ORIGINAL

PATOLOGÍA DEL APARATO LOCOMOTOR, 2005; 3 (1): 13-2317 13

Rediferenciación de condrocitos en plasma rico en factores de crecimiento plaquetarios paracondroplastia articular

Chondrocyte redifferentiation within plateletfactors-rich plasma for articular chondroplasty1 Dpto. Química, Bioquímica y Biología Molecular. Guillén Salazar M.ª I. 1

Facultad de Ciencias Experimentales y de la Salud. Mirabet Lis V. 2Universidad Cardenal Herrera-CEU Sopena Juncosa J. 3

2 Banco de Órganos y Tejidos de la Comunidad Valenciana Fernández Ferri P. 43 Dpto. Medicina y Cirugía Animal. Facultad de Ciencias Segura Gil P. 5

Experimentales y de la Salud. Universidad Cardenal Herrera-CEU Corpa Arenas J. M. 54 Dpto. Farmacología. Facultad de Farmacia. Universidad de Valencia5 Dpto. Atención Sanitaria, Salud Pública y Sanidad Animal

Facultad de Ciencias Experimentales y de la Salud. Universidad Cardenal Herrera-CEU

Correspondencia:M.ª Isabel GuillénDepartamento de Química, Bioquímica y Biología MolecularFacultad de Ciencias Experimentales y de la Salud

Universidad Cardenal Herrera-CEU46113-Moncada (Valencia)e-mail: iguillen@uch.ceu.es

RESUMENLa regeneración del cartílago articular constituye un

problema clínico muy importante de difícil abordaje tera-péutico. Actualmente, la expansión “ex vivo” de condro-citos autólogos se presenta como una de las alternativascon mejores perspectivas. El propósito de este trabajo hasido el estudio de la eficacia del plasma rico en factores decrecimiento plaquetarios en la recuperación y el manteni-miento del fenotipo condrocítico de células cultivadas encompuestos de biomatriz autóloga y en la reestructuracióndel cartílago articular. Para ello hemos realizado compues-tos de condrocitos humanos y de conejo rediferenciadosen plasma rico en factores de crecimiento plaquetarios.Hemos reimplantado compuestos de condrocitos homólo-gos rediferenciados en el cóndilo femoral de conejos lesio-nados experimentalmente. Los resultados obtenidos nospermiten sugerir que el plasma rico en factores de creci-miento plaquetario constituye una novedosa e importanteaportación para transporte de los condrocitos dentro delas nuevas terapias de regeneración del cartílago hialino.

Palabras clave: condrocitos rediferenciados, soporte de plasmarico en factores plaquetarios, factores de crecimiento, cartílago hia-lino, regeneración articular.

Guillén Salazar M.ª I., Mirabet Lis V., Sopena Juncosa J.,Fernández Ferri P., Segura Gil P., Corpa Arenas J. M.Rediferenciación de condrocitos en plasma rico en factoresde crecimiento plaquetarios para condroplastia articularPatología del Aparato Locomotor, 2005; 3 (1): 13-23

ABSTRACTArticular cartilage regeneration is an important clinical

problem. Actualy, autologouos chondrocyte cultured “exvivo” are a good option for cartilage regeneration thera-pies. The aim of this work has been to study the efficacy ofplatelet growth factors-rich plasma in chondrocyte redif-ferentiation and phenotipe maintenance of cells culturedinside autologouos matrix composites, as well as in articu-lar chondroplasty. We have obtained compounds of humanor rabbit chondrocyte redifferentiated within platelet fac-tors-rich plasma. After, we have reimplanted homologousredifferentiated chondrocytes in femoral condyle of rabbitspreviously injuried experimentally. Results suggest thatplatelet growth factors-rich plasma could be a novel andsignificant apportation to chondrocyte transport in thera-pies of hialine cartilage regeneration.

Key words: redifferentiated chondrocyte, scaffold platelet fac-tors-rich plasma, growth factors, hialine cartilage, articular regener-ation.

Guillén Salazar M.ª I., Mirabet Lis V., Sopena Juncosa J.,Fernández Ferri P., Segura Gil P., Corpa Arenas J. M.Chondrocyte redifferentiation within platelet factors-richplasma for articular chondroplastyPatología del Aparato Locomotor, 2005; 3 (1): 13-23

M.ª I. Guillén Salazar, V. Mirabet Lis, J. Sopena Juncosa, et al.

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INTRODUCCIÓN

Actualmente, existe una alta incidencia depatologías causadas por la progresiva destruc-ción del cartílago hialino. Estas patologías dege-nerativas representarán en pocos años una delas enfermedades con mayor prevalencia en elmundo debido al envejecimiento de la pobla-ción (1,2). Además, el cartílago hialino de la ar-ticulación presenta una limitada capacidad dereparación, fundamentalmente por la falta devascularización y por la consistencia de la ma-triz extracelular en la que las células se encuen-tran encapsuladas (3). Aunque en un principio,a la vista de sus características, se podría consi-derar un tejido simple, lo cierto es que tieneunas propiedades biomecánicas específicas, co-mo la resistencia a la compresión o la capaci-dad para distribución de carga, que hacen delmismo un material difícil de reemplazar (3,4).

Los condrocitos, único tipo celular en el car-tílago, en condiciones normales, sintetizan pro-teoglicanos, colágenos, fibronectina y otroscomponentes necesarios para mantener la ho-meostasis de la articulación (5,6). Cuando untrauma, una enfermedad crónica o la alteraciónfisiológica relacionada con la edad afecta a estahomeostasis, el cartílago puede sufrir una gra-dual degeneración, deteriorándose la superficiearticular. La respuesta patofisiológica del cartíla-go articular que rodea a la lesión ocasiona unareparación no funcional por incremento del ín-dice de proliferación celular y de la síntesis deproteínas de matriz extracelular (7,8). Se trata deun tejido fibrocartilaginoso inestable que dege-nera frecuentemente hacia la artrosis. Se sabe,que el grado de reparación que se produce enun cóndilo femoral lesionado es multifactorial,dependiendo de la profundidad de la lesión (le-siones parciales o lesiones osteocondrales), deltamaño, de la integridad del tejido adyacente,de la edad del individuo, etc.

Hoy en día, existen diversas técnicas para elabordaje terapéutico de este tipo de lesiones.Sin duda, una de las primeras opciones es la deutilizar autoinjerto, con tejido obtenido de unazona de no carga. No obstante, supone la crea-ción de una lesión adicional. La opción de pro-fundizar quirúrgicamente en la lesión hasta al-canzar el hueso subcondral, para favorecer elpaso de precursores mesenquimales, no ha

aportado buenos resultados a medio-largo pla-zo. El uso de homoinjertos criopreservados (-196ºC, con sustancias crioprotectoras) presentala desventaja de una reducida viabilidad celular.Por otro lado, disponer de homoinjertos en fres-co (entre 1 y 10ºC), garantiza una mayor viabili-dad pero representa un considerable problemalogístico, ya que el tiempo de almacenamientoes de unas pocas semanas (9).

Por todo ello, la expansión “ex vivo” de con-drocitos autólogos se presenta como una de lasalternativas con mejores perspectivas (10). Conestas técnicas se intenta reproducir fielmente lanaturaleza del cartílago dañado a partir de con-drocitos obtenidos del propio paciente que, unavez multiplicados en cultivo, son implantadosen la zona lesionada. El implante autólogo decondrocitos ya hoy en día es una clara opciónpara determinadas indicaciones clínicas. Ade-más de una óptima compatibilidad gracias aluso de material autólogo, no presenta el proble-ma de la orientación de las fibras de la zona do-nante a la receptora, como puede suceder enotras técnicas (11). Sin embargo, todavía existennumerosos puntos de estudio encaminados aobtener un medio óptimo para el transporte delos condrocitos autólogos hasta el momento delimplante articular.

Por otro lado, el mayor conocimiento quehoy se tiene del mecanismo anabólico (prolife-ración celular, producción de matriz extracelu-lar, síntesis de inhibidores de proteasas y síntesisde citocinas antiinflamatorias) y catabólico (su-presión de la proliferación de condrocitos, se-creción de proteasas y supresión de matriz extra-celular) del cartílago, han derivado en el estudiode nuevas dianas moleculares que podrían pro-teger el cartílago y colaborar en su regenera-ción. Por ejemplo, los factores de crecimientoson proteínas que intervienen en el anabolismodel cartílago, como el factor de crecimiento in-sulínico (IGF-1), el factor de crecimiento fibro-blástico básico (bFGF) o el factor de crecimien-to tumoral (TGFβ). Estos constituyen un grupode moléculas, actualmente en estudio, conoci-das con el nombre de fármacos modificadoresde la lesión articular (3).

El plasma rico en plaquetas (PRP) es un he-moderivado que se puede obtener a partir desangre total. Se está empezando a utilizar comoadhesivo óseo en cirugía maxilofacial y en trau-

matología ya que parece estimular los procesosde reparación tisular. El PRP es una substanciacon importante contenido en citocinas, factoresde crecimiento y otros elementos (catecolami-nas, serotonina, iones calcio, ATP, albúmina, fi-brinógeno, osteonectina, osteocalcina, factoresde coagulación, PDGF, IGF-I, IGF-II, FGF, EGF,TGFβ, entre otros) (12,13).

En base a los antecedentes anteriormente ex-puestos, el objetivo planteado en este trabajo hasido el estudio de la eficacia del plasma rico enfactores de crecimiento plaquetarios (PRFC) pa-ra la recuperación y el mantenimiento del feno-tipo condrocítico de células cultivadas en com-puestos de biomatriz autóloga (CPRFC). Paraello, hemos desarrollado y caracterizado com-puestos de CPRFC humano como futura herra-mienta para el mantenimiento, transporte ytransplante de condrocitos. También hemos rea-lizado un estudio preliminar de la utilidad de es-te tipo de compuesto en la reestructuración delcartílago articular lesionado experimentalmenteen conejo.

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención de Plasma Rico en FactoresPlaquetarios humano y de conejo

A partir de una unidad de sangre total huma-na citratada, de acuerdo con el procedimientoautomatizado desarrollado en el Centro deTransfusión de la Comunidad Valenciana, se ob-tienen concentrados de plaquetas suspendidasen plasma (PRP). Para ello, la sangre se centrifu-ga a alta velocidad (4100 g 15 min) obtenién-dose la capa leucoplaquetar que se resuspendeen plasma homólogo isogrupo. Seguidamente secentrifuga a baja velocidad (300 g 6 min), pro-porcionando un sobrenadante que contiene lasplaquetas. Por otro lado, el PRP de conejo se ob-tiene centrifugando sangre total directamente a400g 7 min, con EDTA como anticoagulante.

Finalmente, tanto el PRP humano como el le-porino, se concentran unas 100 veces por cen-trifugación (4000 g 15 min) y resuspensión enplasma homólogo o medio de cultivo.

Para liberar el contenido de los gránulos in-traplaquetarios, los concentrados de plaquetasse sonican (tres pulsos de 10 seg.) y se centrifu-gan a 10000 g durante 20 min a 4ºC. El sobre-

nadante que constituye el concentrado rico enfactores plaquetarios o PRFC se congela fraccio-nado a -80ºC hasta su uso.

Aislamiento y cultivo de condrocitos humano (1)y de conejo

Los condrocitos humanos proceden de biop-sias de cartílago obtenidas a partir de residuosquirúrgicos de donaciones multitisulares (20-39años de edad), en colaboración con el Banco deÓrganos y Tejidos de la Comunidad Valenciana.Los condrocitos de conejo se extraen del cartí-lago del cóndido femoral de la rodilla de cone-jas de raza Neozelandés blanco de 6 meses deedad. Las biopsias se mantienen en solución sa-lina tamponada con antibióticos a 4ºC hasta suprocesamiento dentro de las 24h.

Los condrocitos articulares se aíslan por di-gestión enzimática del cartílago con colagenasatipo IA al 0,2% (Sigma, USA) e hialuronidasa ti-po II al 0,1% (Sigma, USA) en DMEM-F12. Elproceso se controla con la ayuda del microsco-pio hasta conseguir la total disgregación de loscondrocitos. La suspensión celular se filtra connylon de 70 mm (Falcon, USA) y se lava 4 vecescon DMEM-F12 conteniendo 10% SBF (Sigma,USA). Finalmente los condrocitos humanos seresuspenden en DMEM-F12 conteniendo 10%de suero humano (SH) y los leporinos enDMEM-F12 conteniendo 10% de SBF, donde seprocede al recuento y viabilidad celular.

El inóculo celular se siembra en frasco decultivo y se mantiene en condiciones controla-das de humedad (95%), temperatura (37ºC) yCO2 (5%). Se realizan tres subcultivos seriadosrenovando periódicamente el medio de cultivo.

Formación de CPRFC humano y leporino

Cuando los subcultivos han alcanzado el90% de confluencia, las células se despegancon tripsina, se lavan, se recuentan y se valora laviabilidad celular. En todos los casos ésta ha si-do superior al 95%.

Densidades diferentes de células (0,5, 1 y1,5 � 106 células por ml de medio de cultivo) sesiembran en placa de cultivo de 24 pocillos. In-mediatamente se añade diferentes cantidades de

Condrocitos en plasma rico en factores plaquetarios

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PRFC (5, 10 y 20%) y Cl2Ca 1M para conseguirla gelificación. Las células se mantienen en laestufa de cultivo hasta la gelificación completay retracción del PRFC. El gel o compuesto dePRFC que contiene las células (CPRFC) ya entres dimensiones se mantiene así durante 15 dí-as, embebido en medio de maduración DMEM-F12 conteniendo 10% de SH (humano) o SBF(leporino), 10 ml PRFC/ml, 10 ml de ITS (insuli-na, transferrina y selenio) (Sigma, USA) y 3,5ml/ml ácido ascórbico (10 mg/ml), que se re-nueva periódicamente.

Para caracterizar las condiciones idóneas enla realización de los CPRFC, estudiamos quéproporciones de células procedentes del cultivoen monocapa y de PRFC son las más adecuadaspara obtener mejor rendimiento en base a loscriterios de viabilidad y rediferenciación celular,valorando el número de células/compuesto yevaluando la expresión de colágeno II. Para ellose realizan CPRFC con células humanas proce-dentes de la expansión en subcultivo seriado yajustadas a 0,5, 1 y 1,5 � 106/ml junto con 100ó 200 ml de PRFC. Los resultados obtenidos in-dican que en la proporción de 0,5 � 106 célu-las/ml y 100 ml de PRFC existe un alto índice deproliferación celular respecto a los CPRFC reali-zados con 1 ó 1,5 � 106 células/ml, como se de-muestra por inmunodetección con el factor nu-clear de proliferación celular (PCNA). En el casode los compuestos de origen leporino, ademásde la caracterización, se procede al implante ar-ticular experimental de los mismos.

Implante de CPRFC leporino en el cóndilo femoral

Para realizar los implantes experimentales enel cóndilo de conejo lesionado, hemos escogidoCPRFC realizados en proporción de 1 � 106 cé-lulas/ml y 100 ml de PRFC, dado que estos com-puestos presentaban un número suficiente decondrocitos, con cierto grado de proliferacióncelular y presencia de factores plaquetarios.

El implante de CPRFC se realiza en el cóndi-lo femoral de la rodilla derecha en cuatro cone-jas a las cuales hacía cuatro semanas se les ha-bía lesionado el cartílago derecho e izquierdopara obtener biopsias para el aislamiento de loscondrocitos. El cóndilo lesionado de la articula-

ción izquierda de estos mismos animales se re-serva como control de la regeneración espontá-nea experimental.

Tras anestesia intramuscular con Ketamina(Ketolar) (80 mg/Kg) y Xylacine (Rompum) (3mg/Kg) cada CPRFC es implantado en el mismoanimal del cual se habían extraído inicialmentelos condrocitos evitando así problemas inmuno-lógicos de rechazo tisular. En dos de las conejasla sujeción del CPRFC en el cóndilo derecho le-sionado se realiza con ayuda de periostio obte-nido de los mismos animales en el momento delimplante. En los otros dos animales, los CPRFCse sujetan con la ayuda de plasma coaguladocon Cl2Ca procedente del mismo animal. Losanimales se mantienen durante unas cuatro se-manas hasta su posterior sacrificio para evaluarla regeneración del cartílago.

Transcurrido ese tiempo, con la ayuda deuna sierra, se extrae el cóndilo femoral corres-pondiente a la rodillas derechas de los cuatroconejos donde se había realizado el implante ya las rodillas izquierdas control. Después de di-gitalizar la imagen, los cóndilos se sumergen enuna solución de formalina tamponada durante48h y posteriormente en PBS, hasta su estudiohistológico con hematoxilina-eosina e inmuno-histoquímica con anti-colágeno II.

Inmunodetección de colágeno II, VEGF, TGFβy PCNA

Los cortes histológicos, procedentes deCPRFC o de neocartílago de conejo formadopor el implante de CPRFC, una vez desparafina-dos se tratan con pepsina (1 mg/ml pH 2.0) du-rante 15 min a temperatura ambiente. Seguida-mente se incuban con 1/10 de suero de cabra ycon 1,7% de H2O2 en metanol 80%. Tras lava-dos con PBS-Tween 0,1% se incuban con 1/50de anticuerpos monoclonales anti-colágeno II(Oncogene, USA), anti-VEGF (MD, Spain), anti-TGFb (Serotec, UK) o anti-PCNA (Serotec, UK)durante 12 h a 4ºC con los correspondientescontroles negativos. Posteriormente se incubancon IgG de cabra anti-IgG de ratón marcado conperoxidasa (1/150) (Serotec, USA) durante 45min a 37ºC seguido del substrato cromogénicoDako AEC (DAKO, USA) y tinción de contrasteHematoxilina de Gill (Sigma, USA).

M.ª I. Guillén Salazar, V. Mirabet Lis, J. Sopena Juncosa, et al.

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diciones estables, especialmente en lo que alpH respecta, puede resultar trascendental parasu eficacia (21).

Contrariamente al método descrito por nos-otros, en otros protocolos de gelificación delPRP, se utiliza cloruro cálcico y trombina bovi-na como factores de coagulación. El uso detrombina bovina ha sido asociado con el des-arrollo de coagulopatías (12). En este estudio,hemos comprobado que los factores obtenidosde las plaquetas son suficientes para provocar lacoagulación del plasma, por lo que se puedeobviar la adición de trombina, e incluso parecesuficiente el Cl2Ca aportado por el DMEM-F12,por lo que no sería necesario el aporte externode éste.

Se conoce, no sin cierta controversia, de losbeneficios de los factores de crecimiento en la re-generación del cartílago articular. Así, la presen-cia de ácido ascórbico en el medio de madura-ción reduce el estrés oxidativo, aunque pareceque aumenta el nitrosativo (22). Aunque el PDGFno tiene efecto sobre el cartílago intacto (23), sique incrementa la síntesis de proteoglucanos enexplantes de cartílago (24). La IGF-I estimula laproliferación y la biosíntesis de matriz extracelu-lar y reduce la degradación de proteoglucanos(25). El TGFβ induce la proliferación y desdife-renciación de los condrocitos (26). Un recienteestudio ha demostrado también que el PDGF,TGFβ del PRP y el ácido ascórbico promueven laformación de colágeno asociado a la cicatriza-ción epitelial, incluso sin el uso de antibióticos(27). Por todo ello, la presencia de éstos y otrosfactores de los gránulos intraplaquetarios en elentorno celular del CPRFC, puede favorecer la in-ducción de fenómenos de reparación tisular, eneste caso, la condrogénesis. No obstante, es ne-cesario profundizar en la investigación de la im-portancia de la dosificación de estos factores.

También existen estudios que relacionan losefectos de los factores de crecimiento con elsuero. Condrocitos bovinos cultivados en gelesde colágeno, muestran que el suero bovino fetaly el PDGF tienen efectos sobre la proliferacióncelular y sólo el suero sobre la síntesis de bio-matriz (16). En este sentido, nuestros resultadosindican (Figura 1) que el grado de proliferacióncelular es proporcional al número de célulasque se emplean para constituir la CPRFC (másproliferación con un menor número de células),

e inversamente proporcional a la rediferencia-ción, dado que todas las variables ensayadasiban acompañadas de un 10% de SH y una pro-porción fija de 100 ml de PRFC. Los resultadosobtenidos con 200 ml de PRFC son sensible-mente diferentes a los anteriores, nula prolifera-ción y poca expresión colágeno II para todas lasvariables ensayadas, indicando con ello que laconcentración de factores plaquetarios podríainfluir reestableciendo los niveles proliferativosnormales y en la pérdida del fenotipo(28,29,30).

La integración con el cartílago circundantees un problema en la reparación del cartílagocuando se trata de transplante de condrocitoscultivados o de células madre en combinacióncon una serie de biomateriales. Tanto por loscondrocitos muertos en las superficies expues-tas, como por las barreras físicas fibrilares, comopor la capa profunda de cartílago calcificado esnecesario penetrarlo hasta el hueso subcondral(31). En este estudio hemos empleado dos pro-cedimientos quirúrgicos para el recubrimientodel implante de la CPRFC, con periostio o congel de plasma. Los resultados parecen indicarque el primero ha sido más efectivo, dado queexiste un mayor número de grupos isogénicosde condrocitos acompañados de síntesis de co-lágeno tipo II, además de no existir granulomas.También hemos comprobado que se ha produ-cido una total continuidad entre el periostio vi-vo y el CPRFC. Por ello, no puede descartarseque la regeneración articular mostrada en esteestudio pueda haber estado facilitada por la pre-sencia de precursores llegados desde el huesosubcondral o desde el periostio del recubri-miento. En este sentido se conoce que si setransplantan condrocitos junto con periostio vi-vo se forma tejido de reparación en contraste altransplante de condrocitos vivos y periostiomuerto donde el tejido de reparación no se hallegado a demostrar que existe (24). En el primercaso los condrocitos transplantados expresangenes tipo Sox 9, wnt14 y fibroblast growth fac-tor 3 receptors (FGFR3), marcador de célulasprogenitoras de condrocitos. Por lo tanto, ade-más de la viabilidad del CPRFC, a la hora deconseguir una correcta regeneración del cartíla-go hialino, es importante valorar la forma de re-alizar el implante para llegar a conseguir la co-rrecta generación del neocartílago.

Condrocitos en plasma rico en factores plaquetarios

PATOLOGÍA DEL APARATO LOCOMOTOR, 2005; 3 (1): 13-2325 21

Este trabajo constituye un primer estudio deun novedoso método de rediferenciación decondrocitos autólogos en gel de PRFC. La expe-riencia con células humanas pone de manifiestola viabilidad del modelo de cultivo. La extensióndel mismo al modelo leporino, incorporando eltrasplante experimental, evidencia su utilidadclínica. El modelo de cultivo se propone, enton-ces, como una alternativa a los sistemas que ac-tualmente se emplean para la utilización clínicade condrocitos cultivados en estudios de regene-ración articular. La inclusión de las células en unsoporte tridimensional, facilita su manipulaciónpor parte del cirujano. Por otro lado, la utiliza-ción de factores autólogos en el medio de culti-vo y para la elaboración del soporte tridimensio-nal, hace el método especialmente atractivodesde el punto de vista de su inocuidad respec-to a la potencial transmisión de enfermedades.Finalmente, desde el punto de vista económico,el gasto de material se reduce considerablemen-te frente a otros sitemas que utilizan factores xe-nogénicos o bien homólogos, pero de elevadocoste.

Fundamentalmente, estos resultados prelimi-nares han servido para asentar las bases de unestudio más profundo dirigido principalmente ala optimización del procedimiento de obtenciónde los factores de crecimiento plaquetarios(cuantificando su concentración), la estandari-zación del desarrollo de los compuestos (cuan-tificando las necesidades de productos autólo-gos necesarios) y la evaluación de los resultadosclínicos del implante a largo plazo.

Agradecimientos: A la Fundación MAPFREMedicina por la concesión de una Ayuda a la In-vestigación que ha permitido el desarrollo de es-te trabajo.

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