Chen 

1 

 

Supplemental Information 

 

The structural basis of R‐Spondin recognition by LGR5 and RNF43 

Po‐Han Chen1, Xiaoyan Chen1, Deyu Fang2, Xiaolin He1* 

1Department of Molecular Pharmacology and Biological Chemistry, Northwestern University 

Feinberg School of Medicine, Chicago, Illinois 60611 

2Department of Pathology, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Chicago, 

Illinois 60611 

 

 

*Correspondence to 

Xiaolin He, Ph.D. 

Phone: 312‐503‐8030 

Fax: 312‐503‐5349 

E‐mail: x‐he@northwestern.edu 

 

 

    Chen 

2 

 

Supplemental Materials and Methods 

Cell culture, cloning and BacMam expression  

Sf9 insect cells were maintained in SF900‐II media (Invitrogen) supplemented with 8% (v/v) 

heat‐inactivated fetal bovine serum.  N‐acetylglucosaminyltransferase I (GnTI)‐deficient Human 

Embryonic Kindey‐293 (GnTI− HEK293) cells were maintained in CDM4HEK293 media (HyClone) 

supplemented with 4% heat‐inactivated fetal bovine serum.  The coding sequence for the 

whole ectodomain of human LGR5 (GenBank: AF062006.1), RNF43 (GenBank: AB081837.1), 

RSPO1‐CRD (GenBank: DQ318235.1, E35‐S133), and RSPO1‐TSP (E35‐G209) without signal 

peptide were PCR amplified and subcloned into the baculovirus‐mediated mammalian cell gene 

transduction (BacMam) vector pVLAD627 containing a N‐terminal Gaussia luciferase signal 

peptide and a C‐terminal 7‐histidine tag.  The constructs and the BacVector‐3000 baculovirus 

DNA (EMD Chemicals) were used to co‐transfect Sf9 cells in 6‐well plates in the presence of the 

CellfectinII reagent (Invitrogen).  After incubation of the transfected cells at 27oC for 5 days, the 

resulting low titer virus stock was harvested, and was used to infect Sf9 cells at 2 × 106 cell/ml 

for amplification. The amplified BacMam viruses were used to transduce HEK293 GnTI− cells at 

a density of 1.5‐2 × 106 cells/ml.  Rspo1 and LGR5 were co‐expressed for improved protein 

stability, and RNF43 was expressed separately.  The cells were pelleted 72 hours later, and the 

supernatants were concentrated and buffer‐exchanged to HBS (10mM Hepes pH7.5, 150mM 

NaCl).  The recombinant proteins were captured by the Talon affinity resin and eluted with 300 

mM imidazole pH 7.5, glycan‐minimized with endoglycosidase‐F1 (Sigma), and treated with 

bovine carboxypeptidase‐A (Sigma) for His‐tag removal.  RNF43 and RSPO1/LGR5 were mixed 

    Chen 

3 

 

with appropriate ratios, and proteins were further purified with size exclusion columns 

(Superdex‐200, Amersham Biosciences) pre‐equilibrated and eluted with HBS. 

 

Crystallization and data collection 

Crystallization was performed in a 200C incubator using the sitting‐drop vapor diffusion method.  

Crystals of the complex were obtained from drops composed of 0.5 µL reservoir solution and 

0.5 µL protein solution (10mg/ml) equilibrated against 1 ml reservoir solution.  The composition 

of the reservoir solution is 10% PEG4000, 0.2M ammonium sulfate, 7% Sucrose and 0.1 M TRIS 

pH 8.0.  Prior to being flash frozen in liquid nitrogen, the crystals were transferred to a cryo‐

solution consisting of the reservoir solution supplemented with 19% ethylene glycol.  The heavy 

atom derivatives were prepared by quick‐soaking selected crystals in the cryo‐protectant 

containing 0.2 M NaI for ~60 seconds.  X‐ray diffraction datasets were collected at 100K at the 

Life Science Collaborative Access Team (LS‐CAT) beamline 21‐ID‐D, the Advanced Photon Source, 

Argonne, Illinois, USA.  The data were processed with HKL3000 (Otwinowski and Minor, 1997), 

and the statistics are summarized in Table S1. 

 

Structure determination and refinement 

The structure was solved by single isomorphous replacement with anomalous scattering (SIRAS) 

using Iodine‐soaked crystals.   Taking advantage of non‐crystallographic symmetry present in 

the crystal, the electron‐density map was furthered improved by density modification in CNS 

(Brunger, 2007; Brunger et al., 1998).  Initial atomic models were built manually in O and COOT 

    Chen 

4 

 

(Emsley and Cowtan, 2004).  The model of LGR5 was built with LRR repeats of FSHR (PDB 4AY9) 

as template.  Due to lack of similar structures, RSPO1 was built initially by baton building when 

electron density map was improved to sufficient details, followed by manual adjustment of 

amino acids that agree best with sequence information (i.e., by locating the conserved disulfide 

bonds.  Model of RNF43 were built by manually fitting in the aminopeptidase structure, 

followed by adjustment of amino acid side chains and backbones.  The complex structure was 

refined using CNS1.3 and REFMAC5 (Collaborative Computational Project, 1994). Local NCS 

restraint is maintained throughout the refinement process. 

 

Isothermal Titration Calorimetry experiment 

Calorimetric titrations were implemented with a VP‐ITC calorimeter (MicroCal) at 30 °C.  Using 

gel filtration chromatography (Superdex‐200, Amersham Biosciences), all proteins to be used in 

the titrations were buffer exchanged by into an identical lot of HBS buffer (10 mM Hepes pH7.5, 

150 mM NaCl) to minimize the dilution effects of buffer heat during titration. Proteins eluted 

from the column were concentrated and concentrations measured by Nanophotometer P330 

(IMPLEN): RNF43 1.4 mM, R‐CRD 0.07 mM, R‐TSP 0.02 mM, R‐CRD/LGR5 0.03 mM, and R‐

TSP/LGR5 0.02 mM.  The protein samples were degassed for 5 min before being loaded 

separately into the reaction chamber (all samples except for RNF43) and injection syringe.  The 

proteins in the syringe (RNF43) were injected into the reaction chamber in 3µL pulses at 5‐min 

intervals. The data were processed with MicroCal Origin 5.0 software. 

References 

    Chen 

5 

 

Brunger, A.T. (2007). Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols 2, 2728‐2733. Brunger, A.T., Adams, P.D., Clore, G.M., DeLano, W.L., Gros, P., Grosse‐Kunstleve, R.W., Jiang, J.S., Kuszewski, J., Nilges, M., Pannu, N.S., et al. (1998). Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 54, 905‐921. Collaborative Computational Project, N. (1994). The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 50, 760‐763. Emsley, P., and Cowtan, K. (2004). Coot: model‐building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D 60, 2126‐2132. Otwinowski, Z., and Minor, W. (1997). Processing of X‐ray diffraction data collected in oscillation mode. Method Enzymol 276, 307‐326. 

 

 

    Chen 

6 

 

Supplemental Table 1 

crystals Human LGR5-Rspo1-RNF43

native I-soaked Data collection

Space group P212121 P212121

Cell parameters 104.575/120.971/181.009 71.17/80.07/164.06

Resolution range 39.5-2.5 (2.6-2.5) 50-3.0 (3.04-3.00)

Unique reflections 74020 (5121) 19693 (952)

Completeness (%) 97.8 (91.9) 99.2 (99.7)

I/sigma(I) 19.5 (4.2) 18.6 (6.6)

Redundancy 6.2 (4.8) 16.2 (12.8)

Rmerge (%)* 6.1 (33.8) 8.0 (38.2)

phasing

Number of heavy atoms 8

Riso (%) 13.4

Rano (%) 4.8

FOM 0.53

Refinement

Resolution range 39.5-2.5 (2.6-2.5)

r.m.s.d bonds (Å) 0.009

r.m.s.d angles (°) 1.67

Rfree (%)† 23.0

Rwork (%)† 27.8

Number of protein atoms, averaged B factor (Å2)

11019, 77.2

Number of glycan atoms, averaged B factor (Å2)

28, 67.9

Number of waters, averaged B factor (Å2)

255, 48.8

Ramachandran plot (%) (favored, allowed, outliers)

76.6, 12.5, 10.9

 *Rmerge= Σhkl|I-<I>|/ΣhklI, where I is the intensity of unique reflection hkl, and <I> is the average over symmetry-related observation of unique reflection hkl.

†Rwork=Σ|Fobs-Fcalc|/ΣFobs, where Fobs and Fcalc are the observed and the calculated structure factors, respectively. Rfree is calculated using 5% of reflections set aside from refinement.  

    Chen 

7 

 

Supplemental Table 2.  Selected interface residues* between Rspo1‐CRD and LGR5‐ECD 

Rspo1‐CRD  LGR5‐ECD 

Asp85  R144 (LRR4) 

Arg87  Asp146 (LRR4), Asp171 (LRR5)

F106  His166, Trp168 (LRR5)

F110  Val213/214 (LRR7)

Lys122  Val213 (LRR7), Glu237 (LRR8)

*Interface residues are listed according to PISA analysis and visual inspection of electron 

density map. 

    Chen 

8 

 

Supplemental Table 3.  Selected interface residues* between Rspo1‐CRD and RNF43‐PA  

Rspo1‐CRD  RNF43‐PA 

Ser48  Glu110 

Leu64  His86, Leu88, Tyr89

Arg66  Asp97, Gln84 

Asp68  Lys81, His183 

Ile69  Leu82, Gln84, Lys181, Val176

Arg70  Gln84 

Gln71  Gln84, His86, Asp97

*Interface residues are listed according to PISA analysis and visual inspection of electron 

density map. 

    Chen 

9 

 

 

Supplemental Figure 1.  Comparison between LGR5‐RSPO1 and FSHR‐FSH.  Direct view of the 

LRR concave face in both structures. 

    Chen 

10 

 

  

Supplemental Figure 2.  Crystal packing of back‐to‐back dimer.  The side view and top view are 

presented.  The modeled Ni2+ ion is shown as the gray sphere surrounded by His residues in 

sticks. Boxed region indicates site of RNF43‐LGR5 packing in the crystal structure. 

 

    Chen 

11 

 

 

Supplemental Figure 3.  Electron density surrounding the RSPO1‐LGR5 interface.  RSPO1 is 

shown in cyan and LGR5 in green.  2Fo‐Fc electron density map contoured at 2.0 σ.  The 

interface consists of hydrophilic interactions (RSPO1 D85 and R87 with LGR5 R144 and D146) 

and hydrophobic interactions (right part of the figure, in particular RSPO1 F106 and F110 and 

LGR5 W168, H166, and V213).   

    Chen 

12 

 

 

 

Supplemental Figure 4.  Electron density surrounding the RSPO1 β‐hairpin (L64‐Q71) 

interaction with RNF43 β3.  Orientation is the same as in Fig. 3.  RSPO1 is shown in marine and 

RNF43 shown in hotpink.  The 2Fo‐Fc map is contoured at 1.0 σ.