Sciences des Aliments - Revuesonline

Action des acides hydroxycinnamiques libres etestérifiés sur la croissance des bactéries lactiques

A.G. SALIH, J.-M. LE QUÉRÉ *, J.-F. DRILLEAU

SUMMARY Effect of hydrocinnamic acids on the growth of lactic bacteria.Hydroxycinnamic acids, their quinic esters and quinic acid are present in applejuice and cider. Effects of each of these compounds and of two mixtures onthe growth of one strain of two lactic acid bacteria species were studied by afour level factorial design. Each design involved three factors. Thus sixteendesigns were required to achieve the work described in the present paper. Thecompounds were the following hydroxycinnamic acids: Ferulic acid, p-Couma-ric acid, Caffeic acids, p-Coumaroyl quinic acid, 5’-Caffeoyl quinic acid and thenon-phenolic acid: Quinic acid. The two mixtures on an equimolecular basiswere: p-Coumaric acid/Quinic acid and Caffeic acid/Quinic acid. The lacticbacteria species were: Oenococcus oeni and Lactobacillus plantarum. The fac-tors involved were: pH, tested compound concentration and pitching rate. Twogrowth parameters were examined: apparent growth rate and biomass produc-tion. Results showed that esters and Quinic acid were not active and that bac-terial growth was only affected by hydroxycinnamic acid concentrations. Adecreasing inhibitory effect was shown from Ferulic acid to p-Coumaric acidand Caffeic acid. The two strains behaved differently: both apparent growthrate and biomass production decreased for Oenococcus oeni while only theapparent growth rate was affected for Lactobacillus plantarum.

Key-words: lactic acid bacteria, bacterial growth, phenolic compounds, pH,cider.

RÉSUMÉLes dérivés des acides hydroxycinnamiques (AHC) sont naturellement présentsdans les jus de fruits, vins et cidres. Au cours de ce travail nous avons déter-miné, à l’aide de plans d’expérience, les effets de ces composés sur la crois-sance d’une souche de Oenococcus oeni et d’une souche de Lactobacillusplantarum. Les plans d’expérience comprennent trois facteurs : pH, taux d’ino-culation et concentration en composés phénoliques. Ces composés sont :l’acide quinique, les AHC libres (acides férulique, p-coumarique et caféique),

SCIENCES DES ALIMENTS, 20(2000) 537-560

Station de recherches cidricoles, Biotransformation des fruits et légumes, Institut national de larecherche agronomique, B.P. 29, 35650 Le Rheu, France.

* [email protected]

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les formes estérifiées (acides 5’-caféoyl-quinique et p-coumaroyl-quinique)ainsi que deux mélanges équimolaires (acide caféique / acide quinique et acidep-coumarique / acide quinique). Les résultats ont montré que les AHC libressont inhibiteurs vis-à-vis des bactéries lactiques, alors que leurs esters n’ontque peu ou pas d’effet. Les AHC libres peuvent être classés par ordre d’ac-tions inhibitrices décroissantes : acide férulique, acide p-coumarique et acidecaféique, c’est-à-dire dans l’ordre décroissant de leur hydrophobicité. Lesdeux bactéries examinées réagissent différemment vis-à-vis de la toxicité desAHC : pour Oenococcus oeni, on observe à la fois une baisse du µ apparent etde la quantité de la biomasse produite. En revanche, pour Lactobacillus planta-rum, l’effet des AHC concerne surtout la réduction du µ apparent.

Mots clés : composé phénolique, bactérie lactique, croissance bactérienne,pH, cidre.

1 - INTRODUCTION

Dans les boissons fermentées telles le vin et le cidre, les bactéries lactiquesjouent un rôle important. Leur développement peut être considéré comme favo-rable si leurs actions se limitent à la transformation de l’acide L-malique en acideL-lactique (Transformation Malo-Lactique ou TML). Malheureusement ces bacté-ries sont souvent du type hétéro-fermentaire et donc capables de métaboliserles sucres résiduels en divers composés dont l’acide acétique, ce qui peutentraîner une altération de la boisson connue sous le nom de « piqûre lactique ».

Au cours de leurs travaux sur la fermentation de divers cidres dans desconditions naturelles, SALIH et al. (1988) ont observé la disparition des bactériesau bout de trois semaines dans un des échantillons sans qu’il y ait eu lemoindre début de TML. Il s’agissait d’un cidre élaboré à partir de variétésamères c’est-à-dire riches en composés phénoliques ; la concentration initialedu moût en composés phénoliques totaux était de 2,7 g·L–1. Ces mêmesauteurs (SALIH et al., 1987) avaient déjà montré qu’effectivement la présence decomposés phénoliques dans le moût jouait un rôle significatif sur le délai d’ap-parition de la TML et sur sa vitesse lorsque le taux d’inoculation était faible. Orces deux critères sont corrélés à la croissance bactérienne.

Dans le fruit « Pomme à Cidre », on rencontre principalement des acideshydroxycinnamiques sous la forme d’esters quiniques et des tanins c’est-à-diredes flavan 3-ols, catéchines (oligo et polymères de catéchines) ainsi que deschalcones.

Périodiquement, quelques auteurs tentent de faire le point sur l’action decomposés phénoliques sur le comportement de diverses populations micro-biennes. C’est ainsi que FORNACHON (1943) et KUNKEE (1967) pensent que lestanins n’ont qu’une influence mineure sur la croissance des bactéries lactiques,alors que DOMERCQ et al. (1959) montrent que l’enrichissement du vin en com-posés phénoliques venant du fût de bois neuf rend la TML difficile. De même,BENARD et JOURET (1962) soulignent que la richesse en tanins du raisin pourraitinhiber la croissance de la flore lactique ce qui fut confirmé par RADLER (1963),HUSFELD (1964) et VIVAS et al. (1995) ; ces derniers observèrent une forte inhibi-

538 Sci. Aliments 20(6), 2000 A. Salih et al.

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tion de la croissance de Leuconostoc oenos (aujourd’hui nommée Oenococcusoeni) et de la décarboxylation du malate en présence de procyanidols.

Si quelques auteurs ont étudié l’effet des procyanidols sur des bactéries decontamination telles que Clostridium, Pseudomonas et Enterobacter (SCALBERT,1991) l’activité antimicrobienne des composés phénoliques a surtout étérecherchée du côté des dérivés des acides cinnamiques. C’est ainsi que LEIFER-TOVA et al. (1975) ont observé une activité antimicrobienne vis-à-vis de Staphy-lococcus pyrogenes et Escherichia coli, de divers composés phénoliques, enparticulier de dérivés de l’acide benzoïque, du benzaldéhyde, mais pas desdeux acides hydroxycinnamiques, l’acide p-coumarique et l’acide férulique. Cesdernières observations sont contraires à celles de HERALD et DAVIDSON (1983)qui, eux, ont montré que les AHC ont une activité inhibitrice vis-à-vis du déve-loppement d’Escherichia coli, de Staphylococcus aureus et de Bacillus cereus.Tout récemment, MACIEJEWICZ et MERESTA (1999) ont mis en évidence une acti-vité bactériostatique de l’acide férulique, l’acide caféique et l’acide p-couma-rique vis-à-vis de Staphylococcus aureus.

L’activité anti-microbienne n’est d’ailleurs pas limitée aux bactéries decontamination ; en effet BARANOWSKI et al. (1980) ont constaté que l’acide féru-lique, à forte concentration (250 mg·L–1) inhibait la croissance de Saccharo-myces cerevisiae.

Dans le domaine des boissons, des travaux plus tardifs ont mis en évidencel’action des acides hydroxycinnamiques sur les bactéries lactiques qui y sonthabituellement rencontrées. STEAD (1993, 1994) signale l’effet des acidescaféique, p-coumarique, férulique et 5’-caféoyl-quinique. Il montre que les acidesp-coumarique et férulique en concentration supérieure à 500 mg·L–1 inhibent lacroissance de souches de bactéries lactiques : Lactobacillus brevis et Lactobacil-lus collinoides ; dans les mêmes conditions l’effet de l’acide caféique étaitmoindre tandis que celui de l’acide 5’-caféoyl-quinique était plutôt stimulant.

CAVIN et al. (1993) constatent que l’acide férulique (100 mg·L–1) exerce uneactivité inhibitrice sur les souches de Lactobacillus sp., de Pediococcus sp. etsurtout de Oenococcus oeni. Cette inhibition de croissance se traduit notam-ment par une prolongation de la phase de latence.

Plus récemment, COWAN (1999), signale que l’acide caféique, contenu dansl’estragon et dans le thym, exerce un effet inhibiteur contre les virus, les bacté-ries et les moisissures.

L’inhibition de la croissance n’est pas d’ailleurs la seule activité des compo-sés phénoliques, il peut y avoir stimulation. C’est le cas des anthocyanes libresselon VIVAS et al. (1995) sur Oenococcus oeni et de l’acide gallique sur des bac-téries lactiques (STEAD, 1994 ; VIVAS et al., 1995).

Les différentes conditions d’études seraient responsables des contradic-tions rencontrées quant aux activités plus ou moins inhibitrices ou stimulantesdes divers acides hydroxycinnamiques et de leurs esters vis-à-vis des diversescomposantes de la microflore. C’est pourquoi, dans le présent travail, nousavons cherché à préciser les conditions favorisant la croissance de souches debactéries lactiques éventuellement utilisables dans le domaine du cidre deconsommation ; en effet cette boisson est caractérisée par l’emploi d’unematière première le plus souvent composée de variétés de pommes à cidreriches en composés phénoliques et par une fermentation partielle. Les contra-

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dictions relevées dans la littérature concernant les effets inhibiteurs ou activa-teurs de certains composés résulteraient de la présence d’interactions entrefacteurs. Il a donc été pris soin de choisir des plans d’expérience permettant lamise en évidence de ces interactions.

2 - MATÉRIEL ET MÉTHODES

2.1 Microorganismes et milieux de culture

Deux espèces de bactéries lactiques ont été utilisées pour réaliser cetteétude : Oenococcus oeni et Lactobacillus plantarum commercialisées par la firmedanoise CHR Hansen, sous forme lyophilisée, respectivement sous la marqueVinifloraTM oenos et VinifloraTM plantarum. Dès l’ouverture du sachet, le levain estreconditionné en flacon stérile sous gaz carbonique et congelé à – 30 °C.

L’ensemencement des bactéries lactiques s’effectue à partir du levain lyo-philisé qui est mis en suspension dans de l’eau physiologique (tryptone 1 g·L–1 ,NaCl 8,5 g·L–1) stérile pour ensemencer les plaques de microtitratation commedécrit plus loin. L’ensemencement a été effectué sans propagation, pour desraisons de reproductibilité des manipulations et pour se reprocher de la réalitéindustrielle où l’ensemencement est direct.

Le milieu FT 80 (Fructose Tween 80) dérivé de celui du CAVIN et al. (1988) aservi pour la croissance des bactéries. Ce milieu est composé de (en g·L–1) :casaminoacids -Difco (5) ; extrait de levures -Difco (4) ; D (+) glucose (5) ; D (-)fructose (3,5) ; acide L (-) malique -Sigma®(4) ; KH2PO4 (0,6) ; KCl (0,45) ; CaCl2(0,13); MgSO4 (0,13); MnSO4 (0,003) et Tween 80 (1 mL). La modification a portésur le remplacement de l’acide DL (-) malique (10 g·L–1) par l’acide L (-) malique(4 g·L–1). Le pH a été ajusté à 4,5 par NaOH 10 N. Le milieu est stérilisé parautoclavage 10 min. à 110 °C.

2.2 Composés phénoliques

Différents acides hydroxycinnamiques libres et estérifiés et un acide orga-nique ont servi à cette étude : les acides férulique, p-coumarique, caféique, qui-nique, 5’-caféoyl-quinique, ont été fournis par Sigma®. En revanche, l’acidep-coumaroyl-quinique (p-CQ) qui n’est pas disponible dans le commerce, a étéisolé et purifié au laboratoire de la Station de recherches cidricoles — Inra — LeRheu à partir d’un cidre au moyen d’une extraction liquide / liquide par l’acétated’éthyle suivie d’une chromatographie à l’échelle préparative sur une colonneLichrospher® éluée par un mélange eau acidifiée avec l’acide acétique / acéto-nitrile. Le rendement d’extraction est de 32 mg d’acide p-CQ pour 1 L de cidre.

La pureté de l’acide p-CQ a été vérifiée après son hydrolyse acide en met-tant en évidence l’acide quinique formé par chromatographie sur papier selon laméthode décrite par RIBEREAU-GAYON et al. (1982). L’acide p-coumarique libéréa été identifié par chromatographie en phase inverse d’après son spectreUV/Visible et de son temps de rétention par comparaison avec l’acide p-cou-marique standard du commerce. La structure de l’acide p-CQ a été confirmée


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par spectrométrie de masse à ionisation electrospray (ESI, MS-MS). Les résul-tats obtenus sont comparables à ceux déjà observés par POON (1998) réalisésdans des conditions équivalentes.

Au moment de l’utilisation, les divers composés phénoliques sont dissousdans l’éthanol absolu (99,8 %) ; les solutions obtenues sont filtrées sur mem-brane stérile (Millex®-HV, 0,45 µm) qui n’absorbe pas les composés utilisés. Laconcentration éthanolique de la solution mère est de 20 % v/v (avec 80 %d’eau déminéralisée stérile). La concentration finale d’éthanol dans le milieusera de 5 % vol.

2.3 Planification

Au moyen des plans d’expérience, le comportement de chacune des deuxbactéries (Oenococcus oeni et Lactobacillus plantarum) a été étudié en pré-sence des différents composés phénoliques ou mélanges suivants :

– ester quinique de l’acide caféique (acide 5’-caféoyl-quinique) ;

– ester quinique de l’acide p-coumarique (acide p-coumaroyl-quinique : p-CQ) ;

– mélange équimolaire : acide caféique / acide quinique ;

– mélange équimolaire : acide p-coumarique / acide quinique ;

– acide férulique, acide p-coumarique, acide caféique, acide quinique.

Bien que l’objectif principal de ce travail soit d’étudier l’effet des composésphénoliques nous avons ajouté deux autres facteurs — le pH et le taux d’inocu-lation — afin de vérifier la présence d’une éventuelle interaction.

Tableau 1Modalités des facteurs testés dans les plans factoriels

Table 1Quantitative levels of the experimental designs factors

Facteurs NiveauxCode – 3 – 1 1 3

pH P 3,3 3,8 4,3 4,8

Teneur en composés phénoliques (mM) F 0 1 2 3

Taux d’inoculation (UFC·mL–1) I 103 104 105 106

Les expérimentations ont été planifiées sous la forme de plans factorielscorrespondant chacun à une combinaison d’une bactérie avec un composéphénolique. Pour chaque plan nous avons attribué aux trois facteurs (pH,concentration en composé phénolique, taux d’inoculation) quatre modalitéscodées – 3 ; – 1 ; + 1 ; + 3 (tableau 1) ce qui conduit à 64 individus différents.Les plaques de microtitration comportant 96 puits, il a été tiré profit des 32puits résiduels pour répéter 50 % des individus du plan complet. Les individussupplémentaires ont été choisis de la même façon que pour la réalisation d’unplan fractionnaire selon CLIQUET et al. (1994).


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2.4 Suivi de la croissance en plaques de microtitration

La croissance de bactéries, a été réalisée dans des plaques de microtitrationFALCON® (Becton Dickinson, France) à fond plat stérilisées aux rayons gammaet comportant 96 puits. Ces plaques sont munies de couvercles stériles pourréduire l’évaporation du milieu et la contamination liée. La croissance des bac-téries lactiques a été déterminée en suivant l’évolution de la Densité Optique(DO à 690 nm) du milieu de culture dans chaque puits. La DO a été mesurée aumoyen d’un lecteur de plaque de microtitration UVmaxTM (Kinetic MicroplateReader, Molecular Devices Corporation-Menlo Park, California, USA). Selon leconstructeur, à 690 nm, l’absorbance est linéaire de 0 à 2,500 DO et la préci-sion de l’appareil est de ± 1 %.

Le remplissage des puits est effectué en quatre étapes successives :

– 90 µL de milieu FT80 double concentration, tamponné et ajusté aux pH duplan ;

– 45 µL de solution de composés phénoliques dans un mélange hydro-alcoolique à 20 % ;

– 45 µL de suspension bactérienne dans de l’eau physiologique ;

– 20 µL d’huile de vaseline préalablement autoclavée.

Au final chaque puits contient 180 µL de milieu de croissance à 5% d’étha-nol. Les 20 µL d’huile de vaseline contribuent à limiter l’évaporation. Lesplaques de microtitration sont incubées à 25 °C ; la lecture de la DO est effec-tuée sans couvercle, à intervalles réguliers (une à deux fois par jour, pendanttrois semaines environ).

2.5 Exploitation des résultats

Les résultats bruts (DO) ont été traités par étapes successives :

1. Pour chaque espèce bactérienne, les valeurs de DO ont été transforméesen biomasse à l’aide d’une gamme étalon établie selon la relation, Y = aX2 + bX,avec :

Y = la biomasse sèche (exprimée en g·L–1)

X = DO du milieu de croissance – DO du milieu stérile.

2. Les courbes de croissance en biomasse [biomasse = f(t)] ont été construitespour chaque combinaison de facteur (soit 2 × 8 × 96 cas). Ces courbes tracées surune échelle logarithmique montrent une augmentation de la croissance suivie d’unarrêt. La biomasse atteint alors sa valeur maximale puis reste constante jusqu’à lafin de l’expérience. Nous avons fixé une valeur seuil (DO = 0,01) qui correspond àla limite de sensibilité de la mesure de DO. Les valeurs inférieures à ce seuil ont étééliminées des calculs ultérieurs. Le point initial de la courbe a été calculé à partirde la biomasse initiale inoculée dans le milieu.

3. À partir de chaque courbe, deux critères (ou variables expliquées) ont étédéterminés pour décrire la courbe de croissance des bactéries ; il s’agit de :

– la pente de la droite reliant la biomasse initiale et la biomasse en fin decroissance (exprimées en logarithme népérien) ;

– la quantité de la biomasse produite, obtenue par la différence entre la bio-masse finale et la biomasse initiale.


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Les valeurs de ces deux critères constituent les réponses des plans d’expé-rience. Lors des étapes suivantes ces valeurs sont traitées par des procéduresstatistiques pour déterminer les effets des facteurs du plan.

4. Le traitement statistique est réalisé à l’aide du logiciel SAS® par la procé-dure GLM (General Linear Model) selon la méthode décrite par NOEL et al.,1991. Il consiste à exprimer chacune des réponses (µ apparent et biomasseproduite) sous forme d’un polynôme d’ordre 2 en fonction des trois facteurs duplan :

µ apparent = a1.(P) + a2.(P)2 + b1.(F) + b2.(F)2 + c1.(I) + c2.(I)2 + g.(P).(F) +

h.(P).(I) + i. (F).(I) + e

Biomasse produite = α1.(P) + α2.(P)2 + β1.(F) + β2.(F)2 + γ1.(L) + γ2.(I)2 + δ.(P).(F)

+ ε.(P).(I) + ϕ.(F).(I) + e

où P, F et I représentent les polynômes orthogonaux normés correspondantrespectivement au pH du milieu, à la concentration du composé phénolique(mM) et au taux d’inoculation (UFC.mL–1) et e l’erreur par rapport au modèle.Les coefficients polynomiaux a1, a2, b1, b2, ... et α1, α2 ... β1, β2 ... définissentainsi les effets des facteurs.

5. Afin de visualiser l’action des trois facteurs, nous avons représenté, sousforme d’histogrammes, les valeurs simulées des deux réponses à l’aide d’unsous-modèle impliquant uniquement les valeurs vraies des facteurs ayant uneffet significatif.

3 - RÉSULTATS

Bien que l’acide férulique soit peu représenté dans la pomme et dans lecidre, il a été inclus dans ce travail pour pouvoir en comparer ses effets avecceux de la littérature, généralement obtenus dans le vin qui contient une quan-tité non négligeable de cet acide.

3.1 Signification des résultats

Ce travail est constitué de 16 plans d’expérience qui se caractérisent par lechoix de la bactérie et du composé phénolique ainsi que l’indique le tableau 2.L’objectif des expérimentations est de déterminer l’effet de la concentration descomposés phénoliques sur la croissance des bactéries, dans différentes condi-tions de pH et de taux d’inoculation.

Du fait de la faible sensibilité de la mesure de la DO le début de la crois-sance n’est pas observable. En conséquence il est impossible de déterminer letemps de latence et la vitesse spécifique de croissance. Nous avons doncquantifié la croissance des bactéries à l’aide de deux paramètres : le µ apparentqui correspond à la pente de la droite reliant la biomasse initiale et la biomasseen fin de croissance (exprimées en logarithme népérien), et la quantité de la bio-masse produite, obtenue par la différence entre la biomasse finale et la bio-masse initiale.


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Tableau 2Intitulé des plans d’expérience

Table 2

Names of the experimental designs

Plan Bactérie Composé phénolique utilisé dans le pland’expérience

OAF Oenococcus oeni Acide féruliqueOAP Acide p-coumariqueOAC Acide caféiqueOAQ Acide quiniqueOEC Ester quinique de l’acide caféiqueOEP Ester quinique de l’acide p-coumariqueOMC Mélange d’acide caféique et d’acide quiniqueOMP Mélange d’acide p-coumarique et d’acide quinique

PAF Lactobacillus plantarum Acide féruliquePAP Acide p-coumariquePAC Acide caféiquePAQ Acide quiniquePEC Ester quinique de l’acide caféiquePEP Ester quinique de l’acide p-coumariquePMC Mélange d’acide caféique et d’acide quiniquePMP Mélange d’acide p-coumarique et d’acide quinique

Dans un premier temps la signification des effets a été calculée. Si l’onretient le degré de confiance de 95 % (α = 0,05), habituellement utilisé dans lesinterprétations statistiques, on observe que même des effets très faibles appa-raissent significatifs, compte tenu du nombre de degrés de liberté élevé. Enconséquence, pour ne retenir que les effets les plus importants, la probabilitéd’erreur de 1re espèce a été abaissée à α = 0,001 (effets très hautement signifi-catifs). De plus, pour chaque effet retenu le coefficient du sous-modèle a étécalculé. Les plans d’expérience se différencient par le composé phénolique (oule mélange des composés) dont on fait varier la concentration. Dans la suite ilsseront désignés à l’aide de sigles dont la signification est indiquée dans letableau 2. Les résultats du traitement statistique sont reportés sur le tableau 3(Oenococcus oeni) et le tableau 4 (Lactobacillus plantarum).

3.2 Effets des facteurs sur la croissance de Oenococcus oeni

3.2.1 Effet du pH

Le tableau 3 montre que, pour tous les plans d’expérience réalisés, le pH (P)a un effet significatif tant sur le µ apparent que sur la biomasse formée : l’aug-mentation du pH provoque une augmentation de ces deux critères. Dans cinqdes huit expérimentations (OAC, OAQ, OEC, OEP et OMC), cet effet est qua-dratique, ce qui indique l’existence d’une zone optimale de pH voisine de 4,3.Dans les trois cas restant, OAF, OAP et OMP, seul un effet linéaire a été mis enévidence. Cet effet du pH peut être visualisé sur la figure 1 et la figure 2.


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Figure 1

Effet de la concentration des esters — acide 5’-caféoyl-quinique (OEC)et acide p-coumaroyl-quinique (OEP) — sur le µ apparent (a, c) et sur la production

de biomasse (b, d) de Oenococcus oeniEffect of 5’-cafeoyl-quinic acid (OEC) and p-coumaroyl-quinic acid (OEP)

concentrations on Oenococcus oeni specific growth rate (a, c)and biomass production (b, d)

Seule l’expérimentation OMP montre une interaction significative entre pH etconcentration en composé phénolique pour le critère « biomasse produite ».Cette interaction s’exprime par une réduction de l’effet du pH lorsque laconcentration en composés du mélange augmente mais, quelle que soit cetteconcentration, l’augmentation du pH entraîne toujours celle de la biomasse pro-duite.

3.2.2 Effet du taux d’inoculation

Le tableau 3 montre que le taux d’inoculation (I) présente un effet significatifsur le µ apparent pour cinq des huit expérimentations (OAC, OAQ, OEC, OEP etOMC) ainsi que sur la quantité de biomasse produite dans un cas (OAQ). Lescoefficients de l’effet I sont tous négatifs ce qui signifie que l’augmentation dutaux d’inoculation entraîne la diminution du paramètre concerné.

3.2.3 Effet de la concentration des composés phénoliques

Les composés et mélanges que nous avons étudiés peuvent être classés endeux catégories principales selon leur effet :

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– d’une part l’acide quinique (OAQ) et les esters quinique des acides hydroxy-cinnamiques, (OEC et OEP – figure 1) pour lesquels l’augmentation de laconcentration n’entraîne en général aucune modification significative du µapparent ni de la biomasse produite. À noter cependant que l’expérimenta-tion OEC (ester quinique de l’acide caféique) se singularise par une produc-tion plus élevée de biomasse pour les concentrations centrales c’est-à-dire1 et 2 mM (effet quadratique négatif sans effet linéaire significatif) ;

– d’autre part les acides hydroxycinnamiques libres (OAF, OAP et OAC –figure 2) et les mélanges équimolaires d’acides hydroxycinnamiques /acide quinique (OMP et OMC) pour lesquels l’augmentation de la concen-


Figure 2Effet de la concentration des acides férulique (OAF), p-coumarique (OAP),

et caféique (OAC) sur le µ apparent (a, c, e) et sur la production de biomasse (b, d, f)de Oenococcus oeni

Effect of ferulic acid (OAF), p-coumaric acid (OAP) and cafeic acid (OAC)concentrations on Oenococcus oeni specific growth rate (a, c, e)

and biomass production (b, d, f)

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tration entraîne une diminution significative du µ apparent et de la bio-masse produite. À titre d’exemple la figure 2 permet de visualiser ceseffets significatifs. Pour les expérimentations OAC et OMC (contenant del’acide caféique) les effets sur le µ apparent et sur la biomasse produitessont linéaires, alors que pour les expérimentations OAF et OAP (acidesférulique et p-coumarique) on observe un effet quadratique sur la bio-masse formée. Pour OMP (mélange acide p-coumarique / acide quinique)il existe un effet quadratique aussi bien sur la biomasse formée que sur leµ apparent. Tant pour les expérimentations concernant les AHC libres(OAF, OAP et OAC) que pour celles concernant les mélanges (OMP etOMC), on observe que l’effet de la concentration en composés phéno-liques varie selon les acides concernés : fort pour l’acide férulique (OAF), ilest nettement plus faible pour l’acide caféique (OAC et OMC).

3.3 Effets des facteurs sur la croissance de Lactobacillus plantarum

3.3.1 Effet du pH

Comme pour Oenococcus oeni le tableau 4 montre que, dans tous lesplans d’expérience réalisés, le pH présente un effet significatif tant sur le µapparent que sur la biomasse formée : l’augmentation du pH provoque celle deces deux critères. Dans trois des huit expérimentations (PAP, PAQ et PMC) ceteffet est quadratique vis-à-vis des deux paramètres ce qui traduit également laprésence d’une zone optimale. Cependant le pH optimum serait plus élevépour cette bactérie (pH > 4,8). Dans les cinq autres cas l’effet du pH est qua-dratique pour un seul des deux critères : le µ apparent pour PAC, PEC, PEP etla biomasse produite pour PAF PMP. Les figures 3 et 4 permettent de visuali-ser ces effets.

Dans six des huit expérimentations (PAF, PAP, PAC, PEP, PMC et PMP) lepH présente une interaction significative avec la concentration en composéphénolique pour le critère µ apparent. Comme pour Oenococcus oeni ces inter-actions s’expriment par une réduction de l’effet du pH lorsque la concentrationaugmente mais, quelle que soit la concentration des composés ou du mélange,le sens de l’effet est toujours le même : l’augmentation du pH entraîne toujoursl’augmentation de la biomasse produite.

En outre pour l’expérimentation PEP il existe une interaction significativeentre pH et taux d’inoculation ; comme précédemment, l’effet du pH restedominant. L’interaction se traduit par une forte augmentation de l’effet du pHsur le µ apparent lorsque le taux d’inoculation est à son niveau le plus élevé.

3.3.2 Effet du taux d’inoculation

Le tableau 4 montre que le taux d’inoculation (I) a un effet significatif sur laquantité de biomasse produite dans six des huit expérimentations (PAF, PAP,PAQ, PEC, PEP et PMC). Les coefficients de l’effet I sont positifs ce qui signifieque l’augmentation du taux d’inoculation entraîne celle de la biomasse produite.

Le taux d’inoculation (I) a également un effet significatif sur le critère µ appa-rent pour trois des huit expérimentations (PAC, PEP et PMC), mais il peut exis-ter des interactions avec la concentration en composé phénolique (PMC) ou lepH (PEP). Dans ces deux cas l’effet du taux d’inoculation doit être calculé en


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Figure 3Effet de la concentration des esters — acide 5’-caféoyl-quinique (PEC)

et acide p-coumaroyl-quinique (PEP) — sur le µ apparent (a, c) et sur la productionde biomasse (b, d) de Lactobacillus plantarum

Effect of 5’-cafeoyl-quinique acid (PEC) and p-coumaroyl-quinique acid (PEP)on Lactobacillus plantarum specific growth rate (a, c) and biomass production (b, d)

Tableau 5Effet du taux d’inoculation (dµ/dI) sur le µ apparent de Lactobacillus plantarum(constant pour PAC) en fonction de la concentration en composés phénoliques

(pour PMC) et en fonction du pH (pour PEP)

Table 5Effect of pitching rate (dµ/dI) on Lactobacillus plantarum apparent specific growthrate (constant for PAC) as a fonction of phenolic compounds concentration (PMC)

and as a fonction of pH (PEP)

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dérivant l’expression du µ apparent (dans le modèle statistique) par rapport autaux d’inoculation (dµ/dI). Les valeurs de l’effet (I) regroupées dans le tableau 5,indiquent que le sens de l’effet est variable :

– soit il est constant et faiblement négatif pour PAC (sans interaction) ;

– soit il varie en fonction de la concentration en composés phénoliques(PMC et PMP) ; l’effet est variable et faible ;

– soit il varie en fonction du pH (PEP) ; l’effet est variable et faible.


Figure 4Effet de la concentration des acides férulique (PAF), p-coumarique (PAP),

et caféique (PAC) sur le µ apparent (a, c, e) et sur la production de biomasse (b, d, f)de Lactobacillus plantarum

Effect of ferulic acid (PAF), p-coumaric acid (PAP) and cafeic acid (PAC)on Lactobacillus plantarum specific growth rate (a, c, e)

and biomass production (b, d, f)

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3.3.3 Effet de la concentration des composés phénoliques

Seules deux expérimentations (PAF et PMP) ont présenté des effets signifi-catifs de la concentration en composés phénoliques sur la biomasse produite.Dans les deux cas l’effet est négatif et il n’est pas accompagné d’interaction.L’effet est quadratique uniquement dans l’expérimentation PAF.

On observe, contrairement aux expérimentations portant sur Oenococcusoeni, qu’en ce qui concerne le µ apparent, les effets significatifs de la concen-tration en composés phénoliques sont toujours associés à une ou plusieursinteractions (pH, taux d’inoculation). Comme dans le paragraphe précédent, dufait de la présence de ces interactions, les coefficients du modèle donnés dansle tableau 4 n’indiquent pas directement l’effet. Seuls les résultats du calcul dela dérivé du µ apparent par rapport à la concentration en composé phénolique(tableau 6) permettent de compléter les résultats en indiquant l’évolution de l’ef-fet pour les différents composés en fonction du pH.

Tableau 6Effet de la concentration en composés phénoliques sur le µ apparent

de Lactobacillus plantarum en fonction du pH

Table 6Effect of the concentration of phenolic compounds on Lactobacillus plantarum

apparent specific growth rate as a fonction of pH

pH 3,3 3,8 4,3 4,8Expérimentation

PAF* – 0,0289 – 0,0623 – 0,0956 – 0,1289PAP – 0,0239 – 0,0413 – 0,0587 – 0,0761PAC – 0,0019 – 0,0096 – 0,0212 – 0,0327PAQ — — — —PEC — — — — PEP – 0,0037 – 0,0052 – 0,0142 – 0,0231PMC** – 0,0000 – 0,0150 – 0,0300 – 0,0450PMP** – 0,0191 – 0,0030 – 0,0814 – 0,1125

(*) Les effets indiqués pour PAF sont des valeurs moyennes (effet à la concentration moyenne) carl’effet de la concentration est quadratique.(**) Les effets indiqués pour PMC et PMP sont des valeurs moyennes (pour un taux d’inoculationmoyen) car il existe également une interaction taux d’inoculation / concentration.(*) Indicated effect for PAF are mean values (at mean concentration) because of the quadratic effectof the concentration.(**) Indicated effect for PMC and PMP are mean values (at mean pitching rate) because of the inter-action effect of pitching rate with concentration.

Globalement, comme pour Oenococcus oeni, les composés et mélangesque nous avons étudiés peuvent être classés, selon leurs effets, en deux caté-gories principales :

– d’une part, les expérimentations PAQ (acide quinique), PEC et PEP (estersquinique des acides hydroxycinnamiques – figure 3), où l’augmentation dela concentration ne modifie pas (ou peu) le µ apparent et la biomasse pro-duite. L’expérimentation PEP présente certes un effet significatif mais il esttrès faible par rapport aux autres effets mis en évidence ;


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– d’autre part les expérimentations PAF, PAC et PAP (acides hydroxycinna-miques libres – figure 4) et les expérimentations PMC et PMP (mélangeséquimolaires d’acides hydroxycinnamiques / acide quinique) où l’augmen-tation de la concentration entraîne la diminution significative du µ apparentet, dans le cas de PAF et de PMP, de la biomasse produite.

La figure 4 permet d’observer, comme pour Oenococcus oeni que l’effet de laconcentration en composés phénoliques varie selon les acides concernés : fortepour l’acide férulique (PAF), elle est nettement plus faible pour l’acide caféiquedans PAC et PMC. De plus, l’effet porte essentiellement sur le µ apparent : seulsPAF et PMP font exception mais, même dans ces cas l’effet de la concentrationen phénol sur la biomasse ne conduit cependant pas à une inhibition totale.

4 - DISCUSSION

Le pH initial du milieu joue un rôle capital sur la croissance de Oenococcusoeni et de Lactobacillus plantarum. L’augmentation du pH accroît à la fois le µapparent et la biomasse formée. Pour Oenococcus oeni, on observe un µ appa-rent compris entre 0,6 et 0,8 h–1 lorsque les pH sont supérieurs à 4,3, alors qu’àpH 3,3 le taux de croissance est plus faible (0,2-0,3 h–1). De même, les valeurs cor-respondantes de la biomasse produites passent respectivement de 0,2-0,3 g·L–1 àmoins de 0,1 g·L–1 lorsque que le pH baisse de 4,8 à 3,3. Pour Lactobacillus plan-tarum le µ apparent est compris entre 0,40 et 0,60 h–1 à pH 4,8, et entre 0,02 et0,03 h–1 à pH 3,3. Les valeurs des biomasses passent de 1,2-1,8 g·L–1 à 0,2-0,6g·L–1 quand le pH baisse de 4,8 à 3,3. Ces observations confirment de nombreuxtravaux antérieurs effectués dans différents milieux (dans le vin : BIDAN, 1967 ; PEY-NAUD, 1967 ; CASTINO et al., 1975 ; DAVIS et al., 1986, ou dans un milieu à base dejus de pomme : CHAMPAGNE et al., 1989). EKLUND (1989) explique l’action du faiblepH du milieu sur la croissance des bactéries par des perturbations du pH interne(pH du cytoplasme) de la cellule bactérienne. Pour Oenococcus oeni, il sembleque le pH optimum soit situé entre pH 4,3 et 4,8, confirmant ainsi les travaux deCHAMPAGNE et al. (1989) qui indiquaient un pH optimal voisinant 4,5 dans le casd’une souche de Oenococcus oeni. En revanche, pour Lactobacillus plantarum leµ apparent et la biomasse continuent d’augmenter au-delà de pH 4,8 ; il auraitdonc fallu élargir le domaine d’étude du présent travail ce qui n’avait plus d’intérêtdans le domaine des boissons fermentées.

Le taux d’inoculation a été considéré comme un facteur du plan pour tenircompte de la variation des situations rencontrées dans l’industrie cidricole. Ilprésente un effet significatif pour les deux souches étudiées. Pour Oenococcusoeni, ce facteur agit négativement sur le µ apparent, tandis que pour Lactobacil-lus plantarum, il influence essentiellement la production de la biomasse en l’aug-mentant. L’effet significatif du taux d’inoculation sur la croissance deOenococcus oeni est difficile à interpréter sur le plan physiologique du fait que leparamètre µ apparent est influencé à la fois par la vitesse spécifique de crois-sance et par le temps de latence : la présence d’un temps de latence diminueraitdavantage le µ apparent dans le cas d’un fort ensemencement. Inversement, lasous-estimation sera d’autant plus forte que le taux d’inoculation sera élevé.L’augmentation de biomasse pour Lactobacillus plantarum, peut être expliquée


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par l’apport d’un facteur nutritionnel résultant de l’inoculation initiale sous formede lyophilisat ou par la présence d’une substance permettant sa survie.

L’effet de la concentration en composés phénoliques est très variable selonle composé considéré. Dans les diverses expérimentations, l’acide quiniquen’exerce aucun effet sur la croissance de Oenococcus oeni et de Lactobacillusplantarum. STEAD (1994) a cependant mis en évidence un effet stimulant del’acide quinique sur la croissance de deux espèces de Lactobacillus (Lactobacil-lus collinoides et Lactobacillus brevis). En accord avec d’autres auteurs (WHITINGet CARR, 1957 ; WHITING, 1975), STEAD explique cette stimulation par la capacitédes bactéries étudiées à réduire, dans des conditions anaérobies, l’acide qui-nique qui est un puissant accepteur d’hydrogène, en acide dihydroshiquimiquequi lui-même joue un rôle dans le métabolisme énergétique de bactéries (apportd’énergie). Ces derniers auteurs signalent que cette réduction se déroule aprèsla transformation malolactique. À ce stade il n’y a pratiquement plus de sucre, dumoins dans le travail des auteurs (WHITING et CARR, 1957 ; WHITING, 1975) qui ontutilisé des cidres anglais i.e. ayant subi une fermentation alcoolique totale. Enrevanche dans notre travail, le milieu employé (FT80) contient 8,5 g·L–1 dumélange glucose / fructose, ce qui peut expliquer en partie que nous ayonsobtenu des résultats contradictoires. Cet effet stimulant de l’acide quinique n’apas été confirmé chez les levures et les moisissures (KALLIO et al., 1985).

En ce qui concerne les esters quiniques, pour Lactobacillus plantarum, l’effetdes deux esters est pratiquement négligeable. Tandis que pour Oenococcusoeni l’ester quinique de l’acide caféique (acide 5’-caféoyl-quinique) a un effetquadratique significatif. Les concentrations intermédiaires augmenteraient légè-rement la production de la biomasse. Ces esters ont été peu étudiés, seulSTEAD (1994) a examiné l’effet de l’ester quinique de l’acide caféique (acide 5’-caféoyl-quinique) sur la croissance bactérienne. Ses résultats sont égalementen contradiction avec ceux obtenus dans le présent travail car l’auteur a montréque cet ester stimulait la croissance de Lactobacillus collinoides et de Lactoba-cillus brevis. Il explique cette action par le fait que certains lactobacilles peu-vent, au moyen d’une hydroxy cinnamoyl quinate estérase (HCQE), hydrolyserl’ester en acides quinique et caféique. Ceci nous ramène à l’effet positif del’acide quinique décrit par ce même auteur.

Comme nous l’avons vu précédemment, les effets des formes estérifiéesdes AHC sont faibles ou nuls dans notre travail. Cependant, dans le vin ou dansle cidre, ces esters peuvent être été hydrolysés par l’enzyme HCQE apportéesoit par certaines moisissures, soit par emploi de préparations commercialesd’enzymes de clarification, de liquéfaction, d’extraction de la couleur qui sontéventuellement riches en HCQE (BARBE, 1995). C’est pour cette raison que nousavons examiné l’effet des mélanges équimolaires acide caféique / acide qui-nique et acide p-coumarique / acide quinique qui résulteraient d’une tellehydrolyse. Ceux-ci donnent des résultats comparables à ceux des AHC librescorrespondants. Compte tenu de l’absence de l’effet de l’acide quinique sur lacroissance des deux bactéries, nous limiterons la discussion à la seule fractionacide hydroxycinnamique du mélange.

Les acides hydroxycinnamiques libres c’est-à-dire l’acide caféique et surtoutl’acide férulique et l’acide p-coumarique ont un effet négatif très significatif sur lacroissance des deux bactéries étudiées. L’augmentation de la concentration deces trois acides entraîne la diminution du µ apparent des deux bactéries. En


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outre, elle diminue nettement la biomasse formée par Oenococcus oeni alors quecelle de Lactobacillus plantarum est peu ou pas affectée. Ces résultats concor-dent avec ceux de STEAD (1993) qui, examinant l’effet de ces AHC libres sur Lac-tobacillus collinoides et Lactobacillus brevis, constate que l’inhibition de lacroissance exercée par l’acide férulique et l’acide p-coumarique est supérieure àcelle due à l’acide caféique. Des résultats similaires ont été obtenus par CAVIN etal. (1993) lors de l’étude de l’action de l’acide férulique et de l’acide p-coumariquesur quatre espèces de bactéries lactiques : Lactobacillus plantarum, Lactobacillusbrevis, Pediococcus pentosaceus et Oenococcus oeni. Ces auteurs ont constaté,que l’acide férulique était plus inhibiteur que l’acide p-coumarique.

Nos observations concernant l’activité inhibitrice des composés phénoliquesconfirment les travaux antérieurs. AALTO et al. (1953), BARANOWSKI et al. (1980),HERALD et DAVIDSON, (1983) et STEAD, (1993) s’accordent sur le fait que l’actioninhibitrice des AHC libres sur la croissance des bactéries lactiques serait inver-sement liée à la polarité de ces acides. L’acide férulique (le moins polaire) estplus inhibiteur que l’acide p-coumarique lui-même plus inhibiteur que l’acidecaféique (le plus polaire). RAMOS-NINO et al. (1996) confirment cette explicationen précisant que l’activité anti-microbienne des AHC dépend de leur capacité àse dissoudre dans la membrane cellulaire. La perturbation qui en résulte seraitdue à la partie lipophile de la molécule. Ces auteurs proposent même un modèlede prédiction de la capacité inhibitrice des composés phénoliques qui tientcompte à la fois du caractère polaire et du pKa. Cependant ce modèle est limitéà des milieux pauvres en lipides et en protéines. Plus récemment BRUL et COOTE(1999), lors d’une étude bibliographique signalent le même effet. Selon CHAMBELet al. (1999), la vitesse spécifique de croissance de Saccharomyces cerevisiaeest réduite d’environ 50 %, par rapport au témoin en présence de dérivés del’acide cinnamique (20-35 mg·L–1). En réponse à ce stress l’adaptation de lalevure se traduit par une augmentation de l’activité H+ -ATPase de la membrane.

La différence de comportement entre Oenococcus oeni et Lactobacillusplantarum a également été signalée par CAVIN et al. (1993). Selon ces auteurs,pour Lactobacillus plantarum, les AHC notamment, l’acide férulique, provoque-raient surtout l’augmentation du temps de latence lorsque l’inoculum a été pro-pagé en absence du substrat. Dans tous les cas le niveau final de biomasse estidentique au témoin. Au contraire Oenococcus oeni cultivé dans les mêmesconditions est réellement inhibé (biomasse deux ou trois fois inférieure autémoin). Les auteurs indiquent également une adaptation des souches en corré-lation avec l’apparition d’une activité hydroxycinamate décarboxylase induc-tible. Pour d’autres auteurs GOODEY et TUBB (1982), HOPE (1987), cette activitédécarboxylase constituerait un mécanisme de détoxification expliquant la résis-tance des levures sauvages de brasserie. Cependant cette hypothèse a étérécemment contredite par les travaux de HAMMOND et al., (1999) qui ont montréque dans le cas de l’acide férulique, c’est le vinyl guaïacol produit par décar-boxylation enzymatique qui exerce l’activité antimicrobienne et non l’acidehydroxycinnamique lui-même.

Le pH a été retenu comme facteur du plan pour vérifier l’existence éventuelled’une interaction pH / composés phénoliques. Ce choix a été motivé par les tra-vaux de HERALD et DAVIDSON (1983) qui avaient observé que la baisse du pH de7 à 5 accentuerait l’efficacité inhibitrice des AHC sur la croissance de Staphylo-coccus aureus et d’Escherichia coli lorsque les AHC augmentaient. Selon eux,l’explication était la suivante : puisque le pKa des AHC est d’environ 4,5 (ONG et


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NAGEL, 1978), à faible pH les AHC se trouvent majoritairement non dissociés,forme qui, selon EKLUND (1989), présente une forte activité antimicrobienne.

Dans le présent travail nous avons mis en évidence quelques interactionspH/concentration en composés phénoliques (OMP, PMP et PMC) mais lesconclusions sont inverses : aux bas pH, l’effet des composés phénoliques estplus faible. Cette contradiction peut s’expliquer par deux remarques : toutd’abord la zone de pH examinée (de 3,3 à 4,8) est très éloignée de celle étudiéepar ces auteurs ; de plus, aux pH les plus bas, l’inhibition de la croissance estsuffisamment importante pour cacher l’effet inhibiteur d’un autre facteur.

5 - CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Le travail réalisé montre que, seuls, les acides hydroxy-cinnamique libresprésentent une action inhibitrice sur la croissance des souches de Oenococcusoeni et de Lactobacillus plantarum testées ; cet effet dépend de l’hydrophobi-cité et de la concentration des AHC expérimentés. En présence d’AHC libres,ces deux espèces réagissent de manière différente : Oenococcus oeni subittoujours une diminution du µ apparent et de la biomasse maximale atteinte.Pour Lactobacillus plantarum le µ apparent est également toujours affecté, tan-dis que la biomasse produite est peu modifiée.

Ces résultats pourraient expliquer l’inhibition du développement plus oumoins rapide d’une population lactique observée dans les moûts et les cidresde variétés de pommes à cidre en fonction de la richesse en composés phéno-liques.

Cependant, pour que le milieu fermentaire devienne hostile aux bactéries ilfaut que les esters quiniques contenus dans les fruits sains, acides caféoylqui-nique et p-coumaroylquinique, soient dé-estérifiés en leurs AHC libres corres-pondants. Cette réaction est catalysée par des enzymes d’origine végétale oumicrobienne, les hydroxycinnamoyl estérases. Dans le domaine cidricole, cettetransformation a été peu étudiée, mais l’utilisation courante d’enzyme de clarifi-cation et la présence de moisissures dans la matière première laisse penser quecette hydrolyse peut avoir lieu. Il serait donc intéressant de vérifier l’apparitionéventuelle des AHC libres dans le milieu fermentaire et de les quantifier pourdéterminer dans quelle mesure les concentrations atteintes pourraient provo-quer une inhibition de la croissance de la population lactique.

REMERCIEMENTS

Les auteurs remercient le Comité des fruits à cidre pour son aide financière,Monsieur GUYOT, Madame MARNET (Station de recherches cidricoles, Inra) etMonsieur THIBAULT J.-N. (Station de recherches porcines, Inra) pour leur assis-tance lors de l’isolement, la purification et la confirmation de la structure de


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l’acide p-coumaroyl quinique, ainsi que Monsieur DESCHAMPS M. (Stationd’amélioration des plantes, Inra) pour le prêt d’un lecteur de plaque de microti-tration. Enfin ils remercient Madame MAI NYGAARD (CHR HANSEN, Danemark)pour la fourniture de levains lactiques.

Reçu le 10 septembre 1999, révisé le 13 juin 2000, accepté le 17 juillet 2000.

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