RETROVIRIDAE

G. Di Bonaventura

Università di Chieti-Pescara

famiglia Retroviridae - tassonomia

Subfamiglia Gruppo Esempi

Oncovirinae Tipo A Intracisternal A Particles (non-infectious)

(oncògeni) Tipo B Mouse Mammary Tumor (MMTV)

Tipo C Avian Sarcoma and Leukemia

Murine Sarcoma and Leukemia

* Human T-cell leukemia virus (HTLV I-II)

Tipo D Mason Pfizer monkey (MPMV)

Lentivirinae Visna, * HIV (1–2), SIV, FIV(lungo periodo di incubazione)

Spumavirinae Human Foamy virus

(effetto vacuolizzante) (citopatico in vitro, non patogeno per l’uomo)

* Oncovirus endògeni * Retrovirus patogeni per l’uomo

H.I.V.(Human Immunodeficiency Virus)

AIDS (Acquired Immuno-Deficiency Syndrome)

1980/81- Segnalazione di focolai di polmonite da Pneumocystis carinii associata a

segni evidenti di compromissione del sistema immunitario (immunodeficienza

acquisita) in giovani adulti (per lo più maschi omosessuali: “gay pneumonia”) e

definizione “clinica” della sindrome.

1983 - Isolamento in Francia (L. Montagnier) e in U.S.A. (R. Gallo) del retrovirus

oggi denominato HIV (human immunodeficiency virus). Inizialmente indicato

LAV (Lymphoadenopathy associated virus) o HTLV-III (perché ritenuto,

erroneamente, essere correlato ai retrovirus oncogeni umani già noti HTLV-I e

HTLV-II).

1985 - Disponibilità dei primi reattivi (preparazioni di antigeni virali) per la ricerca di

anticorpi.

I virus responsabili dell’AIDS

Ad oggi, due sono i virus noti per essere causa

della sindrome da immunodeficienza acquisita

(AIDS) umana: HIV-1 e HIV-2

HIV-1 è diffuso in tutto il mondo ed è

responsabile della maggior parte dei casi di AIDS

HIV-2 è presente soprattutto in Africa occidentale,

India, Caraibi, America meridionale; è di gran

lunga meno virulento di HIV-1

Virus analoghi, responsabili di sindromi assai

simili (immunodeficienza acquisita), sono stati

dimostrati anche in varie specie animali: scimmie

(SIV), felini (FIV), etc.

HIV: caratteri generali

HIV appartiene alla sottofamiglia Lentivirinae,

famiglia Retroviridae

I Lentivirus hanno i caratteri generali dei Retrovirus

con i quali dividono gli aspetti essenziali del ciclo

replicativo e l’organizzazione generale del genoma:

forma: sferica (d = 100 nm)

nucleocapside con simmetria elicoidale

presenza di involucro esterno (peplos), derivato dalla

gemmazione della membrana plasmatica

genoma: RNA+, diploide (unicità tra i virus !); sistema «gag-pol-env» e

presenza di geni «regolatori»

HIV: struttura del virione

HIV. Core ed envelope evidenti; le glicoproteine

di superficie appaiono come protrusioni alla superficie (da: Gallo and Montagnier, Scientific American, 259:42, 1988)

Retrotrascrizione

DNApol-RNAdip(virale)

HIV: organizzazione del genoma

«provirus» (DNA)

LTR (Long Terminal Repeat): contiene promoter/ehnancer per trascrizione provirus

- 2 x RNA- polarità + - 3’-poli-A, in contatto all’estremità 5’- tRNA («innesco» RT)

oltre ai 3 geni sempre presenti ed essenziali nei Retroviridae (gag – pol – env) HIV presenta, in aggiunta, una serie di “geni accessori e regolatori” che svolgono un ruolo essenziale nel ciclo replicativo del virus

HIV

ciclo replicativo

HIV - ciclo replicativo: binding1. ATTACCO: HIV interagisce, mediante un antirecettore (gp120,

gp41) presente sul peplos, con il recettore (CD4) ed i co-recettori

(CCR5, CXR4) delle cellule sensibili (linfociti T-helper, macrofagi,

microglia, monociti circolanti, cellule dendritiche, etc.)

TROPISMO VIRALE per cellule CD4+:

In vivo stipiti con capacità di crescere in linfociti T-helper

(stipiti linfotropi) (CCR5 come co-recettore)

stipiti con capacità di infettare i macrofagi

(stipiti macrofagotropi), durante la fase di persistenza

della malattia in sede extra-linfoide e –vascolare (CXCR4 come co-

recettore)

In vitro entrambi crescono in colture primarie di linfociti da sangue periferico

(dotati di CCR5 e CXCR4)

La presenza di co-recettori (CCR5 o CXCR4), disponibili alla

superficie delle cellule CD4+, che “cooperano” con CD4 alla

fusione dell’envelope virale con la membrana cellulare, è stata

suggerita da:

insensibilità di cellule murine (transfettate con CD4) all’infezione

azione antivirale di chemochine (RANTES, MIP-1α, MIP-1β) che,

legando i rispettivi co-recettori, ne impediscono l’attacco a gp120

2. FUSIONE e PENETRAZIONE: l’interazione dei

recettori cellulari con le glicoproteine virali

gp120/gp41 provoca un riarraggiamento

conformazionale dell’envelope che ne consente la

fusione con la membrana cellulare. In tal modo, il

nucleocapside virale accede al citoplasma

3. UNCOATING (SCAPSIDAMENTO): il virione perde il

capside liberando così nel citoplasma il suo

genoma

HIV - ciclo replicativo: fusione, penetrazione, uncoating

Linfociti T CD4+ infettati da HIV

contenuti in vacuoli citoplasmatici(da: Haseltine and Wong-Staal, Scientific American 259:53, 1988)

HIV – ciclo replicativo

4. REPLICAZIONE

Retrotrascrizione (ad opera di una trascrittasi inversa DNA-polimerasi–RNA dipendente virale) dell’RNA del genoma virale in DNA (provirus)

5. INTEGRAZIONE

provirus circolarizza e si integra nel genoma cellulare

eventi favoriti anche dalle concomitanti:

replicazione della cellula infetta

attivazione della cellula infetta

HIV – ciclo replicativo

6-7-8. REPLICAZIONE GENOMICA - SINTESI PROTEICA

Trascrizione del provirus con la produzione di RNA genomico e dei vari mRNA per la sintesi delle poliproteine strutturali virus-specifiche: LTR 5’ promoter consente attacco RNA-pol cellulare

migrazione verso il citoplasma di mRNA di piccole dimensioni (multi-spliced) codificanti per proteine regolatorie (funzionali). In particolare:

Tat aumenta la velocità di trascrizione

Rev blocca il multi-splicing, consente l’esportazione di RNA-genomici e mRNA per proteine strutturali (capside, peplos) ed enzimatiche (proteasi)

Maturazione delle proteine, mediante clivaggio ad opera di proteasi

Inserimento di proteine del peplos (es. gp120, gp41) in alcuni segmenti di membrana cellulare

Rna (+) genoma

Trascrittasi

inversaEndonucleasi/

integrasi

Proteine

regolatrici

Poliproteine

Proteine

strutturali

Assemblaggio

Acquisizione del pericapside

Progenie virale

ProteasiAAAA

RRETAR

Tat Rev

Trascrizione

Traduzione

TraduzioneSpS

I geni gag, pol, env sono tradotti in poliproteine che, ad opera di proteasi,

verranno semplificate nei singoli prodotti proteici.

In particolare, gag e pol vengono co-tradotti in un singolo polipeptide.

gag (“group-Ag”) codifica le proteine del nucleocapside o “core”

virale, e della “matrice” virale:

p24 che forma il capside virale

p17 proteina della “matrice” virale (riconosce il segmento di membrana cellulare

che formerà il peplos)

p9/7 e p7/6, proteine RNA-binding

gag

pol

envvpr rev

nef

vif tat vpuLTR LTR

pX, X = PM proteinaEsempio: p24, PM = 24-kD

pol («polymerase») codifica la DNA-polimerasi RNA-dipendente o

trascrittasi inversa e gli altri enzimi associati al virione:

proteasi (p9)

trascrittasi-inversa e RNA-si H (p66)

integrasi (p32)

gag

pol

envvpr rev

nef

vif tat vpuLTR LTR

env («envelope») codifica una poliproteina di 88 kD (p88) che viene glicosilata

a gp160

ad opera di una proteasi virale, gp160 viene scissa nelle due glicoproteine

dell’envelope: gp120 e gp41

gp120 è la glicoproteina esterna coinvolta nel riconoscimento e nel legame

al recettore

gp41 è una proteina idrofobica che:

garantisce l’ancoraggio di gp120 tramite

legami non covalenti

coinvolta nella fusione dell’envelope

con la membrana cellulare

gag

pol

envvpr rev

nef

vif tat vpuLTR LTR

Geni “accessori” e “regolatori” di HIV-1

A differenza degli altri Retrovirus HIV possiede, oltre ai geni

“strutturali” (gag, pol, env), almeno altre sei sequenze con

funzioni accessorie o regolatrici nel ciclo di replicazione

virale.

gag

pol

envvpr rev

nef

vif tat vpuLTR LTR

“tat” (trans-activator of transcription) consiste

di due distinti esoni che codificano una

proteina di 14 kD

La proteina Tat è prodotta nella fase iniziale

della trascrizione del provirus e agisce a livello

nucleare:

potenziando l’attività di LTR 5’

reclutando fattori trascrizionali

gag

pol

envvpr rev

nef

vif tat vpuLTR LTR

inducendo cambiamenti conformazionali nella cromatina, così favorendo la

trascrizione del DNA

escreta, può agire sulla stessa cellula (azione autocrina) o su cellule

viciniore non infette (azione paracrina) transattivando la trascrizione di

numerosi geni cellulari produttori di citochine, fattori di crescita, etc.

“rev” (regulator of expression of virion

proteins) ( due esoni), codificano per p19 che

favorisce il trasferimento nucleo-

citoplasmatico di RNA-m unspliced

La proteina Rev si lega agli m-RNA virali in

corrispondenza della sequenza RRE (Rev-

responsive element) sita all’interno del gene

env, proteggendoli dalle operazioni di splicing

gag

pol

envvpr rev

nef

vif tat vpuLTR LTR

Rev è essenziale per il trasferimento nel citoplasma dell’RNA genomico e degli

m-RNA per le proteine strutturali, limitando altresì, indirettamente, (attraverso il

blocco della produzione di RNA-m spliced) l’espressione propria e quella delle

altre proteine accessorie e regolatrici

“vpu” (viral protein unique) presente solo in HIV-1, codifica una

proteina di 15-16 kD che facilita il trasporto di gp120 e gp41 verso la

membrana cellulare

idrolizza CD4 neosintetizzate a livello del reticolo endoplasmico

non essenziale per la replicazione di HIV-1, ha un ruolo nel corretto

assemblaggio e nella liberazione dei virioni neoformati

gag

pol

envvpr rev

nef

vif tat vpuLTR LTR

“nef” (p27) (negative factor)

azione simile a quella di vpu: causa downregulation di CD4. Si lega al CD4

di membrana (provocandone la endocitosi) e a quello dell’apparato di Golgi

conducendolo in sede lisosomiale provocandone, così, la degradazione

associato ad una minore efficienza della replicazione di HIV in colture

di cellule

patogenicità attenuata in vivo degli stipiti nef –defettivi

gag

pol

envvpr rev

nef

vif tat vpuLTR LTR

“vif” (virion infectivity factor) codifica per p23, indispensabile per la

produzione di virus extracellulare infettante, forse intervenendo nella

elaborazione finale dei prodotti del gene “env” e nell’assemblaggio del

“core” virale

Virioni defettivi in “vif” sono scarsamente infettanti per i linfociti o i

macrofagi umani se aggiunti alle colture come virus libero, ma si

trasmettono ancora efficacemente da cellula a cellula

gag

pol

envvpr rev

nef

vif tat vpuLTR LTR

“vpr” (viral protein R) codifica una proteina di 14 kD che viene associata al

virione neoformato, associata alla proteina p7/6 del nucleocapside

Sembra avere un ruolo importante nel favorire il trasporto intranucleare del

complesso nucleoproteico virale (genoma e proteine associate) che

provvederà alla integrazione del DNA provirale nel genoma cellulare

gag

pol

envvpr rev

nef

vif tat vpuLTR LTR

HIV – ciclo replicativo

9. ASSEMBLAGGIO E DISSEMINAZIONE DEI

VIRIONI

Assemblaggio dei singoli virioni: 2 molecole di tRNA genomico si associano a proteine

regolatorie/strutturali a dare il virione completo

Gemmazione dei virioni neoformati che in tal

modo si dotano del peplos (no lisi cellulare)

Variabilità genetica di HIV-1

La trascrizione inversa non possiede i meccanismi di ”controllo” (proof-reading)

presenti nella duplicazione del DNA. Pertanto, gli “errori” (mutazioni) associati alla sua

attività si traducono nella comparsa di stipiti virali con caratteri diversi (quasi-specie)

nei diversi individui infetti

nelle diverse fasi della infezione dello stesso individuo

La “variabilità” è particolarmente evidente a livello di alcune zone di “env” e “nef”

(mutazioni non silenti ed estese) mentre altri geni (gag, pol, tat) sono molto più

“conservati” (mutazioni silenti e puntiformi)

esistenza di uno stretto rapporto struttura-funzione

elusione della risposta immune mediante modificazioni non silenti delle

glicoproteine di superficie (inefficacia della vaccinazione)

Variabilità genetica di HIV-1

Stipiti di HIV-1 classificabili in 3 gruppi: M, N, O

gruppo M (“main”) comprende la maggior parte degli stipiti; si distinguono

vari sottotipi (cladi): A-K (Italia, sottotipo B)

gruppo O (“outlier”): stipiti infrequenti

gruppo N (“non-M non-O”): struttura genomica molto diversa da M ed O

Elevata velocità di replicazione ed elevato tasso mutazionale = diversità di

sequenza

fino al 20% di diversità in env all’interno di un sottotipo

La diversità di sequenza modula le frazioni immunogene del virus

La patogenesi dell’AIDS

L’infezione da HIV è di natura ematogena

Si trasmette attraverso:

rapporto sessuale

omosessuale

eterosessuale

contatto con sangue infetto

scambio di siringhe (tossicodipendenti, operatori sanitari)

trasfusione (sangue o emoderivati)

contatto perinatale

passaggio attraverso il canale del parto

allattamento

All’infezione primaria segue un’incubazione di 3-6

settimane e, quindi, una fase acuta (sindrome

simil-mononucleosica)

Segue una fase asintomatica: la latenza clinica

non equivale alla latenza virale

Infatti, l’infezione si accompagna ad una

progressiva e sostenuta replicazione del virus (in

particolare negli organi linfoidi) - che, per tutto il

periodo asintomatico, viene contrastata e

contenuta dalla risposta immune dell’organismo - e

ad una progressiva diminuzione dei linfociti T-

CD4+ (normalmente circa 1.000/mm3)

La patogenesi dell’AIDS

Con la riduzione dei linfociti T-helper al di sotto di

una soglia critica (in genere, < 500/mm3) e con la

conseguente compromissione della capacità di

risposta immune (soprattutto cellulo-mediata) inizia

la fase sintomatica (AIDS):

iniziale stadio LAS (lymphoadenopatic

syndrome) con linfoadenopatia persistente

La patogenesi dell’AIDS

stadio ARC (AIDS-related complex): calo ponderale, diarrea, astenia con netta

diminuzione dei linfociti T-helper circolanti

quando linfociti T-helper < 300 mm3 compare lo stadio di AIDS conclamato, con

massiva viremia (incapacità linfonodale a contenere il virus) e comparsa di infezioni

“opportunistiche” (batteriche, protozoarie, virali) di inusitata gravità, spesso

accompagnate dalla comparsa di tumori non usuali (linfomi cerebrali primitivi,

sarcoma di Kaposi epidemico) e dalla compromissione del SNC (AIDS-related

dementia)

La patogenesi dell’AIDS

La progressione verso la malattia è in rapporto

alla quantità di virus infettante

alla capacità replicativa del virus

ai caratteri fenotipici del virus (è più rapida con la comparsa di varianti rapid/high)

alla diminuzione nel numero dei linfociti T CD4+ (lisi dei CD4+ infetti)

La patogenesi dell’AIDS è multifattoriale e non è esclusivamente riconducibile alla diretta

distruzione linfocitaria ad opera della infezione virale. Infatti, nonostante HIV causi la

totale deplezione dei linfociti T CD4+:

HIV infetta soltanto il 20-30% della popolazione linfocitaria

“rimpiazzo” dei linfociti T ad opera di un turn-over da parte dei precursori della serie linfoide

Esistenza di meccanismi alternativi (indiretti):

Reclutamento di linfociti CD4+ non infetti da parte di HIV, per induzione del

fenomeno apoptotico innescato dall’interazione tra gp120 e CD4

Un meccanismo patogenetico alternativo è stato anche proposto per spiegare i

quadri di citopenie periferiche e le lesioni del SNC

Le cellule CD34+ (progenitori ematopoietici) ed i neuroni infatti non sono

suscettibili alla infezione da HIV-1 e sono distrutti come conseguenza della

abnorme produzione di citochine indotta in cellule infette (linfociti, glia, astrociti) e

non (linfociti) in seguito all’azione “tossica” di proteine virus-specifiche (gp120,

Tat)

Nella comparsa di tumori non usuali e, in particolare, nella comparsa del

sarcoma di Kaposi (angiosarcoma cutaneo) un ruolo essenziale sembra giocato

dalla proteina Tat per le sue capacità di transattivare una serie di geni cellulari e

di stimolare la replicazione cellulare attraverso segnali di membrana e da altri

fattori (HHV-8 ?)

Patogenesi “multifattoriale”

dell’AIDS

I “long-term non progressors”

< 5% di soggetti infetti da più di 10-12 anni non presenta segni di malattia

o di compromissione della risposta immune e possiede un numero

normale (o comunque superiore a 500/mm3) di linfociti T CD4+

?

-minore capacità replicativa del virus infettante (ad es.: virus nef-defettivi)

-elevata risposta immune ( MHC-I ristretta) dei linfociti T citotossici

(CD8+)

-iperproduzione di chemochine che bloccano i co-recettori

-produzione di “fattori antivirali” (?) da parte dei linfociti T CD8+

-altre cause?

La diagnosi di infezione da HIV

L’ infezione da HIV, una volta verificatasi, si mantiene costantemente attiva

Quindi…Sieropositività = diagnosi di infezione "in atto“ (anche se clinicamente silente)

Ricerca di anticorpi anti-HIV mediante saggio immunoenzimatico (Enzyme-linked

Immuno-sorbent Assay o ELISA): utilizzo di preparazioni antigeniche virali che

consentano la rilevazione di anticorpi nei confronti di HIV-1 e HIV-2 e per il sottotipo O di

HIV-1

Conferma sieropositività: un risultato positivo all’ELISA va sottoposto ad esame "di

conferma" tramite immunoblotting, utilizzando supporti adsorbiti con diversi peptidi di HIV-

1 e gp36 di HIV-2

Tuttavia, la sierologia presenta molti limiti:

fase iniziale (3-4 settimane): il cosiddetto periodo "finestra"

falsa positività in neonati da madri HIV (presenza di anticorpi sierici materni)

in una modesta percentuale di soggetti: risultati "borderline”

La diagnosi di infezione da HIV

Un risultato positivo all’ELISA va sottoposto ad esame "di conferma"

tramite Immunoblotting, utilizzando strisce caricate con i diversi peptidi di

HIV-1 e gp36 di HIV-2

L’immunoblotting negativo o sicuramente positivo non lascia dubbi

interpretativi e non prevede ulteriori indagini diagnostiche.

La diagnosi di infezione da HIV

Diagnostica Virologica = ricerca del virus

Isolamento del virus in colture di cellule

Determinazione dell’antigenemia (p24 nel sangue)

Determinazione di specifiche sequenze nucleotidiche (RNA virionico o

DNA pro-virale nel sangue)

La diagnosi di infezione da HIV

Isolamento del virus in colture di cellule è indicato anche:

a) nel follow-up del paziente per il monitoraggio del fenotipo

(sinciziogeno, a crescita rapida, etc.) dello stipite virale e/o della sua

resistenza ai farmaci antiretrovirali

b) nel monitoraggio delle varianti antigeniche circolanti in un determinato

territorio

Determinazione dell’antigenemia (p24 nel sangue)

Determinazione di specifiche sequenze nucleotidiche (RNA

virionico o DNA pro-virale nel sangue)

Il follow-up virologico del paziente

“viral load”

il livello e l’ andamento nel tempo, rappresentano il criterio essenziale

per:

a) definire la necessità di farmaci antiretrovirali,

b) giudicare l’efficacia del regime terapeutico in atto,

c) valutare l’andamento dell’infezione sotto il profilo prognostico

Per valutare il “viral load”:

1 - determinazione quantitativa del DNA provirale mediante PCR (PCR)

Indica l’ampiezza del “reservoir” di virus presente nell’organismo, non

sempre correlata alla intensità della replicazione virale

2 - determinazione della quantità di virus infettante presente nel sangue

periferico misurata in colture di cellule in vitro

3 - determinazione quantitativa di HIV-1 RNA nel plasma (mediante RT-

PCR o metodi analoghi)

Correlate alla infezione produttiva (replicazione) del virus

Il follow-up virologico del paziente

Il numero di molecole di HIV-1 RNA/ml di plasma (insieme alla

presenza di infezione “sintomatica” e/o al numero di linfociti T

CD4+) è utilizzato per

decidere l’inizio della terapia con farmaci antiretrovirali

valutare l’ efficacia del regime terapeutico in atto,

valutare la prognosi della malattia

La resistenza di HIV-1 ai farmaci

antiretrovirali

Durante la replicazione del genoma in HIV intervengono tre polimerasi:

Transcrittasi inversa virale

DNA pol

RNA pol

3x10-5 errori per base incorporata

Durante la prima fase dell’infezione, la popolazione virale sembra essere

monoclonale, con sequenze nucleotidiche virali omogenee

In seguito, durante il corso della malattia la popolazione virale è

disomogenea.

La presenza di mutanti resistenti impedisce il controllo dell’infezione

Vaccinazione anti-HIV:

problematiche …

Variabilità genetica del virus

Rapida replicazione, alta velocità di mutazione → mutanti immune-escape

Latenza e persistenza

HIV-1 infetta cellule CD4 alterando l’efficacia della risposta immune

Dubbia capacità del sistema immune a prevenire o controllare l’infezione da HIV-1