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TA Cloning ® Kit
双启动子双启动子双启动子双启动子 (pCR®II)
货号货号货号货号 K2050-01, K2050-40, K2060-01, K2060-40, K2070-20, K2070-40，，，，CK2070-20 和和和和 CK2070-40
ii
iii
目目目目 录录录录
目 录............................................................................................................................ iii
重要信息..............................................................................................................................v
附属产品.......................................................................................................................... viii
介介介介 绍绍绍绍 .......................................................................................................................................1
概述......................................................................................................................................1
方方方方 法法法法 .......................................................................................................................................2
实验概要..............................................................................................................................2
PCR产物制备 .....................................................................................................................3
克隆到 pCR®II .....................................................................................................................4
转化感受态细胞..................................................................................................................5
转化子分析..........................................................................................................................7
故障诊断与排除..................................................................................................................8
附附附附 录录录录 .....................................................................................................................................11
进行自连反应....................................................................................................................11
进行对照反应....................................................................................................................12
添加 3´ A尾 .......................................................................................................................14
配 方................................................................................................................................15
pCR®II图谱和特征 ...........................................................................................................16
技术服务............................................................................................................................18
购买者须知........................................................................ Error! Bookmark not defined.
产品质量............................................................................................................................20
参考文献............................................................................................................................21
iv
v
重要信息重要信息重要信息重要信息
试剂盒种类试剂盒种类试剂盒种类试剂盒种类 本说明书适用于以下试剂盒。
试剂盒名称试剂盒名称试剂盒名称试剂盒名称 数量数量数量数量 货号货号货号货号
TA Cloning®双启动子试剂盒 20个反应
40个反应
K2070-20
CK2070-20
K2070-40
CK2070-40
TA Cloning®双启动子试剂盒含 One Shot® INVαF´ 化学 E. coli感受态
20个反应
40个反应
K2050-01
K2050-40
TA Cloning® 双启动子试剂盒含 One Shot® TOP10F化学 E. coli感受态
20个反应
40个反应
K2060-01
K2060-40
保存说明保存说明保存说明保存说明 TA Cloning®双启动子试剂盒用干冰运输，包含有一盒 TA Cloning®试剂（盒 1），一
盒 One Shot®化学感受态菌（盒 2），货号 K2070-20，CK2070-20，K2070-40和CK2070-40不包括 One Shot®化学感受态菌。
盒盒盒盒 1保存在保存在保存在保存在-20非除霜冰箱中非除霜冰箱中非除霜冰箱中非除霜冰箱中，，，，盒盒盒盒 2保存在保存在保存在保存在-80。。。。
下页待续
vi
重要信息重要信息重要信息重要信息，，，，续前续前续前续前页页页页
TA Cloning ®
试剂试剂试剂试剂 TA Cloning® 试剂(盒 1) 中的试剂列表如下。注意：用户必须提供 Taq 聚合酶。40个反应的试剂盒以两个 20反应的试剂盒形式提供。
盒盒盒盒 1需保存在需保存在需保存在需保存在-20。。。。
组份组份组份组份 组成组成组成组成 数量数量数量数量
pCR®II, 线性化的 25 ng/µl in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5
5 x 10 µl
10X PCR 缓冲液 100 mM Tris-HCl, pH 8.3 (at 42°C)
500 mM KCl
25 mM MgCl2
0.01%明胶
100 µl
10X连接缓冲液 60 mM Tris-HCl, pH 7.5
60 mM MgCl2
50 mM NaCl
1 mg/ml 牛血清白蛋白
70 mM β-巯基乙醇
1 mM ATP
20 mM二硫苏糖醇
10 mM亚精胺
100 µl
dNTP Mix 12.5 mM dATP
12.5 mM dCTP
12.5 mM dGTP
12.5 mM dTTP
(调节至 pH 8.0)
10 µl
T4 DNA 连接酶 4.0 Weiss 单位/µl 25 µl
无菌水 高压灭菌的去离子水 1 ml
对照 DNA模板 0.1 µg/µl溶于 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5
10 µl
对照 PCR引物 各 0.1 µg/µl 溶于 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5
10 µl
下页待续
vii
重要信息重要信息重要信息重要信息，，，，续前续前续前续前页页页页
One Shot ® 试剂试剂试剂试剂 下表列出了 One Shot®感受态细胞试剂盒中包含的组份。货号 K2070-20,CK2070-20,
K2070-40和 CK2070-40不不不不含感受态细胞。40个反应的试剂盒以两个 20反应的试剂盒形式提供。
TOP10F细胞的转化效率是 1 x 109 cfu/µg DNA。INVαF´细胞的转化效率是 1 x 108 cfu/µg DNA。
在在在在-80ºC保存感受态细胞保存感受态细胞保存感受态细胞保存感受态细胞。。。。
组组组组份份份份 组成组成组成组成 数量数量数量数量
S.O.C. 培养基
(可以保存在室温或者+4ºC)
2% 胰蛋白胨
0.5% 酵母提取物
10 mM NaCl
2.5 mM KCl
10 mM MgCl2
10 mM MgSO4
20 mM 葡萄糖(右旋糖)
6 ml
INVαF´ 或 TOP10F´ 细胞 -- 21 x 50 µl
pUC19对照 DNA 10 pg/µl溶于 5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8
50 µl
INVααααF´的基因型的基因型的基因型的基因型 F´ endA1 recA1 hsdR17 (rk-, mk
+) supE44 thi-1 gyrA96 relA1 φ80lacZ∆M15 ∆(lacZYA-
argF)U169 λ-
TOP10F´的基因型的基因型的基因型的基因型 F´ [lacIq Tn10 (TetR)] mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆lacΧ74 recA1
araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
viii
附属产品附属产品附属产品附属产品
附加产品附加产品附加产品附加产品 可以单独从 Invitrogen购买的 TA Cloning®试剂盒提供的试剂以及其他适合与该试剂盒
配合使用的产品。订货信息参见下表。
项目项目项目项目 数量数量数量数量 货号货号货号货号
Platinum® Taq DNA聚合酶 100个反应 C10966-018
250个反应 C10966-026
500个反应 C10966-034
5000个反应 C10966-083
Platinum® Taq DNA 高保真聚合酶 100单位 C11304-011
重组 Taq DNA 聚合酶 100单位 10342-053
500单位 10342-020
PureLink™ HQ质粒小量提取试剂盒 100个反应 K2100-01
IPTG 1 g 11529-019
X-gal 100 mg 15520-034
1 g 15520-018
Bluo-gal 1 g 15519-028
卡那霉素 5 g 11815-024
25 g 11815-032
氨苄青霉素 200 mg 11593-019
One Shot ®
感受态感受态感受态感受态
细胞细胞细胞细胞 E. coli感受态细胞可以从 Invitrogen单独购买，感受态细胞以方便使用的 One Shot®形式提供。
项目项目项目项目 数量数量数量数量 货号货号货号货号
One Shot® INVαF´ 化学 E. coli感受态 20个反应 C2020-03
40个反应 C2020-06
One Shot® TOP10F化学 E. coli感受态 20个反应 C3030-03
40个反应 C3030-06
One Shot® TOP10化学 E. coli感受态 20个反应 C4040-03
40个反应 C4040-06
One Shot® Mach1™-T1R化学 E. coli感受态 20个反应 C8620-03
介介介介 绍绍绍绍
概述概述概述概述
目目目目 的的的的 含有 pCR®II 的 TA Cloning® 双启动子试剂盒提供把 PCR产物直接插入质粒载体的一
步法快速克隆策略。T7和 Sp6启动子允许在体内或体外转录插入片段的正向和反向产物。
优优优优 点点点点 使用 TA Cloning® 双启动子试剂盒可以:
• 免除对 PCR产物的任何酶切修饰
• 不需要 PCR引物中包含限制性内切酶位点
• 可以双向转录插入片段
TA Cloning ® 的工的工的工的工作原理作原理作原理作原理
Taq聚合酶具有非模板依赖性向 PCR产物的 3´末端加单个脱氧腺苷(A)的活性。试剂盒中提供的线性化载体的末端具有一个 3´脱氧胸苷(T)残基。这样就使得 PCR产物可以有效的连接到载体上。
图图图图 示示示示 下图表示了 TA Cloning®方法的概念。
3'5'
5'3'
3'5'
5'3'
PCRProduct
AA
T
T Vector
Vector
热稳定性聚合酶具有较强的 3´到 5´核酸外切酶活性，例如 Platinum® Pfx，它并不会在PCR产物的末端保留 3´ A尾。因为使用 Taq聚合酶产生的 PCR产物的 3´ A外延残基没有被去除掉，所以可以被高效率的连接到 TA Cloning®系统。但是如果您使用保真
酶或者希望克隆平末端片段，您可以在 PCR循环之后加入 Taq并孵育以便在产物末端加上 3´ A尾巴。参见第 14页的步骤。
或者您可以尝试使用 Zero Blunt® PCR克隆试剂盒(货号. K2700-20和 K2750-20)。这个试剂盒可以高效克隆从热稳定的保真酶得到的平末端 PCR产物。请访问我们的网站了解更多信息(www.invitrogen.com)，或者联络技术服务（第 18页）。
方方方方 法法法法
实验概要实验概要实验概要实验概要
介介介介 绍绍绍绍 为了把您感兴趣的基因克隆到 pCR®II，首先需要获得 PCR产物。PCR产物连接到
pCR®II 之后转化感受态细胞。因为 PCR产物连接到载体上的方向有两种，还需要分析每个单克隆的基因插入方向。正确的重组质粒可以被用于后续的分析或者亚克隆。
流程图流程图流程图流程图 下表列出了把目的基因克隆到 pCR®II 的主要必须步骤。
步骤步骤步骤步骤 操作操作操作操作 页码页码页码页码
1 用 Taq聚合酶和您自己的引物模板及参数扩增 PCR产物。 3
2 把您的 PCR产物连接到 pCR®II。 4
3 用您的连接产物转化 E. coli感受态细胞。 5-6
4 选择转化子并提取质粒 DNA。用限制性内切酶酶切或者测序的方法分析质粒 DNA中是否插入 PCR产物与否及其插入方向。
7
RECO
MMEND
ATION
如果您是第一次使用 TA Cloning® 双启动子试剂盒，我们建议您使用对照反应帮助评估实验结果(见第 11-13页).
PCR产物制备产物制备产物制备产物制备
PCR指导指导指导指导 一般 10-100 ng DNA足够用于作为 PCR的模板。如果用 cDNA作为模板，需要根据
您感兴趣基因的相对丰度决定模板的用量。为了提高连接反应效率，我们建议扩增不
要超过 30个循环。
需要用需要用需要用需要用户提供的材户提供的材户提供的材户提供的材
料料料料 您将要需要如下试剂和器材。
• PCR所需的 DNA模板和引物
• Taq聚合酶和合适的 10X PCR缓冲液(参见第 viii 页的订货信息)
• 热循环仪
混合聚合酶混合聚合酶混合聚合酶混合聚合酶 如果您希望使用 Taq聚合酶和保真酶的混合酶体系，为了确保 PCR产物有 3´ A尾
巴，Taq必须以 10:1的比例过量。我们推荐使用 Invitrogen 的 Platinum® Taq DNA高保真聚合酶(参见第 viii 页的订货信息)。
如果您使用的混合聚合酶中的 Taq聚合酶不足，保真酶，请参见第 14页的步骤在产物末端加上 3´ A尾。
PCR产物制备产物制备产物制备产物制备 在含有如下试剂的 50µl体系中进行 PCR反应:
DNA 模板 10-100 ng
10X PCR 缓冲液 5 µl
50 mM dNTPs 0.5 µl
引物 各 1 µM
无菌水 加至体积为 49 µl
Taq 聚合酶 1 unit
总体积 50 µl
胶纯化胶纯化胶纯化胶纯化 如果您的 PCR没有获得单一的，可分辨的条带，您可能需要在进行下一步之前对您
的片段进行胶纯化。请小心操作，尽量避免核酸酶的污染和长时间暴露在 UV下。另外一个办法是您可以优化 PCR条件，避免多条带或拖尾(Innis et al., 1990)。Invitrogen 提供的 PCR Optimizer™ 试剂盒可以帮您优化 PCR反应。需要更多信息请联系技术服务(第 18页)。
克隆到克隆到克隆到克隆到 pCR®II
RECO
MMEND
ATION
为了提高连接效率，我们建议使用新鲜（小于 1天）的 PCR产物。PCR产物末端单个3´ A尾会随这时间的延长而降解，从而降低连接效率。
操作 pCR®II 时需要小心，因为丢掉 3´ T外延残基将导致载体平末端自连，从而降低连接效率。
PCR产物用量的计产物用量的计产物用量的计产物用量的计
算算算算 用下面的公式计算与 50 ng (20 fmoles) pCR®II 载体连接的 PCR产物的用量:
X ng PCR 产物 = (Y bp PCR 产物)(50 ng pCR®II 载体) (pCR®II 载体的片段长度 bp: ~3900)
X ng是长度为 Y个碱基对的 PCR产物与载体以 1:1 (载体:插入片段)的摩尔比连接时的
用量。
一般 0.5 到 1.0 µl平均长度(400-700 bp)的常规 PCR样品可以满足 1:1(载体:插入片段)的比例。1:1(载体:插入片段)的比例可以得到最好的连接效率。如果您担心您的 DNA浓度的准确性，可以用 1:3(载体:插入片段)的比例进行第二次连接反应。
不要使用超过 2-3 µlPCR样品进行连接反应，因为 PCR样品中的盐会抑制 T4 DNA连接酶。
连接反应温度低于或者超过 14°C可能会降低连接效率。
步步步步 骤骤骤骤 1. 根据 PCR产物的用量（参照上述方法）确定 PCR样品的用量。如有必要可以用
无菌水稀释 PCR样品。
2. 建立如下 10 µl连接反应体系:
新鲜 PCR产物 X µl
10X连接缓冲液 1 µl
pCR®II 载体 (25 ng/µl) 2 µl
无菌水 加至体积为 9 µl
T4 DNA 连接酶 (4.0 Weiss 单位) 1 µl
终体积 10 µl
3. 连接反应体系在 14°C孵育至少 4小时（过夜更好）。进行下一步，转化感受态细转化感受态细转化感受态细转化感受态细
胞胞胞胞，见下一页。
注释注释注释注释：：：： -20°C保存您的连接反应体系，直到准备好进行转化实验。
转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞
介介介介 绍绍绍绍 当您已经把插入片段连接到 pCR®II，您就已经可以把载体转化进感受态 E. coli了。为
了方便转化，货号是 K2050-01, K2050-40, K2060-01, 和 K2060-40的试剂盒提供了 One Shot®细胞。本节提供了 One Shot®细胞的转化步骤。如果要转化其它感受态菌株，请参见厂家的说明。
INVαF´不表达不表达不表达不表达 lac抑制子。由于 pCR®II 有 lac启动子，您可以在不加 IPTG的条件下表达您的产物。IPTG不会对 INVαF´发挥任何作用。
TOP10F表达表达表达表达 lac抑制子(lacIq)，该抑制子将抑制 lac启动子的转录。如果要进行插入子的蓝白斑筛选，您必须在平板中加入 IPTG以表达 LacZα。
E. coli宿主菌株宿主菌株宿主菌株宿主菌株 您可以使用任何 recA, endA E. coli菌株，包括 TOP10, TOP10F´, INVαF´, DH5α™或者
其他相类似的菌株进行转化。其它的菌株也适合。请参见第viii页中的列表了解Invitrogen可以提供的感受态 E. coli。
使用感受态细胞使用感受态细胞使用感受态细胞使用感受态细胞 • 感受态细胞对温度和移液器造成的机械裂解很敏感。在操作感受态细胞的时候需
要非常温和。
• 在冰上溶解细胞以后立即开始转化。样品加入细胞以后用移液器枪尖温和搅拌混
匀。所有操作步骤尽可能保持细胞处于低温状态。
• 操作转化产物和铺板的时候使用无菌操作。
RECO
MMEND
ATION
如果您的 PCR产物扩增于具有氨苄青霉素抗性的质粒，请使用卡那霉素筛选 pCR®II转化子。使用卡那霉素筛选可以避免原始的带有氨苄青霉素抗性的质粒造成的污染。
需要用户提供的材需要用户提供的材需要用户提供的材需要用户提供的材
料料料料 除了常规微生物学实验所需材料（例如平板和涂菌器），您还需要提供以下试剂和
仪器。
• 适合转化的化学 E. coli感受态细胞
• S.O.C. 培养基 (预热到室温)
• 阳性对照, 可选 (例如 pUC19)
• LB 平板，含有 50 µg/ml 卡那霉素或者 100 µg/ml 氨苄青霉素 (每个转化给两个)
• 42°C 水浴锅
• 37°C 摇床和非摇动孵育箱
下页待续
转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞, 续前页续前页续前页续前页
准备转化准备转化准备转化准备转化 • 水浴锅预热平衡至 42°C。
• S.O.C.培养基置于室温。
• 如果您使用 INVαF´细胞，把带有抗生素的 LB培养基置于 37°C 30分钟。每板涂布 40 mg/ml 的 X-Gal 40 µl。让液体被平板吸收。
• 如果您使用 TOP10F细胞，把带有抗生素的 LB培养基置于 37°C30分钟。每板涂布 100 mM IPTG和 40 mg/ml X-Gal各 40 µl。让液体被平板吸收。
One Shot ® 转化步转化步转化步转化步
骤骤骤骤 按照以下步骤转化 One Shot®感受态细胞。转化其他菌株，请按照其生产厂家的说明进行。
1. 离心装有连接产物的管子并置于冰上。
2. 在冰中化冻 50 µl One Shot®感受态细胞，每个转化化冻一管。
3. 每个转化用移液器取 2 µl连接产物直接加入到感受态细胞中，用枪头温和搅拌混匀。
4. 在冰中放置 30分钟。剩余的连接体系可在-20°C中保存。
5. 在 42°C非振荡条件下热激细胞 30秒，之后把反应管立即置于冰中。
6. 每管加入室温的 S.O.C.培养基 250 µl。
7. 在 37°C摇床中，以 225 rpm的速度水平振荡 1小时。
8. 从转化反应管中取 10µl至 200 µl，涂布于含有 X-Gal和 50 µg/ml卡那霉素或者100 µg/ml氨苄青霉素的 LB平板。如果您使用的是 TOP10F细胞，确保平板含有IPTG。我们建议如果使用 TOP10F细胞，涂布 10-50 µl；如果使用 INVαF´细胞涂布 50-200 µl。
N注释注释注释注释：：：：确保涂布两个不同的体积，以保证至少有一个平板有可以分辨的菌落。如果需要涂布较小的体积，在菌液中加入 20 µl S.O.C.培养基以便均匀的涂布。
9. 37ºC过夜培养平板。把平板放置到+4°C显色 2-3小时。
Important
相对于其他 E. coli菌株，转化的 INVαF´过夜培养后菌落看起来很小。在挑克隆分析以前需要额外培养 2-3小时。
期期期期望的结果望的结果望的结果望的结果 对于 400-700 bp的插入片段，根据涂布的菌液量，您将得到每板 50-200个菌落。这些
在 X-Gal平板(INVαF´)或 X-Gal/IPTG平板(TOP10F´)上的菌落有 80%是白色的菌落。需要注意的是，连接效率与插入片段的大小有关，片段越大效率越低。
转化子分析转化子分析转化子分析转化子分析
分析阳性克隆分析阳性克隆分析阳性克隆分析阳性克隆 1. 挑取至少 10个白色单菌落进行质粒的提取和酶切分析。
2. 在 2-5 ml 含有 50 µg/ml卡那霉素或者 100 µg/ml氨苄青霉素的 LB培养基中过夜培养菌落。
3. 提取质粒，用酶切图谱或测序的方法分析片段的插入方向。我们建议使用PureLink™ HQ质粒小量纯化试剂盒纯化您的质粒 DNA（请参见第 viii 页的订货信息）。
插入片段测序插入片段测序插入片段测序插入片段测序 如果您需要对 pCR®II 中的插入片段测序，可以用 Sp6启动子引物或M13反向引物从
lac启动子方向测定插入片段序列。如果需要从 lacZα片段方向测定插入片段的序列，可以使用Τ7启动子引物或者M13(-20)正向引物。引物序列和引物结合位点请参见第16页的图谱。为了您的方便，Invitrogen提供引物合成服务。更多信息请浏览我们的网站(www.invitrogen.com)或联系技术服务(第 18页)。
Important
如果您没有获得转化子或者没有正确插入的克隆，请按照第 12-13页进行对照反应。这些反应将帮助您诊断和排除实验中的故障。参见第 8页的故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除部分了解
更多技巧。
长期保存长期保存长期保存长期保存 当您鉴定得到了正确的克隆，请纯化菌落并制备甘油菌以便长期保存。我们建议您
在-20°C保存一份质粒 DNA。
1. 用原始菌落在含有 50 µg/ml卡那霉素或者 100 µg/ml氨苄青霉素的 LB平板上划线。
2. 分离单菌落接种到含有 50 µg/ml卡那霉素或者 100 µg/ml氨苄青霉素的 LB培养基中。
3. 培养至平台期。
4. 混合 0.85 ml培养物和 0.15 ml无菌甘油，加入到冻存管中。
5. 在-80°C中保存。
故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除
介介介介 绍绍绍绍 如果您没有获得预期的结果，用下表诊断和排除您实验中的问题。我们推荐进行对照
反应（第 11-13页）帮助您评估您的实验结果。
问问问问 题题题题 原原原原 因因因因 解决办法解决办法解决办法解决办法
转化没有获得菌落 细菌不是感受态菌。 使用 One Shot® 试剂盒中的 pUC19对照载体检测转化效率。
平板的抗生素浓度不正确或者平板
太老。 使用 50 µg/ml卡那霉素或者 100 µg/ml氨苄青霉素。使用新鲜的氨苄青霉素
平板（<1个月）
白色菌落不含有插入片段 载体上的单 3´ T外延残基被降解。 使用另外一管载体。避免保存载体超
过 6个月，避免反复冻融。用自连反应检测载体，见第 11页。
大多数菌落为蓝色或浅蓝
色，白色菌落很少 插入片段没有破坏 lacZ基因的读码框。
如果您的插入片段较小(< 500 bp)，您可能得到浅蓝色菌落。分析蓝色的菌
落，它们可能含有插入片段。
使用的聚合酶不能加 3´ A尾。 不要使用保真酶，例如 Platinum® Pfx，因为它们不能加 3´ A尾。使用Taq聚合酶。
连接以前用胶纯化了 PCR产物。 胶纯化可以去除 3´ A尾。如果需要胶纯化，使用无核酸酶活性的试剂或者
优化您的 PCR反应条件。
连接反应以前 PCR产物已经保存了较长时间。
使用新鲜的 PCR产物。就算保存 1天也会减低反应效率。
连接体系中加入了过多扩增反应样
品。 PCR反应体系中的盐会抑制连接反应。在连接反应中使用不超过 2-3 µlPCR反应样品。
连接反应中使用错误的载体:插入片段摩尔比。
估计 PCR产物的浓度。建立载体:插入片段摩尔比为 1:1或 1:3的连接反应体系。
下页待续
故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除，，，，续前页续前页续前页续前页
问问问问 题题题题 原原原原 因因因因 解决办法解决办法解决办法解决办法
一些菌落为浅蓝色或外周白
色中间蓝色 lacZ的残留表达或者插入片段只部分破坏了 lacZ。
如果您需要小的插入片段，500bp或者更小，分析这些菌落，它们可能含
有插入片段。
白色菌落或者蓝色菌落大小
正常，但是围绕着一些小的
白色克隆
小克隆是氨苄青霉素敏感的卫星菌
落。不要挑小菌落因为它们不含有
质粒。
使用卡那霉素筛选。确保您的氨苄青
霉素的储液和平板都是新鲜的。
白色菌落在液体培养基中不
生长 氨苄青霉素敏感的卫星菌落 请挑取大的白色菌落。确保氨苄青霉
素新鲜。使用卡那霉素以避免这个问
题。
仅得到白色菌落 平板上没有 IPTG或 X-Gal。 蓝白斑筛选时确保加入 X-Gal，如果使用 TOP10F确保加入 IPTG和 X-Gal。
测序得不到结果 不小心使用了试剂盒中的扩增引物
进行测序。它们是用于制备对照
PCR产物的引物。
使用M13正向(-20)和反向引物测序。您也可以用 T7 或 Sp6启动子引物测定插入片段的序列。
使用的 T7引物序列不正确 检查 T7启动子引物，确保其序列和pCR®II 上的引物结合位点匹配。
没有 PCR产物 Taq聚合酶失活或者您的 PCR反应条件不佳。
按照第 11-13页进行对照反应，测试Taq聚合酶的活性。如果 Taq聚合酶活性正常，您将需要优化 PCR反应条件。
质粒产量低 细胞在 LB中生长不良。 尝试使用含有适当抗生素的 S.O.C.培养基。
下页待续
故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除，，，，续前页续前页续前页续前页
解读解读解读解读对照反应对照反应对照反应对照反应 下表说明了为了诊断和排除 TA Cloning®实验中的问题进行的对照反应和如果解释对
照反应的结果。
对对对对照反应照反应照反应照反应 解解解解 释释释释
自连反应 这个对照反应显示 pCR®II 是否丢失了 3´T外延残基。丢失 T外延残基导致平末端连接，破坏 lacZα的读码框。导致产生假白色菌落。一般情况下小于 5%的菌落是白色菌落。
转化对照 检测 One Shot®感受态细胞的转化效率。
INVαF′的转化效率应该为 1 x 108 cfu/µg DNA， TOP10F′的转化效率应该为 1 x 109 cfu/µg DNA。
PCR产物对照 检测包括 Taq聚合酶在内的 PCR试剂。
连接反应对照 检测连接反应试剂和 pCR®II。白色菌落应大于80%，并且含有插入克隆。
附附附附 录录录录
进行自连反应进行自连反应进行自连反应进行自连反应
介介介介 绍绍绍绍 TA Cloning®载体如果没有经过反复冻融在 6个月内是稳定的。载体储存超过这个时间
或者经过反复冻融将丢失 3´ T外延碱基，导致产生“假”阳性白色菌落。按照下面的步骤操作进行自连反应并转化 One Shot®感受态细胞。如果您使用其他 E. coli菌株，请参见其生产厂家的说明。
步步步步 骤骤骤骤 1. 如下建立 10 µl自连反应体系:
无菌水 6 µl
10X连接缓冲液 1 µl
pCR®II 载体 (25 ng/µl) 2 µl
T4 DNA连接酶 (4.0 Weiss 单位) 1 µl
总体积 10 µl
2. 14-15°C孵育过夜。短暂离心连接反应管，置于冰中。
3. 在冰中化冻 50 µl One Shot®感受态细胞，每个转化反应化冻一管。
4. 从上述第一步的对照连接体系中用移液器吸取 1 µl连接产物直接加入到感受态细胞中，用枪尖温和搅拌混匀。
5. 在冰中放置 30分钟。剩余的连接体系可在-20°C中保存。
6. 在 42°C非振荡条件下热激细胞 30秒，之后把反应管立即置于冰中。
7. 反应管中加入室温的 S.O.C.培养基 250 µl。
8. 反应管在 37°C摇床中，以 225 rpm的速度水平振荡 1小时。
9. 转化反应管中取 50 µl，涂布于含有 X-Gal和 50 µg/ml卡那霉素或者 100 µg/ml氨苄青霉素的 LB平板。如果您使用的是 TOP10F细胞，确保平板含有 IPTG。
10. 37ºC过夜培养平板。
期望的结果期望的结果期望的结果期望的结果 您将从涂布 50µl的平板上得到 5-25个蓝色菌落。由超螺旋 pCR®II 载体得到的白色菌
落少于 5%。随着时间的增加，3´ T外延残基将降解，导致载体平末端自连。这将导致 lacZ的移码突变，从而产生“假”白色或者浅蓝色不含插入片段的菌落。
进行对照反应进行对照反应进行对照反应进行对照反应
介介介介 绍绍绍绍 我们推荐您在第一次使用本试剂盒的时候进行对照反应以评估您的结果。进行对照反
应包括用试剂盒提供的试剂制备 PCR产物并用该产物进行连接反应。
制备对照制备对照制备对照制备对照 PCR产产产产物物物物
使用 Taq聚合酶和如下步骤扩增对照 PCR产物。
1. 建立如下 50 µl PCR反应体系:
对照 DNA 模板(100 ng) 1 µl
10X PCR 缓冲液 5 µl
50 mM dNTPs 0.5 µl
对照 PCR 引物 1 µl
无菌水 41.5 µl
Taq 聚合酶 (1 单位/µl) 1 µl
总体积 50 µl
2. 用 70 µl矿物油覆盖。
3. 按照下表的参数循环扩增:
步骤步骤步骤步骤 时间时间时间时间 温度温度温度温度 循环循环循环循环
变性 1分钟 94°C
退火 1分钟 55°C 25X
延伸 1分钟 72°C
终延伸 7分钟 72°C 1X
4. 从反应体系中取 10 µl用琼脂糖凝胶电泳分析。应该得到清晰的 700bp条带。继续按照下一页进行对照连接反应对照连接反应对照连接反应对照连接反应。
下页待续
进行对照反应进行对照反应进行对照反应进行对照反应，，，，续前页续前页续前页续前页
对照连接反应对照连接反应对照连接反应对照连接反应 使用前页获得的对照 PCR产物，按照下面的体系建立连接反应体系。一般 1 µl对照
PCR产物足够连接反应。或者您可以参见第 4页的公式估计与 50 ng pCR®II 连接所需的 PCR产物的量。
1. 如下建立 10 µl对照连接反应体系:
无菌水 5 µl
10X连接缓冲液 1 µl
pCR®II 载体(25 ng/µl) 2 µl
对照 PCR 产物 1 µl
T4 DNA 连接酶 1 µl
总体积 10 µl
2. 连接反应体系在 14°C孵育至少 4小时（过夜更好）。
3. 转化 1 µl 对照反应到一管 One Shot® 感受态细胞或者其他适合的感受态 E. coli菌株。
4. 每个转化取混合物 10-50 µl涂布到含有 50 µg/ml卡那霉素和 X-Gal的平板（如果使用 TOP10F细胞还要包含 IPTG）。
5. 37ºC过夜培养平板。
转化对照转化对照转化对照转化对照 含有 One Shot®感受态细胞的 TA Cloning® 试剂盒自带 pUC19质粒作为转化对照。按
照第6页的步骤，用 10 pg pUC19转化一管 One Shot®感受态细胞。在含有 100 µg/ml氨苄青霉素的 LB平板涂布 10 µl到 50 µl转化混合物。TOP10F的转化效率应该为 1 x 109 cfu/µg DNA，INVαF´的转化效率应该为 1 x 108 cfu/µg DNA。
期望的结果期望的结果期望的结果期望的结果 对照连接反应应该获得>80%的白色菌落。随着时间的增加，3´ T外延残基的降解将导
致背景白色菌落（没有插入片段）的增加。背景白色菌落的数量应该不超过 10%（参见第 11页的进行自连反应进行自连反应进行自连反应进行自连反应）。如果产生这种结果，使用另外一管 pCR®II 并避免反复冻融。
添加添加添加添加 3´ A尾尾尾尾
介介介介 绍绍绍绍 一般直接连接保真酶扩增的 DNA与 pCR®II 非常困难，因为其连接效率非常低。这是
由于保真酶具有 3´ 到 5´核酸外切酶活性，该活性可以去除 TA Cloning®所必需的 3´ A尾。Invitrogen开发了一种克隆平末端片段的简单方法。
如果您经常克隆平末端 PCR产物，我们推荐使用 Zero Blunt®PCR克隆试剂盒（货号K2700-20 和 K2750-20）克隆平末端产物。
需要用户提供的材需要用户提供的材需要用户提供的材需要用户提供的材
料料料料 您将需要提供以下试剂和仪器。
• Taq 聚合酶
• 平衡到 72°C的加热板
• 酚-氯仿
• 3 M 醋酸钠
• 100% 乙醇
• 80% 乙醇
• TE 缓冲液
步步步步 骤骤骤骤 1. 使用保真酶扩增以后，把反应管至于冰中，每管加入 0.7-1单位 Taq聚合酶。混
匀。不必更换缓冲液。
2. 72°C孵育 8-10 分钟（不要循环）。
3. 立即用等体积酚-氯仿抽提。
4. 加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠和 2X 体积的 100% 乙醇。
5. 最大速度室温离心 5分钟沉淀 DNA。
6. 去除乙醇，用 80%乙醇洗涤沉淀，空气中晾干。
7. 用与起始 DNA扩增反应的等体积 TE缓冲液溶解 DNA沉淀。现在 DNA扩增产物可以用于与 pCR®II 连接。
配配配配 方方方方
LB (Luria-Bertani) 培养基和培养基和培养基和培养基和
平板平板平板平板
配方配方配方配方: 1.0% 胰蛋白胨
0.5% 酵母提取物
1.0% NaCl
pH 7.0
1. 配制 1升培养基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物和 10 g NaCl，用950 ml去离子水溶解。
2. 用 NaOH调节 pH至 7.0，补齐体积至 1升。
3. 15 lbs./sq. inch.高压灭菌 20分钟，如果需要可以待冷却到 55°C加入适当的抗生素。
4. 室温或者+4°C保存。
LB 琼脂平板琼脂平板琼脂平板琼脂平板
1. 如上制备 LB培养基，不同的是高压灭菌以前加入 15 g/L琼脂。
2. 15 lbs./sq. in.高压灭菌 20分钟。
3. 高压灭菌以后，冷却到约~55°C ，加入抗生素(100 µg/ml氨苄青霉素或 50 µg/ml 卡那霉素)，倒 10 cm平板。
4. 等待平板凝固，+4°C倒置保存。
pCR®II图谱和特征图谱和特征图谱和特征图谱和特征
pCR®II图谱图谱图谱图谱 线性化的 pCR®II 载体如下图所示。箭头指示 T7 和 Sp6 RNA聚合酶的转录起始位点。
pCR®II 的全序列可以从我们的网站获得的全序列可以从我们的网站获得的全序列可以从我们的网站获得的全序列可以从我们的网站获得(www.invitrogen.com)，，，，您也可以联系技术服您也可以联系技术服您也可以联系技术服您也可以联系技术服
务务务务（（（（第第第第 18页页页页）。）。）。）。
CAG GAA ACA GCT ATG AC C ATG ATT ACG CCA AGC T AT TTA GGT GAC ACT ATA GAA
GTC CTT TGT CGA TAC TG G TAC TAA TGC GGT TCG A TA AAT CCA CTG TGA TAT CTT
M13 Reverse Primer Sp6 Promoter
AGT GAG TCG TAT TA C AAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA C AA CG T CGT GAC TGG GAA AAC
TCA CTC AGC ATA AT G TTA AGT GAC CGG CAG CAA AAT G TT GC A GCA CTG ACC CTT TTG
T7 Promoter M13 Forward (-20) Primer
TAC TCA AGC TAT GCA TCA AGC TTG GTA CCG AGC TCG GAT CCA CTA GTA ACG GCC
ATG AGT TCG ATA CGT AGT TCG AAC CAT GGC TCG AGC CTA GGT GAT CAT TGC CGG
Nsi I Hind III Kpn I Sac I Spe IBamH I
CCA TCA CAC TGG CGG CCG CTC GAG CAT GCA TCT AGA GGG CCC AAT TCG CCC TATGGT AGT GTG ACC GCC GGC GAG CTC GTA CGT AGA TCT CCC GGG TTA AGC GGG ATA
BstX I Not I Xho I Nsi I Xba I Apa I
f1ori
GCC AGT GTG CTG GAA TTC GGC T
CGG TCA CAC GAC CTT AAG CCG A
BstX I EcoR I
T A A GCC GAA TTC TGC AGA TATA T T CGG CTT AAG ACG TCT ATA
EcoR I
PCR Product
EcoR V
+1
P lac
Am
picillin
pU
Co
ri
Kanamycin
pCR®II
4.0 kb
lacZa ATG
lacZ
Comments for pCR®II
3971 nucleotides
LacZa gene: bases 1-587
M13 Reverse priming site: bases 205-221
Sp6 promoter: bases 239-256
T7 promoter: bases 404-423
M13 (-20) Forward priming site: bases 431-446
f1 origin: bases 588-1025
Kanamycin resistance ORF: bases 1359-2153
Ampicillin resistance ORF: bases 2171-3031
pUC origin: bases 3176-3849
下页待续
pCR®II图谱和特征图谱和特征图谱和特征图谱和特征，，，，续前页续前页续前页续前页
pCR®II的特的特的特的特征征征征 下表描述了 pCR®II 的特征。所有特征都经过功能验证。
特征特征特征特征 优点优点优点优点
lac启动子 让细菌表达 lacZα片段，用于α互补（蓝白斑筛选）。
lacZα片段 编码β−半乳糖苷酶的前 146个氨基酸。与Ω片段顺势互补可以用于β−半乳糖苷酶的蓝白斑筛选。
卡那霉素抗性基因 用于质粒在 E. coli的筛选和保存，克隆具有氨苄青霉素抗性的质粒作为模板的扩增产物时使
用。
氨苄青霉素抗性基因 用于质粒在 E. coli的筛选和保存。
pUC复制起始子 用于质粒在 E. coli中的复制，保持和高拷贝数。
Sp6启动子和引物结合位点 用于体内或体外转录正义 RNA。
用于插入片段的测序。
T7启动子和引物结合位点 用于体内或体外转录反义 RNA。
用于插入片段的测序。
M13正向(-20) 和 M13 反向引物结合位点
用于插入片段的测序
f1复制起始子 用于突变或单链测序中单链的获得。
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有限质保有限质保有限质保有限质保 Invitrogen致力于为我们的客户提供高品质的产品和服务。我们的目标是用我们的产
品和服务保证每个客户的 100%满意。如果您对Invitrogen的产品或服务有任何疑虑，请联系我们的技术服务代表。
Invitrogen保证我们所有的产品符合产品分析报告（COA）上的指标。公司将免费更换任何不符合这些指标的产品。Invitrogen这一保证仅限于相关产品的费用。保证不适于超过效期的产品。保证不应用于未按照说明书上的保存条件正确保存的产品。
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Invitrogen 不承担任何形式的连带损失包括但不限于特殊的不承担任何形式的连带损失包括但不限于特殊的不承担任何形式的连带损失包括但不限于特殊的不承担任何形式的连带损失包括但不限于特殊的，，，，偶然的偶然的偶然的偶然的，，，，间接的连带间接的连带间接的连带间接的连带
损失损失损失损失。。。。以上有限保证具有独立性和排他性以上有限保证具有独立性和排他性以上有限保证具有独立性和排他性以上有限保证具有独立性和排他性。。。。我们不做任何其他的保证我们不做任何其他的保证我们不做任何其他的保证我们不做任何其他的保证，，，，无论是直接无论是直接无论是直接无论是直接
表达的表达的表达的表达的，，，，暗示的保证还是任何商业利益的暗示的保证还是任何商业利益的暗示的保证还是任何商业利益的暗示的保证还是任何商业利益的，，，，特殊目的的保证特殊目的的保证特殊目的的保证特殊目的的保证。。。。
产品质量产品质量产品质量产品质量
限制性酶切限制性酶切限制性酶切限制性酶切 为了进行质量鉴定，酶切起始的超螺旋 pCR®II 质粒 TA接头之前的限制性酶切位
点。酶切后用琼脂糖凝胶电泳分析，条带必须正确。
克隆效率克隆效率克隆效率克隆效率 载体制备好之后，用试剂盒提供的对照试剂进行批次质量分析。用第 11-13页的方
法，把 750bp的对照 PCR产物连接到 pCR®II，转化试剂盒中的 One Shot® 化学感受态。为了满足质量要求，必须符合以下质量标准:
• 自连：< 5%白色转化子
• PCR产物连接：> 80%白色转化子
• 克隆效率: > 90%白色转化子含有插入正确PCR产物的 pCR®II
引引引引 物物物物 两个引物都已经通过批次质量鉴定，质量鉴定使用二缩酚酸链终止技术 DNA测序
的方法。
One Shot ®
化学感化学感化学感化学感
受态受态受态受态 E. coli 所有的感受态细胞按照以下内容进行质量鉴定:
• 用试剂盒中提供的质粒检测感受态细胞的转化效率。转化产物涂布到含有 100 µg/ml氨苄青霉素的 LB平板，计算感受态效率。测试重复进行。转化效率需要达到以下标准:
INVαF´ 1 x 108 cfu/µg DNA
TOP10F´1 x 109 cfu/µg DNA
• 为了验证没有噬菌体污染，在 LB顶层琼脂中加入 0.5-1 ml感受态细胞，铺到LB平板上。过夜培养之后，应该检测不到空斑。
• 未转化的细胞铺到含有 100 µg/ml氨苄青霉素，25 µg/ml链霉素，50 µg/ml卡那霉素或 15 µg/ml氯霉素的 LB平板，验证细胞不含有抗生素抗性污染。
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