Embed Size (px)
Citation preview
SYPHILIS Ab ELISA
KAPDSI
SYPHILIS Ab ELISA EN
04.02.2019 2/12 version 2
CONTENT
1 Introduction ..................................................................................................... 3
2 Test Principle.................................................................................................... 3
3 Materials Provided ........................................................................................... 4
4 Other Material Required for Manual Test Performance ................................... 5
5 Storage and Stability ........................................................................................ 5
6 Preparation of Reagents ................................................................................... 5
7 Assay Procedure ............................................................................................... 6
8 Working Schedule ............................................................................................ 7
9 Quality Control ................................................................................................. 8
10 Results Interpretation ...................................................................................... 8
11 Safety Precautions ........................................................................................... 9
12 Procedural Notes............................................................................................ 10
SYPHILIS Ab ELISA EN
04.02.2019 3/12 version 2
Enzyme immunoassay for the detection of total antibodies to Treponema pallidum in human serum or plasma
1 Introduction Syphilis (lues) is a sexually transmitted disease caused by the spirochete bacterium Treponema pallidum subsp. pallidum. The primary route of transmission is through sexual contact. However, in approximately 5-10% of cases the infection is transmitted in different way (congenitally from mother to child, rarely by contact with infected blood or skin lesions).
Syphilis proceeds in the following characteristic stages:
Primary syphilis – 2 or 4 weeks after exposure a hard painless ulcer appears at the point of infection. The ulcer disappears spontaneously after 4 to 6 weeks. Secondary syphilis – the infection spreads in the bloodstream. Skin lesions – exanthema (rash) and highly infectious condylomata lata – are characteristic for this stage of the disease. Lymph nodes are swollen. Later the disease moves to the latent asymptomatic stage. The latent stage can last for years. Tertiary syphilis – severe skin lesions occur. Various organs (heart and cardiovascular system, eyes, central nervous system and spinal cord) may be damaged. The disease may also be transmitted from mother who suffers from primary or secondary syphilis to foetus during pregnancy or at birth. This may result in abortion or child infection (congenital syphilis).
SYPHILIS Ab ELISA kit is intended for qualitative detection of anti-treponemal antibodies of all classes. The kit is suitable only for determination of antibody presence in a tested sample but not for antibody level monitoring. SYPHILIS IgM and IgG ELISA kits (DIAsource ImmunoAssays S.A) are more appropriate for quantitative determination of antibody level.
2 Test Principle
The kit is intended for the detection of anti-treponemal antibodies in a sample by means of a one-step sandwich type of the EIA method (i.e. a solid phase coated with specific antigens – antibody from the analysed sample – conjugate, i.e. specific antigens of Treponema pallidum conjugated with horseradish peroxidase). Peroxidase activity is determined in the test by a substrate containing TMB. Positivity is indicated when blue colour appears; after stopping solution has been added, blue changes to yellow. The yellow colour intensity is measured by a photometer at 450 nm, and it is proportional to the concentration of specific antibodies in the sample.
Antigen used
Selected parts of the specific antigens of Treponema pallidum, particularly p17, p47, p41 and p15
SYPHILIS Ab ELISA EN
04.02.2019 4/12 version 2
3 Materials Provided
Microtiter Plate 1 pc
coated with antigen, 12 x 8 breakable wells in bag with desiccant
Negative Control 1 × 2 ml
Solution containing no specific human antibodies, ready to use
Positive Control 1 × 2 ml
Solution containing specific human antibodies in cut-off concentration, ready to use
Conjugate 1 × 8 ml
Solution containing specific peroxidase labelled Treponema pallidum antigens, ready to use
TMB Solution 1 × 15 ml
Chromogenic substrate solution containing
TMB/H2O2 ready to use
Wash Solution 1 × 75 ml
20× concentrated buffer
Stop Solution 1 × 15 ml
Acid solution, ready to use
Instructions for use 1 pc
SYPHILIS Ab ELISA EN
04.02.2019 5/12 version 2
4 Other Material Required for Manual Test Performance
Single and multichannel pipettes
Disposable tips
Microplate washer
Timer
Incubator (37°C)
Microplate reader
5 Storage and Stability
Store the kit at +2°C to +8°C. Do not freeze. If the kit is stored as described, the labelled expiration date is valid. The expiration date is indicated on the package. The opened kit should be used within three months.
Sample Preparation and Storage
The following human body liquids can be used for testing: serum and citrate plasma. Anticoagulants in the plasma (except for citrate) as well as bacterially contaminated, haemolytic or chylous samples can affect the test results.
Samples can be stored at +2°C to +8°C for one week. For a longer period, store samples at -20°C. Diluted samples should be used as soon as possible.
6 Preparation of Reagents
Dilute the Wash Solution 1:20 (1 part of solution and 19 parts of distilled water); e.g. 75 ml of the concentrated Wash Solution + 1425 ml of distilled water.
Salt crystals might develop in the bottle with the concentrated Wash Solution. Prior to use, it is necessary to dissolve the crystals by warming the bottle in a water bath. The diluted Wash Solution is stable at +2°C to +8°C for one week.
The Controls (positive, negative and CUT-OFF) are ready to use, do not dilute further!
The Conjugate is ready to use, do not dilute further!
TMB Solution is a one-component chromogenic substrate solution ready to use, do not dilute further!
Interchangeability of reagents
The Sample Diluent, TMB Solution and the Avidity Solution are interchangeable between some ELISA of DIAsource ImmunoAssays S.A., provided they have the identical numeric marking (e.g. Sample Diluent 2, Sample Diluent 3, etc.). Further information relative to this interchangeability can be requested to DIAsource ImmunoAssays S.A.
SYPHILIS Ab ELISA EN
04.02.2019 6/12 version 2
7 Assay Procedure
Allow all reagents to come to room temperature and mix well. If you do not use a whole microplate, return unnecessary strips into the bag with desiccant. Seal the bag tightly and store at +2°C to +8°C. Keep dry!
1. Dispense the controls and the undiluted samples according to the working schedule.
• Leave A1 well empty (blank).
• Pipette 50 µl of the Positive Control into 1 well.
• Pipette 50 µl of the Negative Control into 3 wells.
• Pipette 50 µl of the undiluted samples into the other wells.
• Pipette 50 µl of the Conjugate into all wells except A1 well.
• Mix thoroughly for 30 seconds (using a microplate shaker).
2. Cover the microplate with the lid and incubate at 37°C for 30 minutes.
3. Aspirate the content of the wells and wash 5× with the working strength Wash Solution. Fill the wells up to the edge. Finally, tap the inverted microplate thoroughly on an absorbent paper to remove solution remnants.
4. Pipette 100 µl of TMB Solution into all wells. Avoid contamination – see 13 Procedural Notes.
5. Cover the microplate with the lid and incubate at 37°C for 30 minutes. Keep out of light.
6. Stop the reaction by adding 100 µl of the Stop Solution in the same order and intervals as the substrate was added.
7. Read the colour intensity in wells against blank (A1 well) using photometer set to 450 nm. The absorbance should be read within 30 minutes after stopping the reaction. Clean the bottoms of the wells prior to measurement.
SYPHILIS Ab ELISA EN
04.02.2019 7/12 version 2
8 Working Schedule
BL TS 4
PC TS 5
NC
NC
NC
TS 1
TS 2
TS 3
A
B
C
D
E
G
H
F
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
BL Blank (empty well)
PC 50 µl
NC 50 µl
TS 1-x 50 µl Undiluted tested sample
SYPHILIS Ab ELISA EN
04.02.2019 8/12 version 2
9 Quality Control
The test is valid if:
The absorbance of blank is lower than 0.060.
BLANK < 0.060
The absorbance of the Negative Control is lower than 0.060.
< 0.060
The absorbance of the Positive Control is higher than 0.900.
> 0.900
10 Results Interpretation
Calculation of CUT-OFF
To calculate CUT-OFF, sum up the mean absorbance of the Negative Control and 0.170.
When calculating the mean absorbance of the Negative Control, eliminate a potential invalid value of the Negative Control and calculate the mean of remaining two values.
Calculation of Index of Positivity (IP)
Divide the absorbance of a tested sample by the absorbance of CUT-OFF calculated in the same test run:
SYPHILIS Ab ELISA EN
04.02.2019 9/12 version 2
Interpretation of the test results is described in Table 1.
Table 1 Interpretation of results
Index of Positivity (IP)
Evaluation
lower than 0.9 negative
0.9 to 1.1 borderline
higher than 1.1 positive
Examination of borderline samples, i.e. samples with Index of Positivity from 0.9 to 1.1, should be repeated from a new sample collected after 2 to 6 weeks regarding to the disease specifics.
Serological finding can be interpreted only in the context of results of other laboratory tests and patient clinical picture.
11 Safety Precautions
The kit is intended for in vitro diagnostic use only.
The sera used for controls were tested and found to be negative for HIV 1 and HIV 2, HBsAg, HCV. In spite of this fact, they still need to be handled as potentially infectious materials.
Some reagents contain sodium azide, which is a toxic compound. Avoid contact with skin.
The Stop Solution contains diluted acid solution. Avoid contact with eyes and skin.
It is necessary to observe the local safety rules and regulations.
For more information refer to Stop Solution MSDS.
First aid
In case of contact with eyes, flush with copious amount of water and seek medical assistance. In case of contact with skin and clothing, remove all the contaminated clothes. Wash the skin with soap and plenty of running water. In case of contact with solutions containing plasma or clinical samples, disinfect the skin. In case of accidental ingestion, flush the mouth with drinking water and seek medical assistance.
Remnants disposal
All the materials used for performing the test must be treated as potentially infectious due to the contact with biological materials. Therefore they need to be disposed together with biological waste.
SYPHILIS Ab ELISA EN
04.02.2019 10/12 version 2
Expired kit disposal
Disassemble the kit and dispose the components as biological material. Discard the packaging material as required by local regulations.
12 Procedural Notes
In order to obtain reliable results, it is necessary to strictly follow the Instructions for Use. Always use clean preferably disposable tips and glassware.
Microtiter Plate – in order to prevent water condensation on the surface of the microplate, always allow the bag with the microplate to warm up to room temperature before opening.
Wash Solution – use high quality distilled water for preparing the working strength Wash Solution.
Washing procedure – keep to the prescribed number of wash cycles and fill the wells to the upper edge. The soak time (i.e. interval between two different wash cycles during which the wells stay filled up with the Wash Solution) should be approx. 30-60 seconds.
TMB Solution – the vessel used for multichannel pipetting should not be used for other reagents. Do not return the surplus TMB Solution from the pipetting vessel into the vial.
Non-reproducible results might be caused by improper methodology as following:
• insufficient mixing of reagents and samples before use
• improper replacement of vial caps
• using the same tip for pipetting different reagents
• reagent exposure to excessive temperature; bacterial or chemical contamination
• insufficient washing or filling of the wells (the wells should be filled to the upper edge), improper aspiration of Wash Solution remnants
• contamination of the well edges with Conjugate or samples
• using reagents from different kit lots
• contact of reagents with oxidants, heavy metals and their salts
The kit might be used for sequential examinations. When preparing working strength solutions, use only the amount of reagents needed for the analysis.
The kit might be used in all types of automatic EIA analysers.
If necessary, DIAsource ImmunoAssays S.A. can offer a certified modification of the Instructions for Use for the specific type of analyser.
The producer cannot guarantee that the kit will function properly if the assay procedure instructions are not strictly adhered to.
SYPHILIS Ab ELISA EN
04.02.2019 11/12 version 2
SYPHILIS Ab ELISA EN
04.02.2019 12/12 version 2
Summary of SYPHILIS Ab ELISA Protocol
Step No. Symbol Test steps
1 Do not dilute samples
2 Pipette Controls and diluted samples – 50 µl
Blank = empty well
3 Pipette Conjugate – 50 µl
Blank = empty well, shaker 30 sec
4 Incubate at 37°C for 30 min
5 Aspirate and wash the wells 5×
6 Pipette Substrate (TMB Solution) – 100 µl
Including blank
7 Incubate at 37°C for 30 min
8 Pipette Stop Solution – 100 µl
Including blank
9 Read colour intensity at 450 nm
SYPHILIS Ab ELISA
KAPDSI
SYPHILIS Ab ELISA DE
04.02.2019 2/12 version 2
INHALT
1 Einleitung ......................................................................................................... 3
2 Testprinzip ....................................................................................................... 3
3 Bestandteile des Kits ........................................................................................ 4
4 Erforderliche, nicht im Kit enthaltene Geräte und Materialien, für die manuelle Durchführung ................................................................................................... 5
5 Lagerung und Haltbarkeit des Kits .................................................................... 5
6 Vorbereitung der Reagenzien ........................................................................... 5
7 Testdurchführung ............................................................................................. 6
8 Arbeitsschema ................................................................................................. 7
9 Testvalidität ..................................................................................................... 8
10 Auswertung der Ergebnisse .............................................................................. 8
11 Arbeitssicherhei ............................................................................................... 9
12 Technische Anmerkungen .............................................................................. 10
SYPHILIS Ab ELISA DE
04.02.2019 3/12 version 2
Enzymimmunoassay zur Bestimmung der Gesamt-Antikörper gegen Treponema pallidum im menschlichen Serum oder
Plasma
1 Einleitung
Syphilis (Lues) ist eine übertragbare Geschlechtskrankheit, die durch die Spirochäte Treponema pallidum subsp. pallidum hervorgerufen wird. Die Übertragung erfolgt vor allem durch den Geschlechtsverkehr mit einer infizierten Person, lediglich in 5-10% der Fälle auf nicht-sexuellem Wege (Übertragung von der Mutter auf das Kind, selten durch Kontakt mit Blut oder mit Hauterscheinungen).
Die Syphilis verläuft in charakteristischen Phasen:
Primäre Syphilis – An der Infektionsstelle bildet sich nach 2–4 Wochen ein festes, schmerzloses Geschwür, das nach 4–6 Wochen von selbst verschwindet.
Sekundäre Syphilis – Die Infektion breitet sich im gesamten Organismus aus, charakteristisch sind vor allem Hauterscheinungen – Exanthem, hochinfektiöse Papeln (Condylomata lata); es kommt zum Anschwellen der Lymphknoten. Dieses Stadium wird anschließend von einem mitunter mehrjährigen symptomlosen Zeitraum (Latenzzeit) abgelöst.
Tertiäre Syphilis – Es kommt zu einem schwerwiegenden Befall der Haut, der Organe, des Herzens und des kardiovaskulären Systems, der Augen, des zentralen Nervensystems und des Rückenmarks.
Bei schwangeren Frauen mit Primär- oder Sekundärsyphilis kann die Übertragung auf den Embryo erfolgen. Die Folge ist der Abort oder die Ansteckung des Fötus mit dem Befall unterschiedlicher Stufe (kongenitale Syphilis).
Das Kit SYPHILIS Ab ELISA ist ein qualitativer Test zur Bestimmung von anti-Treponema Antikörpern aller Klassen in der getesteten Probe. Zum Monitoring der Antikörperspiegel der Einzelklassen ist der SYPHILIS IgM ELISA und SYPHILIS IgG ELISA der Firma DIAsource ImmunoAssays S.A. geeignet.
2 Testprinzip
Das Kit ermöglicht die Bestimmung von Antikörpern gegen Treponema pallidum in der Probe mittels der Sandwich-ELISA-Methode (feste Phase mit angebundenen spezifischen Antigenen – Antikörper aus der zu untersuchenden Probe – Konjugat, d.h. spezifische Antigene Treponema pallidum, konjugiert mit Meerrettichperoxidase). Die Peroxidaseaktivität wird durch das TMB- Lösung bestimmt, das sich bei einer positiven Reaktion blau färbt. Die Enzymreaktion wird mit einer Stopplösung beendet. Die blaue Färbung schlägt in eine gelbe um. Die Intensität der Gelbfärbung wird mit dem Photometer (bei einer Wellenlänge von 450 nm) gemessen und ist proportional zur Konzentration der in der Probe enthaltenen, spezifischen Antikörper.
SYPHILIS Ab ELISA DE
04.02.2019 4/12 version 2
Verwendetes Antigen
Ausgewählte Abschnitte der spezifischen Antigene von Treponema pallidum, insbesondere p17, p47, p41 a p15
3 Bestandteile des Kits
Beschichtete Platte 1 Stck.
mit gebundenem Antigen, 12 x 8 zerbrechlichen Vertiefungen im Beutel mit Trocknungsmittel
Negative Kontrolle 1 × 2 ml
Lösung ohne spezifische menschliche Antikörper, gebrauchsfertig
Positive Kontrolle 1 × 2 ml
Lösung mit spezifischen menschlichen Antikörpern, gebrauchsfertig
Konjugat 1 × 8 ml
Lösung mit spezifischen Treponema pallidum Antigenen, Peroxidase-Konjugiert, gebrauchsfertig
TMB-Lösung 1 × 15 ml
Einkomponenten-Substratlösung, TMB/H2O2,
gebrauchsfertig
Waschlösung 1 × 75 ml
20× konzentrierter Puffer
Stopplösung 1 × 15 ml
Säurelösung, gebrauchsfertig
Arbeitsanweisung 1 Stck.
SYPHILIS Ab ELISA DE
04.02.2019 5/12 version 2
4 Erforderliche, nicht im Kit enthaltene Geräte und Materialien, für die manuelle Durchführung
Ein- und Mehrkanalpipetten
Einmalspitzen
Wascher
Stoppuhr
Inkubator für 37°C
Photometer für Mikrotiterplatten
5 Lagerung und Haltbarkeit des Kits
Das Kit muss bei einer Temperatur von +2°C bis +8°C gelagert werden. Bei Einhaltung der Lagerungsbedingungen gilt das auf der Verpackung des Kits angegebene Haltbarkeitsdatum. Der angebrochene Kit sollte innerhalb von drei Monaten verbraucht werden. Das Kit darf nicht einfrieren!
Proben und ihre Lagerung
Als Probe kann menschliches Serum und Zitratplasma verwendet werden. Mit Bakterien verseuchte Proben, hämolytische Proben oder Proben mit Chylus und im Plasma enthaltene Antikoagglutinationsmittel (Zitrat ausgenommen) können das Testergebnis beeinflussen.
Die Proben können bei einer Temperatur von +2°C bis +8°C höchstens 1 Woche lang aufbewahrt werden. Frieren Sie die Proben bei längerer Lagerung bei -20°C ein. Verdünnte Proben sind möglichst bald zu untersuchen.
6 Vorbereitung der Reagenzien
Verdünnen Sie die Waschlösung im Verhältnis 1:20 (1 Teil Lösung und 19 Teile destilliertes Wasser). Z.B. 75 ml konzentrierte Waschlösung + 1425 ml destilliertes Wasser.
In der Flasche mit der Waschlösung können sich Salzkristalle bilden. Diese Kristalle müssen vor Gebrauch durch Erwärmung im Wasserbad aufgelöst werden. Die verdünnte Lösung ist eine Woche lang bei +2°C bis +8°C haltbar.
Die Kontrollen (positive, negative und CUT-OFF) sind gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen!
Das Konjugat ist gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen!
Das TMB-Lösung ist eine chromogene Einkomponenten-Substratlösung und gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen!
SYPHILIS Ab ELISA DE
04.02.2019 6/12 version 2
Austauschbarkeit der Lösungen
Die Verdünnungslösung für die Proben, TMB-Lösung und Aviditätspuffer können problemlos mit einigen ELISA-Produkten von DIAsource ImmunoAssays S.A. austauschbar, wenn sie die gleiche numerische Kennzeichnung aufweisen (z.B. Verdünnungslösung für die Proben 2, Verdünnungslösung für die Proben 3, usw.). Weitere Informationen zu dieser Austauschbarkeit können Sie bei DIAsource ImmunoAssays S.A. anfordern.
7 Testdurchführung
Es ist sehr wichtig, alle Reagenzien vor ihrer Verwendung auf Raumtemperatur zu bringen und gründlich zu mischen. Sofern Sie nicht die gesamte Platte verwenden, so legen Sie die nicht benötigten Strips in die Verpackung mit dem Trocknungsmittel zurück, verschließen diese luftdicht und lagern sie bei +2°C bis +8°C. Sorgfältig vor Feuchtigkeit schützen!
1. Pipettieren Sie die Kontrollen sowie die unverdünnten Proben gemäß dem Arbeitsschema.
• Lassen Sie die Vertiefung A1 leer (Blank).
• Pipettieren Sie 50 µl der Positiven Kontrolle in 1 Vertiefung.
• Pipettieren Sie 50 µl der Negativen Kontrolle in 3 Vertiefungen.
• Pipettieren Sie 50 µl der unverdünnten Proben in die verbleibenden Vertiefungen.
• Pipettieren Sie 50 µl Konjugat in alle Vertiefungen mit Ausnahme von A1.
• 30 Sekunden gut schütteln (auf einem MT-Platten Schüttler).
2. Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und lassen Sie sie 30 Minuten bei 37°C inkubieren.
3. Saugen Sie den Inhalt der Vertiefungen ab und waschen Sie 5× mit Arbeitswaschlösung. Füllen Sie die Vertiefungen bis zum oberen Rand. Verbleibende Flüssigkeit zum Schluss durch Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen.
4. Pipettieren Sie in alle Vertiefungen 100 µl Einkomponenten-Substrat TMB-Lösung. Achten Sie auf Verschmutzungen – siehe Kapitel Technische Anmerkungen.
5. Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und lassen Sie 30 Minuten bei 37°C im Dunkeln inkubieren.
6. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stopplösung in der gleichen Reihenfolge und den gleichen Intervallen, wie das Substrat pipettiert wurde.
7. Messen Sie am Photometer bei einer Wellenlänge von 450 nm die Intensität der Verfärbung der Lösungen in den Vertiefungen im Vergleich zum Blank (Vertiefung
SYPHILIS Ab ELISA DE
04.02.2019 7/12 version 2
A1), und zwar innerhalb von 30 Minuten nach dem Stoppen der Reaktion. Vor der Messung die Böden der Vertiefungen gründlich reinigen.
8 Arbeitsschema
BL TP 4
PK TP 5
NK
NK
NK
TP 1
TP 2
TP 3
A
B
C
D
E
G
H
F
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
BL Blank (leere Vertiefung)
PK 50 µl
NK 50 µl
TP 1-x 50 µl verdünnte Testprobe
SYPHILIS Ab ELISA DE
04.02.2019 8/12 version 2
9 Testvalidität
Der Test ist gültig, wenn:
Die Blank-Extinktion ist kleiner als 0,060.
BLANK < 0,060
Die Extinktion der Negativen Kontrolle ist kleiner als 0,060
< 0,060
Die Extinktion der Positiven Kontrolle ist größer als 0,900.
> 0,900
10 Auswertung der Ergebnisse
Berechnung des CUT-OFF
Berechnen Sie den CUT-OFF indem Sie zur durchschnittlichen Extinktion der Negativen Kontrolle (NK) 0,170 addieren.
Ein potentiell ungültiger Werte sollten bei der Berechnung der durchschnittlichen Extinktion der Negativen Kontrolle eleminiert und der Mittelwert nur aus den verbleibenden zwei Werten berechnet werden.
Berechnung des Positivitätsindex (IP)
Dividieren Sie die Extinktion der getesteten Probe durch die Extinktion des CUT-OFF, der aus dem selben Testdurchlauf berechnet wurde
Die Interpretation der Untersuchungsergebnisse siehe Tabelle (Tabelle 1).
Tabelle 1 Interpretation der Untersuchungsergebnisse
Positivitätsindex (IP) Auswertung
kleiner als 0,9 negativ
0,9 bis 1,1 grenzwertig
höher als 1,1 positiv
SYPHILIS Ab ELISA DE
04.02.2019 9/12 version 2
Die Untersuchung grenzwertiger Proben, d. h. mit einem Positivitätsindex von 0,9 bis 1,1, muss nach erneuter Entnahme nach 2 bis 6 Wochen unter Berücksichtigung der jeweiligen spezifischen Erkrankung wiederholt werden.
Der serologische Befund kann nur im Kontext mit den Ergebnissen anderer Labortests und mit dem klinischen Bild des Patienten interpretiert werden.
11 Arbeitssicherhei
Der Test ist nur für Diagnosezwecke in vitro vorgesehen.
Die bei der Fertigung der Kontrollen verwendeten Seren wurden mit negativem Ergebnis auf HIV 1 und HIV 2, HBsAg, HCV untersucht. Dennoch ist es erforderlich, mit den Seren so umzugehen, als seien sie potentielles Infektionsmaterial.
Einige Reagenzien enthalten das giftige Natriumazid. Vermeiden Sie Hautkontakt.
Die Stopplösung enthält eine verdünnte Säurelösung. Schützen Sie bei der Arbeit mit dieser Lösung Ihre Augen und Ihre Haut!
Es ist notwendig, die örtlichen Arbeitssicherheitsbestimmungen einzuhalten.
Weitere Informationen erhalten Sie im Sicherheitsdatenblatt von Stop Solution.
Erste-Hilfe-Maßnahmen
Spülen Sie bei Augenkontakt Ihre Augen gründlich mit lauwarmem Wasser und suchen Sie einen Arzt auf. Entledigen Sie sich bei Kleidungs- und Hautkontakt sämtlicher kontaminierter Kleidung. Spülen Sie die Haut gründlich mit Wasser und Seife ab. Desinfizieren Sie die Haut, sofern Spritzer einer Lösung, die Plasma oder eine klinische Probe enthält, auf diese gelangen. Spülen Sie bei zufälligem Verzehr Ihren Mund mit Trinkwasser aus und nehmen Sie ärztliche Hilfe in Anspruch.
Resteentsorgung
Sämtliche zur Testdurchführung verwendeten Hilfsmittel sind hinsichtlich des Kontakts mit biologischem Material als potentiell infektiös zu betrachten. Deshalb sind sie als biologischer Abfall zu entsorgen.
Entsorgung des Kits nach Ablauf der Haltbarkeitsdauer
Zerlegen Sie das Kit in seine einzelnen Komponenten und entsorgen Sie diese als biologisches Material. Entsorgen Sie die Verpackungen und Verpackungsreste gemäß den örtlichen Vorschriften als sortierten Abfall.
SYPHILIS Ab ELISA DE
04.02.2019 10/12 version 2
12 Technische Anmerkungen
Um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, ist die genaue Einhaltung der Anleitung notwendig. Verwenden Sie bei der Arbeit stets Hilfsmittel höchsten Sauberkeitsgrades. Bevorzugen Sie Hilfsmittel für den einmaligen Gebrauch.
Mikrotiterplatte – Bringen Sie vor dem Öffnen den Beutel mit der Mikrotiterplatte auf Labortemperatur, damit auf der Plattenoberfläche kein Wasserdampf kondensiert.
Waschlösung – verwenden Sie zur Vorbereitung der Waschlösungs-Arbeitsverdünnung hochwertiges destilliertes Wasser.
Waschen – halten Sie die vorgeschriebene Anzahl der Waschzyklen ein und füllen Sie die Vertiefungen bis zum oberen Rand. Die Zeitdauer, während der die Vertiefungen zwischen den Waschzyklen mit der Waschlösung gefüllt verbleiben (soak time), sollte etwa 30 – 60 Sekunden betragen.
TMB-Lösung – verwenden Sie die Pipettierwanne für TMB-Lösung für keine anderen Lösungen. Füllen Sie den Lösungsrest aus der Pipettierwanne nicht in die Flasche zurück.
Nicht nachvollziehbaren Ergebnissen können methodische Fehler zugrunde liegen, insbesondere:
• unzureichendes Mischen der Lösungen und der Proben vor der Verwendung
• Vertauschen der Flaschenverschlüsse
• Verwendung der gleichen Spitze zum Pipettieren verschiedener Lösungen
• die Reagenzien wurden zu hohen Temperaturen, bakterieller oder chemischer Kontamination ausgesetzt
• unzureichendes Auswaschen der Vertiefungen, die Vertiefungen wurden nicht bis zum Rand gefüllt, schlechtes Absaugen der Lösungsreste
• Verschmutzung der Vertiefungsränder mit Konjugat oder mit Proben
• Vertauschen der Reagenzien aus verschiedenen Kit-Chargen
• Kontakt der Reagenzien mit Oxidationsmitteln, Schwermetallen und deren Salzen.
• Das Kit kann in mehrere Tests aufgeteilt werden. Entnehmen Sie zur Vorbereitung der Arbeitslösungen nur so große Mengen Reagenzien, wie für die Analyse notwendig sind.
• Der Test kann auf allen Typen automatischer ELISA-Analysatoren durchgeführt werden. Bei Bedarf bietet DIAsource ImmunoAssays S.A eine zertifizierte Modifizierung der Arbeitsanweisung für den jeweiligen Automatentyp an.
SYPHILIS Ab ELISA DE
04.02.2019 11/12 version 2
Bei Nichteinhaltung des Arbeitsverfahrens haftet der Hersteller nicht für die korrekte Funktion des Tests.
SYPHILIS Ab ELISA DE
04.02.2019 12/12 version 2
Testschema SYPHILIS Ab ELISA
Step Symbol Einzelne Testschritte
1 Proben nicht verdünnen
2 Pipettieren der Kontrollen und der unverdünnten Proben 50 µl
Blank = leere Vertiefung
3 Pipettieren des Konjugats 50 µl
Blank = leere Vertiefung, Schüttelapparat 30 Sekunden
4 Inkubation 30 Min. bei 37°C
5 Absaugen und Waschen der Vertiefungen 5×
6 Pipettieren des Substrats (TMB-Lösung) 100 µl
Einschließlich Blank
7 Inkubation 30 Min. bei 37°C
8 Pipettieren der Stopplösung 100 µl
Einschließlich Blank
9 Photometrische Messung bei 450 nm
SYPHILIS Ab ELISA
KAPDSI
SYPHILIS Ab ELISA ES
04.02.2019 2/12 versión 2
ÍNDICE
1 Introducción ..................................................................................................... 3
2 Principio del test .............................................................................................. 4
3 Composición del conjunto ................................................................................ 5
4 Otro equipamiento necesario para hacer el test de forma manual ................... 6
5 Almacenaje y caducidad de los juegos .............................................................. 6
6 Preparación de soluciones de trabajo ............................................................... 6
7 Procedimiento de trabajo ................................................................................. 7
8 Esquema de trabajo ......................................................................................... 8
9 Validez del test ................................................................................................. 9
10 Valoración de los resultados ............................................................................ 9
11 Seguridad en el trabajo .................................................................................. 10
12 Condiciones técnicas ...................................................................................... 10
SYPHILIS Ab ELISA ES
04.02.2019 3/12 versión 2
Enzimoinmunoanálisis para la detección de anticuerpos totales contra el Treponema pallidum en el suero o el plasma humano
1 Introducción La sífilis (lúes) es una enfermedad de transmisión sexual provocada por la bacteria espiroqueta Treponema pallidum, con subespecie pallidum. La vía de transmisión principal es el contacto sexual. Sin embargo, en el 5-10 % de los casos, la infección se transmite por otra vía (de manera congénita de la madre al hijo, o rara vez por contacto con la sangre o con lesiones de la piel infectadas).
La sífilis se produce en las siguientes etapas características:
Sífilis primaria: 2 o 4 semanas tras la exposición, aparece una úlcera indurada e indolora en la zona de la infección. La úlcera desaparece de forma espontánea después de 4 o 6 semanas. Sífilis secundaria: la infección se expande en el torrente circulatorio. Las lesiones en la piel (exantema [erupción] y condiloma lata altamente infeccioso) son características de esta etapa de la enfermedad. Los ganglios linfáticos se inflaman. Más adelante, la enfermedad pasa a una etapa latente asintomática. La etapa latente puede durar años. Sífilis terciaria: se producen lesiones graves en la piel. Varios órganos (el corazón y el sistema cardiovascular, los ojos, el sistema nervioso central y la médula espinal) pueden verse dañados. La enfermedad también se puede transmitir de una madre que padezca sífilis primaria o secundaria al feto durante el embarazo o el nacimiento. Esto puede provocar un aborto o la infección del hijo (sífilis congénita).
El kit SYPHILIS Ab ELISA está ideado para la detección cualitativa de todos los tipos de anticuerpos antitreponémicos. Este kit solo es adecuado para determinar la presencia de anticuerpos en una muestra en la que se ha realizado una prueba, pero no para el seguimiento del nivel de anticuerpos. Los kits SYPHILIS IgM e IgG ELISA (DIAsource ImmunoAssays S.A.) son más adecuados para la determinación cuantitativa del nivel de anticuerpos.
SYPHILIS Ab ELISA ES
04.02.2019 4/12 versión 2
2 Principio del test
El kit está ideado para la detección de anticuerpos antitreponémicos en una muestra mediante un método de EIA de tipo sándwich de un solo paso (es decir, una fase sólida recubierta de conjugado de antígenos [anticuerpo de la muestra analizada] específicos, es decir, antígenos de Treponema pallidum conjugados con peroxidasa de rábano picante). La actividad de la peroxidasa se determina en la prueba con un sustrato que contiene TMB. Los casos positivos se indican cuando aparece el color azul. Después de añadir la solución de interrupción, el azul cambia a amarillo. La intensidad del color amarillo se mide con un fotómetro a 450 nm y es proporcional a la concentración de anticuerpos específicos en la muestra.
Antígeno empleado
Partes seleccionadas de antígenos específicos de Treponema pallidum, en concreto p17, p47, p41 y p15
SYPHILIS Ab ELISA ES
04.02.2019 5/12 versión 2
3 Composición del conjunto
Placa con pocillos 1 pieza
recubierta con antígeno, 12 × 8 quebradizo pocillos en una bolsa con secante
Control negativo 1 × 2 ml
Solución que contiene anticuerpos humanos no específicos, lista para su uso
Control positivo 1 × 2 ml
Solución que contiene anticuerpos humanos específicos en una concentración de valor de corte, lista para su uso
Conjugate 1 × 8 ml
Solución que contiene los antígenos de Treponema pallidum marcados con peroxidasa específicos, listos para su uso
Solución de TMB 1 × 15 ml
Solución de sustrato cromogénico con
TMB/H2O2, lista para su uso
Solución de lavado 1 × 75 ml
20 amortiguadores concentrados
Solución de interrupción 1 × 15 ml
Solución ácida, lista para su uso
Instrucciones de uso 1 pieza
SYPHILIS Ab ELISA ES
04.02.2019 6/12 versión 2
4 Otro equipamiento necesario para hacer el test de forma manual
Pipetas monocanal y multicanal
Puntas desechables
Limpiador de microplacas
Temporizador
Incubadora (37 °C)
Lector de microplacas
5 Almacenaje y caducidad de los juegos
Almacene el kit a una temperatura de entre +2 °C y +8 °C. No lo congele. Si el kit se almacena según las instrucciones, la fecha de caducidad marcada es válida. La fecha de caducidad se indica en el envase. Los kits abiertos deben usarse en un plazo de tres meses.
Preparación y almacenamiento de la muestra
Se pueden emplear los siguientes fluidos humanos para la prueba: suero y plasma con citrato. Los anticoagulantes en el plasma (excepto el citrato), además de las muestras contaminadas con bacterias, hemolíticas o con quilo, pueden afectar a los resultados de la prueba.
Las muestras se pueden almacenar a una temperatura de entre +2 °C y +8 °C durante una semana. Para un periodo de tiempo mayor, almacene las muestras a -20 °C. Las muestras diluidas deben utilizarse lo antes posible.
6 Preparación de soluciones de trabajo
Diluya la solución de lavado a 1:20 (1 parte de solución y 19 partes de agua destilada); p. ej., 75 ml de la solución de lavado concentrada + 1425 ml de agua destilada.
Es posible que se desarrollen cristales de sal en el frasco con la solución de lavado concentrada. Antes de su uso, es necesario disolver los cristales calentando la botella al baño María. La solución de lavado diluida permanece estable a una temperatura de entre +2 °C y +8 °C durante una semana.
Los controles (positivo, negativo y de valor de corte) están listos para su uso. No los diluya más.
El conjugado está listo para su uso. No lo diluya más.
La solución de TMB es una solución de sustrato cromogénico de un componente lista para su uso. No la diluya más.
SYPHILIS Ab ELISA ES
04.02.2019 7/12 versión 2
Intercambiabilidad de reactivos
El diluyente de muestra, la solución de TMB y la solución de avidez son intercambiables entre algunos ELISA de DIAsource ImmunoAssays S.A., siempre y cuando tengan el mismo marcado numérico (p. ej., diluyente de muestra 2, diluyente de muestra 3, etc.). Puede solicitar más información relacionada con esta intercambiabilidad a DIAsource ImmunoAssays S.A.
7 Procedimiento de trabajo
Deje que todos los reactivos estén a temperatura ambiente y mezcle bien. Si no usa una microplaca entera, devuelva las tiras que no necesite a la bolsa con secante. Selle la bolsa herméticamente y guárdela a una temperatura de entre +2 °C y +8 °C. Manténgala seca.
1. Administre los controles y las muestras sin diluir según el programa de trabajo.
• Deje el pocillo A1 vacío (en blanco).
• Pipetee 50 µl del control positivo en 1 pocillo.
• Pipetee 50 µl del control negativo en 3 pocillos.
• Pipetee 50 µl de las mezclas sin diluir en el resto de los pocillos.
• Pipetee 50 µl del conjugado en todos los pocillos excepto en el pocillo A1.
• Mezcle bien durante 30 segundos (usando un mezclador para microplacas).
2. Cubra la microplaca con la tapa e incube a 37 °C durante 30 minutos.
3. Succione el contenido de los pocillos y lave 5 con la solución de lavado a concentración de trabajo. Llene los pocillos hasta el borde. Por último, golpee con suavidad la microplaca invertida exhaustivamente en un papel absorbente para eliminar los restos de la solución.
4. Pipetee 100 µl de la solución de TMB en todos los pocillos. Evite que se contamine (consulte el capítulo 13: Notas sobre el procedimiento).
5. Cubra la microplaca con la tapa e incube a 37 °C durante 30 minutos. Manténgala alejada de la luz.
6. Interrumpa la reacción añadiendo 100 µl de solución de interrupción en el mismo orden e intervalos en los que añadió el sustrato.
7. Lea la intensidad de color en los pocillos en comparación con el que está en blanco (pocillo A1) usando el fotómetro establecido en 450 nm. Se debe leer la absorbencia en unos 30 minutos después de interrumpir la reacción. Limpie los fondos de los pocillos antes de la medición.
SYPHILIS Ab ELISA ES
04.02.2019 8/12 versión 2
8 Esquema de trabajo
BL TS 4
PC TS 5
NC
NC
NC
TS 1
TS 2
TS 3
A
B
C
D
E
G
H
F
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
BL En blanco (pocillo vacío)
PC 50 µl
NC 50 µl
TS 1-x 50 µl Muestra probada sin diluir
SYPHILIS Ab ELISA ES
04.02.2019 9/12 versión 2
9 Validez del test
La prueba es válida si:
La absorbencia del pocillo en blanco es menor que 0,060.
BLANK < 0,060
La absorbencia del control negativo es menor que 0,060.
< 0,060
La absorbencia del control positivo es mayor que 0,900.
> 0,900
10 Valoración de los resultados
Cálculo del valor de corte
Para calcular el valor de corte, sume la absorbencia media del control negativo y 0,170.
Valor de corte = Absorbencia media del valor de corte + 0,170
Al calcular la absorbencia media del control negativo, elimine el valor potencial no válido del control negativo y calcule la media de los dos valores restantes.
Cálculo del índice de positividad (IP)
Divida la absorbencia de la muestra a la que ha realizado la prueba por la absorbencia del valor de corte calculado en la misma prueba:
Interpretación de los resultados de la prueba descritos en Tabla 1.
Tabla 1 Interpretación de los resultados
Índice de positividad (IP)
Evaluación
menor que 0,9 negativo
entre 0,9 y 1,1 dudoso
mayor que 1,1 positivo
SYPHILIS Ab ELISA ES
04.02.2019 10/12 versión 2
Se debe repetir el examen de las muestras dudosas, es decir, aquellas con índice de positividad de 0,9 a 1,1, a partir de una nueva muestra obtenida de 2 a 6 semanas después según los datos específicos de la enfermedad.
Los resultados serológicos solo pueden interpretarse en el contexto de los resultados de otras pruebas de laboratorio y el cuadro clínico del paciente.
11 Seguridad en el trabajo
El kit está diseñado para utilizarse en el diagnóstico in vitro únicamente.
Se han analizado los sueros empleados para los controles y son negativos para HIV 1, HIV 2, HBsAg y HCV. A pesar de ello, sigue siendo necesario tratarlos como materiales potencialmente infecciosos.
Algunos reactivos contienen acida de sodio, que es un componente tóxico. Evite el contacto con la piel.
La solución de interrupción contiene una solución de ácido diluido. Evite el contacto con los ojos y la piel.
Debe tener en cuenta las normas y reglamentos de seguridad locales.
Si desea más información, consulte las hojas de datos de seguridad de materiales de Stop Solution.
Primeros auxilios
En caso de contacto con los ojos, enjuágueselos con agua abundante y busque asistencia médica. En caso de contacto con la piel y la ropa, quítese todas las prendas contaminadas. Lave la piel con jabón y agua abundante. En caso de contacto con soluciones que contengan plasma o muestras clínicas, desinfecte la piel. En caso de ingesta accidental, enjuáguese la boca con agua potable y busque asistencia médica.
Eliminación de los residuos
Todos los materiales utilizados para realizar la prueba deben tratarse como potencialmente infecciosos debido al contacto con materiales biológicos. Por lo tanto, deben desecharse con los residuos biológicos.
Eliminación de kits caducados
Desmonte el kit y deseche los componentes como material biológico. Deseche el material del envase según lo exija la normativa local.
12 Condiciones técnicas
Para obtener resultados fiables, es necesario seguir estrictamente las Instrucciones de uso. Utilice siempre puntas desechables y material de vidrio limpios y preferiblemente desechables.
SYPHILIS Ab ELISA ES
04.02.2019 11/12 versión 2
Placa con pocillos: para evitar la condensación de agua en la superficie de la microplaca, deje siempre que la bolsa con la microplaca se caliente a temperatura ambiente antes de abrirla.
Solución de lavado: utilice agua destilada de buena calidad para preparar la solución de lavado a concentración de trabajo.
Procedimiento de lavado: continúe con el número de ciclos de lavado estipulado y rellene los pocillos hasta el borde superior. El tiempo de inmersión (es decir, el intervalo entre dos ciclos de lavado diferentes durante el cual los pocillos permanecen llenos con la solución de lavado) debería ser de entre 30 y 60 segundos aproximadamente.
Solución de TMB: el recipiente utilizado para el pipeteado multicanal no debe usarse para otros reactivos. No devuelva al frasco la solución de TMB sobrante del recipiente para el pipeteado.
Si hay resultados no reproducibles, puede deberse a una metodología inadecuada, como la siguiente:
• Mezcla insuficiente de los reactivos y las mezclas antes del uso
• Reemplazo inadecuado de los tapones de los frascos
• Uso de la misma punta para pipetear distintos reactivos
• Exposición de los reactivos a una temperatura excesiva; contaminación bacteriana o química
• Lavado o llenado insuficiente de los pocillos (los pocillos deben llenarse hasta el borde superior), succión inadecuada de los restos de la solución de lavado
• Contaminación de los bordes de los pocillos con conjugado o muestras
• Uso de reactivos de lotes de kits diferentes
• Contacto con reactivos con oxidantes, metales pesados y sus sales
El kit puede utilizarse para exámenes consecutivos. Al preparar soluciones a concentración de trabajo, utilice solo la cantidad de reactivos necesaria para el análisis.
El kit puede utilizarse en todos los tipos de analizadores de EIA.
Si es necesario, DIAsource ImmunoAssays S.A. puede ofrecer una modificación certificada de las Instrucciones de uso para el tipo de analizador específico.
El fabricante no puede garantizar que el kit funcione correctamente si no se siguen estrictamente las instrucciones del procedimiento de ensayo.
SYPHILIS Ab ELISA ES
04.02.2019 12/12 versión 2
Resumen del protocolo de SYPHILIS Ab ELISA
Paso n.º Símbolo Pasos de la prueba
1 No diluir las muestras
2 Pipetear controles y muestras diluidas: 50 µl
En blanco = pocillo vacío
3 Pipetear conjugado: 50 μl
En blanco = pocillo vacío, 30 s en mezclador
4 Incubar a 37 °C durante 30 min
5 Succionar y lavar 5 pocillos
6 Pipetear sustrato (solución de TMB): 100 μl
Incluido el pocillo en blanco
7 Incubar a 37 °C durante 30 min
8 Pipetear solución de interrupción: 100 μl
Incluido el pocillo en blanco
9 Leer intensidad del color a 450 nm
