8/3/2019 Steven A. Wasserman and Nicholas R. Cozzarelli- Determination of the stereostructure of the product of Tn3 resolv

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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 8 2 , p p . 1 0 7 9 - 1 0 8 3 , F e b r u a r y 1 9 8 5B i o c h e m i s t r y

D e t e r m i n a t i o n o f t h e s t e r e o s t r u c t u r e o f t h e p r o d u c t o f T n 3r e s o l v a s e b y a g e n e r a l m e t h o d( s i t e - s p e c i f i c r e c o m b i n a t i o n / p a r t i a l d e n a t u r a t i o n m a p p i n g / c a t e n a n e s / R e c A p r o t e i n / s t r a n d e x c h a n g e )

STEVEN A . WASSERMAN AND N I C H O L A S R . C O Z Z A R E L L ID e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r B i o l o g y , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , B e r k e l e y , CA 9 4 7 2 0C o m m u n i c a t e d b y G u n t h e r S . S t e n t , O c t o b e r 2 2 , 1 9 8 4ABST RACT A m e t h o d h a s b e e n d e v e l o p e d f o r d e t e r m i n a -t i o n o f t h e a b s o l u t e s t r u c t u r e o f DN A c a t e n a n e s . T h e c a t e n a t e dDN A i s p a r t i a l l y d e n a t u r e d b e f o r e b e i n g t h i c k e n e d w i t h a c o a t -i n g o f RecA p r o t e i n a n d s p r e a d f o r e l e c t r o n m i c r o s co p y . T h i st r e a t m e n t a l l o w s v i s u a l i z a t i o n o f t h e o r i e n t a t i o n o f e a c h r i ng a sw e l l a s i d e n t i f i c a t i o n o f t h e o v e r l y i n g a n d u n d e r l y i n g DNAs a tc r o s s i n g p o i n t s . T h e s e d e t e r m i n a t i o n s d e f i n e t h e t o p o l o g y o f ac a t e n a n e , p r o v i d i n g a p o w e r f u l m e a n s f o r t e s t i n g m e c h a n i s m so f c a t e n a n e - pr o d u c i ng e n z y m e s i n DN A r e c o m b i n a t i o n a n dr e p l i c a t i o n . T h e t e c h n i q u e w a s u s e d t o s h o w t h a t t h e s i n g l ei n t e r l o c k o f t h e c a t e n a t e d p r o d u c t s o f s i t e - s p e c i f i c r e c o m b i n a -t i o n m e d i a t e d b y T n 3 r e s o l v a s e i s e x c l u s i v e l y o f n e g a t i v e s i g n .T h e u n i q u e t o p o l o g y o f t h e p r o d u c t s i n d i c a t e s t h a t r e s o l v a s ef i x e s t h e su m o f t h e n u m b e r o f s u p e r c o i l s b e t w e e n r e c o m b i n a -t i o n s i t e s a t s y n a p s i s a n d t h e n u m b e r o f s u c h s u p e r c o i l s l o s t o rg a i ne d d u r i n g s t r a n d e x c h a n g e . T h e d a t a s t r o n g l y s u g g e s t t h a tt h e r e a r e i n f a c t t h r e e n e g a t i v e s u p e r c o i l s b e t w e e n s y n a p s e ds i t e s ; o n e s u p e r c o i l i s d i s s o l v e d i n t h e c r o s s - o v e r m e c h a n i s m ,w h e r e a s t h e o t h e r t w o a r e m e t a m o r p h o s e d i n t o t h e u n i q u e c a t -e n a n e i n t e r l o c k .

I n t e r l o c k e d r i n g s o f DNA, o r c a t e n a n e s , a r i s e f r e q u e n t l y i nb o t h p r o k a r y o t i c a n d e u k a r y o t i c o r g a n i s m s . C a t e n a n e s a r ef o r m e d i n v i t r o a n d i n v i v o i n t h e c o u r s e o f r e p l i c a t i o n , r e -c o m b i n a t i o n , a n d t o p o i s o m e r a s e a c t i o n ( 1 - 3 ) . T h e s t r u c t u r eo f c a t e n a t e d DNA r e f l e c t s t h e m e c h a n i s m o f i t s c r e a t i o n .A n a l y s i s o f c a t e n a n e t o p o l o g y h a s t h e p o t e n t i a l , t h e r e f o r e ,t o h e l p d e l i n e a t e t h e p a t h w a y s o f c e l l u l a r DNA o r g a n i z a t i o na n d r e a r r a n g e m e n t ( 4 - 7 ) . R e a l i z a t i o n o f t h i s p o t e n t i a l h a sb e e n l i m i t e d , h o w e v e r , b y t h e l a c k o f a n a n a l y t i c a l m e t h o dc a p a b l e o f d i s t i n g u i s h i n g e a c h o f t h e m y r i a d p o s s i b l e t y p e so f c a t e n a n e s .I n r e p o r t i n g t h e d e v e l o p m e n t o f s u c h a m e t h o d , we f o c u sh e r e o n t h e c a t e n a t e d p r o d u c t s o f i n t r a m o l e c u l a r r e c o m b i n a -t i o n m e d i a t e d b y T n 3 r e s o l v a s e . I n a n i n v i t r o r e a c t i o n e q u i v -a l e n t t o t h e c o i n t e g r a t e r e s o l u t i o n s t e p o f t r a n s p o s i t i o n , r e -s o l v a s e r e c o m b i n e s d i r e c t l y r e p e a t e d r e s o l u t i o n ( r e s ) s i t e s i na s u p e r c o i l e d p l a s m i d ( 8 ) . T h e p r e d o m i n a n t p r o d u c t i s a c a t -e n a n e o f t w o s i n g l y i n t e r l o c k e d r i n g s ( 9 ) f o r w h i c h t h e s t e r -e o s t r u c t u r e , t h e c o n f i g u r a t i o n o f t h e i n t e r l o c k , i s u n k n o w n .A s s h o w n i n F i g . 1 , t h e t w o p o s s i b l e t y p e s o f s i n g l y i n t e r -l o c k e d c a t e n a n e s a r e i n d i s t i n g u i s h a b l e u n l e s s o n e k n o w sb o t h t h e o v e r l a p a n d o r i e n t a t i o n a t t h e n o d e s ( c r o s s i n g s o fDNA s e g m e n t s ) t h a t c o m p r i s e t h e i n t e r l o c k . T h e s i g n o f an o d e i s f i x e d b y t h e c o n v e n t i o n s h o w n i n F i g . 1 ; a s i n g l yi n t e r l o c k e d c a t e n a n e h a s t w o n o d e s o f t h e s a m e s i g n .I n t h e o r y , t h e s i n g l e i n t e r l o c k o f t h e c a t e n a t e d r e s o l v a s ep r o d u c t c o u l d b e e x c l u s i v e l y o f e i t h e r s i g n . A l t e r n a t i v e l y ,t h e p r o d u c t c o u l d b e a m i x t u r e o f t h e t w o c a t e n a n e t y p e s . T od i s t i n g u i s h a m o n g t h e s e p o s s i b i l i t i e s , we d e v e l o p e d a m e a n so f o r i e n t i n g DNA r i n g s i n a n e l e c t r o n m i c r o g r a p h i n w h i c h

F I G . 1 . T h e tw o t y p e s o f s i n g l y i n t e r l i n k e d c a t e n a n e s . M o l e c u l e sar e s h o w n i n p l a n e p r o j e c t i o n w i t h t h e o r i e n t a t i o n a t e a c h n o d e( c r o s s i n g o f 2 DNA d u pl e x e s) r e p r e s e nt e d b y a n arro w. T h e s i g n o fe a c h n o d e i s a s s i g n e d b y c o n v e n t i o n : I f t h e o v e r l y i n g a r r o w c an b ea l i g n e d w i t h t h e u n d e r l y i n g o ne b y a c l o c k w i s e r o t a t i o n o f l e s s t h a n1 8 0 0 , t h e n o d e i s a s s i g n e d a v a l u e o f - 1 . I f a c o u n t e r c l o c k w i s e r o t a -t i o n c an p r o d u c e a l i g n m e n t , t h e n o d e i s g i v e n a v a l u e o f + 1 . N o t et h a t t h e tw o c a t e n a n e t y p e s are i d e n t i c a l e x c e p t f o r t h e r e l a t i v e o r i -e n t a t i o n o f t h e r i n g s .we c o u l d a l s o o b s e r v e t h e p a t h a n d o v er l a p o f t h e DNA.W e c o n s i d e r e d d e c o r a t i o n w i t h n u c l e i c a c i d s or sequence-s p e c i f i c b i n d i n g p r o t e i n s t o r e v e a l sequ ence o r i e n t a t i o n b u tc h o s e i n s t e a d p a r t i a l d e n a t u r a t i o n o f t h e c a t e n a n e DNA asan e s t a b l i s h e d a n d e a s i l y g e n e r a l i z e d m e t h o d ( 1 0 ) . D e n a t u r -a t i o n b u b b l e s c a n b e m a p p e d t o p a r t i c u l a r a d e n i n e t h y m i n e( A - T ) - r i c h r e g i o n s o f a DNA, a l l o w i n g o r i e n t a t i o n o f t h em o l e c u l e . F o r v i s u a l i z i n g DNA p a t h a n d o v e r l a p , we u s e dt h e r e c e n t l y d e v e l o p e d RecA p r o t e i n - c o a t i n g t e c h n i q u e ( 1 1 ) .C o a t i n g o f DNA w i t h RecA h e i g h t e n s m i c r o g r a p h c o n t r a s t ,m a k i n g i t p o s s i b l e t o d i s t i n g u i s h t h e o v e r l y i n g a n d u n d e r l y -i n g s t r a n d s a t a n o d e . By w e d d i n g p a r t i a l d e n a t u r a t i o n m a p-p i n g t o R e c A - c o a t i n g , we h a v e d e v e l o p e d a g e n e r a l m e t h o df o r d e t e r m i n i n g t h e s t r u c t u r e o f c a t e n a n e s .W e s h o w h e r e t h a t t h e s i n g l y l i n k e d c a t e n a n e s p r o d u c e db y T n 3 r e s o l v a s e are o f o ne s i g n a n d t h a t t h e i r t o p o l o g y d e -l i m i t s s t e p s i n t h e m e c h a n i s m o f DNA s t r a n d r e c o m b i n a t i o n .

MAT ERIALS AND METHODSP r e p a r a t i o n o f P a r t i a l l y D e n a t u r a t e d D N A s . T h e s u b s t r a t e ,p A 2 , i s a h e a d - t o - t a i l d i m e r o f t h e re s s i t e - c o n t a i n i n g p l a s m i dpA ( 1 2 ) . p A 2 DNA was e i t h e r d i g e s t e d w i t h N de I t o y i e l dm o n o m e r - l e n g t h [ 3 2 0 0 - b a s e - p a i r ( b p ) ] l i n e a r m o l e c u l e s o r r e -

a c t e d w i t h T n 3 r e s o l v a s e as d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( 1 2 ) . T hec a t e n a t e d r e s o l v a s e p r o d u c t s w e r e n i c k e d o n c e p e r r e c o m b i -n a n t r i n g w i t h e i t h e r DNase I ( 1 3 ) o r B g l I ( 1 4 ) i n t h e p r e s -en ce o f e t h i d i u m b r o m i d e .P a r t i a l d e n a t u r a t i o n f o l l o w e d t h e p r o c e d u r e o f J o h n s o n( 1 5 ) : DNA ( 2 j i g ) was r e a c t e d a t 5 7 C f o r 2 0 m i n i n 3 0 , u o f 1 0mM p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 6 ) c o n t a i n i n g 1 mMEDTA, 50% ( v o l / v o l ) e t h a n o l ( G o l d S h i e l d , H a y w a r d , C A ) ,a n d 0 . 1 M d e i o n i z e d g l y o x a l . T he DNA t h e n was p a s s e dover a 3 0 0 - , u l S e p h a r o s e CL-4B ( P h a r m a c i a ) c olu mn i n 1 0mM T r i s C l , pH 7 . 6 / 1 mM EDTA.C o a t i n g o f DN A w i t h RecA P r o t e i n . P a r t i a l l y d e n a t u r e dA b b r e v i a t i o n : b p , b a s e p a i r ( s ) .

1 0 7 9

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

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1 0 8 0 B i o c h e m i s t r y : W a s s e r m a n a n d C o z z a r e l l iDN A w a s r e a c t e d w i t h E s c h e r i c h i a c o l i RecA p r o t e i n ( g i f t o fK . M c E n t e e ) b y a s l i g h t v a r i a t i o n o f t h e m e t h o d u s e d b yK o l l e r e t a l . ( 1 6 ) f o r c o a t i n g s i n g l e - o r d o u b l e - s t r a n d e dDNA. S u c c e s s f u l r e a c t i o n r e q u i r e d p r e m i x i n g DNA ( 2, u g / m l ) a n d RecA ( 6 5 , & g / m l ) f o r 5 m i n a t room t e m p e r a t u r ei n 2 5 mM t r i e t h a n o l a m i n e c h l o r i d e ( p H 7 . 2 ) . M a g n e s i u m a c e -t a t e ( 2 . 5 m M) a n d a d e n o s i n e 5 ' - [ y - t h i o ] t r i p h o s p h a t e ( 0 . 5mM) t h e n w e r e a d d e d , a n d t h e 2 5 - / . l m i x t u r e w a s i n c u b a t e da t 3 7 0 C . A f t e r 4 0 m i n t h e r e a c t i o n w a s f i x e d b y a d d i t i o n o fo n e - n i n t h v o l u m e o f 2% g l u t a r a l d e h y d e ( P o l y s c i e n c e , W a r -r i n g t o n , P A , EM g r a d e ) i n 7 5 mM H e p e s ( p H 7 . 5 ) . A f t e r a na d d i t i o n a l 1 5 m i n a t 3 7 0 C , t h e R e c A - c o a t e d DNA was p a s s e do v e r a 3 0 0 - / A l S e p h a r o s e C L - 4 B c o l u m n i n 5 mM m a g n e s i u ma c e t a t e .E l e c t r o n M i c r o s c o p y . P r e p a r a t i o n o f s h a d o w e d g r i d s f o re l e c t r o n m i c r o s c o p y f o l l o w e d t h e g e n e r a l m e t h o d o f W i l -l i a m s ( 1 7 ) . S a m p l e s ( 5 A l ) o f R e c A - c o a t e d , p a r t i a l l y d e n a -t u r e d DNA w e r e a p p l i e d d i r e c t l y t o c a r b o n - c o a t e d s p e c i m e ng r i d s m a d e h y d r o p h i l i c b y g l o w d i s c h a r g e . G r i d s t h e n w e r es t a i n e d w i t h u r a n y l a c e t a t e a n d s h a d o w e d i n t w o s t a g e sf i r s t r o t a r y a n d t h e n u n i d i r e c t i o n a l - a t a 7 0 a n g l e a n d as o u r c e - t o - s a m p l e d i s t a n c e o f 9 . 6 c m . M i c r o g r a p h s w e r e o b -t a i n e d u s i n g a J a p a n E l e c t r o n i c O p t i c s L a b o r a t o r y 1 0 0 - Be l e c t r o n m i c r o s c o p e w i t h 2 5 , 0 0 0 - f o l d p r i m a r y m a g n i f i c a t i o n .T h e a s s i g n m e n t o f s i g n t o c a t e n a n e n o d e s d e p e n d s o n t h es h a d o w e d i m a g e i n t h e e l e c t r o n m i c r o g r a p h b e i n g a n o n i n -v e r t e d r e p l i c a . T h i s w a s e n s u r e d i n t w o w a y s . F i r s t , b y p l a c -i n g t h e g r i d i n t h e m i c r o s c o p e w i t h t h e s h a d o w e d s u r f a c ef a c i n g u p ( t o w a r d t h e e l e c t r o n s o u r c e ) a n d t h e n e g a t i v e i n t h ee n l a r g e r w i t h t h e e m u l s i o n s i d e u p ( t o w a r d t h e l i g h t s o u r c e ) ,t h e s t e r e o s t r u c t u r e o f t h e c a t e n a n e i s c o r r e c t l y p r e s e r v e d .S e c o n d , t h e v i s i b l e r i g h t - h a n d e d h e l i c i t y o f s h a d o w e d DNA-RecA c o m p l e x e s ( 1 8 ) w a s u s e d t o v e r i f y t h e f i d e l i t y o f a l lm i c r o g r a p h s .D e n a t u r a t i o n b u b b l e s s o m e t i m e s s p a n n e d t h e i n t e r s e c t i o no f c a t e n a t e d DNA r i n g s . S u c h i n t e r s e c t i o n s , w h i c h w e r et r e a t e d a s s i n g l e n o d e s , p r o v i d e d a n i n t e r n a l c o n t r o l f o r a s -s i g n m e n t o f DNA o v e r l a p .D e n a t u r a t i o n M a p s . An e x p e r i m e n t a l d e n a t u r a t i o n mapw a s c o n s t r u c t e d f r o m m e a s u r e m e n t s o b t a i n e d w i t h a N u -m o n i c s g r a p h i c s c a l c u l a t o r . T h e l e n g t h d i s t r i b u t i o n o f p a r -t i a l l y d e n a t u r e d DNA was s h a r p ; o n a v e r a g e t h e t w o r i n g s o fa c a t e n a n e d i f f e r e d i n l e n g t h b y o n l y 4 . 1 % . A l l m o l e c u l e st h e r e f o r e w e r e n o r m a l i z e d t o e q u a l l e n g t h .F o r c o m p a r i s o n , a d e n a t u r a t i o n map w a s g e n e r a t e d f r o mt h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f p S l A ( r e f s . 1 9 a n d 2 0 ; R . R e e d ,

F I G . 2 . P a r t i a l l y d e n a t u r e d r e s - c o n t a i n i n g monomer. pA 2 was d i -g e s t e d w i t h N de I t o g e n e r a t e m o n o m e r - l e n g t h l i n e a r m o l e c u l e s par-t i a l l y d e n a t u r e d , a n d c o a t e d w i t h R e c A p r o t e i n b e f o r e e l e c t r o n m i -croscopy. D e n a t u r a t i o n b u b b l e s ( b l , b 2 , and b 3 ) , t h e i n t e r v e n i n g d u -p l e x r e g i o n s ( d 1 2 a n d d 2 3 ) , a n d t h e t e r m i n a l d u p l e x r e g i o n s ( d 3 l a andd 3 l b ) ar e i n d i c a t e d . I n terms o f t h e c i r c u l a r map, d 3 l =d 3 l a + d 3 l b .( x 8 7 , 0 0 0 . )

p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) b y t h e c o m p u t a t i o n a l m e t h o d o fF u n n e l l a n d I n m a n ( 2 1 ) . T h i s m e t h o d i s b a s e d o n t h e c o r r e l a -t i o n b e t w e e n r e g i o n a l A- T c o n t e n t a n d s u s c e p t i b i l i t y t o d e -n a t u r a t i o n . A p l o t o f t h e s l i d i n g a v e r a g e o f A ' T c o n t e n t o v e r3 6 0 b p ( m e a n o b s e r v e d d e n a t u r a t i o n - b u b b l e l e n g t h ) f o r m st h e p r e d i c t e d d e n a t u r a t i o n p r o f i l e .RESULTS

P a r t i a l D e n a t u r a t i o n Map o f r e s - C o n t a i n i n g P l a s m i d . O r i -e n t a t i o n o f a c i r c u l a r m o l e c u l e i n a m i c r o g r a p h r e q u i r e s a tl e a s t t w o d i s t i n g u i s h a b l e o r t h r e e i n d i s t i n g u i s h a b l e l a n d -m a r k s a r r a n g e d a s y m m e t r i c a l l y o n t h e DNA. We t h e r e f o r ef i r s t e s t a b l i s h e d a monomer d e n a t u r a t i o n map w i t h t h e r e q -u i s i t e f e a t u r e s a n d t h e n u s e d i t t o o r i e n t e a c h o f t h e i d e n t i c a lr i n g s i n a c a t e n a n e p r o d u c e d f r o m a d i m e r i c s u b s t r a t e . T h es u b s t r a t e , p A 2 , wa s c l e a v e d w i t h Nde I i n t o m o n o m e r - l e n g t hl i n e a r m o l e c u l e s a n d t h e n t h e r m a l l y d e n a t u r e d i n t h e p r e s -e n c e o f g l y o x a l . G l y o x a l r e a c t s w i t h s i n g l e - s t r a n d e d DNAa n d t h u s p r e v e n t s r e a s s o c i a t i o n o f t h e d u p l e x ( 1 5 ) b u t f o r t u -n a t e l y d i d n o t b l o c k s u b s e q u e n t RecA p r o t e i n - c o a t i n g o f t h et r e a t e d DNA. A f t e r d e n a t u r a t i o n f o r 2 0 m i n , a l a r g e p r o p o r -t i o n o f t h e c o m p l e x e s o f RecA p r o t e i n a n d DNA h a d t h ea p p e a r a n c e o f t h e m o l e c u l e s h o w n i n F i g . 2 . R e g i o n s o f d e -n a t u r a t i o n a r e c l e a r l y i d e n t i f i a b l e a s b u b b l e s ( p a i r s o f b i f u r -c a t i o n s ) i n t h e l i n e a r c o m p l e x e s .T h e l o c a t i o n o f t h e d e n a t u r e d r e g i o n s i n 3 2 s u c h m o l e c u l e si s p l o t t e d i n F i g . 3 ; s i n g l e - a n d d o u b l e - s t r a n d e d DN A a r e o fi d e n t i c a l u n i t l e n g t h u n d e r t h e c o n d i t i o n s u s e d f o r c o a t i n gw i t h RecA p r o t e i n ( 1 6 ) . T h e t h r e e s i n g l e - s t r a n d e d s e c t i o n s o fe a c h m o l e c u l e w e r e a s y m m e t r i c a l l y d i s t r i b u t e d a n d c o u l de a c h b e i d e n t i f i e d b y t h e i r p o s i t i o n r e l a t i v e t o t h e t h r e e n o n -d e n a t u r e d s e c t i o n s o f t h e m o l e c u l e . I n t e r m s o f a c i r c u l a rm a p , t h e d o u b l e - s t r a n d e d r e g i o n s o c c u p i e d 2 0 , 6 , a n d 40% o ft h e monomer l e n g t h ( T a b l e 1 ) . I n a l l c a s e s , t h e s i z e o f a d o u -b l e - s t r a n d e d r e g i o n f e l l o u t s i d e t h e r a n g e s o b s e r v e d f o r t h eo t h e r d o u b l e - s t r a n d e d r e g i o n s . T h u s , a s i n g l e d e n a t u r a t i o np a t t e r n w a s s e e n f o r a l l 3 2 s p e c i m e n s . F i g . 3 a l s o c o n f i r m st h a t t h e l o c a t i o n o f d e n a t u r e d r e g i o n s c a n b e p r e d i c t e d a c c u -r a t e l y f r o m t h e DNA s e q u e n c e .T h e t w o c l o s e l y s p a c e d d e n a t u r e d r e g i o n s ( b 2 a n d b 3 )s o m e t i m e s c o a l e s c e d i n t o o n e l a r g e d e n a t u r e d r e g i o n ( b 2 - 3 )4 0 6 43 2

6 0 )2 4--6 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 5)....52

0 ) 6 4 0 1 2 8 0 1 9 2 0 2 5 6 0 3 2 0 0b p

F I G . 3 . E x p e r i m e n t a l a n d p r e d i c t e d d e n a t u r a t i o n p r o f i l e s . T h ea b s c i s s a m a r k s d i s t a n c e ( i n b p ) f r o m t h e u n i q u e Nde I s i t e i n pA i nt h e c l o c k w i s e d i r e c t i o n o n t h e s t a n d a r d c i r c u l a r p B R 3 2 2 m a p . T h eu ni q u e B g l I s i t e i n pA i s a t p o s i t i o n 1 1 9 0 . F o r t h e e x p e r i m e n t a l d a t a( s h a d e d p r o f i l e ) , t h e l e f t o r d i n a t e i n d i c a t e s t h e n u m b e r o f m o l e c u l e s( o u t o f 3 2 m e a s u r e d ) t h a t a r e d e n a t u r e d a t e a c h p o s i t i o n a l o n g Nde I -g e n e r a t e d l i n e a r DNA. F o r t h e c o m p u t e r - g e n e r a t e d d a t a ( s o l i d l i n e )t h e r i g h t o r d i n a t e r e p r e s e n t s t h e a v e r a g e A- T c o n t e n t f o r a 3 6 0 - b pr e g i o n c e n t e r e d a r o u n d e a c h p o s i t i o n a l o n g t h e c i r c u l a r s u b s t r a t e .A T - r i c h r e g i o n s o f < 5 0 b p a r e n o t e x p e c t e d t o f o r m v i s i b l e d e n a t u r -a t i o n b u b b l e s a n d a r e o m i t t e d f r o m t h e p r e d i c t e d p r o f i l e .

P r o c . N a t L Acad S c i . USA 8 2 ( 1 9 8 5 )

8/3/2019 Steven A. Wasserman and Nicholas R. Cozzarelli- Determination of the stereostructure of the product of Tn3 resolv

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 2 ( 1 9 8 5 ) 1 0 8 1T a b l e 1 . P a r t i a l - d e n a t u r a t i o n map o f r e s - c o n t a i n i n g p l a s m i d

L e n g t h , % o f m o n o m e rL i n e a r m o l e c u l e s C i r c u l a r m o l e c u l e s

F e a t u r e Mean + SD R a n g e Mean + SD R a n g eb , 9 . 9 2 . 3 5 . 7 - 1 4 . 4 9 . 9 1 . 8 6 . 9 - 1 2 . 9b 2 1 3 . 5 2 . 7 6 . 7 - 1 8 . 0 1 5 . 0 2 . 0 1 1 . 2 - 1 9 . 3b 3 1 0 . 3 3 . 4 4 . 8 - 2 1 . 1 8 . 3 2 . 3 5 . 3 - 1 5 . 4d 1 2 2 0 . 4 3 . 2 1 4 . 5 - 2 6 . 9 1 7 . 5 + 2 . 9 1 2 . 2 - 2 2 . 2d 2 3 6 . 0 2 . 3 2 . 5 - 1 1 . 8 6 . 1 1 . 8 3 . 0 - 1 0 . 4d 3 l 3 9 . 8 4 . 2 2 9 . 3 - 4 6 . 4 4 3 . 1 2 . 9 3 7 . 4 - 4 8 . 2b 2 - 3 2 9 . 9 2 . 8 2 3 . 0 - 3 3 . 2 2 5 . 7 3 . 2 2 0 . 4 - 3 1 . 3Mean SD a n d r a n g e o f o b s e r v e d l e n g t h s f o r s e v e n f e a t u r e s o ft h e p a r t i a l d e n a t u r a t i o n map f o r pA e q u i v a l e n t s a r e g i v e n a s p e r -c e n t o f monomer l e n g t h ( s e e l e g e n d t o F i g . 2 f o r n o m e n c l a t u r e ) .L e n g t h s o f t h e t h r e e d e n a t u r a t i o n b u b b l e s ( b l , b 2 , a n d b 3 ) a n d t h ed i s t a n c e s e p a r a t i n g t h e m ( d 1 2 , d 2 3 , a n d d 3 j ) a r e s h o w n f o r a s e t o f 3 2l i n e a r a n d 3 1 c i r c u l a r m o l e c u l e s . L e n g t h o f t h e c o a l e s c e d b u b b l e( b 2 - 3 ) f o r a s e c o n d s e t o f 1 1 l i n e a r a n d 9 c i r c u l a r m o l e c u l e s i s a l s og i v e n . L i n e a r m o n o m e r s a r e p A 2 d i g e s t e d w i t h Nde I ; c i r c u l a rm o n o m e r s a r e c a t e n a n e r i n g s f r o m r e c o m b i n e d p A 2 .

( F i g . 4 ) . H o w e v e r , f o r m a t i o n o f t h i s l a r g e ( 2 0 - 3 3 % monomerl e n g t h ) b u b b l e d i d n o t m a k e t h e o r i e n t a t i o n o f a monomerr i n g a m b i g u o u s s i n c e b 2 - 3 a n d t h e o t h e r b u b b l e ( b 1 ) w e r ea s y m m e t r i c a l l y s i t u a t e d a n d o f m e a s u r a b l y d i f f e r e n t l e n g t h( T a b l e 1 , c o m p a r e d 1 2 w i t h d 3 1 a n d b 1 w i t h b 2 - 3 ) . T h u s , wec o u l d r e l i a b l y i d e n t i f y t h e s e q u e n c e o r i e n t a t i o n o f r i n g s w i t he i t h e r t h r e e d e n a t u r e d r e g i o n s o r o n e s m a l l a n d o n e l a r g ed e n a t u r e d r e g i o n .D e t e r m i n a t i o n o f C a t e n a n e L i n k a g e . M o l e c u l e s o f p A 2w e r e r e a c t e d w i t h r e s o l v a s e a n d t h e n n i c k e d o n c e p e rr e c o m b i n a n t r i n g t o r e m o v e s u p e r c o i l s . T h i s n i c k e d DNAw a s p a r t i a l l y d e n a t u r e d , c o m p l e x e d w i t h R e c A , a n d e x a m -i n e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y . M i c r o g r a p h s w e r e t a k e n o f c a t -e n a n e s i n w h i c h a l l n o d e s a n d d e n a t u r a t i o n b u b b l e s c o u l d b ed i s c e r n e d c l e a r l y . When t h e s e m o l e c u l e s w e r e m e a s u r e d ,t h e d i s t r i b u t i o n o f s i n g l e - s t r a n d e d a n d d o u b l e - s t r a n d e d r e -g i o n s i n b o t h r i n g s f i t t h e e s t a b l i s h e d map v e r y w e l l ( c o m -p a r e l i n e a r a n d c i r c u l a r m o l e c u l e s i n T a b l e 1 ) , a l l o w i n g u n -a m b i g u o u s o r i e n t a t i o n o f e v e r y c a t e n a t e d c i r c l e .A l l o f t h e p r o d u c t s o f r e c o m b i n a t i o n e x a m i n e d w e r e s i n g l yi n t e r l o c k e d . E a c h r i n g o f t h e s e c a t e n a n e s w a s o r i e n t e d , t h eo v e r l a p a t e a c h c r o s s i n g w a s d e t e r m i n e d , a n d t h e s i g n o fe a c h n o d e w a s e v a l u a t e d . T h e c a t e n a n e i n F i g . 5 t h u s w a ss e e n t o b e h e l d t o g e t h e r b y a n i n t e r l o c k c o n s i s t i n g o f 2 n e g a -t i v e n o d e s . I t s l i n k a g e v a l u e , t h e su m o f t h e n o d e t e r m s , i st h e r e f o r e - 2 ( 5 ) .I n t e r p r e t a t i o n o f s o m e c a t e n a n e s r a n d o m l y n i c k e d w i t hDNase I w a s d i f f i c u l t , o w i n g t o d e n a t u r a t i o n - b u b b l e s c i s s i o na n d c o n s e q u e n t m a p p i n g a m b i g u i t y . W e t h e r e f o r e t u r n e d t oa n i c k i n g m e t h o d s p e c i f i c f o r - a s i t e i n a n o n d e n a t u r e d p o r -t i o n o f e a c h r e c o m b i n a n t r i n g . W e u s e d t h e r e s t r i c t i o n e n -z y m e B g l I i n t h e p r e s e n c e o f e t h i d i u m b r o m i d e ( 1 4 ) t o n i c ka t i t s r e c o g n i t i o n s e q u e n c e i n a g u a n i n e . c y t o s i n e ( G C ) - r i c hr e g i o n o f t h e DNA ( s e e l e g e n d t o F i g . 3 ) . As s e e n i n F i g . 6 ,

F I G . 4 . P a r t i a l l y d e n a t u r e d d i m e r i c s u b s t r a t e . ( A ) E l e c t r o n m i -c r o g r a p h o f t h e d i m e r i c s u b s t r a t e p A 2 a f t e r n i c k i n g w i t h DNase I ,p a r t i a l d e n a t u r a t i o n , a n d c o a t i n g w i t h RecA p r o t e i n . ( x 7 8 , 0 0 0 . ) ( B )T r a c i n g o f m o l e c u l e . S i n g l e - s t r a n d e d r e g i o n s a r e d r a w n a s t h i n l i n e s ,a n d d o u b l e - s t r a n d e d r e g i o n s a s t h i c k l i n e s . N o m e n c l a t u r e i s d e -s c r i b e d i n l e g e n d t o F i g . 2 , e x c e p t t h a t t h e c o a l e s c e d r e g i o n f o r m e df r o m b 2 a n d b 3 i s d e n o t e d b 2 - 3 . P r i m e d d e s i g n a t i o n s d i s t i n g u i s h o n eo f t h e monomer l e n g t h s o f p A 2 .s h o r t t a i l s o f s i n g l e - s t r a n d e d DNA w e r e f r e q u e n t l y f o u n d a tt h e p o s i t i o n o f t h e B g l I s i t e , p r o v i d i n g a n a d d i t i o n a l l a n d -m a r k .I n a d d i t i o n t o t h e c a t e n a n e s s h o w n i n F i g s . 5 a n d 6 , 1 8o t h e r c a t e n a n e s c h a r t e d i n T a b l e 1 w e r e a l s o a n a l y z e d . T h i ss e t o f m o l e c u l e s i n c l u d e d b o t h r a n d o m l y a n d s i t e - s p e c i f i c a l l yn i c ke d c a t e n a n e s a n d 9 m o l e c u l e s i n w h i c h o n e r i n g h a d t h ec o a l e s c e d b 2 - 3 s t r u c t u r e . I n a l l 2 0 c a s e s t h e l i n k a g e v a l u e w a s- 2 .

DISCUSSIONW e p r e s e n t a g e n e r a l t e c h n i q u e f o r d e t e r m i n i n g t h e s t r u c t u r eo f c a t e n a n e s . T h e DNA i s f i x e d i n a p a r t i a l l y d e n a t u r e df o r m , c o a t e d w i t h RecA p r o t e i n , a n d v i e w e d b y e l e c t r o n m i -c r o s c o p y . I f t h e i n i t i a l a r r a n g e m e n t o f A T - r i c h s e q u e n c e s i na s u b s t r a t e d o e s n o t r e s u l t i n a d e n a t u r a t i o n p a t t e r n o f u n a m -b i g u o u s o r i e n t a t i o n , a p p r o p r i a t e p i e c e s o f DNA c a n b e i n -

F I G . 5 . P a r t i a l l y d e n a t u r e d r e s o l v a s e -g e n e r a t e d c a t e n a n e . ( A ) M i c r o g r a p h o fc a t e n a t e d p r o d u c t o f r e s o l v a s e r e a c t i o nw i t h p A 2 a f t e r DNase I - n i c k i n g , p a r t i a ld e n a t u r a t i o n , a n d c o a t i n g w i t h R e c A .( x 6 3 , 0 0 0 . ) ( B ) T r a c i n g o f m o l e c u l e . T h ec a t e n a n e i s r e p r e s e n t e d b y b l a c k a n dg r a y r i n g s . N o m e n c l a t u r e i s t h a t o f F i g s .2 a n d 4 . ( C ) I d e a l i z e d d r a w i n g o f m o l e -c u l e . A r r o w s p o i n t i n t h e d i r e c t i o n o f t h ep a t h f r o m b , t o b 2 a n d b 3 . S i g n o f e a c hn o d e w a s a s s i g n e d a c c o r d i n g t o t h e c o n -v e n t i o n i l l u s t r a t e d i n F i g . 1 .

B i o c h e m i s t r y : W a s s e r m a n a n d C o z z a r e l l i

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1 0 8 2 B i o c h e m i s t r y : W a s s e r m a n a n d C o z z a r e l l i

b 3 - , , ;

Ib/bb

F I G . 6 . P a r t i a l l y d e n a t u r e d r e c o m b i n a n t c a t e n a n e w i t h s i t e - s p e -c i f i c n i c k s . R e s o l v a s e - g e n e r a t e d c a t e n a n e i s s h o w n a f t e r B g I I - n i c k -i n g , p a r t i a l d e n a t u r a t i o n , a n d R e c A - c o a t i n g . A r r o w s i n d i c a t e s i n g l e -s t r a n d e d t a i l s i n i t i a t e d a t t h e B g I I r e c o g n i t i o n s i t e . ( x 9 6 , 0 0 0 . )s e r t e d o r r e m o v e d b y r e c o m b i n a n t DNA t e c h n i q u e s . T h e r e -s u l t a n t d e n a t u r a t i o n p r o f i l e c a n b e p r e d i c t e d r e a d i l y f r o m t h ed i s t r i b u t i o n o f a d e n o s i n e a n d t h y m i d i n e r e s i d u e s i n t h e DNAs e q u e n c e ( s e e F i g . 3 ) .T r e a t m e n t w i t h g l y o x a l a n d RecA i s c o m p a r a b l e t o o t h e rt e c h n i q u e s f o r p a r t i a l d e n a t u r a t i o n m a p p i n g i n t e r m s o f a c c u -r a c y a n d r e p r o d u c i b i l i t y . An a d v a n t a g e i s t h a t RecA-DNAc o m p l e x e s may b e a p p l i e d d i r e c t l y t o g r i d s f o r e l e c t r o n m i -

c r o s c o p y , u s i n g l e s s m a t e r i a l a n d g i v i n g a c l e a n e r m i c r o -g r a p h b a c k g r o u n d t h a n t h e c y t o c h r o m e c m e t h o d . U n l i k eo t h e r d e n a t u r a t i o n m e t h o d s t h a t r e l y o n D N A - b i n d i n g p r o -t e i n s , s u c h a s b a c t e r i o p h a g e T 4 g e n e 3 2 p r o t e i n ( 2 2 ) , t h i st e c h n i q u e y i e l d s s i n g l e - a n d d o u b l e - s t r a n d e d DNA o f i d e n t i -c a l u n i t l e n g t h a n d m o r p h o l o g y .W e h a v e s h o w n t h a t t h e i n t e r l o c k o f t h e c a t e n a n e s p r o -d u c e d b y T n 3 r e s o l v a s e i s e x c l u s i v e l y n e g a t i v e , t h e sames i g n a s t h a t o f t h e s u p e r c o i l s i n t h e s u b s t r a t e DNA. T h a t t h ec a t e n a n e s a r e a l w a y s s i n g l y i n t e r l o c k e d , i r r e s p e c t i v e o f s u b -s t r a t e s u p e r h e l i c i t y ( 1 2 ) , i n d i c a t e s , h o w e v e r , t h a t n e g a t i v es u p e r c o i l s a r e n o t i n c l u d e d r a n d o m l y i n t h e s y n a p t i c c o m -p l e x . T h u s r e s o l v a s e - m e d i a t e d r e c o m b i n a t i o n c o n t r a s t ss h a r p l y w i t h t h a t m e d i a t e d b y t h e p h a g e X i n t g e n e p r o d u c t ,i n w h i c h a s u b s t a n t i a l a n d v a r i a b l e n u m b e r o f s u b s t r a t e s u -p e r c o i l s a r e c o n v e r t e d i n t o c a t e n a n e i n t e r w i n d i n g s ( 7 ) .T h e o r i g i n o f t h e n o d e s t h a t i n t e r l o c k r e s o l v a s e c a t e n a n e sc a n b e s t a t e d p r e c i s e l y . T h e r e c o m b i n a t i o n s i t e s d i v i d e t h es u b s t r a t e i n t o t w o d o m a i n s t h a t a r e c o n v e r t e d b y r e c o m b i n a -t i o n i n t o t h e t w o l i n k e d p r o d u c t r i n g s . A c r o s s i n g o f a s e g -m e n t f r o m e a c h o f t h e s e s u b s t r a t e d o m a i n s d e f i n e s a n i n t e r -d o m a i n a l s u p e r c o i l . T h e n u m b e r o f s u c h s u p e r c o i l s a t s i t ea l i g n m e n t p l u s t h e n e t l o s s o r g a i n c o n s e q u e n t t o t h e s t r a n d -e x c h a n g e m e c h a n i s m e q u a l s t h e c a t e n a n e l i n k a g e v a l u e ( 5 ) .S i n c e t h e l i n k a g e v a l u e w a s a c o n s t a n t , - 2 , r e s o l v a s e p r e -s u m a b l y f i x e s e a c h o f t h e s e t w o t e r m s , c o n t r o l l i n g b o t h t h en u m b e r a n d f a t e o f s y n a p t i c i n t e r d o m a i n a l s u p e r c o i l s .W e h a v e d e v i s e d a m o d e l , d i a g r a m m e d i n F i g . 7 , t h a t p r o -v i d e s v a l u e s f o r t h e s e l i n k a g e t e r m s . T h i s s c h e m e a c c o u n t sf o r t h e a p p e a r a n c e o f t h e s i n g l y i n t e r l o c k e d c a t e n a n e s a sw e l l a s t h e r a r e , m o r e c o m p l e x p r o d u c t s o f t h e r e s o l v a s e r e -a c t i o n s . S u c h c o m p l e x p r o d u c t s e a c h m a k e u p a b o u t 1% o ft h e t o t a l p r o d u c t a n d i n c l u d e t o p o l o g i c a l f o r m s w h o s e s t e r e -o s t r u c t u r e i s i n d e p e n d e n t o f DNA o r i e n t a t i o n . I t t h e r e f o r ew a s p o s s i b l e t o d e t e r m i n e b y t h e R e c A - c o a t i n g m e t h o da l o n e t h a t t h e s i m p l e s t o f t h e s e f o r m s were a 4 - n o d e d k n o ta n d a f i g u r e - 8 c a t e n a n e , w h o s e s t r u c t u r e s a r e s h o w n i n F i g .

S u b s t r a t e S i n g l y l i n k e d c a t e n a n e 4 - n o d e d k n o t F i g u r e - 8 c a t e n a n eF I G . 7 . M o d e l o f r e s o l v a s e r e c o m b i n a t i o n . T h e t w o d i r e c t l y r e p e a t e d r e s s i t e s ( t h i c k e n e d a r r o w s ) d i v i d e t h e s u p e r c o i l e d s u b s t r a t e i n t o t w od o m a i n s o f DNA, i n d i c a t e d b y b l a c k a n d g r a y l i n e s . F o r s i m p l i c i t y , o n l y t h e t h r e e i n t e r d o m a i n a l s u p e r c o i l s a r e s h o w n . M o l e c u l e s i n t h e u p p e rr o w a r e i m a g i n e d b o u n d t o r e s o l v a s e , w i t h t h r e e s u c c e s s i v e r o u n d s o f r e c o m b i n a t i o n d r a w n f r o m l e f t t o r i g h t . T h e b o t t o m r o w o f s t r u c t u r e sr e p r e s e n t r e s o l v a s e - f r e e s u b s t r a t e a n d p r o d u c t s d r a w n i n s t a nd a r d f o r m. E a c h r o u n d o f r e c o m b i n a t i o n i s d i v i d e d i n t o t w o s t a g e s : t h e d i r e c tp r o d u c t o f c r o s s i n g - o v e r i s f o r m e d ( s o l i d p a t h w a y a r r o w ) a n d t h e n i s r e a rr a ng e d ( o p en p a t h w a y a r r o w ) t o r e s t o r e p a r a l l e l r e s - s i t e s y n a p s i s . T h es u b s t r a t e h a s 3 ( - ) i n t e r d o m a i n a l s u p e r c o i l s , a n d e a c h r o u n d o f r e c o m b i n a t i o n i n t r o d u c e s a ( + ) i n t er d o m ai n al n o d e . A c c o r di n g ly , t h e i m m e d i -a t e p r o d u c t o f a s i n g l e r o u n d o f r e c o m b i n a t i o n h a s 3 ( - ) n o d e s a n d 1 ( + ) n o d e . I f r e l e a s e d f r o m t h e p r o t e i n , t h i s DNA c a n u n f o l d t o a s t r u c t u r ew i t h j u s t 2 ( - ) n o d e s , t h e s i n g l y i n t e r l i n k e d c a t e n a n e . I f t h e p r o d u c t i s n o t r e l e a s e d , s u c c e s s i v e r o u n d s o f r e c o m b i n a t i o n c a n o c c u r , y i e l d i n gm o r e c o m p l e x s t r u c t u r e s i n w h i c h s u c ce s s i ve p r o du c t s a r e a l t e r n a t e l y k n o t s a n d c a t e n a n e s . T h e s e c o n d r o u n d p r o d u c t i s a 4 - n o d e d [ 2 ( + ) a n d 2( - ) ] k n o t a n d t h e t h i r d i s a 5 - n o d e d [ 3 ( + ) a n d 2 ( - ) ] f i g u r e - 8 c a t e n a n e , a s s h o w n . B o t h o f t h e s e a l s o r e t a i n a ( - ) s u p e r c o i l b e c a u s e n o n e o f t h e i rn o d e s c a n b e c a n c e l l e d b y u n f o l d i n g . T h e t w o ( - ) s u b s t r a t e i n t e r d o m a i n a l n o d e s s h o w n n e a r e a c h r e s s i t e c o u l d b e d u e t o s o l e n o i d a l w r a p s o fe a c h s i t e a r o u n d t h e r e s o l v a s e . T h e t h i r d ( - ) n o d e b e t w e e n t h e r e s s i t e s w o u l d b e f i x e d b y e n z y m e g e o m e t r y o r p e r h a p s b y t h e n e g a t i v es u p e r h e l i c i t y o f t h e s u b s t r a t e .

P r o c . N a t L Acad S c i . USA 8 2 ( 1 9 8 5 )

8/3/2019 Steven A. Wasserman and Nicholas R. Cozzarelli- Determination of the stereostructure of the product of Tn3 resolv

5/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 2 ( 1 9 8 5 ) 1 0 8 37 ( r e f . 1 1 ; A . S t a s i a k , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . N e i t h e rs t r u c t u r e i s e x p e c t e d f r o m a s i m p l e , s i n g l e r o u n d o f r e c o m b i -n a t i o n . T h e f a c t t h a t t h e f i g u r e - 8 c a t e n a n e a l w a y s h a s a n e n -t r a p p e d p o s i t i v e s u p e r c o i l ( 1 1 ) i s p a r t i c u l a r l y s u r p r i s i n g i nl i g h t o f t h e n e g a t i v e s u p e r h e l i c i t y o f t h e s u b s t r a t e . I n o u rm o d e l , t h e s e s t r u c t u r e s a r i s e f r o m a n i n f r e q u e n t i t e r a t i o n o ft h e b a s i c m e c h a n i s m f o r f o r m i n g s i n g l y l i n k e d c a t e n a n e s .T h e u p p e r r o w i n F i g . 7 d e p i c t s t h r e e s u c c e s s i v e s t r a n d -e x c h a n g e e v e n t s o f DNA t h a t i s i m a g i n e d b o u n d t o r e s o l -v a s e ; t h e l o w e r r o w i s a r e d r a w i n g o f s u b s t r a t e a n d p r o d u c t si n s t a n d a r d f o r m . O n c e t h e f i r s t c r o s s i n g - o v e r t a k e s p l a c e ,r e s o l v a s e n o r m a l l y d i s s o c i a t e s f r o m t h e DNA, r e l e a s i n g t h es i n g l y i n t e r l i n k e d c a t e n a n e t h a t i s i n e r t t o f u r t h e r r e a c t i o n( 9 ) . We p o s t u l a t e t h a t o c c a s i o n a l l y t h e p r o t e i n a c t s p r o c e s -s i v e l y , f a i l i n g t o d i s s o c i a t e a n d c a r r y i n g o u t f u r t h e r c r o s s -o v e r s t h a t g e n e r a t e , s u c c e s s i v e l y , t h e 4 - n o d e d k n o t a n d t h ef i g u r e - 8 c a t e n a n e . T h e i n t e r d o m a i n a l l i n k a g e c h a n g e i n r e -c o m b i n a t i o n , d e f i n e d b y t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n s u c c e s s i v ep r o d u c t s , i s i n t h i s m o d e l a s i n g l e p o s i t i v e n o d e . A p o s i t i v el i n k a g e c h a n g e i s e q u i v a l e n t t o a l o s s o f a n e g a t i v e s u p e r c o i l ;i t t h e r e f o r e w o u l d b e e n e r g e t i c a l l y f a v o r e d .T h e s y n a p s e d s u b s t r a t e i n F i g . 7 h a s t w o r e s s i t e s a l i g n e di n p a r a l l e l a n d t h r e e i n t e r d o m a i n a l s u p e r c o i l s b e t w e e n t h e s es i t e s . I t h a s b e e n s h o w n e l s e w h e r e ( 5 ) t h a t f o r r e c o m b i n a t i o no f d i r e c t l y r e p e a t e d s i t e s , a + 1 m e c h a n i s m r e q u i r e s p a r a l l e l -s i t e s y n a p s i s a n d a n o d d n u m b e r o f i n t e r d o m a i n a l s u p e r -c o i l s . To g e n e r a t e t h e o b s e r v e d r e s o l v a s e p r o d u c t s - t h e s i n -g l y l i n k e d c a t e n a n e , t h e 4 - n o d e d k n o t , a n d t h e f i g u r e - 8 c a t -e n a n e - t h e r e m u s t b e t h r e e i n t e r d o m a i n a l s u p e r c o i l s a n dt h e y m u s t b e n e g a t i v e i n s i g n . T h e l i n k a g e v a l u e o f t h e s i n g l yl i n k e d c a t e n a n e s d i d n o t e n t e r i n t o t h i s d e r i v a t i o n b u t i sc l e a r l y p r e d i c t e d t o b e - 3 + 1 o r - 2 . O u r f i n d i n g t h a t t h i s i si n d e e d t r u e s u p p o r t s o u r m o d e l f o r r e c o m b i n a t i o n .T h e a c c o m m o d a t i o n o f e x a c t l y t h r e e i n t e r d o m a i n a l s u p e r -c o i l s a t s y n a p s i s c a n b e e n s u r e d o n l y i n v e r y l i m i t e d w a y s .T h e s i m p l e s t may b e p i c t u r e d a s s o l e n o i d a l w r a p p i n g o fDNA a r o u n d t h e p r o t e i n , a s o c c u r s w i t h n u c l e o s o m e s ( 2 3 )a n d a s p o s t u l a t e d f o r I n t p r o t e i n ( 2 4 , 2 5 ) . I f , a t e a c h r e s s i t e ,r e s o l v a s e m o l e c u l e s a r e e n c i r c l e d b y o n e o r m o r e DNAw r a p s , o n e ( b u t o n l y o n e ) n e g a t i v e i n t e r d o m a i n a l s u p e r c o i lc a n b e f o r m e d a t e a c h s i t e , a s i s d i a g r a m m e d i n F i g . 7 . T h et h i r d n e g a t i v e i n t e r d o m a i n a l n o d e c a n b e c o n s t r a i n e d b e -t w e e n t h e t w o s o l e n o i d s b y t h e s t r u c t u r e o f t h e r e s o l v a s e -DNA c o m p l e x .I t s h o u l d b e e m p h a s i z e d t h a t a l t h o u g h t h e d a t a a r e i n e x -c e l l e n t a g r e e m e n t w i t h o u r m o d e l f o r s y n a p s i s a n d r e c o m b i - .n a t i o n , o t h e r , a l b e i t m o r e c o m p l e x , m e c h a n i s m s a l s o c a n e x -p l a i n o u r o b s e r v a t i o n s . H o w e v e r , t h e m o d e l w e p r e s e n t c a nb e t e s t e d r e a d i l y , s i n c e f u r t h e r i t e r a t i v e r e c o m b i n a t i o ne v e n t s s h o u l d y i e l d m o r e c o m p l e x s t r u c t u r e s o f s p e c i f i c g e -o m e t r y . I n t p r o t e i n a l s o may e n t r a p n e g a t i v e i n t e r d o m a i n a ls u p e r c o i l s a n d i n t r o d u c e a s i n g l e i n t e r d o m a i n a l n o d e i n t h ec o u r s e o f r e c o m b i na t i o n ( 2 4 , 2 6 ) . B o t h t h e m e t h o d o l o g y a n dt h e b a s i c m e c h a n i s m p r e s e n t e d h e r e t h e r e f o r e may h a v ew i d e s p r e a d a p p l i c a b i l i t y .

We t h a nk R o b l e y W i l l i a m s f o r s h a r i n g a d v i c e a n d f a c i l i t i e s f o re l e c t r o n m i c r o s c o p y , M a r k N a v r e f o r a s s i s t a n c e i n g e n e r a t i n g t h ep r e d i c t e d d e n a t u r a t i o n m a p , a n d E l i s a b e t h L i n d h e i m f o r h e l p i n p r e -p a r i n g t h e m a n u s c r i p t . We a l s o t h a nk A n d r ze j S t a s i a k f o r h e l p f u ld i s c u s s i o n s a n d K e v i n McEntee f o r s u p p l y i n g R e c A p r o t e i n .S . A . W . i s a f e l l o w o f t h e M i l l e r I n s t i t u t e f o r B a s i c R e s e a r c h i n S c i -e n c e . T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t hG r a n t s G M 3 1 6 5 5 a n d G M 3 1 6 5 7 .

1 . K a s a m a t s u , H . & V i n o g r a d , J . ( 1 9 7 4 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 4 3 ,6 9 5 - 7 1 9 .2 . N a s h , H . A . ( 1 9 8 1 ) A n n u . R e v . G e n e t . 1 5 , 1 4 3 - 1 6 7 .3 . E n g l u n d , P . T . , H a j d u k , S . L . & M a r i n i , J . C . ( 1 9 8 2 ) A n n u .R e v . B i o c h e m . 5 1 , 6 9 5 - 7 2 6 .4 . S u n d i n , 0 . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 8 0 ) C e l l 2 1 , 1 0 3 - 1 1 4 .5 . C o z z a r e l l i , N . R . , K r a s n o w , M. A . , G e r r a r d , S . P . & W h i t e ,J . H . ( 1 9 8 4 ) C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . 4 9 , i np r e s s .6 . D i N a r d o , S . , V o e l k e l , K . & S t e r n g l a n z , R . ( 1 9 8 4 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . US A 8 1 , 2 6 1 6 - 2 6 2 0 .7 . M i z u u c h i , K . , G e l l e r t , M . , W e i s b e r g , R . A . & N a s h , H . A .( 1 9 8 0 ) J . M o l . B i o l . 1 4 1 , 4 8 5 - 4 9 4 .8 . R e e d , R . R . ( 1 9 8 1 ) C e l l 2 5 , 7 1 3 - 7 1 9 .9 . K r a s n o w , M . A . & C o z z a r e l l i , N . R . ( 1 9 8 3 ) C e l l 3 2 , 1 3 1 3 -1 3 2 4 .1 0 . I n m a n , R . B . ( 1 % 6 ) J . M o l . B i o l . 1 8 , 4 6 4 - 4 7 6 .1 1 . K r a s n o w , M . A . , S t a s i a k , A . , S p e n g l e r , S . J . , D e a n , F . ,K o l l e r , T h . & C o z z a r e l l i , N . R . ( 1 9 8 3 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 4 ,5 5 9 - 5 6 0 .1 2 . B e n j a m i n , H . W . , M a t z u k , M . M . , K r a s n o w , M . A . & C o z z a r -e l l i , N . R . ( 1 9 8 5 ) C e l l , i n p r e s s .1 3 . G r e e n f i e l d , L . , S i m p s o n , L . & K a p l a n , D . ( 1 9 7 5 ) B i o c h i m .B i o p h y s . A c t a 4 7 0 , 3 6 5 - 3 7 5 .1 4 . S h o r t l e , D . & N a t h a n s , D . ( 1 9 7 8 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA7 5 , 2 1 7 0 - 2 1 7 4 .1 5 . J o h n s o n , D . ( 1 9 7 5 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 2 , 2 0 4 9 - 2 0 5 4 .1 6 . K o l l e r , T h . , D i C a p u a , E . & S t a s i a k , A . ( 1 9 8 3 ) i n M e c h a n i s m so f DNA R e p l i c a t i o n a n d R e c o m b i n a t i o n , e d . C o z z a r e l l i , N . R .( L i s s , N e w Y o r k ) , V o l . 1 0 , p p . 7 2 3 - 7 2 9 .1 7 . W i l l i a m s , R . C . ( 1 9 7 7 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 4 , 2 3 1 1 -2 3 1 5 .1 8 . D i C a p u a , E . , E n g e l , A . , S t a s i a k , A . & K o l l e r , T h . ( 1 9 8 2 ) J .M o l . B i o l . 1 5 7 , 8 1 - 1 0 3 .1 9 . S u t c l i f f e , J . G . ( 1 9 7 9 ) C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l .4 3 , 7 7 - 9 0 .2 0 . R e e d , R . R . , S h i b u y a , G . I . & S t e i t z , J . A . ( 1 9 8 2 ) N a t u r e( L o n d o n ) 3 0 0 , 3 8 1 - 3 8 3 .2 1 . F u n n e l l , B . E . & I n m a n , R . B . ( 1 9 7 9 ) J . M o l . B i o l . 1 3 1 , 3 3 1 -3 4 0 .2 2 . D e l i u s , H . , M a n t e l l , N . J . & A l b e r t s , B . ( 1 9 7 2 ) J . M o l . B i o l . 6 7 ,3 4 1 - 3 5 0 .2 3 . R i c h m o n d , T . J . , F i n c h , J . T . & K l u g , A . ( 1 9 8 2 ) C o l d S p r i n gH a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . 4 7 , 4 9 3 - 5 0 2 .2 4 . P o l l o c k , T . J . & N a s h , H . A . ( 1 9 8 3 ) J . M o l . B i o l . 1 7 0 , 1 - 1 8 .2 5 . E c h o l s , H . , D o d s o n , M . , B e t t e r , M . , R o b e r t s , J . D . &M c M a c k e n , R . ( 1 9 8 4 ) C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l .4 9 , i n p r e s s .2 6 . S p e n g l e r , S . J . , S t a s i a k , A . , S t a s i a k , A l . & C o z z a r e l l i , N . R .( 1 9 8 4 ) C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . 4 9 , i n p r e s s .

B i o c h e m i s t r y : W a s s e r m a n a n d C o z z a r e l l i