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UNIVERSIDAD DE MEXICO

Facultad de Ciencias

CULTIVO IN VITRO Y CARACTERIZACION DE MICELIOS DE BASIDIOMYCETES ECTOMICORRIZOGENOS

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(BIOLOGIA) p es en ta

BLANCA SUSANA CRUZ ULLOA

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CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ..................................................... 1 ANTECEDENTES .................................................... 3 Definición de micorriza ................................................. 3 Historia y clasificación de la micorriza .................................... 3 Hongos ectomicorrizógenos en la práctica forestal .......................... 6 Historia de cultivos puros de hongos ectomicorrizógenos .................... 7 Selección de hongos para inoculación ..................................... 7

OBJETIVOS .......................................................... 9

MATERIALES Y MÉTODOS ......................................... 10

Zonas de recolección .................................................. 10 Método de recolección ................................................. 10 Método de aislamiento ............... · ................................. 10 Caracterización de cultivos puros ectomicorrizógenos ...................... 13 Almacenamiento de cultivos puros ...................................... 15

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................ 17

Posición taxonómica de las especies aisladas .............................. 17 Especies aisladas en cultivo puro ........................................ 19 Caracterización de los micelios en cultivo puro ............................ 20 Caracterización de los cultivos preseivados 12 meses en aceite mineral ....... 88 Características macroscópicas de la colonia .............................. 109 Características microscópicas del micelio ................................ 110 Pruebas químicas .................................................... 115

CONCLUSIONES ................................................... 123

LITERATURA CITADA ............................................. 124

Lista de tablas:

l. Entidades federativas de las zonas de recolección

2. Clave de las especies aisladas en cultivo puro

3. Tasa de crecimiento de los micelios aislados en diferentes medios de cultivo

4. Características miceliales macroscópicas y microscópicas de Jos cultivos puros

5. Reacciones de Jos micelios en cultivo puro a las diferentes pruebas químicas

6. Características mice!ialcs de los cultivos puros preservados.

7. Reacciones de Jos micelios preservados a las diferentes pruebas químicas.

Lista de figuras:

l. Amanitagemmata SCOl

2. Amanita gemmata SC02

3. Ama11ita muscaria var.flavivo/va/a SC03

4. Amanita muscaria var.flm•ivo/vata SC04

5. Amanita pamherina SC05

5. Amanita pantheri11a SC06

6. Amanita rubescens SC07

7. Amanita rubescens SC08

8. Amanita rubescens SC09

9. C/itocybe odora SClO

10. Co/lybia afL maculata SCll

11. Hebe/oma saccharioleris SC13

12. Hygrophoms rn.w1/a SC14

13. Inocybe bresadolae SC15

14. Inocybe geophy/la "ª'· lílacina SCJ 6

15. Inocybe grammata SCl 7

16. Laccaria amethystína SC18

17. Laccaria bicolor SC19

18. Laccaria /accala SC20

19. Laccaria /accata SC21

20. Lactarius chrysorr/1e1L< SC22

21. Lycoperdon ca11did11m SC24

22. Lycoperdo11 curtisii SC25

23. Lycoperdon ericetomm SC26

24. Lycoperdon perlatum var. perlalllm SC27

25. Lycoperd011 pusi//11111 SC28

26. Lycoperdo11 spadiceum SC29

27. Lycopcrdon 11mbri11um SC30

28. !'isolitlms tinctorius SC31

29. l'isolíthus tinctorius SC32

30. Rl1izopogon isabellimis SC33

31. Rhizopogon luteolus SC34

32. Rhizopogon mbescens SC35

33. Suil/1is gra11u/at1is SC36

34. Suil/llS gram1/at11s SC37

35. Suillus granulatus SC38

36. S11i/lus /11teus SC39

37. Sui/lus punctatus SC40

38. Sui/lus tome11tos11s SC41

39.Amanita nibescen' SC07

40. Clitocybe adora SClO

41. Hebe/oma sacc/1ariolen' SC13

42. Inocybe grammata SCl 7

43. laccaria amethystina SC18

44. Lactarius cluysorrlieus SC22

45. Lycoperdon per/at11m var. per/atum SC27

46. Lycoperdon spadiceum SC29

47. Rliizopogon isabelli1111s SC33

48. Rhizopogon nibescem SC35

RESUMEN

Las micorrizas, como asociaciones planta-hongo indispensables en Ja naturaleza, se han es­tudiado desde diferentes puntos de vista; sin embargo se considera que en México nun son incipientes las investigaciones en este campo, por Jo que en el presente estudio se obtienen nuevas cepas y se amplían las caracterizaciones, las cuales podrían ser utilizadas en las in­vestigaciones sobre micorrización.

El presente trabajo tiene como finalidad Ja formación de una colección de micelios de hongos ectomicorrícicos, desde su aislamiento, hasta su propagación y caracterización para formar cultivos base (stock).

Las especies consideradas pertenecen a Jos ordenes de Jos Agaricales, Hymenogastrales, Sclerodcrmatales y Lycoperdales, recolectadas en varias localidades de los estados de Méxi­co, Morelos, Oaxaca, Tlaxcala y Distrito Federal, en bosques de Pimt.S spp., Pi1111s spp. -Querc11.S spp. y Abies religiosa.

Los aislamientos se obtuvieron en diferentes medios de cultivo. Los cultivos puros se propagaron en medios nutritivos como MMN, PDA, EMA y V8-agar, caracterizándose tan­to su morfología macroscópica y microscópica como químicamente, con base en los criterios de diversos autores. La confirmación de que el micelio aislado corresponde al hongo basi­diomiceto, se basó en el número de repeticiones en el aislamiento, en el tipo de crecimien­to, en la presencia de fibulas, en las características macroscópicas de los micelios y en las re­ferencias bibliográficas.

Se lograron 39 cultivos puros de especies correspondientes a Hygrophoraceae, Amanita­ceae, Cortinariaceae, Boletaceae, Russulaceae, Rhizopogonaceae, Pisolithaceac y Lycoper­daceae, que se tienen preservados en aceite mineral.

Se demuestra que existe gran variabilidad de las condiciones que se deben de manejar en laboratorio para desarrollar estns especies, con lo que se puede presumir que existen in­teracciones complejas en Ja naturaleza que aún falta definir. La caracterización de los mice­lios y su preservación representan un avance ya que establecen los fundamentos de referen­cia en el estudios de las ectomicorrizas y para investigaciones sobre micorrización a gran esenia, así como en otras áreas de investigación.

SUMMARY

Plant-fungi mycorrhiwl associations are always present in naturc, they havc been studicd from different points of view by researchers ali over the world. Howevcr, fcw researchs has been done in Mexico about this tapie and does not exist in this country a collection of basi­diomycetes mycorrhyzae myce!ia, this is need far future researchs.

The am. of the research was thc iniciation of a collcction with isolates, characterization and propagation of them in arder to get a group of stock cultures.

The species were collected from places of Distrito Federal, State of Mexico, Marcios, Oaxaca and Tiaxcala Pinus spp., Pinus spp.-Quercus spp. and Abies religiosa forests.

The isolates wcre obtained in Iaboratory and in thc field using differcnt cultural media. Thc pure cultures wern grown up in PDA, MMN, EMA and VS-agar, and macroscopically, microscopically and chemically characterizcd with the criteria given by diffcrent authors.

Basydiomycetes characters were consideredin arder to confirm that the mycelia in pure culture carne from them. The pure cultures wcre preserved in sterile mineral oil.

Tlúrty ninc pure cultures were obtained from species of Hygrophoraceae, Amanitaccac, Cortinariaceae, Boletaceae, Russulaceae, Rhizopogonaceae, Pisolithaceae and Lycopcrda­ceae families.

It was confirmed there is variahility according to the laboratory conditions so we need adaptations to manipula te in arder to grow the species, so we can say that complex group of interactions exist in nature not yet define. The mycelia charncterization represents the basic knowledge for future studies. Advances in the preservation techniques and studies of the persistance of mycclia characteristics are presented in this research, to be sure of efficient managment of the pure cultures. TI1ese mycelia are nccessary for pure culture mycorrhizal studies and research in great sea le, including the applied approach.

INTRODUCCIÓN

En México existen 38.9 millones de hectáreas arboladas, de las cuales 27 corresponden a bosques de climas templados; de éstos, 18.7 millones de hectl1reas son de coniferas y latifo­liadas. Las 11.9 millones de hectáreas restantes corresponden á selva alta y mediana (Vela, 1980; Sánchez, 1980). Estas cantidades resultarían muy halagadoras por sus dimc11sioncs. Sin embargo, si consideramos que nuestro país tiene una superficie total de 200 millones de hectáreas, y que casi el 50% podría estar ocupada por áreas forestales, entonces estos datos muestran un grave deterioro que por desgracia aumenta con rapidez.

En México sólo el 40.8% del territorio nacional en 1960 presentaba vegetación sin dis­turbios, hoy en dia ocupa el tercer lugar dentro de los países con desforestación, con una ta· sa de 500 mil hectáreas desforestadas por año de 1981 a 1985, además 200 mil hectáreas se pierden por incendios y 1 millón de hectáreas al año por expansión humana. Los 80 millones de hectáreas sin disturbio que teóricamente existían en la década de los setenta se han redu­cido a 65 millones en 1990 (Toledo, 1988).

Nuestro país es rico en especies de pináceas ya que cuenta con regiones microclimáticas muy diversas que permiten su desarrollo. Además, México tiene 40% de especies del total registrado para el mundo, lo que demuestra su riqueza forestal (Martínez, 1948; Russell, 1961). Es importante mencionar que el 15% de la superficie del país tiene bosques de pino­encino. Las zonas de mayor distribución corresponden a las Sierras Madre Oriental y Occi­dental, Macizo Central, Baja California e Isla de Cedros. La mayor parte de las especies se localizan en altitudes que van de los 500 a los 2800 msnm (Eguiluz, 1977, 1978 y 1982: Nie­to, 1985).

Las características de las áreas ecológicas naturales en México, en la mayoría de los ca­sos se desconocen, por lo que la introducción de especies de otras localidades, producidas en viveros, llegan a ocasionar desequilibrio en el ecosistema natural (Ow.:n, 1977; SCinchcz, et al., 1979; Sánchez, 1980).

En los bosques naturales se forman microecosistemas en donde las bacterias, actinomi­. cetos y hongos del suelo tienen una función particular, de tal manera que el conocimiento

de las relaciones intrnespecíficas e interespecíficas son fundamentales para lograr un mejor uso y manejo adecuado de los ecosistemas (Robinson, 1967; Rzendowski y Vela, 1977).

Un aspecto fundamental de esta interrelación es la simbiosis establecida entre las raíces de las plantas y los hongos. Esta relación se denomina micorriza y la mayoría de las plantas la presenta, teniendo ambos participantes beneficios mutuos. La planta le proporciona al hongo los compuestos orgánicos de la fotosíntesis, y el hongo facilita la captación de nutri· mentas del suelo, principalmente fósforo, cobre y zinc (Ferrera, 1976; Azcón y Barea, 1980; Schenck, 1982; Miller, et al., 1986; Harlcy, 1989).

Existen infinidad de investigaciones sobre la morfología de las micorrizas ( Macdonel, 1963; Zak, 1971; Mark y Foster, 1973; Massicotte, et al., 1986, 1987a, 1987b). L~s más re­cientes abordan temas sobre la función de la micorriza en cuanto a la eficiencia en la capta· ción de nutrimentos del suelo (Bowen, 1973; Benckjord, et al., 1984), en la eficiencia sobre el crecimiento de las plantas (Jorgensen y Shoulders, 1967; Maronek y Hendrix, 1979), so· bre la infección micorrícica (Bowen y Theodorou, 1973; Daughtridge, et al., 1986) la cspeci· ficidad de los simbiontes (Cuevas, 1979; Malina, 1979; Cline y Reid, 1982; Chu-Chou y Gra­ce, 1982; Dani•:lson, 1984; Miller, et al., 1986), y el cultivo de micelios (Vozngakovskaya y Ryzkova, 1958; Fontana, 1968; Malina y Palmer, 1983; Pantidou, et al., 1983), entre otros. Sin embargo, en México se ha estudiado poco al respecto.

Los cultivos puros que se obtienen y mantienen en laboratorio son útiles no sólo para la inducción micorrfcica, sino también para la realización de investigaciones en áreas como la bioquímica, genética, fisiología, morfología y ecología, principalmente en estudios foresta· les.

El presente trabajo tiene como finalidad la formación de una colección de micelios de hongos ectomicorrizógenos desde su aislamiento, propagación y caracterización, con el fin de formar cultivos base (stock) útiles para investigaciones futuras.

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ANTECEDENTES

Definición de micorriza

El término micorriza deriva de los vocablos griegos ¡w1eer que significa "hongo" y p1~a, "raíz", esto es, hongos de la raíz de plantas superiores. La mayoría de las plantas forman mi­corrizas; sólo casos excepcionales, como Cruciferne y Chaenopodiaceae, carecen de esta re­lación. La relación micorrizógena es un tipo de simbiosis mutualista debido a que ambos participantes, hongo y planta, reciben beneficio recíproco para su supervivencia en ecosiste­mas naturales. El hongo forma una red de hifas alrededor de la raíz y de allí tiene relación con toda la planta. El hospedero produce la energía química a través de la fotosíntesis. Ade­más, la relación es benéfica pues incrementa la resistencia a las enfermedades (Marx, 1969a,b; Marx y Davey, 1969 y Stack y Sinclair, 1975b), para la resistencia a la sequía y lasa­linidad y favorece la fijación del nitrógeno, para el caso de las leguminosas (Spurr y Barnes, 1980). Las micorrizas son importantes en el ciclo de los nutrimentos, ya que los absorben, trasladan y almacenan, evitando que se pierdan por lixiviación del suelo. Cuando se repro­ducen desarrollan cuerpos fructíferos que tienen grandes cantidades de estos compuestos; al descomponerse los integran nuevamente al sucio, o bien alimentan a insectos o animales su­periores. También pueden transformar las sustancias orgánicas complejas y minerales en nutrimentos utilizables (Wilde, 1968).

Historia y clasificación de la micorriza

El primero en describir la relación micorrizógena fue Frank en 1885 (in Miller, et al., 1986), pero fue hasta los últimos 20 años cuando los agricultores han dado importancia a las mico­rrizas en el mejoramiento de sus cultivos. Antes de conocer la asociación micorrícica, se sa­bía que los microorganismos, incluyendo los hongos, vivían en relación con las raíces de las plantas. Posteriormente, al iniciarse las investigaciones en pináceas, se observó que las raí­ces eran diferentes entre sí debido a las micorrizas. Las investigaciones modernas se inicia­ron en la década de los cincuenta, y se intensificaron en la década de los sesentas ; en los se-

tenlas se dio una mayor actividad y diversidad de enfoques en las investigaciones (Millcr et al., 1986). En la actualidad es un temu muy estudiado en todo el mundo (Harlcy, 1989).

Al principio, las micorrizas se clnsiflcaron en cctotróficas y cndotróficas, basándose en el tipo de estructuras que formaba el hongo con la rníz. Posteriormente se agruparon en endo­micorrizas, ectomicorrizas y ectendomicorrízas con base en la pcnctrnción de las hifas en las células de In raíz (Pcyronel, et al., 1969). Harley y Smith (1983), describieron 7 tipos de mi­corrizas: vesícula-arbuscular, cctomicorrizas, cn<lomicorrizas, arbutoidc, crícoide, monotro­poide y orquidioide. Cada tipo de micorriz;i forma diferentes combinaciones de estructuras (Mil!er et al., 1986).

Las endomicorrízas sun también dcnominndas micorrízas vesícula arbusculares ya que las !tifas del hongo se establecen en el interior de la rníz y adquieren esas formas. La mico­rrlza vesículo-arbuscular se presentan en Briofitas, Pterídotitas, Gímnospcrmas y Angios­permas, siendo de particular importancia el que se presenten en tocias las plantas de interés agrícola e industrial (Baylis, 1969; Trappe, 1977).

La micorriza vesículo-arbuscular cambia poco la morfología de la raíz. L1 infección se origina por la propagación del micelio en la raíz, o por la germinación de clamidosporas o de esporas de resistencia que forman apresorios sobre la superficie de la misma y penetran a ella. Una vez en el interior de la raíz se ramifica entre las células de la corteza. Estas hifos no invaden la endodermis, ni los tejidos vasculares, ni Jos mcristemos. Además, se forman arbúsculos a partir de las ramificaciones, cuya función es absorber almidón de la célula ve­getal y, a su vez, éstos finalmente son absorbidos por ella. Las vesículas son estructuras ovoi­des con material lipídico que actuan como estructuras de reserva. Algunas hifas emergen de la raíz y se desarrollan formando el micelio externo, para absorber los nutrimcnlos. A partir de este micelio se forman las clamidosporas (Powcll, 1982; Miller, eJ al., 1986).

La mayor parte de los hongos que forman la micorriza vesículo-arbuscular, pertenecen a la familia Endogonaceae de los Mucorales, principalmente los géneros: Glomus, Sclcrocys­tis, Gigaspora y Acaulospora (Azcón y Barca, 1980).

Las ectomicorrizas se forma solamente con el 5% de plantas vasculares (Powell,1982) en las que predominan familias de importancia económica como las Pinaceae, Fagaccae-Betu­laceae (Trappe, '1977).EI hospedero estricto es raro y una plantu puede formar micorriza si­multáneamente con muchos hongos (Dominik, 1969) y muchos hongos pueden ser específi­cos para un solo género de hospedero; aunque es com{111 un amplio rango de hospederos en un diversas zonas geográficas (Marx,1977). Trnppe (1977) estimó que 2000 hongos pueden probablemente forar ectomicorrizas con Pseudotsuga menzíesii. El proceso de infección se inicia cuando el hongo coloniza la superficie de las raíces secundarias cortas de la raíz y con frecuencia forma un manto grueso a su alrededor. Las hifas penetran a la raíz entre las célu· las corticales, formando una serk de hifas interconectadas denominadas red de llnrtig (Fos­ter y Marks, 1967). En esta zona es donde existe contacto con Ja raíz para d intercambio de nutrientes. El hongo produce hormonas que estimulan el crecimiento y ramificación de las rníces de la planta, incrementando de esta manera la superficie de absorción. La forma de ramificación es característica en cada hospedero. L1s ectomicorrizas de los pinos snn fre-

cuentemente bifurcadas o con ramificaciones dicotómicas, pero pueden predominar las es­tructuras pinnadas, coraloides, tuberculadas o de ramificación variable (Dominik, 1969; Zak, 1973). Las ectomicorrizas pueden formarlas infinidad de especies de hongos superiores principalmente de los Ascomycetes y Basidiomycetes con un amplio rango de hospederos y ocasionalmente de los Phycomycetes, de allí la diversidad en la forma y fisiología de éstos (Malina y Trappe, 1984).

Los hongos que forman esta asociación pertenecen al orden de lo• Agaricales principal­mente en familias: Hygrophoraceae, y Tricholomataceae, Amanitaceae, Cortinariaceae, Bo­letaceae, Gomphidiaceae, P1cxillaceae, Russu!aceae y Tricholomataceae. En los Aphyllop­horales las familias Cantharellaceae, Clavariaccae, Hydnaceae, Telephoraceae y Polyporaceae. Se incluyen los ordenes de Hymenogastrales, Hysteriangialcs, Lycoperdales, Phallales, Podaxales y Sclerodermatales con una o dos familias importantes cada uno. Para la clase Ascomycetes, los órdenes: Pezizales, Plectascales y Tuberales y dentro de los Deute­romycetes, los géneros Cenocaccum y Myceli11m (Trappc, 1962).

Trappe (1962) y Hacskaylo (1969) reconocieron 91 géneros como mieorrizógenos, 63 de ellos corresponden a los Agaricales, 14 a los Aphylloplmrales, principalmente de los Telep­horaceae y calcularon que el 80 % de las spp micorríc:icas se encuentran entre los Boleta­ceae, Tricholomataceae, Cortinariaceae, Russulaceae y Amanitaceae. Desgraciadamente la demostración experimental sobre la aptitud de los Agaricalcs para vivir en simbiosis con las raíces de los vegetales no se ha hecho en todas las especies, se tienen datos deAma11ita, Ba­letus, Cantharellm, C/itapilus, Clitacybe, Carlinarius, Entalama, Lactarius, Lepiota, Paxillus, R11ss11/a y Triclwlama los cuales corresponden solo al 10% de los hongos ect.omicorrizóge­nos. Para muchas otras especies se tiene poca información que justifique su clasificación co­mo ectomicorrícicos entre otros citan a Gamphidius, llygrapharns e fnacybe (Bruchet,1973).

Las plantas que establecen la asociación ectomicorrizógena se encuentran dentro de las Gymnospermas como: Abies, Araucaria, Cedms, C11pressus, Jimipems, Larix, Picea, Pinus, Pse11tlats11ga y Tsuga. En las Angiospermas se presenta aproximadamente en 30 géneros, en­tre otros Acer, A/nus, Betula, Castanea, Cas11ari11a, Cercacarpus, Dryas, E11calipt11s, Fagus, Fra.xi11us, Jug/ans, Platanus, Papu/us, Pnmus, Quercus, Sali.t, U/mus y Vitus (Harley y Smith, 1983; Trappe, 1962).

La ectendomicorriza se considera como un subtipo de la ectomicorriza debido a que for­ma un manto delgado y traslúcido, con las células epidérmicas generalmente de color more­no. Presenta ramificaciones como en las ectomicorrizas pero con los pelos absorbentes os­curos. Forman también la red ele Hartig pero el hongo penetra a las célolas corticales (Molinn y Trappe, 1984). Los Discomycetes forman esta asociación y son muy comunes en los viveros (Warcup yTalbot, 1966, Warcup, 1975; Wilcox, 1983).

Los estudios realizados sobre ectomicorrizas abarcan diversos aspectos, sobre la morfo­logía externa de la formación micorrícica (Turner, 1962; Zak, 1973; Brown y Sinclair, 1981; '· Fortín, et al., 1980; Fortín, et al., 1983 y Castellano y Trappe, 1985); la citología y ultraes­tructura de la ectomicorriza (Birraux y Fries, 1981; Debaud, et al., 1981; Warrington, et al.,

1981), y la colonización e infección primaria de la raíz en plántulas de pino con hongos ecto­micorrizógenos (Brown y Sinclair, 1981; Fortín, et al., 1983), pero hay pocos trabajos sobre las características del micelio extramatrical antes y después de la infección. Agcrer (1987) desarrolló investigaciones sobre la caracterización en fresco de ectomicorrizas extraídas di· rectamente de la raíz, formadas por especies del género Corti11ari11s con Picea abies.

El estudio de la formación ectomicorrícica requiere del cultivo de micelios de hongos en laboratorio para inducir la asociación i11 vitro, para conocer la capacidad de infección y la es­pecificidad de cada uno de los hongos aislados y cultivados con el hospedero. Son muy esca­sas las investigaciones sobre cultivos puros, sobre las características macroscópicas, micros­cópicas y químicas de los micelios en diferentes medios y sobre técnicas de conservación en colecciones de ceparios.

Hongos ectomicorriz6genos en la pníctica forestal

El conocimiento de las micorrizas se ha logrado a través de su aplicación práctica en los bos­ques. A principios de siglo se hacían plantaciones de pinos exóticos en áreas donde no se presentaban sus hongos simbiontes. Con el tiempo se tletem1inó que sólo con la inoculación de propágulos nativos del suelo, los árboles sobrevivían y funcionaban adecuadamente.

En los últimos 40 años se han hecho investigaciones sobre la compleja fisiología y ecolo­gía de las ectomicorrizas cuya información ha desarrollado programas forestales en todo el mundo. Actualmente se trabaja en la tecnología para la producción de inóculo a gran escala, para micorrizar plántulas en los viveros y en plantaciones, con hongos ectomicorrizógenos seleccionados (Marx et al., 1982). L~ producción comercial de cultivos puros de hongos cc­tomicorrizógenos amplfa las posibilidades de su aplicación (Le Tacan et al., 1985; Hung y Malina, 1986a; Mauperin, 1987). El éxito de estos programas de inoculación se basa en la selección de los hongos simbiontes efectivos y benéficos en la asociación (Castellano y Trap­pe, 1985). Pero se tienen pocos datos sobre los mejores hongos para inocular una especie particular de hospedero (Malina, 1977; Malina y Trappe, 1984).

Para que la aforestación con pinos exóticos en islas tropicales, en pastizales o en las este­pas, se realice con éxito, se requiere de la previa inoculación de las plántulas (Hatchell y Marx, 1987). Además se hace necesaria la fumigación para eliminar los patógenos en los vi­veros, pero afecta la asociación micorrícica ya que elimina la competencia entre los hongos ectomicorrizógenos nativos y los inoculados (Graham y Linderman, 1981a; Marx, 1981).

La inoculación ectomicorrizógena ofrece alto porciento de éxito en la reforestación de zonas deterioradas. L~ reforestación en lugares secos, cálidos o fríos mejoraría si las plúntu­las fueran inoculadas con hongos específicos para esos hábitats (McAfee y Forlin, 1986). Hatchell y Marx (1987) han logrado incrementar de forma significativa el crecimiento y su­pervivencia de pinos plantados en varias localidades de Carolina del Norte y Florida con fi· nes de reforestación, las cuales fueron inoculadas con Pisolit/111s ti11ctorius. Sin embargo, to-

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davía se requiere de la selección de hongos ectomicorrizógenos para lugares específicos de reforestación (Trappe, 1977).

Resulta de gran interés la producción artificial de inóculo con la finalidad de incremen­tar el crecimiento y lograr la supervivencia principalmente de las plúntulas de pino,

(Marx et al., 1982).

L1s fuentes de inóculo son: suelo de bosque, plántulas micorri1~1das en vivero, esporas y esporocarpos y cultivos puros. Pero cada una presenta problemas particulares (Trappe, 1967).

El inóculo nativo del suelo es conveniente pero poco práctico debido a que se requiere de grandes volúmenes en los viveros, además de que se introducen algunos patógenos o en­fermedades y se desconocen los simbiontes que forman las micorrizas (Mikola, 1973).

El uso de esporas y esporocarpos se encuentra restringido sólo a la estación de recolec­ción y las cantidades que de ellos se obtienen son limitadas (Stack y Sinclair, 1975a; Stack et al., 1975). Además de requerir mucha mano de obra para la recolección de los esporocarpos (HungyTrappe, 1987).

Los cultivos puros constituyen otra alternativa para la producción de inóculo de manera artificial (Zak y Marx, 1964), sin embargo existe gran dificultad en el aislamiento de algunos hongos ectomicorrizógenos, ya que su crecimiento en cultivo puro es muy lento. La produc­ción a gran escala requiere de mucho tiempo y es de costo muy elevado. Además, las condi­ciones para la supervivencia del hongo inoculante en el suelo son poco conocidas. Incluso, los hongos que son más efectivos y benéficos en vivero o invernadero a veces no lo son en plantaciones en el campo (Malina, 1982).

Historia de cultivos puros de hongos micorrizógenos

El cultivo de micelios de hongos tuvo interés principalmente para la producción de hongos comestibles. A principios de siglo, Boulanger (1903) logró obtener cultivo de trufas (As­comycete) a partir de esporas. En cuanto a los basidiomycetes, el conocimiento de las 'mico­rrizas y su función en Pinus silvestris y Picea abies logrado por Melin (1921), propició investi­gaciones en diferentes campos sobre las relaciones micorrícicas con este tipo de hongos. L1 obtención de cultivos puros se hizo para realizar estudios sobre la fisiología y morfología de grupos que presentaban dificultad en su ubicación taxonómica (How, 1940). Pantidou (1961a, 1961b, 1964), Pantidou y Groves (1966) y Laut (1966) estudiaron boletáccos en cul­tivo puro con este fin, incluso obtuvo carpóforos en condiciones asépticas.

Pachlewski (1967a), logró formar ceparios a partir de los cuales, se desarrollaron nuevas investigaciones. Fontana (1968, 1971) obtuvo micelios de Tuber melanosponim en cultivo puro, así como micelios de hongos micorrícicos de pinos. Chevalier (1972), también obtuvo

cultivo de micelios de trufas a partir de carpóforos y micorrizas. Cnmpbell y Pe tersan (1975) estudiaron los caracteres de ciertas especies deAma11ita en cultivo y Davis y Jong (1976) lo­graron la formación de basidiocarpos de Laccaria laccata en medio de cultivo.

La morfología y citología de agaricalcs se ha estudiado en cultivos puros (Kíihncr, 1946), al conocer los nutrimentos esenciales para el desarrollo de los hongos (Melin,1946). Ade­más se ha modificado el medio propuesto por Melin e incluso se ha variado el tipo de fuen­tes de carbono para lograr su mejor desarrollo (Palmer y Hackskaylo, 1970).

Se han utilizado las colecciones dt.! cultivos en investigaciones forestales, para la forma­ción í11 vitro de las micorrizns y para inocular plúntulas de pinos. A fines de la década de 1950 se realizaron inoculaciones con cultivos puros de S11il/11s p/orwis en Pi11m cembra en Australia (Moser, 1958), también Vozzo y Hacskaylo (1971) aplicaron los métotlos tle ino­culación de Moser en plántulas de pino en Puerto Rico. Marx et al. ( 1970) afinaron las téc­nicas de Moscr y han trabajado exitosamente en camas de vivero inoculadas con Piso/it/11l< tí11ctori11s propagado en vermiculita-turba estéril y solución nutritiva.

La obtención de micelio en cultivo puro se ha logrado también a partir de las raíces de las plantas micorrizadas, Z.ak y Marx (1964) aislaron hongos micorrizógenos de rníces de Pi-11us elliottii var. e/Iiottií. Trappe y Strand (1969), han trabajado en aspectos forestales y de producción masiva de hongos ectomicorrizógenos en Orcgon, E. U., en sus t.!xperimcntos han utilizado cultivos puros de colecciones o bien de aislamientos directos de Cc11ococc11111 gra11ifon11e o de Rhizopogo11 spp., incluso se ha practicado con frecuencia la inoculación tlc plántulas de coníferas con esporas; Castellano y Trappe (1985) utilizaron esporas tle 7 espe­cies de Rhizopogo11 en viveros de Estados Unidos.

La producción masiva del inóculo posibilita su uso en pl(1ntulas· mantenidas en contene­dores. La limitante principal para la producción de inóculo a gran escala es la cantidad que de éste se requiere, lo cual resulta poco práctico para su uso en invernadero, vivero y planta­ciones en áreas alteradas (Malina, 1977). Aun así en las investigaciones han obtenido resul­tados interesantes sobre la disponibilidad para formar micorrizas entre algunos simbiontes, como Pseudotsuga me11ziesií y Ce11ococcum geophilwn (Graham y Linderman, 1981a). Reid y Hackskaylo (1983) han hecho estudios sohre la evaluación de la respuesta a la inoculación. Maronek y Hendrix (1979) demostraron que el crecimiento de las plántulas ele Quercus pa­!ustris se incrementó cuando se inocularon con PLwlithus tinctorius, en invernadero y en México se han iniciado estudios similares empleando cultivos de cepas no nativas (Cuevas, 1979). Vnldés, et al. (1983) cultivaron e inocularon Pisolitlms ti11ctorius y Laccaria laccata a 8 especies de pinos en suelos erosionados, y encontraron un aumento considerable en el peso de los pinos estudiados (Valdés, 1986).

En México se ha trabajado sobre la producción de cultivos puros, pero principalmente de hongos comestibles con fines de prnpagación de carpúforos en diferentes sustratos (Mnr­tínez, el al., 1984, 1986; Martínez, el al., 1986; Morales, 1987 y Soto-Velazco, et al., 1989). También se han realizado caracterizaciones de micelios de hongos que causan pudrición en la madera (López, 1979; Veliz, 1982). Se han hecho estudios sobre Ja morfogénesis de fíbu-

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las en micelios de PJi/ocybe caemle.1ce1t~ (Dubovoy y Herrera, 1968a, b) y sobre la fisiología de Agaricalcs saprobios en diferentes medios de cultivo (Olmos, 1971; Cuevas y Herrera, 1971), Ulloa y Herrera (1g67) realizaron estudios sobre los factores que iníluycn en el creci­miento de los micdios de Psilocybe mexicana (Heim) y Psilocy/Je c11/Je11sis (Earle) Sing .. Si­guenza (1988) trabajó sobre el comportamiento y caracterización de basidiomicetos en sus relaciones simbiótica y mkoparasítica. A vila (1988) aisló, caracterizó y confirmó con el septo doliporo los micelios de 4 especies de A manita.

Selección de hongos para inoculación

Existen pocos trabajos sobre los hongos que mejor se asocian con un hospedante particular, aunque se conocen muchísimas especies de hongos ectomicorrizógcnos, resulta muy difícil decidir cuál de ellos es el mejor para un determinado hospedero. Sin embargo, Malina (1977) y Trappe (1977) han propuesto algunos criterios de selección para hongos micorrizó­genos, considerando las siguientes características:

Que sean de fácil aislamiento. Que presenten una tasa importante de crecimiento en cultivo puro.

- Que presenten efectividad como inóculo. Que sean efectivos sobre el crecimiento y vigor del hospedero. Que presenten adaptación ecológica y variación ecotípica.

- Que interaccionen con otros microorganismos y Que presenten especificidad con el hospedero.

OBJETIVOS

El objetivo general del presente trabajo consistió en formar una colección de hongos poten­cialmente ectomicorrizógenos, colectados en áreas de bosques del Distrito Federal, Estado de México, Estado de Marcios, Tlaxcala y Oaxaca.

Los objetivos particulares para llegar a la formación del cepario fueron:

Recolectar y preservar, en el Herbario MEXU hongos potencialmente ectomicorri· zógenos de áreas naturales de pinos mexicanos. Aislar y cultivar el micelio de los hongos recolectados para formar los cultivos hase.

- Caracterizar macroscópica, microscópica y químicamente los cultivos en crecimiento. Almacenar y mantener los cultivos base.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Zonas de recolección

El material de estudio proviene de las entidades federativas que se señalan en la Tabla 1. Las recolecciones de carpóforos se realizaron durante dos años en los meses de julio a

octubre de 1988, y de agosto a septiembre de 1989, con un total de 27 colectas de campo.

Método de recolección

Se recolectaron hongos macromicetos potencialmente ectomicorrizógcnos propuestos por Trappe (1962), se escogieron varios ejemplares en buenas condiciones, y en diferentes esta­dios de desarrollo. Los hongos se separaron en dos grupos, uno para el herbario y otro para el aislamiento. Aquellos utilizados para la colección de herbario se caracterizaron y se iden­tificaron de acuerdo a las claves de los difen:ntes taxa (Kühner y Romagnesi, 1953; Smith y Zeller, 1966; Pérez-Silva, 1967; Guzmán y Herrera, 1969; Thiers, 1975, 1979; Aguirre-Acos­ta y Pérez-Silva, 1978; Capello y Cifuentes, 1982; Singer, 1986; Calderón y Pérez-Silva, 1989). Posteriormente se secaron en estufas de 12 a 48 horas dependiendo de su grosor y se conservaron en el Herbario MEXU.

Método de aislamiento

Medios de cultivo Los medios de cultivo utilizados para los aislamientos fueron:

Melin-Norkrans (MMN) elaborado con 10 mi de cada una de las siguientes soluciones: CaCl2, NaCI, KI-IzP04, (NH4)2 HP04 y MgS04.7 HzO, 1.2 mi de FcCI al 1 %, 100 g de Clo­ruro de tiarnina, 3 g de extracto de maltn, 10 g de dextrosa, 15 g de agar y 1000 mi de agua destilada (Marx, 1969a).

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T"~l" J. ENTlllAllES l'EllEHATIVAS IJE L\S ZO:-IAS DE l!EC:OLEC:C:ll)N

LOCALIDAD ALTITUD 1 nl'il!U

VEGETACION

JllSTHITO ~·EllERAL 1

l. Km JOrnrr. Ajusco ¡ 2800 ¡~,~~l~~~::J:~~~~~~:;:~,~~W:~Q~ ~u~J~/~r~umb. et Donpl., Q. laeta Licmb.,

--1:.F.rn 19 carr. Almw 1 2950 Pi1111r trcxot(• Schccht. n. me.xicana Humh. et Bonp~ Mart et Gal.. O. tarlf.! Liemh . ....2....Krn1írurr...djum1 1 "1100 IPi/1·· r1 •Schccbl.Abirrrdi¡jmqJlJ1K...:.J:JJ/.!!Xi1111.lilllll>"-"e\''i=Klnccl•«"''h'---------l 4.Sicrs~Ajusco.llcsv,JJ5mal CcrroCha.c1tl!_iÍ•=I~ l!l!111rliq!t.~..:il.lli~~l.-----------------------l

1

fi1mr montt'wmac L1mb.,P. lwrnrcc ,ii Lindl., P. ayacalwitc Shaw.,Pimu pat11/a Schl. et Cham., Pi· 5. Dcsicrlo de los Leones 3000 111/S c11gelmanii Carr. y Pimu rtJdiata D. Don., Q1urws /1111ceolata Humb. et Bon pi .. Q. casuuua Ncé 1-----------------;-----;~ .. rtl:iwn!J.c1Bonp~l--------·------------;

ESTADO DE MEXICO _íi,_K111TI.9.m: ... .1'.!aue<1l¡nin PrcsWJ!!JfdP 1(V'Ml -••,· ',...;roma H.B.K P. ha~_fff.11.LJ.n!.~ll·~---------------;

2700 Pimu teocotc Schccht., Quen:us crrmifolit1 Humb. et Bon pi, Q. laurina Humb. et BonpJ., Q. tc.teixa· t-:"~E7·l_C~cd~r-al_,&~··~n1~a=A=~-=cJi~lo~1Z~in~goc-::~:-:----t--::;:;:c;-t""~"T~r~el~ .. ~Q~.c~ro~s~1i~re~1ufl~un~1h~.~c1~B~o~np~0~n~rr~m~muT~rc~l~.------------l µ8,.r. K""'Wr,!'.<,zo-'c>ll".U'·= PR"'º"-"""'="'"'º"'S"""'S."\.._.Jil'lwo,.1nw·n_,,,,,_, --1--"'"""'"1-"'',u=""·u"uh~~ill~· ----------------! >-'-9~, K=m~IO~c=°'='·~"=m=c=ca=n=rc=c.1~·~n=am='=""="~1l~a1~cn~e=e--+-~28=()(=l-r-P=i"=ll.f="~'ª~'=ªl=111.itc Ehr .. l'. montcmw_a1• L1m0. l macrocama. ~·fQia~l~l=.B=.K=·----<

IO. Cm. La Marqucsa-Chalma 2700 jPinus 11w11tt'Z1.m11.1e L.1mh., P. tmcorc Schct:hl., Q. cv11glomeruta Trcl., Q. tucornna Trcl., Q. laurina l-------------,.-,-----r---"r~~un1h.c1Ronrl..QJ:mrrifuliltH!!!!lh.c1Rno,""-nl. ______________ ~ ~µedc Jos Venados NcvadodeTnluca :\000 lrimul1artwq:t>ii Lindl. y A. n.•/ir;r=·º="'~fl=.,B."=K~. ----------------; µl;,,2'-'l"'·'<>'"'""'''"'ªd"''"º"'""''l..,a . .ll!! Hul!.H": '"'.'"''c"--------+-.hd. 2:5.~i:uríiJ:iQia H.B K. yP montr~Jll!Ul.e..Jdm.h~.~--------------• _J],J,¡...!fil!!l_a'i de Zcmrmala. Hui11il;1c 30tXJ lPimi.r mdis Endl. P. 1tam1·e ... .¡; Lindl. P. mm trn1111a{..l.,..1mh. A. rrlici_o"''"'-ª"'H".B"'.K.-"' ------!

Pimts teocou Sche,h1.,P. /uw.rm1ii Roc1l.,P. lt'iopl1)'1/aSchl.c1 Cham.,P. oocatpa Schicde., P. pri11· 14. Km l)carr. Chalma, Col. del Bosque, Cucrnavaca 1900 gfei Shaw., Q. mexicana Humb. et Bnnpl., Q. crassipt•s Humh. et Bonpl., Q. mgosa Ncé., Q. ma·

1------------------;----ir"rtJJ!fil'l/a N~c yArlwt1f:ra/ant'11si.r1-1.B.K. OAXACA

IS. Krn52carr. Te¡msco!ula-T!a,i:ico ?IXJO Pi1"'LJJJJ.Xaca11a Mjmv P miclwacmw M17.. O castm1ra Ne~. yd m'""""~id..J,B.K. J6..:..B!!1l!!IJ!l!.Aftk1J1Q.t;Jl~La~o ______ L_.L~l_- f21t1JrJ11~~,!_f!!JÜ..Bo,gt!J!:.!!1(c;!i<!..<1rn~.Jili·~.~11J!!Í!'!'!ff,y.!!~5!7J!1P.CTUitlh.~:lS-:... _____ _

l7. Tres Cruces a JO Km de.San Juan Mixtcpcc J 2400 ift~~-;{ringlei Shaw., Q. elliptica (l..cmh.) A DC., Q. peduncularir (Ben!h) A Cjmus. y A. xalopcmis

18. TcjocOICS a l4 Km de San Juan Mlxicpcc 2750 !Pi1111s do11¡;/as.riana Mtz., P. ooxacona Mirov., P. ps~·udostrobus Lindl., Q. rugosa Ncé y Q. laurina l----'---------------+----rfl~u=mh.etBonr.~1.-----------------------l

19.CMrodct r.i·o A U"""" .fltm Nd .. ta ~-_i,Ql!L_lfiu,u~_M.11~ P oa:socmig Mirov yO. udumü.I~.1~----------; 20. Barrio de San Pedro el Corral a 3 km SE de San

1900 Pilms laww11i Roe1J.,P.111ic/1oucu11a Mtz.,P. oocarpa Schicdcy Q. magrwlifolia (Ncé) ADC.

Juan Mix1cncc

1 21. Caiiada •El Aguila•, 8 Km S de San Juan Mixle· 1900- Pimu oa:racana Mirov., P. lawso11i Roc1.J.1 P. michoacana Mli., Q. crassifolia Humb. el Donpl .. Q.

wcc 2?'i0 1.:as111r1n1 Ncé, Q. ca111Jicans Nc¿,.r:1/111u jomllcn.si.J H.B.K. y A. ac1tmi11ata H.B.K. ! Tl.AXCALA

:?:!. Km.Ucmr. Tfaxco-Chignahuapan Pitws ayaculmite Ehr., P. mo11tenm1ae Lamh., P. pun1/a Schl. et Cham., P. /ciopliy/lu Schl. et Cham.,

2800 P. tcocorc Schl et Cham., Q. crauifiJ/ia Hum h. et Don pi., Q. barbincrds Dcn1h Q. p11/chefla Humb. el nnnnl.- n. ~lalm•.tei'flf Licmh. ex A DC. n. !Ol'Otn Wmh .... o. c.r 1rra11:ae Trcl.

Papa dextrosa agar (PDA) preparado con: 200 g de papa cocida y licuada, 20 g de dextrosa y 15 g de agar en 1000 mi de agua destilada.

Extracto de malta agar (EMA) preparado con: 20 g de extracto de malta, 20 g de dextrosa, 20 g de agar y 1000 mi de agua destilada.

V8 agar preparado con: 180 mi de jugo de verduras V8, 20 g de agar, 2 g de carbonato de calcio y 1000 mi de agua destilada (Ulloa y 1-Ianlin, 1973; Smith y Onions, 1983).

Esterilizados en autoclave durante 15 mina 121ºey15 lb de presión.

Aislamiento El aislamiento se llevó a cabo de acuerdo con la metodología propuesta por Pantidou (1961 a), Palmer (1969) y Trappe (1977), tanto en el campo como en el laboratorio. El aislamien­to se realizó principalmente a partir del tejido del píleo, de la zona píleo-estípite, del estípi­te y de la gleba en el caso de los Hymenogastrales y Lycoperdales. Se tomó con pinzas esté­riles un fragmento de tejido cerca de la flama, y se trasplantó a tubos de ensayo con MMN, EMA, PDA o V8, de 5 a 10 repeticiones para cada especie, dependiendo de la cantidad de contexto que presentara el carpóforo. Los aislamientos en el campo se realizaron con mate­rial estéril y a la flama de una lámpara de alcohol; una vez aislado el tejido en los tubos, és­tos se etiquetaron y se dejaron en oscuridad en una incubadora bacteriológica a 25 ºC. Para hacer los aislamientos en el laboratorio, los ejemplares se guardaron en bolsas enceradas y se dejaron en refrigeración a 4 ºC. Antes de aislar el tejido, el ejemplar se lavó con agua co­rriente y se secó con una servilleta estéril. El aislamiento se realizó en una área previamente desinfectada con alcohol. En México han trabajado con base en esta metodología Perrera (1976), Avila (1988) y Sigüenza (1988).

En algunos hongos fue posible obtener la esporada en papel filtro estéril dentro de una caja de Petri, de donde se tomaron las esporas con un asa estéril cerca de la flama y se colo­caron dentro de tubos de cultivo con medio líquido estéril, extracto de malta (EM) y solu­ción de Melin y Norkrans (SMN). Se incubaron a 25 ºC y de dejaron en la oscuridad (Marx y Zak, 1965).

Desinfección de carpóforos Algunos hongos son difíciles de aislar debido a que su tejido se encuentra contaminado con bacterias y levaduras. Por tal motivo se realizaron técnicas de desinfección que consistieron en el lavado del tejido durante 20 min con agua corriente en un matraz "kitasato"; después se colocó en una solución de detergente "vel-rosita" (2 ml/100 mi agua destilada} en matraz con un agitador magnético durante 10 min. Se enjuagó con alcohol al 70% durante un min, después se lavó con agua destilada estéril y se sumergió en un antioxidante estéril (ácido e{.

trico 100 mg/I agua destilada} (Benavides, comunicación personal). Después del trata­miento se procedió al sembrado en tubo de ensayo con medio de cultivo estéril (PDA, EMA ó MMN} y se incubó a 25 ºC. Antibi6ticos Para evitar el desarrollo del micelio de hongos saprobios de rápido crecimiento en la prime­ra resiembra en caja de Petri, se agregó rosa de bengala (0.05 g) en el medio y para inhibir el desarrollo de bacterias se añadió estreptomicina (0.03 g /lt de medio de cultivo de

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MMN), después de esterilizado el medio, una vez fria. Para disminuir la contaminación en las cajas de Petri, éstas se sellaron con cinta adhesiva y para las resiembras se utiliwron fras­cos cuadrados de 60 mi con entrada pequeña y tapón de rosca.

Observaciones Se hicieron observaciones diarias para anotar el tiempo de inicio del crecimiento micelial a partir del explante y para eliminar contaminantes. Una vez que el micelio iniciaba su creci­miento sobre la placa de agar, se elaboraban preparaciones en lactofcnol para observar los caracteres miceliales de cada cultivo, y decidir su resiembra para fines de propagación y ca­racterización.

Se resembraron los micelios de su medio inicial de aislamiento al medio de MMN en tu­bos de ensayo para revitalizarlos.

Caracterización de cultivos puros de hongos micorrizógcnos

Uno de los aspectos importantes en el estudio y caracterización de los cultivos puros, obte­nidos a partir de explante de carpóforo, se refiere a la utilización de caracteres de valor ta­xonómico y de uso común (Nobles, 1958a, b; Pantidou, 196la, b). Muchos de los datos reu­nidos en las caracterizaciones de los cultivos puros de trabajos anterioresno son del todo confiables, debido a la diversidad de técnicas y métodos que existen para obtenerlos _(Miller et al., 1983).

Las características macroscópicas que se consideran con más frecuencia en la descrip­ción de los cultivos son: el crecimiento de la colonia, la textura, el color y la tinción del me­dio de cultivo, entre otras. Las características microscópicas consideradas son: diitmetro de la hifa, el tipo de hifas, fibras miceliales, fusiones hifales, esclerocios y clamidosporas, pre­sencia de septos, ramificaciones y [{bulas, así como la presencia de elementos anamórficos (Pantidou, 1961, 1962a, by 1964; Fries y Mueller, 1984)

Las pruebas quimicas se usan en taxonomía, para determinar cambios específicos en la coloración de las hifas o de la masa micelial y el medio de cultivo (Pantidou y Graves, 1966). Los reactivos mas utilizados por Singer (1986) y Watling (1981) son goma de guayaco!, anili­na pura, fenal anilina, hidróxido de amonio 10%, ácido sulflirico concentrado, formol 40%, hidróxido de potasio 10% y Melzer.

En la presente investigación, el estudio de los caracteres tanto macroscópicos, microscó­picos y quimicos se desarrolló con base en los autores antes señalados. Se retomaron los ca­racteres utilizados por ellos con la finalidad de lograr la descripción completa para cada es­pecie estudiada. A continuación se describe el método seguido para cada uno ele los caracteres estudiados.

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Caracteres Macroscópicos

Una vez que se inició el crecimiento del micelio en los tubos de ensayo, se hicieron resiem­bras en diferentes medios como VB agar, EMA, PO Ay MMN para determinar cuál de estos es más favorable para cada hongo aislado. Se anotó la fecha de inicio del crecimiento mice­Iial, forma de la colonia (Collins y Lyne, 1989),color de la masa micelial con base al catúlogo de colores de Kornerup y Wanscher (1978), el diámetro, el tipo de superficie y elevación de la colonia (Harrigan y McCance, 1976; Pitt, 1979), la longitud del micelio, la textura, tipo de crecimiento (postrado, aéreo o sumergido), cambio de color del agar y' margen de la colonia (Nobles, 1958a, b ; Pantidou, 1961a, 1961b; Watling, 1981; Fries y Mueller, 1984).

La tasa de crecimiento del micelio de cada especie, se estableció de acuerdo a la escala propuesta por Pantidou (1966) y Bruchet (1973). Cuando el cultivo creció menos de 9 mm después de 30 días, se consideró extremadamente escaso, de 10-29 mm muy escaso, de 30-59 mm escaso, de 60-89 mm poco importante, y de 90 mm en adelante, importante.

Para los cultivos que crecían rápido y cubrían la placa de agar en menos de 30 días, la lectura se hacía en el momento en que lo lograban. Por el contrario, los micelios que crecían lentamente, la lectura se hacía después de 40 días o incluso más.

Para cada especie se anotó la localidad de colecta, las especies de pinos predominantes de la zona 1 las claves del cultivo y del ejemplar de herbario1y los nombres de los colectores.

La descripción corresponde a los medios de cultivos tlel aislamiento o en el que creció mejor. Se hace notar cuando los caracteres variaron en los diferentes medios de cultivo.

En la mayoría de los cultivos los caracteres macroscópicos se tomaron después de 30 días de crecido el micelio, sólo en aquellos en los que su crecimiento fué más rápido, la ca­racterización se logró antes del tiempo señalado. Por el contrario, cuando los micelios cre­cieron lentamente, la observación se hizo a los 40 días.

Caracteres Microscópicos

Una vez iniciado el crecimiento sohre el explante. Se tomó una porción de éste con asa esté­ril y en condiciones asépticas se elaboraron preparaciones con lactofenol de las partes aérea, postrada, sumergida, de la parte media y de la zona de avance del cultivo. Se hicieron 10 ob­servaciones de diferentes campos del microscopio para cada micelio.

Se realizaron tinciones con azul algodón, safranina y verde de malaquita para contrastar estructuras citoplásmicas (Dop y Gautie, 1928; Sass, 1928; Johansen, 1940; Largeron, 19.\9).

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Para la caracterización microscópica, se consideraron las siguientes características: diá­metro de las hifas, grosor de la pared, presencia de septos, ramificaciones, fíbulas, fusiones hifales, filamentos miceliales entrelazados, vesículas terminales o intercalares, suspensiones citoplásmicas, presencia de gútulas y cristales, así como estructuras anamórficas: coni­dios,artrosporas y clamidosporas (Pantidou, 196la, 1961b; Watling, 1981). De cada especie se tomaron microfotografías y se elaboraron esquemas.

Para aquellos cultivos en los que resultó difícil la elaboración de preparaciones, se hicie­ron microcultivos en medio de harina de maíz agar en caja de Petri estériles con 20 g de ha­rina de maíz, 20 g de peptona, 20 g de dextrosa, 15 g de agar y 1000 mi de agua destilada (Ulloa y Hanlin, 1978) en las que se colocó un disco de agar con el micelio a observar, y se cubrió con un cubreobjetos estéril. Se incubó hasta que el micelio inició su crecimiento so­bre el cubreobjetos. Se observó directamente en el microscopio óptico después de una se­mana o en cuanto se iniciaba el crecimiento del micelio sobre la placa de agar.

Pruebas Químicas

Las pruebas química& se realizaron en el micelio después de 4 meses, o más en aquellos que crecen lentamente. En condiciones asépticas se tomaron 7 discos de agar con micelio, con un sacabocado de 5 mm de diámetro y se colocaron en caja de Petri estéril. Sobre la masa micelial de cada disco se colocó una gota del reactivo a probar y se anotó el cambio de colo­ración del micelio o del medio después de 30 min y 24 horas (Miller et al., 1983; Nobles, , 1958 y Pantidou, 1963). Se utilizó Sudán 111 y Sudán IV para la tinción de grasas dentro y fuera de las hifas. El reactivo de Melzer se usó para teñir los tejidos fúngicos, el cambio de color del micelio a azul oscuro se consideró como positivo. El KOH 10% se empleó para observar cambios en la coloración del micelio. La presencia de oxidasa extrncelular se de­termina por la reacción rápida del guayaco! 98% (2 mctoxifenol) sobre la masa mice!ial y el agar, el diámetro de la zona teñida de azul oscuro, azul capri o azul-verdoso oscuro, indica Ja intensidad de producción de oxidasa. El HzS04 concentrado, el NH40H 10%, formol 40%, fenal-anilina y anilina pura se usan para determinar los cambios en la coloración del micelio, característicos en cada especie (Pantidou, 1961 ). En este tipo de pruebas se consi­deró como negativo cuando no existía cambio de coloración en la masa rnicelial y/o en el medio de cultivo, y positivo cuando se presentaba cambio de color después de 30 minutos y 24 horas de haber colocado el reactivo. Para precisar el cambio provocado por la presencia del reactivo se anotó el color de la reacción en cada especie probada.

Almacenamiento de cultivos puros

Los cultivos puros pueden mantenerse por años en crecimiento en medios de cultivo bajo condiciones favorables, haciendo transferencias a nuevos medios antes de que éstos se ago-

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ten, además se requiere de constante observación macroscópica y microscópica, para deter­minar que no haya infecciones o mutaciones del organismo original. La frecuente transfe· rencia presenta peligro de contaminación, de disminución de su capacidad infectiva y pue­den también variar los caracteres morfológicos y fisiológicos del micelio.

En este trabajo los cultivos caracterizados macroscópica, microscópica y químicamente se conservaron por duplicado en aceite mineral NF 55 estéril, en refrigeración a 4 ºC duran­te 12 meses. Después de este tiempo se resembraron en MMN para propagarlos y caracteri­zarlos en los tres aspectos antes considerados. Debido a que algunos micelios se contamina­ron durante las resiembras, o bien, crecieron lentamente, o no crecieron, no se preservaron al mismo tiempo en aceite mineral. En esta investigación se presenta la caracterización de aquellos que cumplieron con el tiempo de almacenamiento. Otros micelios se caracteriza­rán en su oportunidad.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se recolectaron y aislaron 69 especies de hongos potencialmente formadores de cctomico­rnzas, principalmente de Agaricales, Hymenogastrales y Lycoperdales.

Los hongos se caracterizaron en fresco para su identificación y se prepararon para la co­lección en el Herbario MEXU del Instituto de Biología de la UNAM.

Se obtuvieron 39 aislamientos de los cuales, 36 se mantuvieron en cultivo puro, y 26 en las resiembras. Los micelios aislados de los hongos ectomicorrizógenos que se encuentran en medio de cultivo puro, pertenecen a los siguientes órdenes y familias de los Agaricales, Hygrophoraceae, Tricholomataceae, Amanitaceae, Cortinariaceae, Bolctaceae y Russulu­cene. De los H)menogastrales, la familia Rhizopogonaceae y de los Lycopcrdalcs, la familia Lycoperdaceae, de acuerdo a la clasificación de Singcr (1986).

Posición taxonómica de las especies aisladas

AGARICALES Hygrophoraceae Hygrophorus nissula (Shaeff.:Fr) Qué]. Triclzolomataceae Clitoeybe odora (Bull.: Fr.) Kum. Collybia aff. maculai<1 (A. et S.: Fr.) Qué!. Lacearía ameth)~tina (Hud.) Ck. Laccaria bicolor (Maire) Orton. Laccaria laceara (Scop. :Fr.) Berk et Br. Amanitaccae Amanitagemmata (Fr.) Gil!. Amanita muscaria var.flavivo/vata (L. :Fr.) Hook. Amanita pantherina (DC. :Fr.) Schumm.

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A manita rubescens (Pers. :Fr.)S. F. Gray Cortinariaceae Hebe/oma sacchariolens Qué!. Inoeybe bresadolae Mass. Jnoeybe geophylla var. /ilacina (Sow. :Fr.) Kum. flloeybe grammata Qué!. Boletaceae Suil/11s granula tus (L. :Fr.) O. Kuntze Suillus /uteus (L. :Fr.) S. F. Gray Suillus punctatus Smith et Thiers Suillus tomentosus (Snell et Dick) Sing. Russulaceae Lactarius clirysorrheus Fr.

lfYMENOGASTRALES Rhizopogon isabellinus A. H. Smith Rhizopogon /uteo/us (Fr.:Nordh). Tul. Rhizopogon rubescens Tul.

SCLERODERMATALES Pisolitlms tinctorius (Pers.) Coker et Couch.

LYCOPERDALES Lycoperdon candidum Pers. Lycoperdon curtisii Berk. Lycoperdon ericetorum Peck. Lycoperdon perlatum var. perlatum Pers. Lycoperdo11 spadiceum Pers. Lycoperdon pusil/um Pers. Lycoperdon umbn'num Lloyd

Las especies aisladas y mantenidas en cultivo puro se ordenaron alfabéticamente y se .les dió una clave particular con las iniciales del curador y el número de la serie que le corres­podía. De igual manera para aquellas especies en las que se lograron varios aislamientos de diferentes localidades. Todas las especies aisladas tienen su ejemplar seco correspondiente (Tabla 2).

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Tabla 2. ESPECIES AISLADAS EN CULTIVO PURO

ESPECIE

Amonita gemmata (Fr.) Gi!l. Amonita gemmata (Fr.) Glll. Amanita muscaJia var. flavivolvata Hook. Aman ita muscaria var. fluvfrol\•ata Hoo k. Amanita pantlzeniia (DC. :Fr) Scbumm. Amanita panthcrina (DC. :Fr) Scbumm. Amanita rubescens (Pcrs. :Fr.) S. F. Gray Amanita rubescens (Pcrs. :Fr.) S. F. Gray Amonita rubescens (Pcrs. :Fr.) S. F. Gray Clitocybe odora (Bull. :Fr.) Kum. Collybia a!f. maculata (A.et S. :Fr.) Qué!. Hebeloma sacc/1ario/ens Qu~I. Hygropliorus nissula (Schac!f.:Fr) Qué!. Jnocybe bresado/ae Masscc Inocybe geophylla var. li/acina (Sow :Fr.) Kum Jnocybe grammata Qué!. Laccaria amcthystina (Hud.) Ck. Loccaria bico/or(Mairc) Orton Laccaria /accata (Stop.:Fr.) Bcrk et Br. Laccaria laceara (Scop.:Fr.) Bcrkel Br. Lactarius chryso"lleus Fr. Lycoperdon candidum Pcrs. Lycoperdon cmtisil'Bcrk. Lycoperdon ericctornm Pcck. Lycopcrdon perlatum var. perlat1m1 Pcrs. Lycopcrdon pusil/um Pcrs. Lycoperdon spadlccum Pm. Lycoperdon 11mbri111m1 Lloyd Pisolitlms tinctorius (Pers.) Cokcr et Couch Piro/ithus tinctorius (Pers.) Coker et Couch Rliizopogon lsabellinus A. H. Smith Rliizopogon luteolus (Fr.:Nordlt) TuL Rhizopogon nibescens Tul. Sull/11S granulatus (L.:Fr.) Kuntze Sul/lus granulatus (L.:Fr.) Kunizc Sul/lus granu/atus (L.:Fr.) Kunuc Sul/lus luteus (L.:Fr.) S. F. Gray SÚl/lus punctatus (Sncllct Dick). Smith el Thicrs Sull/us tomentosus (Kau!fm.) Sing.

CLAVE DEL CULTIVO

SOJl SOJ2 50)3

scm SOJS SOl6 san SaJ8 Sal'J SCID SCll SCl3 SC14 SCIS SC16 SC17 SC18 SC19 SC20 sen SC22 SC24 SC25 SC26 SC27 SC28 SC29 SC30 SC31 SC32 SC33 SC34 SC35 SC36 SC37 SC38 SC39 SC40 SC41

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HERBARIO MEXU

2!017 21813 21020 22340 21027 21983 21011 21033 22285 21012 21031 21035 21019 21014 21023 8415

21025 21034 21024 22341 20744 21816 21010 21D.\4 21030 21032 2íXi(y,

21029 21760 22336 21028 21022 21021 21016 21w; 22338 W595 22339 22342

Caracterización de los micelios en cultivo puro

Amanita gemmala (Fr.) Gill.

Morelos: Colonia del Bosque, Cuernavaca; bosque de PimLr ayacahuite y Pi11us teocote. 28 de septiembre de 1988. Col. Cruz-Ulloa, S. Aislado en PO Ay MMN. SCOl MEXU 21017.

Características macroscópicas: En PDA, micelio de tipo secundario, inicia su crecimiento a los 4 días. La colonia creció 50 mm en 30 días, de color blanco ligeramente grisáceo, tiñe el medio de café grisáceo; forma una colonia irregular de superficie lisa y elevación plana, tex­tura aterciopelada con micelio corto y laxo; con crecimiento postrado sobre la placa de agar; de margen irregular y fimbriado. En MMN crece lentamente, 20 mm en 60 días por lo que su crecimiento es poco importante.

Características microscópicas: En cultivos de 4 meses en PDA, en la parte media del cultivo presenta hifas de 3.4µm de diámetro de pared gruesa, con hifas delgadas de 2.0 µm , ligera­mente sinuosas en algunas zonas mas onduladas, con escasos septos que se tiñen con azul lactofenol, poco ramificadas y con citoplasma vacuolado. Presenta conexiones interhifales a través de prolongaciones laterales. Hifas terminales muy onduladas con terminación en punta aguda, otras con terminaciones vesiculosas en forma de clava; algunas hifas se presen­tan ensanchamientos hifales interseptos. No se observan fíbulas. En la zona de avance, con verde de malaquita, las hifas son filamentosas, rectas, de pared gruesa, el citoplasma se tiñe suavemente, la pared se tiñe mas intensamente con safranina (Fig. 1).

Pruebas químicas: no se realizaron por contaminación del cultivo en las resiembras.

Amanita gemmata (Fr.) Gil!.

Morelos: Colonia del Bosque, Cuernavaca; en bosque de Pi1111s ayacal1uite y P. teocote, 19 de agosto de 1989. Col. Pérez-Silva, E. y Cruz-Ulloa, S. Aislado en PDA SC02 MEXU 21813.

Características macroscópicas: En EMA, micelio secundario inicia su crecimiento a los 5 días, con crecimiento muy escaso de 20 mm en 30 días. En cultivos de 1 mes la colonia es de forma circular de color blanco, con micelio corto de aspecto laxo, de superficie lisa poco elevada; de textura aterciopelada, con crecimiento postrado y ligeramente aéreo en algunas zonas de la colonia; con micelio un tanto sumergido; no tiñe el medio. En las resiembras crece mas abundantemente en MMN que en EMAy PDA. En PDA presenta un color ama-

. rillo claro ( 4 A3), forma circular, postrada; reverso de color moreno claro (7 08), tiñe el medio de color moreno (7 E6). El micelio marginal crece muy extendido postrado y fim­briado.

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..

Fig. 1.Amanita gemmata SCOl. a)hifas ligeramente sinuosas, septos y ramificaciones. b) hifas filamentosas. c) ensanchamientos interhifales. d) vesícula terminal. e) hifa con ensanchamientos intercalares.

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Características microscópicas: En Ja parte media del cultívD cnn nzul lactofcnol se observan hifas de 2.0-3.qum de diámetro tic pared gruesa, septaLlas y poco ramificadas, largas, rectas, hia!ínas con gútulas refringentes de diferente diámetro, con ensanchamientos intercalares, células terminales en puntn romn, aguda y vesicular. Hifas delgadas de l.5¡1111 de di{tmetro, de pnrcd delgadas, scptadas, ramificadas, algunas hífns terminales onduladas, otras con pro­longaciones parietales y gt1tulas en d citoplasma. Las hifas se entrelazan paralelamente for­mando paquetes. En la zona de avance, con safra11im11 se observan hifos rectas, gruesas y delgadas, sinuosns, de pared gruesa, scptos separados entre sí y muhiramificadas con cito­plasma vacuo!ado; con verde de malaquita se tíitc intcnsaim:ntc la pared y los septos, d cíto­plasmn se tiñe por secciones en algunns hifas y en otrns se tiñe homogéneamente (Fig. 2).

Pruebas químicas: Se observan gütulas refringentes en las hifos filamentosas con Sudán IV y algunas células globosas presentan abundantes gútulas con Sudan l!l.

Melzer- cambia a moreno oscuro-negro a los 30 min. después de 24 hrs cambia a naranja. KOH- cambia a ligeramente amarillo, después de 24 hrs a café; H2S04- negativo; NH40H­negativo; anilina pura- negativo; formol- el tejido y el medio se tornan blancos después de 24 hrs; fenal anilina- cambia a negro después de 24 hrs; guayaco!- negativo.

Ama11ita mmcaria var.flavivo/vata (L: Fr.) Hook. Marcios: Colonia del Bosque, Cuernavacn, en bosque de Pinw· ayaca/111ite y P. tcocote. 26 de septiembre de 1988. Col. Cruz-Ulloa, S. Aislado en PDA. SC03 MEXU 21020.

Características macroscópicas: El micelio de tipo secundario, inicia su crecimiento a los 4 días en PDA, con crecimiento escaso de 15 mm en 30 días. Forma de la colonia irregular, de color blanco con el margen ligeramente crema, el reverso de la colonia de color rosa violfl­ceo (14 A3); superficie rugosa elevada, textura rugosa o granuloso de aspecto algodonoso, con micelio corto como en grumos, postrado. y crecimiento radial. Margen de la colonia on­dulado. En cultivos de 6 meses en PDA el color cambia a amarillo pf11ido ( 4 A3) con el inar­gen blanco amarillento ( 4 A2) No crece en las resiembras, en ninguno de los medios utiliza· dos V8, PDA, EMA y MMN.

Carncterísticas microscópicas: En la zona media se observan hifas de 3.4¡1m de diámetro, tortuosas, ramificaciones no abundantes, septadas; células terminales en punta. l-lifas delga· das de 2.0¡1m de di{1mctro, ele pared gruesa refringente; citoplasma granular con inclusiones de grasa refringentes. En la zona del septo se presentan células hinchadas de 8.5¡1m de dj{¡­metro como seudofíbulas. L1s hifas anchas con prolongaciones lmcralcs inmediatamente después del septo. Vesículas intercalares de 7.0¡mi y terminales de l 7x25¡1111 con pared grue· sa y color ocre. En la zona de avance se observan hifas gruesas y delgadas sinuosas, poco

· septadas, otras formadas por células en forma irregular un tanto globosas, con abundnntes septos. En algunas hifas se forman ensanchamientos a nivel del scpto de forma irregult1r que podrían considerarse como scudofíbulas (Fig. 3).

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Fig. 2.Ama11itagemmata SC02. a) hifas sinuosas. b) hifas rectas de la zona de avance c) conexiones intcrhifales. d) hifas laterales onduladas. e) vesícula terminal.

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Fig. 3.Amanita muscaria var.jlavivolvata SC03. a) hifos sinuosas con scudoffi1ulas. b) vesícula intercalar. e) citoplasma granular. d) hifas delgadas, rectas y ramificadas. e) células vesiculosas irregulares. f) vesícula terminal.

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Pruebas químicas: Presencia de inclusiones citoplásmicas que se tiñen con Sudán 111 y IV; Mclzer- cambia a morado rojizo; KOI-1- negativo; H2SO~- negativo; Nl-!401-1- negativo; 'tnili­na pura- negativo; formol- negativo; fenol anilina- reacción blanquecina a los 30 min, des­pués de 24 hrs vira a negro; guayaco!- negativo.

Amanita muscaria var.flavivofrata (L: Fr.) Hook. Oaxaca: 2 Km al noreste de Tres Cruces a 30 Km este de San Juan Mixtepec, en bosque de Pi11us pri11g/ei, Quercus elíptica y Q. peduncularis. 2 de septiembre de 1989. Col. Pérez-Silva, E. y Cruz-Ulloa, S. Aislado en PDA. SC04 MEXU 22340.

Características macroscópicas: En PDA, el micelio secundario, inició su crecimiento a los 8 días, con escaso crecimiento sobre el cxplante a los 9 días, micelio de color blanco, al princi­pio el reverso no cambia de color después cambia a amarillo claro ( 4 A3); textura aterciope­lada de micelio muy corto. No creció en EMA y crece lentamente en las resiembras en PDA.

Características microscópicas: En PDA, en la parte media del cultivo el micelio postrndo es­tá formado por rufas varicosas a tortuosas de 2.0-3.Sµm de diámetro, de pared gruesa, cate­nuladas, con abundantes septos cercanos entre sí y ramificadas; citoplasma granuloso no abundante; vesículas intercalares ovoides de pared gruesa, posiblemente clamidosporas y otras terminales muy grandes de 7x10µm de diámetro. Células terminales en punta aguda o en vesícula. La zona del septo no se tiñe con azul lactofenol. Se distinguen hifas delgadas rectas de 1.7¡,m de diámetro con citoplasma vacuolar, septadas y puco ramilicadas (Fig. 4).

Pruebas químicas: No se detectaron grasas con Sudán IlI y IV. Melzer- se tiñen de moreno oscuro-negro tanto medio como micelio; KOH- el micelio y el medio de color gris mate; HzS04- negativo; NH40H- negativo; anilina pura- negativo; formol- violáceo; fenol-anilina­negativo; guayaco!- negativo.

A111anitapantlzeri11a (DC. :Fr.) Schumm. Distrito Federal: Km 25 de la Carretera panorámica del Ajusco, desviación a Toluca, en bosque de Pinus hartwegii y Abies religiosa, 5 de septiembre de 1988. Col. Cruz- Ulloa, S. Aislado en EMA. SC05 MEXU 21027.

Características macroscópicas: En EMA y PDA el micelio secundario, inicia su creci­miento a los 7 días, con crecimiento extremadamente escaso, alcanza 5 mm de diámetro en 30 días. En este tiempo forma un fino micelio de color blanco que cubre el tejido, no tiñe el medio; textura aterciopelada formado de hifas muy cortas. Crece en todas las resiembras en todos los medios.

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Fig. 4;Arnanita muscaria var.jlavivolvata SC04. a) hifas vnricosns tortuosns. h) hifas cortas, catenuludas. e) células vesiculares con pigmento granular.

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Características microscópicas: En EMA y PDA se observan con azul lactofcnol, !tifas delga­das de 2.0pm de diámetro, de pared gruesa, con scptos que se tifien ligeramente con azul lactofenol y escasas ramificaciones, con !tifas omluladas intercalares y células terminales en punta, !tifas y terminales en forma de espiral, algunas vesículas pequeirns intercalares; cito­plasma granular que se tiñe con azul algodón por secciones, algunos de los sectores de las !tifas permanecen hialinos, otros con suspensiones citopl!ismicas muy abundantes. No se ob­servan fíbulas (Fig. 5).

Pruebas químicas: No se determinaron debido a la escasez del cultivo.

Ama11ita pantilcrina (DC :Fr.) Schumm. Estado de México: El Cedral, Santa Anna, Jilotzingo, en bosque de Querws crassifo/ia, Q. lauriana, Q. crassipes, Q. conglomcrata, Q. texcocana y Pim1s tcocote, 27 de agosto de 1989. Col. Cruz-Ulloa,S. Aislado en EMA. SC06 MEXU 21983.

Características macroscópicas: En Erv1A d micelio secundario, inicia su crecimiento a los 7 días, cubriendo solamente el explante con micelio muy corto de color blanco, de textura aterciopelada. No ert. ~e en las resiembras en ningun medio.

Características microscópicas: Hifas delgadas de 1.7¡1m de diámetro, largas, sinuosas de pa­red delgada, ramificadas, con septos delgados, el citoplasma granular se tiñe por secciones con azul Jactofenol, células terminales en punta fina. Es dificil su observación debido a que Ja masa micelial está formada por una red intrincada de hifas (Fig. 5 e).

Pruebas químicas: No se realizaron por falta de cultivo, ya que éste no se propagó en las re­siembras.

Amanita mbescens (Pers.: Fr.) S. F. Gray More los: Colonia del Bosque, Cuernavaca, en bosque de Pi1111slawsolli, P. /coiophylla, P. oo­capa, P. pri11glei, Pinus teocote, Quercus mexicana, Q. crassipes, Q. mgosa, Q. macroplzylla,. 11 de agosto de 1988. Col. Cruz-Ulloa, S. Aislado en EMA. SC07 MEXU 2!011

Características macroscópicas: En EMA y MMN el micelio secundario que inicia su creci­miento a los 7 días, con crecimiento muy escaso de 15 mm de diámetro en 30 días. En culli­vos de 4 meses la co!Clnia es de forma circular zonada, de color blanco amarillento (2 A2), con reverso zonado de color naranja moreno (6 C6); con superficie irregular, no elevada, de textura un tanto aterciopelada. En cultivos de 12 meses, el micelio es granuloso, corto y pos­trado. Crece lentamente en las resiembras en todos Jos medios utilizados. No presenta fíbu­las.

Características microscópicas: En cultivos de 1 mes en EMA y MMN, en la zona media del cultivo presenta !tifas gruesas y delgadas de 5.0¡tm y 2.0¡1m respectivamente, de pared grue-

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Fig. 5.Amanita pa11theri11a SC05. a) hifa plegada intercalar. b) célula terminal en punta. e) ramificaciones d) hifas filamentosas poco sinuosas.Amanita pantherina SC06. e) hifas sinuosas con scptos finos.

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sa, hialinas, con septos frecuentes a Jo largo de la hifa y debajo de la ramificación. En culti­vos de 4 meses, en el mismo medio, en la zona media el micelio es catenulado, formado por !Jifas largas, globosas a vnricosas de 5.0-7.0pm de diúmetro, de pared gruesa. de forma irre­gular, ramificadas, con abundantes septos. Con verde de malaquita la pared es refringente y el citoplasma granular se tiñe intensamente. Con safrnnina se contrastan las inclusiones ciro­plásmicas. Hifos delgadas de 2.0-3.4¡1m de diámetro, ligeramente sinuosas. Hifas terminadas en punta roma, otras en vesícula grande. Sin fíbulas. En la zona de avance se ob~crvan con mas frecuencia hifas filamentosas con scptos distantes entre sí, pocas ramificaciones y célu­las terminales en punta aguda. En los cultivos de 12 meses, se conservan las mismas caracte­rísticas antes señaladas, sólo algunas hifas se observan hialinas con pequeñas porciones cito· plásmicas que se tiñen intensamente con verde de malaquita (Fig. 6).

Pruebas químicas: Se tiflen con Sudán 1lI y IV gútulas en el citoplasma. Mclzer- moreno os­curo-negro; KOH- negativo; H2S04- negativo; NH40H- negativo; anilina pum- negativo; formol- negativo; fenol anilina- negativo; guayaco!- negativo. Amanita rubesce11s (Pers.: Fr.) S. F. Gray Estado de México: Parque de los Venados, Nevado de To!uca, en bosque de Pi1111s hartwegi, Abies religiosa y Cupressus li11dlcyi,. 29 de agosto de 1988. Col. Pércz-Silva, E. y Cruz-Ulloa, S. Aislado en MMN. SCOS MEXU 21033

Características macroscópicas: En MMN y PDA el micelio secundario inicia su crecimiento a los 7 días, con crecimiento escaso de 23 mm de diámetro a Jos 30 días. En cultivos de 4 meses la colonia de forma circular, de color rosa pálido (10 A2), zonado con superficie irre­gular y elevada, con el reverso moreno a ligeramente rojizo (8 04); de textura aterciopelada con micelio postrado al principio, después aéreo y sumergido, formado por !tifas cortas, el margen de la colonia ligeramente fimbriado. Crece bien en !ns resiembras en MMN, dismi­nuye su crecimiento después de 5 resiembras, después pierde su capacidad de crecimiento en los diferentes medios utilizados. Crece mejor en PDA que en cualquiera otro medio.

Características microscópicas: En cultivos de 1 mes en !'DA, en la parte media del cultivo presenta hifas gruesas de 5.0¡cm de diámetro de pmed gruesa, con frecuentes septos y ramas, se observa también hifas delgadas de 2.0pm de diámetro, de sinuosas a tortuosas, de pared gruesa, septadas y ramificadas. Con azul lactofcnol, el micelio aéreo de la zona de avance está formado por hifas globosas, catenuladas, de pared gruesa refringente, de 5.0f'm de diá­metro, ramificadas, con septos cercanos entre si. Hifas sinuosas de 2.5¡m1 de diámetro, de pared gruesa, refringente, de forma filamentosn. En ambas, con safrnnina, se tiñe el cito­plasma de aspecto granular, escaso, otras permanecen hialinas; con verde de malaquita se contrastan inclusiones citoplásmicas no nbundantes. Células terminadas en punta roma. No presenta fibu!as (Fig. 7).

Pruebas químicas: Se observan escasas gútulas refringentes con Sudán IV en las células glo­bosas; en las células vesiculares, abundantes gútulas que se tiñen con Sudán III.Melzer- vira a café oscuro-negro a los 30 min. y a moreno rojizo después de 24 hrs; KOH- negativo; HzS04- el micelio se tiñe de naranja después de 24 hrs; NH40H- vira a moreno claro des-

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Fíg. 6.Amanita mbesce11s SC07. a) hífas sinuosas, ramificadas, septaúas. b) hífas globosas alargadas con citoplasma granular. e) célula varicosa con hífn terminal vesicular. d) hífas filamentosas. e) células vesiculosas.

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b

Fig. 7. Ama11ita mbesce11s SCOS. a) hifas globosas caten u ladas y scptadas. b) hifas con escaso citoplasma granular. c) células filamentosas, d) hifas terminales con célula globosa o célula sinuosa.

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pués de 24 hrs; anilina pura- negativo; formol-negativo a los 30 min., cambia a blanco crema después de 24 hrs; fenal anilina- negativo; guayaco!- negativo.

Ammrita mbescens (Pers.:Fr.) S. F. Gray Oaxaca: Cañada de El Aguila, a 8 km de San Juan Mixtepec, en bosque de Pimis lmvso11ii, P. miclwacana, P. ocirnca11a, Quercus lacta, Q. crassifolia, Q. castanea y Q. candicans. 3 de sep­tiembre de 1989. Col. Pérez-Silva, E. y Cruz-Ullon, S. Aislado en PDA. SC09 MEXU 22285

Características macroscópicas: En PDA el micelio secundario, inicia su crecimiento a los 10 días, con crecimiento extremadamente escaso de 10 mm de diámetro en 30 días. Colonia de forma circular, de color blanco amarillento ( 4 A2), con superficie plana poco elevada, el re­verso de color crema, de textura ligeramente aterciopelada formada con micelio corto, el cual crece postrado y sumergido; con margen liso y fimbriado. Crece bien en MMN y en PDA, conserva las mismas características macroscópicas en ambos medios.

Características microscópicas: En el medio de cultivo de MMN, la zona de avance presenta dos tipos de hifas, unas gruesas de 3.5-5.0¡un de diúmetro, de pared gruesa, catenuladas, con células globosas alargadas y escaso citoplasma granular o hialino, otras hifas delgadas más abundantes de 1.5-2.5 ¡im de diámetro, sinuosas, no muy largas, poco ramificadas, septadas, con hifas terminadas en puntn redondeada. Micelio aéreo y sumergido igual que la especie anterior, sólo las hifas delgadas mas abundantes que las gruesas, incluso en PDA (Fig. 8).

Pruebas químicas: En el micelio se detectaron grasas con Sudún Ill y Sudán IV, las cuales son escasas en células globosas y abundantes en células terminaks.

Melzer- cambia a negro a los 30 min. y a naranja rojizo después de 24 hrs; KOH- negativo; H2S04- destruye el medio y el micelio; NH40H- negativo; anilina pura- negativo; formol­negativo a los 30 min., ligeramente rosado después de 24 hrs; fenal anilina- negativo; guaya­co!- negativo.

Clitocybe odora (Bull.:Fr.) Kum.

Estado de México: Km 23 de la Carretera a Naucalpan, en bosque de Pinus hartwe¡;ii y Abies religiosa. 25 de julio de 1988. Col. Pérez-Silva, E. y Cruz-Ulloa, S. Aislado en EMA. SCJO MEXU210ti

Características macroscópicas: En EMAl micelio secundario, inicia su crecimiento a los 7 días, es extremadamente escaso, 10 mm de diámetro a los 30 días. En cultivos de l mes la colonia zonada es de forma irregular, de color blanco al principio, después blanco amari-

. liento ( 4 A3)con reverso amarillo grisáceo ( 4 B6), superficie lisa, con elevación plana; de textura algodonosa ligeramente aterciopelada, flocosa con micelio muy corto, postrado n su­mergido y zonado, con margen irregular fimbriado. Crece bien durante 6 resiembras, des-

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Fig. 8.Amcmita nibe.scP11s SC09. a) hifas sinuosas. b) hifas caten u ladas con pigmento granular. e) hifas filamentosas ramificadas. d) célula terminal en punta redondeada. e) células globosas con citoplasma granular.

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pués se inhibe totalmente su crecimiento en todos los medios utilizados. En MMN presenta las mismas características. En PDA la colonia es de color blanco al principio que cambia li· gcramentc a moreno claro, tiftc el mcc.lio de moreno claru, crecimiento radial, micelio corto con margen ligeramente continuo.

Características microscópicas: En cultivos de 4 meses en EMA y MMN, en la zona media del cultivo, con azul algodón, se observan hifus rectas y poco sinuosas de 3.0-5.0 pm de diá­metro, de pared gruesa, con abundantes septos, fílrnlas asociadas con el septo de 6.S,rn1 de diámetro y pocas ramificaciones algunas hlfns forman hasta 3 rnmas a nivel del scptn que se observa abultado, con suspensiones en el citoplasma granular que se tiñe en sectores con azul algodón. I-Iifas delgadas de 2.0¡rn1 de diámetro, con fíbulas, septadas y ramificadas; hi· fas terminales en punta roma y algunas hifos con vesículas intercalar. En cultivos de 12 me­ses, las hifas con ensanchamientos, de pared gruesa, refringente con verde de malaquita y safrnnina; con citoplasma granular; algunas hifas rectas son hialinas, fíbulas presentes en ca· da septo. En el micelio sumergido, que corresponde a la zona de avance, presenta las mis­mas características antes señaladas, además de abundantes gútulas en el citoplasma (Fig. 9).

Pruebas químicas: Presencia de grasas que se tiñen con Sudán 111 y Sudán IV.

Melzer· vira a negro; KOH· vira a moreno; H2S04- negativo; NH40H· negativo; anilina pu· ra- negativo; formol- negativo; anilina pura· negativo; guayaco!- negativo.

Collybia aff. macu/ata (A. & S.: Fr.) Qut!l.

Distrito Federal: Desviación al Cerro Chapulín, Carretera Panorámica del Ajusco,en bos­que de Pinus /iartwegii. 12 de septiembre de J 988. Col. Cruz- Ulloa, S. Aislado en MMN. SCll MEXU 21031

Características macroscópicas: En MMN, en la parte media del cultivo el micelio secunda· ria incia su crecimiento a los 7 días, con crecimiento extremadamente escaso de 10 mm de diámetro en 60 días. En cultivo de 2 meses la colonia es de forma circular, de color blanco, no tiñe el medio; con superficie lisa, convexa, de textura algodonosa, micelio corto, aéreo y sumergido; de margen fímbriado. Progresó después de la primera resiembra en PDA, des­pués no creció en los diferentes medios utilizados.

Características microscópicas: En MMN presenta hifas filamentosas de 3.4-5.7¡1111 de di(1mc­tro, de pared gruesa, poco ramificadas, con abundantes ensanchamientos ovoides terminales e intercalares de 10.5-13.S¡tm de diúmctro. Hifas delgadas de 1.7-3.0¡im, de diámetro, con citoplasma granular que se tiñe con verde de malaquita, incluso en las vesículas se tiñen es· tructuras globulares, con escasos septos a veces cercano y a veces separados entre sí. En cul­tivos de 12 meses, en la zona de avance se observan ambos tipos de hifas, con sepias muy distantes entre sí, vesículas de pared gruesa, en las cuales, el citoplasma se tiñe homogénea-

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Fig. 9. C/itocybe adora SC10. a) hifas con fíbulas. b) ramificaciones. e) célula terminal en punta aguda. d) hifas delgadas filamentosas, ramificaciones onduladas. e) fibulas a nivel del sepia y rama. f) conexiones interhifalcs. g) vesícula terminal. h) ensanchamientos interhifales.

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mente con verde de malaquita y safranina; otras hifas totalmente hialinas. En estos cultivos no se observan fíbulas (Fig. 10).

Pruebas Químicas: No se detectan grasas con Sudún llI y Sud(tr1 IV.

Mclzer- vira a moreno; KOH- negativo; HzS04- negativo; NH40H- negativo; anilina pura­negativo; formol- negativo; fcnol anilina- negativo; guayaco!- negativo.

flebeloma sacchariolcns Qué!.

Estado de México: Parque de los Venados, Nevado de Toluca, en bosque de Pinus hmtwegii, Abies religiosa y Cupressus lindleyi. 29 de agosto de 1988. Col. Pérez-Silva, E. y Cruz-Ulloa, S. Aislado en EMA. SC13 MEXU 21035.

Características macroscópicas: En EMA, el micelio secundario inicia su crecimiento a los 6 días, con crecimiento importante de 90 mm de Jhímetro en 10 días. En cultivos de 1 mes la colonia es de forma irregular, el micelio inicial de color naranja amarillento (4 A7) intenso que cambia a amarillo fuerte ( 4 A8) con algunas partes blanquecinas, el margen con tonos amarillo (4 AS) y rojo grisáceo (9 B4), tiñe el medio de color amarillo grisáceo (4 C7); con micelio corlo postrado y ligeramente aéreo, superficie irregular rugosa y elevación plana, de textura grumosa y algodonosa, con margen irregular. Crece bien en PDA donde forma mi­celio sumergido de color moreno rojizo (8 05), con reverso moreno rojizo (8 E4), tiñe el medio de amarillo oscuro. En las resiembras en MMN y PDA crece más lentamente incluso después de 24 meses de aislado. En estos medios, la colonia es al principio blanca que cam­bia rápidamente a naranja ( 4 A7), de aspecto grumoso, tiñe el medio de color amarillo oscu­ro (4 A6).

Características microscópicas: En cultivos de 1 mes en EMA, en la parte media presenta hi­fas filamentosas de 5.1.um-6.fytm de pared gruesa con septos muy cercanos entre sí con cla­midosporas de l0¡1m de diámetro, intercalares, con ramificaciones frecuentes. Abundante pigmento amarillo en el citoplasma. En cultivos de 4 meses, en la zona de avance y parte media del mismo, presentan hifns varicosas de 5-6.4¡1m de diámetro, de pared gruesa y re­fringente, con septos delgados y ramificadas, con pigmento amarillo fuerte, citoplasma gra­nular de calor amarillo, con vesículas esféricas intercalares y terminales, las cuales se tornan vesiculosas en los cultivos de 12 meses. Hifas delgadas de 2.Qum de diámetro sinuosas, rami­ficadas y septadas, con células terminales bulbosas. Se conserva la mayoría de las caracterís­ticas antes señaladas, en la zona de avance y parte media del cultivo, incluso después de va­rias resiembras. Con verde de malaquita y safranina la pared es muy refringente, el citoplasma puede teñirse o conservar su color amarillo. Las !tifas delgadas no presentan in-

. clusiones, el citoplasma se tiñe homogéneamente con verde de malaquita. No presenta fílrn­las (Fig. 11 ).

Pruebas químicas: Abundantes gútulas se tiñen de rojo con Sudán IV.

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Fig. 10. Co/lybia aff. maculata SCl l. a) hifas sinuosas, ramiíicacioncs. b) hifns delgadas con prolongaciones laterales, ramificadas. e) ensanchamientos interhifalcs. d) células vesiculosas intercalares y terminales. e) hífas rectas.

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Fig. 11. Hebeloma sacchario/ens SC13. a) hifas varicosas y septadas. b) vesículas esféricas interhffalcs y subtcrminales. e) hifas sinuosas con terminaciones bulbosas. d} hifas delgadas filamentosas y ramificadas con terminal aguda. e) hifas gruesas, ramificadas, con citoplasma granular refringente y pigmento vacuolar. !) vesícula terminal globosa. g) hifa terminal en punta roma, h) hifa terminal en punta aguda, i) células vesiculosas.

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Melzer- moreno oscuro; KOH- negativo; H2S04- vira a ligeramente rosado; N!-!.101-1- nega­tivo; anilina pura- negativo; formol- negativo; fenal anilina- negativo; guayaco!- negativo.

Hygroplwms nissu/a (Scheff.:Fr.) Qué!.

Morelos: Colonia del Bosque, Cu~rnavaca, en bosque de Pi1111s lawso11i, P. leiopliylla, P. oo­carpa, P. pri11glei, P. teocote, Q. mexicana, Q. crassipes, Q. nigosa y Q. macrophy/111, 26 de sep­tiembre de 1988. Col. Cruz-Ul!oa, S. Aislado en PDAy V8.SCI4 MEXU 21019.

Características macroscópicas: En PDA el micelio secundario inicia su crecimiento a los 19 días, forma una colonia con crecimiento muy escaso, de 20 mm en 30 días, de forma circular, de color blanco con reverso amarol!o claro ( 4 A3); abundante micelio formado por hiías cortas, con superficie lisa y elevación plana; de textura algodonosa, con crecimiento postra­do grumoso en PDA o liso en MMN; de margen fimbriado muy fino. Crece lentamente en la primera resiembra en los diferentes medios, después no progresa en los medios utiliza­dos.

Características microscópicas: En PDA, tanto en la zona de avance como en la parte media presenta hifas rectas o sinuosas, otras moniliformes, de 3.4¡m1 de diámetro, de pared gruesa, refringente con safranina; con septos cercanos entre sí, poco ramificadas, algunas hifas in­tercalares de forma ondulada; ensanchamientos regulares de forma esférica a lo largo de la hifa, que disminuyen en diámetro hacia la punta; presenta vesículas intercalares de 8.Spm de pared gruesa; algunas hifas son hialinas, la mayoría con citoplasma granular que se tiñe homogéneamente con verde de malaquita en los cultivos de 4 meses o en secciones en los de 12 meses. Hifas delgadas de 2.0¡1m de diámetro con células terminadas en punta. En cul­tivos jóvenes abundantes septos y fíbulas a lo largo de las hifas, en cultivos de 12 meses las fíbulas presentes a nivel del septo y estructuras esféricas de pared gruesa, refringente, con citoplasma granular (Fig. 12).

Pruebas químicas: Se tiñen gí1tulas con Sudán lll y Sudán IV. Melzer- micelio cambia moreno oscuro·negro al instante, vira a moreno naranja después de 24 hrs; KOH- negativo, H2S04- negativo; NH40l-I- el micelio cambia a ligeramente rosado, después de 24 horas a moreno claro; anilina pura- negativo; formol-negativo; fenol anilina­negativo; guayaco!- negativo.

lnocybe bresadolae Massee

Distrito Federal: Desierto de los Leones, en bosque de Pinm pallila, P. 111011/ezumae, P. /Jartwegii, P. ay11c11huite y P. engelmanni. 13 de octubre de 1988. Col. Pérez-Silva, E. y Cruz­Ulloa, S. Aislado en MMN. SC15 MEXU 21014.

Características macroscópicas: En MMN el micelio primario, obtenido a partir de esporas, inicia su crecimiento a los 7 días, con crecimiento importante de 90 mm de diámetro en 10

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Fig. 12. Hygrophonis mssula SC14. a) hifas sinuosas ramificadas. b) hifas filamentosas con células sinuosas interhifales. e) fíbulas a nivel del septo e interhifal. d) vesícula intercalar. e) hifo ondulada vesiculosa con terminación en punta redondeada.

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días, colonia de forma circular, de color blanco, reverso de color amarillo claro ( 4 AS); abundante micelio largo, de superficie elevada y lisa, con crecimiento postrado, al principio granular, después aéreo de aspecto algodonoso, de textura aterciopelada, algodonosa; con margen de la colonia ligeramente fimbriado. Crece bien en las resiembras en PDA, en las que conserva sus caracteres. En MMN forma exudado cristalino; en algunas zonas del rever· so de color naranja rojizo (6 CG) y todo el medio de color amarillo claro (3 A2). En cultivos de 6 meses el micelio se compacta. Crecimiento importante en las resiembras incluso des­pués de 24 meses de aislado. En EMA después de 12 meses de resembrado, forma una colo­nia con crecimiento escaso de 22 mm en 60 días, de color blanco, con tonos amarillo claro ( 4 A3) en los pliegues; tiñe el reverso del medio de color moreno (5 CS) en el centro y en la orilla de color naranja (5 A7); micelio muy corto, con superficie irregular, elevación conve­xa, de textura aterciopelada,con margen irregular fimbriado. Fnrma un halo moreno oscuro (5 08) en el medio alrededor de la colonia.

Características microscópicas: En MMN, en Ja parte media del cultivo joven, se desarrolla Ja fase anamórfica a partir de esporas, formada por hifas delgadas de 1.~um de diámetro, de pared delgada, sin septos, ramificadas, con pequeñas vesículas interhifalcs y conitlios ovoi­des. En cultivos de 4 meses abundantes clamitlosporas de pared gruesa y ornamentada. Co­nidios ovoides. Con azul lactofenol se observan hifas gruesas septadas, con vesículas que se colapsan con facilidad. Después de 6 resiembras el micelio está formado por hifas gruesas de 3.4¡1m de diámetro, ramificadas, vesiculosas, con citoplasma granular muy refringente con safranina y verde de malaquita. Presenta células terminales rcdondcadasas. No se ob­servan fibulas.

En microcultivo en la zona de avance, se observan hifas delgadas de 2.0¡1m dr. diámetro, de pared fina con septos y prolongaciones laterales que forman estructuras redondas de pared gruesa, clamidosporas, con células terminales hinchadas que forman también clamidospo­ras, éstas se encuentran libres en el cultivo, son de pared gruesa y equinulada. Las células hi· fales con abundantes gútulas. Hifas rectas gruesas de 3.4 ¡im de diámetro, de pared gruesa, septadas, ramificadas, con escasas inclusiones de grasa; escasas células hialinas; las células terminales alantoideas. Forman paquetes de hifas paralelas (Fig. 13).

Pruebas químicas: Presencia de grasas, negativo con Sudán IJl y Sudán IV en el micelio ana­mórfico, positivo en los cultivos de 12 meses.

Melzer- negativo; KOH- negativo; H2S04- negativo, NH40H- negativo; anilina pura­negativo; formol- negativo; fenal anilina- vira a ligeramente azuloso; guayaco!- negativo.

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o

o o o

a

o

Fig. 13. I11ocybe bresadolae SC15. a) conidióíoro y conidios. b) hifas rectas con pigmento vacuolar. c) hifas delgadas filamentosas. d) células terminales globosas redondeadas, e) clnmidosporas. f) hifas gruesas sinuosas, septadas, ramificadas y abundantes gútulas. g) vesícula intercalar. h) célula terminal en punta aguda y en vesícula. i) vesícula terminal nlantoidea.j) hifa produciendo clamiclosporas. ·

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111ocybe geophyíla var. lilaci11a (Sow. :Fr.) Kum.

Distrito Federal: Km 25 de la Carretera panorámica del Ajusco, desviación a Toluca,en bos­que deAbies religiosa, 5 de septiembre de 1988. Col. Cruz-Ulloa, S. Aislado en EMA. SC16 MEXU21023

Características macroscópicas: En cultivos de 4 meses, en EMA y MMN, el micelio secun­dario inicia su crecimiento a los 4 días, con crecimiento importante de 90 mm en JO días. Colonia de forma irregular, de color blanco con el centro amarillo pálido ( 4 A3); superficie irregular, elevación plana, con micelio no muy corto, abundante, de textura algodonosa-gru­mosa, con crecimiento postrado en Ja placa de agar, después un tanto aéreo y con margen fimbriado. En cultivo de 1 mes, en PDA, Ja colonia es de forma irregular, de color blanco, laxo, de textura algonosa, forma un grupo de hifas que se elevan hacia Ja tapa ele Ja caja de Pe tri, produce exudado hialino, con el reverso de color amarillo claro ( 4 A3). En cultivos de 2 meses, en PDA conserva las mismas características antes mencionadas, pero es menos abundante; a Jos 3 meses el cultivo es de color blanco crema con reverso crema y micelio no abundante. Crece bien en las resiembras en todos los medios utilizados.

Características microscópicas: En EMA, en Ja zona media del cultivo de 1 mes, ser forman hifas gruesas sinuosas, de 3.4¡m1, de pared gruesa, inclusiones citoplfismicas en fragmentos de las !Jifas, septadas y ramificadas. Características que se conservan en los cultivos de varias resiembras. Algunas hifas filamentosas con ramificaciones cortas de 1.7¡tm de di(1metro y con vesículas terminales. En cultivos de 4 meses las fíbulas son abundantes. En cultivos de 6 meses las hifas son sinuosas con células alantoideas, con regiones citoplásmicas que se tiñen de azul algodón, otras con inclusiones citoplúsmicas grandes ele color amarillo, abundantes septos, vesículas intercalares que se tiñen homogenéamente; algunas hifas hialinas con sa­lientes laterales cortas. En cultivos de 12 meses, en Ja zona de avance se observan hifas si­nuosas y algunas rectas con citoplasma granular que se tiñe con safranina y verde de mala­quita, escasas hifas hialinas. Algunas hifas con vesículas terminales grandes. Presenta hifas delgadas que se entrelazan paralelamente (Fig. 14).

Pruebas químicas: Se observan pocas inclusiones citoplásmic¡is que se tiñen con Sudán !lI y Sudán IV.

Melzer- negativo; KOH- negativo; H2SO.¡, reacción gris azulosa; NI-1401-l- negativo; anilina pura- negativo; formol- negativo; fenal anilina- cambia a grisáceo; guayaco!- negativo.

111ocybegram111ata Quél.

Estado de México: La Marqucsa-Chalma,en bosque de Pinus montezumae, P. teocote, P. oo­carpa, Quercus conglomerata, Q. texcocana, Q. crassifolia, Q. crassipes y Q. /aurina. 19 de oc'

· tubre de 1973. Col. Pérez-Silva, E. Aislado en EMA por Pérez-Silva, E. Resiembra en EMA y MMN, 8 de agosto de 1988.SC17 MEXU 8415

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Fig. l4. l11ocybc geoplzylla var. /ilacina SC!6. a) hifas sinuosas gruesas ramificadas y septadas. b) hifa filamentosa. e) ensanchamiento interhifal. d) citoplasma y pigmento granular. e) ramificaciones y gútulas. l) hifas con células nlantoideas. g) célula vesicular terminal. h) hifns delgadas sinuosas terminales. i) prolongaciones parietales.j) hifus entrelazadas con pigmento vacuolar.

Características macroscópicas: En EMA y MMN el micelio de tipo secundario inicia su cre· cimiento a los 14 días, con crecimiento importante de 85 mm de diámetro en 30 días, colonia de forma irregular, de color blanco con el margen de color amarillo claro ( 4 A3); tiñe el re­verso de color amarillo claro (4 A4); con superficie rugosa poco elevada, de textura tlocosa quebradiza con hifas largas y r.bundantes. Al principio con crecimiento postrado después li· geramente aéreo, con margen fimbriado e irregular. En cultivos de 4 meses, en PDA, colo­nia de forma irregular, de color blanco, con el reverso verde claro (27 A2), superficie irregu­lar, de textura grumosa, algodonosa; con crecimiento postrado y ligeramente al:rco. En las resiembras en MMN deja de ser abundante, pero conserva las mismas características de los cultivos jóvenes.

Características microscópicas: En EMA y MMN, en cultivos de 2 meses, en la parte media del cultivo, se distinguen hifos sinuosas, de 3.4-7.0¡im de diámetro, de pared gruesa, con en­sanchamientos interhifales de 7.0 ¡1m de diámetro, con scptos y ramificnciones. Hifas delga­das de 2.0¡im de diámetro, filamentosas, de pared gruesa, con scptos y en la zona de la rami­ficación con ensanchamientos. En la zona de avance las hifas gruesas y delgadas igual que en la parte media del cultivo. En las resiembras se observan hifas varicosas con citoplasma gra­nular que se tiñe homogéneamente de rojo naranja con safrnninn y verde de malaquita. Con frecuencia se presentan hifas cortas y vacuolas grandes. l,1s hifas delgadas tienden a formar una madeja de forma globular, con células terminales globosas, se forman conexiones inter­hifales, algunas hifas se entrelazan paralelamente formando paquetes. No se observan fibu­las (Fig. 15).

Pruebas químicas: No se detectaron glóbulos de grasa con Sudán IJ1 y Sudán IV.Mclzer- ne­gativo; KOH- negativo; H2S04- negativo; Nl-1401-\- negativo; anilina pum- negativo; for­mol- cambia a ligeramente azuloso; fenal anilina- negativo; guayaco\- negativo.

Laccaria amct/1ysti11a (Hud.) Ck.

Distrito Federal: Km 10 de la carretera panorámica del Ajusco,cn bosque de Pinus teocote, Abies religiosa, Quercm pulcl1ella, Q. /aeta, Q. mexicana, Q. mgu/osa y Q. mgosa. 5 de sep­tiembre de 1988. Col. Cruz-Ulloa, S. Aislndo en EMA. SC\8 MEXU 21025

Características macroscópicas: En EM A se desarrolla el micelio secundario que 1111cta su crecimiento a los 2 días, con crecimiento muy importante, en 6 días cubre toda la placa de agar, 90 mm. En cultivos de l mes la colonia de forma irregular, de color blanco que vira a rojo claro (7 A3) con('\ tiempo y se intensilka en los cultivos viejos (7 A4), no tiñe el medio, con superficie irregular y elevación plana, con micelio muy abundante, largo, de textura al­godonosa, plumosa. Forma paquetes de hifas que"' elevan hacia la tapa de la caja de Petri. Es muy abundante, disminuye un poco con las resiembras en PDA. En los cultivos de 3 me­ses toma un aspecto comprimido en la superficie y el color naranja púlido (6 A3). Los culti­vos de 7 meses son menos vigorosos y de color rojo pálido (7 A3) a rosado (7 A2). En PDA, la colonia es de color blanco, de aspecto lanoso-algodonoso, el micelio aéreo, muy abundan-

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Fig. 15. Inocybe grammata SC17. a) hifas sinuosas con células terminales en punta roma, ramificación. b) ensanchamiento interhifal. e) glomérulo de hifa delgada. d) hifas gruesas enrolladas. e) vesículas globosas interhifales y subtcrminales con vacuolus y pigmento granular. t) hifas varicosas con citoplasma granular. g) ramificaciones.

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te. En MMN In colonia es blanca, algodonosa, con crecimiento postrado, de margen conti· nuo, tiiie el medio de color amarillo claro (3 A2).

Características microscópicas: En EMA, en la zona media de cultivos jóvenes se distinguen hifas sinuosas de 3.4-5.0¡un de diámetro, septadas despu~s de la rama, con abultamiento al inicio de la ramificación y con ramificaciones abundantes. I'íbulas a nivel del septo y entre las células hifales, otras al inicio de una nueva rama, asociados también con el septo. Células terminales en punta. En Ja zona de avance, hifas de pared gruesa y refringente con safrani­na, algunas hifas hialinas, otras con inclusiones granulares amarillas; las células terminales en punta roma; las ramificaciones se presentan a nivd del septo y septos a Jo largo de Ja ra­ma; con abundantes fíbulas. Se observan cristales romboides. En cultivos de varias resiem­bras se conservan las mismJs carncterístirns excepto en la forma de la hifas que se hacen tor­tuosas, en los diferentes medios utilizados (I'ig. 16).

Pruebas químicas: Con Sudán \V se tiiicn grasas. Melzer- negativo; KOI-1- cambia a more­no; H2S04- negativo; NH40I-I- negativo; anilina pura- negativo; formol- negativo; fenal ani­lina- negativo; guayaco!- negativo.

Laccaria bico/or(Maire) Orton

Estado de México: Parque de los Venados, Nevado de Toluca, en bosque tic Pi1111s lrartll'cgii, Abies religiosa y Cupressus li11dleyi. 28 de agosto de 1988. Col. Pércz-Silva, E. y Cruz-Ulloa, S. Aislado en EMA. SC19 MEXU 21034

Características macroscópicas: En EMA y MMN el micelio secundario inicia su crecimiento a los 2 días, con crecimiento importante de 90 mm de diúmctro en 15 días. Colonia de forma circular, de color blanco, que cambia a rosa grisúceo (12 133), el reverso del cultivo ligera­mente amarillo claro ( 4 A3); con superficie lisa y elevación plana, con micelio corto, de tex­tura aterciopelada, con crecimiento postrado, zonado, con el margen liso. En cultivos de 7 meses la colonia es de color blanco con zonas naranja grisáceo (6 134) y puntos oscuros y el reverso de color amarillo claro ( 4 A4). En PDA la colonia es de color blanco, aterciopelada y margen liso.

Características microscópicas: En cultivos de 1 mcs se distinguen hifas sinuosas, de 5.0¡1m de diámetro, de pared gruesa con abundantes sepias y ramificaciones. Abundantes fíbulas en cultivos de 4 meses, disminuyen en las resiembras. Hifas delgadas de 1.7pm de diámetro, de pared fina, largas y filamentosas que forman artrosporas; algunas hifas terminales de for­ma helíptica. En cultivos de 12 meses se observan hifas tortuosas, gruesas de 3.4¡1m de diá­metro, de pared gruesa, con inclusiones citopl1ismicas que se tifien homogéneamente con safranina, se observan escasas vacuolas pequeñas, las hifas tienden a fonnar prolongaciones laterales cortas y escasas ramificaciones, con células vesiculares intercalares y terminales de pared gruesa; algunas hifas terminales con ensanchamientos de forma triangular (I'ig. 17).

Pruebas químicas: No se detectaron grasas con Sud{1n 1\\ y Sudím IV

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Fig. 16. Laccaria amethystina SC18. a) hifas sinuosas, ramificadas, septadas con pigmento plasmático. b) ensanchamientos interhifales. c) fíbulas a nivel del septo. d) célula terminal en punta roma y en clava. d) prolongaciones parietales. t) cristales.

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Fig. 17. Laccaria bico/orSC19. a) hifas sinuosas con fíbulas intersepto. b) hifas delgadas con -terminación ensanchada. c) prolongaciones parietales. d) hifns helicoidales. e) hifas sinuosas, ramificadas, septadas con pigmentos plasmáticos. f) vesícula de pared gruesa intercalar y terminal.

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t\.1clzcr· cambia a moreno negro y después de 24 hrs a narnnja fuerte; KOH- cambia ~l mori.:­no-grisúcco a las 24 hrs; HzSO.¡- negativo; NH.!OH- negativo; :1nilina pura- negativo: for­mol- negativo; fcnol anilina- negativo; guayacnl· negativo.

Laccaria /accata (Scop.:Fr.) Berk. et Br.

Distrito Federal: Km ltl carretera panonímica dd Ajusco, en bosque de Pi1111s tcocotc, Abics religiosa, Quercus p11/c/1ella, Q. /ae/I/, Q. mexica1114 Q. nig11/o.m y Q nigosa. 5 de septiembre de 1988. Col. Cruz-Ulloa, S. Aislado en EMA. SC20 ~!EXU 21024

Características macroscópicas: En EMA el micelio de tipo secundario inicia su crecimiento a los 2 días, con crecimiento poco importante de 60 mm en 30 días. En cultivos de 1 mes presenta colonia de forma circular, de color blanco que camhia a naranja grisáceo (6 B4) en las zonas mas viejas, en cultivos de 12 meses; reverso del cultivo negro(! El) zonado con el margen mas claro, tii1e el medio de color narnja claro (6 A4), la superficie un tanto rugosa, elevación plana, formada de micelio corto, de textura aterciopelada, con crecimiento postra­do, radial, de margen liso. El cultivo siempre presenta levaduras que invaden el me<lin e in­hiben el desarrollo del micelio. Crece bien en MMN y PDA. Se observan las mismas carac­terísticas que en EMA.

Características microscópicas: En cultivos Je J mes en EMA, se observan hifas filamentosas, sinuosas, de 3.4¡1 de diámetro, de pared gruesa, hialinas, pocos septos, abundantes fíbulas, algunas asociadas con el septo, en la zona de la fíbula llegan a medir 6.Sp. En la zona de avance las hifas son sinuosas, hialinas, con abundantes ramificaciones, escasos septos y fíbu­las. En MMN y EMA, en la parte media del cultivo de 4 meses, se observan hifas sinuosas de 5.0¡im de diámetro, de pared gruesa, septadas y ramificadas, algunas hifas se enrollan formando estructurns globulares, las células terminales en punta, el citoplasma Je aspecto varicoso, se tiñe intensamente por secciones con azul algodón. Hifas finas filamentosas ra­mificadas de 2.0pm de diúmctro, con citoplasma granular que se tii1c por secciones celulares a lo largo de Ja hifa. En cultivos de 12 meses se observan hifas muy finas, de 1.7¡m1, filamen­tosas, de pared delgada, el citoplasma se tiñe suavemente con verde de malaquita, por lo que es muy difícil su observación. Se observan conidios e hifas formando paquetes, que se tii1en con safranina. También se observan hifas de 3.4pm de pared gruesa, con ramificacio­nes y septos abundantes; vesículas intercalares y/o tern~nalcs con citoplasma granular que se tiñe con verde de malaquita. Algunas hifas cortas, formadas por células catenuladas, con inclusiones citoplásmicas. Se presenta anastomosis entre hifas por medio de prolongaciones laterales. En la zona de avance las hifas son rectas, hialinas, con abundantes fibulas entre la zona de los septos, poco ramificadas (Fig. 18).

Pruebas químicas: Presencia de grasas con Sudán llI y Sudán IV

Melzer- cambia a moreno-negro; KOH- negativo; H2S04- negativo; NJ-140H- negativo; ani­lina pura- negativo; formol- negativo; fenal anilina- negativo; guayaco!- negativo.

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Fig. 18. laccaria /accata SC20. a) hifas rectas varicosas, ramificadas, septadas con escaso pigmento granular. b) hifas enrolladas. c) hifas delgadas recias. d) hifas helicoidales. e) tibulas. !) vesículas subterminal y terminal. g) ensanchamientos intcrhifales con abundante citoplasma granular.

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Laccaria laccata (Scop.:Fr.) Berk. et Br.

Oaxaca: Río Numi a 8 Km W de Tlaxiaco, Tlaxiaco, en bosque de Pi1111s lawso11ii, Pi1111s 111i­clwaca11a, Querc11s 11rba11i y Q11erm mag110/1folia. 2 de scpticm brc de 1989. Col. Pércz-Si!va, E. Aislado en PDA. SC21 MEXU 22341

Características macroscópicas: En PDA el micelio secundario inicia su crecimiento a los 6 días, con crecimiento importante, cubre toda la placa de agar en 9 díns. En cultivos de 1 mes, colonia de forma irregular, de color blnnco, el reverso no cambia, de superficie irregu~ lar y elevada, con micelio largo, laxo de textura algodonosa, con crecimiento inicialmente postrado, después aéreo y un tanto sumergido, con margen irregular y fimbriado. En culti­vos de 4 meses, en Efv!A y MMN, el reverso ligeramente amarillo (1 A3). Crece bien en las resiembras en todos los medios utilizados.

Características microscópicas: En los cultivos de 4 meses en !'DA, el micelio aéreo de lazo­na media presenta hifas delgadas, largas, de 2.0¡im de diámetro, pared delgada, septadas y ramificadas, con citoplasma granuloso que se tiñe con azul algodón. No se observan fíbulas, en su lugar se distinguen prolongaciones parietales que probablemente lleguen a formar co­nexiones en grapa. En el micelio sumergido se presentan hifas sinuosas delgadas, largas, con prolongaciones parietales scptadas y ramificadas, con vesículas a lo largo de la hifa, citoplas­ma granular en algunas, otras permanecen hialinas. Presenta !Jifas sinuosas de 3.S¡im de diá­metro, septadas con ramas de forma dendrítica y ensanchamientos a nivel del scpto con as­pecto de seudofíbula; citoplasma granular que se tiñe con azul algodón. Forma cristales de forma romboide (Fig. 19).

En microcu!tivo se distinguen en la zona de avance, hifas gruesas y delgadas, di! las dimen­siones antes señaladas, unas rectas, ligeramente sinuosas, otras catenuladas, de pared grue­sa, septadas y ramificadas, con citoplasma granular que se contrasta con verde de malaquita, con abundantes vesículas intercalares y terminales de forma globosa con citoplama granular concentrado en su interior.

Pruebas químicas: Se observan escasas gútulas con Sudún ll!.

Melzer- cambia a moreno oscuro; KOH- negativo; H2S04- cambia a naranja pálido después de 24 hrs; NH40H- negativo; anilina pura- negativo; formol-negativo: fenal anilina- cambia el micelio a blanco después de 24 hrs; guayaco!- negativo.

Lactarius clirysorr/Jeus Fr.

Estado de México: Parque de los Venados, Nevado de To!uca, en bosque de Pinus /iartll'egii, Abies religiosa y Cupressus lindleyi. 29 de agosto de 1988. Col. Pérez-Si!va, E. y Cruz-Ul!oa, S. Aislado en EMA y MMN. SC22 MEXU 20744

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Fig. 19. Laccdria lacea/a SC21. a) hifas rectas, septadas y ramificadas. b) hifas sinuosas y ramificadas. e) célula terminal ensanchada con escaso pigmento granular. d) ensanchamientos interhifales. e) hifas sinuosas con citoplasma granular y célula terminal globosa. t) cristales.

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Características macroscópicas: En EMA el micelio secundario inicia su crecimiento a los 15 días, con crt!cimiento muy escaso de JO mm en 30 e.lías. En cultivos de 2 meses Ja colonia es de forma circular, de color amarillo púlido ( .¡ A3) con reverso amarillo claro (4 A4), superfi­cie lisa, poco elevada, con micelio corto, de textura aterciopt!lac.1;1, con crecimiento postrado, con margen fimbriado. En MMN crece 7 mm en 30 días, colonia de forma circular, de color amarillo brillante (.J AS) y el reverso ligeramente moreno (7 04); de textura húmeda; mice­lio corto postrado y sumergido; margen de aspecto fimbriado que se pierde en el medio. No creció en ninguna de las resiembras en los diforcntcs medios de cultivo.

Características micro~c(ipkas: En EivlA, en la zona media se dbtingucn hifas !.-irgas, rectas, de 1.7~4.0pm de di<ímctro, de p::ircd gruesa, scpta<las y escasamente ramificadas, con ct!lulas terminales en punta aguda y/o redondeadas, con escaso citoplasma granular que se tiñe en sectores con azul algodón, algunas hifos hialinas con ensanchamientos ovoides intercalares. Presenta fíbulas en Ja zona del scptn. En Ja zona de avance se observan hifas gruesas y del­gadas muy largas, rectas de. pared gruesa; Ias hifas gruesas hialinas con septos cercanos entre sí, ramific~1ciont!s no abundantes asociados con el scpto, hifas terminales en punta roma; en las hifas delgadas con caracteres similares, solo que el citoplasma presente en secciones en algunas de las células hifales. En cultivos de 12 meses escasas hifas con ensanchamientos que se tüien con verde de malaquita y con safranina se contrasta Ja pared y el citoplasma, al­gunas hifos con vesículas terminales de pared gruesa, al parecer clamiUosporas, otras formíln clamidosporas a partir de una rama mas fina ondulada que se deriva de la hifa principal; las clamidosporas con abundante citoplasma granular. Crece muy lentamente en PDA, se ob­serva pérdida de vigor en las resiembras (Fig. 20).

Pruebas químicas: No se tiñen grasas con Sudün Jll y Sudán IV

Melzer- negativo; KOH- negativo; H2S04- cambia a moreno claro; NH40H- negativo; ani­lina pura- negativo; formol- cí\mbia a moreno oscuro; fenal anilina- negativo; guayacol­cambia a negro.

Lycoperdon candidum Pers.

Marcios: Colonia del l3osquc, Cuernavaca. en bosque de Pi1111s laivsoni, P. /eiophylla, P. oo­cmpa, P. pringlci, P. leocote, Q. meticana, Q. crassipes, Q. mgosa y Q. macrophylla. 19 de agosto de 1989. Col. Cruz-Ulloa, S. Aislado en EM. SC24 MEXU 21816

Carncterísticas macroscópicas: El micelio secundario inicia su crecimiento a los 3 díus en medio de EM líquido, se resembn\ en PDA a Jos 6 días de crecido. Crecimiento importante de 90 mm en 30 días, en PDA y EMA. En EMA, colonia de forma circular, de color amari­llo (3 A3), rt!verso blanco amarillento ( 4 A2) que con el tiempo se torna amarillo oro (5 137) y en PDA el reverso no cambia, superficie irregular, poco elevada, con micelio corto, de tex­tura algodonosa, crecimiento postrado, ligeramente acreo, con margen irregular fimbriado. Después de 2 meses el micelio se compacta.

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b

l ~ L~ ... ;; f

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Fig. 20. Lactarius c/11ysorrhe11s SC22. a) hifas rectas, ramifica.ción. b) hifas delgadas ramificadas y septadas. e) células terminales en punta redondeada y en punta fina. d) seudofibulas. e) vesícula terminal f) ensanchamiento interhifal. g) vesícula en rama sinuosa.

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Carncterísticas microscópicas: En EMA, en la parte media dd cultivo, en cultivos de 4 me­ses, se observa micelio intrincado, formado por hifas sinuosas y tortuosas de 3.4-5.0¡im de diámetro, de pared gruesa, septadas y rnmilicadas, con vesículas terminales, redondas o en formn de clava, otras hifas con células terminadas en punta aguda, con inclusiones citoptús­micas granulares que se tii1en con azul algodón. Hifas sinuosas delgadas lle 2.5¡tm, de pared gruesa, septadas y ramificadas. En cultivos de 12 meses se distinguen hifas de 3.5 m, con cé­lulas globosas en la punta, septadas, ramificadas, con citoplasma granular que se tiñe inten­samente con safranina y verde de malaquita. Hifas sinuosas, de 2.0,um de dülmetro, ramifi­cadas y scptadas que se tificn homogéneamente con safranina y verde de malaquita. Sin fíbulas (Fig. 21 ).

Pruebas químicas: Se observan inclusiones de grasa con St1tlún ll1

Melzer- negativo; KOH- cambia a grisáceo; H2SO~- negativo; NH~OH- cambia a moreno oscuro después de 24 lus; anilina pura- negativo; formol- vira de amarillento a rosado des­pués de 24 horas; fenal anilina- cambia a rosado; guayaco!- negativo.

Lycoperdo11 cw1isii Dcrk.

Morelos: Colonia del Bosque, Cuernavaca,en bosque tle Pi11us /awso11i, P. leiophyl/a, P. oo­carpa, P. pri11glei, P. teocote, Quercus mexicana, Q. crassipcs, Q. mgosa y Q. macropliylla . • 16 de agosto de 1988. Col. Cruz-Ulloa, S. Aislado en EMA. SC25 MEXU 21010

Características macroscópicas: En EMA, el micelio secundario inicia su crecimiento a los 2 días, con crecimiento muy escaso de 20 mm en 30 días. En cultivos de 1 mes presenta una colonia de forma circular, de color blanco, reverso amarillo claro ( 4 A4), superficie lisa, po­co elevada, de textura algodonosa, con crecimiento postrado y sumergido, margen fimbria­do. Crece en las primeras resiembras eu PDAy MMN.

Características microscópicas: En EMA en la zona media del cultivo de.¡ meses, con lacto­fenol, se distinguen hifas sinuosas, ondulauas, de 3.4¡nn de diámetro, de pared gruesa, re­fringente, septadas y ramificadas, con prolongaciones parietales, el citoplasma con abundan­tes gútulas refringentes; células terminales se adelgazan hacia la punta, algunas son redondeadas a globosas; algunas secciones de las hifas son hialinas con pequeñas porciones de citoplasma. Hifns delgadas de 2.0¡tm de diámetro de pared gruesa, septadas y poco rami­ficadas, con inclusiones de grasa. En la zona de avance, en cultivos de 12 meses, se conser­van las mismas características, incluso se observan refringentes la pared y las inclusiones ci­toplósmicas, con verde de malaquita, el micelio es tortuoso, con hifas sinuosas que -'e aglutinan patalelamente, algunas con vesículas intercalares. Sin ffbulas (Fig. 22) .

. Pruebas químicas: Se distinguen gútulas con Sudán 111 y Sudán IV

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Fig. 21. Lycoperdo11 candidum SC24. a) hifas sinuosas, micelio entrelazado. b) células globosas. e) vesícula terminal. ú) hifas delgadas terminadas en punta aguda. e) septos, ramas e inclusiones de grasa. f) hifas sinuosas tortuosas. ·

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Fig. 22. Lycoperdon curtisii SC25. a) hifas sinuosas ramificadas y septadas. b) hifas hialinas, ramificadas con pigmentos granulares. e) gútulas y células terminales redondeadas. d) células ensanchadas, esféricas e irregulares. e) prolongaciones laterales,'

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Melzer- negativo; KOH- cambia a grisáceo; l-!2S0.1- negativo; NH.¡OH- cambia a negro; anilina pura- negativo; formol- c¡1mbia a moreno rojizo; fcnol anilina- negativo; guayacoI­negativo.

Lycopcrdo11 ericetomm Peck.

Estado de México: Laguna de Quila, Huitzilac, en bosque de Abies religiosa, Pi1111s rudis y Pi-111/S mo11tczumae. 18 de septiembre de 1988. Col. Cruz-Ulloa, S. Aislado en PDA. SC26 ME­XU 21044

Características macroscópicas: En PDA el micelio secundario inicia su crecimiento a los 3 días, crecimiento importante de 90 mm a los 30 días. En cultivos de 1 mes la colonia es ele forma irregular, de color blanco, ele aspecto hialino, reverso de color amarillo claro ( 4 A4), micelio corto, lé.txo, con superficie irregular, poco clevada1 de textura algodonosa, con creci­miento postrado, rizoidal y ligeramente aéreo, el margen se pierde en el medio, el borde li­geramente ondulado. Crece lentamente en las resiembras en PDA, no progresa en MMN.

Características microscópicas: En PDA, en cultivos jóvenes, en la parte media, se distinguen hifas poco sinuosas, de 3.4-6,fy<m de diámetro, de pared gruesa, sepias frecuentes asociados con las ramas y ramificaciones, con citoplasma de aspecto varicoso con abundantes inclusio­nes citoplásmicas, las células terminales en punta redondeada. Con seudofíbulas como abul­tamiento en el septo de 5.0¡1m de diámetro (Fig. 23).

Pruebas químicas: No se detecta inclusiones de grasa con Sudán II1 y Sudán IV. Melzer- negativo; KOH- negativo; H2S04 negativo; NH40H- negativo; anilina pura- negati· vo; formol- ligeramente azuloso; fenil anilina- negativo; guayaco!- negativo.

Lycoperdo11 per/atum var.perlatum Pers.

Distrito Federal: Carretera panorámica del Ajusco, desviación a 1 Km al Cerro Chapulín, en bosque de Pinus hartwcgii. 12 de septiembre de 1988. Col. Cruz-Ulloa, S. Aislado en EMA y MMN. SC27 MEXU 21030

Caracteñsticas macroscópicas: En Jos medios aislados se forma el micelio secundario inicia su crecimiento a Jos 3 días, con crecimiento poco importante de 40 mm en 30 días. En culti­vos de 1 mes la colonia es de forma circular, de color blanco amarillo (1 A3), no tiñe el re­verso del cultivo, a los 2 meses medio se tiñe de color amarillo oscuro (4 A6) a naranja cla­ro ( 4 A7), con superficie lisa, sin elevación, micelio largo, laxo, de textura algodonosa, con crecimiento radial aéreo y postrado, ligeramente zonado, con margen fimbriado que descri­be ondas tenues en el borde. En cultivos de 2 meses en PDA, colonia con aspecto seco y el medio se tiñe de color amarillo naranja ( 4 AS), con el tiempo. En cultivos de 6 meses, la su­perficie es venosa del centro hacia el margen, ligeramente radial y zonada, el reverso se tiñe de amarillo oro (5 B7) y el medio de anaranjado (5 BS). En MMN se observan los mismos caracteres excepto en su aspecto que en este caso es ligeramene aterciopelado. Pierde vigor

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Fig. 23. Lycoperdo11 ericetomm SC26. a) hifas ramificadas y septadas, con el septo a nivel de la bifurcación. b) abultamiento en et septo como seudofíbula, c) citoplasma separado de ta pared con pigmento granular. ·

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en las resiembras en todos los medios, se observa el micelio mas laxo y con crecimiento mas lento, aunque crece bien en todos los medios de cultivo utilizados.

Características microscópicas: En EMA en la zona media del cultivo se distinguen hifas si­nuosas anchas de 3.4¡1m de diámetro, con abundantes septos y ramificaciones, con prolonga­ciones parietales; las hifas tienden a aglutinarse paralelamente formando paquetes; con ci­toplasma granular y/o hialinas e inclusiones de grasa. Hifas delgadas de 2.0¡1m de di(unetro, de pared gruesa, scptadas y tendientes a enrollarse en forma helicoidal, con citoplasma gra­nular en secciones de las células hifales, las células terminales son globosas y alantoideas. No presenta fíbulas. En la zona de avance se observan hifas filamentosas largas, un tanto si­nuosas, de pared gruesa, con septos separados entre sí, asociados principalmente con la bi­furcación de las hifas, citoplasma granular e hifas terminales en punta aguda (Fig. 24 ).

Pruebas químicas: Se observan inclusiones de grasa con Sudún Jil

Melzer- cambia u moreno oscuro-negro; KOH- cambia a amarillo y después de 24 horas se torna grisáceo; H1S04 negativo; NH40l-!- cambia a gris verdoso después de 24 hrs; anilina pura· negativo; formol· cambia a vinúcco; fenal anilinaR negativo; guayacol· negativo.

Lycoperdo11 pusi/111111 Pcrs.

Estado de México: Parque de los Venados, Nevado de Toluca,en zona abierta con pasto, en el bosque de Pinus hamvegii, Abies religiosa y Cupressus lind/eyi. 29 de agosto de 1988. Col. Pérez-Silva, E. y Cruz-Ulloa, S. Aislado en MMN y EMA.SC28 MEXU 21032

Características macroscópicas: En los medios aislados se forma el micelio secundario que inicia su crecimiento a los 2 días, con crecimiento escaso de 20 mm de dilimeuo en 30 días. En cultivos de 1 mes se observa la colonia de forma circular, de color blanco amarillento ( 4 A2), con reverso amarillo anaranjado ( 4 87), superficie irregular, formado de micelio corto, de textura algodonosa-aterciopélada, crecimiento postrado y sumergido, con margen irregu­lar. En cultivos de 3 meses, en PDA forma una colonia circular, de color blanco amarillento (3 A3), el reverso moreno oscuro (6 07) y amarillo moreno (5 C7) hacia el margen, de tex­tura grumosa y aspecto seco; superficie irregular con pliegues también irregulares, que en en el centro del cultivo son de color blanco ligeramente rosado (7 A2). con margen irregular de color blanco y en algunas zonas de color grisáceo anaranjado (6 B4).

Características microscópicas: El micelio sumergido formado de hifas sinuosas, gruesas de 3.4µm de diámetro, de pared gruesa, con abundantes septos y ramificaciones, con citoplas­ma homogéneo y secciones hialinas, inclusiones de grasa abundantes, con células terminales globoosas de forma irregular. En cultivos de 12 meses se observan clamidosporas de pared gruesa de 5.0-8.5¡1m de diámetro; hifas terminales en punta aguda y algunas conexiones in­terhifales. No presenta ffirnlas (Fig. 25).

Pruebas químicas: Se distinguen inclusiones de grasa con Sudán!!! y Sudán IV.

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Fig. 24. Lycoperdo11 per/atum var. perlat11111 SC27. a) hifas sinuosas, ramificadas y septadas. b) hifas sinuosas, citoplasma homogéneo, células terminales en punta aguda y roma. c) hifas entrelazadas. d) prolongaciones laterales con escaso pigmento granular. e) c61ula terminal hinchada.

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Fig. 25. Lycoperd:m pusi/lum SC28. a) hifns sinuosas ramificadas, scptadas con citoplasma granular b) células hialinas con gútulas grandes, c) citoplasma en secciones de Ja hifa, d) células terminales globosas irregulares, con pigmento granular e) clamidosporas.

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Melzer- cambia a café ncgrusco y después de 24 hrs vira a amarillo; KOH- cambia a gris ver­doso; HzS04- negativo; NH40!-l- cambia a moreno viohicco; anilina pura- negativo; formol­cambia el micelio y el medio a color vinácco; fcnol anilina- negativo; guayaco!- negativo.

Lycoperdon spadiceum Pers.

Estado de México: Parque de los Venados, Nevado de Taluca, en zona de pasto en el bos­que de A bies religiosa, Pi111Lr /zartwegii y Cuprcssus lí11dlcyi. 29 de agosto de 1988. Col. Pérez­Sílva, E. y Cruz-Ullaa, S. Aislado en EMA y MMN. SC29 MEXU 20606

Características macroscópicas: En EMA y MMN, el micelio secundaria inicia su crecimien­to a los 3 días, crecimiento muy escaso de 20 mm en 30 días. Colonia de forma irregular, de color amarillo-naranja ( 4 A 7), reverso de la colonia amarillo claro ( 4 A5), con superficie ru­gosa de aspecto húmedo formada de micelio corto, de textura rugosa con pliegues irregula­res, can crecimiento postrado y sumergida hacia el margen de la colonia, margen irregular irregular que se pierde en el medio. Se debilita con las resiembras incluso en PDA.

Caracterísicas microscópicas: En EMA en cultivos de 4 meses, en la zona media se distin­guen hifns sinuosas, de 3.4¡<m de diámetro de pared gruesa, con septos cercanos entre sí y ramificaciones, se llegan a formar hasta tres ramas a partir de la hifa principal, algunas aso­ciadas con el septo; hífas terminales en punta roma, con células vesiculares interhifales y/o terminales ovoideas y alantaideas, con citoplasma homogéneo e inclusiones citoplásmicas de grasa. Hifüs sinuosas, delgadas de 2.Qu m de diámetro, con ensanchamiento a nivel de la rama, septadas, ramificadas, las hifns terminales presentan células alargadas que se ensan­chan hacia el f1pice, en general de forma irregular y con scpto debajo de la vesícula; en algu­nas el citoplasma se presenta en secciones. En cultivos de 12 meses, las hifas gruesas están formadas por células ensanchadas con citoplasma concentrado en pequeñas zonas, seµtos cercanos entre sí y las ramas can prolongaciones sinuosas. No se observan fíbulas (Fig. 26).

Pruebas químicas: Se detectan gútulas en todas las hifas, con Sudán III y Sudán IV.

Melzer- cambia a moreno oscura al instante y a amarilla después de 24 hrs; KOH· cambia a amarollo clara tanta el medio como el micelio después de 24 hrs; H2SO~- negativo; NH40H- cambia a rasado después de 24 hrs; anilina pura- el micelio se torna blanquecino, después a color ámbar; fom1ol- cambia a blanquecino despu¿s de 24 hrs; fenal anilina- ne­gativo; guayaco!- negativa.

Lycoperdon umbrinum Lloyd

Distrito Federal: Carretera panorámica del Ajusco, desviación a 1 Km al Cerro del Chapu­. lín, en bosque de Pliius hartwegii. 12 de septiembre de 1988. Cal. Cruz-Ulloa, S. Aislado en

EMAy MMN. SC30 MEXU 21029

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Fig. 26. Lycoperdon spadice11m SC29. a) hifas sinuosas, ramificadas y septadas. b) inclusiones de grasa. c) células con prolongaciones sinuosas y pigmeo tos granular y vacuolar . d) células terminales globosas ovoideas, esféricas y alantoideas.

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Características macroscópicas: En EMA y MMN, el micelio secundario inicia su crecimien­to a los 3 días de, con crecimiento poco importante de 60 mm en 30 días. En cultivos de 1 mes la colonia es de forma irregular, de color blanco, el reverso no cambia, superficie rugo­sa y elevación plann, formada por micelio corto, lnxo, de textura crcmosn hialina con fim~ brias, produce escaso exudado hialino, con margen fimbriado. En cultivos de 1 mes, en !'DA, In colonia es de forma irregular, de color naranja amarillento ( 4 !37), con reverso ama­rillo intenso (4 AS), al igual que la superficie, de textura rugosa, con aspecto seco, con creci­miento postrado y sumergido, de forma irregular, al igual que la superficie, el margen se pierde en el medio. En cultivos de 3 meses, en !'DA, la colon in de forma irregular, de color amarillo claro ( 4 A3) en el centro con margen blanquecino, reverso amarillo ( 4 A4), de as­pecto gelatinoso húmedo, ligeramente radial.

Características microscópicas: En EMA y MMN en la zona media del cultivo, se distinguen !tifos sinuosas, anchas de 4.2-5.0pm de diámetro formada por células cortas, con ensancha­mientos interhifalcs,de pared gruesa, septadas, ramificadas, con citoplasma concentrado en pequeñas zonas, otras hifas hialinas; presenta inclusiones de grasa. Hifas delgadas de 2.Q/lm de diámetro, septadas y ramificadas, con células grandes vesiculares terminaies de forma ovoide y redonda, de pared gruesa y con inclusiones de grasa; otras células terminales en punta roma y aguda; vesículas intercalares de pared gruesa, se observan contactos interhifa­Jes por medio de prolongaciones parietales (Fig. 27).

Pruebas químicas: Se observan inclusiones de grasa con Sudán Ill.

Melzer- negativo; KOH- moreno-grisáceo mate; H2S04- cambia a amariJJo; NH40H- cam­bia a color vino después de 24 hrs; anilina pura- negativo; formol- cambia a moreno vináceo después de 24 hrs; fenal anilina- cambia a moreno vinúceo después de 24 hrs; guayaco!- ne­gativo.

Pisolilhus tinctorius (Pers.) Coker et Couch

Oaxaca: Cerro del Río Azucena, a 4 Km N de Ja Batea, en bosque de Pinus oa.wcana, P. lawso11ii y P. michoacana. 21 de julio de 1989. Col. Reyes, J. Aislado en EM líquido. SC31 MEXU 21760

Características macroscópicas: El micelio secundario inicia su crecimiento a los 30 días de aislado en medio líquido de extracto de malta, a partir de peridiolos y esporas. Con creci­miento poco importante de 55 mm en 30 días. En EMA colonia de forma circular, de color amarillo grisáceo (5 B5), con reverso moreno amarillento (5 FS), con superficie plana, ha elevada y con micelio corto de textura aterciopelada, crece postrado y sumergido en el me­dio, con margen fimbriado regular. Crecimíemo importante en MMN de 70 mm en 60 días. En PDA, Ja colonia circular, es de color moreno (7 ES) y el reverso del cultivo moreno (7

· FS) en el centro y mas claro (7 ES) en el margen, se tiñe todo el medio de color moreno ro­jizo (8 FS). En MMN, Ja colonia es de color ámbar (8 FS), reverso del cultivo y medio more­no oscuro (8 F6).

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Fig. 27. Lycoperdon 111nbri1111m SC30 a) hifas sinuosas con células ensanchadas. b) hifas delgadas sin ramificación. c) ramificación y septos con escaso pigmento granular. d) conexión intcrhifal. e) vesículas interhifalcs y terminales.

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Características microscópicas: En MMN, en cultivos de 3 meses en la zona media del cultivo se observan, hifas largas, rectas, poco sinuosas, de 3.0-5.0µm de diámetro, de pared gruesa, abundantes septos con fíbulas, ramificaciones de 2·3 ramas por hifa principal. En !actofenol, las hifas se observan de color amarillo con citoplasma granular, la pared e inclusiones cito· plásmicas muy refringentes; algunas hifas hialinas. 1-lifas delgadas de 2.0 1n¡1 de diámetro. En MMN en la zona de avance las hifas son muy largas delgadas de 2.0¡rn1 de diúmetro, con células terminales redondeadas, con abundantes ramificaciones y septos; presenta fíbulas en cada septo de la rama. Se forman tres ramificaciones a partir de la hifa, la cual presenta en· sanchamiento en la zona de la ramificación. Las células terminales en punta aguda; escasas hifas en forma de espiral, intercalares y terminales.

En cultivos de 6 meses, hifas largas, sinuosas, anchas y delgadas de igual dimensión que las anteriores, de pared gruesa; ramificadas con abundantes septos; fíbulas presentes en la zona de la ramificación, en el septo y a lo largo de la hifa, con citoplasma granular que se tiñe con azul lactofenol, algunas hifas terminales sinuosas, delgadas, terminadas en punta fina, esca· sas hifas en forma de espiral intercalares y terminales.

En la zona de avance en medio de MMN, se presentan estructuras esféricas de superficie irregular con abundante pigmento de color amarillo fuerte, de 7.0-17.0µm de ancho x 8.5· 20µm de largo, los cuales se disuelven con HzS04 concentrado, NH40H y con cloro al l % . Los pigmentos se formaron también en EMA y PDA. En estos cultivos las hifas son orna­mentadas de pared gruesa, de color ocre rojizo muy oscuro. Se distinguen hifas terminales globosas y con punta roma, además de vesículas intercalares y terminales redondas (Fig. 28).

Pruebas químicas: No se detectan gútulas con Sudán III y Sudán IV.

Melzer· cambia a moreno oscuro-negro y después de 24 hrs a moreno canela; KOH- cambia a amarillo y después de 24 hrs a color crema; HzS04- negativo; NH40H-cambia a naranja después de 24 hrs; anilina pura· negativo; formol- se torna blanquecino; fenal anilina- nega· tivo; guayaco!· negativo.

Pisolithus ti11ctorius (Pers.) Coker et Couch

Oaxaca: Cañada "Las Aguilas", a 8 Km S de San Juan Mixtepec,en bosque de Pinus oaxaca· na, P. /awsonii, P. micltoacana, A/mis joru/lensis, A. ac11mi11ata, Quercus /aeta, Q. crassifolia, Q. castanea y Q. cwtdicans. 3 de septiembre de 1989. Col. Pérez-Silva, E. et a/. Aislado en PDA y EMA. SC32 MF.XU 22336

Características macroscópicas: En PDA en la colonin de 1 mes, el micelio secundario inicia su crecimiento a los 5 días, forma un fino micelio corto que cubre el explante a los 8 días de aislado. Con crecimiento escaso de 20 mm en 30 días. Colonia de forma circular, de color amarillo anaranjado (4 B7) con reverso moreno oscuro (8 F6), superficie lisa, concava, far· mada po micelio corto, de textura aterciopelada, con crecimiento postrado y ligeramente aéreo, de margen liso, fimbriado. No crece en las resiembras. En EMA la colonia de 40 días

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Fig. 28. Piso/ithus ti11ctorius SC31. a) hifas sinuosas, septudas, ramificadas y fíbulas. b) fibulas en el septo. c) células terminales en punta, glohosa, irregular y roma. d) ramificaciones con fíbulas y citoplasma y pigmentos granulares.

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es circular, de color anaranjado amarillento ( 4 B8), reverso amarillo grisáceo ( 4 C7) en el centro y mas claro ( 4 B7) hacia el margen, tiñe el medio de moreno oscuro (8 F6), superficie lisa, cóncava, con micelio largo aéreo, con textura de piel, margen liso, firnbriado.

Características microscópicas: Se distingue en la zona media micelio aéreo formado por hi­fns largas, rectas, de 3.4-5.qum de diámetro, de pared gruesa, septadas y ramificadas, abun­dantes fíbulas a lo largo de la hifa a nivel del septo, con células terminales en punta aguda, las hifas de color naranja amarillento con citoplasma se tiñe homogéneamente con azul !ac­tofenol y con escasos gránolos cercanos al septo. El micelio sumergido, formado por hifas largas sinuosas de 3.5µm de diámetro de pared gruesa, septadas y ramificadas, con células terminales en punta roma, citoplasma granular; abundantes vesículas esféricas, intercalares y terminales. Abundantes fíbulas (Fig. 29).

Pruebas químicas: Se observan inclusiones de grasa amarillas, abundantes en todas las hifas, con Sudán III y Sudán IV.

Melzer-cambia a negro después de 24 hrs; KOH- cambia a gris-morado después de 24 hrs; H2S04- cambia a rojizo a los 30 min, después de 24 hrs, a color ocre; NH40H- negativo; anilina pura- negativo; formol· cambia a canela rosado después de 24 hrs; fenal anilina- ne­gativo; guayaco!- negativo.

Rhizopogon isabellinus A. H. Smith

Distrito Federal: Carretera panorámica del Ajusco, desviación a lKm al Cerro Chapulín, en bosque de Pinus hartwegii. 12 de septiembre de 1988. Col. Sánchez-Cruz, R. Aislado en EMA y MMN. SC33 MEXU 21028

Características macroscópicas: En EMA y MMN el micelio secundario inicia su crecimiento a los 5 días, crecimiento escaso de 23 mm en 30 días. En cultivo de 1 mes, colonia de forma irregular, de color blanco con tonos naranja (5 A7) y amarillo oro (5 B7) con el margen amarillo claro (4 A4), reverso moreno oscuro (7 E6), superficie irregular y elevación ligera­mente convexa, con micelio corto, de textura aterciopelada, que con el tiempo cambia a afelpada, produce abundante exudado moreno oscuro, con crecimiento postrado y sumergi­do, zonado y con forma radial, y margen fimbriado. En PDA, la colonia es un tanto circular, de color amarillo pálido ( 4 A3) que se oscurece hacia el margen ( 4 A5), superficie lisa con líneas ligeramente marcadas de manera radial, de textura correosa, produce exudado amari­llo en los cultivos de 3 meses, con crecimiento postrado que se sumerge en el margen, éste liso. En cultivos de 6 meses, de color rosado (10 A2) y zonado hacia el margen, reverso mo­reno oscuro (7 E6) y superficie con pequeñas elevaciones de color moreno pálido (7 ES). En cultivos de 12 meses se detiene completamente el crecimiento pero en la resiembra de

· éste, crece nuevamente en cualquier medio.

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Fig. 29. Pisolitl:us tinctorius SC32. a) hifas recias, scptadas y ramificadas. b) !tifus hialinas. e) ramificaciones a partir de la hifo principal y fíbulas. d) citoplasma y pigmentos granulares. e) prolongaciones de las conexiones en grapa. f) hifas terminales en punta globosa, sinuosa, aguda, y redondeada. g) vesículas esf6ricas intercalares y terminales.

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Características microscópicas: En EMt\ y MMN, en cultivos de l mes, en la parte media del cultivo, se presentan hifas rectas, largas, de 3.Qum de düímetro, de pared gruesa muy teñida, ramificadas y septadas, granulaciones citoplúsmicas, glóbulos de grasa y abundante pigmen­to amarillo. !-Jifas sinuosas, delgadas de 2.Qum de diámetro, septadas y ramificadas, con in­clusiones citoplásmicas concentradas en secciones de la célula hifal, abundante exudado amarilla en el citoplasma, grandes gotas de color moreno oscuro extrahifales; hifas termina­les en punta fina y otras en punta redondeada; presenta cristales de forma romboide, se for­man paquetes de hifas paralelas. En la zona de avance, hifas filamentosas gruesas y delgadas un tanto sinuosas, no muy scptadas y rnmificadas. El scpto se origina después c.h: la ramifica­ción. Las hifas se encuentran entrelazadas formando redes compactas que dificultan su ob­servación, se distinguen hifas terminales en punta aguda. Sin fíbulas (rig.30).

Pruebas químicas: Se observan gútulus amarillas con Sudán IV.

Melzer- cambia a moreno oscuro; KOI-1- negativo; H2S04- negativo; NH40H- negativo; anilina pura- negativo; formol- ligeramente azuloso a los 30 min. que se pierde después de 24 hrs; fenal anilina- negativo; guayaco]- negativo.

Rhizopogon /11teo/11s (l'r.:Nordh.) Tul.

Morelos: Colonia del Bosque, Cnernavaca, en bosque de Piml~ lawso11i, P. /eiophyl/a, !'. oo­c<1rpa, P. pn'11glci, P. teocote, Q11erc11s mexica11a, Q. crassipes, Q. rugosa y Q. m<1crophyllll. 4 de octubre de 1988. Col. Sánchez-Cruz, R. Aislado en lv!MN. SC34 MEXU 21022

Características macroscópicas: En ·MMN el micelio secundario inicia su crecimiento a los 4 dias, crecimiento escaso de 30 mm en 30 díns. Colonia de forma irregular, de color moreno naranja (6 C7), con reverso moreno oscuro (7 E6), superficie irregular, poco elevada; mice­lio corto, de textura algodonosa, produce exudado hialino, con crecimiento postrado y su­mergido, el mnrgen fimbriado. No crece en las resiembras en ningún medio.

Características microscópicas: En la zona media del cultivo se distinguen hifas largas, rectas, poco sinuosas, de 3.4¡1m de diámetro de pared gruesa, con septos y ramificaciones, algunas con incrustaciones helicoidales, presenta pequeños abultamientos en la hifa como scudofí­bulas, con citoplasma granular que se tiñe homogéneamente con azul algodón, vacuolado y con gútulas, abundante exudado de color amarillo ocre fuera de las hifas, hifas terminales con punta roma, otras aguda. En cultivos de 4 meses, hifas anchas de 3.4µm de diúmetro, ra­mificadas y septadas con citoplasma granular con algunos espacios hialinos. Presenta gran­des vesículas interculnres y terminales que se van haciendo cada vez más pequeñas hacia la punta. En cultivos de 12 meses, las !tifas son filamentosas de pared gruesa, con citoplasma granular, con septos y ramificaciones no abundantes. Algunas hifas formadas de células glo­bosas intercalares. Hifas hialinas escasas. Presenta cristales de forma romboide. Se observan ensanchamientos en las hifas como pscndofíbulas (Fig. 31).

Pruebas químicas: Se dt~tinguen grasas con Sud!in lH y Sudán IV.

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Fig. 30. Rhizopogo11 isabcllinus SC33. a) hifas poco sinuosas, ramificadas, scptadas con citoplasma en secciones y pigmento granular. b) gútulas. e) hifas rectas, delgadas filamentosas. d) ramas laterales terminadas en punta aguda. e) célula ensanchada intcrhifal. t) células terminales en punta roma. g) rama lateral helicoidal. h) cristales.

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Fig. 31. Rhizopogo11 /uteo/us. SC34. a) hifa varicosa septada e hifa poco sinuosa. b) citoplasma en secciones y pigmento vacuolar. c) células terminales en punta roma. d) hifus con incrustaciones de pigmentos epimembranosos. e) gotas de exudado. f) agregados de hifas. g) células terminales globososns y sinuosas con terminación en punta. h) cristales.

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Melzer· negativo; KOI-1· negativo; H2SQ4. negativo; NH40H- negativo; anilina pura· nega· tivo; formol negativo; fenal anilina· negativo; guayaco)- negativo.

Rhizopogon rubescem Tul.

Marcios: Colonia del Bosque, Cuernavaca,en bosque de l'inus lawsoni, /'. /ciophyl/a, P. oo· carpa, P. pringlei, P. teocote, Q11erc11s mexicana, Q. cmuipes, Q. 111gosa y Q. 111acrophyl/a. 4 de octubre de 1988. Col. Cruz-Ulloa, S. y Súnchez-Cruz, R. Aislado en MMN. SC35 rvtEXU 21021

Características macroscópicas: En MMN el micelio secundario inicin su crecimiento a los 4 días, crecimiento poco importante de 45 mm en 30 días. En cultivos de 4 meses, colonia de forma irregular, al principio de color blanco-amarillo (2 A3) mate con el centro negro (2 F3), después cambia a amarillo oscuro (3 DS) con el margen amarillo claro (3 A3), reverso del medio moreno oscuro (5 F8), con elevación convexa y superficie rugosa, fonnaua por micelio corto, de textura de gamuza o ante, con pliegues radiales, secreta exudado de color amarillo fuerte brillante (3 AS), con crecimiento postrado, zonado, con pequeñas elevacio­nes, de margen liso con ondulaciones grandes e irregulares. En PDA Ja colonia es de color amarillo oscuro ( 4 C8), con el borde de color blanco naranja (6 A2), crecimiento aéreo y su­mergido, tiñe el medio de color moreno oscuro (5 F8); produce abundante exudaclo moreno negro (6 F8). En cultivos de 7 meses, el micelio se comprime y no crece en las resiembras en ningún medio.

Características microscópicas: En cultivos de 4 meses, el micelio forma de paquetes de hifas entrelazadas paralelamente, hialinns, delgadas,de pared gruesa, septadas y anastomosadas, con abundante exudado moreno ocre. Se distinguen hifas gruesas de 3.4¡rn1 y delgadas de 2.0¡1m de diámetro. En ambos tipos, el citoplasma es granular presente en algunas células, en otras es hialino con pequeñas gútulas. En cultivos de 12 meses, hifas delgadas y ramifica­das, con abultamientos en la hifa a manera de seudofíbulas, el citoplasma se tiñe por seccio­nes con verde de malaquita y safranina. En el micelio sumergido las hifas son delgadas, rcc· tas poco sinuosas, con citoplasma que se tiñe por secciones con verde de malaquita. En Ja zona de avance se observan hifas gruesas y delgadas con las mismas características de Jos cultivos jóvenes. Se observan cristales romboides (Fig. 32).

Pruebas químicas: Se detectan gútulas con Sudán III.

Melzer· cambia a negro; KOI-1· cambia a grisáceo; I-12S04- negativo; Nl-1401-I- negativo; anilina pura- negativo; formol- negativo; fenal anilina- negativo; guayaco)· negativo.

Sui//us gra1111/af11S (L.:Fr.) Kuntze

Estado de México: Colonia del Bosque, en bosque de l'imL1· lawso11i, P. /eiophylla, P. oocar· pa, P. pringlei, P. teocote, Q11erc1is mexicana, Q. crassipes, Q. rugosa y Q. macrophy/la. 26 de septiembre de 1988. Col. Cruz-Ulloa, S. Aislado en PDAy VS. SC36 MEXU 21016

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Fig. 32. Rhizopogo11 rnbescel!S SC35. a) hifas rectas, septadas y ramificadas. b) hifa hialina. é) hifa delgada con gotas de exudado. d) paquete de hifas paraldas con gotas de exudado. e) célulns terminales en punta roma y citoplasma granular en secciones con pigmento vacuolar. 1) cristales.

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Fig. 33. S11il/11s grm111/at11s SC36. a) hifas rectas, ramificadas, septadas, hialinas. b) gútulas. c) hifas delgadas filamentosas. d) células ensanchadas. e) células globosas terminales e intercalares con pigmento plasmático. 1) hifas rectas, ramificadas con terminación en punta de la zona de avance.

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Características macroscópicas: En PDA el micelio secundario inicia su crecimiento a los 5 días, con crecimiento muy escaso de 40 mm de diámetro en 30 días. Colonia de forma circu­lar, al principio de color blanco después ligeramente amarillo ( 4 AJ); el reverso cambia de amarillo oscuro ( 4 AS) a moreno (6 E7), la superficie lisa, elevación convexa, abundante micelio corto, produce escaso exudado moreno oscuro, de textura aterciopelada ligeramen­te algodonosa, afelpada, con crecimiento al principio postrado, después aéreo, de margen li­so, limbriado. En cultivos de 4 meses, en PDA, la colonia llega a medir 70 mm, es de color blanco amarillento (2 A3) con aspecto algodonoso y abundante exudado cristalino, hialino, con superficie lisa un tanto elevada; tiile el medio de amarillo oscuro (2 A·I) ligeramente amarillo grisáceo (2 B4). En cultivos de 7 meses, Ja colonia cubre toda Ja placa de agar, 90 mm, es de color blanquecino ligeramente gris naranja (5 B2); reverso color moreno (7 E7), tiñe todo el medio. Se pierde su aspecto algodonoso y forma exudado cristalino amarillo.

Características microscópicas: En cultivos de 4 meses, en la zona media,las hifas son rectas de 3.4-6.fyrni de diúmctro, de pared no muy gruesa que se delimita con verde de malaquita, hialinas y escasas gútulas, septadas y ramificadas, con zonas ensanchadas como seudofíbulas, con células terminales hinchadas de forma redondeada, otras terminan en punta roma. En cultivos de 12 meses, en el micelio sumergido de Ja zona de avance se obseivan hifas grue­sas, un tanto sinuosas, de pared gruesa refringente con safranina, scptadas y ramificadas; hialinas en su mayoría con pocas gútulas. Las hifas que originan la rama forman una vesícula antes do! septo, otras hifas mas anchas de la base que Ja rama. Se obscivan hifas delgadas, de pared gruesa, poco septadas y ramificadas, con inclusiones de grasa. En la zona de avance las hifas son rectas muy largas con pocos scptos y ramas, las hifas terminales en punta roma (Fig. 33).

Pruebas químicas: Presencia de grasas que se tiñen con Sudún IV.

Melzer- cambia de moreno oscuro a negro; KOH- cambia a moreno oscuro; I-!2S04- negati­vo; NH40H- negativo; anilina pura- negativo; formol- negativo; fenal anilina- negativo; gua­yaco!- cambia el medio a ligeramente morado después de 24 hrs.

Suillus grmwlatus (L.:Fr.) Kuntze

Marcios: Colonia del Bosque, Cuernavaca,en bosque de Pimis /awsmzi, P. /eioplzyl/a, P. oo­carpa, P. pringlei, P. teocote, Quercus mexicana, Q. crassipes, Q. rugosa y Q. macroplzylla. 19 de agosto de 1989. Col. Cruz-Ulloa, S. Aislado en PDAy EMA. SC37 MEXU 21806

Características macroscópicas: En EMA y PDA el micelio secundario inicia su crecimiento a los 5 días como fino micelio algodonoso, crecimiento poco importante de 30 mm a los 30 días. Colonia de forma circular, de color blanco amarillento (4 A2) con reverso amarillo gri-

. sáceo ( 4 B3), superficie regular un tanto elevada, plana, formada por micelio corto, de tex­tura aterciopelada, con crecimiento al principio postrado después un tanto aéreo, con mar­gen liso, ligeramente fimbriado. En MMN, su crecimiento de 25 mm en 30 días, de color

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blanquecino rosado con el reverso moreno amarillo que con el tiempo cambia a amarillo moreno en el centro y amarillo oscuro hacia el margen, la colonia se torna rosada grisúcea (13 B2) con ex-udado cristalino. En cultivos de 6 meses, en PDA, colonia de forma un tantu circular, de color moreno grisáceo (5 D3), con micelio basal moreno oscuro (7 Eú) casi ne­gro, margen rosado grisáceo (13 B2), liso, fimhriado, reverso café oscuro en el centro y mar­gen mas claro. En cultivos de 12 meses, en PDA, disminuye su crecimiento y el micelio se compacta. Crece bien durante 3 resiembras después no crece en ningún medio.

Características microscópicas: En cultivos de 4 meses, en la zona media, se distinguen hifns rectas y poco sinuosas, de 3.0¡1m de diámetro, de pared gruesa, septadas y ramificadas con seudofíbulas a nivel del scpto, la hifa que origina las nuevas ramas presenta ensanchamiento a nivel del scpto. En cultivos de 12 meses, micelio aéreo con hifas rectas, poco sinuosas, de 3.4¡1m de diámetro, de pared gruesa, refringente con safranina y teñida con verde de mala­quita, algunas hifas hialinas o con escasos gránulos en el citoplasma o citopbsma en st.!Cdo­nes; septadas y escasamente ramificadas; hifas terminales con punta roma o ensanchada, con conexiones interhifales. Hifas delgadas de 2.0¡un de diámetro de pared gruesa con abundan­te exudado moreno oscuro que se adhiere a las paredes de la hifa. No se observan fíbulas. Forma paquetes entrelnzados de hifas paralelas. En la zona de avance se distinguen hifas rectas de pared gruesa, con septos distantes entre sí y pocas ramas, asociadas con la zona del septo; con células terminales en punta aguda y el citoplasma homogéneo (f'ig. 34).

Pruebas químicas: Se tiñen de rojo gútulns con Sudán Ill y Sudán IV.

Melzer- cambia a moreno oscuro-negro; KOH- negativo; H2S04- negativo; NrüOH- nega­tivo; anilina pura- cambia a negro después de 24 hrs; formol- negativo; fennl anilina- negati­vo; guayaco!- negativo.

Suillus gra1111/at11s (L:f'r.) Kuntze

Oaxaca: Cañada de "Las Aguilas", 8 Km S de San Juan Mixtepec, en bosque de Pin11s oaxa­cana, P. lawsonii, P. miclzoacana, Quercz" /aeta. Q. crassifolia, Q. castanca, Q. candicans, Al­nm jorullel!Sis y A. acuminata. 3 de septiembre de 1989. Col. Pércz-Silva, E. y Cruz-Ulloa, S. Aislado en PDA. SC38 MEXU 2238

Características macroscópicas: En PDA el micelio secundario formado por un micelio corto, escaso sobre el explnnte, que inicia su crecimiento a los 6 días de aislado, colonia de forma circular, de color mor~no (6 ES) con matices blancos, reverso moreno oscuro (6 F8); con su­perficie lisa, convexa, formada por micelio corto, de textura de gamuza y crecimiento pos­trado, el margen fimbriado. No creció en la primera resiembra en EMA y PDA. Se hicieron resiembras de diferentes partes del cultivo en MMN y se logró nuevamente el crecimiento.

Características microscópicas: El micelio aéreo fonnado por hifas rectas, de 3.5-4.0,11m de diámetro, con sepias distantes entre sí y ramificadas con algunos ensanchamientos unifor­mes que disminuyen en diámetro hacia la parte terminal de la hifa. Abundante exudado mo-

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Fig. 34. S11illus granulatus SC37. a) hifas gruesas poco sinuosas, ramificadas y septadas. b) hifa hialina y exudado. c) pigmento vacuo lar. d) ramificaciones y septos. e) conexión interhifal con pigmento granular. f) células terminales en punta roma y ensanchada. g) scudo!Thula.

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Fig. 35. Suillus grauulatus SC38. a) hifas rectas poco sinuosas, ramificadas y septadas. b) hifas delgadas, ramificadas con inclusiones morenas y hialinas. c) escaso citoplasma granular con pigmento plasmático. d) gotas de exudado.

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reno (7 E7) fuera y sobre la pared de las hifas. Algunas hifas hialinas con gútulas. Hifas lar­gas, rectas, de 2.0-3.0¡im de diámetro, de pared gruesa y citoplasma granular de color amari­llo, se tiñe por secciones con azul \actofenol. El micelio sumergido forn,ado por hifas de 2.5¡1m de diámetro, muy sinuosas formando un micelio intrincado, con citoplasma de color amarillo, otras hifas permanecen hialinas. Hifns terminales en punta aguda (Fig. 35).

Pruebas químicas: Se detectan gútu\as con Sudún \\I y Sudán IV.

Me\zer- cambia a negro; KOH- negativo; H2S04- cambia a color nmbar; NH40H- negativo; anilina pura- al principio cambia a blanqucsino que con el tiempo se pierde; formol- cambia a moreno grisáceo después de 24 hrs; fenal anilina- negativo; guayaco!- negativo.

Suillus luteus (L:Fr.) S. F. Gray

11axcala: Km 33 de la carretera Tlaxco-Chignahunpan, en bosque de Pi1111s ayacalwite, /'. mo11tezwnae, P. patu/a, P. /eiophylla, P. teocote, Quercus crassifolia, Q. bar/Ji11cn,Í1', Q. p11/c/;e­lla, Q. glabrescem, Q. sagata y Q. esperanzae. 30 de julio de 1988. Col. Pérez-Si\va, E. Nsla­do en MMN y PDA. SC39 MEXU 20595

Caracter!sticas macrnscópicas: En MMN el micelio secundario inicia su crecimiento a los 4 días, crecimiento poco importante de 47 mm de diámetro en 30 días. En cultivos de 1 mes la

colonia es de forma un tanto circular, de color moreno claro (7 04) con el margen mas claro (7 B3); reverso amarillo rojizo (4 !37), superficie plana y elevada en ondas, textura atercio­pelada, con aspecto de gamuza formada de micelio corto que crece inicialmente postrado y después aereo, con el margen irregular y fimbriado. En PDA, con crecimiento importante de 60 mm de diámetro en 30 días, muy abundante. En las resiembras en EMA, VS y MMN, no crece, solo algunas secciones del cultivo son vigorosas.

Características microscópicas: En PDA, en cultivos de 1 mes, en la zona de avance se obser· van hifas largas, un tanto sinuosas de 3.4-7.5m de diámetro, con pared gruesa, scptos no abundantes y ramificaciones, se observan con mas frecuencia en las ramas \ater~les nuevas abultamientos a nivel del septo, al parecer son fibulas de 6.Sm de diámetro; con hifas termi­nales en punta roma y otras en punta redondeada. Con material cristalino refringente de forma romboide. En PDA, en cultivos de 6 meses en la zona media del cultivo se distinguen, hifas rectas poco sinuosas, de 3.4-6.Sm de diámetro, de pared gruesa, septadas y poco ramifi­cadas, con citoplasma granular; algunas se tiñen con azul lactofenol dejando hialina la zona del septo, en este nivel presenta estructuras nodulares, como seudofíbulns, presenta células terminales en punta roma. Las hifas se unen formando haces paralelos con abundantes gotas de color ocre fuera de las hifas. Hifas delgadas de 2.0-3.0m de diámetro, en éstas no se ob­servan llbulas. En cultivos de 12 meses, el micelio es correoso, con hifas anchas de pared gruesa muy refringente con verde de malaquita, septadas y poco ramificadas, el citoplasma se tiñe en secciones con safranina, los septos se tiiíen fuertemente con safranina, otras par­tes de la hifa permanecen hialinas, con verde de malaquita se tiñen solo las inclusiones cito-

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Fig. 36. Suillus luteus SC39. a) hifas sinuosas, scptadns y ramificadas. b) citoplasma grumoso con pigmento granular y gútulas. e) ramificaciones con pigmento vacuolar. d) hifas con gútulas y cristales extrahifales. e) células terminales sinuosas en punta roma. f) ensanchamiento a nivel del septo. g) gotas de exudado. h) rama lateral sinuosa.

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plásmicas. Los scptos se encuentran separados a lo largo de la hifa y n nivel de la ramilica­ción. Las células terminales, rectas, un tanto sinuosas con punta roma. Presenta crístnlcs romboides (Fig. 36).

Pruebas químicas: Se detectan grasas con Sudán IV.

Melzer- negativo; KOH- cambia a ligeramente amarillo a los 30 mio. y después de 24 hrs a rosado mate; H2S04- negativo; NH40H- negativo; anilina pum- negativo; formol· negativo; fenal anilina- negativo; guayaco!- negativo.

Suillus p1111ctat11s (Snell et Dick) Smith et TI1iers.

Oaxaca: Tejocotcs a 14 Km W de San Juan Mixtepec, en bosque de l'í1Z11s pseudoslrobus, P. aaxacana, P. douglasiana, Quercus niga.m y Q. laurina. 4 de septiembre de l 989. Col. Pérez­Silva, E. y Cruz-Ulloa, S. Aislado en PDA. SC40 MEXU 22342

Características macroscópicas: En PDA el micelio secundario inicia su crecimiento a los 8 días, crecimiento escaso de 30 mm de diámetro en 30 días. Colonia de forma circular, de co­lor amarillo moreno (5 C7) con reverso moreno amarillento (5 DS), con superficie irregular, convexa, formada por micelio corto, de textura vclutinosa, con crecimiento postrado inicial­mente y después aéreo, con el margen fimbriado. En EMA, el micelio es blanco amarillento (1 A2), con el reverso narnnia grisáceo (5 85) que cambia a naranja grisúcco (6 B4) con el tiempo; en el margen se forman manchones de color blanco amarillento (4 A2), reverso del margen moreno oscuro muy intenso (7 E6), con pliegues no uniformes en la superficie y abundante elCUdado moreno naranja (7 C7). Con el tiempo, tiñe el medio de color (7 E7). En PDA Ja colonia es amarillo claro ( 4 A3) con moreno claro (7 C7), reverso moreno oscu­ro (7 E6), con exudado moreno oscuro. Con el tiempo cambia a color anaranjado grisáceo en el centro, el margen moreno claro (6 C7), reverso y medio moreno oscuro (7 E6);la su­perficie poco elevada con pliegues. En cultivos de 4 meses, el micelio se compacta y cambia a amarillo grisáceo ( 4 C7). En Ja zona donde se manipula se toma un tanto más oscuro (6 D7).

Características microscópicas: En la zona de avance en cultivos de 2 meses, se presentan hi­fas rectas, de 3.0-7.0m de diámetro, con septos a nivel de la rama y úcspués en ésta, con abultamiento en Ja zona del septo a manera de seudofíbulas, citoplasma escaso, algunas hi­fas hialinas y con gútulas pequeñas; las células terminales un tanto sinuosas con punta aguda o roma. Hifas delgadus de 2.0m de diámetro, largas y rectas. Los cultivos de 3 meses, en el micelio sumergido presenta hifas sinuosas, de pared gruesa, con septos y ramificaciones, ci­toplasma granular que se tiñe de rojo con safranina. En el septo se originan nuevas ramas, la hifa que forma la rama se ensancha a nivel del septo. Hifas terminales helicoidales, otras cé­lulas terminales generalmente globosas, con abundantes inclusiones hialinas y ensancha­mientos a manera de ffimlas (Fig. 37).

Pruebas químicas: Se tiñen de rojo los exudados extra hifales con Sudún lll.

Melzer- negativo; KOH- negativo; H2S04- negativo; NH40H- negativo; anilina pura- nega­tivo; formol- negativo; fenal anilina- negativo; guayaco!- negativo.

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Fig. 37. Suil/us punctatus SC40. a) hifas sinuosas ramificadas, septadas con ensanchamientos interhifales. b) citoplasma granular. e) prolongaciones laterales ensanchadas. d) células terminales en punta aguda y en punta redondeada. e) seudofibulas.

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S11i//11s tomentos11s (Kauffm.) Sing.

Oaxaca: Cañada de "Las Aguilas .. , a 8 Km S de San Juan Mixtepec, en bosque de Pi1111s mi­choacana, P. oamcana, P. lawsonii, Q11erc1Ls /aeta, Q. crassifolia, Q. castanca, Q. ca11dica11s, Alnus jom//ensis y A. ac11111i11ata. 3 de septiembre de 1989. Col. Pérez-Silva, E. y Cruz-Ulloa, S. Aislado en PDA. SC4 l MEXU 22339

Características macroscópicas: El micelio secundario inicia su crecimiento a los 5 días, cre­cimiento importante de 70 mm de diámetro en 30 días. Colonia tic forma circular, de color blanco amarillento (4 A3) con el centro amarillo (4 A4), margen amarillo grísúceo (6 B4) li­geramente naranja amarillento ( 4 B7) con el reverso amarillo fuerte (4 BS), con superficie lisa y elevación convexa, con micelio largo aéreo, dt! textura algodonosa y mnrgcn fimhriado.

En PDA, al principio, la colonia es blanca, después cambia a blanco amarillento ( 4 A3) lige­ramente amarillo claro ( 4 A5) con el margen amaríllo ( 4 A2); en el centro del cultivo, el mi­celio mas llLxo que en el margen; reverso blanco amarillento ( 4 A4) después se torna a ama­rillo oro (5 B7). En cultivos de 1 mes, es de forma circular, el micelio de color amarillo claro (3 A3) y rojo grisáceo (7 B4) en el centro, con el margen claro naranja grisáceo (6 B3) y grandes gotas de exudado moreno oscuro, tiñe el medio de color moreno (7 E7), con super­ficie lisa y elevación con un mamelón central. En cultivos de 3 meses el micelio es algodono­so, ílocoso, aéreo con tonos naranja grisáceos (5 B6) y moreno naranja (6 C7) en el margen. El micelio aéreo moreno naranja (6 C7), amarillo claro (3 A3) y blanquecino. Tiñe todo el medio de color moreno (7 E7), reverso del cultivo moreno oscuro (7 F7) muy intenso. En cultivos de .: meses el micelio se compacta, y al manipularse cambia a color moreno oscuro casi negro (7 F5), incluso en la parte del micelio que está en contacto con el medio, reverso moreno oscuro (7 F7).

En cultivos en EMA la colonia es blanca que cambia con el tiempo a naranja p:ílitlo (5 A3), con el margen amarillo claro ( 4 A3) y reverso amarillo oro (5 B7).

Características microscópicas: En medio de PDA, en la zona de avance del cultivo, se obser­van hifas largas, sinuosas, tic 3.0-6.Sm de diámetro con pared gruesa, ramificadas y septadas, sin granulaciones en el citoplasma y gútulas tle color amarillo fuera de las hifas. L1s células terminales flexionadas con terminación en punta roma. Hifns delgadas, rectas, de 1.7m de diámetro, de pared gruesa, scptadas y poco ramificadas, con citoplasma que se tiñe en sec­ciones con safranina. En cultivos de 3 meses teñidos con safranina se observan hifas rectas, varicosas, de 3.5m de diámetro, de pared gruesa refringente; septadas y ramificatlas, varias ramas partir de la rama principal, citoplasma granular en algunos sectores de la hifa, otras permanecen hialinas. !-liras delgadas de 2.0m de diámetro tle pared gruesa, rectas y varico­sas (Fig. 38).

Pruebas químicas: Se observan abundantes gotas rojizas fuera de las hifas con Sudán 111.

Melzer- cambia a moreno oscuro, después a negro; KOH- cambia a grisáceo; H2SÜ4- nega­tivo; NH40H- negativo, anilina pura- negativo; formol- negativo; fenal anilina- negativo; guayaco!- negativo.

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•

f

• • g

Fig. 38. Sctillus tomentosus SC41. a) hifas sinuosas y tortuosas, ramificadas y septadas. b) citoplasma grumoso con pigmento granualr. c) hifas rectas hialinas. d) hifas varicosas con ramas terminadas en punta aguda. e) células terminales tortuosas. f) ensanchamientos a nivel del septo. g) gotas de exudado.

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CARACTERIZACION DE CULTfVOS PUROS PRESERVADOS EN ACEITE MINERAL

Amanita rubescer<S (l'ers. :Fr.) S. F. Gray SC07 MEXU 21011

Características macroscópicas: El micelio inicia su crecimiento a los 16 días, creció 20 mm en 30 días en MMN, colonia de forma un tanto circular, de color rosa grisáceo (12 A2), su­perficie lisa no elevada, de textura aterciopelada, con crecimiento postrado y sumergido, de margen regular fimbriado.

Características microscópicas: En la zona de avance del micelio sumergido se observan hifas largas un tanto sinuosas, de 2.5-3.5¡1m de diámetro, di! pared delgada, con ramas sinuosas, septadas; el citoplasma se tií1e homogéneamente, excepto en la zona del septo, algunas hifas un tanto hialinas. Células terminales en punta aguda. No presenta fibulas. Forma agregados hifalcs de forma paralela (Fig. 39).

Pruebas químicas: No se detectan gí1tulas con Sudán JII y IV

Melzer- cambia a negro a los 30 min. después de 24 hrs a color ocre; KOH- negativo; I·l2S04- negativo; NH40H- negativo; anilina pura- negativo; formol- cambia a ligeramente rosado después de 24 hrs; fenol anilina- negativo; guayaco!- negativo.

C/itocybe adora (Bull.:Fr.) Kum. SClO MEXU 21012

Características macroscópicas: El micelio iníciu su crecimiento a los 30 días en MMN, crece 1 mm alrededor del micelio resembrado, colonia circular, de color amaríllo claro (4 A3), con superficie lisa, de textura húmeda, con margen regular y fimbriado.

Características microscópicas: En la zona de avance del micelio sumergido en el medio, se observan hifas de 3.0¡im de diámetro de pared gruesa, ramificadas y septadas, con citoplas­ma granular que se tiñe por secciones con azul lactofenol, con hífas terminales en punta ro­ma y en punta aguda. Abundantes fíbulas a lo largo de la hifa (Fig.40).

Pruebas químicas: Se distinguen gútulas no abundantes con Sudán llI y IV.

88

Fig. 39. Amanita mbescen< SC07. a) hifns sinuosas, ramas y septos. b) citoplasma granular. e) células terminales en punta aguda. d) rama lateral sinuosa con punta aguda. e) paquete de hifas entrelazadas.

Fig. 40. C/itocybc oclora SClO. a) fíbulas. b) hifas sinuosas, ramas y septos. e) citoplasma granular. d) célula terminal en punta roma. ,,.ji

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Melzer- cambia a moreno oscuro; KOH- cambia a moreno; I-l2S04. cambia a rojizo oscuro; NH40H- negativo; anilina pura- negativo; formol- negativo; fenol anilina- negativo; guaya­co!- negativo.

Hebeloma sacchario/ens Qué!. SC13 MEXU 21035

Características macrosc<ipicas: El micelio inicia su crecimiento a los 5 días, crece 40 mm en 30 días en MMN; colonia de forma irregular, de color naranja (5 A7) con zonas de micelio blanco-amarillento (3 A2), reverso amarillo oro (5 137), con superficie irregular, de textura granuloso, aterciopelado, con crecimiento postrado y margen irregular fimbriado.

Características microscópicas: En la zona de avance del micelio superficial se observan hifas varicosas, de 4.0-5.0µm de diámetro e hifas delgadas de de l.7¡1m de diámetro de pared gruesa, refringente, con septos a corta distancia entre si, ramificaciones a nivel del scpto; el citoplasma separado de Ja pared dando el aspecto de vesícula de forma variada, con zonas que se tiñen m{1s intensamente con azul lactofenol, de tipo granular con pigmento amarillo fuerte; las células terminales en forma aguda; con vesículas intercalares. No presenta tíbulas (Fig. 41).

Pruebas químicas: Se detectan abundantes gútulas en células hialinas y escusas en células con citoplasma granular, con Sudán III y Sudán IV.

Melzer- cambia a moreno oscuro; KOH- negativo; H2S04- negativo; NH40I-l-negativo; ani­lina pura- negativo; formol- cambia a moreno oscuro después de 24 hrs; fcnol anilina- nega­tivo; guayaco!- negativo.

Inocybe grammala Qué!. SCl 7 MEXU 8415

Características macroscópicas: El micelio inicia su crecimiento a los 5 días en MMN, creció 50 mm en 30 días. Colonia de forma irregular, de color blanco ligeramente blanco grisáceo (2 B4), el reverso no cambia, superficie lisa ligermante elevada, micelio largo, laxo, de textu­ra algodonosa, con crecimiento postrado y margen fimbriado.

Características microscópicas: El micelio sumergido de la zona de avance formado por hifas cortas, sinuosas, de 2.0-2.Sµm de diámetro, de pared gruesa, con abundantes ramificaciones, con zonas que se ensanchan a lo largo de la hifa, el citoplasma se tiñe homogéneamente con azul algodón, excepto en la zona del septo; hifas terminales tortuosas con punta redondea­da. No presenta fibulas (Fig. 42).

Pruebas químicas: No se detectan gútulas con Sudán lll y Sudán IV.

Melzer- cambia a moreno oscuro a los 30 mio, después de 24 hrs. se torna naranja; KOH­cambia a amarillo; H2S04- negativo; NI-l40l-l -negativo; anilina pura- negativo; formol- ne-gativo; fenal anilina- negativo; guayaco!- negativo. ·

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Fig. 41. Hebeloma sacc/1ariolens SC13. n) hifas sinuosas, septos y ramas, b) citoplasma separado de la pared. e) células globosas grandes. d) hifas filamentosas delgadas, ramificadas y scptndas.

91

Fig. 42. Inocybe grammata SCl 7. a) hifas sinuosas y tortuosas, ramificadas y septadas. b) citoplasma homogéneo. e) célula terminal en punta roma.

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Laccaria amethystina (Hud.) Ck. SC18 MEXU 21025

Características macroscópicas: El micelio inicia su crecimiento a los 5 días en MMN, creció 55 mm en 30 días. Colonia de forma irregular, de color blanco, reverso no cambia; con su­perficie lisa no elevada, micelio largo, laxo, de textura algodonosa, con crecimiento postrado muy extendido.

Características microscópicas: En la zona de avance, en los micelios, aéreo y sumergido se observan hifas filamentosas e hifas catenuladas, úc 2.5-3.4¡1m de diámetro de pared gruesa; abundantes septos y fíbulas de 5.0¡1m de diámetro a éste nivel, algunas hifas con septos muy separados entre sí, muy ramificado con ensanchamientos intercalares; citoplasma granular, en algunas hifas escaso citoplasma y en otras hialino. Presenta gútulas en el citoplasma. Se forman paquetes de hifas paralelas que se entrelazan (Fig. 43).

Pruebas químicas: Escasas gútulas con Sudán lll y Sudán IV.

Melzer- cambia a moreno oscuro a los 30 min. y naranja después de 24 hrs; KOH- cambia a amarillo después de 24 hrs; H2S04- negativo; NH40J-J- negativo; anilina pura- negativo; formol -negativo; fenal anilina- negativo; guayaco!- negativo.

Lactarius chrysorrheus Fr. SC22 MEXU 20744

Características macroscópicas: El micelio inicia su crecimiento a los 17 días en MMN, cre­ció 2.0 mm en 30 dfas. Colonia circular, de color amarillo claro ( 4 A3), el reverso no cambia, superficie lisa, no elevada, de textura húmeda, con crecimiento postrado y margen regular, fimbriado; micelio sumergido más abundante que el postrado.

Características microscópicas: En la zona de avance del micelio sumergido se observan hifas largas rectas de 2.0-3.4µm de diámetro, de pared gruesa; con septos y ramificaciones no abundantes;a nivel del septo se presentan pequeños abultamientos como seudofibulas; algu­nas ramas laterales se espiralizan; citoplasma granular se tiñe de azul !actofenol, otras hifas son hialinas en las que se tiñe sólo alrededor del septo, con abundantes gútulas refringentes en las células hialinas (Fig. 44).

Pruebas qufmicas: Se detectan abundantes gútulas, con Sudán lll y Sudán IV. Melzer- cambia a mon•.no oscuro que después se torna ámbar; KOH- cambia a amarillo te­nue, a los 30 min. y amarillo fuerte después de 24 hrs; H2S04 -negativo; NH40H- negativo; anilina pura- negativo; formol- cambia a naranja rojizo después de 24 hrs; fenal anilina- ne­gativo; guayaco!- negativo.

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Fig. 43. Laccaria amethystinaSC18. a) hifas sinuosas, ramificadas, septadas. b) fíbulas. e) células ensanchadas hialinas. d) paquete de hifas paralelas.

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Fig. 44.Lactariuschrysorrheus SC22. a) hifas sinuosas. b) fíbula en el septo. e) ramificación. -d) citoplasma granular. e) células terminales con punta aguda.

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Lycoperdo11 pcr/atum var. per/atwn Pcrs. SC27 MEXU 21030

Características macroscópicas: El micelio inicia su crecimiento a los 9 días, creció 10 mm en 30 días en MMN. Colonia de forma írr~gular, de color amarillo grisáceo ( 4 B3), no cambia el reverso; con superficie lisa no elevada, micelio corto, laxo, de textura algodonosa, húme­da, con crecimiento postrado, de margen irregular y fimbriado. El micelio sumergido mas abundante que el postrado.

Características microscópicas: En la zona de avance del micelio sumergido, se observan hi· fas tortuosas, catcnuladas, cortas, de 3.0-5.0¡im de diámetro, scptadas y rnmificadas; otras hifas formadas por células vesiculosas, de pared gruesa, septadas, con ramificaciones que se septnn después de la bifurcación; el citoplasma se tiflc en secciones con azul algodón, se presentan en las hifns terminales, células vesiculosas. Hifas tortuosas, sinuosas, de l.7¡1m de diámetro, de pared delgada, scptadas y ramificadas en todas direcciones (Fig. 45).

Pruebas químicas: Se detectan gútulas con Sudún 11! y IV.

Melzer- cambia a morcnCJ-negro a los 30 min, después se torna hiali1J{); KOH- negativo; H2S04- negativo, NH40H- negativo; anilina pura· negativo; formol· negativo; fenal anilina­negativo; guayaco!- negativo.

Lycopcrdon spadicewn Pcrs. SC29 MEXU 20606

Características macroscópicas: El micelio inicia su crecimiento a los 9 días en l\'!MN, creció 15 mm en 30 días. Colonia de forma un tanto circular, de color blanco amarillento ( 4 A2), reverso amarillo claro ( 4 A3), con superficie lisa no elev;ida y de textura húmeda, con creci­miento p()strado y sumergido, de margen irregular fimbríado.

Características microscópicas: Hifas sinuosas de 3.4¡1m de d¡{¡mctro, de pared gruesa, septa­das y ramificadas, con ensanchamiento en la zona de la ramificación, citoplasma vacuolado que se contrasta con verde de malaquita, con inclusiones de grasa en el citoplasma; células vesiculares redondas u ovoides, interhifales y terminales, hifas terminales en punta roma, otras con células ensanchadas de forma irregular, generalmente con septo debajo de la vesí­cula. Hifas delgadas de 2.0µm de diámetro, septadas, ramificadas, sin fíbulas (Fig. 46).

Pruebas químicas: Con Sudán lll y IV se ti6en gútulas.

Melzer· cambia a moreno oscuro después a ocre; KOH- negativo; H2S04- negativo; NH40H- negatívo; anilina pura- negativo; formol- negativo; fenal anilina- negativo; guaya­co!- negativo.

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Lycoperdon per/atum var. per/atum Pers. SC271\IEXU 21030

Características macroscópicas: El micelio inicia su crecimiento a los 9 días, creció JO mm en 30 días en MMN. Colonia de forma irregular, de color amarillo grisáceo (4 83), no cambia el reverso; con superficie lisa no elevada, micelio corto, laxo, de textura algodonosa, húme­da, con crecimiento postrado, de margen irregular y fimbriado. El micelio sumergido mas abundante que el postrado.

Características microscópicas: En la zona de avance del micelio sumergido, se observan hi­fas tortuosas, catenuladas, canas, de 3.0-5.0¡im de diámetro, scptadas y ramificadas; otras hifas formadas por células vesiculosas, de pared gruesa, septadas, con ramificaciones que se scptan después de la bifurcación; el citoplasma se tiñe en secciones con azul algodón, se presentan en las hifas terminales, células vesiculosas. Hifas tortuosas, sinuosas, de l.7¡im de diámetro, de pared delgada, septadas y ramificadas en todas direcciones (Fig. 45).

Pruebas químicas: Se detectan gútulas con Sudán IlI y IV.

Melzer- cambia a moreno-negro a los 30 min, después se torna hialino; KOH- negativo; HzS04- negativo, NH40H- negativo; anilina pura- negativo; formol- negativo; fenal anilina­negativo; guayaco!- negativo.

Lycoperdo11 spadiceum Pers. SC29 MEXU 20606

Características macroscópicas: El micelio inicia su crecimiento a los 9 días en MMN, creció 15 mm en 30 días. Colonia de forma un tanto circular, de color blanco amarillento (4 A2), reverso amarillo claro ( 4 A3), con superficie lisa no elevada y de textura húmeda, con creci­miento postrado y sumergido, de margen irregular fimbriado.

C1racterísticas microscópicas: Hifas sinuosas de 3.4¡1m de diámetro, de pared gruesa, septa­das y ramificadas, con ensanchamiento en la zona de Ja ramificación, citoplasma vacuolado que se contrasta con verde de malaquita, con inclusiones de grasa en el citoplasma; células vesiculares redondas u ovoides, interhifales y terminales, hifas terminales en punta roma, otras con células ensanchadas de forma irregular, generalmente con septo debajo de la vesí­cula. Hifas delgadas de 2.0¡1m de diámetro, septadas, ramificadas, sín fíbulas (Fig. 46).

Pruebas químicas: Con Sudán llI y IV se tiñen gútulas.

Melzer- cambia a moreno oscuro después a ocre; KOH- negativo; H2S04- negativo; NH40H- negativo; anilina pura- negativo; formol- negativo; fenal anilina- negativo; guaya~ col- negativo.

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· Fig. 45. Lycoperdon perlalum var. perlatum SCl.7. a) células globosas. b) ramificación. e) citoplasma granular. d) hifas hialinas. e) hifas delgadas con citoplasma en secciones.

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d

Fig. 46. Lycopcrdon spadiceum SC29. a) hifas sinuosas, ramificaciones y septos. b) citoplasma granular. c) prolongaciones laterales. d) células terminales en punta roma. e) micelio intrincado.

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Rhizopogon isabellimis A. H. Smith SC33 MEXU 21028

Características macroscópicas: El micelio inicia su crecimiento a los 5 días, creció solamente como fino micelio sobre el pedacito resembrado, de color anaranjado gris;íceo (6 B4), hifas largas y escasas.

Características microscópicas: Se distinguen hifas sinuosas, de 3.5,um de diámetro, septadas y ramificadas; en la zona del septo ligeramente constreñidas, con citoplasma granular que se tiñe en secciones con azul algodón, algunas células hialinas, las células tenninalcs en punta roma o ligeramente redondeada (Fig. 47).

Pruebas químicas: No se realizaron por la escasez de micelio.

RJ1izopogon rubescens Tul. SC35 MEXU 21021

Características macroscópicas: El micelio inicia su crecimiento a los 13 días, creció 25 mm en 30 días en MMN. Colonia irregular, inicialmente blanca amarillenta ( 4 A2), que cambia a moreno ( 6 E7), con tonos más claros, amarillo rojizo ( 4 A6) y naranja moreno (7 C7), en el centro se torna moreno oscuro (7 E6), el reverso moreno oscuro (7 E7), superficie lisa, poco elevada, de textura afelpada, con crecimiento postrado, de margen irregular, fimhria­do. Abundante micelio sumergido.

Características microscópicas: En la zona de avance del micelio sumergido se distinguen hi­fas largas, rectas, de 1.7¡•m de diámetro, de pared delgada,con seplos que se tií1cn con azul Jactofenol, con ramificaciones no abundantes; las mayoría de las hifas hialinas, otras con pig­mento amarillo-naranja, con gútulns; hifas terminales con punta redondeada, en algunas de ellas con citoplasma granular. Las hifas se entrelazan paralelamente formando paquetes consistentes (Fig. 48).

Pruebas químicas: Se detectan escasas gútulas con Sudún lll.

Melzer- cambia a negro; KOH- negativo; H2S04- el medio se torna rojizo; NH40I-1- el me­dio cambia a moreno oscuro; anilina pura- medio moreno oscuro; formol- negativo; fenol anilina- medio y micelio moreno oscuro; guayaco!- negativo.

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Fig. 47. Rhizopogon iwbellimis SC33. a) hifas sinuosas. b) citoplasma en secciones. e) ramificación y septos.

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Fig. 48. Rhizopogon mbescens SC35. a) hifns rectas y septos. b) citoplasma granular. c) células terminales en punta roma. d) paquete de hifas entrelazadas.

101

Las técnicas de desinfección de1 cxplante1 que se realizaron en esta investigación, ofre· cen pocas alternativas de éxito debido a que el explante no resiste el proceso. En los aisla­mientos realizados bajo la técnica de desinfección, no hubo crecimiento micelial, aunque el tejido permaneci6 fresco, con su color y turgencia iniciales como en los casos de Gomplrus f!occosus (Schw.) Sing., A manita solitaria (Bull.:Fr.) tvlérat., Amcmita f11/i•a (Schacif.:Pcrs.), Lactari11s nifus (Fr.) Fr. y Lactari11s sal111011icolor Heim et. Leclair. Los explantes se elimina­ron después de 6 meses o antes si el medio de cultivo se deshidrataba.

Con la fina1idud de salvar el explantc que no crecía en los primeros dos meses, se trans­fería a nuevos medios de EMA y MMN. Los resultados fueron negativos para 16 micelios transferidos, a excepción de Clitocybe adora en el que se favoreció su desarrollo micelial, a partir de un sector del explante. Los explantes con el tiempo se deshidrataron y adquirieron un aspecto necrosado, en estos casos se eliminaron.

El aislamiento a partir de carpóforo presenta algunas ventajas, ya que el material que se utiliza para obtener el explante es fresco y la especie se puede identificar, pero también tie­ne algunas desventajas, debido a que las especies difieren en cuanto a la facilidad para ser aisladas, en el tipo de crecimiento que presentan y la sensibilidad al ataque de microorganis­mos (Ammirati, 1979).

En este último caso, los micelios de las especies de Laccaria amethystina, L. bicolor, L. lacea/a y Cantlwre/111s cibbarius (incluso ésta última no se pudo desarrollar en el medio de cultivo) se contaminan con facilidad en el medio de cultivo, debido a que el carpóforo frc· cuentementc es atacado por larvas de insectos que acarrean consigo mohos y bacterias.

El uso de antibióticos no es recomendable, ya que en principio se inhibe el desarrollo de bacterias pero no resuelve el problema de la contaminación por mohos, además puede dis­minuir o detener totalmente el desarrollo del micelio aislado. Palmer (1969) consideró que el uso de antibióticos puede tener más desventajas que ventajas, ya que se requiere de un número grande de combinaciones experimentales para ser probadas con cada micelio aisla­do y además un gran número de diluciones para conocer la concentración adecuada del anti­biótico.

En el presente estudio se utilizó antibiótico solamente en la primera resiembra en caja de Petri, en aquellas especies que con frecuencia se contaminaron. Después se optó por uti­lizar frascos con boca pequeña y tapón de rosca, lo cual dió mejores resultados.

Malina y Palmer (1983) hicieron una relación de las especies que más fácilmente se han aislado, entre otras citan a Suil/11s y Rhizopogon, además, las especies del géneroAmanita se han aislado con más facilidad que las del género Amanitopsis. Otros géneros como Russu/a, Astre11s, Bo/et11s, Corti11ari11s, Fuscoboleti111is, Hebeloma, Hymenogmter, Hystcrangi11m, Lacca­ria, Lactarias, Lccci111m1, Melanogmter, Paxil/11s, Pisolitlu<f, Rhizopogon, Sclerodenna, S11il/us y Tric/w/oma se han aislado con frecuencia de carpóforos frescos. Los aislamientos logrados

102

en el presente estudio coinciden con algunas de los génerns antes sc1ialados, como Hcbelo­ma, Laccaria, Pisolitlws, Rhiwpogo11 y Suil/us.

El poco éxito para aislar macromicctos micorrizógenos se debe principalmente al desco­nocimiento de los nutrimentos que requieren y que son producidos por el simbionte con quien establece la asociación. De hecho no se ha logrado la germinación de esporus con fa­cilidad debido a que la raíz produce ciertas sustancias químicas, a través de exudados, que favorecen el proceso (Fries, 1983). El micelio primario, que se pudo obtener a partir de es­poras, fue el de Jnocybe bresado/ae en EMA líquido, pero realmente se desconoce la causa principal que determinó la germinación de las esporas. Estos resultados ofrecen alternativas de investigación a realizarse en un futuro próximo.

Las fórmulas scmisintéticas que actualmente se usan con m6s frecuencia para la propa­gación del inóculo, la conservación de micelio en placa de agar, para las fructificaciones y para otros métodos experimentales son los medíos de cultivo principalmente el propuesto por Melin-Norkrans, modificado por Marx y el medio de Hagem modificado por Modcss, los cuales contienen el nitrógeno y carbono necesarios para el desarrollo mícelial, con algu­nas vitaminas o la mezcla de ellas y sales minerales (Malina y Palmcr, 1983).

Nuestros resultados indican que los micelios que crecen bien en los diferentes medios de cultivo, corresponden principalmente a los Tricholomataceos como Laccaria a111et/1ysti11a, L. laccata, L bicolor, a los Cortinariaceos: como Hebeloma sacchwiolens, Inocybe bresado/ae, f. geophylla var. Jilacina e !. grammata; y algunas especies de Lycoperdon: Lycopcrdon ca11di­d111n, L. per/atu1111>ar. per/atwn y L. umbri1111111.

Los resultados de Ja Tabla 3 muestran que la especie que creció de manera muy impor· tante en todos los medios de cultivo V8, PDA, EMA y MMN, ct1briendo la placa de agar en menos de 30 días fue Laccaria amethystina. También Hebeloma sacchario/ens creció en to· dos los medios de cultivo con crecimiento importante de 60 y 89 mm de dhímetro en JO días, al igual que Laccaria /accata, solo que ésta creció en tres medios distintos. Se observa tam· bién que algunas especies crecieron lentamente en todos los medíos de cultivo, como Amo­nita nibescens y Clítocybe adora; Mras mús no crecen en varios medios o como Amanita mus­caria var. flavivo/vata, A. pantherina y Collybia aff. macu/ata que crecieron en un solo medio. Es necesario señalar que el medio de cultivo no es el selectivo para el crecimiento de este ti­po de hongos, ya que en muchos de los casos en donde no hubo crecimiento micelial se de­bió probablemente más a la presencia de contaminantes y a la capacidad genética del mice­lio que le permitió continuar con su crecimiento en las resiembras, que al tipo de medio de cultivo en donde se desarrolla.

De acuerdo a los resultados obtenidos, en relación al desarrollo micelial en los diferen­tes medios nutritivos, se puede considerar que no existe un medio óptimo para el desarrollo de las especies en general, ya que para algunas es más favorable el V8 agar como en los ca­sos de las especies de Amanita y de S11il/11s, o el PDA para las especies de lnocybe o MMN paraAmanita gemmata. Los resultados coinciden con los obtenidos por Marx et al. (1982) y

103

TABLA 3. TASA DE CRECIMIENTO DE LOS MICELIOS AISLADOS EN DIFERENTES l\IEDIOS DE CULTIVO

ESPECIE MEDIO DE CULTIVO l'RESERVAIJO

MMN EMA PDA VS MMN

Ama11ila gcmmata + A111a11ila gcmmma + Amonita muscaria var.jlm•i\'ol~·ata +- o Ama11ita muscaria var.jlal'ii•ofrata o Amonita pa111hcri11a Ama11ita pamltcri11a o Amonita mbesccns Amanita n1bcscens +- +- + +-Amm1ita mbcsccns o o Clitocybc odora +- +- +- +- o Co/lybia aff. maculara o llebcloma sacdiariolms ++ ++ ++ ++ +-Hygrophon1s ms!llla /11ocybc brcsadolae ++ +- ++ lnocybe geophylla var. li/acina ++ ++ lnocybe grammato ++ ++ + Laccaria amethystca Laccaria bicolor ++ laccaria laccota + + Laccaria lacctJta ++ ++ ++ Laclarius c/11ysorrheus Lycoperdo11 candidum Lycoprm/011 ctllfisii o +-Lycopcrdon ericetomm Lycopcrd011 per/atum ''ª'· per/0111111 + + + +-Lycoperdo11 pusillum +- +- +-Lycoperdo11 spadiccum +- +-Lycoperdo11 wnbrimm1 ++ ++ ++ Pisofitl111s tinctorius + + + Pisolitlms ti11ctorius +- +- +-Rl1izopogo11 isabel/i1111s +- +- +- + Rl1izopogo11 lutco/us + R/1izopogon mbescens + + + Suillus granulahts +- +-Suil111s gra11u/atus +- +- +-Suillus gram1/atus Sui//us luteus + ++ Sui/lus punclatru + + Sui//us tomemosus +-

Símbolos: Indican el diámetro de Ja colonia a los 30 días de crecimienlo.

• 90 mm, + + 60-89 mm, + 30-59 mm, + -10-29 mm, - 9-Smm 0 4-1 mm

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Pantidou et al. (1983), en cuanto a que la mayoría de las especies aisladas crecen bien en PDA y MMN, podríamos agregar que el medio de EMA resulta muy favorable para todas las especies aisladas en este trabajo. Debido a que el medio de MMN es un medio rico en sales minerales, vitaminas y azúcares, éste resulta ideal para el crecimiento no solo del mi­celio de los basidiomicetos, sino de los mohos y bacterias, por lo que los aislamientos en es­te medio se contaminaron con más focilitlnd. Por el contrario la propagación de los micelios aislados resultó más exitosa en E!V!A y PDA, este hecho se debió a que estos medios son de­ficientes en vitaminas y minerales.

Pantidou et al. (1983) han manifestado la dificultad para obtener cultivos de micelios de Basidiomycetes, ya que algunas especies no crecen en los medios de cultivo utilizados en el laboratorio o porque crecen muy lentamente, o bien requieren de medios específicos hasta ahora no conocidos, o incluso porque el tejido frecuentemente está contaminado con bacte­rias o levaduras las cuales impiden obtener cultivos puros.

Los contaminantes como bacterias y mohos se reconocieron con facilidad principalmen­te por el aspecto de las colonias, el crecimiento micelial del moho y por la presencia de co­nidios. En algunos casos los contaminantes permanecieron entre el tejido del explante y el medio de cultivo, desarrollándose rápidamente e impidiendo que el micelio del hongo ecto­micorriz6geno empezara a crecer, como en las especies de Boletm edulis Schaef.:Fr., Cli­tocybe gibba (Pcrs.:Fr.) Kum., Gautieria c/zilemis Zeller et Dodge, /Jelvella crispa Fr.:Scop., Hydnwn repandum L:Fr., lfygroplzo111s c/1rysodo11 (Batch.:Fr.) Fr., Inocybe dulcamara Fr.:Alb et Sch., Laccaria proxima (Boudier) Patouillard, Psathyrel/a spadicea (Schaeff.:Fr.) Sing., R11Ss11la delica Fr., Telephora terrestris Ehrl.:Fr. y Xerocom11s c/1ryserztero11 Bull.

En el tejido del explante de Amanita aspera var. franclzetii Boud. y J11ocybe1 fastigiata (Schaeff.:Fr.) Qué!. se desarrolló Mycogone sp., en todas sus repeticiones. Otros hongos ais­lados fueron muy susceptibles al ataque de Penicillium sp. y Monilia sitoplzila (Mont.) Sacc., como Suill11s llllellS, Rlzizopogon luteol11s, R. mbescem, Amanita gemmata y A. 1111L1caria var. flavivolvata. Otros resultaron menos sensibles como lnoeybe grammala, J. bresadolae e J. geoplzylla var. lilacina. Sin embargo, algunas especies de Lacearía frecuentemente están aso­ciadas con bacterias desde su aislamiento, las cuales se eliminaron por medio de resiembras sucesivas del micelio.

Para los aislamientos se tomaron como base las recomendaciones de Ammirati (1979), en cuanto a que el aislamiento debe realizarse inmediatamente después de la recolección, de preferencia en el campo, en individuos jóvenes y en buen estado para reducir posible la contaminación.

Taylor y Alexandcr (1989) han señalado que dentro de una misma familia existen géne­ros más dificiles de obtener en cultivo puro como el de R11ss11la, pocas especies se han logra­do en cultivo puro y solamente se ha ensayado en la síntesis in vitro de la micorriza como lo han hecho otros investigadores con el género Lactarius.

105

En l!sta investigación .se logrtl un mayor número de nblamicntos en Agaricales que l!Il

Gnstcrornycctos, esto se debió mús a Ja ahunc.Jancia de Jos primeros, que u Ja facifü.lad e.Je su crecimiento en culti\'o. Las especies de Rlziwpogo11 y Lycoperd011 crecieron f;ícilmcntc en medio de cultivo dchido a que el expbnte se obtiene de un carpóforo ccrrndo con :ihundan· te contexto, pero algunos como RJzi:opagon son difícilt.!:-; de recolectar ya que s~ encuentran enterrados y son escasos.

La caracterización de Jos cultivos de micelios es importante debido a que proporciona un buen número de caracteres distintivos de las especies, tanto m;1croscúpicos como hifales, nsí como fisiológicos, determinados éstos por la respuesta que tienen a Jos diferentes reacti­vos, datos que pueden ser utilizados en algunos casos para definir la posición taxonómica o simplemente la caractcrizaciún de una especie. En este ültimo caso se torna primordial eJ conocimiento de los caracteres de Jos micelios cuando los cultivos puros son almacenados y cuyas características micelialcs pueden modificarse temporalmente o incluso llegar a mutar. Esta información fncilita Ja selección adecuada de Jos micelios con los que se pretende tra· bajar durante tiempo prolongado. De otra forma. el investigador se expone al trabajar con cultivos que tienen caracteres no esperados.

En Ja mayoría de las investigaciones en donde se utilizan micelios de hongos ectomico­rrizógcnos, como las de cultivo i11 vitro de Ja micorriza, o en Jos estudios sobre la captación de los diferentes nutrimentos del suelo, o incluso en estudios genéticos, los micelios provie­nen de colecciones que en general no han sido caracterizadas y que simplemente las han conservado y mantenido bajo ciertas técnicas de preservación (Smith, 1990 comunicación personal). Razón por la cual se recomienda revitalizar los cultivos en medios nuevos de l\·IMN y comparar sus características con las descripciones anteriores para después decidir si realmente es el idóneo para el tipo de experimento que se desea desarrollar.

Con relación a Ja confirmación del micelio aislado, Malina y Palrner (1983) establecen que es necesario realizar 10-12 aislamientos a partir de un carpóforo, ya que si se desarrolla el micelio en todos Jos tubos, y además, presentan las mismas características en cada uno se induce que pertenece al contexto del hongo deseado. En algunos casos crecen dos o más mi· celias diferentes a partir del carpóforo, por Jo que resulta dificil decidir cual de ellos corres· pande al hongo basidiomiceto.

En la presente investigación, en algunas especies como las de Lacearía no fue posible obtener el número de aislamientos propuestos por Palrner, debido a su escaso contexto y a que frecuentemente están parasitadas, como en el caso de Suillus y Amanita. Aunque las es­pecies de un mismo género presentan diferencias particulares en sus caracteres micclialcs, en general son muy similares, por lo que se pueden reunir en un mismo grupo, por ejemplo: el aspecto correoso de Ja colonia en las especies de Rlzizopogo11, el micelio aéreo y algodo· naso de las de Laccaria o el micelio corto y húmedo de las de Lycopcrdon. Tales caracteres, entre otros, permitieron la confirmación de los micelios aislados.

106

Dado que las características macroscópicas del micelio de los hasidinmicctos difieren en lo general de los micromicetos en cuanto al tipo de micelio que se desarrolla a partir del cx­plante, la velocidad de crecimiento y la formación de estructuras anamórficas, fue rclativ;1-mente sencillo determinar la presencia de cont:tminantes en el medio de cultivo.

L1 confirmación también se hizo con base en las referencias hihliogrúlic;ts sobre cultivos puros que han 11echo otros investigadores, aunque realmente existe poca información al res­pecto.

La presencia de estructuras microscópicas características de los basidioniicetes, tales co~ mo, fibulas (poco frecuente en los micelios en cultivo obtenidos), septos en las hifas, así co­mo el diámetro y grosor de la pared (muy variables en estos hongos), ayudaron a conlirnrnr el micelio aislado, caracteres propuestos por Singer (1986) y considerados por Avila (1988) en la caracterización de algunas especies de Amanita. Z<tk ( I9ó9 y 1971) explica que la sín­tesis de la micorriza en cultivo puro daría una clara evidencia del aislamiento del hongo cc­tomicorrizógeno. Aun más, los aislamientos a partir del micelio cctomicorrícico de la raíz podrían compararse con los micelios en cultivo puro logrados a partir del carpóforo.

Los aislamientos de una misma especie logrados en localidades y época distintas corres­pondieron a: Amanita gemmata, A. muscaria var. flavivolvata, A. pa11tlzeri11a, A. mbescens, Laccaria laccata, y Pisolitlws ti11ctorius, en los cuales se encontraron diferencias en los carac­teres tanto macroscópicos como en los microscópicos. Este tipo de resultados coinciden con los de Zak (J 969) y aunque no permiten la confirmación por esta vía, tampoco pueden ser rechazados debido a las características de basidiomicetc que presentan.

Las especies de Lycoperdon de las diferentes localidades crecieron en EMA, MMN, PDA y VS, iniciaron su crecimiento a los 2 días de aislados aunque con desarrollo micclial lento. La observación del micelio al microscopio óptico reveló la presencia ele scptos delga­dos, poco frecuentes en algunas especies y no se observaron ffimlas en todos los casos, he­cho que pondría en duda si realmente el micelio corresponde al basidiomicete aislado. Sin embargo se consideran confümadas debido a que el micelio se desarrolló sobre el cxplante en cada una de las repeticiones, coincidieron los caracteres macroscópicos y no hubo conta­minación en ninguno de los cultivos.

Las características miceliales macroscópicas y microscópicas más frecuentes en los culti­vos aislados en esta investigación, se resumen en Ia Tabla 4 para facilitar su an{1Jisis.

A continuación se presenta la descripción general de los caracteres obtenidos en las di­ferentes especies aisladas en cultivo puro:

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Tubln4. CARAt'TERfSTICAS MICELIAI.ES MACl!OSCÓPICAS Y MICROSCÓPICAS UE LOS CULTIVOS PUROS

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Los caractcrc.~ indicados con letras son:

A Inicia crccimicnlo 2a S dfas K Vcsfcutas ln1crcalarcs (x), 1erminales (x-) o ambas (x•) 11 Inicia crccimicn1ocnuc 6 a 9 dlas L Presencia de fibulas (x), scudo!lbulas (x-) e lniciacrccimientocntrc tOa 20dfas M Conexiones inlerhiralcs ll Inicia crecimiento cn1rc 21a3Ddfas N Paquetes hifalcs E Crecimiento de 50a 90mm en 3Ucllas ll Cordoncsmicclíales F Ollonla pigmentada p presencia de gútulas G Tiiic el medio (x), tiñe el reverso (x-) o ambas (x•) Q Producción de exudado JI Hifas gruesas y delgadas ll Producción tic material cristalino 1 Citoplasma granular s E.~truc1urasan:1mOrfü:as

J lnclusioncscitoplásmic¡¡s refringentes 1' Con crecimiento en las resiembras

Características macroscópicas de la colonia

Tiempo de inicio del crecimiento micelial: La mayoría de los hongos aislados inician su cre­cimiento como un fino micelio corto sobre el explnnte, pero el tiempo que tardan en iniciar su desarrollo es variable para cada especie aislada. Existe similitud en cuanto al tiempo que requieren las especies de una determinada familia para iniciar su crecimiento, por ejemplo: las especies de Lycoperdon y de Laccaria iniciaron su crecimiento entre 3-5 días, las de Rhi­zopogo11de4-5 días y las deAmanita entre 4-7 días. Otras especies requirieron de más tiem­po, como Lactarius c/11yso1The11s e Hygroplwms ntssula, que tardaron 14 y 20 días respectiva­mente. Las especies que crecieron en medio líquido, tardaron más tiempo que en medio sólido en Inocybe bresado/ae 7 días y Pisolit/111s ti11ctori11s 30 días, y en medio sólido, 4 y 5 días, respectivamente.

Tasa de crecimiento: L~ mayoría de los micelios aislados presentó un crecimiento lento, por lo que el diámetro de la colonia en 30 días fue pequeño. Las especies que lograron un crecimiento de 90 mm en menos de 10 días fueron las de fiebeloma sacchario/ens, fnocybe bresado/ae, J. geop/Jylla var. li/acina y Laccaria ametlrystina. !11ocybe grammata, Lycoperdon candidum y L. ericetorum lograron cubrir la placa de agar en 30 días. Estas especies son muy vigorosas ya que permanecen durante las resiembrns, a diferencia de aquellas que crecen muy lentamente logrando menos de 40 mm de diámetro y que generalmente pierden vigor durante las resiembras, por ejemplo: A manita muscaria var. flavivolvata, A. pa11tlrerina, A. rubescem, Clitocybe adora, Collybia af[ macu/ata, J-Jygrop/wnis russ11/a, Lactarim clrryso­rrheus, Lycoperdon curtiw'i, L. pusillum, L. spadiceum, Rlrizopogon isabelli1111s, R. luteolus y Sui//us punctallts.

Pigmentación: 18 de las especies en cultivo puro presentan colonia pigmentada, siendo ésta muy aparente en Iiebeloma sacclrario/ens y Laccaria ametlrystina, así como en las espe­cies de Rlrizopogon, Piso/itlrus y Suillus. Las especies de Lycoperdon son color blanco amari­llento y las de Clitocybe adora, Jnocybe bresado/ae y Lactarim c/Jryso1Tlreus son de color ama­rillo. Es notorio el cambio en la intensidad del color en Jos cultivos de 6-12 meses, principalmente en las especies de Laccaria y Suillus.

Reverso: La mayoría de las especies aisladas en cultivo tiñeron el medio y/o el reverso del cultivo. Fue más frecuente que tiñan el reverso, que ambos. Algunas formaron un aro oscuro alrededor del micelio. Las especies de Rlrizopogon y Suil/us tiñeron intensamente el medio.

Forma: La forma fue muy variable en las diferentes especies, pocos cultivos son circula­res. La forma puede cambiar de un medio a otro en una misma especie.

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Superficie: La mayoría de las especies presentó una superficie irregular, en otras fue. lisa, pero varía ésta de acuerdo al medio de cultivo en que se desarrolla. L1 elevación de la colo­nia fue en general irregular y plana, en pocos casos convexa.

Textura: L1 mayoría de las especies desarrolló en un principio, un micelio aterciopelado que cambia a otro tipo con el tiempo, en las especies de I11ocybc llega a ser algodonoso,!ano­so, grumoso y muy fragmentable; en las de Lacearía cambia a algodonoso, plumoso; en las de Lycoperdo11 se torna algodonoso, rugoso de aspecto húmedo, en las de Rhizopogon se tor­na afelpado, como el ante y correoso, y en las de S11il/11s cambia a algodonoso. Las resiem­bras en diferentes medios, produce cambios tanto en la textura como en el aspecto de la co­lonia de una misma especie. El aspecto en la mayoría de las especies es seco, sólo en las de Lycoperdon adquieren un aspecto húmedo.

B.11dado: Las especies que produjeron abundante exudado sobre el micelio fueron m1i­zopogo11 isabel/i1111s, R. luteo/us, R. nibesce11s, y Sui/lus p1111ctatus. En otras fue escaso como en Lycoperdon 11111brín11m, PLwlithus tinctoríus, Suil/us gra1111/atus y S. tomcntosus.

Crecimiento sobre la placa de agar: L1 mayoría de las especies aisladas iniciaron su cre­cimiento de tipo postrado sobre la placa de agar. A partir de este micelio tiende a formarse el micelio aéreo característico de cada especie. En general se forma micelio sumergido aun­que en proporción diferente en cada una. Clitocybe adora y Lactaríus c/uysorrheus formaron abundante micelio sumergido.

Margen: En las especies estudiadas se presenta margen irregular fimbriado, sólo en las especies de Lycoperdon el margen se pierde en el medio por lo que resulta muy dificil su ca­racterización.

Cordones miceliales: Estos fueron característicos en Lycopcrdon per/atum var. per/a/11111 y en L. umbrín11m, únicas especie; que los desarrollaron en cultivo.

Apariencia: En los cultivos de 6-12 meses se tiende a comprimir el micelio y a adquirir un aspecto húmedo y correoso.

Características microscópicus del micelio

Diámetro de las hifas: En la mayoría de las especies aisladas, se distinguieron dos tipos de hifas, las delgadas de 1.7-2.5¡rn1 de diámetro y las gruesas de 3.5-7.0¡Lm de diámetro.

Forma de las hifas: La mayoría de los micelios aislados presentaron hifas sinuosas, va­riando la forma de las células hifales desde tortuosas como en Lycoperc/011 spadicc11111 (Fig. 26 c), hifas globosas como en A. mbcscens (Fig. 6 e) y Lacearía amethJ:>tina (Fig. 16 b); con ensanchamientos interhifales como Amanita gemmata (Fig. 1 c), Clitocybc adora (Fig. 9 h),

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Col/ybia aff. 111ac11/ata (Fig. 10 c), /11ocybe gra111111at<1 (Fig. 15 b) y Lycoperdvn wnbri1111111 (Fig. 27 e).; hifas varicosas como Hebcloma sacchario/enr (Fig. 11 a) e fnocybc grammata (Fig. 15 f); vesiculares como en Collybia aff. maculata (Fig. 10 d); e hifas catenuladas como en A manita muscaria var. flavivolvata (Fig. 3 e y Fig. 4 b) y A. mbcscens SC07 (Fig. 6 b ). Al­gunas especies presentan !tifas poco iinuosas o rectas como Amonita gcmmata (Fig. 1 a),A. pantherina SCOG (Fig. 4 e), Clitocybe odora (Fig. 9 d), Pimlithus tinctorius SC31 (Fig. 28 a), Rhizopogon mbescens (Fig. 32 a), R. luteol1Lr (Fig. 30 a) y Suil/us granulat1Lr SC37 (Fig. 34 a); otras especies forman !tifas rectas como Lactarius ch0wrrhcm (Fig. 20 a), S11il/11s gra1111/at11s SC36 (Fig. 34 a) y S. p1111ctatus SC38 (Fig. 35 a).

Pared de las hifas: La pared gruesa es característica en las hifas de los micelios estudia­dos, sólo en algunos casos se observaron hifas can pared delgada, como en: lnocybe brcsado­lae (micelio primario) (Fig. 13 11), en las especies de R11izopogon (hifas delgadas) (Figs.30, 31 y 32) y en SuilltLr granulatus SC3G la pared no es muy gruesa (Fig. 33). En todos los casos se pudieron distinguir estas características con tinciones de azul algodón y lactofenol, safranina y verde de malaquita, lográndose contrastar Ja pared e incluso, en algunos casos se pudo ob­servar la refringencia de ésta.

Septos: La ausencia o falsa presencia del septo generalmente indica que las hifas corres­ponden a un hongo de los Phycomycetes. El septo de los Ascomycetes está formado por un poro simple, en los basidiomicctos se presenta el septo doliporo encerrado en una estructu­ra hemisférica o parentesoma. Avila (1988) observó el septo doliporo a través de microsco­pía electrónica en el micelio de cultivos puros de hongos ectomicorrizógenos, y Debaud, et. al. (1981) en el manto y red de Hartig de Ja ectomicorriza, En todos Jos micelios aislados en este trabajo, el septo estuvo presente, aunque no se observó con microscopio electrónico, las tincioncs utili7.adas favorecieron su obsevación. En algunos micelios el septo se tiiie in­tensamente con azul algodón como enAma11i1a gemmata SC02 (Fig. 2 n), en otros permane­ce hialino como en !11ocybc grammata (Fig. 15 a), puede ser refringente como en Hebeloma sacchariolcns (Fig. 11 e), grueso como en Lycoperdo11 per/atum var. perlatum (Fig. 24 a) o delgado como en R/1izopogon isabellinus (Fig. 30 d), abundante como en Ama11ita mbesce11s SC09 (Fig. 8 b) o escaso como en Rhizopogo11 /u/eo!tLr (Fig. 31 b), cercano o alejado entre si a lo largo de la hifa como en RJ1izopogo11 mbescens SC09 (Fig. 8 b) y Pisolithus tinctori1Lr (Fig. 28 c) respectivamente y, además estar relacionado con Ja bifurcación de las ramas co­mo en Amonita mtLrcaria var.f/avivolvata (Fig. 3 c),A. rubescens (Fig. 8 e), lnocybe gramma­ta (Fig. 15 f) y Lacearía amethystina (Fig. 16 a) y las fíbulas como en Lacearía amethysti11a (Fig. 16 a), Lactarius chrysorrheus (Fig. 20 d) y Pisolithus ti11ctorius (Fig. 28 b).

Ramificaciones: Presentes en todos los micelios aislados, la diferencia entre ellos radica fundamentalmente en Ja frecuencia de ramificaciones, en el nivel donde se inicia, ya sea en el septo o después de él y el número de ramas que se forman a partir de la hifa principal. La persistencia de estas características son útiles en Ja descripción de los cultivos (Agerer, 1990 comunicación personal). En l'isolit/u¿r tinctorius (Fig. 28 e), Sui111Lr p1111ctatus (Fig. 37 a) y S. tome11tos1Lr (Fig. 38 b) se forman hasta tres ramas a partir de la hifa principal. La variedad

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de formas y tipos de como se origina la ramificaci6n en cada una de las especies estudiadas, sería motivo de una investigación especial.

Fíbulas: Aunque poco frecuentes en los micelios aislados, la presencia de éstas confirma que se trata de un basidiomicete. Las fíbulas tienen un valor diagnóstico adicional para el estudio de este grupo, en cuanto a la forma, tamaño y frecuencia sobre la hifa (Agerer, 1990 comunicación personal). Las especies que presentaron escasas fíbulas como abultamientos a nivel del septo fueron: A111a11ita 11111scaria var.flavivolvata SC03 (Fig. 3 a), Lactari11s c/11yso­rrhem (Fig. 20 d), S11ill1ls gra1111/at11s SC37 (Fig. 35 g) y S. /11tcus (Fig. 371). Los micelios con­firmados por la presencia de fíbulas bien estructuradas y en abundancia, fueron: C/itocybe adora (Fig. 9 a,b,c,d,e), liygropltonts russ11/a (Fig. 12 c), Laccaria amcthystina (Fig. 16 a,b,c,d), Laccaria bicolor (Fig. 17 a), L. /accata (Fig. 18 e), Pisolitlms ti11ctori11s (Fig. 29 a,b,d), (Fig. 30 a-e) y Suillm p1111ctat11s (Fig. 38 c,e). En algunos casos se observaron prolon­gaciones parietales que podrían ser conexiones en grapa en proceso de formación como en Amonita m11scaria var. flavivolvata SC03 (Fig. 3 a), SC04 (Fig. 4 a), Collybia aff. mac11/ata (Fig. 10 a), Inocybc geopltylla var. /ilacina (Fig. 14 i), Lycopcrdon cdcctor11m (Fig. 24 b), L. pcrlatum var. pcrlatwn (Fig. 25 d) y Rltizopogon nibcsccns (Fig. 33 e). Avila (1988) observó scudofíbulas en A. mmcaria.

Vesículas: La mayoría de las especies presentan vesículas, en algunas ele ellas son termi­nales como en Amanita m11scaria var. flavivoll'ata (Fig. 3 !), Lactarius chrysorrlteus (Fig. 20 e) y Collybia aff.maculata (Fig. 10 el), en otras intercalares y otras tern1inales como Laccaria laccata (Fig. 18 !) y Lycopcrdo11 umbrinum (Fig. 27 e). L~ forma y tamaño de las vesículas varían mucho en las especies aisladas, hecho observado por Avila (1988) en A111a11ita gcm­mata f. gracilis, A. muscaria y A. mbcsccns.

Forma de las hifas terminales: Esta característica es muy variable, incluso para las dife­rentes !Jifas de un mismo micelio. Se presentan en general hifas terminales en punta, lo cual coincide con Pantidou (1967) y Avila (1988). En este estudio se detalla la forma particular de la terminación, encontrándose !Jifas en punta aguda como en Clitocybe adora (Fig. 9 e), roma cnA111a11itapa11theri11a (Fig. 5 d) y Suillus lutcus (Fig. 36 e), redondeada en Hygropho­nlf nissula (Fig. 12 c), bulbosa en lnocybc bresadolac (Fig. 13 d), en clava como en Lycoper­don spadice11111 (Fig. 26 d), globosa de forma esférica en Inocybc grammata (Fig. 15 e), alan­toide (Fig. 13 i) o irregular en Lycopcrdon p11S11lum (Fig. 25 d).

Conexiones interhifales: las conexiones interhifales y la anastomosis entre las hifas al pa­recer son caracteres que se distinguen en algunas especies. En los micelios aislados sola­mente se presentaron en Clitocybe adora (Fig. 9 !), fllocybe grammata (Fig. 15 g), Lycoper­don spadlcc11111 (Fig. 26 b) y en Lycopcrdon umbri1111111 (Fig. 27 d).

Citoplasma: Se distinguen dos tipos de citoplasma, homogéneo como en Lycopcrdon spadiceum (Fig. 26 a) y granular en fttocybe gcophylla var. li/aci11a (Fig. 14 d), en algunas es­pecies el citoplasma se encuentra en ciertos sectores de la hifa como en Lycopcrdo11 pusi­l/um (Fig. 26 d), en otras se distribuye en secciones a la largo de la misma como en /nocybe grammata (Fig. 15a), o no se continua en la zona del septo observado también en I11ocybe grammata (Fig. 15 a). El citoplasma se tiñe con azul algodón y se contrasta con verde de ma-

112

laquita y snfranina. Se observan también inclusiones citopl:ísmicus que en algunas especies son refringentes como Lycopcrdo11 curtisii (Fig. 23 d). Estos resultados coinciden con las ob­servaciones de Watling (1981) y Mi!ler, el a/. ( 1983).

Pigmentos: La presencia de pigmentos en el citoplasma corresponde a los cultivos muy pigmentados, tales comn: Hebcloma sacclwriolcm (Fig. 11 c ), Pisoli1l111s ti11ctori11s (Fig. 28 d), Rhiwpogo11 Lmbe/li1111s (Fig. 37 d), R. luteolus (Fig. 31 b), R. rubesce11s (Fig. 32 e), Sui//us gra1111lat11s (Fig. 34 e), S. lutem (Fig. 36 b), S. p1111ctat11s (Fig. 37 d) y S. 1ome11tos11s (Fig. 38 b). En Piwlil/ws ti11ctori11s se distinguen agregados de pigmento, a manera de drusas, fuera de lns hifas, los cuah!s se disolvieron con sales y ácidos como anteriormente se describió.

Ke!lcr y Ammirati (1983) han dado importancia evolutiva a los pigmentos y con ello han podido definir la posición taxonómica de algunos géneros, entre otros el de Dennocybe. Consideran mas evolucionadas a las especies que presentan pigmentos muy oxidados como la dermocybina que aquellos que presentan menor grado de oxidación como la endocrocina y muy primitiv()s a los que presentan pigmentos con bajo grado de oxidación como la favo­manina. Las especies aisladas en esta investigación podrían ser estudiadas desde un punto de vista evolutivo si se tuviera mayor número lit! especies de un mismo género, pero no se descarta la posibilidad de lograrlo en investigaciones futuras.

Brandud, et al. (1990)dividieron la topografia de los pigmentos en el género Cortinarius en 6 tipos: pigmentos extracelulares ( granulares y cristalinos), pigmentos de la epimembra­na (granulares y cristalinos); pigmentos cxtracclulares (plasmáticos o granulares); pigmen­tos intracelulares (vacuo lar); pigmentos de la pared gruesa de la membrana y pigmentos in­crustados. Con base en esta división los micelios aislados en este trabajo quedarían en los siguientes grupos: con pigmentos intracelulares granulares, A. muscaria var. flavivolvata (Fig. 4 c),A. nibescens (Figs.6 b, 7 e y 8 b), Cliwcybe odora (Fig. 9 h), l. geophy/111 var. li/acina (Fig. 14 d, j), l. gra111ma1a (Fig. 15 e), Laccaria /accata (Figs.l 8 a y 19 e), Lycopordon curtisii Fig. 22 b), L. ericetonm1 (Fig. 23 e), L. per/alllm var. perlat11111 (Fig. 24 d), L. pusi/lum (Fig. 25 d), L.umbrinum (Fig. 27), Pisolitlws 1i11ctori11s (Figs.28 d y 29), Rhizopogon isabellinus (Fig. 30 a), Suillus granulatus SC37 (Fig. 34 e), S. luteus (Fig. 36 y e), S. punctatus (Fig. 37 by d) y S. tome11tos11s (Fig. 38 a y b). En los micelios preservados se observó enA. nibescem (Fig. 39 a), C. adora (Fig. 40 e), Lactarim chrysorrheus (Fig. 44 e),/,. per/alwn var. per/atum (Fig. 45 b), L. spadice11111 (Fig. 46 b), R/1izopogo11 isabellimL5 (Fig. 47 a) y R. rubescens (Fig. 48 b).

Las especies que presentaron pigmentos intracelulares de tipo plasmático fueron: Lac­caria a111etliysti11a (Fig. 16 a), L. bicolor (Fig. 15 e), S11i/111s granulatus SC36 (Fig. 33e), S. gra-1111/atus SC38 (Fig. 35 e). En los micelios pmervados Inocybe grammata (Fig. 42 a) y L. ametliystina (Fig. 43 d) presentaron este tipo de pigmentación. L~s especies con pigmento intracelular de tipo vacuolar fueron: A. nibescem (Fig. 7 e y 8 b), Hebeloma saccliariole11s (Fig. 11 e), l. bresadolae (Fig. 13 b), L. pusillum (Fig. 25 a), L. spadicewn (Fig. 26 e), R. lu­teolus (Fig. 31 b), R. rubescens (Fig. 32 e), S. gra1111/atm SC37 (Fig. 34 e). En los micelios pre­servados A. 111besce11s (Fig. 39 b) y /f. saccliariolens (Fig. 41 e).

113

Pisolith11s tinctorius presentó abundante pigmento extracdular de tipo cristalino formado por agregados en forma esférica y en W1b.opogo11 lweolm se observó pigmento epimembra­noso granular (Fig. 31 d).

Grasas: Algunos de los micelios aislados presentan abundantes gútulas, las cuales varían de diámetro aun en las hifas de una misma especie, tal fue el caso de las especies de Lyco­perdon, L. curtisii (Fig. 22), L. ca11did11m (Fig. 21), L. per/atwn var. perlatum (Fig. 24), L. p11-sillum (Fig. 25), L. spadiceum (Fig. 26) y L. 11mbrin11m (Fig. 27).

Cristales: La presencia de cristales cxtrahifales, no es una característica frecuente en las especies estudiadas, pero se distinguen en Clitocybe adora (Fig. 9 i), Laceada laccata (Fig. 19 f), Rhizopogon isabel/im1s (Fig. 30 h), R luteo/11.< (Fig. 31 h) y R. mbescens (Fig. 32 f), for­mados en todos los medios en donde se desarrolló el micelio de cada especie. Anteriormen­te estas estructuras ya habían sido observadas por Pantidou et al. ( 1983), quienes describie­ron también Ja forma romboide observadas en nuestros aislamientos.

Cordones mice!iales: Los agregados de hifas en forma paralela es poco común, en algu­nas especies las !tifas se reunen formando paquetes hifa!cs poco consistentes que durante la manipulación, en el momento de elaboración de preparaciones, tienden a separarse con fa­cilidad, otros permanecen fuertemente unidos como en Inocybe geopliylla var. li!acina (Fig. 14 j), Laccaria /accata (Fig. 18 b), Lycoperdon perlatum var. per/atum (Fig. 24 c), Rhizopogon /11teo/us (Fig. 31 f) y Rhizopogon mbescens (Fig. 32 d).

Estructuras anamórficas: Pantidou et al., 1983 han encontrado tanto estructuras anamór­ficas como te!emórficas en especies de Agaricales, estudiadas en cultivo puro. Anotan la presencia de artrosporas, b!astosporas, conidios, clamidosporas y esclerocios. Los rcsultaclos obtenidos indican que el micelio proveniente de esporas origina conidióforos y conidios, tal fue el caso de Inocybe bresado/ae (Fig. 13 e); además, en su micelio de 12 meses, se forma­ron clamidosporas esféricas de pared gruesa ornamentada. En Lacearía bicolor y L. laccata se observaron clamidosporas ovoides de pared gruesa, formadas en la hifa terminal. En cul­tivos viejos de Lycoperdon pusi/111111 y Piso/itlws tinctori11s se formaron clamidosporas esféri­cas de pared gruesa ornamentada. En L. bicolor (Fig. 17 f) y L. laccata (Fig. 18 f y g) se ob­servaron clamidosporas ovoides de pared gruesa, formadas en la hifa terminal. En cultivos viejos de L. pusi/111111 (Fig. 25 e) y/'. tinctorius (Fig. 29 f) se formaron también clamidospo­ras.

Otras especies forman estructuras intercalares con pared gruesa (no abundantes) que podrían considerarse como clamidosporas como enAmanita muscaria var.flavivolvata (Fig. 3 b ), Collybia aff. macula ta (Fig. 1 O d), Hebeloma saccluiriolens (Fig. 11 b ), /-Iygroplwms ms­sula (Fig. 12 d), Lactarius c/uysorrlieus (Fig. 20 e) y Lycoperdo1111111brin11m (Fig. 27 e).

Pantidou (1983) encontró que Hebeloma eb11me11m Malenscon formaba csc!erocios en­tre el micelio en cultivos de 60 días y Laccaria /accata formaba conidios terminales o inter­calares en las hifas. Palmer (1969) hace notar que son menos frecuentes !ns estructuras re-

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productoras asexuales en las cspccks micorrícica.s que en las lignícolas en cultivos axénicos, que llegan a presentarse clamidosporas y oidios tnnto terminales como intercalares, los co­nidios con frecuencia son terminales en conidióforos cuya forma es variable, considera que !u m{is frecuente es la oval o elipsoidal de pared delgada. Un aspecto importante que sciiala el autor se refiere a la dimensión que oscila entre 25-3Qum de diúmetro o inclusive que la longitud puede >er similar en las diferentes especies, este dato coincide con los resultados obtenidos.

Pruebas químicas

En estudios sobre taxonomía se han usado miís de 40 químicos en In caracterización de es­pecie~ (Watling, 1981). Singcr (1986) ha discutido los químicos más usados en estos estu­dios. L.~s hifas en cultivo de muchos hongos micorrizógenos producen reacciones químicas de un color característico (Pantidou y Graves, 1966). Estas reacciones llegan a producirse también en la ectomicorriza, en el manto y la red de Hartig, de allí la importancia de la ca­racterización química.

En la Tabla 5 se exponen las reacciones químicas que presentan los micelios estudiados en cuanto al cambio de color producido. Los datos son el resultado de 2 repeticiones con to­dos los reactivos utilizados en cada micelio aislado.

Las pruebas químicas de manera aislada no tendrían valor taxonómico, pero consideran­do el conjunto de reacciones que presenta cada especie, se puede inducir que la fisiología de ésta es particular, constituyéndose de esta forma características distintivas para cada una.

La solución de Melzcr provocó oscurecimiento inmediato en la mayoría de los micelios probados. En algunos micelios, la reacción fue instantánea de color negro como en P.ti11cto­ri11s SC32, R. nibescc11s SC35 y S. granulatus SC38, resultados que son congruentes con los obtenidos por Milkr et,¡/., (1983). Otras especies como Collybia aff. mac111Clta, Inocybe /;re­sado/ae, l. gcophylla var. li/acina, J. grammata, L. amcthystina, Lactarius c/1ry.mrrhe11s, Lyco­pcrdon ca11didu111, L. c1111i.1ii, L. cricetron'L. 11mbrim11n. R/1izapog011 /11teo/us, Suillm /11tem y S. pu11ctatus no presentaron reacción hacia el Melzcr. Es interesante ver la consistencia de este carácter en las especies de un mismo género.

Con el KOH al 10% la mitad de los micelios probados tuvieron reacción positiva pero con cambios de coloración muy particulares.

El H2S04 concentrado resulta un reactivo muy agresivo para algunos micelios como Amonita muscaria var.Jla1,ivo/vata, A. nibesce11s SC09, Hebe/oma saccliario/ens, Inocybe bre­sado/ae, J. grammata, Lacearía amet li>~tina, L. lacea ta SC20, Pisolithus ti11ctori11s SC32, S11i­l/11s gra11u/at11s SC38, S. p1111ctat11s, el cual destruye el tejido fúngico después de 2-1 horas, en todos los casos no se observaron hifas al microscopio óptico. En la mnyoría de los micelios

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Tnbln5.REACCIONES DE LOS MICELIOS EN Clll.TIVO PURO A LAS DffERENTES l'RU~:llAS QUIMICAS

'°'ll<º'---- _Q¡""---1___¡,l\'.17,<r f\~l?SOJ muuu._ __Mllll!• t'o)JlloL ~u".:.=L. ..t1··-···" , ... ,1.,rtn :rrYl 1 ~A'r.~ A L.... - n

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c.S..pmlJ:/JJ"" 1 ... ,,,, .... , ... 1 se.u "n- G 1

Slmholos: {-)Reacción ncgati\'3, (•)destrucción del tejido y del medio

Re.acción positiva: A - a1.ul, Ab. ámbar, Am - amarillo, H ·blanco, C -caíé, G ·gris, M ·moreno, MO. moreno oscuro, MOn- morcnom.curo negro, Mr- morado, N - OL>gro, Nn - nar~mja,O-ocrc, R ·rosa, Ri- roji1.o, V-vJolctn, Ve .verde, VJ -i,·ino.

no se presenta reacción y pocas especies tienen reacción positiva como en A manita nthcs­cens SCOS, fl. sacchario/c11s, l. geophyl/a var. lilacina. L. laccata SC2 I, L. clzrysorrltc11s, L. 11111/>rinum, P. ti11ctorius SC36 y S. gra1111lallLV SC38.

Con el NH10H al 10% solo 8 especies rcacdonaron positivamente, entre otras. las de Lycoperdo11 y P. tÍllctorius. Cuando sólo algunas especies de hongos reaccionan a un químico determinado, como anilina pura o fenol anilina, éste adquiere importnncia debido a su espe­cificidad, por desgracia existen pocos datos al respecto. En los micelios aislados se observó que muy pocas especies tienen respuesta a estos reactivos. El formol al 40% provocó una re­acción positiva en la mitad de los micelios aislados, <lan<lo coloraciones fuertes como mcm> no-rojizo en R. luteolrts, o vino en algunas especies de Lycopcrdo11.

La prueba con guayaco! fue negativa para la mayoría de los micelios en cultivo, esta res­puesta podría indicar que no tienen actividad ligninolítica y por lo tanto la asociación mico­rrizógena es más probable. Solamente en ú1ctarius c/10•sorrl1c1L> y en S11il/11s gra1111/at1u SC36 hubo reacción, cambiaron a negro y morado respectivamente. Aunque no es el color azul característico de esta prueba para ser considerada como positiva, no se puede excluir la po­sibilidad de que estas especies produzcan oxidasas cxtraccluhircs y puedan tener comporta­miento saprobio facultativo como se ha demostrado para las especies de T1icho/oma (Pal­mer, 1969), en Hebc/oma sacchaiio/e11s (Ilruchet, 1973). Giltrap (1982) encontró que las especies de Lactarius presentaron una reacción positiva a la fenal oxidasa la que consideró como una habilidad potencial saprobia de estas especies.

Inicialmente la producción de polifonol oxidasa por los hongos se tomó como una herra­mienta para la taxonomía de hongos causantes de pudrición de la madera, la cual se deter­minaba con la incorpornción de los ácidos gálico o túnico alagar, la reacción que se presen­taba era una zona oscura que se difundía en el agar alrededor de la colonia, esto indicaba que los componentes del polifenol oxidasa se habínn disociado. Actualmente se conoce que las fonoloxiuasas cstan formadas por 2 enzimas, la !accasa y la tirosinasa características de los hongos que causan pudrición blanca y morena. Estas técnicas recientemente se han apli­cado a los Agaricales en cultivo puro (1-lutchinson, 1990).

Con relación a los hongos ectomicorrizógcnos en cultivo puro, éstos son difíciles de identificar debido a que casi no se tienen datos de caracteres micromorfo!ógicos 4ue hayan sido usados para su diferenciación. Hutchinson y Mal!och (19&~) sugirieron la utilización de caracteres bioquímicos y fisiológicos aunados con los morfológicos para ayudar en la identi­ficación de los micelios aislados a partir de micorrizas en el campo. Actualmente trabajan sobre la determinación de laccasa y tirosinasa en hongos cctomicorrícicos y han discutido la importancia taxonómica y ecológica de sus resultados.

La función de la tirosinasa estú asociada con la vía metabólica de la melanogénesis res­ponsable de la coloración de los basidiocarpos en varias especies. En cambio la función de la laccasa puede variar en los tliferentes grupos ecológicos. En los hongos que pudren lama-

117

dern, se asocia con Ja degradación de Ja lignina, pero en Jos hongos ectomicorrizúgcnos no la degrada (Harley y Smith, 1983) por lo que su [unción exacta de desconoce.

Molina y Trappc (1987) han trabajado sobre la incompatibilidad de algunos liongos ec­tomicordzógenos con no hospederos, cuyas reacciones fueron similares a las mostradas por Lactarius subdulci< y L. tabidm en /Je/lila, las especies de esta última no son considerns co­mo sus hospederos, sino que estos hongos se encuentran asociados con lns especies de Fa· í,OIS.

Es más probable que la producción de laccasa por los hongos ectomicorrizógenos esté asociada con los compuestos frnólicos antifüngicos que producen las raíces de las plantas como medio de deíensa. Tales interacciones se han propuesto para los hongos patógenos de plantas. También la laccasa puede ayudar a los hongos ectomicorrizógenos en la detoxifica­ción de los compuestos fcnólicos que se encuentran en la capa de humus del suelo en los bosques de coníferas.

Otra posible [unción de la Jaccasa en los hongos ectomicorrizógenos puede estar relacio­nada con la pigmentación producida por las quinonas, las cuales son productos de la degra­dación de los compuestos fenólicos, se ha demostrado la importancia de estos pigmentos en muchos grupos de hongos (Hutchinson, 1990).

A pesar de que no se ha determinado la función exacta de la laccasa y tirosinasa en los hongos cctomicorrizógenos, la frecuencia y detección de estas enzimas en las pruebas quí­micas sugieren que puede considerarse como un carácter taxonómico consistente para los cultivos puros.

Los cultivos puros de hongos ectomicorrizógenos, por lo general se utilizan por varios años, por tal motivo el cultivo base debe mantenerse por separado, almacenado en agar nu­tritivo, de preferencia MMN y en refrigeración. Watling (1983) recomienda hacer resiem­bras y mantenerlas en refrigeración, ya que de esta forma los cultivos crecen lentamente du­rante el almacenamiento y ocurren menos cambios en su fisiología. Srnith y Onions ( 1983) proponen varias técnicas de preservación y mantenimiento de cultivos puros, entre otras ci­tan las resiembras frecuentes y almacenaje en cuarto con temperatura controlada, o en con· gelación , o almacenado a 4-7°C, en cuarto con aire acondicionado a J5°C. El almacena­miento también puede ser en aceite mineral, en suelo, gel de sílice y secado por congelación.

En este trabajo se almacenaron los micelios en cultivo puro en aceite mineral debido a que presenta algunas ventajas ya que por un lado favorece la larga viabilidad de algunos mi­celios y la supervivencia de especies que no sobreviven a otros métodos de mantenimiento y por otro, se evita la penetración de ácaros en el cultivo, además de su bajo costo dadn que no requiere de equipo sofisticado. Como cualquier método, también presenta algunas des .. ventajas ya que se puede contaminar con las esporas del aire cuando está almacenado, adc· más se ha determinado que retarda el crecimiento en las resiembrns y los micelios pierden

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vigor. Este método requiere de !ns transferencias anuales para conocer la sensibilidad del micelio al aceite mineral y a la refrigerackin.

En la Tabla 6 se presentan los resultados sobre las caracterizaciones macrosc(ipicas y mi­croscópicas de los micelios preservados en aceite mineral y en refrigeración, los cuales fue­ron resembrados 12 meses después.

Los caracteres miceliales de cultivos en crecimiento y en cultivos almacenados mostra­ron algunas diferencias entre otras citaremos las de Laccaria amethystina y Rhi:opogon isa­be//inus las cuales iniciaron su crecimiento de 2-5 días en ambos cultivos; Clitocyhe adora, retardó el inicio del crecimiento en el almacenado; Inocye grammata acelera el crecimiento en el almacenado; l. grammata y L. amethy.stina tuvieron crecimiento importante en ambos cuWvos, todas las dcmús especies presentnron crecimiento escaso. En general se conserva~ ron los pigmentos, sólo en L. amethyslina fueron más escasos; H. sacchariolens, R. iwbelli11tL< y R. rabcsccns tiñeron el medio en ambos tipos de cultivos; H. sacchariolc11s, l. grammata, L. amethystina y R. isabclli111Ll· conservaron el citoplasma de tipo granular en ambos cultivos; los paquetes de hifas sólo se presentaron en R. mbescc11s en ambos cultivos; en A. rabescem, H. sacchario/e11s, L. chrysorrhcus y L. per/alum var. pcrlatum varió la presencia de hifas grue­sas y delgadas; se perdió la refringencia de las inclusiones citoplásmicas en los cultivos alma­cenados; la mayoría no formó vesículas intercalares excepto 11. sacchariolc11s y L. pcrlalmn var. pcrlatum que las conservaron en los cultivos almacenados, en estos mismos cultivos no se formaron los cordones miceliales; se observó la persistencia dé gútulas en ambos cultivos y también el crecimiento en las resiembras.

Estos resultados coinciden con Smith y Onions (1983) dado que al disminuir el metabo­lismo de los micelios preservados en aceite mineral algunas cantcterísticas se ven afectadas, además estos cambios no podrían considerarse como mutaciones porque los caracteres prin­cipales se conservaron por lo que es mús factible que estas diferencias se deban al impacto que causa el aceite mineral y la baja temperatura sobre el micelio de las especies aisladas.

Los resultados de las pruebas químicas (Tabla7) coinciden con los obtenidos en los culti­vos sin preservar, sólo ligeros cambios en algunas especies, por ejemplo: en A manita rabes­cens se presenta reacción azul con formol; Laccaria amcthysti11a y Lactarius cl1Tysorrheus producen reacción amarilla con KOH, en todos estos casos fue negativa en los cultivos sin preservar. Estos datos indican que aún cuando el crecimiento micclial se inhibe durante su almacenamiento en aceite mineral, todavía existen algunos procesos metabólicos, los cuales podrían ocasionar el cambio en la respuesta hacia un químico determinado.

Resulta interesante el hecho de que nlgunas especies pierden vigor durante las resiem­bras y llegan a perderse debido a la inhibición total de su crecimiento. Sin embargo en acei­te mineral éstas pueden mantener su potencial de crecimiento y al resembrarse continuar con el mismo. Sería recomendable preservar en aceite mineral aquellas especies que se han seleccionado para una determinada investigación, después de 1 mes de crecimiento (para las especies de crecimiento importante), o 4 meses (para las especies de crecimiento escaso) y

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Tahla 6. Características micelialcs de los cultivos puros preservados.

Es 1cde A ti Amanila mbcsccn.r Climn1f1e adora flcbcloma sacc!wriolens X

~.É!!!f.}'bc grommalt! X

Laccaria amelln•sti110 X

Lactan·us c/1tvso"/Jeus L 'COtJerdoJJ Jcr/atum w1r. >crlatum X

L\'concrd011 .rnadicc11m X

R/Jiwnor-011 ist1bclli11us X

Rl1imno •m1 mliescem

Los caracteres indicados con letras son:

A Inicia su crecimiento de 2 a 5 días B Inicia su crecimiento de 6 a 9 días C Inicia su crecimiento de 10 a 20 días D Inicia su crecimiento de 21 a 30 días E Crecimiento de 50 a 90 mm en 30 días F Colonia pigmentada

e IJ E X

X

X

X

X

X

G Tiñe el medio (x), tiñe el reverso (x-) o ambas (x•) 11 Hifas gruesas y delgadas 1 Citoplasma granular J Inclusiones citoplásmic.1s refringentes

F e; X

X

X 1 x• 1

1 1

X

X

X x-X

X 1 x-

"1 1 1 .J Ki L MI N o p o R s T X ¡ 1 1 1 X X

1 X 1 1 X 1 X X

X

1

X 1 X j 1 X X

1 1 1 X 1 X 1 X ] X 1 X 1 X 1 X

X 1 X 1 1 1 x- 1 X 1 l-1-: X 1 \ x- 1 1 1 X

1 1 1 X x- 1 1 1 X

1 X i í 1

X 1 1 1 1 X X i

K Vesículas intercalares (x), terminales (x-) o ambas (x•) L Presencia de fíbulas (x), seudofíbulas (x-) M Conexiones interhifales N Paquetes hifales O Cordones miccliales P Gútulas Q Producción de exudado n Producción de material cristalino S Estructuras anamórficas T Con crecimiento en las resiembras

X

X

X

Tabla 7. Reacciones de los micelios preservados a las diferentes pruebas químicas

Especie f\.lflzcr KOll Jl¡SQ4 Nll40ll

Anllfnn pum Formol

Fcnol unilino 1 10% 40% roncen.

Ama11ila mbcsce11s N-0 R CUtoct·bc odom MO M RO lfebcloma sacchuriole11s MO MO 1'1oC\•be f!T"ammata MO-N Am Laccaria omcthvsti11a MO-N Am Lactarius cluvso"heus MO-Ab An_1_ ,____.- Rz lvconcrd011 ncrlatum i•ar. nerlatum MOn L\•cnoerdon snadiccum M0-0 Rhizoonro11 mbcsccns N Rz MO MO

Símbolos: reacción negativa(-) reacción positiva, Ab ambar, Am amarillo, M moreno, MO moreno oscuro, MOn moreno oscuro negro, N negro, O ocre, R rosa, RO rojizo oscuro, l!z rojiw.

MO

Gunyncol

de preferencia que no hayan sido resembradas, para evitar que pierdan vigor. L1S especies que sólo crecieron sobre el explante y no progresaron en las resiembras, como Amanita pantherina, al almacenarse durante 12 meses en aceite mineral, tampoco crecieron en la re­siembra.

Esta parte de la investigación no se ha concluido debido a que algunos micelios preser­vados en aceite mineral todavía no cumplen los 12 meses de almacenamiento.

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CONCLUSIONES Los aislamientos de hongos ectomicorrizógenos deberán realizarse de preferencia en el campo, utilizando ejemplares jóvenes y sanos para evitar la contaminación del cultivo, además se recomienda hacer Ja primera resiembra en MMN para revitalizar el cultivo.

- Los medios recomendables para el aislamiento son PDA, EMAy VS.

A pesar de que los cultivos de hongos basidiornicetos ectornicorrizógenos son difíciles de lograr, se obtuvieron 30 especies diferentes en cultivo puro. Muchas de las cuales es la primera vez que se reportan, corno algunas de Lycoperdon.

Esta investigación contribuye con un buen número de especies que se encuentran en cultivo puro, caracterizadas en los aspectos macroscópicos, microscópicos y químicos con base en los diferentes criterios propuestos por autores interesados en esta área.

Las especies que se aislan con facilidad no necesariamente presentan un crecimiento im­portante. En cambio las especies que presentaron un crecimiento importante y que se mantuvieron durante las resiembras, aún después de 12 meses de almacenamiento son las que deberán considerarse para investigaciones futuras. Estas especies corresponden a Hebeloma sacchario/ens, Jnocybe grammata y Laccaria amethystina.

Las especies con crecimiento lento como las deAmanita, Lactarius y Clitocybe conviene preservarlas sin haber sido resembradas, para que consen·cn su vigor a(m después de preservadas.

- La colección de cultivos preservada y mantenida bajo constante observación puede ser utilizada como un banco de micelios para investigaciones en áreas de la bioquímica, fi­siología, morfología, genética y ecología.

Es recomendable que cuando se desee trabajar con algunos de los micelios en cultivo preservados, se resiembren en MMN y caractericen nuevamente, para estublecer com­paración con su caracterización inicial y corroborar que realmente es el micelio deseado.

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LITERATURA CITADA

Agercr, R., 1987. Studies on cctornycorrhizae. X: Mycorrhizae fonned by Co11i11arius obt11S11S nnd C. ve11et11s on sprucc. Mycologia 79(4):524-539.

Aguirre-Acosta, C. E. y E. Pércz-Silva, 1978. Descripción de algunas especies del género Laccaria (Agaricales) de México. Bol. Soc. Mex. Mic.12: 33-58.

Ammirati, J. 1979. Chernical studies of mushroorns thc need far voucher collcctions. Mycologia 71: 437-441.

Avila, Z. 1-1., 1988. Aislamiento, caracterización y confirmación de micelios en cuatro especies dcAmanita (Agaricales) d~ México. Tesis. Fac. de Ciencias. Universidad Nacional Autónoma de México. México D. F. 180 pp.

Azcón, F. de i\. y J. M. Barca. 1980. Micorrizas. b11'estigació11 y Ciencia 47:7-16.

Baylis, G. T. S., 1975. Thc rnagnolioid mycorrhiza and mycotrophy in root systcm derived from it. En: Endomycorrhizas. F. E. Sanders, B. Mosse y P. B. Tinkcr (Eds.). Academic Press, Londres. pp. 373-389.

Beackjord, P. R., D. W. Srnith y M.S. Mclntosh, 1984. Effects of nitro gen fcrtilization and Pisolithus tinctorius on Quercus mbra seedling root and top devclopment. Foresl Sci. 30:124-128.

Birraux, D. y N. Fries, 1981. Germination of 771e/eplzora terrestris basidiosporcs. Can. J. Bol. 59:2062-2064.

Boulanger, E., 1903. Sur la culture de la Truffe ¡)partir de la spora. Bu/l. Soc. Myc. Fr. 19: 262-266.

Bowen, G. D. 1973. Mineral nutrition of ectomycorrhizae. En: Ectomycorrhizae, 77ieir Ecology and Physiology. Eds. G. C. Marks y T. T. Kozlowski. Academic Prcss, Nueva York, pp. 151-201.

Bowen, G. D. y C. Theodorou, 1973. Mineral nutrition of cctomycorrhi7.ae. En: Ectomycorrhizae, 771eir Ecology and Physiology. Eds. G. C. Marks y T. T. Kozlowski. Academic Press, Nueva York, pp. 107-135.

124

Brandud, T. E., H. Lindstrom, H. Marklund,J. MelotyS. Muskos, 1990. Coni11wi11S. Flora Photographica. Vol J. Eds. Cortinarius H. B., Klüverviigch, Nntfirs, Suiza. pp.20-21.

Brown, A. C. y W. A. Sinclnir, 1981. Colonization and infcction oí primary roots of Douglas-fir sccdlings by thc ectomycorrhizal fungus Laccaria lacea/a. Forest Sci. 27 (1):111-124.

Bruchet, G., 1973. Contribution a L'étudc du gcnre Jfebeloma (Fr.) Kumm. (Basidiomycctcs-Agaricales). Essai tnxonomiquc et ecologique. These Doc. L1b. Myco!. Associe. CNRS. Univ. Clnude Bernard, Lyon. Frnncia, 113 pp.

Calderón, A. y E. Pérez-Silvn, 1989. Consideraciones taxonómicas y nuevos registros de algunas especies del género Lycoperdo11 (Gasteromycctcs) en México. Anales Insl. Bio/. Universidad Nacional Autónoma de México, Ser. Bol. 59(1): 1-30. 15, XII.

Campbell, M. P. y R. H. Pcterson, 1975. Cultural characters of certain Anwnita taxa. Mycotaxon 1(3):239-258.

Capello, S. y J. Cifuentes, 1982. Nuevos registros del Género Suillus (Boletaccae} en México. Bol. Soc. Mex. Mico/. 17:196-206.

Castellano, M. A. y J. M. Trappc, 1985. Ectomycorrhizal formation and plantation performance of Douglas-fir nursery stock inoculatcd with Rhizopogon spores. Can. J. For. Res.15:613-617.

Clinc, M. L y C. P. P. Reíd, 1982. Scecl source and mycorrhizal fungus effccts on growth of containerized Pinus cantona y Pi11us po11derosa scedlings. Forest Sci. 28(2):237-250.

Collins, C. H. y P.M. Lyne, 1989. Métodos Microbiológicos. Ed. ACRIBIA, S.A. España. pp. 108-118.

Cuevas, F. J., 197 J. Variaciones morfológicas de los micelios de Psi/ocybe 11111/iercu/a y Psi/ocybc zapotecorum en diversos medios de cultivo. Bol. Soc. Me.r. Mic. 5:37-46.

Cuevas, R. R. A., 1979. Prueba de inoculación con el hongo micorrícico Pisolithm ti11ctori11s (Pers.) Coker ancl Couch, en plántulas de Pinus 1110111ez11111ae Lamb. en sucio ele vivero. Ciencia Forestal 4(19):46-62.

Cheva!ier, G., 1972. Obtention de cultures de mycé!ium de truffe a partir du carpophore et des mycorhizes. Acad. D'Agiicul. de France. pp. 981-989.

125

Chilvers, G. A., P. A. Douglas y F. F. L,peyrie, 1986. A paper-sandwich technique far rapid synthesis of ectomycorrhizas. Ne1v Phytol. 103:397-402.

Chu-Chou, M. y L. J. Grace, 1982. Mycorrhizal fungi of E11ca/yptus in the North lsland of New Zealand. Soil Bio/. Biochem. 14(2): 133-138.

Danielson, R.M., 1984. Ectomycorrhiza tbrmation by the operculate discomycete Sp/Jaerosporel/a br111111ca (Pezizales). Mycologia 76(3):454-461.

Daughtridge, A. T., S. R. Boese, S. G. Pallardy y H. E. Gorrett, 1986. A rnpid staining techique for assessment of cclomycorrhizal infection of oak roots. Can. J. Bot. 64:1101-IJ03.

Da vis, E. E. y S. C. Jong, 1976. Ilasidiocarps formation by Laccaria laccata in agar culture. Mycologia 68:211-214.

Debaud, J. C., R. Pepin y G. Ilruchet, 1981. Ultraestructure des ectomycorhizes sinthétiques a Hebe/oma a/pi1111m et Hebe/oma marginatum de Dryas octopeta/a. Can. J. Bot. 59:2160-2166.

Dominik, T., 1969. Key to ectotrophic mycorrhiza. Folia Foresta/ia Polonica Seria A 15:309.

Dop, P. y A. Gautie, 1928. Manuel de tec/111iq11e botaniq11c. Histo/ogie et microbievcgetales. Ed. J. Lamarre, Francia. pp.108-175.

Dubovoy, C. y T. Herrera, 1967. Estudio morfológico de los micelios de Psilocybe caemlescens Murril en diversos medios líquidos de cultivo.An. Inst. Bio/. Universidad Nacional Autónoma de México. 38, Ser. Bot.(1):111-150.

Dubovoy, C. y T. Herrera, 1968a. Morfogénesis de fíbulas 1: Desdicariotización de micelios de Psilocybe caenilescens M urrill en diversos medios líquidos de cultivo. An. Inst. Bió/. Universidad Nacional Autónoma de México. 39, Ser. Bot.(1):45-16.

Dubovoy, C. y T. Herrera, 1968b. Influencia de factores fisicoquímicos en la morfogt!nesis de estructuras asexuales en micelios de Psi/ocybe caeni/escens Murrill. An. Inst. Bió/. Universidad Nacional Autónoma de México. 39, Ser. Bot. (1):77·1 lO.

Eguiluz, P. T., 1977. Los pinos del mundo. Pub!. Esp. No. l. Depto. de Bosques. Ese. Nnl. de Agricultura, Chapingo. México. 74 pp.

126

Eguiluz, P. T., 1978. Ensayo de integración de los conocimielllos sobre el género Pim1s en México. Tesis. Depto. de Bosques Universidad Autónoma de Chapingo, México. 623 pp.

Eguiluz, P. T., 1982. Clima y distribución del género Pinus en México. Ciencia Forestal 7(38):30-44. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales. SARl-1, México.

Ferrera, C. R., 1976. Micorrizas. Tesis predoctoral. Instituto Politécnico Nacional. Dir. Est. Posgr., México. pp. 44-57.

Font Quer, P., 1953. Diccionario de Botánica. Ed. Labor, Barcelona, Espaila. 1244 pp.

Fontana, A., 1968. Miceli di ftmghi ipogei i11 co/tura pura. Atti Congrcsso lnternazionalc sul Tartufo. Spoleto. 10 pp.

Fontana, A., 1971. Il micelio di "Tuber melmwsponmz" vitt. in col tura pura. Af/ionia 17:12-23.

Fortin, J. A., Y. Piché y M. Lalonde, 1980. Tcchnique far the observation of carly morphological changes during ectomycorrhiza formation. Can. J. Bol. 58:361-365.

Fortin, J. A., Y. Piché y C. Godhout, 1983. Mcthods far synthesizing cctomycorrhizas and their effect on micorrhizal developmcnt. Plant and soil 71:275-284.

Fostcr, R. C. y G. C. Marks, 1966. The fine structure of the mycorrhizac of Pinus radiata D. Don.Austr. J. Biol. Sci. 19:1027-1038.

Foster, R. C. y G. C. Marks, 1967. Observations on tbe mycorrhizas offorcst trces. II. The rhizospbere of Pinus radiata D. Don. Auslr. J. Biol. Sci. 20:915-926.

Fries, N., 1983. Basidiospore germination in species o[ boletaceae. Mycot!Ltoll 18(2):345-354.

Fries, N., 1978. Basidiospore germination in sume mycorrhiza forming hymcnomycetes. Trans. Br. Myco/. Soc. 70(3):319-324.

Fries, N. y G. M. Mueller, 1984. Incompatibility systems, cultural features and species circumscriptions in the ectomycorrhizal genus Laccaria (Agaricales). Myco/ogia 76( 4):633-642.

127

Giltrnp, N. J., 1982. Production of polyphcnol oxidases by ectomycorrhyznl fungí with spccial refcrcncc to Lactarius spp. Trans. Brit. Myco/. Soc. 78:75-81.

Graham, J. H. y R. G. Linderman, 198Ja. Inoculation of containerizcd Douglas-fir with thc cctomycorrhizal fungus Cenococcum gcophy//11111. Foresf Sci. 27(1):27-3.1.

Graham, J. H. y R. G. Linderman, !981b. Effcct of cthylene on root growth, cctomycnrrhiza formation, and fi1sari11111 infection of Douglas-fir. Can. J. Bot. 59: 149-155.

Guzmán, G. y T. Herrera, 1969. Macromicetos de bs zonas áridas de México, ll Gasteromycetos. A11. l11st. Biol. Universidad Nacional A utónnma de México.40. Ser. Bot.(1):1-92, 97 figs.

Hacskaylo, E., J. G. Palmery J. A. Vozzo, 1965. Effcct of tcmpcrature on growth and rcspiration of ectotrophic mycorrhizal fungí. Mycologia 57:748-756.

Harley, J. L. y S. E. Smith, 1983. Mycorrhiwl ~ymbiosi~. Academic Press, Nueva York. pp. 254-278.

Harley, J. L., 1989. The fourth Benefactors' Lecture. The significance of mycorrhiza. Myco. Res. 92(2);129-139.

Harrigan, W. F. y M. E. Me Canee, 1976. Laborafory Methods Íll Food allll Dairy Microbio/ogy. Acadcmic Prcss, Londres. pp. 21,107,289 y 313.

1-latchell, G. E. y D. H. Marx, 1987. Response of Longleaf, Snnd, and Loblolly Pines to Pisolithus Ectomycorrhizac and Fertilizer on a Sandhills Site in South Carolina. Forest Sci. 33(2):301-315.

How, E. J., 1940. The mycorrhizal relations of larch. l. A study of Boletus clc¡;ans Schum. in pure culture.A1111. Bof. Londo11. 4:135-150.

Hung, L. L. y R. Malina, J986a. Temperature and time in stornge in flucnce the efficacy of selected isolates of fungi in commercially produccd ectomycorrhizal inoculum. Forest Sci. 32(2):534-545.

Hung, L. L. y R. Malina, 1986b. Use of the cctomycorrhizal fungus Lacearía laccata in forestry. m. Effects of commercially produce inoculum on container-grown Douglas-fir and Ponderosa pine seedlings. Can J. For. Res. /6(4):802-806.

128

Hunt, G. A. y J. M. Trappc, 1987. Seasonal hypogeous sporocarp produclion in a western Oregon Douglas-fir stand. Ca11. J. Bot. 65:438-445.

Hutchinson, L J. y D. W. Malloch, 1988. A vcrification protocol far cultural isolatcd of ectomycorrhizal Basidiomycetes. pp. 121-124. En: Ca11adia11IVorks/Jop011 Mycorrhízae in Forestry. M. L~londc y Y. Piché (Eds.). Université L~val, Stc.-foy, Québec.

Hutchinson, L. J., 1990. Studies on the systenmtics of ectomycorrhizal fungi in axenic culturc. l!I. Pateros ofpolyphenol oxidase nctivity. Mycologia 82(4):424·~35.

Inventario Forestal del Edo. de México y D. F., 1974. Subsecretaría Forestal y de Ja Fauna. Dir. Gral. Inv. Na!. For. SAG. México. 29: 18-19,40-41.

Inventario Forestal del Estado de Morelos, 1975 Subsecretaría Forestal y de Ja Fauna. Dir. Gral. lnv. Na!. Far. SAG. México. 32: 16-28.

Inventario Forestal del Estado de Oaxaca, 1985. Secretaría de Recursos Hidráulicos. México. Publicación Especial. 58: 157 pp.

Inventario Forestal del Estado de Tlaxcala, 1976. Subsecretaría Forestal y de la Fauna. Dir. Gral. Inv. Na!. For. SAG. México. pp. 12-26.

Johansen, D. A., 1940.Plant 111icrotecliníq11e. Me Graw Hill Book Co. Nueva York. pp. 91.

Jorgensen, J. R. y E. Shoulders, 1967. El desarrollo de la micorriza de la raíz, vital para la supervivencia del pino laciniado (Pi11us caribe a) en vivero. En: Apuntes para el silvicultor, 18(2): 11-15. Centro Regional de Ayuda Técnica del A. l. D. México-Buenos Aires.

Keller, G. y J. F. Ammirati, 1983. Chemotaxonomic significance of antraquinone dcrivates in North American spccies of Dennocybe scction Sanguinae. Mycotaxor1 18(2):357-377.

Khan, S. R. y J. W. Kimbrough, 1982. A revaluatibn of the basidiomycetcs base upan scptal and basidial structures. Mycotaw11 I 5: 103-120.

Kornerup, A. y J. H. Wanscher, 1978. Handbook of Color. Ed. Methucn, E,. Dinamarca. 252 pp.

129

Kühner, R., 1946. Rcchcrches morphologiquc et carynlogique sur le mycclium de quelqucs Agaricales cm culture purc. Extrait du Bu//. Soc. Myco/. France. 62:1-48.

Kühner, R. y H. Romagncsi. 1953. Flore ana/irique des clw111gi11om supérieurs. Masson Et CIE, Editcurs. Paris, Francia. pp. 246.

Langcron, M., 1949. Prcus de Microscopie. Tomo 1-11. Ed. Masson et d 0, Paris, Francia. pp.

538-591, 1380.

Laut, J. G., 1966. Cultural charnctaistics o[ thrcc species of flolcti11us. Can. J. Bol. 44(1):395-40~.

Le Tacan, F., G. Jung, J. Mugnicr, P. Michclot, y C. Maupcrin, 1985 Efficiency in a forcst nursery of an ectomycorrhizal fungus inoculum produce in a fermentar and entrapped in polymeric gcls. Can. J. flor. 63:1664-1668.

López, G. M. T., 1979. Caracterización de algunos cu/tiros de hongos causantes de pudrición e11 la madera. Tesis Profesional, Facultad de Ciencias, UNAM. 76 pp.

Macdoncl, M. C. E., 1963. Formaciones micorrícicus en pinos de semilleros (Pi11us montezumae Lamb. y P. patula Schl. et Cham.) Bol. Tec. No. 9. lnst. Na/. Jnv. Far. México. 44 pp.

Malloch, D., 1981. Mou/ds. 711eir isolatio11, cultivario11, and identijicatio11. Univcrsy of Toronto Press, Canada. 99 pp.

Mark, G. C. y R. C. Foster, 1973. Structure, Morphogenesis and Ultraestructure of Ectomycorrhizae. En: Ectomycorrhizae. Their Eco/ogy a11d l'hysiology. G. C. Marks y T. T. Kozlowski (Eds.). Academic Press. Nueva York. pp. 2-35.

Maronek, D. M. y J. W. Hcndrix, 1979. Growth acccleration of pin oak seedlings with a mycorrhizal fungus. Hort Sci. 14(5): 627-628.

Martínez, C. D., M. Quirartc, C. Soto, D. Salmones y @BIBL = G. Guzmán, 1984. Perspectivas sobre el cultivo de hongos comestibles en residuos agro-industriales en México. Bol. Soc. Mex. Mic. 19:207-219.

Martínez, C. D., M. Sobal y M. Quirarte, 1986. Obtención y caracterización de híbridos de cepas mexicanas de Pleurotus ostreatus. Rev. Mex. Mic. 2:227-238.

130

Martínez, C. D., P. Morales, C. Soto, Ma. E. Murricta y G. Guzmán, 1986. Cultivo de P/eurotus oslreallls sobre hojas usadas en Ja extracción lle accr.es esenciales. Rei·. Mex. Mic. 2:119-1'.?.4

Martínez, M., 1948. Los Pinos Mexicanos. Ed. Botas. México. pp. 56-65, 210-225.

Marx, o: H. y B. Zak, 1965. Effcct nf pi! on Mycorrhizal formation of slash pinc in ascptic culture. Forest Sci. 11:66-75.

Marx, D. 1-1., 1969a. The iníluence of eclotrophic mycorrhizal fungi on the rcsistancc of pinc roots to pathogcnic in fections. l. Antagonism of mycorrhizal fungi to root pathogenic fungi and soil bacteria. Plrytopath. 59: 153-163.

Marx, D. 1-I., 1969b. The iníluence of cctolrophic mycorrhizal fungi 011 the rcsistance of Pinc roots to pathogenic in fcctions. 11 Production, ldcntificalion, and biological activily of anlibiotic produced by Leucopm'illus cerea/is var. picei11a. l'lrytopatlr. 59:411-417.

Marx, D. 1-1., 1977. Trce hosl range and world dislribulion of thc cctomycorrhizal fu11gus Pisolithus tinctorius. Can. J. Microbio/. 23:217-223.

Marx, D. H. y Ch. B. Davey, 1969. The influencc of ectotrophic mycorrhizal fungí 011 the resistance of pine roots to pathogenic infections. IV. Resista11ce of naturally occurring mycorrhizae to infections by Phytop/1t/10ra cinnamomi. l'/Jytopath. 59: 559-565.

Marx, D. H., W. C. Bryan, Ch. B. Davcy, 1970. Iníluence of tempernture on aseptic synthesis of ectomycorrhiza by Teleplwra te"estris and Pisolitlzus tinctori1« on Ioblolly pine. Forcst Sci.16(4): 424-431.

Marx, D. 1-1. y W. J. Daniel, 1975. Maintaining cultures of ectomycorrhízal and plant pathogenic fungi in sterile water cold storage. Escrito no publicado. 12 pp.

Marx, D. H. y S. J. Rowan, 1981. Fungicídes intluence growth and dcvclopmcnt of specific ectomycorrhizac on loblolly pine seedlings. Forest Sci. 27(1):167-176.

Marx, D. 1-1., J. L. Ruehle, D. S. Kenncy, C. E., Cordel!, J. W. Refíle, R. J. Malina, \V. 1-1. Pauk, S. Navratil, R. W. Tinus, y D. C. Gordwin, 1982. Commcrcial vegetative inoculum of Pisolithus tinctorius and inoculation tcchniques far develop ment of ectomycorrhizae on container-grown tree scedlings. Forest Sci. 28(2):373-400.

131

Massicolte, H. B., R. L. Peterson, C. A. Ackcrley, y Y. Piché, 1986. Structure nnd ontogcny ofA/1111s crispa-A/porn dip/oplz/oeus cctomycorrhizae. Can. J. Bol. 64: 177-192.

Mauperin, Dh., F. Morticr, J. Ga1bayc, F. Le Tucan, y G. Carr, 1987. Viability of an cctomycorrhizal inoculu111 produccd in a liquid mcdiu111 and cotrapped in u calcium ni ginatc gel. Can. J. Bol. 65: 2326-2329.

McAfcc, B. J. y J. A. Fortín, 1986. Compelitivc intcrnctions af ectomycarrhizal mycobionts under ficld conditions. Can. J. Bol. 64: 848·852.

Mclin, E., 1921. Über die Mycarrhizcnpilzc van Pinus sifrestris L. und Picea abies L. Karst, Svensk. Bot. Tidskr.15:192:203.

Melin, E., 1946. Dcr Einíluss van Waltlstreuextrnktcn auf das Wackstum van Bondepilze11, mit bcsonderer Bcrucksichtigung clcr Wurzclpilze von Waldbilumen. Symb. Bot. U11Sa/. 8(3).

Mclin, E., 1954. Growth factor rcquirements of mycorrhizal fungi af forcst trees. SPensk bol. Tiskr. 48:86-9-1.

Mclin, E., 1962. Phyr.iological uspccts of mycorrhiza forest trees. En: 'I'ree Growth. E. Th. T. Kozlowski. Ronald Press Co. Nueva York. 247-263 pp.

Miller, J. C., S. Rajapakse y R. K. Garber, 1986, Vesicular-Arbuscular mycorrhizae in vegetable crops. Hort Sci. 21 ( 4):974.

Miller, O. K., S. L. Miller y J. G. Palmer, 1983. Description ancJ iJentification of se!ected mycorrhizal fungi in pure culture. Mycotaxo11 18(2):457-481.

Miller, O. K., D. T. Jenkins y P. Dervy, 1986. Mycorrhizal synthesis ofAmanita muscaria var. persici11a with hard pin e. Mycolaron 26: 165-172.

Mikola, P., 1973. Application of mycarrhizal symbiosis in forestry practice. En: Eclomycorrhizae: 111eir Ecology and Physiology, G. C. Marks y T. T. Kozlowski (Eds.). Academic Prcss, Nueva York. 383-411 pp.

Malina, R., 1977. Ectomycorrhizal fungi and forestry practice. En: iWushrooms and Man, an J11terdiscipli11ary Approac/1 to Myco/ogy. Tony Walter (Ed.). Forest Service. pp. 147-161.

132

Malina, R., 1979. Purc culture synthcsis and hosl spccificy of red alder mycorrhizac. C.111. J. Bol. 57: 1223-1228.

Malina, R., 1982. Use of the cctomycorrhiznl fungus Laccaria laccata in forcs!Iy: J. Consistcncy bctwcen isolalcs in efecctive colonization of containerized conifer seedlings. Can. J. For. Res. 12(3):469-473.

Melina, R. y J. G. Palmer, 1983. lsolatian, mainlenance, and purc culture manipulation oí ectomycorrhizal fungí. En: Metlrod' and Ptinciples of Mycon'hizal Rcsearc/1. N. C. Schcnck (Ed.). The American Phylopatholagical Sociely Minn. pp. 115-126.

Molina, R. y J. M. Trnppc, 1982. Patterns of cclomycorrhyzal host specillcity and poten tia! among Pacil1c Northwcst conifers ami fungí. Forcst Sci.28:423-458.

Malina, R. y J. M. Trappc, 1984. Mycorrhiza Managcment in Bareroot Nurserics. En: Forest Nursery Manual - Production of Bareroot Secd/i11gs. Duryea, M. L. y T. D. Landis (Eds.). The Hague, Boston, Lancaster, for Forcst Rcscarch, L1b. Oregon State Univ. Corvallis. pp. 211-223.

Morales, P., 1987. Cultivo de Pleurotus ostreatus sobre la pulpa de cardamomo. Re''· Mc.r. Mic. 3:71-73

Moser, M., 1958. Die Künstliche Mykorrhizaimpfung von Forstpflanzcn. II. Torfstreukultur von Mycorrhizapilzen. Zentralbl. 77: 257.

Nieto, P. C., 1985. Catálogo de la Flora util de la Sierra del Ajusco. No. 12 ISSN-0185-4445. lnst. Nnc. de Inv. Forest. SARH, México. 55 pp.

Nobles, M. K, !958a. Cultural characters as a guide to the taxonomy and phylogeni• of the Polyporaceae. Can. J. Bot. 36:883-926.

Nobles, M. K., !958b. A rapid test for cxtracelular oxidasa in cultures of wood-inhabiting. Hymenomycetes. Can. J. Bot. 36:91-99.

Olmos, F. C., 1971. Comportamiento de micelios de Agaticales en diferentes medios de cultivo. Tesis profesional. Facultad de Ciencias, UNAM. México. 70 pp.

Owen, O. S., 1977. Consen-'ación de recursos naturales. Ed. Pax-México. Librería Carlos Ccsarman. 45-282 pp.

133

l'nchlewski, R., 1967. l11l'cstigatio11s of purc culture of mycorrhiwl fungi of pi11e. Traslade Dzieciolowski. R. Warsow. Forest Res. Inst., pp. 192,

Pachlcwski, R., 1967. Studies on mycorrhizal fungi of pinc (Pimis silvestris L.)-Lactari11s nifus (Scop. ex Fr.) Fr. and Rhiwpogon /111eolm Fr. and North. under natural conditions and in purc culture. Proc. lnt. Union Forest Res. Organ. U th. 5:12.

Palmer, J. F., 1969. Tcchniques and procedures far culturing ectomycorrhizal fungi. En: Mycorrhiwe procceding of thejirst North Ameiican Confcrence on Mycorrhi:ae. E. Hackskaylo. U. S. Department of Agriculture. Forest Scrvice, Washington. 132-145 pp.

Palmer, J. C. y E. Hackskaylo, 1970. Ectomycorrhizal fungi in purc culture. l. Growth on single carbon sourccs. Physiol. Plan/. 23: 1187.

Pantidou, M. E., 1961a. Cultural studks of 13olctaccac. Gyrodon mcmloides and four species ofBoletinus. Can. J. Bot. 39:1149-1162.

l'autidou, M. E., 1961b. Carpophorcs of l'lilebop11s sulplwreus in culture. Can. J. Bot. 39:1163-1167.

Pantidou, M. E., 1962. Cultural studies ofBoletaceae. Carpophores of l'hlebop1L< lignicola in culture. Can. J. Bot. 40: 1313-1319.

l'untidou, M. E., 1964. Cultural studies of Boletaceae. Carpophores of Xeroconuis badillS andXerocomus illudens in culture. Can. J. Bot . ./2: 1147-1149.

Pantidou, M. E. y J. W. Graves, 1966. Cultural studies of 13olctaceae. Sorne spccies of Sui/lus andFiiscoboletinm. Can. J. Bot. 4./:1371-1392.

Pantidou, M., R. Watlingy Z. Gonou, 1983. Mycelial characters, anamorphs, and teleomorphs in genera and species of various families of agaricales in culture. Mycotaxo11 17: 409-432.

Pérez-Silva, E., 1967. Les Inocybes du Mexique.An. Inst. Bio/. Universidad Nacional Autónoma de México. 38, Ser. Bot. (1):1-60.

l'eyronel, B., B. Fassi, A. Fontana y J. M. Trappe, 1969. Terminology of mycorrhizae. Mycologia 61(2):410-411.

134

Pitt, J. !., 1979. 771e genm Penicillium and its te/eomorp/1ic srates Eupe11icilli11111 ami Ta/aromyces. Academic Press. Londres. pp. 24-41.

Powell, C. L., 1982. Mycorrhizae. En: Erperime11tal Microbio/ Ecology. R. C. Burns y J. lvl. Slater (Eds.). Illacl..>vell Scientiflc Publícations, Londres. PI" 447-471.

Reíd, C. P. P. y E. Hacskaylo, 1983. Evaluation of plant response to inoculation 13. Environmental variables. En: Metlwds mu/ Principies of !vfycorrhizal Research. N. C. Schenck (Ed. ). pp. 175-177.

Robinson, R. K., 1967. Modem Bio/ogy Series. Ecology of Fungí. Thc Englísh Universities Press. Londres. pp. 66-74.

Rojas, R. F. E., 1984. Aná/Lsir del crecimiento de plántulas de 10 especies del género Pinus bajo tres condiciones edáftcas y dos regímenes de humedad. Tesis de Maestría. Colegio de Posgraduados, Cha pingo. México. 92 pp.

Russell, S. G., 1961. 171e Pines of Mexico. Publisher Arnold Arboretum. No.1. Boston. 20-24 pp.

Rzendowski, J. L. y G. Vela, 1977. Algunas consideraciones acerca de la dinámica de los bosques de coníferas en México. Cie11cia Forestal 25: 15-35.

Sánchez, C. L., E. Beltrán, A. S. Pineda, R. Garduño y O. Y{1ñez, 1979. l.a Reforestación en el D. F. fin de la primera. Etapa. IMRNR, México. 55: 59 pp.

Sánchcz, L. R. de J., 1980. Programa de reforestació11 e11 las arcas rurales forestales me.ricaua: tres casos de uso intem;ivo de mauo de obra. (Allleproyecto ). Tesis profesional. Facultad de Economía. UNAM. México. pp. 28-34.

Sánchez, M. J., 1967. Co11trib11ció11 al conocimiemo de la ecología de los bosques de oyamel Abies religiosa (H. B. K.) Scltl. et Clwm e11 el Valle de México. Secretaría de Agricultura y Ganadería. Subsecretaría Forestal y Fauna. JNIF. México. 20 pp.

Sass, J. E., 1928. Botanical Microteclmique. Thc lowa State College Press, Ames, Iowa. pp. 76.

Siguenza, L. C., 1988. Componamie11to y caracterización de algunos Basidiomycetes y sus relaciones simbióticas y micoparasfticas. Tesis profesional. Universidad Autónoma de Chapingo. México. 105 pp.

135

Singcr, R., 1986. 77ie Agaricalcs in Modem T<Lro11omy. Koeltz Scientific Books. R. A. Alemania. pp. 595-617.

Schcnck, N. C. (Ed.), 1982. Me1hodsa11dpri11ciplesofmycorrhiwl rescarch. American Phytopathological Socicty. St. Paul, Minn. EUA. 244 pp.

Smith, A. H. y S.M. Zcller, 1966. A prcliminary account ofthc north american specics of Rlrizopogon. Mcmoirsoftlre New York Bo1m1ica/ Gardc11. J.1(2): 1-178.

Smith, D. y A. H. S. Onions, 1983. Tl1e Prcscrvatio11 ami Mai11tc11a11cc o/ Li1·i11g Fungí. Commonwcallh Mycological Jnstitutc. CAB Inglaterra. 51 pp.

Soto-Velazco, C., L. Guzmán-Dávalos y O. Rodríguez, 1989. Cultivo del hongo comestible Pleurotus ostrcatus sobre bagazo de maguey tcquilero fermentado y mezclado con paja de trigo. Rev. Mex. Mic. 5:97-101.

Spurr, S. H. y B. V. Bnrnes, 1980. Ecología Foresta/. AGT Et!. México. pp. 1-8, 222-224.

Stack, R. W. y W. A. Sinclair, 1975a. Preservation of Laccaria /accata basidiosporcs as inoculum far mycorrhizal synthcsis. Proc. Am. Phytopallw/. Soc. J: 110.

Stack, R. W. y W. A. Sinclair, 1975b. Protection of Douglas-fir seedlings against Fmarium root rot by a mycorrhizal fungus in the absence of mycorrhiza formation. Phytopallr. 65: 468-472.

Stack, R. W., W. A. Sinclair y A. O. Larsen, 1975. Preservation of basidiospores of Laccaria /accata far use as mycorrhizal inoculum. Mycologia 67(1): 167-170.

Sylvin, D.M. y W. A. Sinclair, 1983. Suppresive influence of Laccaria lacea/a on Fusarium oxysponim nnd on Douglas-fir seed!ings. Phytopat/1. 73: 384-389.

Takacs, E. A., 1967. Producción de cultivos puros de hongos micorrizógenos en el Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias, Castelar. INDIA. Suppl. For. 4:83-87.

Taylor, A. F. S. y l. J. Alexander, 1989. Ectomycorrhizal synthesis with an isolatcd of R11ss11/a aeniginea. Mycol. Res. 92(1 ):103-107.

Thiers, H. D., 1975. Califomia MJ1Shrooms, ajieldguide to tire Boletes. Hafner, Nueva York. pp. 173-216.

Thiers, H. D., 1979. The genus Suillm in the Western United States. Myco/ogia 9:285-286.

136

Trappe, J. M., 1962. Fungus associates of cctotrophic mycorrhizac. Bot. Re1•. 28: 538-606.

Trappe, J. M., 1967. Studics on Cenococcum gra11iforme J. An efficienl mcthod for isolalion from sclerolia. Can. J. Bot. 47: 1389-1390.

Trappe, J. M., 1977. Sclection of fungi far ectomycorrhizal inoculation in nurserie>.Amw. Rev. Phytopathol. / 5:203-222.

Trappe, J. M. y R. F. Strnnd, 1969. Mycorrhizal dcficiency in a Douglas-fir rcgion nursery. Fores/ Sci.15:381-389.

Toledo, V.M., 1988. la diversidad biológica de México. Ciencia y Desarrollo 81( 14):17-30.

Ulloa, M. y T. Herrera, 1967. Factores que iníluyen en el crecimiento de los micelios de Psilocyhc mexicana (Heim) y Psilocybe cubensis (Earle) Sing.A11. In.rt. Biol. Universidad Nacional Autónoma. México. 38, Ser. Bot.(1):165-192.

Ulloa, M. y R. T. Hanlin, 1978.Atlas de Micología Básica. Ed. Concepto. México. pp. 9-23.

Turncr, P. D., 1962. Morphological intluence of exudates of mycorrhizal and non-mycorrhizal fungí on cxcised root cultures of Pinus sy/vestris L. Nature 192: 551-552.

Valdés, M., 1986. Survival and growth of pines with spccific ectomycorrhizae after 3 years on a highly eroded site. Can. J. Bol. 64: 885-888.

Valdés, M., F. Piña y R. Grada, 1983. Inoculación micorrícica y crecimiento de plántulas de pino en suelo erosionado. Bol. Soc. Mex. Mic. 18: 65-70.

Vela, G. L., 1980. Contribución a la ecología de Pi11us pa!ll/a. IN!F. México. Pub!. &-p. 19; 109pp.

Veliz, A. F. A., 1982. Caracterizació11 de 22 cepas de hongos basidiomycetes ca11sa11tes de pudrición en la madera. Tesis profesional. ENEP. lxtacala. UNAM. México. 109 pp.

Verduzco, G. J., 1953. Las causa> de la reforestación e11 México. Secretaría de Recursos Forestales y de Caza. México. pp. 39-48.

Vozngakovskaya, Y. M. y A. S. Ryzkova, 1958. Mass culture of mycorrhiza-forming fungí in laboratory conditions. Tr. féres. Nauc/1.-Jssled. lnst. Sel's Kokhoz. Mikrobio/. 15:164.

137

Vou.o, J. A. y E. Hackskaylo, 1971. lnoculation of Pi1111s caribea with cctomycorrhizal fungi in Puerto Rico. Forest Sci. 17:239-245.

Warcup, J. H. y P. H. l3. Talbot, J 966. Perfcct statcs of some Rhizoctonias. Trans. Hrit. Myco/og. Soc. 49:427-435.

Warcup, J. H., J 975. Factors affecting symbiotic gcrmination of orchid seed. En: E11domycorrhi:rL1. F. E. Sanders, l3. Mosse, y P. l3. Tinkcr (Eds.). Academic Prcss, Nueva York. pp. 87-104.

Warrington, S. J., H. D. Black y L. l3. Coons, 1981. Entry of Pisolitlzus ti11ctorius hyphae inlo Pinus taeda roots. Ca11. J. Bot. 59:2135-2139.

Walling, R., 1981. How to ide11tify m1L<hrooms to genus V. Cultural and de1•clopmc11tal features. Mad Rivcr Press, !ne., Eureka, California. 169 pp.

Wilcox, H. E., 1983. Morpholob'Y and Devclopmcnt of ecto· and cctendomycorrhizac. En: Metlwds and Principies of Mycorrhizal Research. N. C. Schenck (Ed.). The Amer. Phytopatho!. Soc. Minn. pp. 103-105.

Wi!dc, S. A., 1968. Mycorrhizae and Tree Nutrition. Bio Sciencc. 18(6): 482-503.

Zak, B. y D. H. Marx, 1964. Iso!ation of mycorrhizal fungi from raots of individual slash pine. Forest Sci.10:214.

Zak, B., 1969. Four Poria terrestris (PC ex Fries) Sacc. strains mycorrhizal with roots of Douglas-fir.Abstr. lltlz lnt. Bol. Congr. pp. 247.

Zak, B., 1971. Characterization and classification ofmycorrhizae ofDouglas·fir. ll Pseudotsuga menziesii + Rhiwpogon vinico/or. Can. J. Bot. 49: 1079-1084.

Zak, B., 1973. Classification of cctomycorrhizac. En: Ectomycorrhizae 711eir Eco/ogy and Physio/ogy. G. C. Marks y T. T. Kozlowski (Eds.). Academic Press, Nueva York. pp. 43-78, 91-112.

138