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Giorgio CattorettiUniversitá degli Studi Milano-Bicocca

U.O. Anatomia Patologica, Citologia Diagnostica Laboratorio di Genetica Medica

Azienda Ospedaliera San Gerardo

14° CORSO NAZIONALEPER TECNICI DI LABORATORIO OPERANTI NEI

SERVIZI DI ANATOMIA PATOLOGICA

Capaccio17 - 20 settembre 2007

Sensibilità e specificità in immunoistochimica:l’evoluzione di IRF4/MUM1

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#125

#8



BLOOD, 15 MARCH 2000 VOLUME 95 (6) pag.2084-92



IM9 myelomaPlasma CellsHHV8 C.D.

Normal P.C.MUM1 Ig light chain

Normal TonsilMUM1 CK

Normal Tonsil:MUM1 in GC

Normal Tonsil:MUM1 in GC





Mod Pathol 2001;14(7):686–694

Lymph node

Melanocytes,Melanomas

944 tissues stained for MUM1

Stages of Germinal Center Transit Are Defined by B CellTranscription Factor Coexpression and Relative Abundance

Giorgio Cattoretti, Rita Shaknovich, Paula M. Smith, Hans-Martin Jäck,Vundavalli V. Murty and Bachir Alobeid

The Journal of Immunology, 2006, 177: 6930–6939



IRF4, Pip, LSIRF, ICSAT and MUM1

Names, names, names (parole, parole, parole….)

IRF4 : interferon regulatory factor

Pip : PU.1 Interaction Partner

LSIRF : Lymphocyte Specific Interferon Regulatory Factor

ICSAT : Interferon Consensus Sequence Adult T cell leukemia

MUM1 : Multiple Myeloma Oncogene 1

IRF4, Pip, LSIRF, ICSAT and MUM1

Names, names, names (parole, parole, parole….)

HGNC GuidelinesGuidelines for Human Gene Nomenclature

Hester M. Wain, Elspeth A. Bruford, Ruth C. Lovering, Michael J. Lush, Mathew W. Wright and Sue PoveyGenomics 79(4):464-470 (2002)

http://www.genenames.org/guidelines.html

Deutsch EW, Ball CA, Bova GS, Brazma A, Bumgarner RE, Campbell D, Causton HC, Christiansen J, Davidson D, Eichner LJ, Goo YA, Grimmond S, Henrich T, Johnson MH, Korb M, Mills JC, Oudes A, Parkinson HE, Pascal LE, Quackenbush J, Ramialison M, Ringwald M, Sansone SA, Sherlock G, Stoeckert CJ Jr, Swedlow J, Taylor RC, Walashek L, Zhou Y, Liu AY, True LD

Development of the Minimum Information Specification for In Situ Hybridization and Immunohistochemistry Experiments (MISFISHIE).OMICS. 2006 Summer;10(2):205-8. Review. PMID: 16901227

http://www.liebertonline.com/doi/abs/10.1089/omi.2006.10.205

Gene name: IRF4Protein name: IRF4Antibody name or clone: MUM1p

IRF4, IRF-4, MUM-1, MUM1, BCL-6, BCL6, Ki67, Ki-67, MIB-1, MIB 1

vWF, Fact8, CD20, L26, panB, CD45, LC, CALLA, CD10

Stages of Germinal Center Transit Are Defined by B CellTranscription Factor Coexpression and Relative Abundance

Giorgio Cattoretti, Rita Shaknovich, Paula M. Smith, Hans-Martin Jäck,Vundavalli V. Murty and Bachir Alobeid




SPECIFICITA’

Definizione di SPECIFICITA’ nella pratica IHC quotidiana

Vista dal PATOLOGO:Colorazione brunastra che conferma il pregiudizio diagnostico del patologo, pregiudizio formato sulla H&E, irrispettivamente dalla qualitá della colorazione IHC stessa.

Vista dal TECNICO DI LABORATORIO:Colorazione diversa dalla concezione astratta di “fondo” che soddisfa la rappresentazione visiva virtuale conseguente alla lettura del foglietto illustrativo, lettura fatta sotto l’effetto della inalazione di solventi.

Vista da ENTRAMBI:Colorazione che soddisfa la percezione estetica del TECNICO e che induce reazioni non prevedibili nel PATOLOGO.

Nat

ure

Bio

tech

nolo

gy

25, 875 -

877 (

2007)

doi:10.1

038/n

bt0

807-8

75

Comparison of a “pheromonicin” with a whole antibody, a Fab domain and a single-chain Fv fragment. A pheromonicin is a fusion of the ~70-kDa bacterial toxin colicin Ia and a ~3-kDa antibody mimetic comprising the VHCDR1 (red), VHFR2 (green)

and VLCDR3 (purple) domains.

Binding of an antibody to its antigen can be mediated by the VHCDR1 and VLCDR3

domains.

Antibodies cut down to sizePeptides only 28 amino acids long retain the specificity of a parental antibody.

YK

KLA

SY

KK

LAS

Rabbit anti YKKLAS

Anticorpi specifici per epitopi, non per antigeni

YK

KLA

SIgG1human

IgG2amouse

YKKLAS

YK

KLA

SY

KK

LAS

Rabbit anti YKKLAS

YK

KLA

S

Proteina A

Proteina B

Anticorpi specifici per epitopi, non per antigeni

Specificita’ per adsorbimento con peptide

+ YKKLAS

Situazione C=

MITI

Il controllo di specificita’ di un anticorpo si fa guardando sul foglietto della ditta e comunque si fa l’inibizione con il peptide con cui si e’ immunizzato l’animale: FALSO

L’inibizione con peptide dimostra solamente che l’antisiero e’ specifico per quel peptide, non che riconosce una proteina nel tessuto. Proteine portanti antigeni crossreattivi vengono riconosciute da anticorpi “specifici”.La definizione di specificita’ e’ comunque responsabilita’ dell’utilizzatore.

YK

KLA

S

Rabbit anti Protein X, Nterm

Anticorpi diretti contro porzioni diverse di una proteina la riconoscono specificamente

YKKLAS

YK

KLA

S

Protein X

Protein Z

Protein Y

Protein J

Rabbit anti Protein X, Cterm

Regole per validare anticorpiper uso clinico ed sperimentale

Criteri per validare un anticorpo per IHC/IF.

• Due o piu’ anticorpi ottenuti contro sequenze non-identiche della proteina (ad es. N- e C-terminale) colorano in modo sovrapponibile.• Colorazione assente in topo Knockout ma presente in topo wild-type (se animale disponibile e peptide antigenicamente conservato)• Colorazione di antigene a localizzazione subcellulare dipendente da attivazione sperimentale, in condizioni controllate (es. da citoplasma va a nucleare solo dopo stimolo)

• 2 anticorpi che riconoscono la stessa proteina in modo differente ad es uomo vs topo colorano in modo simile• Transfettanti in cellule non-esprimenti (RNA-negative) sono positivi, i controlli no.• Linee cellulari con e senza inibizione con siRNA dell’espressione genica si colorano rispettivamente.• Linee cellulari multiple negative (RNA-negative) sono negative, linee positive, ma a contenuto noto e variable, quantificato, sono positive con intensita’ corrispondente.• Transfettanti a contenuto variabile (WB) si colorano rispettivamente.

• L’anticorpo riconosce una banda unica in WB ed e’ molto specifico e pulito con metodi estrattivi.• Due anticorpi sono prodotti in due animali diversi (es. coniglio e topo)e colorano in modo simile.

Criteri maggiori (un test e’ sufficiente per definire la specificita’)

Criteri minori (un solo test e’ suggestivo, ma non definisce la specificita’)

NON criteri (non definiscono la specificita’)

Morale della favola

•E’ totalmente inutile colorare qualsiasi sezione se non si ha un piano ed i reagenti per verificare la specificita’ di un nuovo anticorpo.

•Se l’anticorpo viene riferito come specifico, e’ bene fare i conti in tasca a chi lo ha definito tale.

•Irrispettivamente dalla efficacia e specificita’ di un anticorpo in applicazioni diverse dalla IHC / IF (Western Blot, immunoprecipitazione, Flow Cytometry), il comportamento e la specificita’ in IHC segue la sua logica, le sue regole e la sua specificita’.

5: 125, 2005

Interferon regulatory factor family Interacting partners

IRF2? and IRF8

IRF1? and IRF8

IRF3, IRF7, CBP, p300

IRF8, NFAT, BCL6, PU.1

IRF1, IRF3, IRF7

IRF3, IRF5

IRF1, IRF2, IRF4, PU.1

STAT1, STAT2

ND

ND

Antibodyclone orserum immunogen

Reactiveon species Source dilution

IRF4 sc-6059 C-term mouse h, m goat SCBT 0.2 µg/mlIRF4 #4964 Asp 175 h rabbit CST 1:100IRF4 sc-28696 AA128-267h h, m rabbit SCBT 1 µg/mlIRF4 MUM1 AA144-451h h mouse B. Falini 1:50

Anti-IRF4 antibodies used to define tissue distribution of the molecule

La distribuzione di IRF4 é molto piú ampia di quanto descritto in precedenza, include cellule B mantellari, dendritiche e altre

e corrisponde a quanto riportato per espressione di RNA.




Anticorpi contro la porzione di IRF4 compresa tra gli AA 128-267 riconoscono nel topo e nell’uomo un epitopo

conformazionale presente in cellule PU.1-




Sensitivita’ in IHC

Abundance of molecules, target for detectionstarting from lowest biologically relevant level, up

DNA RNA Protein

Single copy gene & up1-1,000 copies (30%)

1,000-10,000 copies (15%)10,000-100,000 copies (50%)

~ 300 molecules /cell & up

Cytokines : 1/10,000 ofhousekeeping genes(J Histochem Cytochem 46:1249,1998)

IL2R(*) : <500EPO-R (*) : ≈ 1,000cMYC (*) : <3,000 quiescent

3-6,000 prolif.CD3ζ : 25x 103

CD20 : 149 x 103

Hemizygosity(LOH, deletions),

homozygosity

(*) = not detectable by routine IHC

High sensitivity in situ detection methods

DNA RNA Protein

FISH with CARD FISH with CARD

IHC/ IF with CARD ?Single copy geneswith oligonucleotide probe

(isolated nuclei)

IL7 mRNA in 5637 line with pooled

oligonucleotide probes(J Histochem Cytochem 46:1249,1998)

?

Rolling circle amplification



NATURE BIOTECHNOLOGY VOLUME 24 NUMBER 8 AUGUST 2006, pag 914-16

Automated quantitative analysis (AQUA) of in situ protein expression, antibody concentration, and prognosis.McCabe A, Dolled-Filhart M, Camp RL, Rimm DL.J Natl Cancer Inst. 2005 Dec 21;97(24):1808-15. PMID: 16368942

HER2 1:250 HER2 1:4000

J Natl Cancer Inst. 2005 Dec 21;97(24):1808-15

CONCLUSIONE

• La linearita’ della risposta colorimetrica varia a seconda della concentrazione dell’ anticorpo primario.• La linearita’ della risposta colorimetrica varia a seconda del range di concentrazione di proteine in cui viene misurata• Il significato biologico della colorazione ottenuta varia drammaticamente a seconda della proteina colorata, ma soprattutto dalla diluizione dell’anticorpo usato.

GtaMo-biot

GtaMo-biot

GtaMo-F(ab)-FITC

GtaMo-F(ab)-FITC

Av-HRP

Av-HRP

Gta-FITC AP

Gta-FITC AP

2nd layer 3rd layer

A hybrid WB, ISH, IHC methodfor high sensitivity IHC.

Extensive blocking (skimmed milk powder)

Long washing

Higher primary and secondary Abs dilutions(1st Ab <1 µg/ml 2nd Ab >1/1,000)

Fewer layers (one AP-conjugated secondary Ab)

NBT/ BCIP color development for > 30 min

Risultati

Sensibilita’: 0.5 picogrammi per mm2 (pubblicati: 30 picogrammi per mm2 con LSAB,300 picogrammi per mm2 con PAP o ABC)

Non linearita’ della risposta Ag-anticorpo in IHC, ma una curva vagamente proporzionale alla risposta.

Hybrid IHC

Routine IHC

Routine IF

CARD IHC/IF

Routine FCM

WB

ELISA

1x105 1x104 1x103 1x102 1x101

Putative sensitivity of protein detection

RCA

Molecules/cell

IHC

RNA

FCM

Paragone tra distribuzione ed abbondanza di fattori di trascrizione in B cellule, in IHC, FCM ed espressione di RNA

Cat

tore

tti G

, et a

l. JC

atto

retti

G, S

hakn

ovic

h R

, Sm

ith P

M,

Jack

HM

, M

urty

VV

, Alo

beid

B.

Sta

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cen

ter

tran

sit a

re d

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ed b

y B

cel

l tra

nsc

ript

ion

fa

ctor

coe

xpre

ssio

n an

d r

elat

ive

abu

ndan

ce.

J Im

mun

ol.

2006

Nov

15;

177

(10

):69

30-9

. P

MID

: 170

8260

8

Conclusioni•Conosci la tua PROTEINA come le tue tasche: peso molecolare,

isoforme, alternative splicing, distribuzione subcellulare, distribuzione in

vertebrati, presenza di motifs (transmembrane domain, Nuclear

Localization Signals) etc., etc., etc.

•Stabilisci un piano d’azione SCIENTIFICO e seguilo con cura e

determinazione: potrebbe diventare una pubblicazione.

•Non fidarti del foglietto illustrativo, di nessuna informazione contenuta,

tranne i riferimenti bibliografici: guardateli ed in piú cerca PubMed.

Conosci tutta la letteratura chiave di quella proteina.

•Valuta criticamente i risultati preliminari su controlli positivi multipli.

•Sperimenta fino al punto in cui puoi fidarti cosí tanto di quella colorazione

immunoistochimica da poter dire ad un paziente se vivr á o morrá.

[email protected]@UNIMIB.IT

mailto:[email protected]

The Western Blot paradox

WB IHC

Status of the protein Fully denaturedPartially (?) denatured

(boiled in buffer or 6M urea)Crosslinked

Dilutions of primary Ab 1/10- 100th of IHC 10, 100x of WB

Staining time hours minutes

Washing time hours minutes

Penalty for excess primary AbPoor washing

Significant background Some background sometimes

Quantizzazione in situ di proteine marcate

Anticorpi

Dako Handbook

Anticorpi Dako Handbook

massimaridottaDisponibilita’

affinita’Titolo,

Affinita’Concentrazione

Tempo di incubazioneVariabili da considerare:

infinitalimitataRiproducibilita’

fissaspettroAffinita’ per l’antigene

unicaristrettaSpecificita’ per l’antigene

a vallea monteSelezione

nosiNecessita di antigene puro per essere prodotto:

AnticorpoMonoclonale

AnticorpoPoliclonale

Dako Handbook

Diretta Indiretta DoppiaIndiretta

PAPAPAAP

LSAB ABCcomplex

ABCcomplex

polymer

Sistemi di rilevazione

contr

CD40L

p65 p52 cRelphospho

IkBαpos

contrneg

contr

CD79a

Ki-67

NFkB family of TFMove to the nucleus when activated with CD40L

specifico specifico specifico specificodubbioRISULTATI

Il test e’ positivo quando la colorazione passa da citoplasmatic a nucleare dopo stimolazione con CD40L.

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