Embed Size (px)
Citation preview
Silenciamiento
sRNAs Biogeacutenesis y funcioacuten
en estreacutes bioacutetico
Manipulacion del Gen de la Chalcona sintasa
para alterar su nivel de expresion
Wild-type petunia
producing purple
anthocyanin
pigments
Chalcone synthase (CHS)
is the enzyme at the start
of the biosynthetic pathway
for anthocyanins
Photo credit Richard Jorgensen Aksamit-Stachurska et al (2008) BMC Biotechnology 8 25
Anthocyanins
Chalcone
Synthase
(CHS)
La expresioacuten de un mRNA en sentido deberiacutea
aumentar el nivel de expresioacutenhellip
Sense RNA Sense construct
PRO ORF
Endogenous gene mRNA
Transgene
PRO ORF
mRNA
Protein translated
mRNA
mRNA
Extra protein translated
un antisentido disminuir la expresioacuten
Sense RNA
Antisense
RNA
Sense construct
PRO ORF
Endogenous gene mRNA
Transgene
PRO ORF
mRNA
Protein translated
mRNA
mRNA
Extra protein translated
Antisense construct
PRO
ORF
Transgene Sense-antisense duplex forms
and prohibits translation
Sorprendentemente las dos
construcciones pueden inhibir la
expresioacuten del gen chalcona sintasa
Photo credit Richard Jorgensen
Plants carrying CHS transgene
CaMV 35S pro CHS CaMV 35S pro CHS
Sense Antisense
OR
Co-suppression is a consequence of
siRNA production
De Paoli E Dorantes-Acosta A Zhai J Accerbi M Jeong D-H Park S Meyers BC Jorgensen RA and
Green PJ (2009) Distinct extremely abundant siRNAs associated with cosuppression in petunia RNA 15 1965ndash1970
PRO ORF
Wild-type mRNA
mRNA
Protein translated
Endogenous gene
Sense RNA
Sense construct
Co-suppressed transgenic
PRO ORF
Co-suppression
PRO ORF
Endogenous gene mRNA
siRNA
produced
Silenciamiento genico
( breve resentildea historica de sus mayores hitos)
1990 Jorgensen
Introduction of transgenes homologous to endogenous genes
often resulted in plants with both genes suppressed
Called Co-suppression
Resulted in degradation of the endogenous and the
transgene mRNA
1995 Guo and Kemphues
-injection of either antisense or sense RNAs in the germline of
C elegans was equally effective at silencing homologous
target genes
1998 Mello and Fire
-extension of above experiments combination of
sense and antisense RNA (= dsRNA) was 10
times more effective than single strand RNA
Definition the ability of double-stranded RNA
(dsRNA) to suppress the expression of the gene
which corresponds to the dsRNA sequence
Contdhellip
siRNAS siRNAS
Genes Blanco Genes Blanco
Biogenesis de sRNAs
RNA DOBLE CADENA ES
EL INICIO DEL
SILENCIAMIENTO
Biogenesis de sRNAs
Dicer and Dicer-like proteins
From MacRae IJ Zhou K Li F Repic A Brooks AN Cande W Adams PD and Doudna JA (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer Science 311 195 -198 Reprinted with permission from AAAS Photo credit Heidi
Dicerrsquos structure allows it to measure the RNA it
is cleaving Like a cook who ldquodicesrdquo a carrot
Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces
In siRNA and miRNA biogenesis Dicer or
Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA
or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 ndash 25 nt
fragments
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Manipulacion del Gen de la Chalcona sintasa
para alterar su nivel de expresion
Wild-type petunia
producing purple
anthocyanin
pigments
Chalcone synthase (CHS)
is the enzyme at the start
of the biosynthetic pathway
for anthocyanins
Photo credit Richard Jorgensen Aksamit-Stachurska et al (2008) BMC Biotechnology 8 25
Anthocyanins
Chalcone
Synthase
(CHS)
La expresioacuten de un mRNA en sentido deberiacutea
aumentar el nivel de expresioacutenhellip
Sense RNA Sense construct
PRO ORF
Endogenous gene mRNA
Transgene
PRO ORF
mRNA
Protein translated
mRNA
mRNA
Extra protein translated
un antisentido disminuir la expresioacuten
Sense RNA
Antisense
RNA
Sense construct
PRO ORF
Endogenous gene mRNA
Transgene
PRO ORF
mRNA
Protein translated
mRNA
mRNA
Extra protein translated
Antisense construct
PRO
ORF
Transgene Sense-antisense duplex forms
and prohibits translation
Sorprendentemente las dos
construcciones pueden inhibir la
expresioacuten del gen chalcona sintasa
Photo credit Richard Jorgensen
Plants carrying CHS transgene
CaMV 35S pro CHS CaMV 35S pro CHS
Sense Antisense
OR
Co-suppression is a consequence of
siRNA production
De Paoli E Dorantes-Acosta A Zhai J Accerbi M Jeong D-H Park S Meyers BC Jorgensen RA and
Green PJ (2009) Distinct extremely abundant siRNAs associated with cosuppression in petunia RNA 15 1965ndash1970
PRO ORF
Wild-type mRNA
mRNA
Protein translated
Endogenous gene
Sense RNA
Sense construct
Co-suppressed transgenic
PRO ORF
Co-suppression
PRO ORF
Endogenous gene mRNA
siRNA
produced
Silenciamiento genico
( breve resentildea historica de sus mayores hitos)
1990 Jorgensen
Introduction of transgenes homologous to endogenous genes
often resulted in plants with both genes suppressed
Called Co-suppression
Resulted in degradation of the endogenous and the
transgene mRNA
1995 Guo and Kemphues
-injection of either antisense or sense RNAs in the germline of
C elegans was equally effective at silencing homologous
target genes
1998 Mello and Fire
-extension of above experiments combination of
sense and antisense RNA (= dsRNA) was 10
times more effective than single strand RNA
Definition the ability of double-stranded RNA
(dsRNA) to suppress the expression of the gene
which corresponds to the dsRNA sequence
Contdhellip
siRNAS siRNAS
Genes Blanco Genes Blanco
Biogenesis de sRNAs
RNA DOBLE CADENA ES
EL INICIO DEL
SILENCIAMIENTO
Biogenesis de sRNAs
Dicer and Dicer-like proteins
From MacRae IJ Zhou K Li F Repic A Brooks AN Cande W Adams PD and Doudna JA (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer Science 311 195 -198 Reprinted with permission from AAAS Photo credit Heidi
Dicerrsquos structure allows it to measure the RNA it
is cleaving Like a cook who ldquodicesrdquo a carrot
Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces
In siRNA and miRNA biogenesis Dicer or
Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA
or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 ndash 25 nt
fragments
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
La expresioacuten de un mRNA en sentido deberiacutea
aumentar el nivel de expresioacutenhellip
Sense RNA Sense construct
PRO ORF
Endogenous gene mRNA
Transgene
PRO ORF
mRNA
Protein translated
mRNA
mRNA
Extra protein translated
un antisentido disminuir la expresioacuten
Sense RNA
Antisense
RNA
Sense construct
PRO ORF
Endogenous gene mRNA
Transgene
PRO ORF
mRNA
Protein translated
mRNA
mRNA
Extra protein translated
Antisense construct
PRO
ORF
Transgene Sense-antisense duplex forms
and prohibits translation
Sorprendentemente las dos
construcciones pueden inhibir la
expresioacuten del gen chalcona sintasa
Photo credit Richard Jorgensen
Plants carrying CHS transgene
CaMV 35S pro CHS CaMV 35S pro CHS
Sense Antisense
OR
Co-suppression is a consequence of
siRNA production
De Paoli E Dorantes-Acosta A Zhai J Accerbi M Jeong D-H Park S Meyers BC Jorgensen RA and
Green PJ (2009) Distinct extremely abundant siRNAs associated with cosuppression in petunia RNA 15 1965ndash1970
PRO ORF
Wild-type mRNA
mRNA
Protein translated
Endogenous gene
Sense RNA
Sense construct
Co-suppressed transgenic
PRO ORF
Co-suppression
PRO ORF
Endogenous gene mRNA
siRNA
produced
Silenciamiento genico
( breve resentildea historica de sus mayores hitos)
1990 Jorgensen
Introduction of transgenes homologous to endogenous genes
often resulted in plants with both genes suppressed
Called Co-suppression
Resulted in degradation of the endogenous and the
transgene mRNA
1995 Guo and Kemphues
-injection of either antisense or sense RNAs in the germline of
C elegans was equally effective at silencing homologous
target genes
1998 Mello and Fire
-extension of above experiments combination of
sense and antisense RNA (= dsRNA) was 10
times more effective than single strand RNA
Definition the ability of double-stranded RNA
(dsRNA) to suppress the expression of the gene
which corresponds to the dsRNA sequence
Contdhellip
siRNAS siRNAS
Genes Blanco Genes Blanco
Biogenesis de sRNAs
RNA DOBLE CADENA ES
EL INICIO DEL
SILENCIAMIENTO
Biogenesis de sRNAs
Dicer and Dicer-like proteins
From MacRae IJ Zhou K Li F Repic A Brooks AN Cande W Adams PD and Doudna JA (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer Science 311 195 -198 Reprinted with permission from AAAS Photo credit Heidi
Dicerrsquos structure allows it to measure the RNA it
is cleaving Like a cook who ldquodicesrdquo a carrot
Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces
In siRNA and miRNA biogenesis Dicer or
Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA
or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 ndash 25 nt
fragments
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
un antisentido disminuir la expresioacuten
Sense RNA
Antisense
RNA
Sense construct
PRO ORF
Endogenous gene mRNA
Transgene
PRO ORF
mRNA
Protein translated
mRNA
mRNA
Extra protein translated
Antisense construct
PRO
ORF
Transgene Sense-antisense duplex forms
and prohibits translation
Sorprendentemente las dos
construcciones pueden inhibir la
expresioacuten del gen chalcona sintasa
Photo credit Richard Jorgensen
Plants carrying CHS transgene
CaMV 35S pro CHS CaMV 35S pro CHS
Sense Antisense
OR
Co-suppression is a consequence of
siRNA production
De Paoli E Dorantes-Acosta A Zhai J Accerbi M Jeong D-H Park S Meyers BC Jorgensen RA and
Green PJ (2009) Distinct extremely abundant siRNAs associated with cosuppression in petunia RNA 15 1965ndash1970
PRO ORF
Wild-type mRNA
mRNA
Protein translated
Endogenous gene
Sense RNA
Sense construct
Co-suppressed transgenic
PRO ORF
Co-suppression
PRO ORF
Endogenous gene mRNA
siRNA
produced
Silenciamiento genico
( breve resentildea historica de sus mayores hitos)
1990 Jorgensen
Introduction of transgenes homologous to endogenous genes
often resulted in plants with both genes suppressed
Called Co-suppression
Resulted in degradation of the endogenous and the
transgene mRNA
1995 Guo and Kemphues
-injection of either antisense or sense RNAs in the germline of
C elegans was equally effective at silencing homologous
target genes
1998 Mello and Fire
-extension of above experiments combination of
sense and antisense RNA (= dsRNA) was 10
times more effective than single strand RNA
Definition the ability of double-stranded RNA
(dsRNA) to suppress the expression of the gene
which corresponds to the dsRNA sequence
Contdhellip
siRNAS siRNAS
Genes Blanco Genes Blanco
Biogenesis de sRNAs
RNA DOBLE CADENA ES
EL INICIO DEL
SILENCIAMIENTO
Biogenesis de sRNAs
Dicer and Dicer-like proteins
From MacRae IJ Zhou K Li F Repic A Brooks AN Cande W Adams PD and Doudna JA (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer Science 311 195 -198 Reprinted with permission from AAAS Photo credit Heidi
Dicerrsquos structure allows it to measure the RNA it
is cleaving Like a cook who ldquodicesrdquo a carrot
Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces
In siRNA and miRNA biogenesis Dicer or
Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA
or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 ndash 25 nt
fragments
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Sorprendentemente las dos
construcciones pueden inhibir la
expresioacuten del gen chalcona sintasa
Photo credit Richard Jorgensen
Plants carrying CHS transgene
CaMV 35S pro CHS CaMV 35S pro CHS
Sense Antisense
OR
Co-suppression is a consequence of
siRNA production
De Paoli E Dorantes-Acosta A Zhai J Accerbi M Jeong D-H Park S Meyers BC Jorgensen RA and
Green PJ (2009) Distinct extremely abundant siRNAs associated with cosuppression in petunia RNA 15 1965ndash1970
PRO ORF
Wild-type mRNA
mRNA
Protein translated
Endogenous gene
Sense RNA
Sense construct
Co-suppressed transgenic
PRO ORF
Co-suppression
PRO ORF
Endogenous gene mRNA
siRNA
produced
Silenciamiento genico
( breve resentildea historica de sus mayores hitos)
1990 Jorgensen
Introduction of transgenes homologous to endogenous genes
often resulted in plants with both genes suppressed
Called Co-suppression
Resulted in degradation of the endogenous and the
transgene mRNA
1995 Guo and Kemphues
-injection of either antisense or sense RNAs in the germline of
C elegans was equally effective at silencing homologous
target genes
1998 Mello and Fire
-extension of above experiments combination of
sense and antisense RNA (= dsRNA) was 10
times more effective than single strand RNA
Definition the ability of double-stranded RNA
(dsRNA) to suppress the expression of the gene
which corresponds to the dsRNA sequence
Contdhellip
siRNAS siRNAS
Genes Blanco Genes Blanco
Biogenesis de sRNAs
RNA DOBLE CADENA ES
EL INICIO DEL
SILENCIAMIENTO
Biogenesis de sRNAs
Dicer and Dicer-like proteins
From MacRae IJ Zhou K Li F Repic A Brooks AN Cande W Adams PD and Doudna JA (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer Science 311 195 -198 Reprinted with permission from AAAS Photo credit Heidi
Dicerrsquos structure allows it to measure the RNA it
is cleaving Like a cook who ldquodicesrdquo a carrot
Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces
In siRNA and miRNA biogenesis Dicer or
Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA
or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 ndash 25 nt
fragments
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Co-suppression is a consequence of
siRNA production
De Paoli E Dorantes-Acosta A Zhai J Accerbi M Jeong D-H Park S Meyers BC Jorgensen RA and
Green PJ (2009) Distinct extremely abundant siRNAs associated with cosuppression in petunia RNA 15 1965ndash1970
PRO ORF
Wild-type mRNA
mRNA
Protein translated
Endogenous gene
Sense RNA
Sense construct
Co-suppressed transgenic
PRO ORF
Co-suppression
PRO ORF
Endogenous gene mRNA
siRNA
produced
Silenciamiento genico
( breve resentildea historica de sus mayores hitos)
1990 Jorgensen
Introduction of transgenes homologous to endogenous genes
often resulted in plants with both genes suppressed
Called Co-suppression
Resulted in degradation of the endogenous and the
transgene mRNA
1995 Guo and Kemphues
-injection of either antisense or sense RNAs in the germline of
C elegans was equally effective at silencing homologous
target genes
1998 Mello and Fire
-extension of above experiments combination of
sense and antisense RNA (= dsRNA) was 10
times more effective than single strand RNA
Definition the ability of double-stranded RNA
(dsRNA) to suppress the expression of the gene
which corresponds to the dsRNA sequence
Contdhellip
siRNAS siRNAS
Genes Blanco Genes Blanco
Biogenesis de sRNAs
RNA DOBLE CADENA ES
EL INICIO DEL
SILENCIAMIENTO
Biogenesis de sRNAs
Dicer and Dicer-like proteins
From MacRae IJ Zhou K Li F Repic A Brooks AN Cande W Adams PD and Doudna JA (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer Science 311 195 -198 Reprinted with permission from AAAS Photo credit Heidi
Dicerrsquos structure allows it to measure the RNA it
is cleaving Like a cook who ldquodicesrdquo a carrot
Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces
In siRNA and miRNA biogenesis Dicer or
Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA
or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 ndash 25 nt
fragments
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Silenciamiento genico
( breve resentildea historica de sus mayores hitos)
1990 Jorgensen
Introduction of transgenes homologous to endogenous genes
often resulted in plants with both genes suppressed
Called Co-suppression
Resulted in degradation of the endogenous and the
transgene mRNA
1995 Guo and Kemphues
-injection of either antisense or sense RNAs in the germline of
C elegans was equally effective at silencing homologous
target genes
1998 Mello and Fire
-extension of above experiments combination of
sense and antisense RNA (= dsRNA) was 10
times more effective than single strand RNA
Definition the ability of double-stranded RNA
(dsRNA) to suppress the expression of the gene
which corresponds to the dsRNA sequence
Contdhellip
siRNAS siRNAS
Genes Blanco Genes Blanco
Biogenesis de sRNAs
RNA DOBLE CADENA ES
EL INICIO DEL
SILENCIAMIENTO
Biogenesis de sRNAs
Dicer and Dicer-like proteins
From MacRae IJ Zhou K Li F Repic A Brooks AN Cande W Adams PD and Doudna JA (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer Science 311 195 -198 Reprinted with permission from AAAS Photo credit Heidi
Dicerrsquos structure allows it to measure the RNA it
is cleaving Like a cook who ldquodicesrdquo a carrot
Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces
In siRNA and miRNA biogenesis Dicer or
Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA
or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 ndash 25 nt
fragments
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
1998 Mello and Fire
-extension of above experiments combination of
sense and antisense RNA (= dsRNA) was 10
times more effective than single strand RNA
Definition the ability of double-stranded RNA
(dsRNA) to suppress the expression of the gene
which corresponds to the dsRNA sequence
Contdhellip
siRNAS siRNAS
Genes Blanco Genes Blanco
Biogenesis de sRNAs
RNA DOBLE CADENA ES
EL INICIO DEL
SILENCIAMIENTO
Biogenesis de sRNAs
Dicer and Dicer-like proteins
From MacRae IJ Zhou K Li F Repic A Brooks AN Cande W Adams PD and Doudna JA (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer Science 311 195 -198 Reprinted with permission from AAAS Photo credit Heidi
Dicerrsquos structure allows it to measure the RNA it
is cleaving Like a cook who ldquodicesrdquo a carrot
Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces
In siRNA and miRNA biogenesis Dicer or
Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA
or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 ndash 25 nt
fragments
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
siRNAS siRNAS
Genes Blanco Genes Blanco
Biogenesis de sRNAs
RNA DOBLE CADENA ES
EL INICIO DEL
SILENCIAMIENTO
Biogenesis de sRNAs
Dicer and Dicer-like proteins
From MacRae IJ Zhou K Li F Repic A Brooks AN Cande W Adams PD and Doudna JA (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer Science 311 195 -198 Reprinted with permission from AAAS Photo credit Heidi
Dicerrsquos structure allows it to measure the RNA it
is cleaving Like a cook who ldquodicesrdquo a carrot
Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces
In siRNA and miRNA biogenesis Dicer or
Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA
or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 ndash 25 nt
fragments
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Biogenesis de sRNAs
RNA DOBLE CADENA ES
EL INICIO DEL
SILENCIAMIENTO
Biogenesis de sRNAs
Dicer and Dicer-like proteins
From MacRae IJ Zhou K Li F Repic A Brooks AN Cande W Adams PD and Doudna JA (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer Science 311 195 -198 Reprinted with permission from AAAS Photo credit Heidi
Dicerrsquos structure allows it to measure the RNA it
is cleaving Like a cook who ldquodicesrdquo a carrot
Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces
In siRNA and miRNA biogenesis Dicer or
Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA
or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 ndash 25 nt
fragments
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Biogenesis de sRNAs
Dicer and Dicer-like proteins
From MacRae IJ Zhou K Li F Repic A Brooks AN Cande W Adams PD and Doudna JA (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer Science 311 195 -198 Reprinted with permission from AAAS Photo credit Heidi
Dicerrsquos structure allows it to measure the RNA it
is cleaving Like a cook who ldquodicesrdquo a carrot
Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces
In siRNA and miRNA biogenesis Dicer or
Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA
or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 ndash 25 nt
fragments
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Dicer and Dicer-like proteins
From MacRae IJ Zhou K Li F Repic A Brooks AN Cande W Adams PD and Doudna JA (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer Science 311 195 -198 Reprinted with permission from AAAS Photo credit Heidi
Dicerrsquos structure allows it to measure the RNA it
is cleaving Like a cook who ldquodicesrdquo a carrot
Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces
In siRNA and miRNA biogenesis Dicer or
Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA
or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 ndash 25 nt
fragments
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Argonaute proteins
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd EMBO J Bohmert K Camus I Bellini C Bouchez D Caboche M and Benning C (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development EMBO J 17 170ndash180 Copyright 1998 Reprinted from Song J-J Smith SK Hannon GJ and Joshua-Tor
L (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity Science 305 1434 ndash 1437 with permission of AAAS
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Proceso de Amplificacioacuten
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
El silenciamiento se propaga
sisteacutemicamente
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Movimiento sistemico Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
RNA doble cadena es producido por
la infeccioacuten viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing the
viral suppressor proteins can interfere
with the plantrsquos viral defense
mechanism Suppressors can act at
any step of the process
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
La supresioacuten del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Estabilizacioacuten
de duacuteplex
P19 y HcPro
Degradacioacuten
de AGO1
mediado por
P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
RNA as Supressor
CaMV Leader seq
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Muacuteltiples modossitios de accioacuten de los supresores
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Sistema inmune
Virus
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Sistema inmune Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Pequentildeos RNAs
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Regulacioacuten mediada por
ncRNAs
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Clasificacioacuten de sRNAs
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Clase Descripcioacuten Biogeacutenesis y origen genoacutemico Funcioacuten
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble cadena que son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Regulacioacuten post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
Unioacuten a RNAs targets
complementarios guiacutea para la
iniciacioacuten de siRNas secundarios
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequentildeos
interferentes
Se forman por la actividad de RNA
polimerasas RNA dependientes las
cuales generan RNAs doble cadena
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos formacioacuten y
mantenimiento de la
heterocromatina
tasi RNAs (
Trans acting
siRNAs)
sRNAs que
actuacutea en trans
Transcriptos de genes TAS son
clivados por un mecanismo
dependiente de miRNAs luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP seguido del procesamiento por
Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
los transcriptos
natsi RNAs
( natural
antisense
transcript-
derived siRNAs)
siRNAs
derivados de
transcriptos
antisentidos
naturales
Pares de transcriptos sense y
antisense son procesados por Dicer
Regulacioacuten post transcripcional de
la expresioacuten de genes
involucrados en mecanismos de
defensa y respuesta a stress
piRNAs
( Piwi-
interacting
siRNAs)
RNAs que
interaccionan
con Piwi
El mecanismo de biogeacutenesis no se
conoce completamente
seriacutea dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresioacuten de transposones y
retroelementos en liacuteneas
germinales de moscas y de
mamiacuteferos
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
sRNAs clasificacioacuten por
Tamantildeo bull 21-22 bases
bull siRNAs
bull tasRNAs
bull miRNAS
bull Asociados a
silenciamiento
post-
trasncripcional
bull 24-26 bases
bull sRNAs
heterocromaticos
bull sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
bull Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogeacutenesis
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Estructura de un gen miRNA Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
microRNAs Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Proceso de biogeacutenesis estructural de los miRNAs
Bologna N G et al Briefings in Functional Genomics
20131237-45 Base to Loop
Loop to base
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1 2 7
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Several ldquophasedrdquo tasiRNAs are
derived from each TAS gene
Reprinted from Allen E Xie Z Gustafson A M and Carrington JC (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants Cell 121 207-221 with permission from Elsevier
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand
DCL4 moves
along the
dsRNA
measuring and
cutting
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Ago Complex
NatSiRNAs Biogenesis
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex Distribution Function
RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA
RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA
microRNA
RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA 5S rRNA
RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA
RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Kasschau KD Fahlgren N Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA and Carrington JC
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs PLoS Biol 5(3) e57
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences In Arabidopsis as shown above there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon
retrotransposons
Chromosome
Centromere
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins interfering with transcription
Transcription
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons but
also occurs at genes
DNA
Histone
proteins
Silencing
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
O N
NH2
N
~
O
N
N
NH2
~
CH3
cytosine 5-methylcytosine
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation carried out by
DNA methyltransferases
DNA methylation
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known but
involve the action of two plant-specific RNA-
polymerase complexes RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V)
DNA
methyltransferase
Histone modification
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
After DDM inactivation plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Rol de los transposones Generar variabilidad
geneacutetica o Parte de una maquinaria de
regulacioacuten genetica AMBAS
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity
Kakutani T Jeddeloh JA Flowers SK Munakata K and Richards EJ (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations PNAS 93 12406-12411 Copyright (1996) National Academy of Sciences USA
Este fenotipo
es producido
por
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte
El estreacutes es una causa importante de
reprogramacioacuten epigeneacutetica esto incluye al
estreacutes genoacutemico
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Estreacutes
Genoacutemico
En el hombre el
25 de los
promotores tiene
una porcioacuten de
transposon o un
ldquorastrordquo derivados
de los mismos
Regulacioacuten
Coordinada
Produccioacuten de
epialelos
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield
Hauben M Haesendonckx B Standaert E Van Der Kelen K Azmi A Akpo H Van
Breusegem F Guisez Y Bots M Lambert B Laga B De Block M
Source
Bayer BioScience NV 9052 Gent Belgium
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Accionamiento del mecanismo
proteiacutenas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Rol de los miRNAs
Regulacioacuten post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Fahlgren N Howell MD Kasschau KD Chapman EJ Sullivan CM Cumbie JS Givan SA Law TF Grant SR Dangl JL and Carrington
JC (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes PLoS ONE 2007 2(2) e219
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors
bullNon-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
bullConserved ones have often
duplicated to larger gene families
Factors
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Modo de Accioacuten de los miRNAs
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Zona de unioacuten a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family Target gene family Function
156 SPL transcription factors Developmental timing
160 ARF transcription factors Auxin response
development
1656 HD-ZIPIII transcription
factors
Development polarity
172 AP2 transcription factors Developmental timing floral
organ identity
390 TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response
development
395 Sulfate transporter Sulfate uptake
399 Protein ubiquitination Phosphate uptake
Adapted from Willmann MR and Poethig RS (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development Curr Opin Plant Biol 10 503ndash511
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
miRNAs and vegetative phase
change
Germination
zygote
JUVENILE
PHASE
Vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
EMBRYONIC
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Photos courtesy of James Mauseth
Adult
Juvenile A
J
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig RS (2009) Small RNAs and developmental timing in plants Curr Opin Genet Devel 19 374-378 with permission from Elsevier
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
miR156 targets SPL genes
promoters of phase change miR156
binding
site
miR156 SPL
ORF 3rsquo UTR Promoter SPL3 The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets
In wild-type plants miR156
expression decreases with
plant age allowing SPL to
accumulate and promote
phase change
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early
Wild-type miR172-OX
miR172 homology
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level
Aukerman MJ and Sakai H (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15 2730-2741
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
miR156 SPL
miR172 AP2-like
In Arabidopsis SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Estudio de la accioacuten de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresioacuten
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT Mutante JAW
Expresioacuten alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Sobre expresioacuten o expresioacuten ectoacutepica
Maiz Maiz
WT Mutante WT Mutante
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Insensibilidad a la regulacioacuten por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
NO hay reconocimiento rarr
NO hay regulacioacuten
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
Reproduced with permission from Wu G and Poethig RS (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3 Development 133 3539ndash3547
ORF 3rsquo UTR Promoter
ORF Promoter
ORF 3rsquo UTR Promoter
SPL3
SPL3Δ
SPL3m
miR156
binding
site
Wild-type
miR156-
resistant
miR156 SPL
miR156 SPL
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Insensibilidad a mir159 Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172 Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
WT
Planta
Transgenica
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus Plant
Grandes cambios metaboacutelicos y
fisioloacutegicos
Los siacutentomas incluyen la
alteracioacuten de la estatura el
aspecto general y la morfologiacutea de
la planta
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Reprogramacioacuten geacutenica mediada por la
infeccioacuten viral
Proceso Dinaacutemico
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
SINTOMAS
Posibles viacuteas
de interaccioacuten
Virus y sRNAs
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Impacto de la infeccioacuten de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5) e19549 doi101371journalpone0019549
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Chapman etal
PTGS Suppressors
alters miRNA
Silencing (PTGS) as defense mechanism PTGS suppressors as virus counter-defense
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity
Virus and miRNAs pathway ldquoDirect
interactionrdquo
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
siacutentomas
Accioacuten INDIRECTA de sRNAs
en la interaccioacuten viral
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Alteracioacuten mediada por expresioacuten transgeacutenica de
supresores
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis PLoS Pathog 7(5) e1002035 doi101371journalppat1002035
Chapman etal
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (515 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D G Jones Plant Mol
Biol (2009) 69473ndash488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al RNA (2008) 14836ndash843
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage Mid stage Late stage
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Usos del silenciamiento geacutenico
Knock out genico
Anaacutelisis funcional
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
miRNAs artificiales Antisentido HpRNAi VIGS
Construccioacuten
empleada
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endoacutegenos para
generar sRNAs
Formacioacuten de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido El
dsRNA formado es
procesado por DCL
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
estaacuten proacuteximos
de modo que el
dsRNA se forma
faacutecilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicacioacuten viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sisteacutemico
Se ha observado
silenciamientos
sisteacutemico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras ceacutelulas
Si Si Si
Meacutetodos basados en PTGS para disminuir la
expresioacuten de un gen endoacutegeno
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Construccioacuten
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgeacutenesis
para obtener
un
silenciamient
o sisteacutemico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL
Formacioacuten de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido
Formacioacuten de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido
Explota a los
precursores
de miRNAs
endoacutegenos
para generar
sRNAs
Los dsRNAs se forman
durante la replicacioacuten
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
Genoma viral Fragmento de gen target
El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta
PTGS
El silenciamiento del gen target se
produce tras la formacioacuten de
dsRNAs durante la replicacioacuten viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus
VIGS
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Virus Geacutenero Hospedantes
naturales
importantes
Probado en Genes
silenciados
Referencias
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus Nicotiana
tabacum
Nicotiana
benthamiana
Nicotiana
tabacum
PDS PSY Kumagai et al
(1995)
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus Amplio rango
de
hospedantes
N
benthamiana
Arabidopsis
Tomate
especies de
Solanum
pimiento
Varios genes
PDS PSY
GFP EDS
RAR NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
Potato Virus X Potexvirus Solanum
tuberosum
Brassicca
Campestris
N
bentahmiana
Solanum
tuberosum
PDS GFP Ruiz et al
(1998)
Barley stripe
mosaic virus
Hordeivirus Trigo cebada
maiacutez
Trigo cebada PDS Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Tomato goleen
mosaic virus
Begomovirus Lycopersicum
sculetum
N
benthamiana
Su(Sulfur
gene)
Peele et
al(2001)
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Gen reportero Caracteriacutesticas Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS) Enzima implicada en la
siacutentesis de carotenoides
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteiacutena verde fluorescente( GFP) Da fluorescencia verde bajo
la luz UV
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila
Chalcone syntetasa ( CHS) Enzima clave en la siacutentesis
de antocianinas requerida
para la coloracioacuten de los
peacutetalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
peacutetalos sean blancos
Sulfur gene SU Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Godge et al 2008
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS Nicotiana benthamiana Nicotiana
tabacum Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
mR
NA
bullTerapia Geacutenica
bullTransgeacutenesis
miRNA artificial
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Ventajas de los amiRNAs
Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
uacutenico de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico) hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
Construccioacuten de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
httpwmd3weigelworldorgcgi-binwebappcgi
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
httpkatahdinmssmeduarabidopsis2010scriptsmain2pl
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
MIGS miRNA-
induced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI 101111j1365-313X201104896x
Felipe Fenselau de Felippesdagger
Jia-wei WangDagger
Detlef Weigel
![Cis-encoded sRNAs, a conserved mechanism for …jb.asm.org/content/early/2016/06/21/JB.00381-16.full.pdf · 3 39 ,psruwdqfh 40 7khkxpdqjxwlvfrorql]hge\d ghqvhplfurelrwdzklfklvhvvhq](https://img.pdfslide.us/doc/110x75/5b2f6bc77f8b9a91438cd637/cis-encoded-srnas-a-conserved-mechanism-for-jbasmorgcontentearly20160621jb00381-16fullpdf.jpg)
