.9. APLICACIÓN DEL ELECTRODO A LA DETERMINACIÓN DE MUES

TRAS DE L-TIROSINA Y L-DOPA.

En la Tabla 32 se muestra una aplicación del electrodo de

tirosinasa a 4 muestras distintas, 2 de L-tirosina y 2 de L-dopa de concentra

ción conocida. Para cada muestra se empleó una membrana distinta, sobre la

cual se hicieron siete ensayos con patrones para calibrar el electrodo, y otros

siete ensayos para la determinación de la muestra.. De los resultados obtenidos

se ha podido establecer que el electrodo de enzima contrui'do con tirosinasa

inmovilizada en membranas de nylon acopladas a un electrodo de oxigeno, per

mite posibilidades anali'ticas. La sensibilidad del método (0,1 mol en 1 mi de

muestra), no es superior a otros métodos analíticos de fenoles, pero permite

medidas en muy corto tiempo (un ensayo dura un minuto) y con la especifi

cidad propia de la enzima. El inconveniente principal del método, radica en la

fatiga del electrodo por la pérdida de actividad de la enzima. Este inconvenien

te creemos que se podrá superar en un futuro próximo, pues la estabilidad de

la enzima inmovilizada en estos soportes fué superior a la observada por su u-

so en el electrodo. Por ejemplo, los valores de t - j / - de tubo-IME fueron de

5 — 8 horas y en gel-IME de 8—13 horas. Asi' en gel-IME, implica que en 10

horas de uso continuo perdi'a el 50 °/o de actividad, por lo tanto 0,08 % por

minuto, mientras que en las membranas-IME utilizadas en el electrodo tuvieron

pérdidas del 1-2 % por ensayo de 1 minuto. La forma de lavado y tratamien

to del electrodo entre cada ensayo, podn'a ser otra de las causas que alteraron

la estabilidad de la enzima.



-165-

Tabla 23

Aplicación del electrodo de tirosinasa a la determinación de muestras de L-ti-

rosina y L-dopa.

Sustrato

L-tirosina

L-tirosina

L-tiros¡na

L-tirosina

L-dopa

L-dopa

L-dopa

L-dopa

Concentración añadida (mM)

0,50

1,00

1,50

2,00

0,30

0,60

1,00

1,50

Val de

or 7

medio medido ensayos (mM)

0,50

1,01

1,47

1,95

0,29

0,62

0,93

1,55

desviación estándar

± 0,02

± 0,04

± ±

±

± ± ±

0,05

0,05

0,03

0,05

0,05

0,06



11. CONCLUSIONES.



11. CONCLUSIONES.

-167-

1. Se han analizado las propiedades generales de la actividad tirosina hidroxi-

lasa de la tirosinasa inmovilizada por unión covalente a soportes modifica

dos de poliacrilamida, de vidrio poroso y de nylon, bajo distintas formas

fi'sicas y reactores. Se ha aplicado a la síntesis bioenzimática de L-dopa

y a la determinación analítica de L-tirosina y L-dopa mediante un electro

do de enzima.

2. En general, la inmovilización produjo derivados de la enzima con una ma

yor actividad específica tirosina hidroxilasa que la enzima soluble, al con

trario de lo que se había obtenido anteriormente con la actividad dopa

oxidasa. Estas diferencias, junto a lo establecido, en base a la extracción

y purificación, de que ambas actividades se manifestaron por la misma

proteína, sugirieron que los centros activos para L-tirosina y L-dopa actúan

en la misma proteína, pero con un comportamiento catalítico independien

te.

3. La protirosinasa se activó parcialmente por la inmovilización, dando aproxi

madamente un 30 °/0 de la actividad de la proenzima soluble activada con

tripsina-sepharosa, y después de un tiempo de interacción con el sustrato

alcanzó el mismo grado de activación que la proenzima inmovilizada trata

da con tripsina. Esta activación se produce como consecuencia de cambios

conformacionales provocados por la unión al soporte.

4. El estudio sistemático del comportamiento de la tirosinasa frente a los dis

tintos métodos de inmovilización ha permitido encontrar sistemas de alta

eficacia de acoplamiento y proporcionando rendimientos de inmovilización

que en algunos casos fueron del orden del 100 % .



-168-

La actividad manifestada por los derivados inmovilizados se vio notablemen

te afectada por las características del tipo de reactor utilizado y de la po

rosidad del soporte. En reactores de columna empaquetada manifestaron en

general menor actividad que la observada en reactores de baño agitado, co

mo consecuencia de las mayores limitaciones difusionales y de suministro

de oxi'geno que se dan en el reactor de columna.

La inmovilización a los soportes estudiados aumentó notablemente la esta

bilidad de la tirosinasa, tanto al almacenamiento como a su utilización du

rante largo tiempo, con respecto a la enzima soluble. La estabilidad depen

dió de la forma de enzima, del tipo de soporte, y muy notablemente del

tipo de reactor y de las condiciones de trabajo de éste. Se obtuvo una ma

yor estabilidad en reactores continuos de columna empaquetada que en los

reactores de baño, llegándose a obtener en algunos casos tiempos de semi-

inactivación próximos a 20 horas, lo que representó una estabilización de

unas 30 veces superior que la actuación de la enzima soluble en presencia

de ascorbato y de unas 250 veces en ausencia de éste. Este aumento de

la estabilidad, junto con lo; altos rendimientos de inmovilización abrieron

el camino para aplicaciones industriales de la tirosinasa inmovilizada.

En general, el tipo de reactor y las condiciones de trabajo aplicadas al

mismo influyeron en el sentido de que las condiciones que favorecieron un

aumento de la actividad manifestada por el derivado inmovilizado, aumenta

ron la producción de L-dopa a lo largo de la vida de uso del reactor, pe

ro disminuyeron la estabilidad del derivado inmovilizado cuando se midió

por los valores de tiempo de semünactivación. Esto demostró que la pro

babilidad de inactivación, dependió no sólo del tiempo de uso, sino que a-

demás, en gran, medida de pendió del número de veces que su centro acti

vo es utilizado en ciclos catalíticos. Esto apoyó la hipótesis de que la re

acción de inactivación parte de un intermediario del ciclo catalítico. Por

otro lado, el aumento de la estabilidad por inmovilización sugirió que el

proceso de inactivación puede implicar cambios conformacionales ó del es-



-169-

tado de agregación y que son parcialmente impedidos por la unión al so

porte sólido.

8. Se han aplicado los derivados de tirosinasa inmovilizada a la si'ntesis de L-

-dopa en los distintos tipos de reactores. Se han analizado los resultados

obtenidos en base a curvas de Producción-Conversión, que permitieron la

comparación de la capacidad de producción de L-dopa, utilizando como

criterio de comparabilidad de los distintos reactores y de los distintos de

rivados inmovilizados, la igualdad de una parámetro p asignado al reactor

y definido por las unidades de actividad estándar utilizadas por litro de di

solución procesada durante la vida de uso del reactor. Para un mismo de

rivado y con reactores con el mismo valor del parámetro p del reactor, se

obtuvo mayor producción en todos los casos, empleando el reactor de ba

ño agitado. La mayor producción en este tipo de reactor, a pesar de que

en él la enzima inmovilizada tenía menos estabilidad al uso, estuvo asocia

da a la mayor actividad manifestada en este tipo de reactor.

9. Un electrodo de enzima construido con tirosinasa inmovilizada en membra

nas de nylon, acopladas a un electrodo de oxígeno tipo Clark, ofrece po

sibilidades analíticas para la determinación de los sustratos de la enzima,

por un método sencillo y rápido, y con la especificidad propia de la enzi

ma, pero con el inconveniente de una fatiga del electrodo por su utiliza

ción,



12. MÉTODOS EXPERIMENTALES



-170-

12. MÉTODOS EXPERIMENTALES.

12.1. OBTENCIÓN DE ENZIMA.

Como fuente de enzima se empleó epidermis de Rana esca

lenta ridibunda, obtenida de suministradores locales durante los meses de Octu

bre a Marzo, que es el periodo durante el cual manifestaron mayor actividad

(Galindo, 1976).

12.1.1. EXTRACCIÓN DE PROTIROSINASA.

Para la extracción de la tirosinasa bajo la forma de proenzi

ma, se utilizó el mismo procedimiento que ha sido empleado anteriormente en

el Departamento por Cortés (1978) y Manjón (1978).

Las pieles de rana se maceraron con BrK 2 M en cámara

fn'a a 5 °C durante 24 horas, después de lo cual las epidermis se separaron de

la dermis por simple raspado. Las epidermis se lavaron varias veces con agua

destilada hasta eliminación de bromuros; se liofiiizaron en un liofilizador Telstar-

Criolab y se almacenaron a —30°C en ambiente seco hasta su uso.

La extracción de la protirosinasa se llevó a cabo por el si

guiente procedimiento estándar: se homogenizaron 600 mg de epidermis liofiliza-

da con 30 mi de agua bidestilada en un homogenizador Potter con émbolo de

vidrio. El homogenado se centrifugó a 18.000xg durante 30 minutos en centrí

fuga angular Sorvall con cabezal SS-1. El sobrenadante sk decantó y desechó.

El sedimento se volvió a homogenizar con 30 mi de tampón fosfato 0,1 M

pH=7,0, y se centrifugó de nuevo a la misma velocidad, recogiéndose el sobre

nadante como fuente de proenzima. El extracto obtenido por este procedimien-

se etiquetó como extracto estándar H20/P¡, y el obtenido suprimiendo el trata

miento previo con agua, como extracto Pj. Todo el proceso de extracción se

llevó a cabo en cámara fría a 5oC.



-171-

12.1.2. PURIFICACIÓN DE PROTIROSINASA.

La purificación de la protirosinasa se llevó a cabo en dos e-

tapas consecutivas: 1) Interacción por intercambio iónico con CM-Sephadex G-

50 2) Cromatografía de afinidad hidrofóbica con Phenyl-Sepharosa CL-4B. Para

ello se aplicó el siguiente procedimiento:

Se pesaron 0,5 g de CM-Sephadex y se hincharon con agua

destilada durante 1 hora en baño maría; se f i l t ró en una placa de vidrio poro

so (porosidad 4) y se equilibró con tampón fosfato 0,05 M pH 7,0. Cien mi

de extracto de proenzima, obtenido por el método descrito anteriormente, se

diluyeron al doble de volumen con agua destilada, para que la concentración

en tanpón fosfato fuese 0,05 M. A continuación se adicionaron al CM-Sephadex

y se mantuvo la interacción gel-enzima durante 30 minutos con agitación suave,

Al cabo de este tiempo se f i l tró en placa porosa y el fi ltrado se desechó. La

elución de la proenzima se realizó en la misma placa porosa por adición de 10

mi de tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 con suave agitación con varilla de vidrio,

los cuales se succionaron después de 10 minutos por medio de vaci'o. Se repitió

esta operación cuatro veces más, recogiéndose 50 mi de disolución de proenzima

purificada por CM-Sephadex, con rendimiento del 60/o y un factor de purifica

ción de 4-5 veces el extracto original.

Estos 50 mi de extracto de proenzima que habían sido pu

rificados con CM-Sephadex, se adsorbieron en una columna (9 mm $) empaque

tada con 3 mi de Phenyl-Sepharosa, previamente embebidos en tampón fosfato

0,5 M, a una velocidad de flujo de 12 ml/h. Previamente, a la disolución de

proenzima se le añadió la cantidad de fosfato monosódico y disódico sólidos

necesarios para dar una concentración final de 0,5 M. A continuación se lavó

el gel con la proteína adsorbida con 10 mi de tampón fosfato 0,5 M, pH 7,0.

La proenzima se eluyó de la columna con 25 mi de tampón fosfato 0,1 M,

pH 7,0. El rendimiento de esta etapa fué del 8 0 % con un factor de purifica

ción de 2-3. Una muestra de proenzima así purificada, se sometió a caracteri

zación analítica de su pureza por electroforesis en gel de poliacrilamida y se



-172-

etiquetó como protirosinasa purificada CM/Phe.

12.1.3. ACTIVACIÓN DE LA PROTIROSINASA.

Para la conversión de protirosinasa a tirosinasa activa se uti

lizó la activación que provoca la enzima tripsina, según procedimientos descritos

por Iborra et al.(1976). La activación se llevó a cabo, en cada caso, por uno

de los dos métodos siguientes:

a)Activación con tripsina soluble. Este procedimiento se empleó solamente en

la activación de pequeñas cantidades de disolución de proenzima para la medi

ción de su actividad enzimática. Para ello, a 0,1 mi de disolución de proenzima

se añadieron 0,01 mi de disolución de tripsina ( 1 mg/ml) y se incubaron a

37°C durante 5 min.. La enzima se utilizó inmediatamente después.

b)Activación con tripsina inmovilizada. Este método se utilizó cuando fué nece

sario disponer de grandes cantidades de tirosinasa, sin que estuviera contaminada

por la enzima proteolítica. Para conseguir la activación, se inmovilizó previamen

te la tripsina en Sepharosa activada con BrCN, según el procedimiento descrito

por Axen y Ernback (1971). Un gramo de tripsina-Sepharosa, se colocó en una

columna de 9 mm de diámetro, se lavó con tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 y

a través de ella se pasó disolución de proenzima a una velocidad de flujo de

20 ml/h, a temperatura ambiente. Una vez elui'da de la columna, la enzima ac

tiva mostró iguales niveles de actividad que la alcanzada por la activación con

tripsina soluble y pudo conservarse durante 1-2 semanas sin pérdida apreciable

de actividad.

12.1.4. CRITERIO DE HOMOGENEIDAD. ELECTROFORESIS EN GEL DE

POLIACRILAMIDA A pH 4,3.

Para determinar el grado de purificación de las disoluciones

de tirosinasa y para comprobar la identidad de la proteiha con actividad dopa



-173-

oxidasa con la de actividad tirosina hidroxilasa, se utilizó como criterio la elec

troforésis de disco en geles de poliacrilamida, de tipo catiónica a pH 4,3. Se u-

tilizó para ello el equipo de la firma Buchier Inst.Co. de electroforésis anali'tica

con fuente estabilizada. Se emplearon geles con grados de reticulación de 5%

de bisacrilamida, cuyo límite máximo de separación de proteínas era de unos

500.000 dalton (Shuster, 1971). Los geles separadores de poliacrilamida, de 6

cm de longitud se formaron por copolimerización de acrilamida y bisacrilamida

en presencia de riboflavina y persulfato amónico como catalizadores.

Se procedió a realizar la electroforésis conectando la fuente

de alimentación a los terminales. Se aplicó corriente de 1 mA por tubo duran

te 10 min. y a continuación 2 mA por tubo hasta que el indicador visual lle

gó al extremo inferior ( polo negativo ). Una vez concluida la electroforésis, u-

nos geles se fijaron y tiñeron durante 5 horas con disolución de azul Comassie

R 250 ( 1,25 g en 500 mi de agua conteniendo 227 mi de metanol y 46 mi

de ácido acético). Después los geles se destiñeron electroforéticamente en una

disolución de 50 mi de metanol y 75 mi de ácido acético glacial por litro. Li

na vez desteñidos se conservaron en la misma disolución de destinción y se

procedió a realizar densitogramas por lectura de absorbancia a 685 nm en un

densitómetro Transdyne

Por otro lado y simultáneamente otros geles se tiñeron con

una disolución de L-dopa ( 2 mg/ml) en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0, conte

niendo tripsina (0,1 mg/ml), para visualizar la proteína con actividad dopa oxi-

dasa (Pomerantz, 1963 ; Ferragut, 1980). No se añadió tripsina cuando la mues

tra sometida a electroforésis había sido previamente activada por su paso a tra

vés de la columna de tripsina inmovilizada. También se tiñeron geles con L-t¡-

rosina (2mM), en las mismas condiciones que la tinción con L-dopa, para de

tectar la banda de proteína con actividad tirosina hidroxilasa. Así pues, la com

paración de los geles teñidos con los tres procedimientos indicados permitió i-

dentificar las bandas de proteína con la tinción con azul Comassie y su corres

pondencia con las bandas que poseyeron actividad tirosina hidroxilasa y/o dopa

oxidasa.



-174-

12.2. PREPARACIÓN DE SOPORTES.

12.2.1. ENZACRYL-AA Y CPG-AA.

El Enzacryl-AA, soporte de poliacrilamida, modificado con

grupos reactivos arilamina fué suministrado por Koch-Light Lab. (England), en

estado liofilizado. El soporte CPG-AA es de vidrio de poro controlado, recu

bierto con óxido de circonio y modificado también con grupos funcionales a-

rilamina, preparado por la firma Corning y que fué suministrado por Pierce

Chem. Co. (USA).

12.2.2. PREPARACIÓN DE POLVO DE NYLON.

Para la preparación de los distintos soportes a partir de pol

vo de nylon, se partió de nylon-6 comercial en forma de granza, proporcionado

gentilmente por BASF ESPAÑOLA S.A.. Para la preparación del polvo de ny

lon se utilizó el procedimiento descrito por Hornby y Goldstein (1976). Para

ello , se suspendieron 15 g de nylon-6 comercial en 500 mi de una disolución

de cloruro calcico anhidro al 20% en metanol; se agitó a temperatura ambien

te hasta que se obtuvo una disolución homogénea muy viscosa. La disolución

de nylon se adicionó gota a gota a un gran volumen de agua en fuerte agita

ción. El gel así precipitado se separó por filtración en placa porosa ( porosidad

3). Se lavó y se resuspendió dos veces con agua y por último se volvió a lavar

con etanol y éter, y después se secó con corriente de aire. El polvo seco se

trituró en mortero y se conservó en desecador conteniendo pentóxido de fos

foro.

12.2.3. MODIFICACIÓN DE MEMBRANA Y TUBO DE NYLON.

Para la preparación de membranas se utilizaron mallas de 10

mieras de tamaño de poro ( NY-10 HD Super) suministrada por ZBF (Switzer-

land). El tubo de nylon-6, de 1 mm de diámetro interno, se obtuvo de la fir-



-175-

ma Portex (U.K.), en grado estándar. Para hinchar y hacer amorfa la superficie

de las membranas y del interior de los tubos de nylon, se trataron con una

mezcla de cloruro calcico al 18,6 % y agua al 18,6 % e n metanol, a 40 °C,

durante 30 minutos ( Daka y Laidler, 1978). Se lavó después con agua duran

te 20 minutos. El nylon amorfo obtenido se empleó inmediatamente en los tra

tamientos o modificaciones posteriores.

12.2.4. PREPARACIÓN DE NYLON ALQUILAMINA (NAQA).

Se realizó según el método descrito por Hornby y Goldstein

(1974). Se suspendieron 100 mg de polvo de nylon con 2 0 mi de N,N-dime-

tilmetilendiamina en baño termostatizado a 70 °C durante 12 horas. Se fi l tró

y lavó con agua destilada eb frío ( 5 °C). Se almacenó suspendido en agua a

5 °C.

12.2.5. PREPARACIÓN DE NYLON PARCIALMENTE HIDROLIZADO (NH).

El gel de nylon parcialmente hidrolizado se preparó por el

método descrito por Goldstein et al. (1974b),modificado ligeramente por noso

tros: 3 g de polvo de nylon, obtenido por el método 12.2.2, se suspendieron en

90 mi de CIH 4 M y se dejó agitando durante un di'a en agitador mecáríictr

de vaivén a temperatura ambiente. Al cabo de dicho tiempo, se f i l tró a través

de placa porosa (porosidad 4) y se lavó con agua destilada y sucesivas porcio

nes de etanol y éter. Después se pasó durante 15 minutos aire seco para elimi

nar el éter, y se almacenó en un desecador con pentóxido de fósforo.

En el caso de utilizar membrana de nylon, aproximadamente

unos 80 cm2 de membrana con su superficie amorfa, se introdujeron en un

matraz de 50 mi. Se le añadieron 45 mi de CIH 4 M, sometiéndose a conti

nuación al mismo procedimiento descrito para el gel de nylon, salvo que los

lavados se hicieron por decantación.

Cuándo se empleó tubo de nylon, un metro de tubo con



-176-

su superficie amorfa, se introdujo en un baño a 40 °C, y se le reciclaron, por

medio de una bomba peristáltica, 50 mi de CIH 4 M a 40 °C durante 3 ho

ras y a un flujo de 20 ml/h. La hidrólisis se detuvo por lavado con agua des

tilada, etanol y éter. Se guardó en desecador hasta su utilización.

12.2.6. PREPARACIÓN DE NYLON-BENCIDINA (NB)

NH (200 mg de gel, 50 cm de tubo ó 40 cm2 de membra

na), preparado por el método 12.2.5, se trató durante 4 horas a 10 °C con

50 mi de cloruro de metileno, 50 mi de bencidina y diciclohexilcarbodiimida

al 0,5 % cada una de ellas en cloruro de metileno. Se lavó con 50 mi de

cloruro de metileno, 50 mi de acetona y finalmente con 50 mi de agua desti

lada y se utilizó inmediatamente después de su preparación.(Daka y Laidler,

1978).

12.2.7. PREPARACIÓN DE NYLON POLIISONITRILO (NPI)

Gel de NPI se preparó según el método descrito por Golds-

tein et al. (1974b). En un matraz de 100 mi se suspendió 1 g de NH en 40

mi de isopropanol, se adicionaron 10 mi de acetaldehido y 4 mi de 1,6-diiso-

cianohexano, sintetizado como se describe posteriormente, y se dejó agitando

a temperatura ambiente durante 24 horas. Se f i l tró en placa porosa ( por. 4)

y se lavó en pequeñas porciones con 25 mi de isopropanol, 100 mi de éter

y se secó con aire seco.Para su conservación se guardó en un desecador con

pentóxido de fósforo a 5 °C en la oscuridad.

La si'ntesis de 1,6-diisocianohexano se llevó a cabo según

Goldstein et al. (1974a). Se disolvieron 60 g de 1,5-diaminohexano en 170 mi

de formiato de etilo por agitación sobre baño de hielo. Después de la comple

ta disolución y formación de un precipitado blanco, se le añadieron 50 mi

más de formiato de etilo. El compuesto insoluble formado, N,N-diformil,l,6-dia-

minohexano, se separó por decantación y se secó en rotavapor. El punto de

fusión del sólido fué de 105 °C. A una disolución de 150 g de cloruro de



-177-

p-tolueno sulfonilo en 300 mi de piridina secada con KOH, se le añadieron 30

g de N,N-diformil,l,6-diaminohexano, en pequeñas porciones y con agitación.

Una vez disuelto este compuesto y que el medio adquiriera un color oscuro,

se siguió agitando durante 2 horas a temperatura ambiente. A l cabo de este

tiempo, se añadieron 250 mi de agua y hielo picado para bajar la temperatura.

El 1,6-diisocianohexano formado, se extrajo con tres porciones de 150 mi de

éter, el extracto etéreo se lavó tres veces con 250 mi de agua, se secó con

sulfato sódico anhidro y el éter se evaporó en evaporador rotatorio Buchi. El

aceite crudo obtenido se destiló a vacío a presión inferior a 0,3 mm Hg y

temperatura de 90 °C. Se guardó en viales cerrados a —30 °C.

12.2.8. PREPARACIÓN DE NYLON POLIARILAMINA (NPAA).

El NPAA se preparó a partir del NPI por el método de

Goldstein et al. (1976). Se suspendieron 0,5 g de NPI en 50 mi de metanol

conteniendo 0,5 g de p,p<J¡aminofen¡lmetano y 0,15 mi de isobutiral. Después

se añadieron 0,5 mi de ácido acético glacial y se dejó durante 24 horas con

agitación a temperatura ambiente. El NPAA obtenido se separó por filtración

en placa porosa y se lavó con metanol y éter en pequeñas porciones, y se se

có durante 15 minutos con aire seco. El NPAA se guardó en un desecador

con pentóxido de fósforo a 5 °C.

12.3. INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA.

12.3.1. INMOVILIZACIÓN A SOPORTES CON GRUPOS ARILAMINA

ACTIVADOS CON ACIDO NITROSO.

Este método de unión se aplicó para la inmovilización de

tirosinasa a los soportes Enzacryl-AA, CPG-AA, NPAA y NB, en forma de gel.

Con Enzacryl-AA también se acopló protirosinasa. El procedimiento que se si-.,

guió para la unión por activación con ácido nitroso, fué, con ligeras modifica

ciones, el especificado por las casas suministradoras para el Enzacryl-AA y el



-178-

descrito por Hornby y Goldstein(1976) para el soporte NPAA.Cuando se emple

aron cantidades de gel menores de 100 mg para inmovilización, el tratamiento

con los distintos reactivos de acoplamiento se realizó por técnica de columna

de 0=0,9 mm, por reciclaje de los reactivos a través de la columna a una velo

cidad de flujo de 30 ml/h. Cuando las cantidades de gel fueron de 100 mg,

activación y acoplamiento se realizaron por técnica de baño con suave agitación

y se eliminaron los reactivos por filtración a vacío en placa de vidrio poroso

(por. 4). Todas las operaciones se realizaron en cámara fn'a a 3-5 °C. El tra

tamiento fué el siguiente: 100 mg de gel se suspendieron en CIH 2M, después

se trataron con una mezcla de 10 mi de CIH 2 M y 4 mi de N0 2 Na al 4 %

durante 1 hora. El derivado del soporte diazotado se lavó con 10 mi de tam

pón fosfato 0,1 M pH 7,0, después de lo cual se trató durante 48 horas con

disolución de proenzima o enzima en el mismo tampón conteniendo, según el

el experimento, de 5 a 10 U de actividad tirosina hidroxilasa, lo que corres

pondía a 1-50 mg de proteína, según el estado de purificación. El derivado

de enzima o proenzima inmovilizada se lavó con tampón fosfato 0,5 M pH

7,0, a temperatura ambiente, después con fosfato 0,1 M pH 7,0 y finalmen

te con agua destilada. Los derivados de enzima inmovilizada se etiquetaron co

mo Enzacryl-AA-IME, CPG-AA-IME, NPAA-IME y NB-nitroso-IME.

12.3.2 INMOVILIZACIÓN A SOPORTES CON GRUPOS ALQUILAMINA Y/O

ARILAMINA ACTIVADOS CON GLUTARALDEHIDO.

Se inmovilizó tirosinasa en los derivados NH, NAQA y NB

por activación con glutaraldehido por el siguiente procedimiento: Se trataron

100 mg de gel ó 40 cm] de membrana con 30 mi de disolución de glutaral

dehido al 12,5 % en tampón borato 0,2 M pH 8,5. La suspensión se dejó

agitando durante 1 hora a temperatura ambiente. Después el gel se f i l t ró en pla

ca porosa y la membrana o el gel se lavaron con tampón fosfato 0.1M pH 7,0

Posteriormente se les adicionó una disolución de enzima purificada CM/Phe

(5-50 mU de enzima por mg de gel o cm2 de membrana). Se dejó agitando



-179-

suavemente durante 24 horas en cámara fn'a (5°C). El derivado inmovilizado

se separó de la disolución por filtración o decantación y se lavó con tampón

fosfato 0,1M pH 7,0. El gel-IME se almacenó suspendido en tampón fosfato

0,1 M pH 7,0 a 5°C o se liofilizó y almacenó a —30°C, mientras que las

membranas-I ME se almacenaron en el tampón fosfato a 5°C. Para la inmovili

zación sobre tubo de nylon se siguió el mismo procedimiento que con geles,

salvo que el tratamiento con giutaraldehido y enzima se realizó por reciclaje de

de los reactivos a través del tubo a una velocidad de flujo de 20 ml /h; se u-

nieron 5-50 mU de enzima por cm lineal de tubo, y el tubo-IME se almacenó

a 5°C lleno de tampón fosfato 0,1 M pH 7,0. Los derivados obtenidos se de

nominaron como NAQA-IME, NH-IME y NB-glut-IME.

12.3.3. INMOVILIZACIÓN SOBRE NPI ACTIVADO CON ACETALDEHIDO.

Se inmovilizó enzima sobre gel de NPI por acoplamiento de

ambos con acetaldehido en presencia o ausencia de acetato, por el procedimien

to descrito por Hornby y Goldstein (1976).

Para la unión de la proteína en presencia de acetato, se sus

pendieron 100 mg de gel de NPI en 10 mi de una disolución de fosfato sódico

y acetato sódico 0,5 M de pH 7,0; se añadieron 25 mi de disolución de enzi

ma ( 50 mU/mg de gel) y 0,5 mi de acetaldehido y se dejaron agitando duran

te 24 horas, después de lo cual se f i l tró y se lavó con agua destilada. El deri

vado obtenido se etiquetó como NPI-acético-IME y se almacenó suspendido en

agua destilada a 5°C. Todas las operaciones se realizaron en cámara fría (0-5°C)

Para el tratamiento en ausencia de acetato, se suprimió la a-

dición de los 10 mi de disolución: fosfato-acetato y se aumentó el volumen de

acetaldehido a 2 mi. En este caso el derivado se denominó NPI-IME.



-180-

12.4. DETERMINACIÓN DE PROTEINA.

Para la determinación de proteína se utilizó una modificación

del método de Lowry propuesta por Hartree (1972). El procedimiento fué el

siguiente: A 1 mi de disolución, conteniendo 5-120 g de proteína, se le adi

cionaron 0,9 mi de disolución A, y la disolución resultante se calentó durante

10 minutos en un baño a 50 °C. Posteriormente se enfrió a temperatura am

biente y se añadieron 0,1 mi de disolución B y se agitó. Después de 10 minu

tos a temperatura ambiente se añadieron 3 mi de disolución C, se agitó, se

mantuvo durante 10 minutos a temperatura de 50 °C, luego se enfrió a tempe

ratura ambiente y se midió la absorbancia a 650 nm en un espectrofotómetro

Hitachi 100-60 frente a un blanco exento de proteína. Se determinó la concen

tración de proteína comparando con una curva de calibrado construida emple

ando albúmina de suero bovino como proteína patrón.

Disolución A: 2 g de tartrato sódico potásico y 100 g de

carbonato sódico disueltos en 500 mi de NaOH 1 M y llevados a 1 litro con

agua bidestilada.Disolución B: 2 g de tartrato sódico potásico y 1 g de sulfato

de cobre disuelto en 90 mi de agua bidestilada y 10 mi de NaOH 0,1 M.Diso

lución C: Un volumen de reactivo de Folin-Ciocalteu por cada 15 volúmenes

de agua bidestilada; se prepara inmediatamente antes de usarla.

La cantidad de proteína unida en cada uno de los derivados

inmovilizados obtenidos, se determinó por diferencia entre la cantidad de pro

teína en las disoluciones antes y después de la reacción de acoplamiento.

12.5. DETERMINACIÓN DE ASCORBATO.

Muchas de las experiencias que se realizaron ocurrían con

un consumo de ascorbato a lo largo del tiempo de reacción. La variación de

la concentración de ascorbato con el tiempo se estudió, de forma directa mi

diendo la absorbancia a 265 nm, longitud de onda a la que el ascorbato pre-



-181-

senta un máximo de absorción y a la que no interfiere el cambio espectral

provocado por la conversión de L-tirosina a L-dopa en las reacciones enzimáti-

cas de la tirosinasa. Se calibró el método con patrones que contenían L-tirosi

na 2 mM en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 y añadiendo ascorbato inmediata

mente antes de medirse, a partir de una disolución concentrada (1 mM), prepar

rada dentro del mismo di'a. En estas condiciones la curva de calibrado dio:

Ascorbato(mM)=0,116-Ab265 — 0,001 , siendo lineal hasta valores de 1,5 unida

des de absorbancia.

12.6. DETERMINACIÓN DE OXIGENO DISUELTO.

La determinación del oxígeno consumido en las reaccio

nes catalizadas por tirosinasa soluble e inmovilizada, se llevóa cabo polaro-

gráficamente mediante un oxígrafo de la firma Yellow Sprig modelo YSI-53,

con electrodo de Clark y dotado de células termostatizadas con baño de pre

cisión de 0,01°C. Para el ensayo estándar, 5 mi de disolución de tirosina o

dopa, de concentración especificada en cada experimento, se adicionaron a una

de las células del oxígrafo, provistas de un agitador magnético. Se burbujeó

aire en la disolución para alcanzar la saturación, lo que correspondió a una

concentración de oxígeno de 0,26 mM (Yamaguchi et al., 1969) en tampón

fosfato 0,1 M pH=7,0. A continuación se añadieron 0,2 mi de disolución de

enzima ó 4 mg de derivado inmovilizado. Inmediatamente se introdujo el elec

trodo y se registró la desaparición de oxígeno con el tiempo de reacción.

12.7 DETERMINACIÓN DE L-DOPA.

Se enSpleó el método descrito por Arnow(1937) modificado

por nosotros. Se basó en la formación de un derivado diazotado de la L-dopa,

que en medio ácido da un color amarillo estable que puede medirse colorimé-

tricamente a 460 nm. En el método original de Arnow, el complejo formado

tomaba una coloración roja por adición de NaOH, midiéndose la absorbancia

a 495 nm. Pero aunque de esta forma la sensibilidad era mayor, el color fué



-182-

muy inestable, lo que ocasionaba una gran imprecisión en el método.

El procedimiento aplicado fué el siguiente:A 1 mi de disolu-

que contenía L-dopa (0,005—1,5 mM) se le añadió 1 mi de CIH 0,5 M. A con

tinuación se trató con 1 mi de una disolución formada por N0 2Na al 15% y

Mo04Na al 15 % ; se agitó intensamente con un agitador de tubos Mixotub-

Gricel, dejándose en reposo durante 5-15 minutos. La agitación intensa fué ne

cesaria cuando las medidas se realizaban en presencia de ascorbato (Letts y

Chance, 1974). Si en el medio existía material insoluble, como partículas de

gel-IME, la disolución resultante se f i l tró a través de un f i l tro tipo jeringuilla

con papel Wattman n°3. Se leyó la absorbancia de la disolución frente a un

blanco, exento de L-dopa, a 460 nm. El método dio una linealidad de absor

bancia para una concentración de L-dopa en el rango de 0,002—0,8 mM ( E =

l ,22-10"3mor lcm"1); para concentraciones de 0,8—1,5 mM la curva de calibrado

se ajustó a una ecuación de segundo grado.Midiendo a 420 nm el método fué

algo más sensible (E=l,85-10"3mol"'''cm"1), pero disminuyó el intervalo de con

centraciones en que la respuesta fué lineal ( 0,002-0,4 mM). Dado que en nues

tro caso se manejaron normalmente concentraciones elevadas de L-dopa (0,1—

1,0 mM), se prefirió la medida a 460 nm, tal como se ha descrito.

12.8 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.

12.8.1. ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE LA PROTEINA SOLUBLE

La determinación de actividad se basó en la medida de la

L-dopa formada en un tiempo determinado de reacción, utilizando L-tirosina

como sustrato. Para evitar la oxidación de la L-dopa a la forma de quinona

por efecto de la actividad d opa oxida sa de la misma enzima,'se adicionó al me

dio de reacción ascorbato sódico. El procedimiento fué el siguiente: Se colocó

en un tubo de ensayo, 0,2 mi de disolución de enzima, previamente activada

con tripsina según el método descrito en 12.1.3. Se añadió 1 mi de disolución

de sustrato ( L-tirosina 2,5 mM; ascorbato 2,5 mM; en tampón fosfato 0,1 M

a pH=7,0) y se dejó reaccionar durante 10 minutos a 25 °C, después de lo

cual se detuvo la reacción por adición de 1 mi de CIH 0,5 M y se midió la



-183-

L-dopa formada por el método colorimétrico descrito en 12.7. Se comprobó

que en las condiciones descritas, la velocidad de reacción se mantuvo constante,

en el intervalo de tiempo empleado y que no existió el periodo de retardo ca-

rasten'stico de la actividad tirosina hidroxilasa (Pomerantz, 1966; García Carmo-

na, 1980).

12.8.2. ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE TIROSINASA I N M O V I L I

ZADA.

Para medir la actividad de la enzima inmovilizada en geles,

a 10 mg de gel-IME liofilizado, o su equivalente húmedo, se adicionaron 5 mi

de disolución sustrato (L-tirosina 2,5 mM y ascorbato2,5 mM en tampón fosfa

to 0,1 M pH=7,0). Se mantuvo agitando en un agitador mecánico de vaivén du

rante 30 minutos. A los 15 y 30 minutos respectivamente, se tomaron alícuotas

de 1 mi y se añadieron en tubos de ensayo que contenían 1 mi de CIH 0,5 M

y se determinó la concentración de L-dopa por el método descrito en 12.7.

Si la enzima estaba inmovilizada en membranas, el ensayo

de actividad consistía en adicionar 1 cm2 de membrana-1 ME a cada uno de des

tubos, conteniendo 1 mi de disolución sustrato. A los 15 minutos en el primer

tubo y a los 30 en el segundo, se adicionó 1 mi de CIH 0,5 M y a continua

ción se determinó la concentración de L-dopa formada.

En el caso de enzima inmovilizada en la superficie interna

de tubo de nylon, se recicló 1 mi de disolución sustrato, a una velocidad de

flujo de 1 ml/min, a través de 2 cm de tubo-IME, durante 15 minutos. A con

tinuación se añadió 1 mi de CIH 0,5 M y se midió la concentración de L-dopa

formada. Con otros 2 cm de tubo-IME se repitió el ensayo para 30 minutos de

tiempo de reacción.

Los métodos anteriormente descritos se consideraron como

métodos estándar de medida de la actividad de enzima inmovilizada (Act|(yj^).

Para el estudio de la actividad manifestada por I ME en reactores funcionando

durante largo tiempo (Actp), se empleó siempre como criterio la determinación

de L-dopa formada en la disolución producto de reacción. Así, en reactores de



-184-

baño discontinuo, se tomaron alícuotas de 1 mi a distintos tiempos a lo largo

de la vida de uso del reactor y se determinó la concentración de L-dopa en

las alícuotas. En el caso de reactores de flujo continuo, el producto de reac

ción se recogió en una serie de fracciones tomadas a un tiempo definido y

durante 1 hora por fracción, determinándose posferiormente la concentración de

L-dopa en cada una de ellas.

En todos los casos, se definió la unidad de actividad (U),

como se ha realizado para la enzima soluble. La actividad de los derivados in

movilizados se expresó en mU/mg de gel para los geles-IME, en mU/cm2 para

las membranas-IME y en mU/cm lineal de tubo para los tubos-IME.

12.8.3. ACTIVIDAD DOPA OXIDASA DE TIROSINASA

La determinación de la actividad dopa oxidasa de tirosinasa

se basó en la medida espectrofotométrica directa, a 475 nm, del dopacromo

formado como producto de la oxidación de la L-dopa. Para ello a 0,1 mi de

disolución de tirosin'asa, previamente activada (método 12.1.3), se añadieron 2,9

mi de disolución saturada de L-dopa (2 mg/ml) en tampón fosfato 0,1 M a

pH 7,0, y se siguió la formación de dopacromo a 475 nm.(E=3,7-103mor ,cm" l>

Waite, 1976). La unidad de actividad dopa oxidasa se definió como la cantidad

de enzima que catalizó la formación de 1 micromol de dopacromo por minuto

a 25 °C y pH 7,0 (Fling et al. 1963) y en términos de velocidad inicial.

12.8.4. DETERMINACIONES CON EL ELECTRODO DE TIROSINASA INMO

VIL IZADA

Para la preparación del electrodo de enzima, se inmoviliza

ron 50 mi l de tirosinasa purificada por cm2 de membrana modificada como

NB-glut-IME, según método descrito en 12.2..6 y 12.3.2. y se conservó en fri

gorífico (5o) suspendida en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0. Mediante una a-

randela de goma, la membrana-IME junte con una membrana de teflón^ se fija

ron a un electrodo de oxígeno tipo Clark.

Para realizar un ensayo de respuesta del electrodo frente a



-185-

una disolución de un sustrato de la enzima se siguió el procedimiento siguiente:

2 mi de tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0, saturados de aire por burbujeo, se co

locaron en la cubeta de ensayos del oxigrafo, se introdujo en electrodo de en

zima y se ajustó el 100 % del aparato manteniendo la disolución agitada con

agitador magnético. A continuación, se sustituyó la disolución de tampón por

2 mi de la disolución conteniendo sustrato en una determinada concentración

e igualmente saturada de aire, se introdujo de nuevo el electrodo de enzima

y se registró el porcentaje de oxi'geno consumido, en función del tiempo. Fina

lizado el ensayo, el electrodo se lavó con agua destilada y se equilibró de nue

vo con tampón saturado de aire durante 5 minutos. Todos los ensayos se rea

lizaron a 25°C.



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Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi ...rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/16546/1/Vilanova-Gisbert-Eugenio.pdf · APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA A LA SÍNTESIS