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Somatische Gentherapie
Teil 6
Definition Somatische Gentherapie Genetische Krankheiten Virale Transfersysteme (Retroviren, Adenoviren) Nicht-Virale Transfersysteme (Liposomen, PEI-Partikel, Naopartikel)
Was ist Gentherapie ?
Lucas Cranach d. Ä., 1546
Was ist Gentherapie ?
Die Übertragung und Expression von Nukleinsäure(n) in ein bestimmtes Gewebe oder Zelle mit dem Ziel die funktionelle Einheit zu
verändern oder neu einzusetzen, um einen heilenden oder prophylaktischen Effekt für den Patienten zu erzielen.
Therapeutisches Gen
Vektor +
klau
surr
elev
ant
Gentherapie
• Keimzellen (beim Menschen nach EschG §5 verboten)
• Körperzellen (Somatische Gentherapie)
Einbringen heterologer DNA in
klau
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elev
ant
Genetische Erkrankungen
Krankheitstypen Monogenetische Erberkrankung Polygenetische Erberkrankungen Erworbene genetische Störung
Beispiele Hämophilie, Sichelzellenanämie Adenosin-Deaminase-Defizit Zystische Fibrose Duchennsche Muskeldystrophie Familiäre Hypercholesterämie Krebs, Herz-Kreislauf AIDS, Hepatitis
ADA und Purinstoffwechsel
IMP ↔ AMP ↔ ADP ↔ ATP dAMP ↔ dADP ↔ dATP
Adenosin 2-Deoxyadenosin
Inosin 2-Deoxyinosin
Adenosin- Deaminase
Akumulation
Biochemische Grundlagen der ADA-Defizienz
dAMP ↔ dADP ↔ dATP
2-Deoxyadenosin
2-Deoxyinosin
Adenosin- Deaminase
Akumulation Inhibition der
Ribonucleotid-Reduktase Folge:
Keine DNA-Replikation
Apoptose
Keine T-Zellaktivierung
Ashanthi DeSilva (14)
Dystrophin-Komplex
DNA-Typen
• Lineare DNA (Bsp. Antisenseoligonukleotide) • Plasmid-DNA
DNA-Typen
• Lineare DNA (Bsp. Antisenseoligonukleotide) • Plasmid-DNA
• Therapeutisches Gen - Codierung eines therapeutischen
Proteins • Genexpressionssystem - Kontrolle über die Funktion des Genexpressionssystems in der Zielzelle • Abgabe- (Delivery)-System - Kontrolle der zellulären Verteilung des Plasmids im Zielgewebe oder an die Zielzelle
Plasmid
Formulierung
klau
surr
elev
ant
GentransferGentransfer--ArzneimittelArzneimittel
genetisch modifizierteZellen
Vektoren, Nukleinsäuren, vermehrgsf. Mikroorg.
1) Reinigung der Zielzellen(autolog oder allogen,xenogene Zellinien)
2) Gentransfer
3) Re-Infusiongen. modifizierter Zellen
direkte Anwendung:
virale Vektoren
nicht-virale Vektoren
nackte Nukleinsäuren
vermehrungsfähige Mikroben(Adenovirus, Salmonella)
Zellinie
Zelle
Gentherapeutische Strategien 1. Addition zu einem defekten Gen
3. Antisense Inhibition eines Gen
mRNA
Antisense-RNA
Translation
2. Substitution eines fehlenden Gen + Produktion eines
therapeutischen Proteins
Virale Vektoren für den Gentransfer
rekombinante • Adenoviren • Adeno-assoziierte Viren (AAV) • Mäuse-Retroviren • Herpes-Viren • Vaccinia-Viren • Masern-Viren • Sendai-Viren • Lentiviren (HIV, SIV, EIV, FIV)
ex-vivo-Therapie mit Retroviren Prinzip: 1. Entnahme von Zellen aus betreffender Person 2. Korrektur des genetischen Defekts durch Gentransfer 3. Selektion und Vermehrung der genetisch korrigierten (therapeutischen)
Zellen 4. Rückführung dieser Zellen in den Patienten per Infusion oder Transplantation Erstellung eines Retrovirusvektor:
gag pol env
5‘-LTR 3‘-LTR
ψ+
Gen x NeoR
5‘-LTR 3‘-LTR
ψ+
Häufig eingesetzt: Moloney murine leukemia virus MMLV
Zu exprimierendes Gen Resistenzmarkre
Promoter
B gag: Capsid pol: Transcriptase env: Hülle LTR: Long Terminal Repetion
Produktion verpackter Retrovirus-VektorRNA
klau
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Vor- und Nachteile des retroviralen Systems
Vorteile: Hohe Transduktionseffizienz
Insertionsgröße bis 8 kb stabile Integration und Expression sehr gut studierte biologische Systeme Vektorproteine werden im Wert nicht exprimiert
Nachteile Integration nur in sich teilende Zellen möglich
Geringe Titer Integration ist nur zufällig Geringe Infektionsraten in vivo, deshalb Einsatz einer Packungzelllinie
Beispiel der Herstellung
rekombinanter replikationsdefekter
Ad5
Vor- und Nachteile des adenoviralen Systems
Vorteile: Hohe Transduktionseffizienz
Insertionsgröße bis 8 kb hohe Titer infiziert teilende und ruhende Zellen
Nachteile Integration ist transient (virale DNA wird nicht integriert) Expression von viralen Proteinen Integration ist nur zufällig In vivo Infektionen von Immunreaktionen begleitet
Rekombinante virale Vektoren
• Adenoviren • Adeno-assoziierte Viren (AAV) • (Murine) Retroviren
Nachteile • Komplizierte Technik mit hohen Kosten: Arbeiten mit sogenannten „Verpackungslinien“ und „Produktionslinien“ • Begrenzte Beladung mit Nukleinsäuren • Hohe Immunogenität • Zufällige Integration in Wirtschromosome und Induktion von Onkogenen • Humanpathogenität • Produktion viraler Proteine und Abtötung der Wirtszelle • Reversionsmutanten • Keine ausreichend hohe Zellspezifität wie gewünscht • Keine wiederholten Anwendungen in kurzen Abständen
• Herpes-Viren • Vaccinia-Viren • Lentiviren (HIV, SIV, EIV, FIV)
Tod bei Gentherapie US-Forscher verschweigen Tod von Patienten Ein neuer Todesfall bei einer Gentherapie hat in den USA die Aufmerk- samkeit der Behörden weiter verstärkt. Wie jetzt bekannt wurde, haben Wissenschafter des St. Elizabeth's Medical Center in Boston nach Erken- ntnissen der Aufsichtsbehörde FDA den Tod eines Mannes verschwiegen, dem das Gen für einen Blutgefäß-Wachstumsfaktor injiziert wurde. Der Patient, der unter verstopften Herzkranzgefäßen litt, sei zwei Monate später gestorben. Derzeit werde noch untersucht, ob die Therapie selbst zum Tod geführt hat. Bei einem anderen Patienten könnte durch die experimentelle Genbehandlung das Wachstum eines Lungenkarzinoms begünstigt worden sein. Die neuen Vorwürfe belasten den Genforscher Jeffrey Isner von der Tufts-Universität in Boston, dessen Versuche bereits mit anderen Todesfällen in Verbindung gebracht wurden. Sie ereigneten sich nach einem Bericht der "Washington Post" an der Harvard-Universität in Boston (US-Bundesstaat Massachusetts) und am Gentherapy-Institut in Philadelphia. Der Zeitung lagen 691 Berichte amerikanischer Genforscher von schwerwiegenden Problemen in Folge gentherapeutischer Experimente vor. Für besonderes Aufsehen hatte der Tod des 18-jährigen Jesse Gelsinger aus Tuscon (Arizona) im September gesorgt, der auch erst Wochen später bekannt wurde. Gentherapien werden seit knapp zehn Jahren erprobt. Sie sollen genetisch bedingte, oft vererbte Krankheiten heilen. Dafür werden den Patienten meist entschärfte Viren injiziert, die gesunde Kopien der für die Krankheit verantwortlichen Gene in ihre Zellen schleusen.
Marhsall et al. (2000) Science 286:2244
Physikalische Vektoren/Methoden: • Hydrodynamischer Druck • 'Biolistic Bombardment' • Transfer durch Anwendung eines elektrischen Feldes • direkte Inokulation ins Gewebe Chemische Vektoren/Methoden: • Kationische Liposomen • Polykationen wie DEAE-Dextran, Polyethylen-Imin • Poly-Lysin-Verdichtung Biochemische Vektoren/Methoden: • mit Liganden vernetztes Poly-Lysin • 'Transferinfection'
Nichtvirale Vektoren für den Gentransfer
Elektroporation
Physikalisches Prinzip
Gehl J (2003) Acta Physiol Scand 177:437
CHO-Zellen, 20 ms, 1 kV cm-1
klau
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Elektroporation Anwendungsbeispiele Vor- und Nachteile
+ hohe Sicherheit + hohe Patientencompliance + kein Infektionsrisiko
Zielzellen / Zielorgane • Leberzellen • Hautzellen • Muskelzellen Hauptsächlich: Transdermale Applikation
– niedrige Transfektionsleistung – keine Gewebsspezifität – transiente Expressionsdauer
K562 Zellen mit phGFPS65T transfiziert
Beta-Galactosidase Transfektion in vivo in Muskelzellen
Mir et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:4262
klau
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Biobalistik Technische Prinzip
Goldpartikel Haut Gene Gun
Expression
Anwendungsbeispiele Vor- und Nachteile
• Applikation von Vakzinen • Hepatitis B Vakzinierung • Arilvax®, Hepagene®
• Powderject Inc: Accell®
• Biorad Inc: Helios®
• Transdermale Applikation
+ einfache Anwendung + auf dem Markt befindliche Technik - hohe Kosten - nur transdermale Applikation - geringe Effizienz
1-3 µm
klau
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Powderject Inc.: Accell®
Düse
Dämpfer
Kassette
Heliumzylinder
Sicherheitsverschluß
Auslöser
Maa et al. (2000) Curr Pharm Biotechnol 3:283 Yang et al. (1999) in Nonviral vectors for gene therapy, Academic Press, 171
Vorteile nicht-viraler Vektoren
• Geringe Kosten • Keine Infektiösität • Keine Immunogenität • Gute Compliance • Definierte chemische und physikalische
Eigenschaften • Wiederholte Anwendungen möglich
Zystische Fibrose (ZF)
ZFTR-Gen
A T C A T C T T T G G T G T T
Chromosom 7 Nukleotdsequenz des ZFTR Gens
Aminosäuresequenz des ZFTR Gens
Isoleucin 506
Isoleucin 507
Phenylalanin 508
Glycin 509
Valin 506
Eigenschaften des ZFTR-Gen
• 250.000 bp lang
• 27 Exons
• 1.480 Aminosäuren
• Molekulargewicht 168 kDa
• 6500 Nukleotide
ZFTR: Zystische Fibrose Transmembran Regulations-Gen
Zystische Fibrose Phathologie
Na+
K+
ATP ADP
K+ Cl- Na+
Cl-
Cl-
Na+
Submoca Lumen
Ca2+
cAMP
Normal
Na+
K+
ATP ADP
K+ Cl- Na+
Cl-
Cl-
Na+
Submoca Lumen
Ca2+
H20
Zelle mit ZF-Gendefekt Betroffene Organe
Intestinaltrakt Pankreas Leber Lunge
Exon X Intron Transkription, Splicing
mRNA
Konstruktion eines DNA-Vektors
Intron Exon X Zu klonierendes Gen
Exon X Reverse Transkription
cDNA
Vektor
Promoter Gen X Terminator
Promoter Gen X Terminator Terminator
Tetracyclin Origin
Klonierung und Rekombination
Synthese des ZFTR-Plasmid
Modulare pCI Plasmidserie (5632 bp)
NheI
NotI BamHI
BglII Promoter
Hybridintron
ZFTRTransgen
Poly(A)
Antibiotika Resistenz- gen
Plasmid-Herstellung
Gentechnologische Rekombination
Hochdichtefermentation E. coli K 12
Alkalische Zellyse Zellmühle
Neutralisierung
(Plasmidrenaturierung)
Anionenaustauscher-filtration
(Capture-Schritt)
Feinreinigung (Gel-, RP-Filtration)
Abtrennung von genomischer DNA und Proteinen
Abtrennung von RNA
Abtrennung von Filtrierhilfsmitteln, Salzen, Endotoxinen, Plasmidisoformen Ausbeute: 200 mg/L
Guilherme et al. (2000) TIBTECH 18:380
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Freigabe Spezifikation
Aussehen klare, farblose Lösung Größe, Restriktionsstellen Übereinstimmung mit
Plasmidkarte Identität Agarose-Gelelektrophorese (GE),
Restriktionsverdau Zirkuläre Plasmid DNA >95% (Gelelktrophorese, HPLC) E. coli DNA < 0,2 µg/µg Plasmid DNA
(Southern Blot) Protein Nicht nachweisbar (BCA-Assay) RNA Nicht nachweisbar (GE) Endotoxin <0,1 EU/µg Plasmid DNA (LAL Test) Sterilität kein Wachstum nach 14 Tagen (USP) Spezifische Aktivität entspricht Referenzstandard
(in vitroTransfektion)
Marquet et al. (1997) Biopharm Teil 1, 10,40
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EX VIVO vs IN VIVO
Tumorzellen
Fibroblasten
Hämopathische Zellen
Gentransfer in Kultur
Direkte Applikation zum Zielorgan
Vektor
lokal
systemisch
ZFTR-Expression
% ZFTR Exprimierende Zellen 14 12 10 8 6 4 2 0 100
-2
0
2
4
6
∆Isc
ZFT
R E
xpre
ssio
n (µ
A/c
m ) 2
Johnson et al. (1992) Nature Genetics 2:21
Eingesetzte Genfähren
34,1 26,9
6,111,1
1,22,4
12,17,3
0
5101520253035
Retroviren Adenoviren PoxvirenNackte DNA Gene Gun AAV*Liposomen Sonstige
%
Angabe in % nach http://www.wiley.co.uk/genmed
*Adenoassoziierte Viren
Stand Mai 2003
10,3
23,2
0
5
10
15
20
25
1998 2003
%
Anteil nicht-viraler Systeme
Gentransfersysteme
• Virale Genvektoren
• Nicht virale Genvektoren
Rekombinante virale Vektoren
• Adenoviren • Adeno-assoziierte Viren (AAV) • (Murine) Retroviren
Nachteile • Komplizierte Technik mit hohen Kosten: Arbeiten mit sogenannten „Verpackunslinien“ und „Produktionslinien“ • Begrenzte Beladung mit Nukleinsäuren • Hohe Immunogenität • Produktion viraler Proteine und Abtötung der Wirtszelle • Humanpathogenität • Zufällige Integration in Wirtschromosome und Induktion von Onkogenen • Reversionsmutanten • Keine ausreichend hohe Zellspezifität wie gewünscht • Keine wiederholten Anwendungen in kurzen Abständen
• Herpes-Viren • Vaccinia-Viren • Lentiviren (HIV, SIV, EIV, FIV)
Forderungen an einen nicht-viralen Genvektor
• auch große DNA (RNA)-Abschnitte aufnehmen und schützen,
• leicht und in konzentrierter Form herstellbar sein, • auf spezifische Zellen gerichtet werden, • hohe Transfektionsrate aufweisen, • zytosolisch stabil sein, • den Nukleustransfer unterstützen, • keine Toxizität aufweisen
(cave: Rekombination; Insertion) und • keine Immunantwort auslösen.
Der ideale Vektor muß in vivo …
Nicht-virale Transfertechnologien Physikalische Vektoren / Methoden: • Direkte Injektion, Mikroinjektion • Elektroporation • Biobalistik Chemische Vektoren: • Liposomen (kationisch) • Kationische Polymere (PEI,PLL, DAEMA) • Poly-L-Lysin / Arginin / Histidin-Verdichtung • Chitosan • Kationische Dendrimere Biochemische Vektoren: • Amphipatische Peptide
Nicht-virale Transfertechnologien Physikalische Vektoren / Methoden: • Direkte Injektion, Mikroinjektion • Elektroporation • Biobalistik Chemische Vektoren: • Liposomen (kationisch) • Kationische Polymere (PEI,PLL, DAEMA) • Poly-L-Lysin / Arginin / Histidin-Verdichtung • Chitosan • Kationische Dendrimere Biochemische Vektoren: • Amphipatische Peptide
Kationische Liposomen (Lipoplexe)
Ziele/Vorteile: Einfache Herstellung Integration der zu transportierenden DNA Schutz vor DNA-Abbau vor Nukleasen Zielgerichtete zelluläre Applikation
Eigenschaften Kopplung: möglich, z.B. Immunoliposomen Plasmaeiweißbindung: hoch Lagerstabilität: gering bis moderat Toxizität: gering Metabolisierung: schnell Lipid/DNA-Ratio: 1:2-20 Größe: optimale Größe 400-500 nm Beladung: 100 Da – 22 kDa Genexpression: transient
Brown et al. (2001) Int J. Pharm 229:1
Eingesetze kationischer Lipide Multivalente kationische Lipide DOSPA 2,3-Dioleoyloxy-N-[2-(spermincarboxyamido)ethyl]-N,N-dimethyl- 1-propanamminiumchlorid DOGS Dioctadecylamidoglycylspermin Monovalente kationische Lipide DOTMA N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid DOTAP 1,2-Dioleoyloxypropyl-3-N,N,N-trimethylammoniumchlorid DC-Chol 3β-[N-(N´,N´-dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterol DMRIE 1,2-Dimyristyloxypropyl-3-N,N-dimethylhydroxyammoniumbromid
Gegenwärtig intensiv in Studien eingestzt: DOTAP 1,2-Dioleoyloxypropyl-3-N,N,N-trimethylammoniumchlorid DC-Chol 3β-[N-(N´,N´-dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterol
Wheeler et al. (1996) PNAS USA 93:11454
Kommerzielle kationische Transfektionssysteme: Lipofectin® (DOTMA/DOPE)
ONH
NHO
DC-Chol
Multivalente kationische Lipide
Monovalente kationische Lipide
O
ON+
O
O
O
NH2+
NH3+
H2N
NH3+
DOSPA
O
ON+
O
O
O
ON+
OH
DMRIE
DOTAP
Strukturwirkungsbeziehung
O
ON+
O
O
DOTAP
Polarer Kopf
Spacer
Hydrophober Anker
Liposomenbildung Dialkylketten effektiver als Monoalkylkette Optimal 12-18 C lang Hydrophober Anker beeinflußt Transfektion
Ort der DNA-Komplexierung Negativer Ladungsüberschuß für Transfektion wichtig Positiver Ladungsüberschuß reduziert zelluläre Aufnahme und Freisetzung Esterbindung für schnellen Abbau (Bsp. DOTAP vs. DOTMA)
Ester- / Etherbindung
In vitro – In vivo Korrelation nicht bekannt !
Lee et al (1996) Hum Gene Ther 7:1701
O
O
H
O
H
H
HH
P OO
O
H
O
H
H
HH
P OOO
-
-
BASE
BASE
O
ON+
O
O
O
ON+
O
O
O
ON+
O
O
O
ON+
O
O
Komplexierung der DNA (+/- -Verhältnis)
O
ON+
O
O
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Safinya et al. (2001) 11:440 Rädler et al. (1997) Science 275:113
DNA
Lipidbilayer
6,4 nm
Lamellare DNA/Lipid- Komplexierung mit DOPC
3,9 nm
2,6 nm
Laminare Phase des Lipid:DNA-Komplexes AFM-Aufnahme von Plasmid-DNA
auf kationischem Bilayer
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Hexagonale DNA/Lipid-Komplexierung mit DOPE
Safinya (2001) Curr Opinion Structural Biol 11:440
Synchrotron SAXS-RÖNTGENSPEKTRUM
DNA-Kondensation unter Elektrolyteinfluß
Safinya (2001) Curr Opinion Structural Biol 11:440
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In vivo Eigenschaften von Liposomen/DNA-Komplexen
Probleme: • geringe Gewebs- und Zellspezifität • Toxizität • schnelle Metabolisierung • zelluläre Aufnahme • geringe Transfektionsleistung
Biopharmazeutische Barrieren
• Abbau von DNA im Plasma
• DNA-Aufnahme durch MPS
• Bei systemischer Anwendung, keine orale Gabe möglich
• Transfektion durch Mucus häufig inhibiert
• Immunologische Reaktionen
Extrazelluläre Barrieren Intrazelluläre Barrieren
• Endosomale Freisetzung der DNA
• Lysosomaler Abbau • Nukleasen • Zytoplasmatische Stabilität • Nukleustransfer
Wiethoff und Middaugh (2003) JPS 92:203
klau
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ant
In vivo - Gewebsspezifität
4339
59
2 0,30
10
20
30
40
50
60
70
80
90
37
57
2 5 2 3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Angaben in 32[P] %-Verteilung der injizierten Dosis (PCMC-Cat/DOTMA/DOPE 2:1:0,3; 60 mg pDNA)
Lunge Leber Milz Herz Blut
nach 15 min nach 120 min nach 24 h 83
3 2 1,510
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Mahato et al. (1998) Hum Gen Ther 9:2083-2099
Verbesserte Gewebeapplikation
Beispiele • Galactolipid HepG2 (Leber) • Trigalactoplipid • Transferrin HepG2
HeLa (Zervixepithel) • Asialoglykoprotein (Asialofetuin) HepG2 (Leber) • Monoklonale (humanisierte) Antikörper Neoplasmen
(Oncoscint, Prostascint, CeaScan)
Gene-Targeting mit avβ-3-Liganden
Hood et al. (2002) Science 296:2404
Ziel: Kopplung von Integrin-avβ-3 als Ligand an kationische Nanopartikel
In vivo - Toxizität
• Problem ist die Toxizität als Detergentien durch Zelllysis • Reduktion der Toxizität durch Mischung mit neutralen Lipiden als
„Helferlipid“ (Bsp. DOPE)
0,020,040,060,080,0100,0120,0
CTAB
TTAB
DTAB
CTAB/DOPE
TTAB/DOPE
DTAB/DOPE
DOPE
Negativkontrolle
CTAB: Cetyltrimethylammoniumbromid; TTAB: Tetradecylammoniumbromid; DTAB: Dodecylammoniumbromid; DOPE: Dioleoylphosphatidylethanolamin
Zel
lwac
hstu
m
(%, M
TT
)
Pinnaduwage et al. (1989) Biochim Biophys Acta 985: 33-37
In vivo – Zelluläre Aufnahme
?
Zellkern!
Proteine! "
Endozytose!
Zielzelle!
Prinzip des nichtviralen Gentransfers
Gentransferkomplex"
Lysosomal escape!
Plasmid DNA"
-"-"
-"-"-"
-"
-"
kationisches Agens"
+"+"
+"
+"
+"
mRNA!
klau
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elev
ant
Zelluläre Aufnahme und Migration
Wattiaux et al. (2000) ADDR 41:201
Aktive Aufnahme in den Nukleus
DNA Abbau durch Nukleasen
pH 4,5-6 Hohe Verweilzeit DNA-Hydrolyse
klau
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ant
Polyethylenimin (PEI)
Wightman et al. (2001) J. Gene Med 3:362
Gentransferkomplex Aufnahme Migration / Transfektion
Hohe Lagerstabilität HWZ: 30-60 min Hohe Toxizität (40-100 µg in Maus) Größe 50-100 nm, genaue Synthese Lineare Struktur → Hohe Transfektion Hohe Verzweigung → Geringe Transfektion Beladung bis zu 800 kB
Kopplung mit Liganden (Transferrin, Monoklonale Antikörper, Zucker, Folat)
Hohe Stabilität „Protonenschwammeffekt“
Nukleaseabbau
Transiente Expression
klau
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ant
Zellkern!
Zielzelle Protonenschwamm-Modell
PEI-Gentransferkomplex"
+" -"-"-"
-"+"
+"+"+"
+"+"
+"+"
+"+"+"-"
-"-"-"
-"-"-"-"
-"-"-"
+"
+"
+" +"+"
+"+"
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-"+"
+"+"+"
+"+"
+"+"
+"+"+"-"
-"-"-"
-"-"-"-"
-"-"-"
+"
+"
+" +"+"
+"+"
+" Endozytose!
+" -"-"-"
-"+"
+"+"+"
+"+"
+"+"
+"+"+"-"
-"-"-"
-"-"-"-"
-"-"-"
+"
+"
+" +"+"
+"+"
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+" -"
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+"+"
+"+"
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+"
-"-" -"
+" +"+"
+"
+"
+" -"-"-"
-"+"
+"+"+"
+"+"
+"+"
+"+"+"-"
-"-"-"
-"-"-"-"
-"-"-"
+" +"+"
+"+"
+"
H+"
H+"
+" -"-"-"
-"+"
+"+"+"
+"+"
+"+"
+"+"+"-"
-"-"-"
-"-"-"-"
-"-"-"
+" +"+"
+"+"
+"
Cl-"
Cl-"H2O"
H2O"
+"+" -"-"+"
Innere tertiäre Amine neutralisieren niedrigen pH in Endosomen à Schwellung à Aufbrechen
„Protonenschwamm“ Behr (1997) Chimia 51:34
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ant
Mechanismen der Transfektion
Zelluläre Aufnahme
Verteilung im Zytosol
DNA-Freisetzung
Eintritt in den Nukleus
Mechanismen Probleme Aufnahmemechanismen (aktiv, passiv, Endozytose, Rezeptoren) Aufnahme und Degradation in Endosomen Freisetzung aus Endosomen Abbau durch zytosolische Nukleasen Eintritt durch Nukleusporen
DNA-Transport in den Nukleus
Nukleusmembran Kernpore
100-120 nm
Passiv: Makromoleküle < 45 kDa Aktiv: Makromoleküle > 45 kDa
Nukleusporen- komplex
DNA-Transport in den Nukleus
Nukleusmembran Kernpore
100-120 nm
Passiv: Makromoleküle < 70 kDa Aktiv: Makromoleküle > 70 kDa
Signalerkennung
NLS IMPβ
IMPα
Nukleusporen- komplex
� DNA
IMP: Importin; NPC: Nuclear Pore Complex; NLS: uclear Location Sequence; Ran: Guanin-Nucleotid-bindendes Protein; NTF: Nuclear Transport Factor; EE: Endosom Exit Sequence; DBD: DNA binding domain
DNA-Transport in den Nukleus
Nukleusmembran Kernpore
100-120 nm
Passiv: Makromoleküle < 70 kDa Aktiv: Makromoleküle > 70 kDa
Signalerkennung
NLS IMPβ
IMPα
Andockung
Nukleusporen- komplex
NLS IMPβ
IMPα
�
�
IMP: Importin; NPC: Nuclear Pore Complex; NLS: uclear Location Sequence; Ran: Guanin-Nucleotid-bindendes Protein; NTF: Nuclear Transport Factor; EE: Endosom Exit Sequence; DBD: DNA binding domain
DNA
DNA
DNA-Transport in den Nukleus
Nukleusmembran Kernpore
100-120 nm
Passiv: Makromoleküle < 70 kDa Aktiv: Makromoleküle > 70 kDa
Signalerkennung
NLS IMPβ
IMPα
Andockung
Nukleusporen- komplex
NLS IMPβ
IMPα
Aufnahme NTF2
RAN-GDP
�
�
�
NLS IMPβ
IMPα
DNA
DNA
DNA IMP: Importin; NPC: Nuclear Pore Complex; NLS: uclear Location Sequence; Ran: Guanin-Nucleotid-bindendes Protein; NTF: Nuclear Transport Factor; EE: Endosom Exit Sequence; DBD: DNA binding domain
RAN-GTP
DNA-Transport in den Nukleus
Nukleusmembran Kernpore
50 nm
Passiv: Makromoleküle < 70 kDa Aktiv: Makromoleküle > 70 kDa
Signalerkennung
NLS IMPβ
IMPα
Andockung
Nukleusporen- komplex
NLS IMPβ
IMPα
Aufnahme NTF2
RAN-GDP
NLS
IMPβ
IMPα
NTF2
RAN-GTP RAN-GDP
�
�
� � Freisetzung
IMP: Importin; NPC: Nuclear Pore Complex; Nuclear Location Sequence; Ran: Guanin-Nucleotid-bindendes Protein; NTF: Nuclear Transport Factor; EE: Endosom Exit Sequence; DBD: DNA binding domain
NLS IMPβ
IMPα RCC1
DNA
DNA
DNA
DNA
Weiterentwicklungen
• Virosomen Liposomen, die virale Proteine oder fusiogene Peptide enthalten, um Freisetzung aus Endosomen zu erleichtern und Gentransfer zu verbessern.
• Immunoliposomen Modifizierte Lipid:DNA-Komplexe mit immunologisch aktiven Molekülen zur Verbesserung des Zelltargeting
• Kationische Emulsionen Emulsionen mit DC-Chol/DOPE mit Tween 80, Span 80 and Brij 78
• Transoplexe Kationische Solid Lipid Nanoparticle (SLN)
Polymere Vektoren (Polyplexe)
• Kationische Peptide – Poly-L-Lysin, Poly-L-Arginin, Poly-L-Histidin
• Kationische Polymere – Polyethylenimin (PEI), verzweigt, linear – Polyvinylpyrrolidin (PVP) – Poly[(dimethylamino)ethylmethacrylat]
PDMAEMA – Poly[α-(4-aminobutyl)-L-glycolsäure] – Chitosan
• Kationische Dendrimere (D.) – pDMEAMA-D. – Starbust-D.
Struktur polymerer Genvektoren NH2
O
*
NH2
NH2NH2
*NH
NH
NH
NH
NH
N
O
O
O
O
O
NH2
NH2
n
NH2NNNH2
OO
NHO
NH2
PLL
PEI
pAMEAMA Dendrimer (1. Generation)
*NH
n *
*
N+
n
PVP
OOO
OHNH2
OOHO
NH2 **
OH
OH n
Chitosan
Poly-L-Lysin (PLL)
Ziel: Integration der zu transportierenden DNA Erhöhter Schutz vor DNA-Abbau vor Nukleasen gerichtete zelluläre Applikation
Kopplung mit Poly-L-Histidin um Stabilität bei endosomalen pH unter 6 zu erhöhen
Eigenschaften:
Brown et al. (2001) Int J. Pharm 229:1-21
Kopplung: Transferrin, Folat, monoklonale Antikörper Plasmaeiweißbindung: hoch Lagerstabilität: gut Toxizität: gering Metabolisierung: (10-30 min) Matrix/DNA-Ratio: 2:1 Größe: optimale Größe 400-500 nm, hohe Polydispersität Beladung: 100 – 22 kDa Genexpression: transient
DNA-Kompaktierung mit kationischen PLL
Martin et al. (2000) FEBS Lett 480:116 CHee-Kai Chan und Jans (2002) Immunol Cell Biol 80:119
Verbesserung der PLL-Zytotoxizität
0
20
40
60
80
100
120
140
KontrolleLipofectionPLL5% Mol PEG10% Mol PEG25% Mol PEG
Choi et al., 1998, J. Control Rel. (54) 39-44
% Z
ellv
italit
ät
Polyethylenimin (PEI) Ziele/Vorteile: Einfache Herstellung
Hohe chemische Stabilität bei Lagerung Erhöhter Schutz vor DNA-Abbau vor Nukleasen Hohe endosomale Stabilität
Eigenschaften: Kopplung: Liganden wie Transferrin, Folat, monoklonale Antikörper, Mannose oder Asialoglykoprotein Plasmaeiweißbindung: hoch Toxizität: hoch Metabolisierung: 30-60 min Matrix/DNA-Ratio: 1:4-10 Größe: 50-1000 nm, optimale Größe 50-100 nm Beladung: 10 – 800 kDa Genexpression: transient
Brown et al. (2001) Int J. Pharm 229:1-21
Besonderheiten: Innere tertiäre Amine neutralisieren niedrigen pH in Endosomen à Schwellung à Aufbrechen „Protonenschwamm“
Bedeutung fusiogener und endolytischer Moleküle
Rudolph et al. (2002) J Biol Chem 278:11411
Zellkern!
Zielzelle!
Zellkern!
Zielzelle!ohne TAT" mit TAT"
TAT: 12 Aminosäuren-Sequenz (= TAT Sequenz) Arg reiches Motiv des HIV-1 TAT-Protein
Proteintransduktionsdomäne Kernlokalisierungssequenz kl
ausu
rrel
evan
t
Eigenschaften nicht-viraler Transfertechnologien
• Geringe Kosten • Einfache Herstellung von Lipid:DNA-Komplexen • Nicht infektiös • Definierte DNA, da nur Plasmid-DNA • Hohe Beladung mit Nukleinsäuren möglich • Keine Immunogenität • Gute Compliance • Definierte chemische und physikalische Eigenschaften • Periodische Applikationen möglich • Übernahme bekannter Technik aus Pharmazeutischen
Technologie
Nachteile nicht-viraler Vektoren
• Nur transiente Genexpression • Zu geringe Effizienz • 106 Plasmidkopien zur Transfektion nötig,
102-104 Kopien erreichen Nukleus • Nicht oder nur moderat zellspezifisch • Geringe Transfektionsleistung • Z.T. hohe Toxizität (PEI) • Keine orale Applikation
Zusammenfasung
klau
surr
elev
ant
Die Entwicklung nicht-viraler Vektoren ist komplex
• Zellbiologie des Transport von Makromolekülen - Zelluläre Aufnahme - Endosomale Freigabe - Transport durch Kernmembran
• DNA/Trägerkonstrukte - Materialien und Prozesse zur DNA-Kondensation - Stabilität - Upscaling und Produktion
• Drug-Delivery - Targeting-Strategien - In vitro versus in vivo
Gebiete Pharmazie Biochemie Biotechnologie Nanotechnologie Polymerchemie Zellbiologie
