Embed Size (px)
Citation preview
Research Collection
Doctoral Thesis
Die Reinheitsprüfung offizineller Alkaloide mit Hilfe derPapierchromatographie
Author(s): Schumacher, Herbert
Publication Date: 1958
Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000091727
Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For moreinformation please consult the Terms of use.
ETH Library
Prom. Nr. 2690
Die Reinheitsprüfung offizineller
Alkaloide mit Hilfe der
Papierchromatographie
VON DER
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN
HOCHSCHULE IN ZÜRICH
ZUR ERLANGUNG
DER WÜRDE EINES DOKTORS DER
NATURWISSENSCHAFTEN
GENEHMIGTE
PROMOTIONSARBEIT
VORGELEGT VON
Herbert Schumacher
dipl. Apothekervon Entlebuch (Lu)
Referent : Herr Prof. Dr. J. Büchi
Korreferent : Herr Prof. Dr. H. Flück
Zürich 1958
Offsetdruck : Schmidberger & Müller
Meinen lieben Eltern
in Dankbarkeit gewidmet
Die vorliegende Arbeit wurde an der chemischen Abteilung des
Pharmazeutischen Institutes der ETH in Zürich auf Anregung und
unter Leitung von
Herrn Prof. Dr J. Buchi
ausgeführt. Meinem hochverehrten Lehrer mochte ich für seine
vielseitigen Anregungen und sein stetes Interesse herzlich dan¬
ken.
Ebenfalls herzlich danken mochte ich Herrn Rudolf Schwegler,
Verwalter am Pharmazeutischen Institut der ETH, für seine mir
erwiesene grosse Gute und stete Hilfsbereitschaft.
INHALTSÜBERSICHTSeite
A. Einleitung 1
B. Allgemeiner Teil 3
I. Die Reinheitsprüfung der offizineilen Alkaloide nach
den Vorschriften der Ph.Helv.V 3
Schwefelsäureprobe, Schmelzpunktsbestimmung,Optische Drehung, Titrimetrische Gehaltsbestimmung,Speziaireaktionen
II. Bisherige Untersuchungen zur Trennung und Reinheits-
prüfung von Alkaloiden mit Hilfe der Papierchromatographie 11
III. Die Methodik der Papierchromatographie 12
1. Chromatographiertechniken 14
2. Chromatographiergeräte 15
3. Chromatographierpapiere 16
4. Organische Lösungsmittel 18
5. Chemische Methoden zum Entwickeln der Chromatogramme 19
6. Optische Methode zur Sichtbarmachung der Alkaloide 21
C. Spezieller Teil 24
I. Arbeitsplan 24
II. Eigenschaften und Reinheit der untersuchten Alkaloide 25
III. Abklärung einiger Versuchsbedingungen der Papier¬
chromatographie 46
1. Papiersorte 46
2. Klimatisierungszeit 47
3. Phasenverhältnis 50
4. Einfluss der Laufgesehwindigkeit und der Laufstrecke 51
5. Einfluss der Substanzmengen auf den Rf -Wert 53
6. Abhängigkeit von der Temperatur 54
7. Abhängigkeit des Rf-Wertes von der Reaktion 55
IV. Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennungder Alkaloide 56
A. Verwendung des organischen Lösungsmittels als
mobile Phase 57
Chromatographierverfahren A 57
Chromatographierverfahren B 58
Chromatographierverfahren C 59
Seite
V. Papierchromatographische ReinheitsprUfung der natürlichen
Alkaloidgruppen 60
1. Solanaceen-Alkaloide 60
a) Bisherige Untersuchungen 60
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung 63
c) Papierchromatographische ReinheitsprUfung 66
2.Coca-Alkaloide
a) Bisherige Untersuchungen 71
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung 73
c) Papierchromatographische ReinheitsprUfung 76
3. Opium-Alkaloide 78
a) Bisherige Untersuchungen 78
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung 82
c) Papierchromatographische Reinheitsprüfung 85
4. Hydras tis-Alkaloide 89
a) Bisherige Untersuchungen 89
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung 90
c) Papierchromatographische ReinheitsprUfung 93
5. Ipecacuanha-Alkaloide 95
a) Bisherige Untersuchungen 95
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung 96
c) Papierchromatographische ReinheitsprUfung 98
6. Strychnos-Alkaloide 100
a) Bisherige Untersuchungen 100
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung 102
c) Papierchromatographische ReinheitsprUfung 104
7. China-Alkaloide 106
a) Bisherige Untersuchungen 106
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung 110
c) Papierchromatographische ReinheitsprUfung 112
8. Mutte rkorn-Alkaloide 114
a) Bisherige Untersuchungen 114
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung 117
c) Papierchromatographische ReinheitsprUfung 118
Zusammenstellung der Rf - und pKfj-Werte 120
Seite
VI. Quantitative Alkaloidbestimmung mit Hilfe der Papier¬
chromatographie 123
a) Literaturbearbeitung 123
b) Kritische Beurteilung der Methoden 131
c) Zusammenstellung der die Gehaltsbestimmung beein¬
flussenden Faktoren 131
1. Genauigkeit beim Auftragen der Substanz 131
2. Grösse der aufgetragenen Startflecken 132
3. Bildung konstanter Endflecken-Grossen 134
4. Chromatographierbedingungen 138
d) Aufstellung der Anforderungen für die quantitative Methodik 141
e) Vorschlag einer Methode für die quantitative Bestimmung der
Alkaloide mit Hilfe der Papierchromatographie 141
1. Auftragen der Alkaloide auf die Startlinie 141
2. Auswertung des Alkaloidgehaltes 142
D. Zusammenfassung 145
- 1 -
A. Einleitung
Eine der originellsten Ideen der neueren Zeit auf dem Gebiete der chemi¬
schen Analyse war die Verwendung von Filterpapier zur Verteilungschromato¬
graphie (l). Die papierchromatographische Methode (2) bietet auf Grund des ho¬
hen Trenneffektes, der zur Analyse benötigten geringen Substanzmengen, ihres
geringen apparativen Aufwandes und durch ihre Einfachheit und Raschheit der
Durchfuhrung neue Aspekte auch für die pharmazeutisch-chemische Analyse.
Sie macht jedoch die klassischen Verfahren der Mikroanalyse keineswegs über¬
flüssig.
Ihre grosse Bedeutung liegt in der qualitativen Anwendung, wahrend sie in¬
folge der relativ grossen Fehlerbreite als semiquantitatives Verfahren bezeich¬
net werden muss. Es hat aber nicht an Versuchen gefehlt, die Papierchromato¬
graphie zu einer quantitativen Methode zu entwickeln.
Die vorliegende Arbeit stellte sich zur Aufgabe, die Anwendungsmöglichkei¬
ten der Papierchromatographie für die Arzneimittelprüfung von offizineilen Alka-
loidbasen und -salzen zu untersuchen. Diese Arzneistoffe werden heute ohne Aus¬
nahme durch Isolierung aus pflanzlichen Materialien gewonnen. Die dabei benutzten
1. R. Consden, A.H. Cordon und A. P. Martin, Biochem.J.38,224 (1944)
2. R. Consden, Nature 162, 359 (1948)A.H. Cordon, Angew.Chem. ja, 367 (1949)H. H. Strain, Analyt.Chem. Washington ZU, 75 (1949)F. Cramer, Papierchromatographie, Verlag Chemie, 3.Aufl., Weinheim (1954)R.J. Block, E.L Durrum und G Zweig, A manual of Paper Chro¬
matography and Paper Electrophoresis, Academic Press Inc. N.Y. (1955)R.C. Brinley und F . C Barett, Practical Chromatography, Chapmanand Hall, London (1954)
E. und M. Lederer, Chromatography, Elsevier Publishing, Amsterdam (1954)H. Hellmann, Papierchromatographie, in moderne Methoden der Pflanzen¬
analyse, Bd. I, Springer (1955)Firma Schleicher und Schull, Feldmeilen, Fapierchromatographische
Arbeitsmethoden
Firma E. Merck, Säulenchromatographie, PapierchromatographieA.J.P. Martin, A.rev.Biochem. 19, 517 (1950)H. Brauniger, Pharmazie 8, 909~Tl953)L. Rut ter, Nature 161, 435"Tl948)Alvarez de la Vega, Galemca Acta 5, 45 (1952)
- 2 -
Extraktions-, Ausschüttelungs-, Fällungs- und Salzbildungsverfahren liefern
sogenannte "Reinsubstanzen", die mit verschiedenen Nebenalkaloiden mehr
oder weniger stark verunreinigt sind. Es war nun zu Überprüfen, ob das sehr
leistungsfähige Trennungsverfahren der Papierchromatographie die Abtrennung
und qualitative Bestimmung der verunreinigenden Nebenalkaloide gestattet und
zur Verbesserung der Prufungsvorschnften der Ph.Helv.V ausgewertet werden
kann.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit dieser Methode ergibt sich bei der
IdenütatsprUfung von alkaloidhalugen, offizmellen Arzneidrogenpraparaten und
Arzneizubereitungen. Hier vermag die Papierchromatographie hauptsächlich
dann viel zu leisten, wenn die herkömmlichen Ausschüttelungs verfahren und
die Identitatsreaküonen und Reinheitsprllfungen versagen
3-
B Allgemeiner Teil
I. Die Reinheitsprüfung der offizinellen Alkaloide nach den Vorschriften der
Ph.Helv.V
Die Pharmakopoe schreibt, soweit dabei Nebenalkaloide und Fremdalka-
loide erfasst werden, die folgenden Reinheitsprüfungen vor:
1. Die Schwefels iure- Probe : Diese Prüfung dient in erster Linie zum
Nachweis von Verunreinigungen wie Staub
und anderen, mit konzentrierter Schwefelsaure verkohlenden Stoffen. Zur Un¬
tersuchung von Alkaloidsalzen kommt der Probe aber eine weitere Bedeutung
zu, da sich ein Teil der Alkaloide in reinem Zustand farblos in der Schwefel¬
säure lösen, während andere Alkaloide charakteristische Färbungen ergeben.
Dies gestattet, die Lösung in Schwefelsaure sowohl als Identitats- wie auch ins¬
besondere als ReinheitsprUfung zu verwenden.
Farblos, oder mit höchstens schwacher Gelbfärbung müssen sich losen:
Atropinsulfat
Chinin und seine Salze
Cocain und seine Salze
Emetinhydrochlond
Hyoscyaminsulfat
Kodein und seine Salze
Mo rphinhydrochlorid
Skopolaminhydrochlond
Stry_hmnnitrat
Eine charakteristische Färbung zeigen:
Bruzinhydrochlond rot
Ergonovintartrat gelb (braun)
Narceinhydrochlorid gelb-braun
Narcotinhydrochlond gelb
Papaverinhydrochlond violett
Thebainhydrochlorid braunrot
- 4 -
Diese Färbungen gestatten, die oben angeführten Alkaloide als Verunreinigungen
neben Alkaloiden nachzuweisen, welche mit konzentrierter Schwefelsaure an sich
keine Färbungen geben Die Empfindlichkeit dieser Proben ist noch nicht näher
überprüft worden; diese dürften erst dann einen praktischen Wert haben, wenn die
Pharmakopoe die auftretenden Verfärbungen mit Farbvergleichslösungen genau er¬
fassen las st.
2 Schmelzpunkt-Bestimmung: Trotzdem der Schmelzpunkt im allgemei¬
nen ein vorzügliches Reinheitskriterium
für eine organische Substanz ist, vermag er bei der Reinheitsprüfung der Alkaloid-
salze relativ wenig zu leisten. Dies beruht darauf, dass zahlreiche Alkaloide und
ihre Salze sich beim Erhitzen zersetzen und keinen eindeutigen Schmelzpunkt zei¬
gen. Ferner sind die Schmelzpunkte der absolut reinen Alkaloide noch nicht eindeu¬
tig ermittelt worden, sodass die Ansetzung von Maximalgrenzen noch nicht mög¬
lich war. Endlich sind wir über den Umfang der Schmelzpunktsdepression durch
die als Verunreinigung vorkommenden Nebenalkaloide noch zu wenig orientiert,
als dass auf die Menge der verunreinigenden Substanz geschlossen werden könnte.
Die von der Ph.Helv.V zugelassenen Schmelzpunktsintervalle sind denn bei den Al-
kaloidsalzen durchwegs gross.
3 Optische Drehung: Die Bestimmung des Drehungsvermögens ist bei den
Alkaloiden, von denen zahlreiche optisch aktiv sind,
ein sehr wertvolles Hilfsmittel zur Beurteilung der Reinheit. Besonders leistungs¬
fähig ist sie, wenn es sich darum handelt, eine optisch aktive Substanz neben einer
inaktiven oder einer entgegengesetzt drehenden nachzuweisen oder zu bestimmen.
Unter diesen Bedingungen gelingt es mit einer leistungsfähigen Apparatur, wenige
Prozent einer Verunreinigung zu erfassen (siehe Tabelle l).
4 Titrimetrische Gehalts be s timmung: Die Ph.Helv V bedient sich
der alkalimetrisehen Bestim¬
mung der Alkaloidbase oder der azidimetrischen Bestimmung der Sàurekomponente
des Alkaloidsalzes. Da dabei auch die verunreinigenden Nebenalkaloide miterfasst
werden, sagen diese Bestimmungsverfahren in der Regel nichts aus über die Art und
Menge dieser Verunreinigungen
- 5 -
5. Speziaireaktionen: In der Tabelle 1 finden sich die von der Pharma¬
kopoe vorgeschriebenen speziellen Nachweisver¬
fahren für Nebenalkaloide und Fremdalkaloide zusammengestellt. Sie lässt er¬
kennen, das s auf einzelne Âlkaloide und Alkaloidgruppen geprüft werden muss.
Die in der letzten Kolonne aufgeführte Empfindlichkeit der Reaktionen ist von
Liem (l), Bürgi (2) und Butz (3) bestimmt worden. Es wird sich im Ver¬
laufe unserer Untersuchungen darum hmdeln, die Leistungsfähigkeit einer Vor¬
schrift mit derjenigen des papierchromatographischen Nachweises zu verglei¬
chen.
1. Han T. Liem, Ueber die Reinheitsprüfung offizineller Alkaloide,
Dissertation Nr. 586 ETH Zürich (1929)
2. E. Bürgi, Ueber die Reinheitsprüfung offizineller Alkaloide und Purin-
basen, Dissertation Nr. 592 Zürich (1930)
3. P.W. Butz, Ueber die Prüfung und Gehaltsbestimmung einiger stickstoff¬
haltiger Arzneistoffe, Dissertation Nr. 1162 ETH Zürich
(1942)
Morphin
0,15%
ca
Brucin
%0,1
ca
Homatropin
%1
ca
i-Scopolamin
%Hyoscyamin
%
Atropin
%Apoatropm
%
ca
ca
Salpetersaure
konz
mit
Färbung
Salpetersaure
konz
mit
Färbung
Brombromkalium-Fallung
Drehung
optische
Brombromkalium-Fallung
-Fallung
Brombromkalium
Drehung
optische
anganat-R
im
pe
Kalium
Morphin
%0,
1ca.
Brucin
%0,1
ca
Apoatropm
%
Atropin
%2
ca
4
Apoatropm
%10
Salpetersaure
Konz
mit
Färbung
Salpetersaure
konz
mit
Färbung
(unl
ösli
ch)
Ammoniak
mit
Base
der
Fallung
Drehung
optische
(unlöslich)
AmmoruaJc
mit
Base
der
Fallung
Morphin
%0,1
ca
Brucin
%0,1
ca
Scopolamin
%4,0
ca
Apoatropm
f02
ca
Hyoscyamin
/o
1,8
ca
Apoatropm
%10
Salpetersäure
icon?
mit
Färbung
Salpetersaure
konz
mit
Färbung
Diehung
optische
Drehung
optische
(unl
ösli
ch)
Ammoniak
mit
Base
dei
Fallung
(unl
ösli
ch)
Ammoniak
mit
Base
dei
Fallung
prüfung
Reinheits
dei
Empfindlichkeit
Reinlieitsprüfung
Vorgeschlichene
Freirdalkaloide
und
Morphin
Brucin
Homatropir
l-Scopolamin
Hyoscyamin
Atropin
hydrobromicum
Scopolaminum
Apoatropm
Scopolamin
Morphin
Brucin
Belladomn
sulfuricum
Hyoscyammum
Apoatropm
Hyoscyamin
Morphin
Brucm
Scopolamin
Hyoscyamin
Belladomn
sulfuricum
Atropinum
tropin
Apoa
Atropin
ist
prüfen
zu
die
auf
Verunreinigungen
Alkaloid
Nebenalkal
auf
Prüfungen
sReinheit!
Offizinelle
iTabelle
Morphin
%0,1
ca
Brucin
%0,1
ca
Nebenalkaloide
%1
ca.
Cinchonidin
%1,5
ca
Chinin
%1,5
ca.
Morphin
%0,1
ca
Brucin
%0,1
ca
-j
Cinchonidin
%2,5
ca.
,Chinidin
%1
ca.
Morphin
%0,5
ca.
Brucin
%0,3
ca.
Zinnamylcocain
%0,1
ca
Tropacocain
%0,1
ca.
Isatropylcocain
%4
ca.
Salpetersaure
konz.
mit
Färbung
Salpetersaure
konz.
mit
Färbung
Drehung
optische
Jodkalium-Fallung
ung
Fall
-Jodkalium
Salpetersaure
konz.
mit
Färbung
Salpetersaure
konz.
mit
Färbung
Drehung
optische
Kaliumchromat
mit
Fallung
Kaliumchromat
mit
Fallung
Salpetersaure
konz.
mit
Färbung
Salpetersäure
iconz
mit
Färbung
(Oxydierbarkeit)
pennanganat-R.
Kalium
(Oxydierbarkeit)
permanganat-R.
Kalium
h)(u
nlos
lic
Ammoniak
mit
Base
der
Fallung
Reinlieitsprüfungder
Empfindlichkeit
ReinheitsprUfung
Vorgeschriebene
Morphin
Brucin
(lin
ksdr
ehen
de)
Nebenalkaloide
Cinchonidin
Chinin
Morphin
Brucin
(rechtsdrehende)
Nebenalkaloide
Cinchonidin
Chinidin
Morphin
Brucin
Zinnamylcocain
Tropacocain
Isatropylcocain
sulfuricum
Chinidinum
Chinidin
tanmcum
"
sulfuricum
"
hydrochloncum
"
ricum
hlo-
dihydroc
"Chimnum
Ciunin
um
nitric
Cocainum
um
chloric
hydro¬
Cocainum
um
basic
Cocainum
Cocain
ist
prüfen
zu
die
auf
Verunreinigungen
Alkaloid
Thebain
0,5%
ca.
Narcein
%0,5
ca.
Morphin
%0,25
ca.
gelb
-Schwefelsàureprobe
gelb
-Schwefelsäureprobe
Niederschlag
blauer
oder
Färbung
blaue
oder
blaugrUne
Keine
-Berlinerblau-Reaktion
Papaverin
%1
ca.
Narcotin
%1
ca
Morphin
0,25%
ca.
Trübung
-Natnumacetat
Färbung
blaue
oder
blaugrune
Keine
-Berlmerblau-Reaktion
ODi
Thebain
%0,5
ca.
Narcein
%0,5
ca
Narcotin
%0,5
ca.
Morphin
%0,1
ca.
Morphin
0,25%
ca
farblos
-Schwefelsàureprobe
gelblich
schwach
höchstens
klar,
-Benzol
in
Loslichkeit
Blaufärbung
oder
Grün-
Keine
-Berhnerblau-Reaktion
Thebain
0,05%
ca.
Papaverin
%0,013
Narcein
0,05%
Narcotin
%0,2
Codein
%0,2
Apomorphin
%0,1
gelb-braun
schwach
höchstens
-Schwefelsàureprobe
Trübung
Keine
-Mayers-Reag.
gelb-braun
schwach
höchstens
-Schwefelsàureprobe
Trübung
Keine
-Mayers-Reag.
Trübung
Keine
-
Mayers-Reag.
Rosafarbg.
Keine
-Fernzyankalium
ReinheitsprUfungder
Empfindlichkeit
ReinheitsprUfung
Vorgeschriebene
Thebain
Narcein
Morphin
Narcotin
apaverin
INarcotin
chloricum
hydro¬
Thebainum
Morphin
Thebain
.
Thebain
Narcein
Narcotin
phoricum
phos¬
Codeinum
chloricumhydro¬
Codeinum
Codeinum
hydrochloricum
Narcotinum
Morphin
Codein
Thebain
apaverin
INarcein
Narcotin
Codein
Apomorphin
chloricum
hydro-
Morphinum
Morphin
ist
prüfen
zu
die
auf
Verunreinigungen
Alkaloid
Codein
%1
ca.
Cephalein
0,05%
ca.
Färbung
blaue
keine
-Probe
Femchlond-Schwefelsäure-
violett
nicht
-aureprobe
sel
chwef
Molybdäns
tin
sHydra
%5
ca.
tin
sHydra
%2
ca.
Berberin
%1
ca.
Thebain
%0,5
ca.
Narcein
%0,5
ca.
Narcotin
%0,5
ca.
Morphin
0,25%
ca.
Cryptopin
%0,2
a.
Codein
%1
ca
änderung
Ver¬
Keine
-Ammoniakprobe
RAmmoniak
in
löslich
Niederschlag,
-Bromwasser
farblos
-Schwefelsàureprobe
farblos
-Schwefelsäureprobe
farblos
-Schwefelsàureprobe
Niederschlag
blauer
noch
Färbung,
blaue
oder
grüne
tief-
Keine
-Berlinerblauprobe
farblos
-Schwefelsàureprobe
Fernchlorid-Probe
Papaverin
%0,013
ca.
Narcotin
%0,2
ca.
Morphin
0,25%
ca.
Codein
0,2%
ca.
Trübung
Kerne
-Mayers-Reagens
Trübung
Keine
-Mayers-Reagens
Niederschlag
blauer
noch
Färbung,
blaue
oder
blaugrüne
Keine
-Berlinerblau-Reaktion
Rosafärbung
Keine
-Nitroprussid-Natrium-Probe
Trübung
Keine
-Mayers-Reagens
Reinheitsprüfungder
Empfindlichkeit
ReinheitsprUfung
Vorgeschriebene
Codein
Cephalein
an
sHydra
Berberin
Thebain
Narcein
Narkotin
Morphin
Cryptopin
Codein
Papaverin
Narcotin
Morphin
Methylnarcein
Codein
ist
prüfen
zu
die
auf
Verunreinigungen
chloricumhydro¬
Emetinum
Emetin
chloratum
Hydrastimnum
Hydrastmui
hydrochloricum
Fapaverinum
Papaverin
chloricum
hydro¬
Narceinum
Narcein
Alkaloid
an.
gleich
Mutterkomalkaloide
alle
auf
Ehrlich-Reagens,
wie
Spricht,
*
Ergotoxin
und
Ergotamin
%3
ca.
*Farbe
violette
bis
blaue
-Phosphorsäureprobe
Ferrichlorid-,
Essigsäure-,
Trübung
Keine
-Ammoniak
mit
Base
der
Fällung
Drehung
optische
Alkaloide
fremde
tartaricum
vinum
Ergono
vin
Ergono
Brucin
%1
ca.
prUfung
Reinheits
der
Empfindlichkeit
Rosafärbung
Keine
-Schwefelsäureprobe
ReinheitsprUfung
Vorgeschriebene
Brucin
ist
prüfen
zu
die
auf
Verunreinigungen
nitricum
Strychninum
Strychnin
Alkaloid
- 11
II Bisherige Untersuchungen zur Trennung und Reinheitsprüfung von Alkaloiden
mit Hilfe der Papierchromatographie
Die ersten experimentellen papierchromatographischen Arbeiten mit Al¬
kaloiden erschienen von M um er und Macheboeuf (l) . Sie klarten ab,
unter welchen Bedingungen zufriedenstellende Trennungen zu erhalten sind und
teilen die Alkaloide auf Grund ihrer Dissoziationskonstanten in vier Gruppenein Schute (2) behandelte die theoretischen Grundlagen der Alkaloid-Pa-
pierchromatographie. Ueber allgemeine Erfahrungen beim papierchromatogra¬
phischen Arbeiten mit Alkaloiden berichteten Gore und Ad s head (3),Decker (4) studierte die Eignung der Lösungsmittel; Brindle, Carles s
und Woodhead (5) befassten sich mit dem Einfluss der Pufferung auf die
Trennung Ausgehend von diesen Arbeiten nahm die Papierchromatographie in
der Alkaloidanalyse eine sturmische Entwicklung Als Höhepunkte dieser Ent¬
wicklung sind die Arbeiten von Karrer (6) über die Curarealkaloide, von
S t o 11 (7) über die Secalealkaloide und von Lussman (8) über die Chinaal-
kaloide zu bezeichnen
Die Papierchromatographie ist nach den überraschenden Erfolgen bei der
Trennung von Naturstoffen, bei Verwendung minimalster Substanzmengen wohl
zur analytischen Methode der Wahl auch in der Alkaloidanalyse geworden Ihre
Leistungsfähigkeit spiegelt sich in folgenden Anwendungsgebieten
a) Nachweis von Alkaloiden in Drogenmaterial, Extrakten und bei der
Isolierung
b) Identitätsprüfung von Reinalkaloiden
c) Reinheitsprüfung von Alkaloiden
d) Bestimmung von Zersetzungsprodukten der Alkaloide, die durch un-
sachgemässe Lagerung oder Verarbeitung entstanden sind
Während die pharmazeutisch-chemische Industrie schon heute häufig Ge¬
brauch macht von der papierchromatographischen Reinheitsprüfung ihrer Pro¬
dukte, sind in der Literatur erst wenige Angaben zu finden über ihre Verwendung
1 R Munier und M Macheboeuf, Bull.soc.Chim biol j31, 1144 (1949)R Munier und M Macheboeuf, id jh, 1198 ( 1949)R Munier und M. Macheboeuf, id 32,192,908(1950)R Munier urd M Macheboeuf, id j!3, 846, 1919 (1951)R. Munier, Bull soc.Chim biol. &5. 857 (1951)R Munier und M Macheboeuf, Bull soc Chim biol ^4,209(1952)R Munier, Bull.soc Chim France 852 (1952), 19
R Munier, Bull soc Chim )iol 35,1225(19537"
2. J.B Schute, Chem.Weekbl 49, 301 (1950)JB. Schute, Pharm.Weekbl 86,44,201 (1951)
3D Gore und I Adshead, J Pharm und Pharmacol, i, 803 (1952)4 F Decker, Pharmazie fi, 371 (1953)5 H Brindle, I E Carless und H B Woodhead, J Pharm, und
Pharmacol. 3, 799 (1951)6. P Karrer, Hr!v Chim Acta_33, 512 (1950)7 A. Stoll, A Ruegger, Helv.Chim Acta £7, 1725 (1954)8 D Lussman, E Kirch und G Webster, J.Amer.pharm.Ass.Sci.Ed
40, 368 (1951)
- 12
bei der Alkaloidprufung. Der Umstand, das s die handelsüblichen Chinaalkalo-
lde wegen der Schwierigkeit der quantitativen Auftrennung des aus der China¬
rinde gewonnenen Alkaloidgemisches oft kleine Mengen Nebenalkaloide ent¬
halten, gab Lussman, Kirch und Webster (1) Anlass, diese Alkaloid-
gruppe papierchromatographisch zu bearbeiten. Es gelang ihnen, mit wasser-
oder salzsàuregesàttigtem Cyclohexanol als mobile Phase eine gute Trennungvon Chinin, Chinidin, Cinchonin und Cmchomdin zu erhalten. Castille (2)berichtete über den papierchromatographischen Nachweis von Cinchona-Neben-
alkaloiden. Es gelang ihm, 1 % Chinidin, 3 % Hydrochinin, 1,5 % Cinchonin und
2,5 % Cmchomdin zu erfassen. Die papierchromatographische Trennung der
Secalealkaloide wurde durch S toll und Ru egger (3) vervollkommnet. Mit
Hilfe der sogenannten "echten VerteilungsChromatographie mit umgekehrtenFhasen" (Phthalsàure-dimethylester als stationäre und Wasser-Formamid-
Ameisensäure als mobile Phase) konnte die einwandfreie Trennung der Ergo¬tamin-, Ergobasin- und Ergotoxin-Gruppe erreicht werden. Da mit Hilfe der
Farbreaktion nach Van Urk mit Dimethylammobenzaldehyd weniger als lugAlkaloid nachgewiesen werden kann, eignet es sich sehr gut auch zur Reinheits-
prufung von Secale-Einzelalkaloiden. Werden z.B. 100 ug Reinalkaloid zur Chro¬
matographie gebracht, so lasst sich die Anwesenheit von 1 % Nebenalkaloid
einwandfrei erfassen. Dieses Verfahren gestattet ohne weiteres die Ueberwa-
chung der praparativen Auftrennung der Alkaloidgemische
Diese spärlichen grundlegenden Untersuchungen waren uns Veranlassung,eine systematische Ueberprüfung des Verhaltens der offizinellen Alkaloide
durchzufuhren.
III Die Methodik der Papierchromatographie
Als Chromatographie bezeichnet man heute allgemein ein Verfahren, bei
welchem eine Lösung zu trennender Stoffe eine unlösliche, feste, mehr oder
weniger fein verteilte Substanz in einer bestimmten Richtung durchfliesst,
gleichgültig durch welchen Mechanismus (Adsorption, Ionenaustausch oder Ver¬
teilung) die Wanderung der Stoffe selektiv verzögert und dabei aufgetrenntwird Strain (4) bezeichnet die Chromatographie als "die unterschiedlich
gerichtete Wanderung der zu trennenden Stoffe durch ein mehr-, meist zwei-
phasiges System unter Ausbildung reversibler Gleichgewichte".
Die Chromatographie ist somit zu den Verteüungsverfahren zu rechnen.
Als Verteilung bezeichnet man das Verteilen einer Substanz zwischen zwei
nicht unbegrenzt miteinander mischbaren, gegenseitig aber abgesattigten Lo¬
sungsmitteln. Als Mass der Verteilung gilt der Verteilungskoeffizient k Nach
dem Nernst'schen Verteilungsgesetz gibt er das Verhältnis der Konzentration
des Stoffes in den Volumeneinheiten beider Solvenuen wieder.
1. D. Lussman, E. Kirch und G. Webster, J.Amer pharm Ass.
Sei Ed 40, 368 (1951)2. P. Castille, Pharm Weekbl. 89, 1 (1954)3. A Stoll und A.Ruegger, Helv.Chim Acta 37, 1725 (1954)4. H H. Strain, Analyt Chem._21, 75 (1949)
- 13 -
Cl
c2
Diese Beziehung hat aber nur Gültigkeit, wenn
1. keine chemische Reaktion eintritt zwischen Substanz und Lösungsmittel,
2. Temperaturkonstanz herrscht,
3. die Substanz m beiden Phasen löslich ist und
4. die Losungsmittelphasen gegenseitig abgesattigt sind.
Die die Verteilung beherrschenden Kräfte sind in den von den Solvensmolekeln
ausgehenden van der Waal'schen Kräften, in Wasserstoffbindungen oder in ho¬
möopolaren Bindungskraften zu suchen.
Um eine der beiden Phasen stationär anzuordnen, benötigt man einen Tra¬
ger, im Falle der Papierchromatographie reines Linterspapier. In erster Linie
soll es nur die stationäre Losungsmittelphase binden, sich sonst aber indiffe¬
rent verhalten.
Der erhaltene Trenneffekt ist eine Resultante von einzelnen differenten
Wirkungen. Es sind dies:
1. die Verteilung der Substanz zwischen der reinen mobilen und der reinen
stationären Phase,
2. der Aussalzeffekt; die Hydratation der Zellulose und die Bildung von Polv-
saccharidsolen durch die stationäre wassnge Phase werden beeinflusst
durch die aussalzenden Effekte, ev verwendeter Pufferlosungen,
3. der Einfluss der Bindekrafte, wie sie von den Karboxyl- und Hydroxylgrup¬pen der Zellulose ausgeübt werden.
Bei der idealen Verteilung wirkt zur Hauptsache 1, bei der realen Verteilungdagegen auch 2 und 3.
Auch zur Durchführung der Papierchromatographie von
Alkaloiden sind sehr verschiedene Techniken, Apparate, Filtermateria-
lien und Losungsmittel in Vorschlag gebracht worden.
- 14 -
1. Chromatographietechniken
Apparative Anordnung
Flache Streifen auf Glasplatten
Einzelne Papierstreifen
Einzelne Papierstreifen und
Elektroden
Einzelne Papierbogen
Filterpapier bzw. Säulen-
material imprägniert mit Puf¬
fersubstanzen oder Salzen
Filtermaterial bzw. Säulen¬
material imprägniert mit
lipophilem Ueberzug
Papier imprägniert mit Adsor-
bentien
Papier imprägniert mit Ionen¬
austauschern
Filterpapier bzw. Säulenmate¬
rial mit chemisch reaktivem
Material
Paket aus Filterpapieren
Säule aus Rundfiltern
Verfahren
Chromatostripverfahren (1)Streifenchromatographie"Oberflächenchromatographie"
Eindimensionale Papierchromatogra¬
phie, auf- oder absteigend (2)
Papierchromatographie, Ionophorese,
Elektrochromatographie (3)
ein- oder mehrdimensionale Papier¬
chromatographie, auf- oder ab¬
steigend (4,5)
pH-gesteuerte auf- oder absteigende
Chromatographie bzw. Säulentechnik
(6,7,8)
Verteilungschromatographie mit ver¬
kehrten Phasen, Filterpapier- oder
Säulentechnik (9)
Adsorptions -Papierchromatographie(10)
Ionenaustausch-Chromatographie
(11)
Chemochromatographie(12)
Chromatopack-VerfahrenFilterpaket-Chromatographie (13)
Chromatopile Verfahren, Rundfilter¬
säulen-Chromatographie (14)
1. Kirchner, G.J. Keller undJ.M. Miller, Analyt.Chem. 23, 420 (1951)
J.E. Meinhard undN.F. Hall, Analyt.chem. 21, 185 (1949)2. J.K. Mietinen undA. Vietanen, Acta ehem.scand. 3, 459 (1949)3. M. Grossmann und M. Knedel, Dtsche med.Wschr. 76, 233 (1951)
R.E. Nocholas und C. Remington, Biochem.J. 48, 3Ü6 (1951)4. F. Cramer, Papierchromatographie, Verlag Chemie GmbH, Weinheim
5. ff siehe Seite 15 (1954), 3. Auflage
-15-
Allen Anordnungen ist das Arbeiten in Losungsmittelgesattigter Atmosphäre
gemeinsam.
Im Hinblick auf die Saulentrennung wurde in dieser Arbeit absteigend ge¬
arbeitet. Die aufsteigende Methode gab wohl kompaktere Flecken, aber niedri¬
gere Rf -Werte und bedeutend längeren Zeitverbrauch. Beim absteigenden Verfah¬
ren sickert das Losungsmittel kapillar in einem Papier herab. Die Laufgeschwindig¬keit ist nahezu konstant Die Methode eignet sich für Trennvorgange mit langer Lauf¬
zeit und für Substanzen mit sehr kleinen Rf-Wert-Unterschieden (Durchlaufchroma-togramme).
2. Die Chromatographiergerate
Folgende Gerate werden zu allen Verfahren benötigt:
1. Ein Behälter, der gasdicht zu verschhessen ist und nach Möglichkeit eine
Beobachtung des Trennvorganges durch die Glaswände gestattet. Er soll
gleichzeitig die Vorrichtung zur Befestigung des Papierbogens enthalten.
2. Eine Wanne, die das Lösungsmittel zur Durchführung des Trennvorgangesenthalt. Sie soll säurefest und bestandig gegen organische Losungsmittel sein.
3. Der Trager fur die stationäre Phase ist das Papier. An dieses werden beson¬
dere Anforderungen gestellt.
Für unsere Versuche verwendeten wir eine Apparatur aus Glas, die uns er¬
laubte, vier Bogen von 25 x 50 cm zu verwenden. Der Dampfraum der Apparaturkonnte leicht gesattigt werden. Die Reproduzierbarkeit der Resultate war gut.
5. R. Williams und A. Kirby, Science 107, 481 (1948)6. H. Brindle, J.E. Carless und H.B. Woodhead, J.Pharm. und
Pharmacol. 3_, 799 (1951)7. A. Bettschart, Diss. Nr. 2404 ETH Zurich (1954)8. D. Kraft, Pharmazie 8_, 251 (1953)9. J. Boldhing, Experienüa 4, 270 (1948)
Discuss. Faraday Soc. _7. 162 (1949)Th.H. Kritchevsky und A. Tiselius, Science 114, 209 (1951)
10. D. Kritchevsky und M. Calvin, Amer.Chem.Soc. 72, 4330 (1950)S. Datta und B. Overell, Bjochem.J. 44, 43 (1949)
11. T.R.E. Kressmann, Nature 165, 568 (Ï950)12. W. Lautsch, G. Manecke und W. Broser, Z.Naturforsch. 8b, 232 (1953)
R.J. Boscott, Nature 159, 342 (1947)M. Kotake, T. Sakan, N. Nakamura und S. Senoh,
J.Amer.Chem.Soc. 73, 2973 (1951)G.B. Bonino und V. Carasatti, Nature 167, 56~9 (1951)
13. W.L. Porter, Analyt.Chem. 23, 412 (1951)14. H.K. Mitchell und F.A. Haskins, Science 110, 278 (1949)
L. Rutter, Nature 161, 435 (1948)R.H. Mueller und D.L. Clegg, Analyt.Chem. _21, 1123 (1949)O. Westphal, Z.Naturforschg. 7b, 136 (1952)
-16-
3. Die Chromatographierpapiere
Die Auswahl der Papiere (1) richtet sich nach der zu benutzenden Technik,
dem Lösungsmittelgemisch, der beabsichtigten Frontlänge, der Trenndauer und
den zu trennenden Substanzen. Die Eignung der Linterspapiere wird durch fol¬
gende Eigenschaften bestimmt:
1. die anorganischen und organischen Fremdsubstanzen,
2. die Fasergleichheit und gleichmässige Textur,
3. den Feuchtigkeitsgehalt,4. die Fliessgeschwindigkeit der mobilen Phase,
5. die Adsorptionsaffinität,6. die Anzahl der Aldehyd- und Carbonylgruppen der Zellulose.
FUr die vorliegende Arbeit wurden Whatmanpapiere Nr. 1 verwendet (2). Bei der
Lagerung sind die Papiere glatt zu legen, besonders auch vor Labordämpfen zu
schützen. Sie dürfen nicht mit gepufferten, imprägnierten oder bereits entwickel¬
ten Chromatogrammen zusammen gelagert werden.
Vor Gebrauch werden die Papiere gewaschen. Verunreinigungen stören den
Chromatographieverlauf und machen die Lösungsmittelfront schwer- oder unbe¬
stimmbar. Als Waschmittel dienten uns destilliertes Wasser (3), Aether (4), eine
wässrig-alkoholische 8-Oxychinolinlösung oder eine Komplexonlösung. Da beim
Fabrikationsprozess der Papiere stark aufleuchtende blau bis blauviolett fluores¬
zierende Stellen entstehen können, die nicht auszuwaschen sind, müssen Papiere,welche man unter dem ultravioletten Licht betrachten will, zuvor auf die Abwe¬
senheit solcher Flecke überprüft werden.
Reines, mit stationärer Phase beladenes Linterspapier führt nicht immer
zum Trennerfolg. Um eine Trennung doch zu erreichen, wird das Papier in einer
Pufferlösung oder in organischen Lösungsmitteln getränkt (5).
1. J.N. Baiston und B.E. Talbot, A guide to Filter and Cellulose Powder
Chromatography, London (1952)2. Whatman-Papiere, Reeve Angel and Co.Ltd., London BC 5, Brindewall Plane
3. V. Wynn, Nature 164, 445 (1949)4. L. Hellner und H. Helmuth, Naturwiss. JU, 527 (1954)CS. Hanes und F.A. Isherwood, Nature 164, 1107 (1949)L. Novelle, Nature 166, 1000 (1950)A. Grüne, Arzneimittelforschung A_, 347 (1954)
5. F. Jaminet, J.Pharm.Belg. 6, 81 (1951)G. Vitte und E. Boussemart, Bull.trav.Soc.pharm.Bordeaux, 88,181 (1951)R. Munier, M. Macheboeuf und N. Cherrier, Bull.Soc.chim.biol.
34, 204 (1952) , 33, 1919 (1951)V.E. Tyler und A.E. Schwarting, J.Amer.pharm.Ass. 41, 354 (1952)A. Zaffaroni, J.biol.Chem. 177, 109 (1949)T.H. Kritschevsky und A. Tiselius, Science 144, 299 (1951)I. Jullander, Nature 162, 300 (1948)S.M. Partridge und T. Swain, Nature 164, 272 (1950)I.E. Carless und H.B. Woodhead, Nature 168, 203 (1951)H. Brindle, I.E. Carless und H.B. Woodhead, J.Pharm.u.Pharmacol.
3, 793 (1951)
Fortsetzung siehe Seite 17
- 17 -
Dies geschieht durch Eintauchen des Papieres in die Lösung, kurzes Absaugender überschüssigen Flüssigkeit zwischen Filterpapier und vorsichtiges Trock¬
nen in neutralem Milieu bei erhöhter oder Zimmertemperatur. Wird die Trock¬
nung bei Zimmertemperatur vorgenommen, so muss mindestens 3-6 Stunden
getrocknet werden.
Für unsere Versuche verwendeten wir wegen der guten Haltbarkeit, Puffer¬
kapazität, einem geringen Aussalzeffekt und der Abwesenheit C02-empfindlicher
Laugen die Puffermischungen nach Kolthoff (1):
1. Mischungen von 0,05 m-Berns teinsäure mit 0,05 m-Borax:
0,05 m-Bern- 0,05 m- 0,05 m-Bern- 0,05 m
PH steinsäure Borax PH steinsäure Borax
ml ml ml ml
3,0 9,86 0,14 4,6 7,00 3,003,2 9,65 0,35 4,8 6,65 3,35
3,4 9,40 0,60 5,0 6,32 3,683,6 9,05 0,95 5,2 6,05 3,953,8 8,63 1,37 5,4 5,79 4,21
4,0 8,22 1,78 5,6 5,57 4,43
4,2 7,78 2,22 5,8 5,40 4,604,4 7,38 2,62
Fortsetzung von Seite 16
5. A.M. Berg, Pharm.Weekbl. 86, 99(1951) 87,282(1952)S. Blackburn und A.C. Lowther, Biochem.J. 48, 126 (1951)K. Felix und A. Krekels, Hoppe Seylers Zeitschr. phys.chem
290, 78 (1952)J.D. Smith und R. Markham, Biochem.J. 46, 509 (1950)G.R. Wyatt, Nature 166, 237 (1950)M.E. Fewster und D.A. Hall, Nature 168, 78 (1951)M. Soliva, Diss. No. 2452 ETH Zürich (195~5TA. Bettschart, Diss. No. 2408 ETH Zürich (1954)S.P. Datta und M. Stack-Dunne, Nature 164, 673 (1949)S.P. Datta und M. Overell, Biochem.J. 44, XLIII (1949)L.E. Bush, Nature 166, 445 (1950)R. Munier, Bull.soc.chim.France 19, 852 (1952)H. Flood, Z.analyt.chem. 120, 32771940)P.P. Hopff, Soc. 785 (l94éT~T.R.E. Kressmann, Nature 165, 568 (1950)L.A. Liebermann, A. Zaffaroni und E
10, 216 (1951)
49, 401 (1951)
Stotz, Fed.Proc.
1. I .M.Kol thoff, Der Gebrauch der Farbindikatoren, 3. Aufl. Seite 148
zit.
E. Schmidt, Lehrbuch der pharm. Chemie, Braunschweig (1933)
18
2. Mischungen von 0,1 m-prim .Kaliumpho sphat mit 0,05m-
Borax:
0,1 m-prim. 0,05 m- 0,1 m-prim. 0,05 m-
PH Kaliumphosphat Borax pH Kaliumphosphat Borax
ml ml ml ml
5,8 9,21 0,79 7,6 5,17 4,83
6,0 8,77 1,23 7,8 4,92 5,08
6,2 8,30 1,70 8,0 4,65 6,35
6,4 7,78 2,22 8,2 4,30 5,70
6,6 7,22 2,78 8,4 3,87 6,13
6,8 6,67 3,33 8,6 3,40 6,60
7,0 6,23 3,77 8,8 2,76 7,24
7,2 5,81 4,19 9,0 1,75 8,25
7,4 5,50 4,50 9,2 0,50 9,50
Kolthoff gibt für die Puffersubstanzen folgende Reinigungsvorschriften:
Prim. Kaliumphosphat (KH2PO4): Das Handelsprodukt wird dreimal aus
Wasser umkristallisiert und bei 100° bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Borax (Na2B4Û7 + 10 H2O): Reiner Borax wird in 4 Teilen Wasser gewaschen,
filtriert, die heisse Lösung in eine Porzellanschale gegeben und gerührt bis zum
Erkalten. Der Borax scheidet sich als feines Kristallmehl ab. Es wird auf der
Nutsche abgesaugt und mit wenig kaltem Wasser gewaschen. Man lässt ihn auf
Filterpapier bei gewöhnlicher Temperatur trocknen und verwendet ihn erst, wenn
er wie Sand von einem Uhrglas rinnt, ohne haften zu bleiben.
Bernsteinsäure (HOOC-CH2* CH2-COOH): Das Handelsprodukt wird aus
20-proz. Salpetersäure, dann zweimal aus Wasser umkristallisiert und bei ge¬
wöhnlicher Temperatur im Vakuumexsikkator getrocknet.
4. Die Organischen Lösungsmittel
Das Lösungsmittel muss nach Decker (1) folgende Bedingungen erfüllen:
1. Die Rf-Werte sollen im Bereich von 0,05 - 0,9 liegen.
2. Die Rf-Werte der zu trennenden Substanzen sollen sich um 0,05-0,1 Einheiten
unterscheiden.
3. Die Stoffe sollen möglichst runde Flecken ohne Schwänze liefern.
Wohl die wichtigste Forderung ist eine teilweise Mischbarkeit der organischen
Lösungsmittel mit Wasser; ferner sollen sie so rein sein, dass sie mit einem
Adsorbens vom gleichen Aktivitätsgrad konstante Adsorptionswärmen geben.
1. P. Decker, Pharmazie 8, 371 (1953)
- 19 -
Hentzsch (1) behandelte in einer Uebersicht, wie ein Lösungsmittelgemischgewählt werden soll.
Der Verteilungskoeffizient soll möglichst 1, die Verteilungsisotherme ge¬
radlinig und die Selektivität für die aufzutrennenden Stoffe gross sein.
Unter Verwendung von gepufferten Papieren machten wir im Verlaufe un¬
serer Untersuchungen mit den Lösungsmitteln folgende Erfahrungen:
1. Bei Verwendung höherer Alkohole als mobile Phase werden teils runde,
teils längliche Alkaloidflecken erhalten, oft tritt keine Trennung ein;
2. Wassergesättigte Alkohole oder Mischungen derselben wie Methyl- und
Aethylalkohol, Alkohole mit Azeton oder Aether ergeben runde Flecken,
aber meist keine gute Trennung;
3. Mischungen von isomeren Alkoholen ergeben meist scharfe Flecken, leider
tritt bei manchen Alkaloiden keine genügende Trennung auf;
4. Die Rf-Werte steigen, wenn als mobile Phase ein Alkohol mit seinen niede¬
ren Homologen mitverwendet wird (2);
5. Methanol, Aethanol, Azeton, Methylazetat, Aethylazetat und Chloroform
allein oder in Mischung ergeben zu grosse Rf-Werte, wie aus der Löslich¬
keit zu erwarten war;
6. Aether eignet sich, wie auf Grund der Löslichkeit der Alkaloidbasen zu er¬
warten war, schlecht zur Alkaloidchromatographie. In saurem Bereich tritt
auf gepuffertem Papier keine Trennung ein, im alkalischen Gebiet eine sol¬
che mit kleinen Rf-Werten (3);
7. Benzol ergibt bei bedeutenden Substanzverlusten unregelmässige Chromato-
gramme.
5. Die chemischen Methoden zum Entwickeln der Chromatogramme
Zum Entwickeln sind Reagentien geeignet, die mit dem chromatographier-ten Stoff spezifische Reaktionen, d.h. gut sichtbare und beständige Flecken geben.
1. F.A. von Hentzsch, Angew.Chem. j>5, 586 (1953)2. R. Munier, Bull.soc.chim.France Jj>, 852 (1952)3. A. Bettschart, Diss Nr. 2408 ETH Zürich (1954)
-20-
Sie sollen vom Lösungsmittel nicht abgefälscht werden, noch das Papier zerstö¬
ren. Mittels einfacher Zerstäuber sprühten wir die verschiedenen Reagentienauf das Papier. Dadurch bildeten die nachzuweisenden Alkaloide gefärbte oder
fluoreszierende Derivate. Wir benutzten folgende Alkaloidreagenzien:
Dragendorff'
s Reagens nach R. Munier und Macheboeuf (1)
Lösung A: 850 mg Wismutsubnitrat
40 ml Wasser
10 ml Eisessig
Lösung B: 8 g Kaliumjodid20 ml Wasser
Verbrauchslösung: 5 ml Lösung A
5 ml Lösung B
20 ml Eisessig100 ml Wasser
Die meisten Alkaloide geben lange Zeit bestehen bleibende orange-rote bis rosa¬
rote Flecken.
Konzentrierte Salpetersäure D = 1,4
Einige Alkaloide geben orange-rote oder gelbe Flecken auf weissem Hinter¬
grund, sie verschwinden aber nach einiger Zeit.
Mandel-Reagens (Solutio Iodi aquosa mitis Ph.Helv.V, Suppl. I)
Mandel mitis: 2,0 g Jod4,0 g Kaliumjodid
94,0 g Wasser
Verbrauchslösung: 10,0 g Mandel mitis
90,0 ml Wasser/Alkohol ää
Die meisten Alkaloide geben gelbbraune bis gelbe Flecken. Narcein wird blau.
Die anfänglich nuancierten Farben verschwinden fast vollständig.
Reagens nach Zaffaroni (2)
5 ml 5-proz. Platinchloridlösung in n-HCl
45 ml 10-proz. Kaliumiodidlösung50 ml Wasser
Die meisten Alkaloide geben blauviolette bis purpurne, lange beständige Flecken
auf rosa Hintergrund.
1. R. Munier und M. Macheboeuf, Bull.soc.Chim.biol. 32,
192, 304 (1950)2. A. Zaffaroni und Mitarb., J.biol.chem. 177, 109 (1948)
- 21 -
Reagens nach Ehrlich-Koziczkowsky (l)
2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd20 ml 25-proz. Salzsäure
ad 100 ml Wasser
Das Ehrlich-Reagens wird leicht angewärmt und dann direkt auf das Papier ge¬
sprüht. Die Mutterkorn-Alkaloide geben sofort gelbe bis blauviolette Flecken.
Reagens nach Kiefer (2)
10 ml 1-proz. Kaliumferrizyanidlösung2-3 Tropfen 2 n-Ferrichlorid
Das besprühte Papier muss sofort nach dem Entwickeln ausgewaschen werden,
da es sich sonst mit diesem Reagens, wie die Alkaloide, stark blau färbt.
6. Die optische Methode zur Sichtbarmachung der Alkaloide
Viele Alkaloide zeigen im ultravioletten Licht charakteristische Färbungen.Durch Besprühen mit folgenden Reagenzien werden diese verstärkt oder gelöscht.Dadurch ist eine weitere Charakterisierung der Alkaloide möglich.
1. Gesättigte methanolische Aluminiumsulfatlösung2. Gesättigte wässrige Boraxlösung3. Konzentrierte Salpetersäure D = 1,044". 5-proz. Kalilauge in 50-proz. Aethanol
Da die meisten Papiere selbst etwas fluoreszieren, ist aber bei der Bewertung der
Fluoreszenz im ultravioletten Licht Vorsicht geboten (3).
1. Ph.Helv.V ,S. 1069 (1933)
2. Mercks Reagentienverzeichnis S. 304 (1939)3. T.S.G. Jones, Discuss.Faraday Soc. 1_, 249 (1949)
H.G. Osborn und A. Jewsburry, Nature 164, 443 (1949)R. Markham und J.D. Smith, Biochem.J. 45, 294 (1949)D.L. Clegg, AnalytXhem. 22, 49 (1949)
cuon
violettblau
violettblau
violettblau
-umrandet
violettblau
-
weiss
violettblau
violettblau
violett
violett
violett
violett
violett
violett
blau
blauviolett
blauviolett
braun-gelb
:alt
blauviolett;
braun-gelb
:alt
blauviolett;
gelb
blauviolett
blauviolett
purpur
blauviolett
blauviolett
blauviolett
blauviolett
blauviolett
blau
blauviolett
grunblaugrau
blaugrun
schwach
grauviolett
grau
viol
ett
blauviolett
blauviolett
purpur
blauviolett
blauviolett
blauviolett
blauviolett
Ehrlich-Reagens
Kiefer-Reagens
Zaflaroni-Reagens
keine
=-
Gamma
100
-5
Mengen:
gelbbraun
gelborange
Ergotaminin
gelbbraun
det
gelborange
Ergotamin
braun
ran-
gelborange
Ergosimn
braun
um-
gelborange
Ergosin
gelbbraun
rot
gelborange
vimn
Ergono
gelbbraun
gelborange
vin
Ergono
gelbbraun
orange
Brucin
gelbbraun
orange
Strychnin
gelbbraun
orange
Cephalein
gelbbraun
orange
EmeUn
gelbbraun
gelb
Berberin
gelbbraun
orange
Hydrastin
dunkelbraun
orange
tinin
Hydras
braun
purpur
Cryptopin
braun
orange
Papaverin
blau
dunkelgelb
Narcein
braun
orange
Narcotin
braun
orange
Thebain
braun
orange
Codein
gelbbraun
orange
Morphin
braun
orange
Cinchonidin
braun
orange
Cinchonin
gelbbraun
orange
Chinidin
gelbbraun
orange
Chinin
gelbbraun
orange
Tropakokain
braun
orange
Kokain
gelb
rot
Tropin
braun
orange
Apoatropm
braun
orange
Homatropin
gelbbraun
orange
Scopolamin
gelbbraun
orange
Atropin
Mandel-Reagens
Dragendorff-Reagens
Alkaloid
Nachweismethoden
Chemische
2Tabelle
rotlichblau
grau
-rötlich
violett
rötlich
violett
rötlich
hellblau
blau
blau
Ergotaminin
rotlichblau
grau
-rötlich
violett
rötlich
violett
rötlich
hellblau
blau
blau
Ergotamin
rotlichblau
braun
-rotlich
violett
rötlich
violett
rötlich
dunkelblau
hellblau
blau
Ergosimn
rötlichblau
braun
-rötlich
violett
rötlich
rötlichviolett
dunkelblau
hellblau
blau
Ergosin
rötlichblau
violettbraun
-rötlich
violett
rötlich
violett
rötlich
hellblau
blau
blau
Ergonovinin
rotlichblau
violettbraun
-
alt
rötlich
violett
rötlich
violett
rötlich
hellblau
blau
blau
vin
Ergono
blau
orange
dunkel
grau
grau
schwach
grau
grau
schwach
-Brucin
blau
orange
schwach
dunkel
grau
grau
schwach
grau
grau
-
Strychnin
blau
-
grUnlich
rotlichblau
blau
blau
leuchtend
dunkelblau
blau
alt:
Cephalein
gelbgrun
-
grünlich
rötlich
blau
blau
dunkelblau
gelb
leuchtend
alt:
Ernenn
braungelb
gelb
gelb
braun
gelb
leuchtend
braungelb
leuchtend
gelb
leuchtend
gelb
leuchtend
Berberin
blaugrun
dunkel
-hellblau
blaugrün
blau
grün
blau
stark
blau
Hydrastin
blau
leuchtend
-
blaugrun
bläulich
blau
leuchtend
blau
leuchtend
blau
leuchtend
blau
leuchtend
Hydrastimn
rötlich
--
orange
orange
rötlich
rotlich
orange
Cryptopin
gelblich
-
dunkelgrau
bläulich
grünblau
gelb
gelb
leuchtend
schw.gelbl.
alt:
gelb;
Papaverin
blau
-
gelblich
blaulich
bläulich
blau
bläulich
blau
schwach
Narcein
blau
-ocker
blau
bläulich
graugelb
graugelb
blau
Narcotin
grau
-
dunkelgrau
grau
bläulich
grau
blau
schwach
gelb
lich
schwach
Thebain
bläulich
-
dunkelgrau
-bläulich
grau
graublau
blauviolett
Codein
blaulich
-
dunkelgrau
-bläulich
grau
graublau
blauviolett
Morphin
blau
schwach
-blau
blau
blau
blau
blau
schwach
dunkelblau
Cinchonidin
blau
schwach
-blau
blau
blau
blau
blau
sehr
dunkelblau
Cinchomn
blau
schwach
-hellblau
hellblau
weissblau
hellblau
hellblau
hellblau
Chinidin
blau
schwach
-hellblau
hellblau
weissblau
hellblau
heUblau
hellblau
Chinin
bläulich
--
grau
-
grau
grau
-
Tropakokam
bläulich
--
grau
-
grau
grau
-Kokain
bläulich
-bläulich
blaul.Rand
bläulich
grau
bläulichgrau
bläulich
schwach
Tropin
bläulich
-bläulich
blaul.Rand
bläulich
blau
bläulich
bläulich
schwach
Apoatropm
bläulich
-bläulich
blaul.Rand
bläulich
blaugrau
bläulichgrau
bläulich
schwach
Homatropin
blaulich
-
bläulichgrau
blaul.Rand
bläulich
-bläulich
bläulich
schwach
Scopolamin
bläulich
-
bläulichgrau
blaul.Rand
bläulich
grau
bläulichgrau
bläulich
schwach
Atropin
proz.Aethanol
50
o°1
zn1
£1
in
5-proz.Kalilauge
Salpetersäure
Boraxlösung
ung
Los
Methanol-Aluminiumsulfat-
UV-Licht
Alkaloid
Farbreaktion
keine
=-
Papier
trockenem
auf
Farbe
=3
spater
UV
=2
sofort
UV
=1
Gamma
500,0
-25,0
Mengen:
Bemerkungen:
«eismethoden
Nach
Physikalische
3Tabelle
- 24 -
C. Spezieller Teil
I. Der Arbeitsplan
Auf Grund des Literaturstudiums über die papierchromatographische Auf¬
trennung von Alkaloidgemisehen gingen wir wie folgt vor, um uns Rechenschaft
zu geben über die Verwendbarkeit dieser Technik zur ReinheitsprUfung der offi¬
zineilen Alkaloide:
1. Bereitstellung der offizinellen Alkaloidsalze und Nebenalkaloide und ihre
Prüfung auf Identität, Reinheit und Gehalt nach den Vorschriften der Ph.Helv.V.
2. Festlegung der wichtigsten physikalischen Eigenschaften der untersuchten
Alkaloide.
3. Abklärung einiger technischer Fragen der Anwendung der Papierchromato¬
graphie auf die Alkaloidanalyse (verwendete Papiersorte, Klimatisationszeit,
organische Lösungsmittelphase, Phasenverhältnis, Einfluss der Klimatisa¬
tionszeit auf die Diffusion der Startflecken und auf den RfWert, Verhältnis
der Laufstrecke zur Fleckengrösse, Substanzmenge, Einfluss der Tempera¬
tur und der Reaktion auf den Rf-Wert).
4. Untersuchung der Auftrennungsmöglichkeiten der natürlichen Alkaloidgemi-
sche, also Studium des Verhaltens der offizinellen Alkaloidsalze im Gemisch
mit ihren Nebenalkaloiden. Eine möglichst eindeutige Trennung wurde mit
folgenden Verfahren angestrebt:
A. Verwendung des natürlichen Lösungsmittels als mobile und von
Wasser als stationäre Phase,
B. Verwendung des organischen Lösungsmittels als stationäre und
von Wasser als mobile Phase,
C. Verwendung von optisch aktiven Hilfsmitteln.
5. Ermittlung der Empfindlichkeit des papierchromatographischen Nachweises
von Alkaloiden in Gemischen und ihre Auswertung für die Reinheitsprüfung.
6. Versuche zur quantitativen Bestimmung kleiner Alkaloidmengen durch Papier¬
chromatographie.
25-
II. Die Eigenschaften und die Reinheit der untersuchten Alkaloide
Unseren Untersuchungen legten wir alle natürlichen Alkaloidbasen und
-salze zu Grunde, welche in der Ph.Helv.V (inkl. Suppl. I und II) aufgeführt sind,
sowie alle nicht offizineilen Nebenalkaloide, die wir aus dem Handel beziehen
konnten. Sie finden sich nach Pflanzengruppen geordnet in der Tabelle 4 zusam¬
mengestellt. Die Angaben umfassen unter anderem die wichtigsten physikyh-
schen Eigenschaften, wie LosJichkeit und pK-Werte. Da die Angaben der Litera¬
tur über die letzteren ausserordentlich differieren, entschlossen wir uns zur ana¬
lytischen Bestimmung sämtlicher pK-Werte *).
Die Messungen wurden unter Stickstoff-Begasung bei 20 urd bei einer kon¬
stanten lonalen Starke (p) von 0,1 ausgeführt mit einer Konzentration an Alkaloi-
den von ca. 1-10 Mol/1 . Dabei wurde die konstante îonale Starke stets durch
Zugabe der berechneten Menge Kaliumchlond hergestellt. Unter den angegebenen
Konzentrationsverhaltnissen werden die Aküvitatskoeffizienten praktisch durch
den im Ueberschuss anwesenden Elektrolyten bestimmt, sodass sie und das Akti-
vitatsglied konstant bleiben.
Wenn in die Definitions gleichung fur
K-[h+] [Al
[HA]
nun statt Aktivitäten Konzentrationen eingesetzt werden, so erhalt man sogenannte
Konzentrationskonstanten, die in diesem Falle fur die îonale Starke 0,1 gelten.
Diese ist ein Mass fur die freie Energie der Anlagerungsreaktion
HA V*- H+ + A~
in der betreffenden Losung des Neutralelektrolyten. Somit muss für die Berech¬
nung dieses Gleichgewichtes die Konzentration der H30+-Ionen gemessen werden,
was bedeutet, das s die Glaselektrode auf H30+-Konzentrationen geeicht werden
*) Die pK-Wert-Bestimmungen führten wir im Laboratorium fur AnorganischeChemie an der ETH durch. Herrn Dr. G. Anderegg, der diese Arbeiten leitete,mochten wir an dieser Stelle fur seme wertvolle Mitarbeit danken.
-26-
muss. Als Eichsubstanz wurde Essigsäure verwendet, flir die Harned (1) die
scheinbare Aziditätskonstante für 20 C und ;i = 0,1 sehr genau gemessen hat.
Er fand für den pK-Wert bei diesen Bedingungen 4,548.
Die Messanordnung wird durch die Kette
Glaselektrode/Lösung mit HA, KCl, ju = 0,1
// 0,1m KCl, Kalomelelektrode
symbolisiert.
Berechnung: Da die Konzentrationen der Alkaloide unbekannt sind, weil diese
Substanzen nicht getrocknet wurden, rechnet man mit Hilfe der Gleichung
OH
pH = pK + log
>,-RF]
OH
-log K = -log H - log
10PK = 10pH •
v[-^]
t-^J-1
wobei:
b = die zu jedem Mess
punkt zugefügteMenge Lauge ist,
c = <\l Konzentration
der Alkaloide
b = benötigte Menge Lau¬
ge um ein Proton des
Alkaloids zu neutra¬
lisieren
iqPk
ioP" b -
OH-
1 =
b-OH"
10PK
10J,PH
1. H.S. Harned und B. Owen, The Physical Chemistry of electrolyticSolutions, 2. Ed., Reinhold Publishing Corporation, New York
(1954)
- 27-
Zur graphischen Berechnung dient:
b
x
Achsenabschnitte:
x = b-°£- Y = -10PH
Zu unseren Untersuchungen verwendeten wir die offizineilen Alkaloidbasen
und -salze und prüften diese nach den Vorschriften der Ph.Helv.V, die nichtoffi-
zinellen Nebenalkaloide nach anderen einschlägigen Vorschriften auf ihre Rein¬
heit und den Gehalt. Besonderen Wert legten wir auf die Durchführung der Rein¬
heitsprüfungen und hier vor allem auf die als Verunreinigungen in Betracht fallen¬
den Neben- und Fremdalkaloide. Das Resultat dieser AlkaloidprUfungen ist in Ta¬
belle 5 zusammengestellt.
Die PrUfungsresultäte lassen erkennen, dass wir aus dem Handel auch Prä¬
parate erhalten hatten, welche nicht den Anforderungen der Pharmakopoe entspre¬
chen. Diese Alkaloide benutzten wir zu Vergleichszwecken bei der Aufstellung der
Prüfungsnormen zur papierchromatographischen Reinheitsprüfung. Als Testsub¬
stanzen zur Bearbeitung der papierchromatographischen Verfahren dagegen be¬
nutzten wir nur Alkaloide, die den Anforderungendder Pharmakopoe genügten und
im Kontrollchromatogramm keine Nebenalkaloide erkennen Hessen.
IQ13K
10PH
y
a = b-x - c-y
(1952)
N.J.
Rahway
Inc.
Co.
u.
Merck
drugs,
and
chemicals
of
Index
Merck
The
aus
Formelbilder
1.
(0,02)
7,94
Petrolather
und
Benzol
in
löslich
schlecht
Azeton.
Chloroform,
Aether,
Alkohol,
in
Wasser,
heissem
in
löslich
gut
C6H5
HC—CH—CH
II
3I
I\
CH-OCO-CH
N-CH,
O
2I
2I
/Il
CH„OH
CH_
HC—CH
303,35
NO
HC
Skopolamin
(0,05)
10,00
Merck)
(19°)
HT12
x1,
9(K
Sauren
verd.
in
gut
Benzol
in
150
:1
Chloroform
in
1:
1
Aether
in
69
:1
Alkohol
in
gut
Wasser
in
280
:1
-CH„
I3
C6H5
2
I
I3
ICH-OCO-CH
N-CH,
I*
II
—CH
H2C
CH„OH
-(rH2
H„C—CH-
289,4
C.-H.-O-N
Hyoscyamin
(0,05)
9,8313,9ö-pKA
pKB=
(Empfindl.)
20°
Bestimmung
Merck)
4,5xlO"5
(K
(Kolthoff)
(15°)
4,35
(Merck)
4,35
Sauren
dünnten
ver¬
und
Benzol
in
löslich
Chloroform
in
1:
1
Aether
m25
:1
Alkohol
in
2:
1
Wasser
heissem
in
90
:1
Wasser
in
455
:1
C6H5
-CH„
2ICH„OH
I3
ICH-OCO-CH
N-CH„
2ICH„
H2C—CH-
I2I—CH
H.C
Literatur
Loslichkeiten
Alkaloide
untersuchten
der
Werte
289,4
C1?H2303N
1)Atropin
Solanaceen-Alkaloide
Mol.-Gew.
Bruttoformel
Alkaloidbase
pK-
und
Loslichkeiten
4Tabelle
(0,03)
9,51
(Merck)
(15°)
4,32
(Kolthoff)
(15°)
6,60
(0,02)
8,85
(Merck)
(15°)
5,59
(0,05)
10,05
(Merck)
(15°)
3,80
(0,05)
10,04
pKA
-13,96
=pKß
Cra
1(Empfindl.)
20°
Bestimmung
furP
K-W6
116
L
Sauren
verdünnten
und
Benzol
Chloroform,
Aether,
Alkohol,
in
löslich
gut
Wasser,
in
loslich
schlecht
-CH,
6"5
?h
H2C—CH-
CH-OCO-C,H
N-CH,
II
2I
H,C—CH-
-CH,
245,31
C,,H,Q02N
Tropacocain
Benzol
und
azetat
Aethyl-
Azeton,
in
loslich
Chloroform
in
70,
:1
Aether
in
53,
:1
Alkohol
in
56,
:1
Wasser
heissem
in
270
:1
Wasser
in
600
:1
-CH2
56
|3
|,H.
CH-OCO-C
N-CH,
H2C—CH
-CH-COOCH,
IH,C—CH-
303,35
C17H21°4N
Kokain
Koka-Alkaloide
Chloroform
und
Aether
in
löslich
Alkohol,
und
Wasser
in
löslich
gut
141,21
-CH2
-
I3
I
CHOH
N-CH,
H2C—CH
"CH2
IH„C—CH-C8H15ON
Tropin
Isoamylalkohol
und
ather
Petrol-
in
löslich
schlecht
Benzol
Chloroform,
Aether,
Alkohol,
in
löslich
gut
Waäser
in
unlöslich
C6H5
-CH,
II
3I
CH-OCO-C
N-CH,
T"2
2|
"
I
H2C—CH-
CH0
-CH,
CH
H„C—
271,35
0,N
H,
CApoatropm
Loslichkeiten
Mol.-Gew.
Bruttoformel
Alkaloidbase
(do.)
10,03
(Tol
stoo
uhoy
)5,85
(do.)
9,29
(do.)
9,48
(do.)
9,92
(Kolthoff)
5,85
>'
[*'"
(Kolthoff)
6,43(15°)
,,
(do.)
9,92
(0,0
5)4,40
(Merck)
5,85
(Kolthoff)
(15°)
10,0
(Kolthoff)
(15°)
9,50
(Kolthoff)
(15°)
5,43
(0'03)
8'62
(Kolthoff)
(15°)
6,62
,,
,(Merck)
10,0
(0,0
5)4,47
(Merck)
(20°)
5,40
(do.)
9,88
(Tolstoouhoy)
6,00
(Kolthoff)
9,88
9,89
9,48
(Kolthoff)
(15°)
5,97
'*
(8'64
(Kolthoff)
(15°)
6*66
(0,0
5)4,47
(Merck)
(18°)
5,97
pKA
_13(96
=pKß
Literatur-
(Empfindl.)
20°
Bestimmung
pK-Werte
„,
,
Chloroform
in
110
:1
Aether
in
500
:1
Alkohol
in
60
:1
Wasser
in
unlöslich
C^CH=CH,
CH2~CH
CH,2
ICH,
00I
HOC-
-CH,
*£fc
-H
294,38
C19H22ON2
Cinchonin
Chloroform
in
6:
1
Aether
in
56
:1
Alkohol
in
36
:1
Wasser
in
2000
:1
CHCH=CH„
-CH
lICH,2
ICH,
I
H2C-
-CH,
324,41
IHOCH—CH-N-
C20H24°2N2
CH3O
Chinidin
Benzol
in
80
Chloroform
in
12
Aether
in
250
Alkohol
in
0,8
Wasser
in
1900
CHCH=CH
CH
2CH
2ICH,2
I
-CH,
324,41
CH
I—CH—N
HOCHC2
0H24°2N2
CH3O
Chinin
Alkaloide
China
Loslichkeiten
Mol.-Gew.
Bruttoformel
Alkaloidbase
(Sch
oorl
)6,9
(Kolthoff)
(15°)
7,0
(0,02)
8,26
(Merck)
(15°
)6,05
(Tol
stoo
uhoy
)6,17
(do.)
6,1
(Sch
oorl
)6,9
(Kolthoff)
(15°)
6,17
(Qjm)
g29
(Merck)
9,85
(0,05)
8,22
(Merck)
(20°)
6,13
(do.)
10,08
(Tol
stoo
uhoy
)5,80
(do.)
10,08
(Kolthoff)
5,80
(0,03)
8,51
10'0
3<d°
->(0,05)
4,38
(Merck)
5,80
pKA
.13>%
=pKß
Literatur
(Empfindl.
20°
Bestimmung
pK-Werte
.
Säuren
verd.
in
löslich
gut
Benzol
in
13
1
Chloroform
in
0,5
1
Aether
in
18
1
Alkohol
in
21
Wasser
in
120
1
och3
-CH2
CH2
CH3-
N
299'39
C18H21°3N
Codein
Säuren
verd.
in
löslich
gut
löslich,
schlechtSolventien
org.
in
Chloroform
in
1220
:1
Amylalkohol
in
114
:1
Alkohol
in
210
:1
Wasser
in
5000
:1
CH2
CHg
—
CH3-N
285,33
C.-H.qO-N
Morphin
Opium-Alkaloide
Chloroform
und
Aether
in
löslich
Alkohol
in
löslich
gut
Wasser
in
unlöslich
CH=CH,
Cr"
CH
CH=—
H2
ICH,2
ICH,
ICH,
N
i
WHOC-"^
294,38
C,QH22ON2
Cinchonidin
Löslichkeiten
Mol.-Gew.
Bruttoformel
Alkaloidbase
(Kolthoff)
(15°)
10,7
(0,03)
9,43
(Merck)
10,7
(0,05)
2,77
(Merck)
(20°)
9,3
(Tol
stoo
uhoy
)7,83
(Kolthoff)
(15°
)7,10
(0,05)
6,6
(Merck)
7,8
(Kolthoff)
(15°)
6,05
(0,04)
8,46
(Merck)
(15°)
6,05
pKA
.13>96
=^
Literatur
(Empfindl.)
20°
Bestimmung
pK-Werte
„.„
.
Säuren
verd.
in
löslich
gut
Benzol,
und
Chloroform
Aether,
in
unlöslich
fast
Alkohol
heissem
in
löslich
Wasser
in
770
:1
^^V<CH2)2-N-(CH3)2
°
J~^
OCH3
HOOC
-^/S
-r'O
CH3
0CH3
445,45
C23H
2708N
Narcein
CH30
Toluol
in
40
Benzol
in
30
Azeton
in
20
Chloroform
in
2
Aether
in
250
Alkohol
in
250
Wasser
in
3300
Pyridin
in
12
Benzol
in
25
Chloroform
in
13
Aether
in
230
Wasser
in
1460
ÊÔO
0CH3
413,41
C22H
2307N
och3
OCH,
Narcotin
311'37
C19H
21°3N
CH
CH*
CH,-N
Thebain
Löslichkeiten
Mol.-Gew.
Bruttoformel
Alkaloidbase
>11,0
(Merck)
2,62
)/
(8,58
(Tol
stoo
uhoy
)8,1
(do.)
8,09
(Kolthoff)
(15°)
7,05
(0,02)
6,36
(Merck)
(25°)
8,07
13,96-pKA
pKB=
(Empfindl.)
20°
Bestimmung
Literatur*p̂K-Werte
„.„
.
Säuren
verd*
und
r^0^^^^^^0"3
Aether
Chloroform,
Alkohol,
in
löslich
gut
Wasser
in
unlöslich
207,22
C-.H-.OJN
Hydrastinin
Hydrastis-Alkaloide
Lösungsmitteln
org.
sten
mei
den
in
löslich
schlecht
Chloroform,
in
löslich
Aether
Alkohol,
Wasser,
in
unlöslich
369,40
C,,H9,O^N
Cryptopin
Anilin
in
3:
1
Pyridin
in
13
:1
^f^"ocH3
CH30^^^
Azeton
roform,
11
lT
I
Chlo-
in
löslich
schlecht
CH3°^^^x^.CH2_^s<n
Amylalkohol
in
80
:1
Alkohol
in
45
:1
VM
Wasser
in
unlöslich
339,38
C„nH„.O.N
Papaverin
Löslichkeiten
Mol.-Gew.
Bruttoformel
Alkaloidbase
(Kolthoff)
(15°)
6,64
(Kolthoff)
5,30
)(do
5,77
10,ü5'
9'12
(Kolthoff)
(15°)
5,70
,_-.,
.,
Q(Merck)
6,64
(0,0
5)7,85
(Merck)
5,77
>11,0
2,s
«(Merck)
2,47
(Kolthoff)
7,77
(Kolthoff)
(15°)
7,0
(0,01)
6,61
(Merck)
7,8
pKA
-13,96
=pKg
Literatur
(Empfmdl.)
20°
Bestimmung
pK-Werte
Chloroform
und
Aether
Aethanol,
in
loslich
gut
Wasser
in
loslich
schlecht
480,63
C29H40°4N2
Ernenn
Ipecacuanha-AIkaloide
Benzol
und
Chloroform
Aether,
Azeton,
in
löslich
schlecht
Aethanol
in
100
:1
Wasser
m20
:1
OH
OCH3
t-^
-y
CH3O
319
20
3C3,36
C^H.-O.N
Berberin
Benzol
und
Azeton
in
löslich
gut
Chloroform
in
1:
1
Aether
in
245
:1
Alkohol
in
210
:1
Wasser
in
unlöslich
OCH3
V^°CH3
„rf"^^^^
383>39
C21H21°6N
tin
Hydras
Loslichkeiten
Mol.-Gew.
Bruttoformel
Alkaloidbase
(do.)
11,70
(do.)
10,60
(do.)
6,04
(Kolthoff)
(15°)
3,14
.
,,
(Merck)
11,7
(0,04)
8,37
(Merck)
6,04
(do.)
11,7
(do.)
10,22
(do.)
6,0
(Kolthoff)
(15°)
6,85
>n>()
(Merck)
11,7
(0,04)
8,40
(Merck)
6,0
(0,10)
10,10
(0,10)
8,74
(0,10)
7,7513,96-pKA
pKB-
r(Empfindl.)
20°
Bestimmung
pK-Werte
„r
,
Benzol
m100
Chloroform
in
5
Alkohol
in
1,3
Wasser
m1320
CH2
0I
ICH
CH
-^„AJs^1
°h3
c
f^N
CH3°Y^||
-CH2
H2C-
394>45
C23H26°2N2
Brucin
Toluol
in
200
Benzol
in
180
Chloroform
m5
Alkohol
in
150
Wasser
in
6400
CH2
O0
C,H
>k/rH
"I
I
CH2
^1
IH2C
334'40
C21H22°2N2
Strychnin
Brechnuss-Alkaloide
Chloroform
und
Aether
Alkohol,
in
loslich
gut
Wasser
in
löslich
schlecht
,AA^hikAAo
CH30
ch3o.
466'60
C28H38°4N2
Cephalein
Loslichkeiten
Mol.-Gew.
Bruttoformel
Alkaloidbase
(0,1)
,47
(Merck)
7,3
Pyridin
in
löslich
gut
Chloroform
in
löslich
massig
Aceton
und
Alkohol
in
löslich
gut
Wasser
in
unlöslich
fast
(0,1)
6,87
(Merck)
6,8
Chloroform
in
löslich
leicht
Azeton
azetat,
Aethyl-
in
Alkoholen,
meisten
den
in
löslich
gut
Wasser
in
löslich
wenig
13,96-pKA
pKB=
(Empfindl.)
20°
Bestimmung
pK-Werte
Literatur
Löslichkeiten
pano
l-(l
)2-Aminopro-
Aminoverb.
KetosäureHydrolyse
Nach
CH3
'^n^-^
CH2OH
-NH
-,
_
CHg-
ÇH-N
H-OC
-,:WV^.n.
39
325'
C19H23N3°2
Ergonovinin
pano
l-(l
)2-Aminopro-
Aminoverb.
säure
Keto
Hydrolyse
Nach
ch3
^N
CH2OH
l3
CH--CH-NH-OC-
325-39
cioH23N302
vin
Ergono
Mutterkorn-Alkaloide
Mol.-Gew.
Bruttoformel
Alkaloidbase
)/
(6,51
)(/
6,80
)/
(6,7013,96-PKA
PKB=
UteratUr
(Empfindl.)
20°
Bestimmung
pK-Werte
Benzol
in
löslich
schlecht
Aethylazetat
in
löslich
Eisessig
und
Pyridin
Chloroform,
in
löslich
gut
Azeton
in
150
:1
Alkohol
in
300
:1
Methanol
m70
:1
Wasser
in
unlöslich
d-Prolin
bensaure
1-Phenylalanin
Brenztrau-
Aminoverb.
KetosaureHydrolyse
nach
ch3
581,65
C-jH-.O.N,
Ergotamin
Benzol
in
löslich
wenig
Aethylazetat
in
löslich
Chloroform
und
Azeton
in
löslich
gut
Methanol
in
löslich
schlecht
Wasser
in
unlöslich
d-Prolm
bensaure
1-Leuzin
Brenztrau-
Aminoverb.
KetosaureHydrolyse
nach
547,64
N,
C^H^O
Ergosinin
Benzol
und
azetat
Aethyl-
in
loslich
schlecht
Chloroform
in
löslich
gut
Azeton
und
Methanol
in
löslich
sig
mas
Wasser
in
unlöslich
d-Prolin
bensaure
1-Leuzin
Brenztrau-
KetosaureHydrolyse
nach
547'64
C30H37°5N5
in
srgo
E
Loslichkeiten
Mol.-Gew.
Bruttoformel
Alkaloidbase
245)
(S.
1955
York
New
Company,
Publishing
(Chemical
research
chemotherapeutic
in
action
drug
of
interpretation
Ionic
Tolstoouhoy,
A.V.
(1939)
76,1497
Weekbl.
Pharm.
Schoorl,
N.
(192
5)^2,1291
Weekbl.
Pharm.
(192
5);
289
162,
Z.
Biochem.
Kolthoff,
J.M.
(195
2)N.J.
Rahway
Inc.
Co.
u.
Merck
drugs,
and
chemicals
of
Index
Merck
The
Literatur:
)/
(6,35
pKA
-13,96
=pKB
(Empfindl.)
20°
Bestimmung
pK-Werte
Literatur
Eisessig
und
Pyridin
Chloroform,
in
löslich
Methanol
heissem
in
1500
:1
Alkohol
heissem
in
1000
:1
Wasser
in
unlöslich
Löslichkeiten
d-Prolin
bensäure
1-Phenylalanin
Brenztrau-
Aminoverb.
KetosaureHydrolyse
nach
Ch3
rvV>
581,65
C,,H,.O.N„
Ergotaminin
Mol.-Gew.
Bruttoformel
Alkaloidbase
Base
*
negativ
99,41
-1,24
200,3
-199,8
(far
blos
)Scopolaminhydrochlorid
negativ
99,54
negativ
99,80
negativ
99,35
abwesend
99,30
negativ
99,82
negativ
99,94
negativ
99,30
negativ
99,74
negativ
99,63
abwesend
99,3
negativ
99,66
negativ
99,35
negativ
99,71
negativ
100,10
negativ
99,62
abwesend
99,3
prUfung
%in
Bestimmung
Reinheits¬
Titrimetrische
-1,30
-2,85
-1,24
-1,28
-1,24
-1,20
193,4
192,8
193,1
194
193,0
192,4
192,3
191
farblos
III
Muster
farblos
II
Muster
farblos
IMuster
,,
*,
»».
Ph.Helv.V
farblos
hydrobromicum
Scopolaminum
-2,66
-2,70
-2,69
-2,71
108,3
106,4
106,3
-108.1
-106.0
106,5
-106,0
(far
blos
)(f
arbl
os)
(far
blos
)(f
arbl
os)
IV
Muster
III
Muster
IIMuster
IMuster
Hyoscyaminbase
-2,7
2,65
*106
*107
-105,4
-104
farblos
farblos
IMuster
.
_..
Ph.Helv.V
sulfuricum
Hyoscyaminum
0
-0,01
-0,02
114,8
115,0
114,1
-114,0
-114,2
-113,7
(far
blos
)(f
arbl
os)
(far
blos
)
III
Muster
11Muster
IMuster
Atropinbase
0*
114,4
-113,8
farblos
IIMuster
0115,2*
-114,5
farblos
IMuster
0*
115
-113,5
farblos
Ph.Helv.V
sulfuricum
Atropinum
in
Schmelzpunkt
Schwefelsäureprobe
Solanaceen-Alkaloide
Alkaloid
Alkaloide
untersuchten
der
Gehaltsbestimmung
und
ReinheitsprUfung
5Tabelle
+*
+*
97-proz.Alkohol)
2,=
(c
negativ
JD
L
neSaüv
169
.=
LI15
negativ
-17,92
negativ
-17,89
abwesend
-18,0
-17,8
negativ
negativ
90,8
.00,04
abwesend
99,4
negativ
negativ
99,40
99,70
-3,63
-3,62
-3,65
-3,55
-3,62
-3,64
-3,68
-3,58
prUfung
Reinheits¬
%in
Bestimmung
°in
Titrimetrische
Drehung
Spezifische
Base
*
Kaliumsulfatprobe
*
(Zer
s.)
177
(Zer
s.)
270-280
96,4*
-95.8
97,0*
-96.7
*98
97,2
97,3
98
95
-96,5
-96,9
-95
gelb)
(schwach
IV
Muster
gelb
)(schwach
in
Muster
gelb
)(schwach
II
Muster
gelb)
(schwach
IMuster
Chininbase
gelb
schwach
II
Muster
gelb
schwach
IMuster
gelb
schwach
Ph.Helv.V
sulfuricum
Chinmum
China-Alkaloide
(far
blos
)(f
arbl
os)
(far
blos
)
III
Muster
II
Muster
IMusterrid
Tropacocainhydrochlo
farblos
farblos
farblos
II
Muster
IMuster
T,
..
Ph.Helv.V
hydrochloricum
Cocainum
farblos
farblos
11
Muster
IMuster
farblos
Ph.Helv.V
Cocainum
Coca-Alkaloide
63,2
-63
62,5
-62,1
63,1
-62,8
(far
blos
)(f
arbl
os)
(far
blos
)
III
Muster
II
Muster
IMuster
Tropinbase
239,3
-238,1
(far
blos
)Apoatropinhydrochlorid
in
Schmelzpunkt
Schwefelsäureprobe
Alkaloid
negativ
99,73
abwesend
99,30
negativ
negativ
negativ
abwesend
94,50
94,82
94,25
95
94
negativ
Meüianol)
in
1,=
(c
-132
=Hd
negativ
85,95
negativ
86,35
negativ
86,35
abwesend
87,0
85,5
Alkohol)
(in
Alko
hol)
(in
+229
=Hd
Alkohol)
in
1,(c=
+**
+258
=Hd
+*»
100,0
10,62
+
abwesend
99,5
+10,7
+10,5
prUfung
Reinheits¬
%in
Bestimmung
°in
Titrimetrische
Drehung
Spezifische
Base
*
Kaliumjodidprobe
**
154,7'
-154,3
:
156
-153
farblos
farblos
IMuster,
„.,
Ph.Helv.V
hydrochloricum
Codeinum
155,4
-154,1
155,2
-153,9
155,8
-154,2
156
-153
farblos
farblos
farblos
farblos
III
Muster
II
Muster
IMuster
Ph.Helv.V
Codeinum
(Zer
s.)
254
(far
blos
)Morphinbase
farblos
farblos
farblos
farblos
III
Muster
IIMuster
IMuster
,„
..
Ph.Helv.V
hydrochloricum
Morphinum
Opium-Alkaloide
(Zer
s.)
210
(Zer
s.)
265
gelb
)(schwach
gelb
)(schwach
IMuster
IMuster
Cinchonidin
Cinchonin
(Zer
s.)
Hi
gelb
schwach
gelb
schwach
gelb
schwach
IMuster
Chimdinbase
Ph.Helv.V
sulfuricum
Chimdinum
°in
Schmelzpunkt
Schwefelsàureprobe
Alkaloid
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
abwesend
99,60
99,30
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
abwesend
Alko
hol)
in
0,7
=(p
negativ
[tt]2D3=-185
negativ
100,05
abwesend
99,0
Alkohol)
in
2,=
(p
negativ
-219
=Hd
negativ
99,42
abwesend
99,0
negativ
99,43
abwesend
99,30
pruning
%in
Bestimmung
in°
Reinheits-
Titrimetrische
Drehung
Spezifische
146,9
•
147
147
-146,6
147
-146,8
(violett)
(violett)
(violett)
(violett)
Base
*IV
Muster
III
Muster
II
Muster
IMuster
Papaverinbase
146,8
*147
-145,2
-144
violett
violett
IMuster
.„
..
Ph.Helv.V
hydrochloricum
Papaverinum
138,2
138,6
138,0
-137,8
138,2
-137,2
(braun)
(braun)
(braun)
(braun)
IV
Muster
III
Muster
II
Muster
IMuster
Narceinbase
193
-192
(braun)
IMuster
hydrochloricum
Narceinum
172,3
-171,9
rotviolett)
(gelb-
Narcotinbase
172,3*
-171,2
*173
-171
gelb-rotviolett
gelb-rotviolett
IMusterT
..
wPh.Helv.V
hydrochloricum
Narcotinum
(Zer
s.)
193
(bra
un-r
ot)
Thebainbase
braun-rot
braun-rot
IMusterT
,.,
Ph.Helv.V
hydrochloricum
Thebainum
154,6*
-154,2
*156
-153
farblos
farblos
IMuster
.
_.,
Ph.Helv.V
phosphoricum
Codeinum
in
Schmelzpunkt
Schwefelsäureprobe
Alkaloid
negativ
99,8
abwesend
99,5
Chloroform)
(in
-43°
=[a]D
+30°
=Hd
+***
negativ
negativ
negativ
87,40
88,20
88,54
88,35
abwesend
90
87
negativ
92,67
negativ
92,35
negativ
92,80
abwesend
93
92
prUfung
Reinheits¬
%in
Bestimmung
°in
Titnmetnsche
Drehung
Spezifische
Molybdänschwefelsaure
***
farblos
IMuster
farblos
Ph.Helv.V
mtricum
Strychmnum
Brechnuss-Alkaloide
Aether)
(aus
116
245
(gel
blic
h)
gelb
lich
)(schwach
gelb
lich
)(schwach
gelb
lich
)(schwach
gelb
lich
)(schwach
gelb
lich
)(schwach
gelb
lich
)(schwach
Cephaleinbase
rid
Cephaleinhydrochlo
IV
Muster
III
Muster
IIMuster
1Muster
,,
.,
Ph.Helv.V
hydrockloricum
Emetinum
Ipecacuanha-AIkaloide
145,2
144,8
braun)
(grU
nBerbennbase
116,3
•-
115,9
rotviolett)
(gelb
Hydrastinhydrochlorid
braun
gelb
braun
gelb
braun
gelb
brau
n)(gelb
III
Muster
II
Muster
IMuster
T,
..
Ph.Helv.V
chloratum
Hydrastininium
Hydrastis-Alkaloide
221
220
(violett)
Cryptopin
°in
Schmelzpunkt
Schwefelsäureprobe
Alkaloid
Chloroform)
in
1=
(c[fl]2D°=+420
Chloroform)
in
1=
(c
-«»
H2d°
=
Chloroform)
in
(c=0
,26
Chloroform)
in
1(c=
-«
H2d°=
negativ
negativ
abwesend
99,2
99,2
99,0
0,322
0,3020,33
-0,30Al
koho
l)abs.
(in
"85
=Hd
negativ
negativ
negativ
negativ
.Alk
ohol
)abs
in
0,5
=(c[a
]2D°
=-10
4
prUfung
Reinheits¬
%in
Bestimmung
°in
Titrimetrische
Drehung
Spezifische
(Zer
s.)
220
(braun))
(gel
bErgosinin
(Zer
s.)
228
(braun))
(gel
bErgosin
)(braun)
(gel
bvininum
rgono
E
(Zer
s.)
162
)(braun)
(gelb
vinum
Ergono
144
-142
145
-142
(Zer
s.)
140-145
(braun))
(gel
b(braun))
(gel
bII
Muster
IMuster.
,.,
Ph.Helv.V
tartaricum
vinum
Ergono
-Alkaloide
Mutterkorn-
178
-177,4
178,3
-177,9
(ros
a)(rosa)
III
Muster
II
Muster
178,4
-177,3
(ros
a)I
Muster
Brucinbase
(Zer
s.)
268-290
(far
blos
)(f
arbl
os)
(far
blos
)
(far
blos
)
IV
Muster
III
Muster
II
Muster
IMuster
Strychninbase
in
Schmelzpunkt
Schwefelsäureprobe
Alkaloid
Chloroform)
in
0,5
=(c
+385
=Hd
Chloroform)
0,4in
=(c
bis-160
=-150
[a]2
p
Chloroform)
in
1(c=
"5
-=
Hd
prUfung
%in
Bestimmung
°in
Reinheits-
Titrimetrische
Drehung
Spezifische
(1952)
Index
Mercks
Literatur:
Fremdalkaloide
und
Neben-
auf
immer
:ReinheitsprUfung
(Zer
s.)
241-243
(braun))
(gelb
(Zer
s.)
183-186
(braun))
(gelb
Musterll
Ergotaminin
(Zer
s.)
183-186
)(braun)
(gelb
IMuster
Ergotamintartrat
(Zer
s.)
212-214
)(braun)
(gelb
in
Schmelzpunkt
Schwefelsäureprobe
Ergotamin
Alkaloid
-46-
III. Abklärung einiger Versuchsbedingungen der Papierchromatographie
Die qualitative Auswertung eines Papierchromatogramms, d.h. die Identifi¬
zierung von Substanzen, setzt eine genügende Trennscharfe des Verfahrens bei
den zu untersuchenden Stoffgemisehen voraus. Diese Bedingung ist erfüllt, wenn
genugende Unterschiede im Rf-Wert der vorliegenden Substanzen vorhanden sind,
und wenn die sichtbar gemachten Stofflecken eine scharfe Begrenzung und eine
möglichst runde Form aufweisen.
Der Rf-Wert und die Ausbildung geeigneter Flecken des Untersuchungsma-
teriales sind von verschiedenen Faktoren abhangig. Einige dieser Faktoren haben
wir in ihrer Auswirkung im folgenden naher abgeklärt.
1. Die Papiersorte
Die unterschiedliche Beschaffenheit der Chromatographier-Papiere, wie
Dicke, Faserdichte, Oberflachenbeschaffenheit etc.,ist massgebend fur die Saug¬
leistung, d.h. für die Laufgeschwindigkeit der mobilen Phase. Dies hat Bett-
s chart (1) an einigen Alkaloiden festgestellt. Nach dieser Arbeit und nach un¬
seren Versuchen zeigen die härteren Papiere einen niedrigeren Rf-Wert als wei¬
chere. Damit wird die Kenntnis der Geschwindigkeit der Verteilung der Stoffe
zwischen den beiden Phasen wichtig. Um diesen Unterschieden auszuweichen, ver¬
wendeten wir fur unsere Untersuchungen nur das Whatman-Papier No. 1 fur ein¬
zelne Alkaloidgruppen aus der gleichen Fabrikationscharge. Wir konnten durch
Verwendung quei zur Faserrichtung geschnittener und aufgehängter Papiere run¬
dere Flecken erhalten. Dies ist bei Trennungen bei tieferem pH von Bedeutung,
da in saurem Milieu sonst längliche Flecken auftreten. Das "Rundwerden" der
Flecken durch Aenderung der Flecken-Ellipsenachsen bedingt einen um ca. 7 %
kleineren Rf-Wert.
I.A. Bettschart, Diss No. 2408 ETH Zurich (1954)
-47-
2. Die Klimatisierungszeit
Als Klimatisation bezeichnet man das Anpassen der Chromatographierpa-
piere an die Dampfverhältnisse in der Wanne. Das Papier nimmt hauptsächlich
Wasser und wenig hydrophiles Lösungsmittel auf. Da der Grossteil des aufgenom¬
menen Wassers zur Ausbildung des für die Verteilung notwendigen Wasser-Zellu¬
lose-Komplexes als stationäre Phase verwendet wird, war es notwendig zu wissen,
wann die günstigsten Verhältnisse für die Verteilung der aufzutrennenden Stoffe
zwischen der stationären und mobilen Phase vorliegen. Diese Verhältnisse sind
schon früher von Bettschart (1) und Soliva (2) für die von ihnen verwendeten Sy¬
steme untersucht worden. Unsere Resultate, die wir bei der Klimatisierung von
Whatman-Papier No. 1 gewannen, welche mit Pufferlösungen vom pH 3,4; 3,6;
3,8; 5,8 und 6,6 imprägniert wurden, hernach mit wassergesättigtem Isobutanol-
Toluol und mit Isobutanol-Toluol-gesättigtem Wasser klimatisiert, bestätigten
diese Befunde.
Fig. 1
Wasseraufnahme von gepufferten Papieren bei der Klima-
tis ierung
V) 25-
20-
<¥ </> 15E <u
oc |.0
II-+-
10 15
Stunden
20 24
I.A. Bettschart, Diss. No. 2408 ETH Zurich (1954)2. M. Soliva, Diss. No. 2452 ETH Zürich (1955)
48-
Die auf verschiedene pH-Werte gepufferten Papiere verhalten sich gleichartig.
Die grösste Wasseraufnahme ist in den ersten zehn Stunden der Klimatisierung
festzustellen; später nimmt sie nur noch wenig zu, ohne dass aber nach 24
Stunden die Sättigung erreicht wird. Dies war erst nach ca. fünfzig Stunden der
Fall, nach einer Klimatisierungszeit, welche nicht eingehalten werden kann, da
sie grosse Nachteile mit sich bringt.
Der D?uer der Klimatisierungszeit sind Grenzen gesetzt, da die auf der
Startlinie aufgetragenen Substanzen während der Klimatisierung diffundieren.
Dies ist, wie unsere Untersuchungen an Brucin und Strychnin ergaben, insbeson¬
dere bei einer Klimatisierungszeit von zwanzig Stunden und mehr der Fall.
Auch ausgesprochen schlecht wasserlösliche Alkaloide unterlagen der Diffusion.
Die Ausbildung grosser Startflecken und damit die beschriebene Diffusionser¬
scheinung ist deshalb sehr nachteilig, weil sie vergrösserte Flecken im Chroma-
togramm zur Folge hat. Da dieser Einüuss sowohl bei der qualitativen als auch
bei der quantitativen papierchromatographischen Analyse der Alkaloide konstant
gehalten werden muss, haben wir uns entschlossen, alle Chromatogramme nach
einer Klimatisierungszeit von vierzehn Stunden herzustellen.
Fig. 2
Diffusion der Startflecken während der Klimati-
sationszei t
12 16
Stunden
-49-
Diese Versuchsbedingung muss streng eingehalten werden, weil die Klima-
tisierungszeit auch einen Emfluss auf den Rf-Wert ausübt. Wie die folgende Fig. 3
zeigt, deren Resultate mit Brucm und Strychnin auf verschieden lang klimatisier¬
tem, auf pH 6,6 gepuffertem Papier erhalten wurden, nehmen die Rf-Werte mit
längeren Klimaüsierungszeiten zu. Ausser der Aenderung der Rf-Werte konnte
auch eine solche der Form der Stofflecken festgestellt werden. Wahrend bei kurzer
Klimaüsierungszeit ( - 16 h) die vorteilhaften runden Flecken entstehen, werden
sie bei Verlängerung der Klimatisierung länglich oval bis sattelförmig. Bei Mi¬
schungen verschiedener Alkaloide mit nur geringen Unterschieden im Rf-Wert
können diese Verwischungen zu Unsicherheiten fidren, selbst wenn Kontrollsub¬
stanzen mitgefuhrt werden. Auch diese Beobachtung lasst erkennen, dass nicht ex¬
trem lang klimatisiert werden darf.
Fig. 3
Verhältnis von Rf-Wert zu Kli mati sations zeit
I.0--
0.9-
0.8-
0.7-
0.6-
0.3 -
0.2
0.1 •
Strychnin
Brucm
+- +-t-
I 3 5 10
Klimotisotionszeit
Stunden
20
- 50 -
3. Das Phasenverhaltnis
Nach der von Martin u. Synge (1) entwickelten Formel
Rf
AL + «As
Aj^ = von der mobilen Phase benetztes Volumen
Ag = von der stationären Phase benetztes Volumen
a = Verteilungskoeffizient
ist der Rf-Wert ausser vom Verteilungskoeffizienten abhangig von den Volumina
der mobilen und der stationären Phase. Das Verhältnis A^/Ag, welches auch als
Papierkonstante bezeichnet wird, ist abhangig von der Feinstruktur des Chroma-
tographiepapieres und kann somit von Papier zu Papier nicht unerheblich variieren.
Dies veranlasst uns, stets mit nur einer Papierqualitat derselben Fabrikations¬
charge und soweit wie möglich mit einer einzigen mobilen Phase (Isobutanol 50
Vol.T. + Toluol 50 Vol.T., gesättigt mit Wasser) zu arbeiten.
Fig. 4
Phasenverhaltnis in Abhängigkeit der Wegstrecke
AL/AS
5.0
4.0 f
Itn 3.0•ock.
> 20cHl(0
o 1 0
t
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Zurückgelegter Weg in %
1. A.J. Martin u. R.L.M. Synge, Biochem.J. 35, 1358 (1941)
- 51 -
Das Verhalten dei mobilen Phase (At ) zur stabilen Phase (Ag) bei un¬
serer Chromatographieanordnung geht aus Fig. 4 hervor. Von der Startlinie weg
verschiebt sich das Volumenverhaltnis Aj^/Ag durcli Wasseraufnahme zugun¬
sten der stationären Phase. Diese Phasen-Volumen-Verschicbung verändert, wie
wir mit Soliva (1) annehmen wollen, die Verteilungszahl, lasst aber den Ver¬
teilungskoeffizienten unberührt.
4. Der Einfluss der Laufgeschwindigkeit und der Laufstrecke
Die Konstant-Erhaltung der Laufgeschwindigkeit der mobilen Phase hat
sich ebenfalls als wichtig erwiesen. Die Anfangsgeschwindigkeit beim Einfluss
der mobilen Phase ins Chromatographierpapier und der Durchfluss durch das
Gebiet der Startlinie ist rascher als die Fliessgeschwindigkeit in der Mitte und
im unteren Teil des Papieres. Eine zu grosse Anfangsgeschwindigkeit fuhrt zu
Anomalien m der Stofftrennung. Es kommt dabei zu erhöhter Diffusion der Stoff¬
flecke und zu einer verminderten Trennscharfe. Auch der Rf-Wert ist abhangig
von der Geschwindigkeit der Verteilung; er wird grosser mit zunehmender Lauf¬
geschwindigkeit.
Ferner konnte ein Einfluss der Laufstrecke auf die Fleckengrosse und den
Rf-Wert beobachtet werden. Wir haben diese Verhaltnisse mit Hilfe von Strychnin
und auf pH 6,6 gepuffertem Papier untersucht und folgende Beziehungen gefunden.
Die Fleckengrosse nimmt zu Beginn der Laufzeit am stärksten zu. Dd dann die
Laufgeschwindigkeit am grossten ist, darf der Schluss gezogen werden, dass grosse
Geschwindigkeiten und zu lange Wegstrecken zu grosse, unscharf abgegrenzte und
langgezogene Flecken abgeben. In ungunstigen Fallen, d.h. bei schlecht '..rennbaren
Stoffen, zu grosser Laufgeschwindigkeit und -strecke besteht die Gefahr, dass
die Flecken so gross und langgestreckt werden, dass sie ineinander übergehen.
Von Buch (2) ist ferner auf die Abhängigkeit der Rf-Werte von der Lange der
Laufstrecke hingewiesen worden. Auch in unseren Versuchen mit Brucin und
1. M. Soliva, Diss. No. 2452 ETH Zurich (1955)
2. M.L. Buch, R. Montgomery und W.L. Poster, Z.analvt Chem24, 489 (1952)
52
Fig- 5
Verhältnis der Laufstrecke zur Fleckengrosse(Strychnin, pH 6,6)
100 200 300 400 500 mm*
Fleckengrosse
Strychnin konnten wir Rf-Werte-Vergrosserungen zwischen 0,05 - 0,10 hinlvei-
ten feststellen. Sowohl fur die saubere qualitative, besonders aber fur eine ein¬
wandfreie quantitative Alkaloidanalyse ist es notwendig, in Bezug auf die ange¬
führten Versuchsanordnungen optimale Bedingungen und Normen zu schaffen. Aus
diesen Gründen empfiehlt es sich, die Einfliessgeschwindigkeit der mobilen Phase
in das Filtnerpapier zu verlangsamen und zu normieren. Dies geschieht am be¬
sten dadurch, das s die Kuvette nur auf eine Schichthohe von 15 mm mit mobiler
Phase gefüllt wird,und das s man die Startlinie in einem Abstand von 6 cm vom
Papierfalz bei der Kuvette anordnet. Ferner ist eine Laufzeit von ca. - 4 1/2 Stun¬
den einzuhalten, um eine Laufstrecke von max. 300 mm zu erreichen.
-53-
5. Der Einfluss der Substanzmengen auf den Rf-Wert
Bettschart (1) hat bei der Papierchromatographie von Atropin, Scopo-
lamin und Tropin mit zunehmenden Stoffmengen eher grössere Rf-Werte gefun¬
den. Wir untersuchten diese Verhältnisse bei den Opium-Alkaloiden, von denen
wir Mengen von 25, 50, 100 etc. bis 400 ug auf Papier verwendeten, welches auf
pH 3,5 gepuffert war. Die Nachweisbarkeit der aufgetrennten Alkaloide erfolgte
mit Dragendorff' s Reagens und war auch mit den geringsten Aikaloidkonzentra-
tionen einwandfrei. Die Flecke waren rund bis oval. Die gefundenen Rf-Werte
sind in Fig. 6 dargestellt.
Fig. 6
Einfluss der Substanzmenge auf den Rf-Wert(gleich grosser Startfleck)
(pH 3,5)
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
fc 0.5-
10.4
CE
0.3
0.2+
0.1
100 200 300
Substanzmenge
-o Norcotin
Papaverin
-° Narcein-° Thebain
-° Cryptopin
-o Codein
-? Morphin
400 ^g
I.A. Bettschart, Diss. No. 2408 ETH Zürich (1954)
- 54 -
Die gefundene Rf-Wert-Konstanz ist bei den bearbeiteten Einzelalkaloiden
erstaunlich. Die Formulierung von Lindstedt (1), zu hohe Konzentrationen be¬
dingten zu hohe Rf-Werte mit schlechter Trennung (Schwanzbüdung), gilt, wenn
die Alkaloide in Mischung auf das Papier gegeben werden. Fur Losungen unbekann¬
ter Alkaloid-Konzentration sind daher mehrere Chromatogramme mit verschiede¬
nen Verdünnungen anzufertigen. In unseren Versuchen konnten ohne Schwierigkeit
Alkaloidmischlingen mit je 25 - 200 Gamma getrennt werden.
Die Rf-Wert-Abhangigkeit von Begleitstoffen ist nach unseren Untersuchun¬
gen gut ersichtlich bei Kodein und Morphin einerseits (Fig. 6) und bei Papaverin
und Narcottn anderseits (Fig. 6). So konnten bei Morphin und Kodein eine Abstos-
sung, bei Papaverin und Narcotin ein Zusammenlagern der beiden Alkaloide fest¬
gestellt werden. Die Zusammenlagerung (schlechte Trennung) tritt allerdings erst
bei ungleich grossen Mengen, wie bei der Trennung von Opialum oder bei Mengen
Über 200 Aig,auf. In solchen Fallen behalfen wir uns durch Aufsetzen kleiner Stoff¬
mengen Punkt um Punkt nebeneinander auf die Startlinie ; damit erreichten wir im¬
mer eine gute Trennung. Die Flecken waren dann mehr bandförmig angeordnet.
6. Die Abhängigkeit von der Temperatur
Da wir wassergesattigte Losungsmittel oder Wasser mit organischen Losungs¬
mitteln gesattigt als mobile Phase verwenden, ändert sich mit der Temperatur de¬
ren Zusammensetzung. So ist die Temperatur in erster Linie als Variable der
Viskosität der mobilen Phase zu betrachten. Im Zusammenhang mit der Gleichge-
wichtsemstellung muss man auch die Temperaturabhangigkeit des Dampfdruckes,
sowohl der am Boden der Kammer befindlichen Phase, wie der des Entwicklers, be¬
rücksichtigen. Bei unseren Versuchen konnten zwischen den extremsten Tempera¬
turschwankungen, wie die Fig. 7 zeigt, minime Veränderungen der Rf-Werte fest¬
gestellt werden. Bei 19-21,d.h. bei normaler Zimmertemperatur,herrscht aber
Rf-Wert-Konstanz.
1. P. Lindstedt, Acta chim. scand. 4_, 448 (1950)
- 55 -
Fig. 7
Temperaturabhängigkeit der Rf-Werte
1.0
0.9--
0.8-•
0.7
0.6-
a>
5 0.5-
£-0.4 +
0.3-
0.2
0.1 4
+-
16 20 24" C
Temperatur
7. Die Abhängigkeit des Rj-Wertes von der Reaktion
Ausgehend von der Tatsache, das s der die Auftrennung beeinflussende
Verteilungskoeffizient a der zu trennenden Stoffe abhängig ist von ihrem Disso¬
ziationsgrad, sind verschiedene Ableitungen des Einflusses der Reaktion auf
die Chromatographie gemacht worden (1). Der bei der Auftrennung zu erwarten¬
de Verteilungskoeffizient a' ist berechnet worden als
= log a - pH + pK
1. M. Soliva, Diss. No. 2452 ETH Zürich (1955)
-56-
Daraus geht hervor, das s der beobachtete Verteilungskoeffizient eine einfache
Funktion des pH ist. Eine Erhöhung des pH muss somit zu einer Vergrösserung
des Rf-Wertes führen. Dies konnten wir bei allen Untersuchungen feststellen.
Auch bei den Alkaloiden können nun die Bedingungen so gestaltet werden, dass
beim pH-Bereich gearbeitet wird, wo sich ihre Verteilungskoeffizienten am mei¬
sten unterscheiden. Mit einer lipophilen mobilen Phase und einer wässrigen sta¬
tionären Phase müssten sich zwei Âlkaloide dann am besten trennen, wenn das pH
zwischen der Basenstärke der beiden Âlkaloide liegt. Dies hat sich jedoch bei der
praktischen Durchführung von Papierchromatogrammen nicht bestätigt. Sol i va
(1) glaubt, eine Erklärung für diese Beobachtung darin zu sehen, dass die Verhält¬
nisse in einer wässrigen Pufferlösung und auf einem gepufferten Papier verschie¬
den sind. Die vorhandene stationäre Phase ist nicht in der Lage, die Gesamtmenge
der Puffersubstanzen wieder aufzulösen; ein Teil derselben bleibt ungelöst im Pa¬
pier. Dadurch kommt es zu einer Aenderung der Eigenschaften des Papieres und
der stationären Phase (Aussalzeffekt, Reaktion etc.).
Wir konnten ferner die interessante Beobachtung machen, dass Pufferlösun¬
gen desselben pH, welche sich aber durch eine verschiedene Zusammensetzung
(Bernsteinsäure oder Zitronensäure) auszeichnen, unter sonst gleichen Versuchs¬
bedingungen verschiedene Rf-Werte ergeben. So zeigt Narcein bei pH 5,8 einen
höheren Rf-Wert als Thebain. Nach Pufferwechsel sinkt sein Rf-Wert jedoch unter
jenen des Thebains.
Die Versuche zur Festlegung des pH-Bereiches, der zur besten Auftrennung
der natürlichen Alkaloidgruppen führt, haben wir im nächsten Abschnitt bei den
entsprechenden Alkaloidgruppen beschrieben.
IV. Die Verfahren zur papierchromatographischen Auftrenmuig der Alkaloide
Die Erfahrungen aus den im Vorstehenden beschriebenen Versuchen nützten
wir aus, um drei verschiedene Techniken auf ihre Eignung zur Auftrennung der
natürlichen Alkaloidgemische zu überprüfen. Wir arbeiteten mit organischen
1. M. Soliva, Diss. No. 2452 ETH Zürich (1955)
- 57 -
Lösungsmitteln als mobile Phase, mit Wasser als mobile Phase und überprüften
die Eignung optisch aktiver Hilfsstoffe zur Auftrennung von optischen Antipoden.
A. Verwendung des organischen Lösungsmittels als mobile Phase
Als Arbeitsmethode dieser Technik verfolgten wir:
Chromatographieverfahren A:
1. Papier: Whatman Papier No. 1 auf 10 - 20 / 48 cm geschnitten; Laufrichtung
quer zur Faserrichtung; nach Bedarf gepuffert mit Pufferlösungen nach Kolt¬
hoff (1).
2. Mobile Phas e: Isobutanol (50 Vol.T.) - Toluol (50 Vol.T.) mit Wasser ge¬
sättigt. Käufliches Isobutanol wird von den Verunreinigungen durch zwei¬
stündiges Kochen mit Zinkstaub und starken Alkalien mit anschliessender De¬
stillation und Redestillation gereinigt. - Toluol wird mit 7-proz. Schwefel¬
säure während vier Stunden geschüttelt, die. Schwefelsäure abgezogen, das To¬
luol mit Natronlauge nachgewaschen und rektifiziert.
3. Auftragen der Alkaloide: Die Alkaloide können in Form ihrer Basen
oder Salze verwendet werden, da keine Unterschiede im Verhalten der verschie¬
denen Formen festzustellen waren. Sie werden in Chloroform oder Methanol,
resp. in einem Gemisch dieser Lösungsmittel gelöst. Für schwerlösliche Alka¬
loide haben sich verdünnte organische Säuren oder Pyridin als geeignet erwie¬
sen. Die Alkaloidlösungen werden mit einer Mikropipette (eingeteilt in 0,001 ml,
auf Auslauf geeicht, mit Schellbachstreifen) in Mengen von 10 - 100 ^ug Alkaloid
auf die Startlinie gegeben. Diese befindet sich 9 cm vom oberen Rand des Bo-
gens entfernt. Die Lösungen werden auf einen Kreis von 1 cm Durchmesser ge¬
geben. Der Abstand zwischen zwei solchen Kreisen soll ca. 3 cm betragen.
Grössere Alkaloidmengen sollen streifenförmig aufgetragen werden.
4. Chromatographieren: Wir verwendeten die Apparatur von Dumas (2)
und arbeiteten nach der absteigenden Methode, vor intensivem Licht geschützt,
1. J.M . Kolthoff, Der Gebrauch der Farbindikatoren, Verlag Springer u. Co.,
Berlin, S. 148 (1925)2. Fabrikant: Arnold Dumas, Zürich 7/44, Schmelzbergstrasse 26
-58 -
an einem zugfreien Ort von möglichst konstanter Temperatur (19- 21 ). Am
Boden der Wanne steht eine flache, weite Schale mit der mobilen Phase; wäh¬
rend der Boden der Wanne 1-2 cm hoch mit Wasser bedeckt wird. Die Wannen¬
wände werden mit nassem Filtrierpapier ausgekleidet, das bis an den Boden
der Wanne geführt wird und ins Wasser eintaucht. Die so vorbereitete Wanne
las st man zur Sättigung des Innenraumes 48 Stunden lang stehen. Der nach (3)
vorbereitete Chromatographiebogen wird am Abend in die gesättigte Wanne
gehängt und 14 Stunden lang klimatisiert. Hierauf wird die mobile Phase in die
Kiivette eingegossen, sodass sie eine Schichthöhe von 15 mm aufweist. Die mo
bile Phase, welche sofort in das Papier einzuströmen beginnt, wird auf eine
Laufstrecke von 30 cm vordringen gelassen (ca. - 4 1/2 Stunden). Nun wird der
feuchte Chromatographiebogen aus der Wanne genommen, die erreichte Front¬
linie markiert und bei Zimmertemperatur getrocknet (15 - 20 Min.).
5. Nachweis der Alkaloide auf dem Papier: Das getrocknete Chro-
matogramm wird zuerst unter dem UV-Licht betrachtet und die fluoreszie¬
renden Alkaloidflecken durch exaktes Umranden festgelegt. Hierauf werden
die Chromatogramme mit den Reagenzien besprüht, welche sich für den UV-
oder visuellen Nachweis eignen. Wird auf eine UV-Betrachtung verzichtet, so
können die halbfeuchten Chromatogramme mit den Reagenzien besprüht werden.
Dieses Vorgehen ist empfehlenswert, weil scharf umrandete Farbflecke auf
weissem Papier erhalten werden.
6. Bestimmung des Rf-Wertes: Die entstandenen Flecken werden auf
dem trockenen Chromatogramm mit Bleistift umrandet und ausgemessen. Die
Laufstrecke wird von der Startlinie bis zum Fleckenzentrum gemessen.
Chromatographieverfahren B: (mit Wasser als mobile Phase)
1. Papier: Whatman Papier No. 1, nicht gepuffert
2. Mobile Phase: Wässrige Pufferlösung vom pH 6,6, 1/100 Kolthoffkonzentration
3. Auftragen der Alkaloide: 15-50 jag Atropin und 15-50 Aig
1-Hyoscyamin
4. Chromatographieren: Die Wanne wird vorbereitet wie beim Chromato¬
graphieverfahren A ; hierauf wird das Chromatographierpapier mit Toluol
- 59 -
(5 Vol.T.) - Isopropylather (95 Vol.T.) imprägniert und 10 Minuten lang an
der Luft getrocknet. Dann werden die Alkaloide innerhalb 5 Minuten aufgetra¬
gen, das Papier in die Wanne gehangt und 1 Stunde lang klimatisiert. Hierauf
giesst man soviel wassrige Pufferlosung in die KUvette ein, das s sie eine
Schichthöhe von 15 mm einnimmt. Das Chromatogramm wird über eine Lauf¬
strecke von 30 cm laufen gelassen (ca. - 4 1/2 Stunden).
Im übrigen entspricht die Arbeitsweise dem Chromatographieverfahren A.
Das Prinzip der praparativen Auftrennung von dl-Basen mittels optisch
aktiver Sauren ist auch bei der Papierchromatographie auswertbar. Berlin-
gozza (1) imprägnierte das Papier mit d-Kampfersulfosàure und trennte so
die optischen Antipoden von a-Aminophenylessigsaure. Da Stoll u. Hoffmann
(2) mit Erfolg Di-(p-toluyl)-l-wemsàure zur praparativen Auftrennung der ste-
reomeren Secale-Alkaloide verwendeten, entschlossen wir uns, diese optisch ak¬
tive Saure ( \a_
= -195° in Aceton) auf ihre Eignung zur papierchromatogra-
phischen Trennung von Alkaloid-Razematen zu überprüfen. Wir arbeiteten nach
folgender Vorschrift:
Ch romatographie verfahren C: (mit einer optisch aktiven Saure)
1. Papier: Whatman Papier No. 1 gepuffert, Faserrichtung quer
2. Mobile Phase: Isobutanol (50 Vol.T.) - Toluol (50 Vol.T ) mit Wasser
gesattigt
3. Auftragen der Alkaloide: Die Alkaloidbase wird in Methanol gelost,
welches die Di-(p-toluyl)- t -weinsaure m geringem Ueberschuss enthalt.
Von dieser Losung wird eine ca. 50 ^g Alkaloidbase entsprechende Menge auf
die Startlinie aufgetragen.
4. Chromatographiercn: Klimatisierungszeit 1 Stunde, absteigende Lauf¬
strecke 30 cm (ca. - 4 1/2 Stunden). Im übrigen wird genau wie nach Chromato¬
graphieverfahren A gearbeitet. Die Empfindlichkeit des Dragendorff-Reagens
ist wenig herabgesetzt.
1. Berlingozza und Mitarb., Sperimentale, Sec.Chim.Biol. 2, 89 (1951)2. A. Stoll und A. Hoffmann, Helv.Chim.Acta 26, 925 (1943)
- 60 -
V. Papierchromatographische ReinheitsprUfung der natürlichen Alkaloidgruppen
1. Solanaceen-Alkaloide
a) Bisherige Untersuchungen
Die papierchromatographische Auftrennung der Solanaceen-Alkaloide ist
schon häufig bearbeitet worden. Munie r und Macheboeuf (1) zeigten an¬
hand von Modellversuchen mit Reinalkaloiden, das s gute Trennungen mit Butanol
+ Eisessig + Wasser oder mit Isobutanol + Salzsaure + Wasser möglich sind,
ohne das s eine Hydrolyse der Alkaloide auftritt. Unklare Bilder infolge Verdop¬
pelung der Flecken und Deformation treten nur auf, wenn die Entmischungsfrontin die Gegend der Flecke zu hegen kommt. Dies konnten die Autoren vermeiden,
indem sie das Chromatographiepapier zuvor mit einer Salzlosung tränkten, wel¬
che dasselbe Anion enthalt wie die mobile Phase. Die Auftrennung von Atropin
(resp. d-Hyoscyamin) und 1-Hyoscyamin gelang ihnen dagegen nicht. Mit gepuf¬ferten Papieren (m/15-Phosphat- resp. m/15-Zitratpufferlosungen) arbeiteten
Brindle, Carles s u. Woodhead (2). Aether als mobile Phase gab gute
Trennungen von Atropin und Scopolamin, doch waren die Alkaloidflecken ziem¬
lich gross. Scopolamin hess sich von Atropin, Apotropm und Methylatropinmtratmit einem Chloroform + Petrolather + Tetrachlorkohlenstoff - Gemisch (33 +
33 + 33 + 100), das mit Wasser gesattigt wurde, zufriedenstellend trennen. Von
Schute (3) wurde ein Verfahren zur Trennung der Solanaceen-Alkaloide ent¬
wickelt, das Wasser + 5 % Ammoniak als mobile Phase verwendet, da ihm mit
Hilfe organischer Losungsmittel eine Trennung nicht gelang. Damit konnte er
die Schwanzbildung der Alkaloidflecke zurückdrängen, die Laufstrecke wurde ver¬
längert und die Rf-Werte waren konstant über ein grosseres Konzentraüonsgebiet.Er konnte Belladonin (Rf= 0), Apoatropm (Rf= 0,30, gestreckter Fleck), Atropin
(Rf = 0,75, gestreckter Fleck mit scharfer Front und diffuser Schwanzflache) und
Scopolamin (Rf = 0,90, meist runder Fleck) voneinander trennen. Die Empfindlich¬keit der Methode gestattet, aus einem Gemisch von 200 yug Atropin + 4 Aig Scopol¬amin einen grossen Atropinfleck (Rf= 0,72, mit Schwanzbildung) und einen kleinen
vom Atropinfleck nicht ganz abgetrennten Scopolaminfleck zu gewinnen. H e g -
nauer (4) hat sich bei der Untersuchung von Datura-Alkaloiden dieser Methode
mit Erfolg bedient. Ueber Erfahrungen mit der Rundfiltermethode berichtet
Romeike (5), die als mobile Pliase ein Butanol + Essigsaure - Gemisch (100 +
10 + Wasser gesattigt) gebrauchte. Damit konnte die Trennung von Atropin, Sco¬
polamin, Tropin und Scopolin erreicht werden. Fur ein gutes Chromatogrammsind 50-100Aig Alkaloide notwendig. Jen t z s c h (6) nützte den grossen Unter¬
schied der Loshchkeit der salzsauren Salze von Hyoscyamm (gut löslich) und
Scopolamin (unlöslich) in Chloroform aus. Nach der absteigenden Methode wurde
in Salzsäure-gesättigter Atmosphäre mit einem salzsauregesattigten n-Butanol +
Chloroform - Gemisch chromatographiert. Dabei traten die Alkaloide Atropin
1. R. Munier u. M. Macheboeuf, C.r.hebd.Sc.Acad.Sci. 1177 (1950)Bull.Soc.chim.biol. 32, 209 (1950)
03, 851 (1951)34, 204 (1952)
2. H. Brindle, I.E. Carless u. H.B. Woodhead, J.Pharm.Pharmacol.
3, 793 (1951)3. J.B. Schute, Pharm.Weekbl. 86, 201 (1951)4. R. Hegnauer, Pharm.Weekbl. 86, 321, 805, 935 (1951)5. A. Romeike, Pharmazie 7_, 496~(l952); £,672,729(1953)6. K. Jentzsch, Scientia pharm. ^0, 216 (1952)
- 61 -
(Hyoscyamin), Scopolamin, Tropin und Scopolm als scharf begrenzte Flecke ohne
Schwanzbildung auf. Mit 400 /Ug waren einwandfreie Chromatogramme zu erhalten;
die untere Grenze der Nachweisbarkeit mit Dragendorff s Reagens lag bei lOyUg.Versuche, die Bettschart (1) zur papierchromatographischen Trennung von
Atropin und Hyoscyamin anstellte, blieben ebenfalls ohne Erfolg. Ein von Brau¬
niger u. Borgwardt (2) in Vorschlag gebrachtes Verfahren führt die Solana-
ceen-Alkaloide in ihre Methyljodide über und unterwirft sie der Chromatographieauf Rundfiltern. Es gelang ihnen die quartaren Salze von Atropin, Scopolamin und
Tropin einwandfrei aufzutrennen. Reichelt (3) trennt die Solanaceen-Alkaloide
auf mit Formamid-impragmertem Papier und Chloroform als mobile Phase So ge¬
lang ihm die Trennung von Tropin, Atropin und Scopolamin. Schultz u. Strauss
(4) trennten in ihrem Analysengang Atropin von Scopolamin. Als mobile Phasen ge¬
brauchten sie Butanol + Essigsaure + wassergesatügt oder Butanol + Ameisensaure
+ wassergesattigt. Krogerus u. Tuderman (5) trennten Atropin von Scopola¬
min auf gepuffertem Papier mit Kaliumphosphat. Als Losungsmittel verwendeten
sie n-Amylalkohol-, n-Butanol-, Isobutanol-, sek.Butanol- und Isoamylalkohol +
Saure + Wasser-Gemische. Mit n-Amylalkohol + Ameisensaure + Wasser (100 +
18 + 4) als erste und Isopropanol + Wasser (75 + 25) als zweite mobile Phase er¬
hielten sie als Rf-Werte fur Atropinsulfat 0,62 und fur Scopolaminhydrobromid0,34. Mit n-Butanol + Essigsaure + Wasser (40 + 10 + 150), n-Butanol + Ameisen¬
saure + Wasser (10 + 1 + 10) und n-Butanol + Propionsäure + Wasser (10 + 1 + 10)
trennten Gore u. Adshead (6) Alkaloidbasen und-salze. Mit der mobilen
Phase n-Butanol + Essigsaure + Wasser (40+10 + 50) zeigen die Rf Werte ein
gleiches Wandern der Basen und Salze (Atropin Rf = 0,73, Atropinsulfat Rf = 0,72;
Homatropin Rf = 0,68, Homatropinhydrobromid Rf = 0,66; Scopolamin Rf = 0,63,
Scopolaminhydrobromid Rf - 0,62; Hyoscyamin Rf = 0,75, Hyoscyammsulfat Rf =
0,73). Klem ents chi tz u. Mathes (7) trennen mit Aethylglykol und Wasser
(70 + 30) als mobile Phase (Tropin Rf = 0,75, Laktyltropin Rf = 0,85,
Atropin Rf = 0,90, Hyoscyamin Rf = 0,90, Homatropin Rf = 0,90). Mit dieser
Methode konnten die Autoren mg-Mengen papierchromatographisch sauber differen¬
zieren. Die planimetrische Fleckenauswertung zeigte bis 250 /Ug Fehler von weni¬
ger als - 10 Prozent. Deckers u. Schreibtr (8) trennten in ihrer elektro-
phoretischen Arbeit Scopolamin und Atropin. Die Autoren stellten bei Mengen von
30-150 Aig eine gute Ueberemstimmung zwischen Fleckengrosse und Alkaloidkon-
zentration fest. Hakim u. Mirimanoff (9) stellten bei den SolanaceenUnk-
turen fest, dass sehr saure oder sehr alkalische Reaktion zur guten Trennung not¬
wendig ist. Die Tinkturen wurden alb solche oder nach Isolierung der Alkaloide
I.A. Bettschart, Diss. No. 2408 ETH Zurich (1954)2. H. Brauniger u. G. Borgwardt, Pharmazie 8, 909 (1953)3. J. Reichelt, Pharmazie^, 968 (1954)4. O.E. Schultz u. D. Strauss, Arzneimittelforschg 5, 342 (1955)5. V.E. Krogerus u. L. Tuderman, Eripainos Suomen Apteekkarivh-
distyksen Aikakauslehdesta 16, 245 (1954)6. D. Gore u. I. Adshead, J.Pharm.Pharmacol. _4, 803 (1952)7. W. Klementschitz u. P. Mathes, Sci.pharm. _19, 235 (1951)8. W. Deckers u. J. Schreiber, Naturwiss. 40, 553 (1953)9. A. Hakim u. A. Mirimanoff, CotnbuUon à l'étude des incompati¬
bilités de quelques teintures. Diss. No.
1180 Université Genève (1951)
- 62-
aus der Tinktur Chromatographien, wobei meist gute Trennungen erreicht wur¬
den. Die Verfasser geben an, das s in den Tinkturen als Hauptalkaloide Atropinund Scopolamm nachgewiesen wurden. Eine Auftrennung des Atropins in die d-
und 1-Form gelang ihnen jedoch nicht. Anderseits fanden sie in den Tinkturen
zwei bis drei weitere, nicht identifizierbare Alkaloide. Das papierchromatogra-
phische Verhalten von Belladonna-Urtinktur und Tinctura Belladonnae DAB 6 un¬
tersuchte Lang (1). Mit 70-proz. Alkohol als mobile Phase erhielt er folgen¬des Bild:
UV Tct. Urtct.
„ , . Rf-Wert R,-Wert
Sodalosung i fZone
Tageslicht
Sodalosung
1
2
3
grun grün
« gelblich
4 — gelblich
5 — schw. gelb
6 — schw. gelb
— 0,0 0,0
hellblau 0,07
hellblau 0,47 0,48
intensiv
gelb 0,55 0,55
intensiv
grünblau 0,68 0,66
intensiv
grünblau 0,75 0,73
Die Identität der einzelnen Alkaloidflecke wurde nicht bestimmt. Zone 2 konnte in der
Urtinktur nicht gefunden werden. Abschliessend seien noch folgende Arbeiten erwähnt
(2 - 23).
1. W.Lang, Dtsche Apoth.Ztg. 91, 125(1951)2. L.R. Goldbaum, L. Kazyak, Anal.chem. j!8, 1289 (1956)3. A. Aziz, A. Rahman, Proc.pharm.soc.Egypt (1956)4. S.M. Blang, Drug Standarts 23, 143 (1955)5. H. Schriftman, A.A. Condirtzer, J.Amer.Pharm.Assoc. ib, 173 (1957)6. T.J. Quinn, J.G.Jeffrey, W.C. McAulay, J.Amer.Pharm.Assoc. £6,384 (1957)7. F.Abaffy, S.Kveder, Acta Pharm.Jug. 6, 207 (1956)'8. B. S re pel, Acta Pharm.Jug. b, 39 (1956)9. St. Vach, F. Horak, Pharmazie_12, 38 (1957)
10. K.Krebs, A. Wankmüller, Naturwissenschaften 40, 623 (1953)11. C.B. Marmi-Bettolo, J.A. Coch Frugoni, II Farmaco _12, 329 (1957)12. C.B Marini-Bettolo, J.A. Coch Frugoni, Gaz.Chim.lt. 86, 1324 (1956)13. K. Macek, J. Hacapercova, B. Kakac, Pharmazie 11, 533~Tl956)14. J. Reichelt, M.Sarsunova, Pharmazie 13, 21, 24(1958)15. M. Deffner, A. Is sidondes-Deffner, J.Amer.Pharm.Assoc.47,843 (1958)16. D.I. French, M.R. Gibson, AnalyUc.Chem. J29, 1166 (1957), C 129,7207 (1958)17. R. Bonnichsen, A.C. Moehly, S. Nordlander, Acta ehem.scand.II,1280 (1957)18. R.Paris, G. Faugeras, Ann.pharmac.franç. 14,537 (1956),
Fac.Pharmac.Pans,_13,359 (1955), Z.anal.Chem. 158,143 (1957)19. H. Schindler, M. Herb, Naturwissenschaften£3, 83 (1956)20. G. Nadeau, Chn.Chemistry, 2, 347 (1956), HÔp.Samt-Michel Archange,
Mastai Quebec, Z.anal.Chemie _157, 234 (1957)21. A.R. Poggi, F.Mattu, M.Alquati, Chemica Müano, N.S _H,245,277 (1955)22. D.H. Cox, Amer.J.Vetenn. Res.Jji, 929 (1957)23. Q.E. Beiles, H.W. Sievert, J.Lab.clm.Med. 46, 628 (1955)
- 63-
Trotz der Fülle der Untersuchungen über die papierchromatographische
Trennung von Solanaceen-Alkaloiden blieb vor allem ein Problem ungelöst, die
Trennung von Atropin und Hyoscyamin, d.h. die eindeutige Aufspaltung von d-
und 1 -Hyoscyamin.
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung
Chromatographie i verfahren A (Verwendung des organischen Losungs¬
mittels als mobile Phase). Zum Nachweis wird Dragendorff's Reagens verwendet.
Einfluss der Reaktion auf die Verteilung der Solanaceen-
Alkaloide: Unter Einhaltung der vorstehend beschriebenen Versuchsan¬
ordnung untersuchten wir bei den Solanaceen-Alkaloiden den Einfluss der Re¬
aktion auf die Verteilung. Die Chromatographiepapiere wurden auf verschiede¬
ne pH-Werte zwischen 3,0 und 7,0 gepuffert. Die erreichte Verteilung der Al-
kaloide las st sich der Figur 8 entnehmen. Samtliche Rf-Werte nehmen mit stei¬
gendem pH, allerdings wenig einheitlich, zu. Bei Atropin, Hyoscyamin, Homatro-
pin und Tropin ist die Zunahme gleichmassig gering, bei Scopolamin und Apo-
atropin besonders stark gegen die neutrale Reaktion hin.
Ein Vergleich der Rf- und pK-Werte der untersuchten Alkaloide las st
keine Zusammenhange erkennen.
Die optimale Auftrennung der Solanaceen-Alkaloide erhielten wir bei der
Pufferung der Papiere auf einen pH 6,6 (Fig. 9). Eindeutig getrennt erschienen
Tropin, Homatropin, Atropin, Scopolamin und Apoatropm, wahrend mit Isobu -
tanol + Toluol + Wasser als mobile Phase keine Trennung von d- und 1-Hyoscya-
min zu erreichen war.
Verschiedene Beobachtungen liessen erkennen, dass sich fur schwer was¬
serlösliche, in organischen Lösungsmitteln gut lösliche Substanzen die soge¬
nannte "echte Verteilungschromatographie mit umgekehrten Phasen" als brauch¬
bar erwiesen hat. Tschesche, Grimmer u. Seehofer (1) benutzten
1. R. Tschesche, G. Grimmer u. Fr. Seehofer, B. 86, 1235(1953)
- 64 -
Fig. 8
Einfluss der Reaktion auf die Verteilung der Solanaceen-Alkaloide
APOATROPIN
SCOPOLAMIN
optimaler pH-Wert pK-Wert
10 04
7 94
ATROPIN 9 83
HYOSCYAMIN 10 00
HOMATROPIN 9 90
10 05
Fig. 9
Chromatogramm der Solanaceen-Alkaloide bei pH 6,6 (Verfahren A)
Rf-Wert
1 ATROPIN 0,18
2 HYOSCYAMIN 0,16
3 HOMATROPIN 0,08
4 SCOPOLAMIN 0,51
5 APOATROPIN 0,65
6 TROPIN 0,03
7 GEMISCH
-65-
diese Technik mit Erfolg bei manchen Glykosiden und ihren Abbauprodukten,
während Stoll u. RUegger (l) auf diese Weise die Trennung der Secale-
Alkaloide durchführten. Wir gingen deshalb dazu über, diese Modifikation auch
auf das Atropin-Hyoscyamin-Gemisch anzuwenden.
Fig. 10
Auftrennung von Atropin und Hyoscyamin bei pH 6,6 (Verfahren B)
Rf -Wert
1. d-HYOSCYAMIN 0,80
2 l- HYOSCYAMIN 0,56
3. ATROPIN
Wie das in Fig. 10 abgebildete Chromatogramm zeigt, gelingt es nach dem be¬
nutzten Chromatographierverfahren B, d- und 1-Hyoscyamin einwandfrei zu tren¬
nen. Es treten zwar relativ grosse Flecke, aber mit scharfer Umgrenzung auf.
Die Rf-Werte betragen 0,80 für d-Hyoscyamin und 0,56 für 1-Hyoscyamin.-Die¬
ses Verfahren eignet sich aber nur zur Trennung von Atropin und Hyoscyamin.
Die anderen Solanaceen-Alkaloide zeigen Schwanzbildung oder Ueberlagerung.
Das Prinzip der präparativen Auftrennung von dl-Basen mittels optisch
aktiven Säuren ist auch bei der Papierchromatographie auswertbar. Berlin-
gozzi (2) imprägnierte das Papier mit d-Kampfersulfosäure und trennte so die
optischen Antipoden von a-Aminophenylessigsäure. Da Stoll u.Hoffmann
(3) mit Erfolg Di-(p-toluyl)- £-weinsäure zur präparativen Auftrennung der
1. A. Stoll u. A. Rüegger, Helv.Chim.Acta 37, 1725(1954)2. S. Berlingozzi u. Mitarb., Sperimentale, Sec.Chim.Biol. 2, 89
(1951)3. A. Stoll u. A. Hoffmann, Helv.Chim.Acta 26, 925 (1943)
- 66-
stereomeren Secale-Alkaloide verwendeten, entschlossen wir uns, diese optisch
aktive Saure (lan=-195 in Azeton) auf ihre Eignung zur papierchromato-
graphischen Trennung von Alkaloid-Razematen zu überprüfen. Wir arbeiteten
nach folgender Vorschrift:
Chromatographlerverfahren C (mit einer optisch aktiven Saure)
Das in Fig. 11 wiedergegebene Chromatogramm beweist die erfolgreiche Tren¬
nung von Atropin in d- und 1-Hyoscyamin und zeigt, dass nach diesem Verfahren
gleichzeitig auch die Auftrennung von Apoatropin, Homatropin und Tropin gelingt.
Gute Trennungen werden erreicht durch Verwendung des Verfahrens B kombiniert
mit Punkt 3 des Verfahrens C.
Fig. 11
Trennung von Atropin in d- und 1-Hyoscyamin bei gleichzeitiger Auftrennung der
übrigen Solanaceen-Alkaloide
1 o:dI ATROPIN
| 1 d + l HYOSCYAMIN
Rf -Wert
0,19
2 7.0I| 2 1 - HYOSCYAMIN 0,29
3 o1
| 3 SCOPOLAMIN 0,52
4 o:& o1
1 4 GEMISCH 1 + 2 + 3
5Ç } CLÜ o oI TROPIN 0 03
| 5 d-HYOSCYAMIN.I-HYOSCYAMIN,SCOPOLAMIN, APOATROP 0,65
c) Die papierchromatographische Reinheitsprufung der Solanaceen-Alkaloide
Nachdem es gelungen war, die Alkaloide einwandfrei zu trennen, sollte es
im Prinzip möglich sein, geringe Mengen von Nebenalkaloiden als Verunreini¬
gungen in offizmellen Alkaloidsalzen im Sinne einer Grenzreaktion qualitativ zu
erfassen. Voraussetzungen hierfür sind genugende Empfindlichkeit der Nachweis -
reaktionen auf dem Chromatographiepapier und die Möglichkeit der einwandfreien
- 67 -
Papierchromatographie grosserer Alkaloidmengen (300 - 500 jag), von denen
sich sehr geringe Mengen Nebenalkaloide abtrennen lassen. Diese Verhaltnisse
würden gestatten, 0,5 - 1 % verunreinigende Nebenalkaloide nachzuweisen.
Die Empfindlichkeit des papierchromatographischen Nachweises hat schon
zahlreiche Autoren beschäftigt. (Munier u. Macheboeuf (1) geben all¬
gemein für Dragendorff' s Reagens 10-20 Aig an.) Die in der Literatur angege¬
benen Werte fur die Alkaloide haben wir in Tabellen zusammengestellt. Sie kön¬
nen nur einen ungefähren Anhaltspunkt geben, da sie nach verschiedenen Tech¬
niken und mit Reagenzien verschiedener Zusammensetzung bestimmt wurden.
Die widersprechenden Angaben in der Literatur über die Empfindlichkeit
des Alkaloidnachweises und die Notwendigkeit, die Empfindlichkeit unserer Chro-
matographierverfahren zu kennen, veranlasste uns, Alkaloidgrenzreaktionen, wel¬
che mit den wichtigsten Reagenzien gerade noch nachgewiesen werden können, zu
überprüfen. Zu diesem Zwecke trugen wir 3, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 200 und
250 Aig Alkaloid auf die Startlinie auf und chromatographierten genau nach den
Vorschriften der Verfahren. Der Nachweis der Alkaloidflecken erfolgte mit den
m den Tabellen angegebenen Reagentien, indem für ein Reagens 3 Papiere verwen¬
det wurden. Die Resultate, einheitlich fur die Verfahren A und B, sind in den Ta¬
bellen zusammengestellt.
Um bei einer Empfindlichkeit von 3 resp. 5 Aig 1 % fremde Alkaloide in
Alkaloidsalzen nachweisen zu können, müssen entsprechend 300-500 Aig Alkalo¬
ide chromatographiert werden. Es war deshalb zu untersuchen, ob derart ausser-
gewohnlich grosse Mengen ohne Nachteil (Aenderung der Rf-Werte, ungenügende
Abtrennung sehr kleiner von sehr grossen Alkaloidmengen, Deformation der Al-
kaloidflecke unter Bildung von Schwänzen und unscharfe Umrandungen) chromato¬
graphiert werden können. (Die Alkaloidsalze werden Punkt um Punkt streifenför¬
mig auf die Startlinie gegeben.) Die zahlreichen Erfahrungen lehrten, das s sich
diese Nachteile nicht bemerkbar machen, vielmehr war die einwandfreie Auftren¬
nung und der Nachweis so geringer Mengen Nebenalkaloide eindeutig möglich. Da¬
mit sind die Voraussetzungen zur Reinheitsprufung der Solanaceen-Alkaloide er¬
füllt.
1. R. Munier u. M. Macheboeuf, Bull.Soc.chim.biol. 31, 1146 (1949)
68 -
Tabelle 6
Empfindlichkeit des papierchromatographischen Nachweises der
Solanaceen-Alkaloide
Empfindlichkeit in /UgAlkaloid Dragen- Mandel- Zaffaroni- UV- Auto
dorffs-R. Reagens Reagens Nachweis
Atropin 20
20
10
3,5-8
10
10
(1)(2)(3)(4)(5)(6)
5 20 20 >200 (*)
Hyoscyamin 00,2
5-10
10
10
(?)(8)(5)(6)
5 20 20 »200 (*)
Scopolamin 4
30
20
3,5-810
10
(9)(1)(2)(4)(5)(3)
5 20 20 »200 C)
Apoatropin 5 (8)5 20 15 >200 (*)
Tropin 5 ca.
10
10
(5)(3)(6)
3 10 10 »200 (*)
Homatropin 5 20 20 '200 (*)
(*) = eigene Bestimmungen
Literatur s.S. 69
- 69-
Ein Vergleich der Empfindlichkeit der Reinheitsprilfungen nach der Ph.
Helv.V und nach der papierchromatographischen Methode ergibt für die Solana¬
ceen-Alkaloide, das s die letztere Methode kleinere Mengen Nebenalkaloide er-
fasst. Sie übertrifft vor allem die Prüfung auf schwerlösliche Alkaloidbasen
(Ammoniakfällung), aber auch die Leistungsfähigkeit der Schmelzpunktsbestim¬
mung als Reinheitsprüfung, der optischen Drehung und der titrimetrischen Be¬
stimmung.
Als Prüfungs vor Schriften für die Pharmakopoe können in
Aussicht genommen werden:
Atropinum sulfuricum Ph.Helv.V:
"1,00 ml Stammlösung (entsprechend 0,5 g) werden mit 1,00 ml weingei¬
stiger 10-proz. Kalilauge verdünnt.0,002 ml dieser Verdünnung (entsprechend
ca. 500 Aig) werden auf die Startlinie eines vorbereiteten Chromatographierpa-
pieres Whatman No. 1 aufgetragen und nach den Chromatographierverfahren A,
B oder C Chromatographien. Das mit Dragendorff s -Reagens entwickelte Chro-
matogramm darf nach dem Verfahren A nur einen Farbfleck vom Rf -Wert ca.
0,18, nach dem Verfahren B nur zwei Farbflecke vom Rf-Wert ca. 0,56
(l-Hyoscyamin) und 0,80 (d-Hyoscyamin) und nach dem Verfahren C nur zwei
Farbflecke vom Rf-Wert ca. 0,19 (d-Hyoscyamin) und ca. 0,29 zeigen."
1. V.E. Krogerus u. L. Tuderman, Eripainos Suomen Apteekkariyh-distyksen Aikakauslehdestä _16, 245 (1954)
2. W. Deckers u. J. Schreiber, Naturwiss. 40, 553 (1953)3. A. Romeike, Pharmazie 7, 496 (1952)4. J. Buchs, Rapport Hyoscyamine/Scopolamine dans des drogues contenant
des alcaloides de tropane, Wettbewerbs¬
arbeit des Fonds Golaz SAV. 1956
5. R. Hegnauer, Pharm.Weekbl. 86, 321, 805, 935(1951)6. K. Jetzsch, Sei .Pharm. 20, 2l6~{i952)7. R. Munier u. M. Macheboeuf, Bull.Soc.Chim.biol. ^1, 1146 (1949)8. A. Bettschart, Diss. No. 2408 ETH Zürich (1954)9. J.B. Schute, Pharm.Weekbl. £6, 201 (1951)
- 70 -
Hyoscyaminum sulfuricum Ph.Helv.V:
"1,00 ml Stammlösung (entsprechend 0,4 g) werden mit 1,00 ml Alkohol
verdünnt. 0,0025 ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 500 ^ug) werden auf die
Startlinie eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman No. 1 aufge¬
tragen und nach den Chromatographierverfahren A, B oder C chromatographiert.
Das mit Dragendorff's-Reagens entwickelte Chromatogramm darf nach allen Ver¬
fahren nur einen Farbfleck zeigen: für Verfahren A Rf-Wert ca. 0,16, für Ver¬
fahren B Rf-Wert ca. 0,56 und für Verfahren C Rf-Wert ca. 0,29."
Homatropiium hydrobromicum Ph.Helv.V:
"1,00 ml Stammlösung (entsprechend 0,05g) werden mit 1,00 ml Alkohol
verdünnt. 0,02 ml dieser Verdünnung, (entsprechend 500 Aig) werden auf die
Startlinie eines vorbereiteten Chromatographiepapieres Whatman No. 1 aufgetra¬
gen und nach dem Chromatographierverfahren A chromatographiert. Das mit
Dragendorff's-Reagens entwickelte Chromatogramm darf nur einen Farbfleck
vom Rf -Wert ca. 0,08 zeigen."
Scopolaminum hydrobromicum Ph.Helv.V:
"1,00 ml Stammlösung (entsprechend 0,025 g) werden mit 1,00 ml Alkohol
verdünnt. 0,04 ml dieser Verdünnung (entsprechend 500 ^ug) werden auf die Start¬
linie eines vorbereiteten Chromatographiepapieres Whatman No. 1 aufgetragen
und nach dem Chromatographierverfahren A chromatographiert. Das mit Dragen¬
dorff s-Reagens entwickelte Chromatogramm darf nur einen Farbfleck vom Rf-
Wert ca. 0,51 zeigen."
- 71 -
2. Coca-Alkaloide
a) Bisherige Untersuchungen
In der Gruppe der Coca-Alkaloide wurde meist nur das Verhalten des
Cocains untersucht. Vitte u. Boussemart (1) fanden für Cocain einen
Rf-Wert von 0,82 bei Verwendung von Butanol + Eisessig + Wasser (50+ 15 + 45).Dadurch konnten sie Cocain von Novocain u.a. differenzieren. Jam inet (2)trennte Cocainhydrochlond von den Hydrochlonden des Anaesthesins, Stovams,
Pantocains und des Novocains. Bei Verwendung von Isobutanol mit wassriger
Salzsaure gesattigt als mobile Phase ergab sich als Rf-Wert fur Cocainhydro¬chlond 0,83. Klements chitz u. Mathes (3) trennten mittels Methyl-
athylketon + Wasser + Pyridin + Aethylglykol + Ligroin vom Sdp. 95,1° (30+5+0,5+ 1,5+ 3,5) als mobile Phase Ecgomn (Rf = 0,00, Benzylecgomn (Rf = 0,53),Tropacocam (Rf = 0,75) und Cocain (Rf = 0,97). Ferner differenzierte Soli va
(4) auf gepuffertem Papier bei pH 4,0 mit Toluol + Butanol + Wasser (85+ 15+50)als mobile Phase Novokain (Rf = 0,01), Cocain (Rf = 0,15), Xylokain (Rf = 0,28),Pantokam (Rf = 0,48) und Percain (Rf = 0,86). Munier u. Macheboeuf (5)
beschäftigten sich bereits mit der Trennung der Coca-Alkaloide mit den glei¬chen mobilen Phasen, die sie bei der Trennung der Solanaceen-Alkaloide ver¬
wendeten. Der Trennungseffekt war aber gering. In einer weiteren Veröffent¬
lichung benchten die Verfasser über eine Trennung von Cocain (Rf = 0,77),Pseudococain (Rf = 0,87 - 0,88) und Tropacocam (Rf = 0,83 - 0,84). Sie gebrauch¬ten mit m/5 - m/10 primärem Kaliumphosphat gepuffertes Papier und als mobile
Phase Isopropanol + Wasser (3 + 1). Mit den mobilen Phasen n-Butanol + Amei¬
sensaure + Wasser (10+ 1+ 10), n-Butanol + Essigsaure + Wasser (40+ 10+50)
resp. n-Butanol + Propionsäure + Wasser (10+1+10) prüften Gore u. Ads-
head (6) die Reinalkaloide. Fur Cocain und Cocainhydrochlond fanden sie fol¬
gende Rf-Werte: Cocain (0,76 resp. 0,72 resp. 0,79), fur Cocainhydrochlond(0,00 resp. 0,66 resp. 0,69). Krogerus u. Tuderman (7) trennten Cocain
von anderen Alkaloiden mit den Systemen n-Butanol + Essigsaure + Wasser
(100 + 5, resp. 20 + 30 + Sättigung), n-Butanol + Ameisensaure (100 + 5, resp.
10, 20, 30), n-Butanol + Salzsaure (100 + 1, resp. 3,10, 20, 30), Isobutanol + Essig¬saure (100 + 5, resp. 30) und Isobutanol wassergesattigt. Mit n-Butanol wasserge¬
sattigt, sek. Butanol wassergesattigt und Isopropanol + Wasser (75 + 25) erhiel¬
ten sie ebenfalls Trennungen. Mit der zuletzt aufgeführten mobilen Phase erhiel¬
ten sie auf gepuffertem Papier (m/7-Monokaliumphosphat) fur Cocainhydrochlondeinen Rf-Wert von 0,86. Schultz u. Strauss (8) trennten in ihrem Analysen-
1. G. Vitte u. E. Boussemart, Bull.trav.soc.pharm.Bordeaux 88,181 (1951)2. F. Jaminet, J.pharm.Belg. 6, 81 (1951)3. W. Klementsclutz u. P. Mathes, Sci.pharm. 20, 65 (1952)4. M. Soliva, Diss No. 2452 ETH Zurich (1955)5. R. Munier u. M Macheboeuf, Bull.Soc.chim.biol. 33, 851, 1927 (1951)6. D. Gore u I Adshead, J.Pharm.Pharmacol. _4, 803 (Ï952)7. V.E. Krogerus u. L. Tuderman, Eripainos Suomen Apteekkanyh-
distyksen Aïkakauslehdesta _16, 245 (1954)8. O.E. Schultz u. D. Strauss, Arzneimittelforschg j>, 342 (1955)
- 72 -
gang Cocain mit Rf-Werten von 0,73, 0,84, 0,74, 0,74, 0,77 ebenfalls von
anderen Alkaloiden mit den verschiedensten mobilen Phasen (siehe Opium-Al-kaloide). Nach der Rundfiltermethode versuchten Caronna u. Bruno (l)eine Trennung mittels Aethyl- oder Methylamin zu erreichen. Mit Methylaminkonnten sie keinen Rf-Wert für Cocain erhalten, mit Aethylamin lagen die Rf-Werte von Cocain (0,84), Codein (0,88) und Atropin (0,87) nahe beieinander.
Hakim u. Mirimanoff (2) untersuchten das papierchromatographischeVerhalten von Tinctura Cocae Ph.Helv.V. Mit der mobilen Phase tert. Butyl-alkohol + n-Butanol + 20-proz. Schwefelsaure (25 + 25 + 15) fanden sie vier Sub¬
stanzen, die sich mit Dragendorffs-Reagens wie Alkaloide verhielten. Als Rf-Werte konnten fur diese nicht naher identifizierten Substanzen erhalten werden:
0,52, 0,70, 0,80, und 0,88. Die folgenden Autoren (3 - 11) haben sich ebenfalls
mit der Trennung der Coca-Alkaloide befasst.
Durch die Methode von Klements chitz u. Mathes (8) lassen sich
die wichtigsten Coca-Alkaloide auftrennen. Uns interessierte aber das Verhal¬
ten der Rj-Werte der Solanaceen-Alkaloide zu dem chemisch sehr nahe verwand¬
ten Cocain und Tropacocain.
Da uns zur Untersuchung nur Cocain und Tropacocain zur Verfügung stan¬
den, untersuchten wir auch das papierchromatographische Verhalten von Ex-
tractum Cocae Ph.Helv.V. Wir arbeiteten den Extrakt nach der Pharmakopoe-
Vorschrift fur^iie Gehaltsbestimmung auf und gaben die gereinigte weingeistige
Alkaloidlosung auf das Chromatographiepapier. In einem weiteren Versuch wur¬
den die Coca-Alkaloide mit Ammoniak aus dem Extrakt gefallt, mit Chloroform
ausgeschüttelt und auf das Chromatogramm aufgetragen. Die jeweils aufgetrage¬
nen Alkaloidmischungen betrugen ca. 500 Aig. Wie die Fig. 13a zeigt, konnten nach
beiden Arbeitsweisen nur drei Alkaloidflecken erhalten werden. Aus Leitchroma-
togrammen konnten immer Cocain und Tropacocain bestimmt werden, ebenso
konnte Cocain sicher von den Nebenalkaloiden abgetrennt und ermittelt werden.
Auffallend bei der Extraktuntersuchung ist der Startfleck neben dem sehr kleinen
1. G. Caronna u. S. Bruno, Il Farmaco K), 497 (1955)2. A. Hakim u. A. Mirimanoff, Diss. No. 1180 Université Genève (1951)3. L.R. Goldbaum, L. Kazyak, Anal.chem. j!8, 1289 (1956)4. V. Kastaneda, J. Chiriboga, Bol.Soc.Quim.Peru 22, 214 (1956)5. K. Macek, J. Hacapercova, B. Kakac, Pharmazie U_, 533 (1956)6. C.B. Marim-Bettolo, J.A. Coch Frugini, Il Farmaco_12, 329
7. C.B. Marmi-Bettolo, J.A: Coch Frugini, Gaz.Chim.Ital. £6,1324 (1956)
8. W. Klementschitz u. P. Mathes, Sci.pnarm. 20, 65 (1952)9. R.Bonnichsen, A.C. Maehly, S .No rdlander, Actachem.Scand.il,
10. G.Nadeau, Chn.Chemistry 2, 347 (1956) 1280(1957)11. Q.C.Belles, H.W.Sievert, J.Lab.clm.Med. 46, 628 (1955)
- 73 -
Cocainfleck und der grosse Fleck von Tropacocain. Ob der auf dem Startpunkt
zurückbleibende relativ grosse Fleck ein Nebenalkaloid oder das Verseifungs-
produkt Ecgonin ist, konnte nicht bestimmt werden. Da aber allgemein Substan¬
zen mit Hydroxyl-Gruppen kleinere Rf-Werte aufweisen (Tropin, Morphm,Co-
dein, Cephalein und Hydrastinin), neigen wir zur Ansicht, das s es sich hier um
Ecgonin handelt.
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung
Chromatographlerverfahren A: (Verwendung des organischen Losungs¬
mittels als mobile Phase). Der Nachweis der aufgetrennten Remalkaloide erfolgte
mit Dragendorff s-Reagens. Zur Auswertung des Chromatogramms von Coca-
Extrakt wurde zuerst unter dem UV betrachtet und hierauf mit Dragendorff s-Rea¬
gens entwickelt.
Einfluss der Reaktion auf die Verteilung der Coca-Alkaloide
Aus der Fig. 12 las st sich die Verteilung der Coca-Alkaloide auf von pH 3,0 bis
7,0 verschieden gepufferten Papieren ablesen. Die R^-Werte von Cocain und Tro¬
pacocain nehmen mit steigendem pH gleichmassig zu. Cocain ändert etwas starker
gegen die neutrale Reaktion hm. Zusammenhange zwischen pK- undRf-Werten sind
bei den untersuchten Coca-Alkaloiden nicht zu erkennen.
Die optimale Trennung unter sich und gegenüber den Solanaceen-Alkaloiden
konnte bei pH 6,6 erreicht werden.
- 74 -
Fig- "
Einfluss der Reaktion auf die Verteilung der Coca-Alkaloide
optimaler pH-Wert pK-Wert
1
Cocain 8.85
Tropacocain 9.51
Wie die Fig. 13 und 13a zeigen, sind die erhaltenen Rf-Werte von Cocain
und Tropacocain aus der Bestimmung der Reinalkaloide und des Extraktes
gleich. Nach unseren Erfahrungen lassen sich mit dem Chromatographierver-
fahren A bei verschiedener Reaktion die wichtigsten Coca- und Solanaceen-Al-
kaloide gut auftrennen.
-75-
Fig. 13
Chromatogramm der Coca-Alkaloide bei pH 6,6 (Verfahren A)
Rf - Wert
2 TROPACOCAIN 0,60
* COCAIN 0,82
3 GEMISCH
Fig. 13a
Chromatogramm von Extractum Cocae Ph.Helv.V, pH 6,6 (Verfahren A)
R(-W«rt
2,Q V. /
b
O o
O
1 COCAIN | 0,82
TROPACOCAIN | 0,60
2 EXTRACTUM
COCAE
76 -
c) Die papierchromatographische Reinheitsprüfung der Coca-Alkaloide
Anschliessend an die Trennung der Alkaloide bestimmten wir die Mindest¬
menge an Alkaloiden, die nach den verschiedenen Nachweismethoden noch er¬
fassbar sind. Die Angaben aus der Literatur und die von uns bestimmten sind in
Tabelle 7 zusammengestellt.
Tab. 7
Empfindlichkeit des papierchromatographischen Nachweises der
Coca-Alkaloide
Empfindlichkeit in Mg
Alkaloid Dragen-dorffs-R.
Mandel-
Reagens
Zaffaroni-
Reagens
UV-
NachweisAuto
Cocain 15
20
10
5 10 10 200
(1)(2)(3)(*)
Tropacocain 5 7 7 200 (*)
Um bei einer Empfindlichkeit von bug 1 % fremde Alkaloide im Cocain oder
Tropacocain resp. ihren Salzen nachweisen zu können, müssen 500/ag Chroma¬
tographien werden. Wird diese Menge Punkt neben Punkt kettenförmig auf die
Startlinie gegeben, so können solch grosse Mengen ohne Störungen chromato-
graphiert werden. Nach dieser Methode lassen sich auch kleine Mengen Neben¬
alkaloide gut abtrennen.
Der Vergleich der Empfindlichkeit der papierchromatographischen Me¬
thode mit den Ph.Helv.V - Vorschriften ergibt für die Coca-Alkaloide, das s die
erste Methode kleinere Mengen Nebenalkaloide erfasst. Sie übertrifft vor allem
die Prüfung auf schwerlösliche Alkaloidbasen (Ammoniakfällung) und die Kalium-
1. V.E. Krogerus u. L. Tuderman, Eripainos Suomen Apteekkariyh-distyksen Aikakauslehdestä _16> 245 (1954)
2. F. Jaminet, J.Pharm.Belg. 6, 81 (1951)3. R. Munier u. M. Macheboeuf, Bull.Soc.chim.biol. 31_, 1146 (1949)*) eigene Bestimmungen
- 77 -
permanganatprobe, aber auch die Leistungsfähigkeit der Schmelzpunktsbestim¬
mung als Reinheitsprlifung, der optischen Drehung und der titrimetrischen Be¬
stimmung.
Als Pharmakopöe-Prüfungs vo r seh rif ten können in Aussicht genom¬
men werden:
Cocainum Ph.Helv.V:
"1,00 ml Stammlösung (entsprechend 0,0225g) werden mit 1,00 ml Alkohol
verdünnt.0,05 ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 560^) werden auf die
Startlinie eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman No. 1 aufge¬
tragen und nach dem Chromatographierverfahren A chromatographiert. Das mit
Dragendorffs-Reagens entwickelte Chromatogramm darf nur einen Farbfleck
vom Rf -Wert ca. 0,82 zeigen."
Cocainum hydrochloricum Ph.Helv.V: (Cocainum nitricum Ph.Helv.V)
"1,00 ml Stammlösung (entsprechend 0,025 g werden mit 1,00 ml Alkohol
verdünnt. 0,04 ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 500 Aig) werden auf die
Startlinie eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman No. 1 autge¬
tragen und nach dem Chromatographierverfahren A chromatographiert. Das mit
Dragendorffs-Reagens entwickelte Chromatogramm darf nur einen Farbfleck
vom R.f-Wert ca. 0,82 zeigen."
- 78 -
3. Opium-Alkaloide
a) Bisherige Untersuchungen
Die Opium-Alkaloide waren mehrmals Gegenstand papierchromatographi-scher Untersuchungen. Macheboeuf u. Munier (1) beschrieben die Tren¬
nung von Morphin, Codein und Thebain mittels eines Gemisches von n-Butanol +
Eisesssig + Wasser (100 + 100 + 50). Die als Basen aufgesetzten Alkaloide wurden
gut getrennt. Die Autoren stellten aber fest, dass unter diesen Bedingungen Nar-
cotin und Papaverin nicht getrennt werden konnten. Ein ähnliches Verhalten zeig¬ten Codein und Cryptopin. Mit Butanol + Eisessig + Wasser (100 + 30 + Sättigung)erhielten sie ebenfalls eine gute Auftrennung für Morphin, Codein und Thebain.
Unter Verwendung von gepufferten Papieren und Propanol + Wasser (3 + 1) gelangihnen die Trennung des Thebains (Rf = 0,75 - 0,78) von Narcotin und Papaverin
(Rf =• 0,94-0,96). Schliesslich trennten sie Morphin, Codein, Thebain, Narcotin
oder Papaverin, indem sie das Papier in einer Salzlösung tränkten (m/2-Kalium-chlorid), die das gleiche Anion enthält, wie die mobile Phase. Bei der Verwendungvon mit Wasser unbegrenzt mischbaren mobilen Phasen wie Azeton + Wasser
(3 + 1) erhielten die Autoren eine Trennung von Morphin, Atropin und Scopolamin.Sie stellten dabei fest, dass der Wassergehalt solcher mobiler Phasen von Bedeu¬
tung ist für die Fleckenform und fordern einen solchen über 20 Prozent. Eine
gleichzeitige Auftrennung von Morphin und Codein neben Papaverin und Narcotin
gelang ihnen jedoch nach keiner der geprüften Methoden. Svendsen (2) be¬
richtete in seiner Veröffentlichung über die quantitative Bestimmung von Morphinaus Opium und über die Trennung des Morphins von anderen Alkaloiden. Als mo¬
bile Phase diente ihm Essigester + Ameisensäure + Wasser (10 + 1 + 3). Mit n-Bu-
tanol + Eisessig + Wasser (20 +2+10) untersuchte der Verfasser opiumhaltigeGalenica und Tetraponlösungen. Mittels Farbreagentien charakterisiert er die
teilweise getrennten Alkaloide. Eine Trennung von Narcotin und Papaverin gelangihm jedoch nicht. Mesnard u. Boussmart (3) prüften mittels Butanol +
Eisessig + Wasser (50 + 15 + 15) Injektionslösungen, die neben Morphin noch Sco¬
polamin, Spartein und Strychnin enthielten. Sie konnten alle Alkaloide papierchro-
matographisch identifizieren. Vitte u. Boussmart (4) untersuchten einen
angeblich Codein und Dionin enthaltenden Sirup mittels Papierchromatographie,da die üblichen Methoden zum Nachweis nicht genügten. Sie bewiesen aus der Flek-
kengrösse des Codeins, dass dieses entsprechend der Menge von Codein und Dionin
1. R. Munier u. M. Macheboeuf, Bull.Soc.chim.France 852 (1952)Bull.Soc.chim.biol. jll, 1154 (1949);
J32, 209 (1950) ; 33, 1925 (1951) ;
34, 213 (1952) ; J52, 904 (1950)2. A.B. Svendsen, Pharm Acta Helv. .26, 323 (1951)
Dans Tidsskr.Farmaci 26, 125 (1952)3. P. Mesnard u. E. Boussmart, Bull.trav.soc.pharm.Bordeaux 88,
175 (1950)4. G. Vitte u. E. Boussmart, Bull.trav.soc.pharm.Bordeaux 89,
83 (1951)
- 79 -
enthalten war. Jatzkevitz (1), Salvesen u. Paulsen (2), Wagner(3), Romano (4), Caronna u. Bruno "(5), Kaiser u. Jon (6) trenn¬
ten Opiumalkaloide, teilsynthetische Morphinabkommlinge, Spasmolytica und
andere Alkaloide ohne eine gleichzeitige Trennung von Papavenn und Narcotin
zu erhalten. Gore u. Adshead (7) prüften Reinalkaloide resp. deren Basen
und Salze mittels n-Butanol + Ameisensaure + Wasser (10 + 1 + 10), n-Butanol +
Essigsaure + Wasser (40 + 10 + 50), n-Butanol + Propionsäure + Wasser (10 + 1 +
10) als mobile Phasen. Sie stellten dabei fest, dass Alkaloidbasen und -salze ein
gleiches Wandern zeigen, z.B. Rf-Werte fur Codein (0,65, 0,42, 0,51) und Co-
deinphosphat (0,6J, 0,0, 0,0). Borke u. Krich (8) beschrieben eine Metho¬
de, nach welcher Glasplatten mit fluoreszierenden Stoffen bestrichen werden.
Diese Platten werden nach der papierchromatographischen Methode mit Dioxan
entwickelt. Das Verschwinden der Fluoreszenz zeigt die Lage der Alkaloide an.
Es wurden als Rf-Werte gefunden: fur Narcein 0,0, Morphin 0,38, Codein 0,62,
Papavenn 0,88, Narcotin 0,92. Schute (9) trennte Morphin von den übrigenOpiumalkaloiden mit Hilfe von 5-proz. Ammoniakwasser als mobile Phase.
Reichelt (10) untersuchte das papierchromatographische Verhalten von 12
natürlichen und teil synthetischen Opiumalkaloiden mittels Formamid als sta¬
tionäre Phase und Chloroform, Benzol oder einem Gemisch beider als mobile
Phase. Mit Chloroform + Benzol (2 + 3) werden die Alkaloide gut getrennt, nicht
aber Narcotin und Papavenn. Vidic (11) untersuchte die Opiumalkaloide und
Spasmolytica in forensischer Hinsicht. Er studierte den Einfluss der Saure und
des Wassers am System Butanol + Ameisensaure + Wasser (12 + 1 + 7). Er stell¬
te ein Absinken der Rf-Werte wahrend der ersten Tage fest und glaubt, die¬
ses Verhalten mit dem Grad der Sättigung des Dampfraumes im Chromatogra-phiertrog erklaren zu dürfen. Zur chromatographischen Trennung der Opiumal¬kaloide verwendeten Asahma u. Ono (12) n-Butanol + Ammoniak + Wasser
(50 + 9 + 15) als mobile Phase, und fanden als Rf-Werte für Narcein 0,58, Mor¬
phin 0,72, Codein 0,93, Narcotin 0,95, Papavenn 0,94. Schultz u. Strauss
(13) versuchten die Papierchromatograph1 e für einen Analysengang auszunützen.
Sie untersuchten zahlreiche Alkaloide des DAB 6 und des Erg.-B. 6 (u.a. Morphin,Codein, Papavenn und Narcotin) mittels der mobilen Phasen n-Butanol + Essig¬saure + Wasser (100 + 10 + 40), (100 + 20 + 53,5), (100 + 30 + 93,5), n-Butanol +
Ameisensaure + Wasser (120 + 10 + 70), (120 + 20 + 70) und n-Butanol + n/10 Salz¬
saure (50 + 50). Eine Trennung von Narcotin und Papavenn gelang indes mit keinem
1. H. Jatzkewitz, Z.phys.chem. 292, 94 (1953)2. B. Salvesen u. A. Paulsen, Medd.Norsk.Farm.Selsk. _15, 33 (1953)3. G. Wagner, Pharmazie _10, 470 (1955)4. C. Romano, Minerva Medicolegal _70, 172(1950)5. G. Caronna u S. Bruno, II Farmaco_10, 497 (1955)6. H. Kaiser u. H. Jon, Arch.Pharm. _59, 224 (1954)7. D. Gore u. I. Adshead, J.Pharm.Pharmacol. 4, 803 (1952)8. M.L. Borke u. E.R. Kirch, J.Amer.Pharm.Ass., Sci.Ed. 42, 627 (1953)9. J.B. Schute, Pharm.Weekbl._86_, 201 (1951)
ref. Dtsche Apoth.Ztg. 93, 153 (1953)10. J. Reichelt, Pharmazie_10, 234 (1955J"U.E. Vidic, Arzneimittelforschg. _5, 291 (1955)12. H. Asahina u. M. Ono, Uno-Berichte Genf, Juni (1955)13. O.E. Schultz u. D. Strauss, Arzneimittelforschung _5, 342 (1955)
- 80 -
der vorgeschlagenen Verteilungssystème. In der Arbeit wird ferner die Berech¬
nung eines Rf-Wertes beschrieben, der bei sich entmischenden mobilen Phasen
(n-Butanol + Salzsaure) zur Anwendung gelangt. Mit dem papierchromatographi-schen Nachweis von Opiumalkaloiden im Urin und tierischen Gewebe befasste
sich Mannering (1). Isoamylalkohol + konz. Ammomak + Wasser (10 + 1 + 5)ergab keine bessere Trennung als das viel verwendete Butanol + Essigsaure +
Wasser - Gemisch. Tuderman u. Krogerus (2) trennten verschiedene
Alkaloidsalze, u.a. Morphinhydrochlorid, Codeinphosphat und Papavennhydro-chlorid. Als mobile Phasen dienten n-Amylalkohol + Ameisensaure + Wasser
(100 +18 + 4) auf mit m/7 Kaliumphosphat gepufferten Papieren, als zweite mo¬
bile Phase Isopropanol + Wasser (75 + 25). Als Rf-Werte fanden sie für Morphin¬hydrochlorid = 0,16, filr Codeinphosphat = 0,33 und fur Papavennhydrochlorid =
0,94. Krogerus, Rautiainen u. Westerlund (3) trennten mittels
Dioxan + Ameisensaure + Wasser (90 + 0,5 + 9,5) Narcotin (Rf = 0,89) und Papa¬verin (Rf = 0,77) nicht aber Codein (Rf = 0,21) und Morphin (Rf = 0,17). Wird als
zweite mobile Phase in der gleichen Richtung essigsaurer Aether verwendet, so
werden Morphin (Rf = 0,52) und Codein (Rf = 0,63) nachträglich getrennt. Mit es¬
sigsaurem Aether als mobile Phase trennten sie ebenfalls Papaverin (Rf = 0,53)und Narcotin (Rf = 0,85). Curry u. Powell (4) überprüften Alkaloidfraktio-
nen bei toxikologischen Untersuchungen und fanden mit dem System n-Butanol +
Wasser + Zitronensaure (5+5+1) auf mit primärem Natnumzitrat gepuffertemPapier als Rf-Werte fur Morphin 0,12, Codein 0,16, Narcotin 0,47 und Papaverin0,48. Thies u. Reuther (5) verhindern die Entstehung von Ester im Lo-
sungsmittelgermsch Butanol + Eisessig + Wasser durch Zusatz des entstehenden
Esters. Er setzt die Rf-Werte herab und verbessert die Trennbarkeit der Alka-
loide erheblich. Mit der mobilen Phase Butylazetat + Butanol + Eisessig + Wasser
(85 + 15 + 30 + Sättigung) trennten sie Papaverin (Rf = 0,57) von Narcotin (Rf =
0,70). Pfeifer (6) gibt eine Methode zur Trennung der wichtigsten Mohnalka-
loide. Zunächst werden auf gepuffertem Papier vom pH 5,5 (Zitratpuffer) Morphin(Rf = 0,16), Codein (Rf = 0,23), Thebain (Rf = 0,61) und Narcem (Rf = 0,61) unter¬
einander und von Narcotin (Rf = 0,91) und Papaverin (Rf = 0,92) getrennt. Die letz¬
teren werden anschliessend mit ammoniakahschem Aether nach der Methode von
Matthias (7) aufgeteilt. Haus sermann (8) trennt mit einer wassrigen
Elektrolytlosung (250 g Ammonsulfat, 250 ml 2 n-Salzsaure, Wasser ad 1000 ml)Narcotin und Papaverin, mcht aber Morphin und Codein mit den folgenden Rf-Wer-ten: Narcotin 0,43 - 0,45, Papaverin 0,26 - 0,29, Morphin 0,68, Codein 0,67 -
0,69, Thebain 0,47 und Narcem ca. 0,4. Die Versuche von Bettschart (9)
1. G.J. Mannering, A.C. Dixon, N.V. Caroll u. O.B. Cope,chn.Med. 44, 292 (1952)
2. V.E. Krogerus u. L. Tuderman, Eripainos Suomen Apteekkanyh-
distyksen Aikakauslehdesta 16, 245 (1954)3. V.E. Krogerus, I. Rautiainen u. R. Westerlund, Suomi Kemis
^8, 117 (1955); Medd.fra Norsk Farm.Selsk.
_17, 198 (1955)4. A.S. Curry u. H. Powell, Natuie (London) 173, 1143 (1954)5. H. Thies u. F.W. Reuther, Naturwissenschaften^]., 230 (1954)6. S. Pfeifer, Sci.Pharm. 24, 84 (1956)7. W. Matthias, Naturwissenschaften 41, 17(1954)8. H. Haus sermann, Arch.Pharm., Ber.dtsch.pharm.Ges. 289, 303 (1956)9. A. Bettschart, Diss. No. 2408 ETH Zürich (1954)
- 81 -
zur papierchromatographischén Trennung der Opium-Alkaloide waren grundle¬
gend für unsere Untersuchungen. Er trennte mit wassergesättigtem Aether auf
mit m/2-Zitronensäure-Phosphatpuffer vom pH 3,8 behandeltem Papier Narcotin
(Rf = 0,63) und Papaverin (Rf = 0,18). Nach dieser Methode gelang ihm die Tren¬
nung der anderen Alkaloide nicht. Bei Pufferung auf pH 7,4 trennte er mittels
Aethylazetat wassergesättigt Nàrcein (Rf = 0,0), Morphin (Rf = 0,05), Codein
(Rf = 0,26), Thebain (Rf = 0,82), Laudanin (Rf = 0,76), Laudanosin (Rf = 0,83) und
Cryptopin (Rf = 0,67). Mit wassergesättigtem n-Butanol erhielt er auf gleich ge¬
puffertem Papier bei pH 6,8 folgende Rf-Werte : für Morphin 0,38, Codein 0,56,Narcein 0,74, Laudanin 0,81, Cryptopin 0,81, Thebain 0,84, Narcotin und Papave¬rin 0,96. Versuche mit anderen mobilen Phasen, wie Benzol, Mischungen von Bu-
tanol und Aether oder Chloroform ergaben schlechtere Trennungen. Graf u.
List (1), Mariani (2) und Burma (3) trennten Narcotin und Papaverin in
neuerer Zeit papierelektrophoretisch. Hörhammer u. Leue (4) untersuch¬
ten mit n-Butanol + Essigsäure + Wasser (4+1 + 5) Tinctura Opii simplex DAB 6.
In unter dem UV ziemlich gut reproduzierbaren Chromatogrammen fanden sie
fünf Zonen
blau 0,86
blau 0,74
0,71
hellblau 0,57
0,15
Die folgenden Autoren (5 - 48) haben sich ebenfalls mit der Trennung der Opium-alkaloide befasst.
Trotz vielfacher Untersuchungen Über die papierchromatographische Tren¬
nung der Opiumalkaloide blieb die gleichzeitige Trennung der wichtigsten Opium-alkaloide (Morphin, Codein, Thebain, Narcein, Narcotin, Papaverin und Cryptopin)in einem Arbeitsgang auf dem gleichen Chromatogramm ungelöst.
b) Verfahren zur Papierchromatographischen Auftrennung
Chromatographierverfahren A: (Verwendung des organischen Lösungs¬
mittels als mobile Phase). Der Nachweis der aufgetrennten Reinalkaloide erfolgte
durch Beobachtung unter UV und mittels Dragendorffs-Reagens. Betts chart (48)
trennte mit dem apolaren Aether Narcotin und Papaverin und mit dem polaren Bu-
tanol die anderen Opiumalkaloide ausser Papaverin und Narcotin. Die von ihm ver¬
wendete Mischung Butanol-Aether (polar-apolar) führte zu keinem Erfolg, weil
Entmischung der beiden Lösungsmittel auftrat infolge zu grosser Unterschiede im
spez. Gewicht und in den Siedepunkten. Wir suchten daher nach einem Lösungsmit¬
telpaar, das ähnliche Siedepunkte besitzt. Nach vielen Versuchen fanden wir dann
Isobutanol + Toluol + Wasser (50+50 + gesättigt) als die für viele Trennungen ge¬
eignete mobile Phase.
Lit. 1-48 siehe Seite 81 a
- 81 a -
1. E.Graf u. H.P.List, Arzneimittelforschg. 4, 450 (1954)2. A.Mariani, Pharm.Weekbl. 90, 125 (1955)3. D.Burma, Naturwissenschaften 41, 19(1954)4. L.Hörhammer u. K.W.Leue, Arch.Pharm. 288, 377 (1955)5. P.Berkès -Tomas evic, M.Kalpakdzijan, Ber.Chem.Ges.Belgrad 20,
6. Ch.L.Brown, P. L. Kirk, Mikrochim.Acta 1957, 720 523 (Ï955)7. L.R.Goldbaum, L.Kazyak, Anal.Chem. 28, 1289 (1956)8. M.Schmall, E.G.Wollish, E .G.E .Shaffer, Anal.Chem.28,1373 (1956)9. H.Thiess, CI.Sorgenfrey, F.W.Reuther, Naturwissensch. £2, 605
10. G.Csoban, I.HegedUs, Magyar Kemiai Fol. 60, 4 (1954) (1955)11. R.Miram, S.Pfeifer, Pharm.Zhalle 96, 457 (Ï957)12. S.M.Blang,' Drug Standarts 23, 143 (1955)13. H.Jatzkewitz, L.Lenz, Hoppe-Seylers Ztschr.physiol.Chem. 305,53 (1956)14. A.B.Svendsen, A.Paulsen, Medd.norsk.farmac.Selsk. J7, 1167Î955)15. A.Bossi, O.Häfliger, O.Schnider, Arzneimittelforschg. 5, 62 (1955)16. A.Resplandy, Ch.Saumier, C.R.Séances Acad.Sci.Paris, 239, 496 (1954);
241, 65 (1955) ; Compt.rend.Acad.Sci. J38, 2527 (1954)17. W.Grassmann, K.Hannig, Dtsch.med.Wschr. J76, 333 (1951)18. V.M.Palmieri, C.Romano, Arch.It.Sci.farmacol. L7, 345 (1952)19. A.Aziz, A.Rahman, Arch.Pharm. 290, 321 (1957)20. G.Thomas, P.Roland, Ann.Pharmac.franç. 12, 318 (1954)21. E.Graf, D.List, Arzneimittelforschung £, 450 (1954)22. G.Panopoulos, A. A. Va s silion, Praktica, Akad.Athen 29, 140 (1954)23. J.L.Lach, D.M.Patel, S.M.Blang, J.Amer.Pharm.Assoc. 45, 611 (1956)24. W.Kuhn, Madjallah Pharmasi J., 122 (1955)25. D.P.Burma, Naturwissenschaften 41, 19(1954)26. V. Vukcevic-Kovacevic, J.Bican-Fis ter, Acta Pharmac.Jugosl. X 185
27. A.A.Rahman, Arch.Pharm. 288, 53 (19jo) (1953)28. R.A.Seibert, C.E.Williams, R.A.Huggns, Science 120, 222 (1954)29. A.C.G.Lindblad, A.Agren, Farm.Revy 53, 69 (1954)30. Th.Wieland, E.Fischer, Naturwissenschaften j$5, 29 (1948)31. G.B.Marini-Bettolo, J.A.Coch Frugoni, Gaz.Chim.Ital.^6,1324(1956)32. R.Fischer, N.Otterbeck, Sci.Pharm. 2b, 242 (1957)33. G.Panopoulos, A. L. Vas siliou, Akad.Athenon. 31,119(1956)
C _129, 4268 (1958)34. H.Baggesgaard Rasmussen, J.Berger, K.Folting og G .E s per s en,
Dansk T.Farm. 32, 81 (1958)35. V.E.Krogerus, J.Tuovinen, Farmac.Nitisbl. ^6,139 (1957),
C _129, 3975 (1958)36. J.Holubek, S.Kudrnac u. M.Novak, Pharmazie 13, 95 (1958)37. R.Miram u. S.Pfeifer, Sc.pharm. 26, 22, 153 (1958j~38. M.Deffner, A .1 s s idorides-Deff ner, J.Amer.Pharm.Assoc. 47,343 (1958)39. J.Reichelt, M.Sarsunova, Pharmazie K3, 21, 24 (1958)40. J.Jakubec, V.Laskova, E.Kamova, Farmacia Bratislava 25, 137 (1956)41. F.Sabon, H.Grignon, A.Viala, Trav.Soc.Pharmac.Montpellier 15,
123 (1955) ; Algerien, Fac.de Méd. et de Pharm.
42. R.Bonnichsen, A.C.Maehly, S .Nordlander, ActaChem.Scand.il,
43. J.Erben, Diss. Karls Univ., Prag (1949) 1280 (1957)44. T.Kariyone, T.Inoue, J.pharmac.Soc.Japan, 76, 625 (1956)
Z.anal.Chem. _U>7, 237 (1957)45. G.Nadeau, G .Sobolew ski, L.Fiset, C.G.Farmilo, J.Chrom.J.,32746. A.Jermstadt, Ann.pharmac.franç. ^3, 57 (1955) (1958)47. Q.C.Beiles, H.W.Sievert, J.Lab.clin.Med. 46, 628 (1955)48. A.Betts chart, Diss. No. 2408, ETH Zürich (1954)
-82-
Einfluss der Reaktion auf die Verteilung der Opium-Alkaloide
Die Chromatographiepapiere wurden auf verschiedene pH-Werte zwischen 3,0 und
7,0 gepuffert. Die erreichte Verteilung der Alkaloide nach dem Chromatographie¬
verfahren A lässt sich aus Fig. 14 entnehmen.
Sämtliche Rf-Wene nehmen mit steigendem pH zu. Narcotin und Papaverin
zeigen eine besonders grosse Zunahme zwischen pH 3,0 und 4,0. Thebain steigt
gleichmässig über den ganzen untersuchten pH-Bereich. Morphin, Codein und Cryp-
topin naben stark steigende Rf-Werte gegen die neutrale Reaktion hin. Das in die¬
ser Tabelle der Uebersichtlichkeit wegen nicht aufgezeichnete Narcein (pK-Werte
2,77 und 9,49) zeigt bis pH 5,8 einen über Thebain liegenden Rf-Wert, der gleich¬
mässig mit Thebain ansteigt. Bei einem pH über 5,8 (Pufferwechsel) sinkt der
Fig. 14
Einfluss der Reaktion auf die Verteilung der Opium-Alkaloide(Verfahren A)
optimaler pH-Wert
Thebain
optimaler pH-Wert
ohne Narcotin od. Papaverin
Narcotin 6,6Papaverin 6,36
8,46
Cryptopin 8,58
Codein 8,26
Morphin 8,22
9,29
pK-Wert
-83-
Rf-Wert unter denjenigen von Thebain (pH 7,0 = Rf-Wert 0,49). Ein Vergleich
der Rf-Werte und pK-Werte der untersuchten Alkaloide las st keine Zusammen¬
hänge erkennen. Die optimale Auftrennung der Opiumalkaloide erhielten wir bei
einer Pufferung der Papiere auf ein pH von 3,5 (Fig. 15). Eindeutig getrennt er¬
scheinen Morphin, Codein, Cryptopin, Thebain, Narcein, Papaverin und Narcotin.
Fig. 15
Auftrennung der Opium-Reinalkaloide bei pH 3,5 (Verfahren A)
1 o 1. MORPHIN
2 o 2. CODEIN
3 o 3 CRYPTOPIN
4 o 4. THEBAIN
5 CP 5 NARCEIN
6 o 6. PAPAVERIN
7 o 7. NARCOTIN
8 ooo oo oo 8. GEMISCH
0,39
0,47
Wird Narcotin in Chloroform gelöst aufbewahrt, so zeigen sich auf dem Chroma-
togramm ein Dragendorff-negativer, aber im UV blau aufleuchtender Fleck mit
dem Rf-Wert von 0,048. Wird nicht auf Narcotin oder Papaverin geprüft, so schla¬
gen wir eine Trennung bei pH 6,6 vor. Die Reihenfolge der Alkaloide lautet dann:
Morphin, Codein, Cryptopin, Narcein, Thebain, Narcotin oder Papaverin.
Nach dieser Methode und bei pH 3,5 trennten wir Opialum Ph.Helv.V
(Morphin-, Codein-, Thebain-, Narcotin-, Papaverin- und Narceinhydrochlorid).
Zur Auftragung gelangte 500 Mg Opial, das in kleinsten Mengen Punkt neben Punkt
auf die Startlinie gebracht wurde. Durch diese Massnahme erhielten wir breitere
Flecken, die kompakter waren und eine eindeutige Feststellung erlaubten (Fig. 16).
- 84 -
Fig. 16
Chromatogramm der Opium-Alkaloide aus Opialum Ph.Helv.V bei pH 3,5
(Verfahren A)
Rf-Wert
1. MORPHIN 0,04
2. CODEIN 0,10
3. THEBAIN 0,40
4. NARCEIN 0,48
5. PAPAVERIN 0,77
6. NARCOTIN 0,87
7 OPIALUM
Weiter untersuchten wir Extractum Opii Ph.Helv.V nach der glei¬
chen Methode bei pH 3,5. Wie aus Fig. 17 ersichtlich ist, konnte kein Narcein ge¬
funden werden; auch bei der UeberprUfung des Extraktes über den ganzen pH-Be¬
reich von 3,0 bis 7,0 bestätigte sich dieser Befund. Eine entsprechende Ueberprü-
fung von Pantopon (Roche) Hess ebenfalls kein Narcein erkennen. In beiden Opium¬
präparaten konnten wir keine weiteren Alkaloide nachweisen.
Fig. 17i£
Chromatogramm aus Extractum Opii Ph.Helv.V bei pH 3,5 (Verfahren A)
o
o
o
ooo
o
o
Rf-Wert
1. MORPHIN 0,029
2. CODEIN 0,098
3. CRYPT0PIN 0,15
4. THEBAIN 0,39
o 5. PAPAVERIN 0,78
o 6. NARCOTIN 0,88
OCD 7. EXTRACTUM
OPII
-85 -
In der folgenden Tabelle sind sämtliche Rf-Werte zusammengestellt, wie
sie bei der Untersuchung der Reinalkaloide, des Opials und des Opiumextraktes
gefunden wurden. Sie zeigen eine gute Uebereinstimmung, was ein weiterer Be¬
weis dafür ist, dass sich nach unserem Verfahren konstante Rf-Werte erreichen
lassen.
Alkaloid Reinalkaloide Opial Opiumextrakt
Morphin 0,03 0,04 0,029
Codein 0,09 0,10 0,098
Cryptopin 0.15 - 0,15
Thepain 0,39 0,40 0,39
Narcein 0,47 0,48 -
Papaverin 0,76 0,77 0,78
Narcotin 0,86 0,87 0,86
c) Die papierchromatographische Reinheitsprüfung der Opium-Alkaloide
Nachdem die Trennung der Alkaloide gelungen war, bestimmten wir die
Mindestmengen an Alkaloiden, die mit den verschiedenen Nachweismethoden noch
zu erfassen waren. Tabelle 8 gibt die in der Literatur angegebenen Werte und die
von uns bestimmten wieder.
Ein Vergleich der Empfindlichkeit der ReinheitsprUfungen nach der Ph.
Helv.V und nach der papierchromatographischen Methode ergibt für die Opium-
alkaloide, dass die Ph.Helv.V - Vorschriften kleinere Mengen Nebenalkaloide er¬
fassen, ohne dieselben aber zu differenzieren (Schwefelsäureprobe, Berlinerblau¬
reaktion und Benzollöslichkeit). Die papierchromatographische Methode Übertrifft
aber vor allem die Ph.Helv.V-Vorschriften bei Alkaloidmischungen wie Opialum
Ph.Helv.V, Pantopon, Tetrapon und Opium-Galenica und die Leistungsfähigkeit der
Schmelzpunktsbestimmung und der titrimetrischen Gehaltsbestimmung als Rein¬
heitsprüfung.
Auch bei den Opium-Alkaloiden können grosse (1500 yug) von kleinen Alkaloid-
mengen (5-20 «g etc.) chromatographisch getrennt werden, wie dies bei Opialum
Ph.Helv.V gezeigt wurde.
-86-
Tabelle 8
Empfindlichkeit des papierchromatographischen Nachweises der Opium-Alkaloide
Alkaloid Dragen-dorffs-R.
Mande
reagei
Morphin 5
5
60
5
5
20
20
Codein 5
30
5
20
15
Thebain 5
5
20
15
Narcotin 5
5 20
5 15
Narcein 5
>50**
>20***
20
15
Papaverin 5
15
5 20
5 15
Cryptopin 5
5
20
20
Empfindlichkeit in Aig
Zaffaroni-
reagens
10
10
10
10
Kiefer¬
reagens
1
0,5
1
UV-
Nachweis
50
10
30
200
100
100
20
20
15
50
50
0,5< 20
3
50
Autor
(1)(2)(3)(4)C)
(2)(3)(*)
(2)(*)
(5)(2)(6)C)
(2)(*)
(5)(3)(2)(6)(*)
(2)C)
1. H. Kaiser u. H. Jori, Arch.Pharm. 287, (1954)2. A. Bettschart, Diss. No. 2408 ETH Zürich (1954)3. V.E. Krogerus u. L. Tuderman, Eripainos Suomen Apteekkariyh-
distyksen Aikakauslehdestä_16, 245 (1954)4. A.B. Svendsen, Pharm.Acta Helv. J26, 323 (1951)5. H. Häussermann, Arch.pharm. 303 (1956)6. R. Munier u. M. Macheboeuf, Bull.Soc.chim.biol. _31, 1146(1949)
(*) eigene Untersuchungen
**pH unter 5,8
***pH über 5,8
- 87 -
Als Pharmakopoe-Vor Schriften können in Aussicht genommen
werden:
Morphinum hydrochloricum Ph.Helv.V:
"1,00 ml Stammlösung (entsprechend 0,035 g) werden mit 1,00 ml Alkohol
verdünnt. 0,03 ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 525 /ug) werden auf die
Startlinie eines vorbereiteten Chromatographierpapiers Whatman No. 1 aufgetra¬
gen und nach dem Chromatographierverfahren A chromatographiert. Das mit Dra-
gendorff- oder Kiefer-Reagens entwickelte Chromatogramm darf nur einen Farb¬
fleck vom Rf-Wert ca. 0,03 zeigen."
Codeinum Ph.Helv.V:
"0,125 g Codeinum (genau gewogen) werden in 5,00 ml Alkohol gelöst.
0,02 ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 500 Aig) werden auf die Startlinie
eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman No. 1 aufgetragen und
nach dem Chromatographierverfahren A chromatographiert. Das mit Dragen-
dorffs-Reagens entwickelte Chromatogramm darf nur einen Farbfleck vom Rf-
Wert ca. 0,09 zeigen."
Codeinum hydrochloricum resp. phosphoricum Ph.Helv.V:
"1,50 ml Stammlösung (entsprechend 0,06 g) werden mit 1,50 ml Alkohol
verdünnt.0,025ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 500 ^ig) werden auf die
Startlinie eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman No. 1 aufge¬
tragen und nach dem Chromatographierverfahren A chromatographiert. Das
mit Dragendorffs-Reagens entwickelte Chromatogramm darf nur einen Farb¬
fleck vom Rf-Wert ca. 0,09 zeigen."
Thebainum hydrochloricum Ph.Helv.V:
"1,00 ml Stammlösung (entsprechend 0,035 g) werden mit 1,00 ml Alkohol
verdünnt. 0,03 ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 500 ^g) werden auf die
Startlinie eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman No. 1 aufge¬
tragen und nach dem Chromatographierverfahren A chromatographiert. Das
mit Dragendorffs-Reagens entwickelte Chromatogramm darf nur einen Farb-
fleck vom Rf-Wert ca. 0,39 zeigen."
- 88 -
Narceinum hydrochloricum Ph.Helv.V:
"0,1 g Narceinhydrochlorid (genau gewogen) werden in 10,00 ml Methanol
gelöst. 0,05 ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 500 ^g) werden auf die
Startlinie eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman No. 1 aufge¬
tragen und nach dem Chromatographierverfahren A chromatographiert. Das
mit Dragendorffs-Reagens entwickelte Chromatogramm darf nur einen Farbfleck
vom Rf-Wert ca. 0,47 zeigen."
Narcotinum hydrochloricum Ph.Helv.V:
"1,00 ml Stammlösung (entsprechend 0,01 g) werden mit 3,00 ml Alkohol
verdünnt. 0,05 ml dieser Verdünnung (entsprechend 560 yug) werden auf die Start¬
linie eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman No. 1 aufgetragen
und nach dem Chromatographierverfahren A chromatographiert. Das mit Dragen¬
dorffs-Reagens entwickelte Chromatogramm darf nur einen Farbfléck vom Rf-
Wert ca. 0,86 zeigen."
Papaverinum hydrochloricum Ph.Helv.V:
"1,00 ml Stammlösung (entsprechend 0,01g) werden mit 1,00 ml Alkohol
verdünnt. 0,05 ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 500 Aig) werden auf die
Startlinie eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman No. 1 aufge¬
tragen und nach dem Chromatographierverfahren A chromatographiert. Das mit
Dragendorffs-Reagens entwickelte Chromatogramm darf nur einen Farbfleck vom
Rf-Wert ca. 0,76 zeigen. Ebenso darf bei UV-Betrachtung nur ein Fleck vom glei¬
chen Rf-Wert sichtbar sein."
- 89 -
4. Hydrastis-Alkaloide
a) Bisherige Untersuchungen
Bouchardy (1) untersuchte Hydrastis-Dialysat mit den mobilen Phasen
Aether + 5-proz. Ammoniak (4 + 1). Mit dieser Methode konnten fünf Zonen fest¬
gestellt werden (0,97 citronengelb, 0,73 bläulich, 0,73 gelb, 0,66 blauviolett und
0,47 blau). Mit Ammoniak + Alkohol + Chloroform (1 + 8 + l) wurden drei Zonen
unterschieden (0,66 gelblich, 0,66 blau und bis 0,66 goldgelb). Wird eine 5-proz.
Natriumkarbonatlösung als mobile Phase verwendet, so lassen sich wieder 5 Zo¬
nen beobachten, die ebenfalls Dragendorff-positiv sind (0,7 rosa, 0,54 blau, 0,42
gleb, 0,20 grau bis 0,20 goldgelb). Macheboeuf u. Munier (2) haben Tren¬
nungen durchgeführt mit Hydrastinin, Berberin, Spartenin, Chelidon und Cotarnin.
Sie beschrieben die verschiedenen Fluoreszenzfarben und das Verhalten gegen
Dragendorff s-Reagens. Bei der Untersuchung von Berberin- und Hydrastinin-Reinalkaloiden konnten sie in jedem Falle mehrere Flecken beobachten. Diese
Tatsachen versuchten sie durch Auftreten von tautomeren Formen mittels Ca-
nizzarro-Reaktion im alkalischen Milieu zu erklären. Die Inhalts Stoffe von Hy¬drastis canadensis (Berberin, Hydrastin, Hydrastinin und Canadin) wurden durch
Erbing u. Wulf (3) untersucht. Zum Nachweis der Alkaloide zogen die Auto¬
ren deren Fluoreszenz heran (Berberin: stark gelb, Canadin: gelblich, Hydrasti¬nin: blau, Hydrastin: bläulich). Da Hydrastin nicht sofort Fluoreszenz zeigt, son¬
dern erst nach einigen Tagen, nehmen die Autoren an, dass die gebildeten Oxy-
dationsprodukte,unter denen sich wahrscheinlich Hydrastinin befindet, die Fluo¬
reszenz bedingen. Mittels Collidin + Wasser trennten sie Berberin (Rf = 0,47)und Hydrastin (Rf = 1,0) von Hydrastinin und Canadin. Mittels 94-proz. Aethanol
als mobile Phase konnten sie gleichzeitig Canadin abtrennen. Bei der Elution trat
zunächst das gelbfluoreszierende Berberin auf. Es zeigte lange Schwanzbildung,
aus der das blaufluoreszierende Hydrastinin und das Hydrastin sich herauslöste.
Canadin konnte als zwischen Hydrastinin und Hydrastin liegende schwach gelbfluoreszierende Substanz festgestellt werden. Schultz u. Strauss (4) trenn¬
ten mit den verschiedenen Alkohol-Säuregemischen Alkaloide des DAB 6 und des Erg.B.zum DAB 6. Mit allen Systemen konnten runde Flecke mit den RfWerten 0,44, 0,58,
0,55, 0,44 und 0,49 erhalten werden. Aehnliche Rf-Werte zeigen mit diesen mobi¬
len Phasensystemen Morphin, Eukodal, Pilokarpin. Hörhammer u. Leue
(5) untersuchten Extractum Hydrastidis fluidum DAB 6. Sie fanden unter Verwen¬
dung von n-Butanol + Eisessig + Wasser (4+1 + 5) als mobile Phase folgendes
0,96 sehr breite Zone hell grün0,79 sehr breite Zone hell blau
0,70 sehr breite Zone grau blau
0,68 sehr breite Zone gelb0,55 sehr breite Zone gelb
1. M. Bouchardy, Pharm.Acta Helv. 26, 360 (1951)2. M. Macheboeuf u. R. Munier, Bull.Soc.Chim.blol. jü, 1151 (1949)3. H. Erbing u. W. Wulf, Kolloid.Ztg. 125, 99 (1952)4. O.E. Schultz u. D. Strauss, Arzneimittelforschg 5, 342 (1955)5. L. Hörhammer u. K.W. Leue, Arch.Pharm. 288, 377 (1955)
- 90 -
0,47 sehr schmale Zone hell gelb0,40 grau gelb0,34 violett und mehrere Zonen
bis 0,18 grau gelb
Nach Angaben der Autoren sind die Chromatogramme gut reproduzierbar; dies
gilt vor allem für die Zonenlagen. Die unten aufgeführten Autoren (1-5) befassten
sich ebenfalls mit den Hydrastis-Alkaloiden.
Di-3 Trennung der vier Alkaloide konnte, wenn auch unter Schwanzbüdung,
erreicht werden. Eue sofortige und eindeutige Charakterisierung der Alkaloide
erwies sich weder im UV-Licht noch mit einem Farbreagens als möglich. Unser
Ziel war, die drei Hauptalkaloide, unter Vermeidung der Aufspaltung von Hydra-
sünin zu Hydrastm sofort und einwandfrei nachzuweisen.
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung der Hydrastis-Alkaloide
Chromatographlerverfahren A (Verwendung des organischen Lösungs¬
mittels als mobile Phase). Der Nachweis der aufgetrennten Alkaloide hat mit
Hilfe des UV, von Dragendorff's- und Zaffarom-Reagens zu erfolgen. Die Sicht¬
barmachung unter UV ist am empfindlichsten.
Einfluss der Reaktion auf die Verteilung der Hydrastis-Alkaloide
Die auf ein pH von 3,0 bis 7,0 gepufferten Papiere ergeben eine Verteilung
der Hydrasùs-Alkaloide, wie sie aus Fig. 18 ersichtlich ist. Samtliche Rf-Werte
nehmen mit steigendem pH zu. Die Rf-Werte von Hydrastm steigen besonders
stark zwischen pH 3,0 bis 5,0. Berberin und Hydrastimn steigen parallel gegen
die neutrale Reaktion hm. Es sei hier auf die niedrigen Rf-Werte hingewiesen,
1. P. Hagedorn, Dtsch.Apoth.Ztg. W, 780 (1952)2. A. Roux, Ann.Pharm.franç. 15, 119 (1957)3. K. Mazek, J. Hacapercova, B. Kakac, Pharmazie _U, 533 (1956)4. C.B. Manni-Bettolo, J.A. Coch Frugoni, II Farmaco
_12, 329 (1957)5. C.B. Manni-Bettolo, J.A. Coch Frugoni, Gaz.Chim.Ital.
86, 1324 (1956)
91 -
Fig. 18
Einfluss der Reaktion auf die Verteilung der Hydrastis-Alkaloide (Verfahren A)
optimaler pH-Wert pK-Wert
Hydrastin 6,61
«2,5Berberin >ll,0
Hydrastinin »11,0
die bei allen von uns untersuchten Alkaloiden mit Hydroxyl-Gruppen erhalten
wurden. Heftmann (1) hat bereits bei andern Körperklassen beobachtet, dass
der Rf-Wert umso niedriger ist, je mehr Hydroxyl-Gruppen im Molekül der Ver¬
bindung enthalten sind. Klementschitz u. Mathes (2) (Coca-Alkaloide)
und Bentley u. Whitehead (3) haben ähnliche Beobachtungen gemacht. Ein
Zusammenhang zwischen pK-Wert und Rf-Wert kann auch bei den Hydrastis-Alka¬
loiden nicht erkannt werden.
I.E. Heftmann, Science 111, 571 (1950)2. W. Klementschitz u. P. Mathes, Sci.pharm. 20, 65 (1952)3. H.R. Bentley u. J.K. Whitehead, Biochem.J. 4(£ 341 (1950)
- 92 -
Die optimale Auftrennung der Hydrastis-Alkaloide erhielten wir bei der
Pufferung der Papiere auf einen pH von 6,6 (Fig. 19).
Fig. 19
Chromatogramm der Hydrastis-Alkaloide bei pH 6,6 (Verfahren A)
Rf-Wert
1 HYDRASTININ 0,02
2 BERBERIN 0,06
3 HYDRASTIN 0,93
Eindeutig getrennt erscheinen Hydrastinin, Berberin und Hydrastin. Im UV sind
alle drei Alkaloide sichtbar (Hydrastinin leuchtend hellblau, Berberin leuchtend
gelb und Hydrastin schwach blau). Mit Dragendorff s-Reagens werden Hydrastin
und Hydrastinin, mit Zaffaroni-Reagens Hydrastin und Berberin erfasst. Das von
uns untersuchte Extractum Hydrastidis fluidum Ph.Helv.V zeigt ein
gleiches Verhalten wie die untersuchten drei Reinalkaloide. Die Rf-Werte sum¬
men uberein. Im UV zeigte der Extrakt weitere Flecken und zwar
Fleck a hellblau
b grünblau
c blaulich
d bläulich
Dragendorff Zaffaroni
- 93-
Fig. 20
Chromatogramm von Extractum Hydrastidis fluidum Ph.Helv.V bei Ph 6,6
(Verfahren A)
Rf-Wert
HYDRASTININ 0,02I.BERBERIN 0,06HYDRASTIN 0,93
2EXTRACTUM
HYDRASTITIS
c) Die papierchromatographische ReinheitsprUfung der Hydrastis-Alkaloide
Nach der Trennung der Alkaloide versuchten wir die Mindestmenge an Al-
kaloiden festzustellen, welche auf die Untersuchungsmethoden gerade noch an¬
sprechen. Die Grenzwerte sind in der Tabelle 9 aufgeführt.
Tabelle 9
Empfindlichkeit in Aig
Alkaloide Dragen- Mandel- Zaffaroni- UV- Auto
dorff-R. Reagens Reagens Nachweis
Hydrastinin 10 20 (1)
10 50 — 5 (*)
Hydrastin 10 50 50 10 (*)
Berberin — 20 10 5 (*)
1. R. Munier u. M. Macheboeuf, Bull.Soc.chim.biol. 31, 1146 (1949)
(*) eigene Bestimmungen
- 94 -
Bei den Hydrastis-Alkaloiden lassen sich nach dem Chromatographlerverfahren
A ebenfalls kleine Mengen von grossen und grosse Mengen Alkaloid ohne Schwie¬
rigkeiten trennen.
Werden die Empfindlichkeiten der Ph.Helv.V-Vorschriften und der papier-
chromatographischen Methode untereinander verglichen, so zeigt sich, dass die
zweite Methode kleinere Mengen von Nebenalkaloiden erfasst. Sie übertrifft vor
allem die Bromwasser- und Ammomakreaktion, aber auch die Leistungsfähigkeit
der titrimetnschen Bestimmung.
Als Pharmakopoe-Prüf ungs vo r s ch rift kann in Aussicht genom¬
men werden:
Hydra s tininium chloratum Ph.Helv.V:
"1,00 ml Stammlosung (entsprechend 0,1 g) werden mit 9,00 ml Alkohol
verdünnt. 0,05 ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 500 zag) werden auf die
Staitlime eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman No. 1 aufge¬
tragen und nach dem Chromatographlerverfahren A chromatographiert. Das im
UV betrachtete Chromatogramm darf nur einen blau aufleuchtenden Fleck vom
Rf-Wert ca. 0,02 zeigen."
- 95 -
5 . Ipecacuanha-Alkaloide
a) Bisherige Untersuchungen
Hashimoto (1) trennte Emetin von Chinin, Scopolamin und Eserin
mittels Butanol + Essigsaure. Reichelt (2) untersuchte das Verhalten von
Emetin und anderen Alkaloiden auf mit Formamid behandeltem Papier. Als mo¬
bile Phase dienten ihm Toluol, Benzol odt r Chloroform. In ihrem papierchroma-
tographischen Analysengang versuchten Schultz u. Strauss (3) ebenfalls,Emetin von anderen Alkaloiden des DAB 6 zu trennen. Mit Butanol + Essigsaure +
Wasser (100+20+40) erhielten sie einen Rf-Wert für Emetin = 0,70, mit dem
gleichen Losungsmittelgemisch von der Zusammensetzung (100 + 30 + 40) einen
solchen von 0,65 fur Emetin; je saurer das Gemisch war, je kiemer wurde der
Rf-Wert. Diese Beobachtung ist durch Hakim u. Mirimanoff (4) und durch
unsere Versuche bestätigt worden. Die letztgenannten Autoren untersuchten Tinc-
tura Ipecacuanhae Ph.Helv.V mit der mobilen Phase tert. Butanol + Butanol + 30-
proz. Ammoniak (25 + 25 + 15). Nach dieser Methode konnten sie die Gegenwartvon vier Alkaloiden nachweisen. Hörhammer u. Leue (5) bestimmten das
papierchromatographische Verhalten von Tinctura Ipecacuanha DAB 6 mit der
mobilen Phase n-Butanol + Eisessig + Wasser (4 + 1 + 5). Sie fanden im UV-Bild
Rf = 0,70 hellblau, Rf = 0,57 hellblau, Rf = 0,35 breite Zone, Rf = 0,26 hellblau
und eine Zone bei Rf = 0,13. Nach diesen Autoren sind die Chromatogramme sehr
gut reproduzierbar, doch erscheinen die Zonen 0,13, 0,26 und 0,57 manchmal nur
schwach. Weitere Untersuchungen an Ipecacuanha-Alkaloiden vollführten folgendeAutoren (6- 12).
Nach unseren Literaturkenntnissen wurden bis heute die Ipecacuanha-Alka¬
loide wenig papierchromatographisch untersucht, vor allem noch keine Trennung
des Emetins vom Cephalein beschrieben. Diese Aufgabe war für uns von besonde¬
rem Interesse.
1. J. Hashimoto, Rev.bras.Farmacia 35, 297 (1954)2. J. Reichelt, Pharmazie _U, 718 (1956)"3. O.E Schultz u. D. Strauss, Arzneimittelforschg. 5, 342 (1955)4. A. Hakim u. A. Mirimanoff; Diss.No. 1180 Université Genève (1951)5. L. Horhammer u. K.W. Leue, Arch.Pharm. 288, 377 (1955)6. G.B. Marini-Bettolo, J.A. Coch Frugoni, Gaz.Chim.Ital.
86, 1324 (1956)7. L.R. Goldbaum, L. Kazyak, Anal.Chem. ^8, 1289 (1956)8. N.F.H. Kent, B.M. Amengual, Arch.Farmac.bioquim.Tucuman
4, 333 (1950)9. G. Thomas, P. Roland, Bull.Soc.Chim.biol. _12, 318 (1954)
10. A. Indra, V. Junge, J. Zyka, Ceskoslov.Farmac. J., 195 (1952)11. K. Macek, J. Hacaperkova, B Kakac, Pharmazie jj, 533 (1956)12. J. Reichelt, M. Sarsunova, Pharmazie 13, 21, 24 (1958)
- 96 -
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung der Ipecacuanha-
Alkaloide
Chromatographierverfahren A (Verwendung des organischen Lösungs¬
mittels als mobile Phase). Der Nachweis hat durch UV und mit Hilfe von Dragen-
dorff s-Reagens zu erfolgen, wobei die Darstellung im UV wesentlich empfindli¬
cher ist.
Einfluss der Reaktion auf die Verteilung der Ipecacuanha-Alkaloide
Mittels den auf pH 3,0 bis 7,0 gepufferten Papieren wurden die beiden Ipe¬
cacuanha-Alkaloide chromatographiert. Es handelt sich hier um Emetin und Ce-
phalein. Die erhaltene Verteilung ist aus der Fig. 21 abzulesen.
Fig. 21
Einfluss der Reaktion auf die Verteilung der Ipecacuanha-Alkaloide(Verfahren A)
optimaler pH-Wert
i
pK-Wert
Emetin
Zepholein
7,85
9,12
7,75
8,7410,10
- 97 -
Die Rf-Werte der Alkaloide nehmen mit steigendem pH parallel zu. Gegen die
neutrale Reaktion hin steigen Emetin und Cephalein stark, was die Versuche von
Schultz u. Strauss (1) und Hakim u. Mirimanoff (2) bestätigt.
Zwischen pK-Wert und Rf-Wert kann kein Zusammenhang beobachtet werden.
Die optimale Auftrennung der beiden Ipecacuanha-Alkaloide erhielten wir bei
einer Pufferung der Papiere auf pH 7,0. Der Einfachheit halber trennten wir trotz
der kleineren Rf-Werte bei pH 6,6, werden doch die meisten Alkaloide bei dieser
Reaktion getrennt
pH 6,6 : Rf = 0,08 für Cephalein, 0,22 für Emetin
pH 7,0 : Rf = 0,22 für Cephalein, 0,48 für Emetin.
Bei pH 6,6 untersuchten wir auch Extractum Ipecacuanhae Ph.Helv.
V. Es konnten vier Alkaloide festgestellt werden (Fig. 22); Emetin und Cephalein
Hessen sich durch Leitsubstanzen charakterisieren, während das auf dem Start¬
punkt zurückbleibende und das am weitesten wandernde nicht identifiziert werden
konnten.
Fig. 22
Chromatogramm der Ipecacuanha-Alkaloide bei pH 6,6 (Verfahren A)
1 a> 1 EMETIN
2 o 2. ZEPHALE
3. o o 3. GEMISCH
Die Chromatogramme der Reinalkaloide, wie diejenigen von Brechwurzelextrakt
zeigen die gleichen Rf-Werte. Ausser den 4 Alkaloidflecken (Dragendorff + und
Zaffaroni +) konnten wir im UV sichtbar werdende Begleitflecken beobachten
1. O.E. Schultz u. D. Strauss, Arzneimittelforschg. 5_, 342 (1955)2. A. Hakim u. A. Mirimanoff, Diss. No. 1180 Université Genève (1951)
-98-
Fig. 23
Chromatogramm von Extractum Ipecacuanhae Ph.Helv.V bei pH 6,6
(Verfahren A)
i — Rf -W«rt
I
I 4. EMETIN 0,22
] 2. CEPHALEIN 0,08
I 3 EXTRACTUM
| IPECACUANHAE
J
uv
Fleck a blau
b gelbc bläulich
d blau
Es muss sich hier um weitere Inhaltsstoffe des Ipecacuanha-Extraktes handeln,
da die Reinalkaloide Emetin und Cephalein diese Erscheinung nicht zeigen.
Werden Emetin oder Brechwurzelextrakt längere Zeit in Chloroform auf¬
bewahrt, so tritt ein papierchromatographisch nachweisbares Zersetzungspro¬
dukt auf, welches im UV-Licht blau aufleuchtet (Fig. 23).
c) Die papierchromatographische ReinheitsprUfung der Ipecacuanha-Alkaloide
Nach der erfolgreichen Trennung der Alkaloide bestimmten wir die Min-
destkonzentration an Ipecacuanha-Alkaloiden, welche nach den verschiedenen
Nachweis -Methoden noch erfasst werden. Diesbezügliche Angaben konnten in der
Literatur nicht gefunden werden. Die Bestimmung der Grenzreaktion ergab folgen¬
des Bild:
1 O
2 O
Ta b c ä
Dragendorff Zaffaroni
-99-
Tabelle 10
Empfindlichkeit des papierchromatographischen Nachweises der
Ipecacuanha-Alkaloide
Empfindlichkeit in Aig
Alkaloid Dragen- Kiefer- Mandel- Zaffaroni- UV- Autor
dorffs-R. Reagens Reagens Reagens Nachweis
Emetin 10 - 20 10 (*)
Cephalein 10 5 20 10 3 (*)
Werden die 500 Aig Ipecacuanha-Alkaloide streifenförmig aufgetragen, so ist es
möglich, mit so grossen Mengen zu Chromatographieren, ohne dass Mängel auf¬
treten. Es lassen sich auch kleine Mengen Cephalein abtrennen.
Ein Vergleich der Empfindlichkeit der Molybdänschwefelsäure-Reaktion
der Ph.Helv.V mit derjenigen der Papierchromatographie zeigt, dass die erstere
empfindlicher ist. Die papierchromatographische Methode ist aber gegeben bei
Untersuchungen von Drogenpräparaten.
Als PrUfungs Vorschrift für die Pharmakopoe kann in Aussicht
genommen werden:
Emetinum hydrochloricum Ph.Helv.V:
"1,00 ml Stammlösung (entsprechend 0,05 g) werden mit 1,00 ml Alkohol
verdünnt. 0,02 ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 500 yug) werden auf die
Startlinie eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman No. 1 aufge¬
tragen und nach dem Chromatographierverfahren A Chromatographien. Das im
ultravioletten Licht betrachtete Chroiratogramm darf keinen aufleuchtenden Fleck
zeigen, und mit Zaffaroni- oder Dragendorffs-Reagens nur einen Fleck vom Rf-Wert
ca. 0,22 zeigen."
- 100 -
6. Strychnos-Alkaloide
a) Bisherige Untersuchungen
Munier u. Macheboeuf (1) beschrieben zuerst Versuche zur Tren¬
nung von Brucin und Strychnin. Sie schlugen Butanol + Eisessig + Wasser (100 +
30 + Sättigung) als mobile Phase vor. Die erreichte Trennung war aber unbe¬
friedigend. Gute Trennung erhielten sie dann mit Butanol + Salzsäure + Wasser
(100 + 20 + Sättigung) als mobile Phase unter Entmischung. In einer weiteren
Arbeit verhindern sie das Auftreten von Unregelmässigkeiten durch Verwendungvon Butanol + Salzsäure + Wasser (100 + 15 + Sättigung). Auf mit m/1 bis m/5-
primärem Kaliumphosphat gepuffertem Papier konnten sie eine gute Trennungvon Brucin und Strychnin erreichen unter Verwendung von Propanol + Wasser
(3 + 1), Isopropanol + Wasser (3 + 1) oder Butanol wassergesättigt. Durch Be¬
handlung des Papieres mit einer Salzlösung, die das gleiche Anion enthält, wie
die der mobilen Phase zugesetzte Säure, erhielten sie ebenfalls eine gute Tren¬
nung von Strychnin und Brucin. Denoel, Jaminet u. Philippot (2) un¬
tersuchten die Alkaloide in Strychnos angolensis. Sie fanden Strychnin neben
zwei anderen unbestimmbaren Alkaloiden. Als mobile Phase verwendeten sie
Isobutanol + Salzsäure + Wasser (50 + 7,5 + 13,5) oder n-Butanol + Salzsäure +
Wasser (50 + 7,5+17). Griffon u. Romano (3) klärten mittels Papier¬
chromatographie Vergiftungs fälle auf. Sie trennten mit Aceton + Diäthylamin +
Wasser (150 + 10 + 40) Oxy- sowie Methylstrychnin von Strychnin und Brucin;die letzteren wurden durch eine Mischung aus Salzsäure und Butanol (30 + 200)und einer 10-proz. Kaliumferricyanidlösung + Glyzerin + Essigester (50 +5+5)getrennt. Jaminet (4) untersuchte das papierchromatographische Verhalten
von Strychnos Holstii mit Isobutanol, Isopropanol mit Salzsäure oder Ammoniak¬
zusätzen als mobile Phase. So konnte er 9 Alkaloide, nämlich Strychnin, Brucin,
Genostrychnin, Dihydrobrucin, a-Columbrin, (3-Columbrin, Vomicin, Holstinin
und Rutelin nachweisen. Bräuniger u. Borgwardt (5) beschreiben eine
Methode zur papierchromatographischen Trennung von Alkaloiden mit Hilfe ihrer
quartären N-Verbindungen. Als mobile Phase verwendeten sie wassergesättigtesoder mit Salzsäure angesäuertes Butanol. Sie fanden bei steigendem Säurezusatz
ein anfängliches Absinken der Rf-Werte von Brucin und Strychnin, dann ein erneu¬
tes Ansteigen derselben. Deckers u. Schreiber (6) trennten Strychnin und
Brucin papierelektrophoretisch. Sie stellten bei Mengen von 30-150 yug eine gute
Uebereinstimmung zwischen Fleckengrösse und Alkaloidkonzentration fest.
Caronna u. Bruno (7) gelang die Trennung von Brucin und Strychnin mit
Methylamin und Aethylamin nach der absteigenden- und Rundfiltermethode.
1. R. Munier u. M. Macheboeuf, Bull.Soc.chim.biol. 32, 210 (1950)33, 854 (1951), 33, 1923 (1951), 34, 209 (1952)
2. A. Denoel, F. Jaminet u. E. Philippot, Arch.int.Physiol.59, 341 (1951)
3. H. Griffon u. C. Romano, Ann.pharm. Franc. _10, 497 (1952)4. F. Jaminet, J.Pharm.Belg. 8, 449 (1953)5. H. Bräuniger u. G. Borgwardt, Pharmazie 8, 909 (1953)6. W. Deckers u. J. Schreiber, Naturwissenschaften 40, 553 (1953)7. G. Caronna u. S. Bruno, II Farmaco _10, 497 (1955)
- 101 -
Die besten Resultate erhielten sie mit der Rundfiltermethode mit 0,1 % Aethyl-amin (Rf = 0,59 ftlr Brucm und 0,71 für Strychnin). Krogerus u. Tuderman
(1) untersuchten die verschiedensten mobilen Phasen zur Trennung des Strych¬nin von andern Alkaloiden. Mit den mobilen Phasen n-Amylalkohol + Ameisensau¬
re + Wasser (100 +18 + 4) bei Verwendung von mit m/7 Monokaliumphosphat-Gemisch behandeltem Filterpapier und als zweite mobile Phase Isopropanol +
Wasser (75 + 25) erhielten sie die besten Resultate. Der Rf-Wert für Strychninbetragt 0,62, ebensoviel der Rf-Wert von Atropin. Gore u. Adshead (2) be¬
stimmten das papierchromatographische Verhalten von Brucin und Strychnin. Sie
stellten mit drei verschiedenen mobilen Phasen n-Butanol + Ameisensäure + Was¬
ser (10 + 1 + 10), n-Butanol + Essigsäure + Wasser (40 + 10 + 50) und n-Butanol
+ Propionsäure + Wasser (10 + 1 + 10) ein gleiches Wandern von Brucin (Rf =
0,67, 0,44, 0,58), Brucinhydrochlond (Rf = 0,64, 0,39, 0,53), Strychnin (Rf = 0,74,
0,58, 0,70) und Strychninhydrochlond (Rf = 0,73, 0,56, 0,69) fest. In ihrem Analy¬
sengang trennten Schultz u. Strauss (3) Strychnin und Brucin von anderen
Alkaloiden. Mit Butanol + Ameisensaure + Wasser (120 + 10 + 70) (120 + 20 + 70)erhielten sie die besten Trennungen (Strychnin 0,61, 0,67) und Brucin (0,42, 0,55).Hörhammer u. Leue (4) chromatographierten Tinctura Strychm DAB 6 mit
der mobilen Phase n-Butanol + Essigsaure + Wasser (4 + 1 + 5). Sie fanden drei
Zonen bei 0,80, 0,55 und 0,45. Die Zone 0,55 ist der Chlorogensäure zuzuordnen.
Die Zonen 0,80 und 0,45 treten nicht immer auf. Hakim u. Minmanoff (5)unterzogen Tinctura Strychm Ph.Helv.V der Papierchromatographie. Mit der mo¬
bilen Phase tert. Butanol + n-Butanol + 10-proz. Salpetersaure (25 + 25 + 20) trenn¬
ten sie Brucin von Strychnin. Folgende papierchromatographische Arbeiten über
die Strychnos-Alkaloide seien noch zitiert (6-32).
1. V.E. Krogerus u. L. Tuderman, Eripamos Suomen Apteekkanyh-
distyksen Aikakauslehdesta J^, 245 (1946)3. O.E. Schultz u. D. Strauss, Arzneimittelforschg. 5_, 342 (1955)4. L. Horhammer u. K.W. Leue, Arch.Pharm 288, 377 (1955)2. D. Gore u. I. Adshead, J.Pharm.Pharmacol. _4, 803 (1952)5. A. Hakim u. A. Minmanoff, Diss.No. 1180, Université Genève (1951)6. G. Tappi, Ann Chim. 40, 345 (1950)7. P. Karrer, J.K. Eberle, H. Schmidt, Helv.Chim.Acta
37, 1384 (1954)8. A. Aziz, A. Rahman, Proc.pharm.soc.Egypt Nov. (1954)9. J.J. Nosek, O. Krestynova, Chemie 1_, 64 (1951)
10. N.F.H. Kent, B.M. Amengual, Arch.farmac.bioquim.Tucuman4, 333 (1950)
U.E. Vidic, Arzneimittelforschung^, 291 (1955)12. A.S. Curry, H. Powell, Nature 173, 1143 (1954)13. G. Thomas, P. Roland, Bull.Soc.chim.biol. \X 318 (1954)14. Z. Margasinski, A. Szymanska, L. Wasilewska, Acta Polon.
Pharmac _12, 65 (1955)15. C. Romano, Minerva medicolegale 70, 172 (1950)16. J.E. Carless, H.B. Woodward, Nature 168, 203 (1951)17. M. Schmall, E.G. Wollish, E.G.E. Shaffer, Anal.Chem.
28, 1373 (1956)18. K. Macek, J. Hacapercova, B. Kakac, Pharmazie U_, 533 (1956)19. G.B. Marini-Bettolo, J.A. Coch Frugoni, U Farmaco _12, 329 (1957)20. G.B.Marini-Bettolo, J.A.Coch Frugoni, Gaz.Chim.Ital.^6,1324(l956)21. L.R.Goldbaum, L.Kazyak, Anal.chem. 28, 1289 (1956)22. W.G.Gorman, R.Salisbury, J.Amer.Pharm.As soc. _46, 476 (1957)
Forts, siehe Seite 102
- 102 -
Strychnin und Brucin konnten mit den meisten beschriebenen Systemen
voneinander getrennt werden. Trotzdem untersuchten wir das Verhalten der bei¬
den Reinalkaloide und von Extractum Strychni Ph.Helv.V nach unserem Verfah¬
ren A, war es doch unser Ziel, möglichst viele Alkaloide (Solanaceen-, Coca-,
Opium-, Hydrastis-, Ipecacuanha-, Strychnos-Alkaloide) mit der gleichen mobi¬
len Phase zu trennen.
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung
Chromatographlerverfahren A (Verwendung des organischen Losungs¬
mittels als mobile Phase). Der Nachweis der aufgetrennten Alkaloide hat mit
Dragendorff's-Reagens zu erfolgen.
Einfluss der Reaktion auf die Verteilung der Strychnos-Alkaloide
Die auf ein pH von 3,0 bis 7,0 gepufferten Chromatographierpapiere wer¬
den unter Einhaltung der vorstehend beschriebenen Versuchsanordnung entwickelt.
Die erreichte Verteilung der Alkaloide lasst sich aus Fig. 24 entnehmen. Ueber
den ganzen pH-Bereich nehmen die Rf-Werte annähernd parallel zu für Strychnin
und Brucin. Gegen die neutrale Reaktion hm steigt der Rf-Wert von Brucin etwas
mehr. Em Zusammenhang zwischen pK- und Rf-Wert konnte nicht festgestellt
werden. Die optimale Auftrennung der Strychnos-Alkaloide erhielten wir bei pH 6,6.
Nach dieser Methode konnten sowohl die Reinalkaloide als auch der Extrakt, der
nach der Methode der Ph.Helv.V zur Gehaltsbestimmung aufbereitet wurde, aufge¬
trennt werden (Fig. 25). Die Rf-Werte zeigen Uebereinstimmung zwischen Rein-
alkaloid und Extrakt. Bei langer aufbewahrten Losungen von Strychnin und Extrac¬
tum Strychni Ph.Helv.V in Chloroform konnte ein neuer Dragendorff-positiver
Fleck a vom konstanten Rf-Wert 0,075 beobachtet werden. Weitere, nicht auf der
zersetzenden Wirkung von Chloroform beruhende Alkaloidflecken lies sen sich bei
der Auftrennung von Strychnos-Extrakt nicht feststellen.
23. H.Philibert, Bull.Soc.Fharm.Marseille A, 183(1955)24. S.W.Goldstein, D.P.Sanders, Drugs Standarts 24, 115 (1956)25. Ch.L.Brown, P.L.Kirk, Mikrochim.Acta 1957, 720
26. M.Deffner, A.I s sidorides-Deffner, J.Amer.Pharm.Assoc.47,343(1958)27. J.Reichelt, M.Sarsunova, Pharmazie 13, 21, 24 (1958)28. R.Bonmchsen, A.C.Maehly, S .Nordlander, Acta chem.Scand.II.1280
29. G.Nadeau, Clin.Ch«mistry 2, 347 (1956) (1957)30. D.H.Cox, Amer.J.Vetenn.Res._18, 929(1957)31. Q.E.Beiles, H.W.Sievert, J.Lab.chn.Med. 46, 628 (1955)32. F.Ohlweiver da Silveira, Tnbuna farmac. 24, 86 (1956)
- 103 -
Fig. 24
Einfluss der Reaktion auf die Verteilung der Strychnos-Alkaloide(Verfahren A)
optimaler pH-Werf
Strychnin
Brucin
8,40
>ll,0
6,37
>ll,0
pK-Werf
Fig- 25
Chromatogramm von Strychnin und Brucin und Extractum StrychniPh.Heiv.V bei pH 6,6 (Verfahren A)
Rf - Wert
1. STRYCHNIN 0,61
2 BRUCIN 0,39
3 GEMISCH
4 EXTRACTUM
STRYCHNI
- 104 -
c) Die papierchromatographische Reinheitsprllfung der Strychnos-Alkaloide
Nachdem es gelungen war, die Strychnos-Alkaloide einwandfrei zu tren¬
nen, bestimmten wir die Empfindlichkeit der Reagenzien gegenüber Strychnin
und Brucin. Tabelle 11 zeigt die Angaben aus der Literatur und die eigenen Be¬
stimmungen.
Tabelle 11
Empfindlichkeit des papierchromatographischen Nachweises fur
Strychnos -Alkaloide
Empfindlichkeit in xig
Alkaloid Dragen- Mandel- Zaffaroni- Kiefer- UV- Autor
dorffs-R. Reagens Reagens Reagens Nachweis
Strychnin
Brucin
15
12-15
10
30
10
30
10
15
15
10
10
10
50
20
(1)
(2)
(3)
(4)
C)
(4)
(*)
Nach der beschriebenen Methode gelingt es, kleine Mengen Brucin von gros¬
sen Mengen Strychnin abzutrennen. Mit dem Kiefer-Reagens ist es möglich, die
Anwesenheit von Brucin zu beweisen.
1. V.E. Krogerus u. L. Tuderman, Enpainos Suomen Apteekkanyh-distyksen Aikakauslehdesta 16, 245 (1946)
2. H. Griffon u. C. Romano, Ann.pharm.Franc. _10, 497~[Ï952)3. F. Jaminet, J.Pharm.Belg._8, 449 (1953)4. W. Deckers u. J. Schreiber, Naturwissenschaften 40, 553 (1953)
(*) eigene Untersuchungen
- 105-
Die Empfindlichkeit der papierchromatographischen Methode übertrifft
diejenige der Ph.Helv.V-Vorschriften. Vor allem wird die Schwefelsäureprobe
und die titrimetrische Gehaltsbestimmung als ReinheitsprUfung Ubertroffen.
Als Pharmakopoe-Vorschrift kann aufgestellt werden:
Strychninum nitricum Ph.Helv.V:
"1,00 ml Stammlösung (entsprechend 0,01g) werden mit 1,00 ml Wasser
verdünnt. 0,1 ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 500 Aig) werden auf die
Startlinie eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman No. 1 aufge¬
tragen und nach dem Chromatographierverfahren A chromatographiert. Das mit
Kiefers-Reagens entwickelte Chromatogramm darf keinen Farbfleck aufweisen.
Mit Dragendorffs- oder Zaffaroni-Reagens entwickelt, darf das Chromatogramm nur
einen Farbfleck vom Rf-Wert ca. 0,61 aufweisen."
- 106-
7. China-Alkaloide
a) Bisherige Untersuchungen
Munier u. Macheboeuf (1) hatten m ihren Untersuchungen zur Tren¬
nung von Chinin, Chinidin, Cinchomn und Cmchomdin keinen Erfolg. Moer-
loose (2) versuchte zunächst die China-Alkaloide mit Collidin bzw. Cyclohexa-nol (salzsauregesatügt) zu trennen. Er arbeitet aufsteigend nach der Methode
von Williams u. Kirby (3); die Flecken lagen aber dicht beisammen und
waren wegen der Schwanzbildung nicht scharf voneinander zu trennen. Bei Alka-
loidmischungen bekam er nur ein Fleckengemisch. Nach der Methode von
Rockland u. Dunn (4) (unten verjüngte Papierstreifen m Reagensglasern,in denen sich 1-2 ml mobile Phase befindet) erhielt er folgende Resultate: Mit
Wasser als mobile Phase wurden kleine Rf-Werte erhalten (0,21 - 0,27), zudem
waren die Flecken verlängert. 5-proz. Ammoniak zeigte grossere Rf-Werte(0,64 - 0,78) und Konstanz der Rf-Werte mit Mengen zwischen 2 - 40^. Der Ein-
fluss des Feuchtigkeitsgehaltes des verwendeten Chromatographierpapieres war
bedeutend, wie die Rf-Wertunterschiede für Chinin (0,58 - 0,70) zeigten. Der Ver¬
fasser rat, immer mit lufttrockenem Papier zu arbeiten. Eine Trennung mit 5-proz.Ammoniak ist hingegen mcht gelungen. Wassnge 5-proz. Pyridinlosung ergab eine
Trennung von Chinin und Chinidin (Rf = 0,70 - 0,60) nicht aber von Chinin und Cin-
chomdin (Rf = 0,70 - 0,72). Cinchomn ergab einen langen Streifen, bei dem eine Rf-
Wert-Festlegung nicht möglich war. Da die China-Alkaloide wegen der Schwierig¬keit der quantitativen Auftrennung in die einzelnen Komponenten oft kleine Mengen
Verunreinigungen durch Nebenalkaloide enthalten, versuchten Lussmann,
Kirch u Webster (5) dieselben papierchromatographisch auf ihre Reinheit
zu prüfen. Sie arbeiteten aufsteigend nach der Methode von Wolfson, Cohn u.
De van y (6). Als mobile Phasen dienten Cyclohexanol (1) oder Cyclohexan(2). Diese Losungsmittel wurden mit Wasser bzw. 2-4n-Salzsàure versetzt. Repro¬duzierbare Resultate wurden nur mit Cyclohexanol erhalten, wenn auch die Tren¬
nung von Chinin und Chinidin mit Cyclohexan besser ist. Meist wurde die beste
Trennung mit wassergesattigtem, die am besten reproduzierbaren Resultate mit
salzsauregesattigtem Cyclohexanol erhalten. Die Rf-Schwankungen sind ziemlich
gross (t 0,05). Bei Chinin und Chinidin war es gleichgültig, ob Basen oder Salze
aufgetragen wurden, wahrend Cinchomn- und Cinchonidmsalze etwas kleinere Rf-Werte ergeben
1 R. Munier u. M. Macheboeuf, Bull Soc.Chim.Biol. 31, 1146 (1949),34, 204 (1952)
2. P. de Moerloose, Pharm.Tijdschr.v.Belgie 29_, 117(1952)3. R J. Williams u. H. Kirby, Science 107, 481 (1948)4. L B. Rockland u. M.S. Dunn, Science 109, 541 (1949)5. D. Lussmann, E. Kirch u. G. Webster, J.Amer.pharm.Ass.
40, 368 (1951)6 W Q. Wolfson, C. Cohn u. W.A Devany, Science 109, 541 (1949)
- 107 -
Rf-Werte der China-Alkaloide mit Cyclohexanol (1) bzw. Cyclohexan (2) salz¬
säuregesättigt, Kammer säuregesättigt
Chinin Chinidin Cinchonin Cinchonidin
(1) (2) (1) (2) (1) (2) (1) (2)
2,5 n-HCl 0,45 0,25 0,51 0,75 0,35 0,20 0,27 0,32
3,5 n-HCl 0,51 0,34 0,58 0,55 0,42 0,27 0,34 0,48
Rf-Werte der Chinaalkaloide mit Cyclohexanol wassergesättigt, Kammer salz¬
säuregesättigt
Chinin Chinidin Cinchonin Cinchonidin
2,5 n-HCl 0,32 0,43 0,09 0,06
3,5 n-HCl 0,21 0,31 0,03 0,05
Zum Nachweis der Nebenalkaloide des Chinins schlägt Castille (1) folgendeschromatographisches Verfahren vor. Das verwendete Papier wird mit einer 0,02 m -
Kaliumoxalat-Lösung als stationäre Phase getränkt, zwischen Filterpapier abge-presst und bei Zimmertemperatur getrocknet. Dann löst er eine 50 mg Chininba¬
se entsprechende Menge Chininsalz in 5 ml Wasser, versetzt mit 2 Tropfen Na¬
tronlauge und 5 ml Chloroform, schüttelt 30 Sekunden um und gibt von der Chloro¬
formlösung so viel auf das Papier, dass 10, 20 und 40 ,ug Alkaloide aufgetragensind. Das Chromatographierpapier hängt er sodann in ein 50 ml 1,25 n-Kalium-
oxalat-Lösung enthaltendes Becherglas. Nachdem die mobile Phase bis auf 2 cm
vom oberen Rand gestiegen ist (30 - 40 Minuten),bringt er das noch feuchte Chro-
matogramm in ein mit loddampf gefülltes Becherglas. Dabei muss der Chininfleck
von 20 Aig gleichmässig gefärbt sein, bei 40 Aig darf der Chininfleck ein Maximum
aufweisen, ein Cinchonin- und Cinchonidinfleck darf nicht sichtbar sein. Das Ver¬
fahren gestattet die Bestimmung von 0,25 Aig Chinidin, 1 jag Hydrochinin, 0,5 Aig
Cinchonin und 0,5 jag Cinchonidin. Je nachdem ob der Chminfleck bei 10, 20 und
40 yUg einen Höchstwert zeigt, sind mindestens 2,5, 1,25, 0,625 % Chinidin oder
10,5 oder 2,5 % Hydrochinin im Chinin enthalten. Die Gegenwart eines Cinchonin-
Cinchonidinfleckens in 10, 20 oder 40 Aig beweist die Anwesenheit von 5, 2,5,
1,25 % Cinchonin oder Cinchonidin. Caronna u. Bruno (2) erhielten mit
1-proz. Aethylamin als mobile Phase nach der Rundfiltermethode Rf-Werte für
Chinin = 0,64 und Chinidin = 0,60. Krogerus u. Tuderman (3) trennten
Chininsulfat von andern Alkaloidsalzen unter Verwendung von n-Amylalkohol +
Ameisensäure + Wasser als mobile Phase (100 +18+4) auf einem mit m/7-Ka-
liumphosphatpuffer behandelten Papier. Nach Trocknung des Papieres wird mit
Isopropanol + Wasser (75 + 25) als mobile Phase in der zweiten Richtung Chro¬
matographien (Rf-Wert = 0,52). Schultz u. Strauss (4) versuchten in
1. P. Castille, Pharm.Weekbl. 89, 1 (1954)2. G. Caronna u. S. Bruno, II Farmaco ^0, 497 (1955)3. V.E. Krogerus u. L. Tuderman, Eripainos Suomen Apteekkariyh-
distyksen Aikakauslehdestä 16, 245 (1954)4. O.E. Schultz u. D. Strauss, ArzneimittelforschungJ5, 342 (1955)
- 108 -
ihrem Analysengang Chinin, Chinidin, Cinchonin und Cmchonidin zu trennen.
Bei ihren Untersuchungen fanden sie, dass fur die China-Alkaloide ein Salzsàu-
rezusatz zur mobilen Phase am geeignetsten sei. Mit der sich entmischenden
Phase n-Butanol + 0,1 n-Salzsaure (100 + 100), Wasserphase abgetrennt, er¬
hielten sie eine Trennung Chimn-Chimdin von Cinchonin-Cinchonidm. Gore u.
Ad s head (1) untersuchten mit verschiedenen mobilen Phasen das Verhalten
von Chininbase und Chimnhydrochlorid. Die Rf-Werte zeigen keinen Unterschied
zwischen Base (0,84) und Salz (0,83). Horhammer u. Leue (2) untersuch¬
ten das papierchromatographische Verhalten von Tinctura Chmae, Tinctura Chi-
nae composita und Extractum Chinae fluidum (alle DAB 6). Ohne die Alkaloide zu
differenzieren, fanden sie Zonen mit verschiedener Fluoreszenz, die bei den un¬
tersuchten Arzneiformen teilweise übereinstimmten.
Tinctura Chinae
0,22 grau-rot-braun0,28 blauviolett
0,36 blauviolett
0,55 blau
0,70 gelb0,80 blau *
Tinctura China comp.
0,22 grau-rot-braun0,28 blauviolett
0,36 blauviolett
0,42 braun *
0,55 bläulich
0,70 gelb0,80 blau *
Extract.Chinae fl.
0,30 blau
0,33 blau
0,48 braun-violett
0,52 gelb
0,58 blau
0,65 blau *
0,70 hellblau *
0,80 blau *
*= sehr breite Zone
Die beim Fluidextrakt auftretenden drei Zonen (0,33 - 0,30) erklaren die Ver¬
fasser durch die Salzsaurezugabe beim Extraktionsverfahren. Salzsaurezusatze
zu China-Infusen ergeben das gleiche Verhalten wie Extractum Chinae fluidum.
Der Rf-Wert 0,8 ist nach den Autoren Chinin zuzuordnen. Die Chromatogrammesollen gut reproduzierbar sein bei Verwendung der mobilen Phase n-Butanol +
Eisessig + Wasser (4+1 + 5). Hakim u. Mirimanoff (3) stellten bei ih¬
ren Untersuchungen an Tinctura Cmchonae Ph.Helv.V fest, dass durch blosses
Aufsetzen von Tinkturtropfen mit Dragendorff's-Reagens nur verwaschene Bilder
erhalten werden. Ein Zusatz von 5 % Glyzerin zur Tinktur liess die Flecken her¬
vortreten. Wurden die Alkaloide der Chinatinktur aber vorher als Mischung iso¬
liert, diese in Saure gelost und dann Chromatographien, so wurden mindestens
vier Flecken erhalten. Die Verfasser weisen aber darauf hin, dass eine wirkliche
Trennung der China-Alkaloide nicht erreicht wurde.
1. D. Gore u. I. Adshead, J.Pharm.Pharmacol. _4, 803 (1952)2. L. Horhammer u. K.W. Leue, Arch.Pharm. 288, 377 (1955)3. A. Hakim u. A. Mirimanoff, Diss. No. 1180 Umversité Genève (1951)
- 109 -
Folgende Autoren (1-19) stellten weitere Untersuchungen über die China -
Alkaloide an.
Trotz eingehender Prüfung des papierchromatographischen Verhaltens der
China-Alkaloide sind nur zwei Verfahren zur Trennung der vier hauptsächlich¬
sten Alkaloide anwendbar, nämlich die Methode von Lussmann, Kirch u.
Webster (20). und die Methoden von Reich elt (1, 17). Beide Verfahren brau¬
chen lange Trennzeiten.
1. J. Reichelt, Pharmazie _U, 718 (1956)2. Ch.L.Brown, P.C.Kirk, Mikrochim.Acta 1957, 720
3. D.P.Burma, Naturwissenschaften^, 19(1954)4. E.Scholz, P.Hagedorn, Dtsch.Apoth.Ztg. 93, 81 (1953)5. P.de Moerloose, Mededel Vlaam.Chem.Ver. _15, 13 (1953)6. Z.Marga s inski, A.Szymanska, L .Wa silews ka,
Acta Polon.Pharmac. _L2, 65 (1955)7. C.Romano, Minerva medicolegale 70, 172(1950)8. A.Quevauliier, Chim.Anal. ^3, 85~7l95l)9. D.Banes, J.Amer.Pharmac.Assoc.Sci.Ed. 43, 580 (1954)
10. K.Macek, J .Hacaperko va, B.Kakac, Pharmazie 11, 533 (1956)
11. F.Abaffy, S.Kreder, Acta.Pharm.Jugosl. 6, 207 (1956T12. J.Bonastre, Ann.Falsific.Fraudes 48, 109(1955)13. J.Bayer, K.Katona, Acta Pharm.Hung. 25, 189 (1955)14. G.B.Marini-Bettolo, J.A.Coch Frugoni, Gaz.Chim.Ital.
£6, 1324 (1956)15. L.R.Goldbaum, L.Kazyak, Anal.chem. 28, 1289 (1956)16. V. Vukcevic-Kovacevic, Z.Bozin, Acta Pharm.JugosI. b, 243 (1956)
17. J.Reichelt, M.Sarsunova, Pharmazie _13, 21, 24 (1958)18. R.Bonnichsen, A.C.Maehly, S .Nordlander, Acta chem.Scand.
H. 1280 (1957)19. I.Jakubec, V.Laskova, E.Hamova, Farmacia Bratislava, ^5, 137 (1956)
20. D.J.Lus smann, E.R.Kirch u. G.L.Webster, J.Amer.Pharm.Ass.
40, 368 (1951)
- 110 -
b) Verfahren zur papierchromatographischen Auftrennung
Zur Trennung der China-Alkaloide wird als mobile Phase Wasser-Toluol/
Isobutanol gesättigt-Pufferlösung pH 3,6 und dest. Wasser verwendet.
Die Mischung setzt sich folgendermassen zusammen: 100 T. dest. Wasser -
50 T. Toluol /Isobutanol gesättigtes Wasser und 50 T. Puffer nach Kolthoff vom
pH 3,6. Zur Erreichung runder Fleckenformen wurde noch 1 % Formamid zur mo-
bilden Phase zugesetzt. Die Wanderung der China-Alkaloide ist weniger stark pH-
abhängig. Die Klimatisierungszeit beträgt 1 Stunde. Die andern Versuchsanordnun¬
gen sind dem Verfahren A gleich. Trotz Versuchen mit den verschiedensten Lö¬
sungsmitteln als mobile Phasen konnte keine in jeder Beziehung (Zeit und Trenn¬
schärfe) befriedigende Lösung gefunden werden. Das von uns vorgeschlagene Sy¬
stem trennt die beiden offizinellen Alkaloide als Basen untereinander und von
Cinchonin und Cinchonidin, welche ihrerseits untereinander nicht aufgetrennt werden.
Fig. 26
Chromatogramm der China-Alkaloide bei pH 3,6
1 ::oi
1. CHININ
2 o 2. CHINIDIN
3 o 3. CINCHONIN
4 <3 4. CINCHONIDIN
5 o:a<o 5. GEMISCH
Rf-WERT
0,62
0,50
0,66
- Ill -
Bei der Trennung von Alkaloidgemischen wird eine Verminderung der Rf -Werte
beobachtet, Chinin rein 0,61, gemischt mit Nebenalkaloiden 0,57, Chinidin rein
0,50, gemischt mit Nebenalkaloiden 0,45. Mit Chinidin verunreinigtes Chinin zeigt
eine leichte "Schweifbildung" zum Chinidinfleck hin.
Zur Sichtbarmachung der Alkaloide wird das Chromatogramm zuerst unter
dem UV-Licht betrachtet und die aufleuchtenden Flecken von Chinin und Chinidin
umrandet. Cinchonin und Cinchonidin leuchten erst in hohen Konzentrationen schwach
dunkelblau auf. Anschliessend an die UV-Lichtbetrachtung wird das Chromatogramm
mit Dragendorffs-Reagens oder mit Zaffaroni-Reagens besprüht. Mit Zaffaroni-Rea¬
gens zeigen Cinchonin und Cinchonidin eine grünlich-violette, Chinin und Chinidin
eine blau-violette Färbung.
- 112-
c) Die papierchromatographische Reinheitsprtifung der China-Alkaloide
Nach der Trennung der Alkaloide bestimmten wir die Empfindlichkeit der
Reagenzien gegenüber den China-Alkaloiden. Tabelle 12 zeigt die Angaben aus
der Literatur und die eigenen Bestimmungen.
Tabelle 12
Empfindlichkeit des papierchromatographischen Nachweises der
China-Alkaloide
Alkaloid Dragen-dorff-R,
Chinin 10
10-20
10
10
10
10
Chinidin 5
10-20
10
10
Cinchonin 10
10-20
10
20
Cinchonidin 10
10-20
10
Empfindlichkeit in yugMandel- Zaffaroni-
Reagens Reagens
10
25
10 10
10
10
20
15 15
10-20
25
15
UV-
Nachweis
0,25
3
3
3
0,253
2
25 3
10 3
0,5
0-20 20
40
00
20Jgrösser1100
I!
0,5
20
40
grösser
100
Autor
(1)(2)(3)(4)(5)C)
(1)(2)(3)(4)O
(1)(2)(3)(4)C)
(1)(2)(3)(4)
1. P. Castille, Pharm.Weekbl. 89, 1 (1954)2. R. Munier u. M. Macheboeuf, Bull.Soc.Chim.Biol. 31, 1146 (1949)3. P. de Moerloose, Pharm.Tijdschr.v.Belgie 29, 117(1952)4. D.J. Lussman, E.R. Kirch u. G.L. Webster, J.amer.Pharm.
Ass. 40, 368 (1951)5. V.E. Krogerus u. L. Tuderman, Eripainos Suomen Apteekkariyhd-
styksen Aikakauslehdestä _16, 245 (1954)
(*) eigene Bestimmungen
- 113-
Ein Vergleich der Empfindlichkeit der papierchromatographischen Methode
und den PrUfungs Vorschriften der Ph.Helv.V ergibt: Weder die Kahumchromatpro-
be noch die Jodkalifallung zeigt eine so grosse Empfindlichkeit; übertroffen werden
ebenfalls die titnmetrische Gehaltsbestimmung und die Bestimmung der optischen
Drehung.
Als Prufungs vor s chrif ten fur die Pharmakopoe kann in Aus¬
sicht genommen werden :
Chinidinum sulfuricum Ph.Helv.V
"0,100 g (genau gewogen) werden neutralisiert und mit Alkohol zu 10 ml ge¬
löst. 0,055 ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 100^ug) werden auf die Start¬
linie eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman No. 1 aufgetragen und
nach dem vorstehend beschriebenen Chromatographlerverfahren bei pH 3,6 Chro¬
matographien. Das im ultravioletten Licht betrachtete Chromatogramm darf nur
einen blau aufleuchtenden, und bei 100° getrocknet, mit Dragendorffs-Reagens
orange und Zaftarom-Reagens grauviolett werdenden Fleck mit einem Rf-Wert von
ca. 0,50 zeigen.
Chininum hydrochlo ricum und dihydrochloricum Ph.Helv.V
"1,00 ml Stammlosung (entsprechend 0,02 g) werden neutralisiert und mit
Alkohol zu 2,00 ml verdünnt. 0,015 ml dieser Verdünnung (entsprechend ca. 100/ug)werden auf die Startlinie eines vorbereiteten Chromatographierpapieres Whatman
No. 1 aufgetragen und nach vorstehendem Chromatographlerverfahren bei pH 3,6
Chromatographien. Das im ultravioletten Licht betrachtete Chromatogramm darf
nur einen blau aufleuchtenden Fleck aufweisen, der sich,bei 100° getrocknet, mit
Dragendorffs-Reagens orange, mit Zaffaroni-Reagens grauviolett färbt, mit einem
Rf-Wert von ca. 0,61."
Chininum sulfuricum Ph.Helv.V
"0,100 g (genau gewogen) werden neutralisiert und mit Alkohol zu 10 ml ge¬
lost. 0,015 ml dieser Stammlosung (entsprechend ca. 100 jug) werden auf ein vor¬
bereitetes Chromatographierpapier Whatman No. 1 aufgetragen und nach dem be¬
schriebenen Chromatographlerverfahren bei pH 3,6 Chromatographien. Das im ul¬
travioletten Licht betrachtete Chromatogramm darf nur einen blau aufleuchtenden
Fleck aufweisen, der sich,bei 100° getrocknet, mit Dragendorffs-Reagens orange,
mit Zaffarom-Reagens grauviolett färbt, mit einem Rf-Wen von ca. 0,61."
- 114 -
8. Mutterkorn-Alkaloide
a) Bisherige Untersuchungen
Viel Arbeit wurde der Analytik der Mutterkornalkaloide gewidmet. Die
einzige Möglichkeit, eine einfache und schnelle Auftrennung eines Alkaloidge-misches auszuführen, bietet das chromatographische Verfahren. Dieses gestat¬tet nicht nur eine Auftrennung einzelner Alkaloide voneinander, sondern auch
der wirksamen linksdrehenden Isomeren von den wenig wirksamen rechtsdre¬
henden. Foster, Macdonald u. Jones (1) erreichten auf papierchroma-
tographischem Wege die Abtrennung des Ergobasins und Ergobasinins aus dem
Alkaloidgemisch. Mit der mobilen Phase n-Butanol + Eisessig + Wasser (4+1 + 5)erhielten sie Rf-Werte 0,59 für Ergobasin und 0,68 fur Ergobasimn. Caries s
u. Woodhead (2) arbeiteten mit sauer gepufferten Papieren; es gelang ihnen
die Trennung von Ergotamin und Ergotaminin, sowie die Abtrennung des Ergocn-stinins aus dem Ergotoxinkomplex. Die übrigen Ergotoxinalkaloide wanderten ge¬
meinsam. Brindle u. Caries s u. Woodhead (3) studierten den pH-Ef¬fekt auf den Rf-Wert bei Verwendung von mit Zitrat-Phosphat gepufferten Papie¬ren und Chloroform oder Aether wassergesattigt als mobile Phasen. Ca ri e s s
(4) Übertrug dieses Verfahren auf Cellulosepulver-Kolonnen, auch mit dieser An¬
ordnung konnte er den Ergotoxinkomplex nicht auftrennen. Tanaka u. Sugava(5) untersuchten die zweidimensionale Chromatographie mit den mobilen Phasen
n-Butanol-Essigsaure + Wasser und Pyridin + n-Butanol + Wasser in Bezug auf
Alkaloidgemische aus Mutterkorn verschiedener Wirtspflanzen. Sie charakteri¬
sierten die Emzelalkaloide durch Bestimmung der durch Hydrolyse freigesetztenAminosäuren Tyler u. Schwarting (6) verwendeten mit Propylenglykol,Formamid oder Silikonharzen imprägnierte Papiere. Die mobile Phase bestand aus
Butanol + Essigsaure + Wasser oder aus dem wassrigen Anteil von Butanol + Was¬
ser vom pH 3,0 (Phosphat-Zitronensaure-Puffer Mac Ilvaine) (7). Als Rf-Werte erhielten sie für Lysergsaure (0,52 0,34), Ergotamiain (0,57 0,72), Ergo-novin (0,62 0,52), Ergonovinmaleat (0,64 0,50), Ergotamin (0,75 0,54), Ergota¬mintartrat (0,78 0,54), Ergometnnin (0,78 0,72), Ergotoxm (0,85 0,67), Ergo-timn (0,87 0,68). Das Ergotoxin verhalt sich jedoch auch bei diesem Vorgehen als
einheitliche Substanz. Fuchs u. Pohm (8) analysierten das Ergotoxin indi¬
rekt durch Bestimmung der hydrolytisch gespaltenen Aminosäuren. Als mobile
Phase verwendeten sie n-Butanol + Benzylalkohol + Wasser (1+1 + 2). Berg (9)
1. G.E. Foster, J. Macdonald u. T.S. Jones, J.Pharm.Pharmacol.h 802 (1949)
2. J.E. Carless u. H.B. Woodhead, Nature 168, 203 (1951)3. I.E. Carless, H. Brindle u. H.B. Woodhead, J.Pharm.Pharmacol.
3, 793 (1951)4. J.E. Carless, J.Pharm.Pharmacol. 5_, 883 (1953)5. K. Tanaka u. T. Sugava, J.Pharm.Soc.Japan 72, 616 (1952)6. V.E. Tyler u. A.E. Schwarting, J.Amer.pharm.Ass. ^1, 354 (1952)7. T.C. Mac Ilvaine, J.Biol.chem. 49, 183(1921)8. L. Fuchs u. M. Pohm, Scienùa pharmaceutica 19, 232 (1951)9. A.M. Berg, Pharm.Weekbl. 87, 282 (1952)
Diss. Universität Utrecht 1953
- 115 -
berichtet Über eine erfolgreiche Trennung der intakten ErgotoxinkomponentenErgocornin, Ergocryptin und Ergocrystin mit einem Benzol-Aether-Gemisch
(9+1) auf gepufferten (3,0) Rundfiltern. Pöhm u. Fuchs (1) erhielten
einen guten Trenneffekt unter Verwendung von Tetrachlorkohlenstoff + Chloro¬
form + Benzol (7+2+1) als mobile und mit Formamid, das 4 % Benzoesäure
enthielt, als stationäre Phase. Als Resultat erhielten sie, aufgeführt in der Trenn¬
folge Ergometrin und Ergometrinin (nicht gewandert), Ergotamin, Ergosin, Er¬
gotaminin, Ergosinin, Ergocristin, Ergocornin, Ergocryptin, Ergocristinin, Er¬
gocornin und Ergocryptinin. Mit Formamid, jedoch ohne Säurezusatz, als statio¬
näre Phase und mit Benzol + Chloroform (8 + 2) oder Benzol als bewegliche Pha¬
se trennten Macek, Cerny u. Semonsky (2) sowie Macek (3) Ergo¬tamin und Ergotaminin und die Zersetzungsprodukte des Ergotamintartrates.Tuzson u. Vas tagh (4) trennten mit Hilfe eines Gemisches von Toluol +
Petroläther + Methanol (25 + 25 + 10) den nativen vom hydrierten Ergotoxin-komplex, ohne dass jedoch die Komponenten der beiden Gemische einzeln aufge¬
tragen wären. Macek, Semonsky u. Mitarb. (5) trennten auf Formamid¬
papier mit Chloroform als mobile Phase Ergobasin (Rf = 0,03), Methylergobasin(Rf = 0,05), Ergobasinin (Rf = 0,19), Methylergobasinin (Rf = 0,33) und Ergotamin(Rf=0,86). Stoll u. Rtiegger (6) verwendeten 10-proz. Dimethylphthalataufgetragen mit Diisopropyläther als stationäre und ein Formamid-Wasser-Ge-
misch (4+6) für die Ergotamin-und Ergotoxin- (1 + 9), für die Ergobasin-und (1 + 4) für die hydrierte Ergotoxingruppe. Nach dieser Methode werden
sämtliche Mutterkorn-Alkaloide innerhalb dieser Gruppen voneinander und von
den dazugehörigen Isomeren getrennt, nachdem eine vorangehende Trennung eines
Gemisches sämtlicher Mutterkorn-Alkaloide in die Ergotamin-, Ergotoxin-, Er¬
gobasin- und die hydrierte Ergotoxingrüppen nach einer anderen Methode durch¬
geführt wurde. Der günstigste pH-Bereich zur Auftrennung ist für die Ergotoxin-und hydrierten Ergotoxin- 4,0, für die Ergotamin- 5,2 und für die Ergobasinalka-loide 5,0. J. Kolsek (7) trennte auf mit 50 % Formamid imprägnierten Pa¬
pieren Ergobasin (0,00), Ergobasinin (0,00), Ergotamin (0,12), Ergosin (0,15), Er¬
gotaminin (0,46), Ergosinin (0,49), Ergocornin (0,56), Ergocristinin (0,59), Ergo¬cryptin (0,71), Ergocorninin (0,83), Ergocristinin (0,84) und Ergocryptinin (0,87).Als mobile Phase diente ihm Benzol, in einigen Versuchen auch eine Benzol +
Chloroform-Mischung (8+2). Tanaka u. Kimura (8) empfehlen für die
zweidimensionale papierchromatographische Trennung von Mutterkorn-Alkaloiden
als mobile Phasen eine wässrige 1-proz. d-Weinsäurelösung und Essigsäure + Bu-
tanol + Wasser (1 + 4+5). Hörhammer u. Leue (9) untersuchten Ex-
tractum Seealis cornuti fluidum. Sie fanden im UV vier verschiedene Zonen vom
Rf-Wert 0,15 0,21 rot, 0,27 gelb und 0,96 hellbraun mit der mobilen Phase n-Bu-
tanol + Eisessig + Wasser (4+1 + 5). Thieleman, Lang u. Kaiser (10)
1. M. Pöhm u. L. Fuchs, Naturwissenschaften 41, 63 (1954)2. K. Macek, A. Cerny u. M. Semonsky, Pharmazie 9, 388 (1954)3. K. Macek, Pharmazie 9, 420 (1954)4. J. Tuzson u. G. Vastagh, Pharm.Acta Helv. 29, 118 (1954)5. K. Macek, M. Semonsky, S.Vanacek, V.Zikan u. A. Cerny,
Pharmazie £, 752 (1954)6. A. Stoll u. A. Rüegger, Helv.Chim.Acta 37, 1725(1954)7. J. Kolsek, Microchim.Acta (Wien) 1377 (1956J-8. M. Tanaka u. T..Kimura, J.pharmac.Soc.Japan 74, 430 (1954)9. L. Hörhammer u. K.W. Leue, Arch.Pharm. 288, 377 (1955)
10. E. Thielman, W. Lang u. H. Kaiser, Arch.Pharm. 286, 379 (1953)
- 116-
trennten mit o-Ameisensaureathylester + Spiritus dilutus + Isobutanol (5 + 9+2)Ergotamin (Rf= 0,71) und Ergobasin (Rf = 0,58). Blazek u. Bos wart (l)untersuchten papierchromatographisch nach der Methode von Brindle, Car¬
less u. Woodhead (2) und Berg (3) den Gehalt vonMutterkornalkaloi-
den auf Graserarten (Molina arundinacea und Molina coerula). S toll u.
Schlientz (4) berichten in einer Arbeit über Belichtungsprodukte von Mutter-
kornalkaloiden, dass Ergotamintartratlosungen,dem UV-Licht ausgesetzt,nebenkleinen Mengen von Lysergsaure noch ein weiteres Zersetzungsprodukt, das
Lumiergotamin enthalten, das papierchromatographisch nachzuweisen ist. Alte
Losungen von Ergotamin in Chloroform (siehe Narcotin, Strychnin und Emetin),in denen sich aus Ergotamin bereits Ergotaminin gebildet hatte, wurden eben¬
falls untersucht. Dabei konnten die Autoren nach Behandlung mit UV-Licht eben¬
falls kleine Mengen Lysergsaure und Lumiergotamin feststellen. Durch Kombi¬
nation des auf- und absteigenden Arbeitsverfahrens und verschiedener Losungs¬mittelsysteme gelang es Kolsek (5) nach der Methode von Macek die rechts -
drehenden Alkaloide der Ergotoxingruppe aufzutrennen. Soffel u. Rochel¬
meyer (6) trennten in ihren Wertbestimmungen von Seeale cornutum Stada
Ergometnn, Ergometrimn und die Abbauprodukte Lysergsaure, Ergin und ihre
Isomeren im System Butanol + Eisessig + Wasser (20 + 5 + 25) mittels Rund-
filterchromatogrammen. Die wasserunlöslichen Alkaloide trennten sich nicht
auf, störten aber die Trennung der wasserlöslichen Alkaloide nicht, da sie mit
der Lösungsmittelfront liefen. Die wasserunlöslichen Alkaloide werden von den
Autoren absteigend auf mit Formamid imprägnierten Papieren und Benzol als
mobile Phase aufgetrennt. Mit Mutterkorn-Alkaloiden befassten sich noch weite¬
re Autoren (7- 23).
1. Z. Blazek u. J. Böswart, Pharmazie 8, 851 (1952)2. H. Brindle, J.E. Carless u. H.B. Woodhead, J.Pharm.Pharmacol.
5, 793 (1951)3. A.M. Berg, Diss. Universität Utrecht (1953)4. A. Stoll u. W. Schlientz, Helv.Chim.Acta &S, 585 (1955)5. J Kolsek, Microchim.Acta (Wien) 1663, 1679(1956)6. W. Soffel u. H. Rochelmeyer, Pharm.Ztg. 101, 1059 (1956)7. V. Pedersen, Arch.Pharm.og.Chem. b2, 675 (1953T8. K. Macek, J. Hacaperkova, B Kakac, Pharmazie_11, 533 (1956)9. G B Marmi-Bettolo, J.A. Coch Frugoni, Gaz.Chim.Ital.
86, 1324 (1956)10. R. Schindler, A. Bürgin, Helv.Chim.Actaj39, 2132 (1956)11. D.P. Jones, H. Hatyama, E.V. Tyler, J.Amer.Pharm.Assoc.
46, 426 (1957)12 J. Reichelt, L. Ludek, Csekoslov.Farmac. 4, 404 (1955)13. J. Pita, V. Sapara, Csekoslov.Farmac. 5, 585 (1956)14. K. Macek, S Vanecek, Pharmazie _10, 422 (1955)15. J Buchi, A. Kapoor, H. Schumacher, Pharm.Acta Heiv.
32, 411 (1957)16. H. Rochelmeyer, E. Stahl, A. Patani, Arch.Pharm. 291, 1 (1958)17. E. Glaz, Acta pharmac.hung. _25, 11(1955), C 129, 3972(1958)18. H. Potter, ref.Pharm.Ztg. 103, 564 (1958)19. J. Reichelt, M. Sarsunova, Pharmazie_13, 21, 24 (1958)20 R. Voigt, Sci.pharm. 26, 83 (1958)21. R. Voigt, F Weiss, Pharmazie JJ3, 212, 319, 364 (1958)22. K.H. Renneberg, G.L. Szendey, Arch.Pharm. 291/63, 407 (1958)23. K. Mothes, F. Weygand, D. Groger, H. Griesbach, Z.Natur-
forschung 13b, 41(1958); Berlin TU Inst.f.Organ.Chem. C 129, 11565(1958)
- 117 -
b) Verfahren zur chromatographischen Auftrennung der Mutterkorn-Alkaloide
Die Auftrennung der Mutterkorn-Alkaloide der Ergotamingruppe erreichten
wir am besten unter Verwendung des Chromatographierverfahrens A und der mo¬
bilen Phase Wasser/Toluol-Isobutanol gesättigt bei einem pH von 4,4. Die Klima¬
tisationszeit beträgt eine Stunde. Zur Erhaltung runder Flecken wurden noch 3 %
Glyzerin zur mobilen Phase gegeben. Nach diesem Verfahren musste leider eine
Isomerisierung der Alkaloide festgestellt werden. Zur Identifizierung der Alkalo-
ide wird das UV-Licht und das Ehrlich-Reagens angewendet.
Fig. 27 Chromatogramm der Ergotamin-Alkaloide bei pH 4,4 (Verfahren B)
Rf-WERT
1. ERGOTAMIN 0,22
2. ERGOTAMINE 0,36
3. ERGOSIN 0,31
ERGOSININ 0,49
Durch Verwendung der folgenden mobilen Phase Formamid 60 T, Puffer nach Kolt-
hoff pH 4,6 80 T, Toluol/Isobutanol gesättigtes Wasser 20 T, dest. Wasser 40 T,
lassen sich Ergotamin, Ergotaminin und Dihydroergotamin einerseits und Ergono-
vin und Ergonovinin anderseits unter sich trennen. Diese Trennung ist stark pH-ab¬
hängig. Eine Umlagerung Konnte nur bei Ergotamin und Ergotaminin beobachtet wer¬
den. Die Klimatisationszeit beträgt 1 Stunde, die andern Versuchsbedingungen sind
dem Verfahren A gleich.
Fig. 28 Chromatogramm der Mutterkorn-Alkaloide bei pH 4,6
1
2
o
1 r\f -nu\
1 1. ERGOTAMIN 0,54
j 2. ERGOTAMININ 0,43
3
1
| 3. D.H.E. 0,63
00
"
r
1 1. ERGONOVIN 0,74
2 | 2. ERGONOVININ 0,52
- 118 -
c) Die papierchromatographische Reinheitsprtifung der Secale-Alkaloide
Nach gelungener Alkaloidtrennung bestimmten wir die Empfindlichkeit der
Reagenzien und Nachweismethoden gegenüber den Ergotamin- und Ergobasinal-
kaloiden. Tabelle 13 zeigt die Angaben aus der Literatur und die eigenen Bestim¬
mungen.
Tabelle 13
Alkaloid
Empfindlichkeit in Aig
Ehrlich-Reagens UV-Nachweis Autor
Ergonovin
Ergonovinin
Ergosin
ErgosininErgotaminErgotamininD.H.E.
(1)
(2)
0,2 (3)
(4)
(5)
0,2 (6)
(7)
(*)
Ein Vergleich der Empfindlichkeit zwischen der papierchromatographi-
schen Methode und den Prüfungsvorschriften der Ph.Helv.V für Ergonovintar-
trat ergibt, dass die erstere Methode die Nebenalkaloide in kleineren Mengen
erfasst und zudem eine Differenzierung der verunreinigenden Alkaloide ermög¬
licht. Sie übertrifft die Ph.-Prüfung mit Ammoniak, die titrimetrische Gehalts-
bestimmung und alle Farbreaktionen auf die Lysergsäure.
Kolsek, Microchim.Acta (Wien) 1377 (1956)Tuzson u. G. Vastagh, Pharm.Acta Helv. ^9, 118 (1954)E. Foster, J. Macdonald u. T.S.G. Jones, J.Pharm.Phar-
macol. h 802 (1949)Macek, A. Cerny u. M. Semonsky, Pharmazie 9, 388 (1954)Stoll u. A. Rüegger, Helv.Chim.Acta 37, 1725 (1954)
. Soffel, H. Rochelmeyer, Pharm.Ztg. 101, 1059 (1956)Büchi, H. Schumacher, A.L. Capoor, Pharm.Acta.Helv. 32,411
(*) eigene Untersuchungen 7J957)
1. J.2. J-3. G
4. K
5. A
6. W
7. J-
- 119 -
Als Prüfungs Vorschrift für die Pharmakopoe kann in Aus¬
sicht genommen werden:
Ergonovinum tartaricum Ph.Helv.V
"0,020 ml Stammlösung (entsprechend 100 Aig) werden auf die Startlinie
eines vorbereiteten Chromatographierpapiers Whatman No. 1 aufgetragen und
nach dem vorstehend aufgeführten Chromatographierverfahren bei pH 4,6 Chro¬
matographien. Das im UV-Licht betrachtete Chromatogramm darf nur einen blau
aufleuchtenden Fleck ohne Umlagerungserscheinung, und nach Trocknung im Trok-
kenschrank bei 100°, mit Ehrlichs-Reagens einen sich violettfärbenden Fleck vom
Rf-Wert ca. 0,74 zeigen, der durch leichtes Erwärmen schneller und intensiver
sichtbar wird."
- 120 -
Zusammenstellung der Rf - und pKg-Werte
Die folgende Uebersicht sollte uns Auskunft geben über das Vorhandensein von
Zusammenhängen zwischen festgestellten Rf- und pKg-Werten:
Rf PKBVerfahren A
pH 3,5 Morphin 0,03
Codein 0,09
Cryptopin 0,15
Thebain 0,39
Narcein 0,47
Papaverin 0,77
Narcotin 0,87
pH 6,6 Hydrastinin 0,02
Tropin 0,03
Berberin 0,06
Cephalein 0,08
Atropin 0,18
Emetin 0,22
Brucin 0,39
Scopolamin 0,51
Tropacocain 0,60
Strychnin 0,61
Apoatropin 0,65
Cocain 0,82
Hydras tin 0,93
Verfahren B
pH 3,6 Ergotamin 0,22 6,51
Ergosin 0,31 6,70
Ergotaminin 0,36 6,35
Ergosinin 0,49 6,80
8,22 9,29
8,26
8,58
8,46
2,77 9,49
6,36
6,60
>11,0
10,05
< 2,5 >11,0
7,75 8,74 10,1
9,83
7,85 9,12
8,37 >11,0
7,94
9,51
8,40 >11,0
10,04
8,85
6,61
- 121 -
% pKß
Verfahren B (mobile Phase gepuffert)
pH 3,6 Chinidin 0,50 4,47 8,62
Chinin 0,61 4,47 8,64
Cinchonin 0,66 4,38 8,51
Cinchonidin 0,66 4,40 8,72
pH 4,6 Ergotamin 0,54 6,51
Ergotaminin 0,42 6,35
Ergobasin 0,74 6,87
Ergobasinin 0,52 7,47
Dihydroergotamin 0,64
pH 6,6 d-Hyoscyamin 0,56
1 -Hyoscyamin 0,80 10,0
Verfahren C
pH 5,8 Tropin 0,03 10,05
d-Hyoscyamin 0,19
1-Hyoscyamin 0,29 10,00
Scopolamin 0,52 7,94
Apoatropin 0,65 10,04
Wie aus der Zusammenstellung ersichtlich ist, können keine Zusammenhänge
zwischen Rf- und pKg-Werten festgestellt werden.
- 122
Vergleich der Prüfungs vor s chrif ten der Ph.Helv.V und der
papierchromatographi sehen Prüfung
Im folgenden haben wir die Resultate unserer vergleichenden Ueberpriifung
der Empfindlichkeiten zusammengestellt:
Alkaloide
Solanaceen
Coca
Cinchona
Opium
Hydrastis
Ipecacuanha
Strychnos
Seeale
Empfindlichkeit
Ph.Helv.V - Vorschriften Papierchromatographie
+ (bei Alkaloid-
mischungen wie
Extrakt und Opial
+ (bei Extrakt)
+
+
Unsere Resultate lassen erkennen, dass die papierchromatographische Reinheits-
prüfung bei den meisten Alkaloidsalzen den Vorzug verdient und deshalb von der
Pharmakopoe eingeführt werden sollte.
In unserer Arbeit untersuchten wir Alkaloide folgender Firmen:
Böhringer u. Söhne AG., Mannheim
British Drug Houses Ltd., Poole
F. Hoffmann-La Roche u. Cie. AG., Basel
Light u. Co. Ltd., London
E. Merck AG., Darmstadt
Sandoz AG., Basel
vorm. B. Siegfried AG., Zofingen
Wir sind den Firmen F. Hoffmann-La Roche und Sandoz AG. für die freundliche
Ueberlassung der wertvollen Alkaloidpräparate zu aufrichtigem Dank verpflichtet.
- 123 -
VI. Quantitative Alkaloidbes timmung mit Hilfe der Papier¬
chromatographie
a) Literaturbearbeitung
Zahlreiche Arbeiten wurden mit dem Ziele unternommen, die Papierchro-
matogramme quantitativ auszuwerten. Die folgenden Möglichkeiten zur quantita¬
tiven Erfassung von papierchromatographisch isolierten Substanzen sind in der
Literatur beschrieben worden:
A. Nach dem Entwickeln der Substanzgemische werden die aufgetrennten Sub¬
stanzen auf irgend eine Weise sichtbar gemacht und die Grösse bzw. die Stär¬
ke der auftretenden Flecken auf dem Papier auf optischem Wege mit Proben
von bekanntem Gehalt verglichen. Diese Methode las st sich folgendermassen
auswerten:
1. Direkter visueller Vergleich der Flecken mit solchen von Testproben, die
als Leitsubstanzen mitchromatographiert wurden (1).
2. Schrittweise photometrische Auswertung im durchfallenden Licht. Die Ex¬
tinktion wird als Funktion der Wellenlänge auf Millimeterpapier aufgetra¬
gen. Die Substanzmenge berechnet sich aus der Fläche zwischen Extink¬
tionskurve und der Linie, welche die Extinktion des Papieres darstellt (2).
1. E. Work, Biochem.Biophysicy Acta 3, 400 (1949)R. Consden, A.H. Gordon u. H.J. Martin, Biochem.J.
41, 596 (1947)C.E. Dent, Biochem.J. 41, 24Ö~7l947)O. Högl, Z.U.L. 95, 177~{i952)A.H. Gordon, Discuss.Faraday Soc. ]_, 128 (1949)E. Beerstecher jr., Analyt.Chem. 22, 1200 (1950)L.S. Fosdick u. R.Q. Blackwell, Science 109, 314 (1949)
2.L.S. Fosdick u. R.Q. Blackwell, Science 109, 314 (1949)W. Grassmann u. K. Hannig, Z.physiol.Chem. 290, 1 (1952)R.J. Block, Science 108, 608 (1948)H.B. Bull, J.W. Hahn u. V.H. Baptist, J.Amer.Chem.Soc.
71, 550 (1949)A.Poison, V.M. Rosley u. R.W. Wykoff, Science 105, 603 (1947)
- 124 -
3. Nach der Sichtbarmachung werden die Chromatogramme Photographien
und die Negative wie unter 2. ausgemessen (1).
4. Nach dem Sichtbarmachen werden die maximalen Farbdichten der Flecken
mit dem photoelektrischen Densitor auf dem Papier ausgemessen (2).
5. Die Grösse bzw. die Länge der Flecken wird planimetrisch oder durch
Auszählen auf Millimeterpapier bestimmt, oder das betreffende Papier¬
stück wird gewogen (3).
6. Werden radioaktive Elemente in die Substanz eingebaut, so kann die Strah¬
lung in geeigneter Weise bestimmt und damit die Menge des Stoffes ermit¬
telt werden (4).
7. Gewisse, auch nicht fluoreszierende Stoffe absorbieren im UV bei bestimm¬
ten Wellenlängen (Purine bei 2600 a). Im Photoabdruck sieht man helle
Flecken, die planimetriert werden (5).
8. Vitamine resp. Antibiotika können mikrobiologisch sichtbar gemacht wer¬
den, indem man die Papierstreifen auf eine Bakterienart legt, die das be¬
treffende Vitamin zum Wachstum benötigt, resp. durch das Antibiotikum
im Wachstum gehemmt wird. Nach Abheben des Papiers ist der Agar an
der entsprechenden Stelle bei den Vitaminen getrübt, bei den Antibiotika
klar. Von der Agarplatte wird eine Fotographie hergestellt, die planime¬
trisch oder photometrisch ausgewertet wird (6).
1. R.B.Fisher, D.B.Parson u. G.A.Morrison, Nature 161,746(1948)C. Gustafsson u. J.Sundman Linth, Paper and Timber 33,1 (1951)R.C. Bromley, Nature 163, 215 (1949)A. R. Patton, Analyt.Chem. 23, 168(1951)J. Brüggmann u. K. Drepper, Naturwiss. ^9, 301 (1952)
2. R.J. Block, Science 108, 608 (1948)Proc.Soc.Exptl.Biol.Med. 72, 337 (1949)Analyt.Chem. TL, 1327 (1950)
3. R.B.Fisher, D.B.Parson u. G.A.Morrison, Nature 161,746(1948)E.F. McFarren, E.F.Brand u. H
.R. Rutkowsky, Analyt.Chem.
^3, 1146(1951)H.B.Bull, J.W.Hahn u. V.H.Baptist, J.Am.Chem.Soc. 71,550 (1949)R.B.Fisher, D.B.Parson u. G.A.Morrison, NatureÏ6"4,183(1949)O.E.Schultz u. D.Strauss, Dtsche Apoth.Ztg. 95, 642 (1955)
4. R.C. Brimley, Nature 163, 215 (1949)5. R. Markham u. J.D. Smith, Biochem.J. 45, 294 (1949)6. W. u. A.Winsten u. E.Eigen, Proc.exp.Biol.Med. £7, 513 (1948)
- 125 -
B. Man lasst zusammen mit der mobilen Phase eine Reagenzlosung mitlaufen.
Trifft die Losung auf die reagierende Substanz, so bildet sich eine Lücke,
deren Grosse der Substanzmenge proportional ist (1).
C. Das Papierchromatogramm wird zerschnitten, worauf die Stoffe aus dem
Papier herausgelost und mittels Mikromethoäen (polarographisch, spektro-
photometrisch oder biologisch) bestimmt werden (2).
D. Man stellt Durchlaufchromatogramme her, sammelt die einzelnen Fraktio¬
nen und bestimmt diese mittels geeigneten quantitativen Methoden.
So zahlreich die Arbeiten über quantitative papierchromatographische Be¬
stimmungen sind, so beziehen sie sich mit wenigen Ausnahmen auf zwei Stoff¬
gruppen, nämlich die Aminosäuren und die Zuckerarten. Ueber andere Stoffgrup¬
pen und besonders über Alkaloide liegen nur wemge Arbeiten vor. Uns sind nur
die folgenden Untersuchungen über quantitative Bestimmungen von Alkaloiden be¬
kannt:
Svendsen (3) bestimmte papierchromatographisch-kolorimetnsch Mor¬
phin in Opium und Opiumtinktur. Als mobile Phase diente in seinen Versuchen
Amylazetat + Ameisensaure + Wasser (10 +1 + 3). Das chromatographisch ab¬
getrennte Morphin wurde eluiert, mit Nitrit und Ammoniak behandelt und mittels
Spektrophotometer kolorimetnert. Bei dieser Methode fand er Einzelabweichun-
gen von t 3 %, die Mittelzahl ist hingegen nahe an der berechneten Konzentration.
Ferner vergleicht er die Resultate mit denen der Bestimmungsmethoden der
Ph.Sued.XI, Ph.Norv.V und der Ph.Helv.V. Die Durchschnittszahlen seiner papier-
1. Th. Wieland, Angew.Chem. 60, 250, 313 (1948) ; Naturwiss. 35, 29 (1948)2. F. Cramer, Angew.Chem. b2, 73 (1950)CE. Dent, Biochem.J. 41, 240 (1947)R. Consden, A.H. Gordon u. H.J. Martin, Angew.Chemie
61, 367 (1949)H. Flood, E. Hirst u. J Jones, Nature 160, 86 (1947)H. Sulser, Lebensmitteluntersuchung 42, 376 (1951)CE. Dent, F.C Heward u. W. Stepka, Nature 160, 682 (1947)A.B. Svendsen, Pharm.Acta Helv. 26, 323 (1951)
Medd.fra norsk Farm.Selsk. 17, 116 (1955)E . W o o k, Biochem.biophysica Acta N.Y. Z, 400"[T949)
3. A.B. Svendsen, Pharm.Acta Helv. 26, 323 (1951)
- 126-
chromatographisch-kolorimetrischen Bestimmungen nach der Methode von
O F. Granicher kamen denjemgen der Ph.Helv.V am nächsten (1). Die Ab¬
weichungen des Morphingehaltes ein und desselben Musters waren sehr gering
(+0,21%, -0,14%). In einer spateren Arbeit untersuchte Svendsen (2)
zwei papierchromatographische Verfahren, ein Ausschneideverfahren, das auf
der Elution des chromatographierten Morphins und nachfolgender Bestimmung
im Spektrophotometer fus st, und ein Densitometerverfahren. Das erstere er¬
wies sich dem Densitometer-Verfahren überlegen. In beiden Verfahren verwen¬
det er ein Gemisch von Butanol + Toluol + Essigsaure + Wasser (20+ 10+3+9)
als mobile Phase. Wegen der Störung des Chloridions (bedingt unebenen Fleck)
bei der densitometrischen Bestimmung tragt er Morphin als Base oder Azetat
auf. Folgende Tabelle gibt die Resultate von verschiedenen Bestimmungen:
Opiummus ter
1 2 3 4 5
1,98 10,72 11,25 11,18 16,24 %
i,75 10,23 11,23 11,78 17,45 %
:,73 13,20 11,73 12,93 18,40 %
Verfahren:
Ph Helv.V
(Mittel)
Papierchromatographie(Mittel) (kolorimetrisch)
Papierchromatographie(Mittel) (densitometrisch)
Aus der Tabelle geht hervor, das s eine gewisse Uebereinstimmung zwischen den
Ergebnissen der Ph.Helv.V-Methode und der papierchromatographischen Methode
herrscht. Die Resultate, die nach der papierchromatographischen-densitometri-
schen Methode erhalten werden, liegen alle viel hoher. Nach Svendsen (2) sollte
es mittels der angegebenen Methode möglich sein, ein wahrscheinlich annähernd
richtiges Bild des wirklichen Inhaltes des Morphins in den untersuchten Opiummu¬
stern zu erhalten.
Aus der Tabelle lasst sich ferner erkennen, dass die papierchromatogra-
phisch-kolonmetrisch bestimmten Werte der ersten drei Muster unter denjeni¬
gen Werten, die titnmetrisch nach der Methode der Ph.Helv.V gefunden wurden,
1. O.F. Granicher, Ueber die Bestimmung des Morphins im OpiumDiss. ETH Zurich (1936)
2. A.B Svendsen, E D. Aarnes u A Paulsen, Medd.fra Norsk
Farm.Selsk. 17, 116(1955)
- 127 -
liegen. Wir untersuchten daher die Titrationsrückstande der Morphinbestim-
mungen aus Opium nach der Methode der Ph.Helv.V und fanden noch folgende Al-
kaloide vor: Codein, Thebain und Narcotin. Eine Erklärung für die Werte der
Muster 4 und 5, die hoher liegen als diejenigen der Ph.Helv.V - Methode,fanden
wir hingegen nicht. Schultz u. Strauss (1) untersuchten Morphin und Bru-
cin enthaltende Galemca quantitativ papierchromatographisch. Mobile Phase war
Butanol + Eisessig + Wasser (100+ 20 + 53,5) und Butanol + Ameisensaure + Was¬
ser (120+20+70). Sie gingen ferner den äusseren Einflüssen auf die quantitative
papierchromatographische Bestimmung wie Steighohe, Papiersattigung, Ausdeh¬
nung des Ausgangsflecks, Sprühreagens, Losungsmittel und Fleckenflache zum
Substanzgehalt nach. Sie fanden, dass bei den von ihnen untersuchten Alkaloiden
die lineare Proportion Fleckengrosse zum Logarithmus des Substanzgehaltes
nur bei kleinen Konzentrationen und bei kleinen Steighohen erhalten bleibt. Sie
berechneten die Substanzmenge nach der Formel von Fi sher (2):
ul (ui + u2) " ^sl+s2^>°s—
,VU2) + ,VS2,»**
s. und s„ = bekannte Substanzmengen
u, und u„ = unbekannte Substanzmengen
Z = gesuchte Substanzmenge
Die Autoren geben nach obiger Berechnung eine Bestimmungsgenauigkeit von
t 5-10 % bei Verwendung von 40-80 ug Substanz und einer Steighohe von 100 -
130 mm an. Asahina u. Ono (3) untersuchten Opiumtinkturen auf den Ge¬
halt an Morphin. Als mobile Phase diente Butanol + Ammoniak + Wasser (50+9 +
15). Sie arbeiteten mit einem Beckman DU Spektrophotometer und mit Jod-Kahum-
platinat als Reagens. Nach dieser Methode fanden sie einen Gehalt von 1,07 %
Morphin bei einem berechneten Gehalt von 1,00 % M ira m u. Pfeifer (4)
untersuchten Codein und Papavenn photometrisch.
1. O.E.Schultz u. D.Strauss, Dtsche Apoth.Ztg. j)5, 642 (1955)2. R.B.Fisher, D.S.Parsons u. G.A.Morrison, Nature 161,746(1948)3. H.Asahina u. M.Ono, Nations Unies Secrétariat ST/SOA/SER. K/40
(1955). Dosage, Caractéristiques Composition et Origine de l'opium4. R.Miram u. S.Pfeiffer, Pharm.Zthalle 96, 457 (1957)
- 128
0,369 0,393 %
0,297 0,302 %
0,345 0,377 %
Reichelt (l) extrahiert die papierchromatographisch getrennten Alka¬
loide mittels eines Gemisches von Aethanol + Essigsäure + Wasser (5+6+89).
Das Eluat wird quantitativ durch einen G2-Filter in ein Glaskölbchen von 10 ml
filtriert und mit Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die zu bestimmenden Proben wer¬
den in eine Glasschale gebracht, das Lösungsmittel auf dem siedenden Wasser¬
bad verdampft,und anschliessend die Alkaloide nitriert und kolorimetriert.
Reichelt vergleicht in der folgenden Tabelle die papierchromatographisch
getrennten und kolorimetrisch bestimmten Resultate mit der Bestimmungsme¬
thode des DAB 6 für Folium Belladonnae DAß 6 :
Atropin (Hyoscyamin) Scopolamin Summe DAB 6
1. 0,343 0,026
2. 0,272 0,025
3. 0,313 0,032
Romeike (2) eluiert die papierchromatographisch getrennten Alkaloide (Atro¬
pin und Scopolamin) mit Ammoniak und Chloroform, filtriert und schüttelt mit
Essigsäure aus. Der essigsaure Extrakt wird auf dem Wasserbad eingedampft,
mit dem Reagens versetzt und kolorimetriert. Die Autorin gibt einen Fehler von
10 % an.
Die quantitative Bestimmung der Mutterkornalkaloide mittels Papierchroma¬
tographie ist schon oft beschrieben worden. Sie erfolgt entweder direkt auf dem
Papier oder nach Elution der Alkaloide aus dem Chromatogramm. Eine annähern¬
de Bestimmung der Alkaloidkonzentration auf dem Papier kann durch den Ver¬
gleich der Intensität im UV-Licht blau fluoreszierender Flecke mit Vergleichs¬
lösungen verschiedener Konzentration erfolgen. Foster, Macdonald u.
Jones (3) benutzten diese Methode.Bei ihrem visuellen Vergleich - auch die
Fluoreszenz der Alkaloide ist verschieden - stellten die Autoren Fehler von
t 20 % fest. Eine weitere Methode zur quantitativen Auswertung von Chromato-
grammen besteht in der Planimetrierung der Flecken. Obige Autoren haben diese
1. J. Reichelt, Pharmazie 9, 968 (1954)2. A. Romeike, Pharmazie T, 496 (1952); 8, 672, 729 (1953)3. G.E. Foster, J. Macdonald u. T.S.G. Jones, J.Pharm.
Pharmacol. 1, 802 (1949)
- 129 -
Methode ebenfalls versucht, aber keine zufriedenstellenden Resultate erhalten.
Ebenso mis slangen die vergleichenden Versuche von Brindle, Carless
u. Woodhead (1), die mit Dragendorffs- und Ehrlichs-Reagens hervorgeru¬
fene Standardflecken von bekannter mit solchen von unbekannter Konzentration
verglichen. Quinn, Jeffrey u. MacAulay (2) bestimmten die Solana¬
ceen auf densitometrischem Wege. Als letzte quantitative Möglichkeit bleibt die
Elution der Substanzen vom Papier und die Bestimmung des Alkaloidgehaltes im
Eluat auf kolonmetrischem Wege. Brindle, Carless u. Woodhead (1)
stellten beim Eluieren aber erhebliche Substanzverluste fest. Im besten Falle
konnten die Autoren 96 % der aufgetragenen Alkaloide wiederfinden. Durch Ver¬
wendung von 50-proz. Alkohol konnten sie die irreversible Adsorption vermei¬
den. Das zu eluierende Papier wurde in einen Trog gehangt, das Aethanol hes-
sen sie aufsteigen. Auf diese Weise eluierten sie die totale Alkaloidmenge.
Thielman, Lang u. Kaiser (3) extrahierten mit einer alkoholischen
Weinsaurelosung. Mit dieser Methode erhielten sie einen durchschnittlichen
Fehler von 3,4 % Pohm u. Fuchs (4) schüttelten die im UV-Licht mar¬
kierten und ausgeschnittenen Flecken in einer Schliffepruvette mit einem Ge¬
misch von 1-proz. wassriger Ameisensaurelosung und Ehrlichreagens (1 + 2)
bis eine Papierzerfaserung eintrat. Die blau gefärbte Losung wird durch eine
Glasfilternutsche filtriert und die klare Losung kolonmetnert. Auf diese Wei¬
se konnte die zugefugte Alkaloidmenge wiedergefunden werden. Macek u.
Mitarb. (5) arbeiteten nach der gleichen Methode. Auch ihnen gelang es, die
gesamte Alkaloidmenge zu eluieren und zu bestimmen. Die Reaktion zwischen
dem Ehrlich-Reagens und den Mutterkornalkaloiden führt zur Bildung von blau
gefärbten Lysergsaureverbmdungen (6). Belichtung mit UV-Strahlen steigert
die Farbintensitat erheblich. Silber u. Schulze (7) haben von dieser
1. H. Brindle, I.E. Carless u. H.B. Woodhead, J.Pharm.Pharmacol. 3, 793 (1951)
2. T.J. Quinn, J.G. Jeffrey, W.C. Macaulay, J.am.pharm.Assoc.46, 384 (1957)
3. E. Thielman, W. Lang u. H. Kaiser, Arch.Pharm. 286, 379 (1953)4. M. Pöhm u. L. Fuchs, Naturwiss. 4L 63 (1954)5. K. Macek, M. Semonsky, S. Vanacek, V. Zikan u. A. Cerny,
Pharmazie 9, 752 (1954)6. M. Pohm, Arch.Pharm. 286, 509 (1953)7. A. Silber, T Schulze, Pharmazie 8, 675 (1953)
- 130-
Eigenschaft bei der quantitativen Bestimmung kleiner Alkaloidmengen in Ein-
zelsklerotien Gebrauch gemacht. Dieselben Autoren stellten fest, das s eine be¬
stimmte Belichtungszeit auf die Farbbildung fördernd wirkt, längeres Belichten
dagegen infolge Zersetzung der Alkaloide eine Abnahme der Extinktionskurve
hervorruft. Kolsek (1) bestimmte in seinen eingehenden Untersuchungen die
günstigste Belichtungszeit, die scheinbar zwischen 7-10 Minuten liegt. Ferner
vergleicht er die Extinktionskurven von Pöhm u. Fuchs (2) mit den seini¬
gen und findet höhere Werte für die Kurve von Pöhm u. Fuchs. Als Er¬
klärung dafür gibt er eine durch Versuche erwiesene Zersetzung der Alkaloide
an. Eine solche trat auch dann ein, wenn die Belichtungsdauer nur 15 Sekunden
betrug. Da der Nachweis der Mutterkomalkaloide nach erfolgter chromatogra¬
phischer Trennung fast ausschliesslich mit UV-Licht durchgeführt wird, ist
nach Kolsek (1) eine quantitative exakte Bestimmung der absoluten Alkaloid-
menge nicht mit voller Sicherheit durchführbar. Thielman, Lang u. Kai¬
ser (3) bestimmten papierchromatographisch die Mutterkorn-Gesamtalkaloide
und quantitativ die Alkaloide der Ergotamin- und Ergotoxingruppe. Die quantita¬
tive Bestimmung wurde kolorimetrisch durchgeführt. Die erhaltenen Fehler lie¬
gen zwischen 0-7 %. Kolsek (4) bestimmte in seiner letzten Arbeit die Kon¬
zentration papierchromatographisch getrennter Mutterkomalkaloide nach der Me¬
thode von Pöhm u. Fuchs (2). Die Fehlergrenze soll darnach 1-2 % be¬
tragen. Jones, Katyama, Tyler bestimmten nach der Formel AR' =
Rl yug Alkaloid, die papierchromatographisch getrennten Alkaloide Ergotamin
und Ergotoxin (5).
1. J. Kolsek, Microchim.Acta (Wien) 1500 (1956)2. M. Pöhm u. L. Fuchs, Naturwiss. 4L 63 (1954)3. E. Thielman, W. Lang u. H. Kaiser, Arch.Pharm. 288, 377 (1955)4. J. Kolsek, Microchim.Acta (Wien) 1679 (1956)5. D.D. Jones, H. Katyama u. V.E. Tyler jr., J.am.pharm.Assoc.
46, 726 (1957)
- 131 -
b) Kritische Beurteilung der Methoden
So gut die Resultate der aufgeführten quantitativen Alkaloidbestimmungen
sind, so kommen für uns vorerst kolorimetrische, densitometrische und photo¬
metrische Methoden nicht in Frage, da sie apparativ zu teuer und methodisch
zu kompliziert sind für den praktischen Gebrauch. Aus diesen Gründen können
wir, wie aus der vorstehenden Zusammenstellung ersichtlich ist, nur Methoden
verwenden nach A 5 oder B. Trotz Einschränkung durch die Arbeit von
Schultz u. Strauss (1) (kleine Steighöhe und kleine Substanzmengen) ent¬
schlossen wir uns zu einer planimetrischen rechnerischen Gehaltsbestimmung,
d.h. zur Verwendung von Planimeter und Millimeterpapier, nach der Methode A 5.
c) Zusammenstellung der die Gehaltsbestimmung beeinflussenden Faktoren
Als Fehlermöglichkeiten und Faktoren, die eine papierchromatographische
quantitative Bestimmungsmethode beeinflussen, seien erwähnt:
- Fehler bei der Herstellung der zu chromatographierenden Lösungen
- Fehler beim Dosieren und Auftragen der Lösungen
- Nachsaugen von Lösung aus der Pipette beim Auftragen
- die Inhomogenität in der Struktur des Papiers
- unterschiedliche Handhabung der einzelnen Papierchromatogrammebei der Pufferung
- Trocknung und Lagerung beim Chromatographieren, beim Trocknen
und beim Besprühen.
1. Genauigkeit beim Auftragen der Substanz
Um solche quantitative Versuche überhaupt durchfuhren zu können, war es not¬
wendig, eine Bürette, Pipette oder Spritze zu eichen, die es erlaubt, 1 /iû mit
grosser Ablesegenauigkeit auf das Papier zu geben. Bei unseren Versuchen ver¬
wendeten wir eine "Agla Spritze" (Fa. Burrough Wellcome u. Co., London), die
eine Ablesegenauigkeit von 0,2 «1 gestattet. Zur Eichung derselben benutzten wir
nach Schonländer (2) Quecksilber als Verdrängungsflüssigkeit. Die Spritze
1. O.E. Schultz u. D. Strauss, Dtsche Apoth.Ztg. 95, 642 (1955)2. P.F. Schonländer, G.A. Edwards u. L. Irving, J.Biol.Chem.
148, 495 (1943)
- 132 -
gestattet, 10 Ail mit einem Fehler von t 0,05 yul, d.h. t 1/2 % aufzutragen. Um
das Nachsaugen der Losung durch das Whatman-Papier zu vermeiden, wurde die
Injektionsnadel mit dem Papier nur kurze Zeit in Berührung gebracht.
2. Grosse der aufgetragenen Startflecken
Patton (1) schreibt bei seiner densitometrischen Auswertung von Papierchro-
matogrammen, das s man beim Auftragen von 2 au am besten chromatographle¬
ren könne. Dabei entsteht ein Startfleck von stets gleichbleibender Grosse.
S ul s e r u. H ögl (2) fanden bei ihren photometrischen Bestimmungen von
Chromatogrammen die grosste Proportionalität ebenfalls bei Verwendung von
2 «1 Losungsmittel.
Nach unseren Feststellungen entstehen beim Auftragen von gleichen Flüssig¬
keitsmengen in einem Mal stets gleich grosse Flecken. Im folgenden untersuch¬
ten wir den Emfluss verschieden grosser Flüssigkeitsmengen auf die Grosse der
Startflecken. Wir prüften diesen Einfluss mit einer Brucmreihe, die 50 Aig in je
5 All, 10 All und 20/ul Losungsmittel enthielt. Die gesamten Losungsmengen wur¬
den auf die Startlinie aufgetragen, getrocknet, mit Dragendorffs-Reagens sicht¬
bar gemacht und plammetrisch mit dem "Aristo"-Plammeter (Fa. Dennert u.
Pape, Hamburg) ausgemessen. Probemessungen auf Millimeterpapier ergaben
eine gute Messgenauigkeit (t 0,02 cm2) für den Plammeter. Wie aus Tabelle 14
ersichtlich ist, erhielten wir mit den verschiedenen Flussigkeitsmengen Start¬
flecken von 50, 75 resp. 100 mm^ (+ 2 %). Ein in gleicher Weise nochmals vor¬
bereitetes Chromatogramm wurde nach dem Chromatographlerverfahren A bei
pH 6,6 entwickelt und mit Dragendorffs-Reagens sichtbar gemacht. Die Auswer¬
tung der Endflecken erfolgte nach Umrandung mit Bleistift. Zur genauen Umran¬
dung wurde ein Beleuchtungskasten verwendet, der mit einer blauen, roten und
weissen Lampe ausgerüstet war. Dadurch konnten wir eine maximale Kontrast¬
wirkung und scharfe Umrandung erzielen Die planimetrische Bestimmung der
Endflecken ergab uns folgende Werte:
1. A.R. Patton, Analyt.Chem. ^3, 168 (1951)
2. H. Sulser u. O. Hogl, Lebensmitteluntersuchung 44, 79 (1953)
- 133 -
Tabelle 14
Einfluss der Losungsmengen auf die Grosse der Start- und Endflecken
Brucin 50 Aig in
Startfleck
Endfleck 1
2
3
4
Mittel
Abweichung +
5^ 10 /ul 20/ul
50 mm2 75 mm2 100 mm2.
190 mm2
180 mm2
176 mm2
178 mm2
280 mm2
276 mm2
282 mm2
278 mm2
420 mm2
418 mm2
420 mm2
423 mm2
181 mm2 279 mm2 420,25 mm2
5%3%
1,2%
1,2%
0.6%
0.8%
Diese Resultate lassen erkennen, das s uns verschieden grosse Losungsmittel -
mengen mit gleichen Alkaloidmengen verschieden grosse Startflecke ergaben,
welche verschieden grosse Endflecken lieferten. Gleiche Alkaloidmen¬
gen ergeben nur dann gleich grosse Endflecke, wenn sie
aus gleich grossen Startflecken entwickelt wurden. Rein me¬
thodisch ist es möglich, unter folgenden Bedingungen gleich grosse Startflecken
auf das Chromatographlerpapier zu setzen:
1. Bei gleicher Stoffkonzentration und gleicher Flussigkeitsmenge,
2. Bei verschiedener Stoffkonzentration und gleicher Flüssigkeitsmenge,
3. Bei gleicher oder verschiedener Stoffkonzentration und verschiedenen
Flüssigkeitsmengen.
Dies kann mit Hilfe der "Agla"-Mikrometerspritze erreicht werden, wenn der
erste abfallende Tropfen auf der Startlinie sich ausbreiten und lufttrocknen ge¬
lassen wira. Hierauf markiert man die Umrandung des Fleckens und sorgt beim
weiteren Auftragen der Losung dafür, dass sich die Flüssigkeit nicht über den
Fleckenrand ausbreitet. Zwischen den einzelnen Auftragungen muss jeweilen ge¬
trocknet werden. In dieser Weise kann man die Grossenunterschiede der Start¬
flecken innerhalb von i 2 % halten.
- 134
3. Bildung konstanter Endflecken-G rös s en
Im folgenden war zu untersuchen, ob aus gleich grossen Startflecken mit glei¬
chen Alkaloidmengen konstante Endflecken-Grössen zu erhalten sind. Zur Ab¬
klärung dieser Frage brachten wir Tropfen mit 50 «g Brucin resp. Strychnin in
10 au Chloroform auf die Startlinie von je einem Chromatographierpapier und
sorgten für die Bildung gleich grosser Startflecke (Î 2 %). Hierauf entwickelten
wir die beiden Papiere nach dem Chromatographierverfahren A bei pH 6,6, trock¬
neten in der Luft.und machten die Endflecken mit Dragendorffs-Reagens sicht¬
bar. Die planimetrische Auswertung der Endflecken ist in Tabelle 15 zusammen¬
gestellt.
Tabelle 15
Einfluss der Grösse des Startfleckens auf den Endfleck
50 ug Brucin 50 >ug Strychnin
Startfleck (t 2%) 100 mm2 100 mm2
Endflecken 1
2
3
4
5
6
280 mm2
280 mm2
285 mm2
275 mm2
278 mm2
283 mm2
350 mm2
345 mm2
353 mm2348 mm2354 mm2351 mm2
Mittel 280,16 mm2 350,16 mm2
Abweichung + 1,7%1,9%
1,1%1,5%
Bei kleineren Rf-Werten (Brucin = 0,39) werden kleinere und schöner begrenzte
Endflecken erhalten. Die mit Strychnin (= 0,61) gewonnenen Werte der Flecken
sind infolge längerer Laufstrecke grösser und die Flecken selbst weniger scharf
begrenzt. Die Abweichungen von der mittleren Fleckengrösse sind für Brucin und
Strychnin etwa gleich und betragen ca. t 2 %. Unter Voraussetzung der Einhaltung
von gleich grossen Startflecken mit gleichen Alkaloidmengen, lassen sich End¬
flecken von hinreichend konstanter Grösse erhalten.
- 135 -
Mit verschieden grossen Alkaloidmengen in der gleichen FlUssigkeitsmenge ist
unter Einhaltung gleich grosser Startflecke eine lineare Abhängigkeit zwischen
aufgetragener Alkaloidmenge und dem gefundenen Endflecken-Wert festzustel¬
len. Zum Beweis dieser Feststellung trugen wir die in Tabelle 16 angeführten
Brucin- resp. Strychninmengen auf je ein Chromatographierpapier unter Verwen¬
dung gleicher Lösungsmengen und Einhaltung gleicher Startfleckengrössen von
je 100 mm2 auf und entwickelten die beiden Papiere nach dem Chromatographier-
verfahren A bei pH 6,6, besprühten mit Dragendorffs-Reagens und planimetrier-
ten die erhaltenen Endflecken.
Tabelle 16
Beziehungen zwischen den Alkaloidmengen und den Grössen der Endflecken
Brucin Strychnin
25y«g 75,ug 100/ug 25^ 75^ 100 yUg
Endfleckengrös sen
(in mm2)180
180
175
270
280
275
390
395
385
250
250
250
350
345
340
550
545
520
Mittel 178,3 275 390 250 345 538
Abweichung + 1%2%
2%2%
1,4%1,4%
0%0%
1,5%1,5%
2,2%3,3%
Die Rf-Werte sämtlicher Brucin- (= 0,39) und Strychninflecke (= 0,61) waren
gleich. Die Endfleckengrös sen nehmen eindeutig zu mit grösseren Alkaloidmen¬
gen. Die Abhängigkeit zwischen aufgetragener Alkaloidmenge und Endflecken¬
grösse ist linear, wie aus Fig. 29 hervorgeht.
Unter den Bedingungen, die wir in diesen Versuchen einhielten, lassen sich so¬
mit quantitative Beziehungen anstellen zwischen der aufgetragenen Alkaloidmenge
und der Endfleckengrösse. Die bei Brucin und Strychnin festgestellten Abweichun¬
gen liegen zwischen t 3,3 %. Nach unseren Erfahrungen bestehen lineare Bezie¬
hungen beim Chromatographieren einzelner Alkaloide auch bei geringern und
grösseren Mengen.
- 136-
620
600
500
Q
400
300-
200-
150
> = STRYCHNIN
> = BRUCIN
Fig. 29
Abhängigkeit von Alkaloidmenge und Endfleckengrösse
50
SUBSTANZMENGE
100 ug
- 137 -
Beim Vorliegen von Alkaloidgemischen schrankt sich diese Gesetzmäs¬
sigkeit auf engere Mengenbereiche ein, wie Fisher u. Mitarb. (1) bei ih¬
rer papierchromatographisch-photometrischen Gehaltsbestimmungsmethode
feststellten. Dies prüften wir in der Weise nach, das s wir die Konzentration /ig
in 20 Ail Alkaloidlosung so lange erhöhten, bis die lineare Abhängigkeit grob ge¬
stört wurde. Diese Störung trat bei 150/ig Strychnin neben 25/ig Brucin ein. Als
gunstigsten quantitativen Bestimmungsbereich fanden wir 25- 100/ig Alkaloidge-
misch.
Von Bedeutung fur die Beurteilung der Methode war es, zu wissen, wie gross einer¬
seits die Streuung zwischen Parallelversuchen auf dem gleichen Papierbogen, an¬
derseits zwischen Parallelversuchen auf verschiedenen Blattern war. Die Auswer¬
tung erfolgte immer durch Vergleich mit genau eingemessenen Testproben von
Brucin und Strychnin. So wurden Flecken aus 25, 50 und 100 Aig Alkaloid einzeln
und in Gemischen aufgetragen. Dadurch konnten wir einerseits die Trennscharfe,
anderseits aber die Verhaltnisse auf dem gleichen und auf verschiedenen Chro-
matographierpapieren überprüfen.
Tabelle 17
Untersuchung der Beziehungen zwischen Alkaloidmenge und Endfleckengrossenbei verschiedenen Chromatographlerpapieren
Papie re
25/ig
Brucin
50/ig 100/ig 25/ig
Strychnin
50 /ig 100/ig
Blatt 1 178 275 390 250 345 538
Blatt 2 180 250 390 250 340 520
Blatt 3 230 290 410 240 370 620
Blatt 4 160 280 510 250 350 550
Blatt 5 220 310 500 130 220 420
Blatt 6 200 300 490 230 320 580
Mittel 194,7 284,1 448,3 225 324,1 538
Abweichung18 %17,5 %
9%13%
13,5%13 %
11%42%
8,5%35 %
16,2 %22 %
Fur Brucin- und Strychninchromatogramme auf verschiedenen Chromatographier-
papieren ergibt sich, dass die mittlere Streuung der Endflachenwerte grosser ist
als bei Arbeit auf demselben Papier. Die Abweichungen betragen t 18,5 %.
1. R.B.Fisher, D.B.Parson u. G.A.Morrison, Nature 164, 746 (1948)
- 138 -
Hier kommen Unregelmässigkeiten in den äussern Bedingungen bei der Handha¬
bung verschiedener Papierchromatogramme hinzu, die sich in der Praxis nicht
vermeiden lassen, wie verschiedene Lagerung, Pufferung, Trocknung usw. Fer¬
ner kann die Papiennhomogenitat hier noch von grosserer Bedeutung sein, als
bei Versuchen auf dem gleichen Blatt. Diese Beobachtungen lassen den Schluss
zu, das s bei der quantitativen Papierchromatographie nach dem planimetnschen
Verfahren folgende Bedingungen eingehalten werden müssen:
a) Endfleckengros s en sollen nur auf demselben Chromatographierpapier ver¬
glichen werden.
b) Für die quantitativen Bestimmungen müssen stets Testproben von bekannter
Substanzmenge auf demselben Chromatographierpapier mitlaufen gelassen
werden.
4. Chromatographlerbedingungen
Wenn schon die qualitative Auswertung eine genugende Trennscharfe voraus¬
setzt, so ist diese Trennscharfe bei quantitativen papierchromatographischen
Bestimmungen unbedingt erforderlich. Daher müssen die Versuchsbedingungen
zur Auftrennung genau eingehalten werden. Immer gleich bleiben müssen die
Klimatisationszeit, die Zusammensetzung der mobilen Phase und die Tempera¬
tur. Diese drei Versuchsbedingungen wirken sich direkt auf den Rf-Wert und
auf die Diffusion der zu untersuchenden Substanzen aus, was aus den Fig. 2, 3
und 7 ersichtlich ist. Je starker aber bei kleinen Substanzmengen die Diffusion
auf dem Papier ist, umso kleiner ist die Empfindlichkeit des Reagens. Quantita¬
tive Vergleiche von nach verschiedenen papierchromatographischen Verfahren
getrennten Substanzen sind somit nicht möglich. Dies wird durch folgende Re¬
sultate erhärtet:
mobile Phase Endfleckengrosse von 20 Aig Strych-mn in 0,01 ml
Butanol-Eisessig-Wasser 312 mm^
Butanol-Ameisensaure-Wasser 256 mm^
Toluol-Isobutanol-Wasser 220 mm^
Trotz im übrigen gleichen Versuchsanordnungen fuhren verschiedene mobile
Phasen zu verschieden grossen Flecken.
- 139 -
Da die Fleckengrös se nicht konstant zunimmt mit steigender Laufstrecke
(Fig. 5), grosse Laufgeschwindigkeiten oder zu lange Laufstrecken grosse, un¬
scharf abgegrenzte oder geschwänzte Flecken geben, muss die Laufstrecke kon¬
stant gehalten werden. Unscharf abgegrenzte oder stark geschwänzte Flecken
zeigen eine schwache Empfindlichkeit gegen das Reagens, sodass eine quantita¬
tive planimetrische Endflecken-Ausmessung unmöglich wird. Zu lange Laufstrek-
ken bewirken aber auch Veränderungen im Rf-Wert. So konnten wir Rf-Wert-Zu-
nahmen bis zu 0,1 Einheiten beobachten, was bei Substanzen, deren Rf-Werte bei
der Lösungsmittelfront liegen, zu unscharfen Trennungen führen kann. Die Be¬
obachtung von Lindstedt (1), dasszu hohe Konzentrationen von Alkaloidmi-
schungen unscharfe Trennungen ergeben, was schlechte Ausmessung bedeutet,
konnten wir ebenfalls bestätigen. Schultz u. Strauss (2) fanden bei ihren
papierchromatographisch-planimetrischen Bestimmungen eine lineare Abhängig¬
keit zwischen Fleckengrösse und log.des Substanzgehaltes nur bei kleinen Lauf¬
strecken und niedrigen Konzentrationen. Seiler (3) fand bei seinen quantita¬
tiven papierchromatographisch-planimetrischen Bestimmungen ebenfalls, dass
die Fleckengrösse sich mit der absoluten Laufstrecke ändert.
Die Art der Trocknung soll immer gleich sein, da einerseits die Diffu¬
sion der aufgetragenen Startflecken, anderseits jene der entwickelten Endflecken
durch die Trocknungsgeschwindigkeit beeinflusst wird. Verschieden grosse Start¬
flecken haben,, wie unsere Versuche zeigten, verschieden grosse Endflecken zur
Folge:
Art der Trocknung
Luftgetrocknet
Trocken geblasen
Hei s sluftgetrocknet
Infrarot getrocknet
Startfleck
(Mittelwert)
100 mm2
78 mm2
71 mm2
64 mm2
Endfleck
(Mittelwert)
280 mm2
264 mm2
258 mm2
210 mm2
Im weiteren war der Einfluss des Reagens auf die Endflecken-
grö s s e abzuklären. Die Wahl des Reagens richtet sich nach der Empfindlichkeit
1. P. Lindstedt, Acta chim. Scand. 4, 448 (1950)2. O.E. Schultz u. D. Strauss, Dtsche Apoth.Ztg. 95, 642 (1955)3. H. Seiler, E. Sorkin u. H. Erlenmeyer, Heiv.Chim.Act a
35, I, 120 (1952)
- 140 -
der Substanz diesem gegenüber. Die Sichtbarmachung mit dem Reagens ist im¬
mer gleich auszuführen, ebenso die anschliessende Trocknung des entwickelten
Papierbogens. Die Einhaltung gleicher Bedingungen ist notwendig, da die Flecken-
grösse von der Menge des aufgesprühten Reagens abhängt und da sich der mit
dem Reagens gebildete Alkaloidniederschlag in der mobilen oder stationären Pha¬
se je nach Reaktion lösen und/oder diffundieren kann. Aus diesem letzteren Grun¬
de spielt auch die Lagerung der entwickelten Chromatogramme eine Rolle. Sie
soll ebenfalls immer gleich gehandhabt werden. Die nachfolgende Figur 30 zeigt,
dass verschiedene Reagenzien verschieden grosse Flecken erzeigen können.
Fig. 30
Einfluss des Reagens auf die Fleckengrösse
EE
Ç
-° konz. Salpetersäure
-o Dragendorff's Reagens
—I 1
25 50 >i.g
Substanzmenge
Für die quantitative Bestimmung auf Grund der Endfleckengrössen muss somit
stets das gleiche Reagens zum Sichtbarmachen der Flecken verwendet werden.
- 141 -
d) Aufstellung der Anforderungen für die quantitative Methodik
Für das Gelingen einer quantitativen Papierchromatographie müssen un¬
bedingt folgende Bedingungen eingehalten werden:
1. Grosste Genauigkeit bei der Herstellung der Alkaloidverdunnungen.
2. Sauberes quantitatives Auftragen der Alkaloidverdunnungen mittels
einer geeigneten Mikroburette auf dasselbe Chromatographierpapier.
3. Einhalten gleich grosser Startflecken. Sind Substanzen in verschiedenen
Flüssigkeitsmengen gelost, so muss das Auftragen auf dem Papierso vorgenommen werden, dass gleiche Startfleckengrossen eingehaltenwerden.
4. Die Einhaltung der unter c)4 beschriebenen Chromatographlerbedingungen(Klimatisierung, Laufstrecke, Trocknung und Reagens) ist notwendig.
e) Vorschlag einer Methode fur die quantitative Bestimmung der Alkaloide mit
Hilfe der Papierchromatographie
Auf Grund der im vorstehenden beschriebenen Versuchsbedingungen las¬
sen sich quantitative Bestimmungen von Alkaloiden durch Papierchromatographie
durchführen. Die dabei gefundenen Endfleckenwerte auf demselben Chromatogra¬
phierpapier zeigen eine lineare Abhängigkeit von der Alkaloidmenge. Die bei
nicht standardisierten Temperaturen und anderen Bedingungen schwankende Nei¬
gung und Parallelverschiebung der diese lineare Abhängigkeit darstellenden Ge¬
rade, ermitteln wir durch Mitlaufenlassen einer unteren und einer oberen bekann¬
ten Kontrollmenge in jedem Versuch.
1. Auftragen der Alkaloide aut die Startlinie
Entsprechend dem von uns gewalüten Vorgehen sind die bekannten und die
quantitativ zu bestimmenden Alkaloidlosungen wie folgt auf die Startlinie aufzu¬
tragen:
- 142 -
1-3 = untere Kontrollwerte mit je 25 «g Alkaloidsalz
4-6 = unbekannte, gleichgrosse Alkaloidsalzmengen zw. 25 und 100 ;ug
7-9 = obere Kontrollwerte mit je 100 «g Alkaloidsalz
Müssen verschiedene Alkaloide quantitativ bestimmt werden, so muss die
Bestimmung der einzelnen Bestandteile auf verschiedenen Chromatographierpa-
pieren durchgeführt werden.
Bei Alkaloidmengen, die bei der Empfindlichkeitsgrenze der Reagenzien
liegen, verfährt man so, dass man der zu untersuchenden Substanz eine defi¬
nierte Menge des zu bestimmenden Alkaloides zusetzt. Man hat dann im Ender¬
gebnis lediglich die zugesetzte Menge abzuziehen.
2. Auswertung des Alkaloidgehaltes
a) Rechnerische Ermittlung:
Die parallel verschobene Gerade lässt sich dann nach Seiler (1) auf
Grund der folgenden Gleichung berechnen:
gx = (Fx - Fu)-F. - F
+ S,
gx = gesuchte MengeFx = gefundener Flecken unbekannter Alkaloidmenge in mm^ (Mittel aus 4-6)
Fu = unterer Kontrollfleck in mn\2 (Mittel aus 1-3)
F0 = oberer Kontrollfleck in mm^ (Mittel aus 7-9)
g0= obere Kontrollmenge (= 100 jug)
gu = untere Kontrollmenge (= 25 yug)
1. H. Seiler, E. Sorkin u. H. Erlenmeyer, Helv.Chim.Acta
35 I, 120 (1952)
- 143 -
Zum Beispiel:
Fx = 290 mm2 g0 = 100 ug
Fu = 230 mm2 gu = 25^F0 = 410 mm2
gx = (290-230) iîS-2àO + 25 = 50'°V«
aufgetragene Alkaloidmenge = 50 /agerrechnete Alkaloidmenge = 50,00 «g
ß) Graphische Auswertung
Man trägt auf der x-Achse die bekannten Alkaloidmengen in Aig, auf der
y-Achse die errechneten Mittelwerte der entsprechenden Endfleckengrössen in
mm2 auf. Sodann verbindet man den oberen und den unteren Kontrollwert durch
eine Gerade. Vom gefundenen Mittelwert der Endfleckengrösse (z.B. 290 mm2)
der unbekannten Alkaloidmenge geht man bis zum Schnittpunkt der Geraden und
liest dann auf der x-Achse die Alkaloidmenge in xig ab (siehe Fig. 31).
Für unsere planimetrischen Versuche an Strychnin und Brucin erhielten
wir Einzelfehler von t 3 %, im Mittel einen Fehler von t 0,9 %.
t) Auswertung der Fleckengrössen mit Millimeterpapier
Wir pausten die auf dem Chromatogramm erhaltenen Endflecken auf Milli¬
meterpapier, zählten die Quadrate und Teilquadrate aus und berechneten nach
der Formel von Seiler (1) die gesuchte Alkaloidmenge. Die so erhaltenen Re¬
sultate streuten, wie Tabelle 18 zeigt, um 5 - 10 % gegenüber der planimetrischen
Bestimmung.Tabelle 18
Flächenmessung mit dem Millimeterpapier (1)
Planimetermessung Millimetermessung Abweichung vom Sollwert
230 mm2 227 mm2 + 5,5 %290 mm2 293 mm2410 mm2 405 mm2
250 mm2 242 mm2 + 7,2 %350 mm2 359 mm2
550 mm2 547 mm2
1. H.Seiler, E.Sorkin u. H . E rlenmeyer, Helv.Chim.Acta 35 1,120 (1952)
- 144 -
Fig. 31
Graphische Ermittlung des Alkaloidgehaltes
400-
300-
E
E
0)
c
0)JE
üw
•4-
oc
tu
: 200- -
100--
30 40 50 60 70 80
Alkaloidmenge pg
- 145 -
D. Zusammenfassung
1. Es wurden chromatographische Methoden beschrieben, die es gestatten, die
wichtigsten Alkaloide der Ph.Helv.V einschliesslich ihrer stereomeren Um-
lagerungsprodukte zu trennen. Das Prinzip der Verfahren besteht in der Ver¬
wendung von Isobutanol/Toluol wassergesättigt als mobile Phase und als sta¬
tionäre Phase. Zur Trennung optischer Antipoden wurde p-Ditoluyl-1-Wein¬
säure gebraucht. Die hauptsächlichsten Faktoren, die eine Trennung bestim¬
men oder ermöglichen, wurden ebenfalls bestimmt.
2. Die Empfindlichkeit des papierchromatographischen Nachweises der offizi-
nellen Alkaloide wurde bestimmt und zu einer Reinheitsprilfung derselben
ausgewertet. Die in der Ph.Helv.V aufgeführten Prüfungen konnten in verschie¬
denen Fällen verschärft werden.
3. Mit den beiden Alkaloiden Strychnin und Brucin wurden Versuche, zu einer
papierchromatographischen Alkaloid-Wertbestimmung durchgeführt. Es wur¬
den die eine quantitative Bestimmung beeinflussenden Faktoren beschrieben
und eine Methode zur quantitativen Bestimmung von Brucin und Strychnin ge¬
geben. Als Dreipunktsbestimmung gestattet sie eine Bestimmung der Alkaloid-
konzentration auf t 3 % genau.
Curriculum vitae
Am 3. Juli 1926 wurde ich als Sohn des Josef Schumacher und der
Luise geb. Schmid in Rheinau geboren. Wahrend sechs Jahren be¬
suchte ich dort die Primarschule und anschliessend durchlief ich
das Gymnasium in Schwyz. Im Sommer 1946 bestand ich daselbst
die Matura.
Ab 1949 war ich an der Abteilung fur Pharmazie an der Eidge-
nossischen Technischen Hochschule eingeschrieben. Praktikum
und Assistentenjahr absolvierte ich in Zurich, wo ich das Assi¬
stentenexamen im Frühjahr 1952 ablegte. Im Frühling 1955 er¬
warb ich das Diplom als Apotheker an der ETH. Seither beschäf¬
tige ich mich mit der vorliegenden Promotionsarbeit, die ich am
Pharmazeutischen Institut unter der Leitung von Herrn Prof.
Dr. J. Büchi ausführte. Beim Abschluss derselben (1956) war ich
als Assistent am Pharmazeutischen Institut der ETH tatig.
