Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in …tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/4484068.pdfReal-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples Catalog

GUIDE DE L’UTILISATEUR

Uniquement réservé aux échantillons de production primaire.

Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production SamplesCatalog Number 4428176 (PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit, 300 rxns), 4480466 (PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit, 100 rxns), 4426715 (PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit - Extra Clean with Proteinase K), 4403930 (MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit)Publication Number 4484068Revision A

Réf. attestation (ABI 29/02 – 09/10)

METHODES ALTERNATIVES D’ANALYSE POUR L’AGROALIMENTAIRECertifié par AFNOR Certificationwww.afnor-validation.org

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© 2013 Life Technologies Corporation. All rights reserved.

Translated from English Publication Number 4476867 Rev. A

Sommaire

5Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples

Informations sur le produit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9Description . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9Utilisateurs visés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9Durée de vie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9Spécificité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9Validation ISO 16140 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10Date d’expiration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10Conditions de fonctionnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11Définition de termes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

Processus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

■ CHAPITRE 1 PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

Matériel et équipement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13Contenu du kit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13Matériel non inclus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

Préenrichissement d’échantillons de production primaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16Homogénéisation et enrichissement primaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16Enrichissement secondaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

Préparation automatique des échantillons à l’aide du PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit . . . . 16Préparation du matériel du PrepSEQ® kit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16Préparation des plaques de traitement MagMAX™ Express-96 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18Traiter les échantillons sur le MagMAX™ Express-96 Instrument . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

Résolution des problèmes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

■ CHAPITRE 2 PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Matériel et équipement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21Contenu du kit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21Matériel non inclus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

6 Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples

Sommaire

Préenrichissement d’échantillons au stade de production primaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23Avant de commencer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23Homogénéisation et enrichissement primaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23Enrichissement secondaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

Préparation d’échantillons à l’aide du PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23


■ CHAPITRE 3 MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit . . . . . . . . . . . 29

Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

Matériel et équipement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29Contenu du kit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29Matériel non inclus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

Préparation de la PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31Préparation de la PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31Préparation des tubes pour le 7500 Fast System, le StepOne™ System et le StepOnePlus™ System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Exécution des réactions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35Avant de commencer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35Exécution des réactions de 8 tubes sur le 7500 Fast System (uniquement) sans RapidFinder™ Express Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

Affichage des résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Procédure générale sans RapidFinder™ Express Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Ressources d’affichage des résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Confirmation des résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37


■ ANNEXE A StepOne™ et StepOnePlus™ Systems . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

Exécution des réactions de 8 tubes sur le StepOne™ System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

Exécution des réactions de 8 tubes sur le StepOnePlus™ System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

■ ANNEXE B Bonnes pratiques en matière de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41Bonnes pratiques de laboratoire en matière de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41Configuration de plaques suggérées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

■ ANNEXE C Sécurité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

Sécurité chimique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44Manipulation spécifique des produits chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

Sécurité en matière de dangers biologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45


Sommaire

Références . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Documentation et support . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

Obtention d’une FDS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

Obtention de certificats d’analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

Obtention d’assistance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

Support relatif à la sécurité alimentaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

Garantie limitée . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50


Sommaire


Informations sur le produit

IMPORTANT ! Avant d’utiliser ce produit, lire les informations décrites dans l’annexe « Sécurité » et s’assurer de les avoir bien comprises.

Présentation

Description Life Technologies a développé une procédure de préparation d’échantillons pour la détection de Salmonella spp. dans des échantillons de production primaire. Cette procédure s’articule autour de l’enrichissement, la préparation des échantillons et la détection par la PCR en temps réel. Les méthodes de préparation d’échantillons suivantes peuvent être employées lors de la détection du Salmonella spp. dans des échantillons de production primaire après enrichissement :

• Méthode basée sur des billes magnétiques — voir « PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp. », page 13

• Méthode basée sur des colonnes de centrifugation — voir « PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp. », page 21

Les deux méthodes ont recours à un enrichissement en deux étapes avant l’extraction d’ADN des échantillons

Utilisateurs visés Le MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit est destiné aux microbiologistes qui doivent rechercher la présence de Salmonella spp. dans des échantillons alimentaires et environnementaux. Le MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit n’est pas destiné à un usage diagnostic ou thérapeutique chez les animaux ou les hommes.

Durée de vie Voir la date de péremption indiquée sur l’emballage externe.

Spécificité Le MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit permet la detection de toutes les espèces de Salmonella enterica testées et n’a détecté aucune autre espèce. Cette méthode ne permet pas la détection de Salmonella bongori.


Informations sur le produit Présentation

Validation ISO 16140

Le PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit et le PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K font partie de la procédure validée par l’AFNOR Certification couvrant l’ADN du Salmonella spp. dans les bouillons de cultures d’échantillons environnementaux de production primaire fréquemment trouvés. La certification se base sur la norme ISO 16140 pour la validation de méthodes alternatives (Alternative Analytical Methods for Agribusiness. Certifié par NF Certification ; www.afnor-validation.org). Ce kit a été comparé à la méthode de référence ISO 6579 et jugé équivalent. Le protocole validé inclut :

• Un des protocoles de préparation d’échantillon suivants :– PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit– PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with

Proteinase K• MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit• Applied Biosystems® 7500 Fast Real-Time PCR Instrument• RapidFinder™ Express Software v1.1

Le PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit et le PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K ont tous deux été certifiés « NF Validation » pour les échantillons environnementaux de production primaire.

Remarques générales et recommandations :

• Respecter les bonnes pratiques de laboratoire (se référer à la norme NF EN ISO 7218)

• Il est recommandé de suivre les modalités décrites dans les normes ISO 6579 et ISO 6887 pour la préparation de la suspension mère

• Dans le cadre de la certification NF VALIDATION, les prises d’essai supérieures à 25 g n’ont pas été testées

Date d’expiration Pour plus d’informations sur la date d’expiration de la certification « NF Validation », se reporter au certificat ABI 29/02 – 09/10, disponible à l’adresse www.afnor-validation.org.

Certifié par AFNOR Certification

www.afnor-validation.org]

Réf. attestation (ABI 29/02 – 09/10)METHODES ALTERNATIVES D’ANALYSE POUR L’AGROALIMENTAIRE

Méthode de référence Matrice

Deux méthodes de référence ont été employées pendant l’étude de validation :• NF EN ISO 6579:2002/Amd 1:2007 :

Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp. Recherche des Salmonella spp. dans les matières fécales des animaux et dans des échantillons environnementaux au stade de la production primaire

• NF U47-100 : Norme française pour l’isolement et l’identification du Salmonella spp. dans l’environnement et des échantillons de productions animales : « Recherche par l’isolement et l’identification de tout sérovar ou de sérovar(s) spécifié(s) de salmonelles dans l’environnement des productions animales »

Échantillons environnementaux : pédichifonnettes (volaille et porcs), matières fécales (volaille et porcs), litière, eau potable pour animaux et éponges




Informations sur le produitPrésentation

Conditions de fonctionnement

Altitude

Les systèmes 7500 Fast Real-Time PCR System d’Applied Biosystems® sont réservés à un usage en intérieur et à des altitudes qui n’excèdent pas 2 000 m (6 500 pieds) au-dessus du niveau de la mer.

Définition de termes

Dans ce protocole, les termes suivants sont utilisés :

• Amplification : processus de création de copies d’une séquence d’ADN spécifique, et donc multiplication de cette séquence.

• Contrôle positif interne (IPC) : contrôle dans tous les puits de réaction qui devrait donner une amplification. S’il ne donne pas d’amplification, cela signifie qu’il y a un problème au niveau de l’amplification. La présence d’un inhibiteur dans l’échantillon inconnu est indiquée si le signal IPC est significativement réduit.

• Contrôle négatif : mélange réactif qui ne contient pas de séquence cible. Ce contrôle indique une contamination si une amplification se produit ou un problème d’amplification si le signal IPC est réduit ou absent. Le Pathogen Detection Negative Control est fourni dans le kit comme contrôle négatif. Un contrôle négatif au moins est requis pour chaque série analytique.

• Réaction en chaîne à la polymérase (PCR, Polymerase chain reaction) : technologie permettant d’amplifier ou de multiplier une séquence d’ADN.

• Contrôle positif : contrôle qui établit l’amplification attendue d’une cible. L’absence d’un signal cible dans un puits de contrôle positif indique une erreur de pipetage ou un problème d’amplification. Un contrôle positif est fourni par le chercheur et est recommandé, mais n’est pas obligatoire pour chaque série analytique.

• Amorce : segment d’ADN complémentaire de la séquence d’ADN cible ou de la séquence d’ADN IPC. Ce segment est nécessaire pour commencer l’amplification.

• Sonde : segment d’ADN complémentaire de la séquence d’ADN cible ou de la séquence d’ADN IPC. La sonde est couplée à un fluorochrome. Quand la sonde se lie à la cible ou à l’IPC pendant l’amplification, la fluorescence est émise. Le système Sequence Detection System (SDS) ou Real-Time PCR System détecte la fluorescence, indiquant la présence de la séquence d’ADN cible ou IPC.

• Cible : bactérie dépistée.• Échantillon inconnu : échantillon d’ADN prélevé sur un produit alimentaire

soumis au dépistage de plusieurs agents pathogènes alimentaires.

Température et humidité requises

Condition Plage acceptable

Température 15 à 30 °C (50 à 90 °F)

Variation maximale inférieure à 15 °C (59 °F) par 24 heures

Humidité 20 à 80 % d’humidité relative, sans condensation


Informations sur le produit Processus

Processus

Une procédure de préparation d’échantillon est illustrée ci-dessous pour la méthode basée sur les billes magnétiques (voir page 13) ainsi que pour la méthode basée sur les colonnes de centrifugation (voir page 21).

PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit automatisé sur MagMAX™ Express-96

PrepSEQ® Rapid Spin Extra Clean Kit with Proteinase K

Diluer l’enrichissement selon un rapport 1:9: Transférer 1 ml de bouillon TT enrichie dans 9 ml d'EPT

Incuber les enrichissements à 37 °C pendant 16 à 20 heures

Real-time PCR: utiliser MicroSEQ® Salmonella spp. Detection kit avec 7500 Fast Instrument

Diluer l’échantillon avec du bouillon TT selon un rapport 1:9. (p. ex. 25 g ou 25 ml d’échantillon pour 225 ml de bouillon TT)

Incuber les bouillons à 37 °C pendant 4 à 6 heures

1


PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit:Salmonella spp.


Présentation

Le PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit permet de préparer facilement l’ADN à partir d’échantillons environnementaux de production primaire pour 300 réactions. L’utilisation du PrepSEQ® Kit avec des échantillons environnementaux de production primaire est validée. La procédure du kit implique les tâches suivantes :

• Enrichissement de Salmonella spp. ; enrichissement primaire en bouillon de tétrathionate (bouillon TT) suivi d’une dilution et d’un enrichissement secondaire en eau peptonnée tamponnée (EPT)

• Extraction automatique des échantillons à l’aide du MagMAX™ Express-96 Magnetic Particle Processor

Les échantillons de départ recommandés sont pris en charge :

• Pédichiffonnettes et éponges : 100 à 150 ml de bouillon TT (veillez à l'immersion complète des échantillons)

• Écouvillons : 10 ml de bouillon TT• Autres échantillons environnementaux (tels que des matières fécales) : Bouillon TT

selon un rapport 1:10 ; par exemple, 25 g d’échantillon avec 225 ml de bouillon TT

Matériel et équipement

Contenu du kit Le PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit contient des réactifs pour 300 réactions. Les composants du kit et leurs conditions de conservation sont décrits dans le tableau ci-dessous. Pour plus d’informations sur le contenu du kit, se reporter à la section « Matériel fourni » de la notice qui accompagne le kit.

PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit ;Cat. nos. 4480466 (100 rxns), 4428176 (300 rxns‡)

Élément Quantité ou volume Conservation

Lysis Buffer 2 flacons, 50 ml/flacon

Température ambiante (23 ± 5 °C)

Magnetic Particles 2 tubes, 1,5 ml/tube

5 ± 3 °C


Chapitre 1 PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp.Matériel et équipement1

Pour plus d’informations sur la conservation du contenu du kit, se reporter à la section « Conservation » de la notice qui accompagne le kit.

Remarque : Des réactifs peuvent être expédiés séparément, selon des conditions de stockage des différentes parties du kit

Matériel non inclus Le tableau suivant indique le matériel et l’équipement nécessaires (mais non inclus) pour l’utilisation du PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit for Food Testing. Sauf indication contraire, bon nombre des éléments indiqués sont disponibles auprès des principaux fournisseurs de matériel de laboratoire (MLS, Major Laboratory Supplier).

Binding Solution (Isopropanol) 1 flacon vide Température ambiante (23 ± 5 °C)

Wash Buffer Concentrate 2 flacons, 26 ml/flacon

Température ambiante (23 ± 5 °C)

Elution Buffer 1 flacon, 25 ml Température ambiante (23 ± 5 °C)

Proteinase K (PK) Buffer 1 flacon, 50 ml Température ambiante (23 ± 5 °C)

Proteinase K (20 mg/ml) 1 tube, 1,25 ml En-dessous de -18 °C

‡ Le kit pour 300 réactions (Cat. no. 4428176) contient 3 fois les quantités et volumes indiqués dans le tableau ci-dessus.

PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit ;Cat. nos. 4480466 (100 rxns), 4428176 (300 rxns‡)


Équipement, consommables et réactifs

Élément Source

Équipement

96-Well Magnetic Ring Stand Life Technologies Cat. no. AM10050

Bloc chauffant ou bain-marie à (37 – 50 °C)

Centrifugeuse de plaque Eppendorf 5804 ou équivalent

MagMAX™ Express-96 Deep Well Magnetic Particle Processor

Life Technologies Cat. no. 4400079

Homogénéisateur (mélangeur de laboratoire, type Stomacher® 400)

Seward Cat. no. 0400/001/AJ ou équivalent

Mélangeur de type Vortex MLS


Chapitre 1 PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp.Matériel et équipement 1

Consommables

Gants jetables MLS

Embouts de micropipettes, résistants aux aérosols MLS

Multipipettes :• À piston• À air comprimé• Multicanal

MLS

MagMAX™ Express-96 Deep Well Tip Combs Life Technologies Cat. no. 4388487

MagMAX™ Express-96 Deep Well Plates Life Technologies Cat. no. 4388476

MagMAX™ Express-96 Standard Plates Life Technologies Cat. no. 4388475

Sacs à filtre Whirl-Pak®, 15,2 cm × 22,8 cm (6" × 9"), 680 g (24 oz.), 250/pkg (sacs Stomacher® avec tamis)

Nasco Cat. no. BO1348WA ou équivalent

Sacs à filtre Whirl-Pak®, 15,2 cm × 22,8 cm (6" × 9"), 680 g (24 oz.), (sacs Stomacher® sans tamis)


Tubes Microcentrifuge, PCR-Clean, 1,5 ml MLS

Tubes stériles, 15 et/ou 50 ml MLS

Réactifs

Bouillon d’enrichissement : eau peptonée tamponnée (EPT)

MLS

Bouillon tétrathionate (TT) MLS

Nuclease-Free Water Life Technologies Cat. no. AM9938

Éthanol à 95 % MLS

Isopropanol à 100 % • Fisher Chemical Cat. no. A464-1• Sigma-Aldrich Cat. no. 190764-1L• Ou équivalent


Élément Source


Chapitre 1 PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp.Préenrichissement d’échantillons de production primaire1

Préenrichissement d’échantillons de production primaire

Homogénéisation et enrichissement primaire

1. Diluer l’échantillon avec du bouillon tétrathionate (Bouillon TT) selon un rapport 1:9 dans un sac à filtre de type Stomacher (Nasco WhirlPak Cat. no. B01488WA ou équivalent) ; par exemple, diluer 25 grammes d’échantillon avec 225 ml de bouillon TT.

2. Homogénéiser l’échantillon dans un mélangeur de laboratoire de type Stomacher® 400 (ou équivalent) pendant 1 minute environ à vitesse normale.

3. Incuber l’échantillon à 37 ± 1 °C pendant 16 à 20 heures.

Enrichissement secondaire

1. Diluer l’échantillon enrichi avec l’eau peptonnée tamponnée (EPT) selon un rapport 1:9 ; Transférer, 1 ml d’échantillon dans 9 ml d’EPT.

2. Incuber l’échantillon à 37 ± 1 °C pendant 5 ± 1 heure dans des conditions statiques.

3. Mélanger brièvement l’échantillon pour s’assurer que les bactéries se trouvent dans la solution ; par exemple, mélanger au vortex pendant 5 secondes environ.

4. Procéder à la préparation des échantillons.

Remarque : Conserver les enrichissements EPT pour confirmer les positifs présumés à 5 ± 3 °C pendant 72 heures maximum.

Préparation automatique des échantillons à l’aide du PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit

IMPORTANT ! Lors de la manipulation des échantillons, respecter les techniques d’asepsie appropriées afin d’éviter toute contamination croisée.

Préparation du matériel du PrepSEQ® kit

1. Régler la température du bloc chauffant sur 37 °C.

2. Binding Solution (Isopropanol) : Ajouter 35 ml d’isopropanol à 100 % dans le flacon Binding Solution vide. Étiqueter le flacon de manière à indiquer que de l’isopropanol y a été ajouté.

3. Wash Buffer : Ajouter 74 ml d’éthanol à 95 % dans un flacon Wash Buffer Concentrate, bien mélanger, puis étiqueter le flacon de manière à indiquer que de l’éthanol y a été ajouté.

4. Magnetic Particles : Incuber le tube Magnetic Particles à 37 ± 1 °C pendant 8 ± 2 minutes, puis mélanger au vortex pendant 10 secondes environ ; conserver à température ambiante (23 ± 5 °C) jusqu’au moment de l’utilisation. Si, au bout de l’incubation initiale, le précipité blanc n’est pas complètement dissous, un temps d’incubation plus long et des températures supérieures (jusqu’à 50 °C) peuvent être appliqués en vue de dissoudre le précipité.

IMPORTANT ! Un précipité blanc peut parfois se former dans le tube Magnetic Particles. Il ressort des expériences en matière d’extraction que la formation du précipité n’affecte pas les performances du système, à condition que ce précipité soit dissous avant utilisation et que le tube Magnetic Particles soit remis en


Chapitre 1 PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp.Préparation automatique des échantillons à l’aide du PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit 1

suspension. Avant utilisation, toujours incuber le tube Magnetic Particles à 37 ± 1 °C pendant 10 minutes, puis le mélanger au vortex pour le remettre complètement en suspension. Si, au bout de 10 minutes, le précipité blanc n’est pas complètement dissous, il est recommandé d’appliquer un temps d’incubation plus long et des températures supérieures (≤ 50 °C), puis de remélanger au vortex afin de remettre complètement les particules en suspension.

Remarque : Les Magnetic Particles sont le réactif limitatif du PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit. S’assurer qu’il y a suffisamment de Magnetic Particles pour le nombre d’échantillons à traiter ; 25 µl de billes magnétiques par échantillon sont requis.

5. Binding Premix Solution :

a. Prémélanger 450 µl de PK Buffer avec 325 µl de Binding Buffer et 25 µl de Magnetic Particles par échantillon dans un récipient approprié.

Remarque : Lors de la préparation de la Binding Premix Solution pour plusieurs échantillons, multiplier les volumes par le nombre d’échantillons (y compris les contrôles) plus 10 % supplémentaires pour la variation des échantillonnages.

Remarque : Utiliser la Binding Premix Solution dans l’heure qui suit sa préparation. Conserver à température ambiante.

b. Bien mélanger au vortex pendant 5 secondes environ jusqu’à la fin de la remise en suspension.

c. Ajouter 800 µl de Binding Premix Solution dans chaque puits de la Lysis Plate (échantillon).

d. Charger la plaque dans l’instrument quand le MagMAX™ Express-96 magnetic particle processor le demande.


Chapitre 1 PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp.Préparation automatique des échantillons à l’aide du PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit1

Préparation des plaques de traitement MagMAX™ Express-96

1. Préparer les plaques de traitement comme décrit dans le tableau ci-dessous. Ajouter des réactifs aux plaques comme décrit à la section « Action ».

Traiter les échantillons sur le MagMAX™ Express-96 Instrument

1. Sélectionner le programme 4428176DWPrepSEQFA sur le MagMAX™ Express-96 Magnetic Particle Processor. Appuyer sur Start.

2. Charger les plaques dans le MagMAX™ Express-96 Instrument selon la mesure indiquée. Vérifier chaque orientation de la plaque {A1 à A1}.

Remarque : Il n’y a aucune autre intervention manuelle quand on utilise la procédure automatique, jusqu’à la fin de la procédure de purification.

PlaqueType de plaque

MagMAX™ Express-96

Action

Tip Plate Standard Placer un 96-well Deep Well Tip Comb dans une plaque standard MagMAX™ Express-96.

Elution Plate Standard Ajouter 120 µl d’Elution Buffer par puits.

Remarque : Pour inclure le contrôle Elution Buffer, aliquoter 120 µl d’Elution Buffer dans un puits vide supplémentaire de l’Elution Plate.

Wash Plate I Deep well plate (Cat. no. 4388476)

Ajouter 300 µl du Wash Buffer.

Wash Plate II Deep well plate Ajouter 300 µl du Wash Buffer.

Lysis Plate (échantillon)

Deep well plate Ajouter 100 µl d’EPT enrichi à la Lysis Plate (échantillon) contenant 800 µl du Binding Premix.

Plaque Action

Tip Plate Charger la Tip Plate, puis appuyer sur Start.

Elution Plate Charger l’Elution Plate préparée, puis appuyer sur Start.

Wash Plate II Charger la Wash Plate II préparée, puis appuyer sur Start.

Wash Plate I Charger la Wash Plate I préparée, puis appuyer sur Start.

Lysis Plate (échantillon) Charger la Lysis Plate (échantillon), puis appuyer sur Start.


Chapitre 1 PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp.Résolution des problèmes 1

3. Quand la préparation des échantillons est terminée, le message « Enjoy your DNA » s’affiche à l’écran. Retirer l’Elution Plate.

Remarque : L’Elution Plate contient l’ADN purifié.

Remarque : Retirer et éliminer les plaques utilisées sur le MagMAX™ Instrument : La Lysis Plate contient du guanidinium et les Wash Plates contiennent de l’alcool. Eliminer de manière appropriée (voir « Sécurité chimique », page 44).

POINT D'ARRÊT Poursuivre avec l’exécution de la MicroSEQ® Salmonella spp. real-time PCR (comme indiqué) ou sceller l’Elution Plate avec du film adhésif transparent et conserver à 4 °C (pendant toute une nuit) ou en dessous de -18 °C (pendant une période prolongée).

Résolution des problèmes

Observation Cause possible Action recommandée

L’inhibition de la PCR est indiquée par l’absence de détection de réaction IPC.

Présence de Magnetic Particles sur l’Elution Plate.

Éviter de mettre en suspension les Magnetic Particles lors du prélèvement d’extrait d’ADN.

Facultatif :

Faire tourner la plaque à environ 4 000 × g pendant 30 secondes pour culotter les Magnetic Particles au fond de la plaque.

ou

Placer l’Elution Plate sur le 96-Well Magnetic Ring Stand (Cat. no. AM10050) lors du prélèvement de l’extrait d'ADN.

L’Elution Plate contient des résidus particulaires qui n’ont pas été éliminés complètement de l’échantillon alimentaire.

Eviter de prélever des résidus lors du prélèvement de l’extrait d’ADN.

Facultatif :

Faire tourner la plaque à 4 000 × g pendant 30 secondes pour culotter les résidus alimentaires au fond de la plaque.


Chapitre 1 PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp.Résolution des problèmes1

2


PrepSEQ® Rapid Spin SamplePreparation Kit – Extra Clean with

Proteinase K: Salmonella spp.


Présentation

Le PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K permet de préparer facilement l’ADN à partir d’échantillons environnementaux de production primaire pour 100 réactions. L’utilisation du PrepSEQ® Kit avec des échantillons environnementaux de production primaire est validée. La procédure du kit implique les tâches suivantes :

• Enrichissement de Salmonella spp. ; enrichissement primaire en bouillon tétrathionate (bouillon TT) suivi d’une dilution et d’un enrichissement secondaire en eau peptonnée tamponnée (EPT)

• Préparation d’échantillons à l’aide de colonnes de centrifugation

Le mode de préparation suivant est recommandé :

• Pédichiffonnettes et éponges : 100 à 150 ml de bouillon TT (veillez à l’immersion complète de l’échantillon)

• Écouvillons : 10 ml de bouillon TT• Autres échantillons environnementaux (tels que des matières fécales) : Bouillon TT

selon un rapport 1:10 ; par exemple, 25 g d’échantillon avec 225 ml de bouillon TT

Remarque : Pour la préparation d’échantillons à partir d’échantillons de production primaire, Applied Biosystems recommande un volume d’échantillon de 750 µl (chargé dans la colonne de centrifugation).


Contenu du kit Le PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K (Cat. no. 4426715) contient des réactifs pour 100 préparations d’échantillons. Les compo-sants du kit sont décrits dans le tableau ci-dessous. Pour plus d’informations sur le contenu du kit, se reporter à la section « Matériel fourni » de la notice qui accompagne le kit.


Colonnes de centrifugation 100 Température ambiante (23 ± 3 °C)

Tubes de microcentrifugeuse, 1,5 ml 2 x 100

Lysis Buffer, 1 flacon 5 ml 5 ± 3 °C

Proteinase K (20 mg/ml), 1 tube 1,25 ml En-dessous de -18 °C


Chapitre 2 PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp.Matériel et équipement2


Remarque : Des éléments peuvent être expédiés séparément, selon la configuration commandée et les conditions de conservation.

Matériel non inclus Le tableau suivant indique le matériel et l’équipement nécessaires (mais non inclus) pour l’utilisation du PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K. Sauf indication contraire, de nombreux composants indiqués sont disponibles auprès des principaux fournisseurs de matériel de laboratoire (MLS, Major Laboratory Supplier).


Élément Source

Équipement

Bloc chauffant, 97 °C MLS

Bloc chauffant, 56 °C MLS

Portoir pour tubes de 1,5 ml MLS

Microcentrifugeuse de laboratoire Eppendorf 5415 D ou équivalent

Homogénéisateur (mélangeur de laboratoire de type Stomacher® 400)

Seward Cat. no. 0400/001/AJ ou équivalent

Multipipettes :• À piston• À air comprimé

MLS

Mélangeur de type Vortex MLS

Consommables

Gants jetables MLS

Embouts de pipette résistant aux aérosols MLS

Sacs à filtre Whirl-Pak®, 25,5 cm × 38 cm, (10" × 15"), 2,6 kg (92 oz.) (sacs Stomacher® avec tamis)


Sacs à filtre Whirl-Pak®, 15,2 cm x 22,8 cm (6" × 9"), 680 g (24 oz.), 250/pkg (sacs Stomacher® avec tamis)


Sacs à filtre Whirl-Pak®, 15,2 cm × 22,8 cm (6" × 9"), 680 g (24 oz.) (sacs Stomacher® sans tamis)


Réactifs

Eau peptonée tamponnée (EPT) MLS

Bouillon de tétrathionate (TT) MLS

Nuclease-Free Water Life Technologies Cat. no. AM9938


Chapitre 2 PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp.Préenrichissement d’échantillons au stade de production primaire 2

Préenrichissement d’échantillons au stade de production primaire

Avant de commencer

Préparation des réactifs de préparation d’échantillons• Régler la température de chauffage d’un bloc sur 97 °C et celle d’un deuxième

bloc sur 56 °C.• Étiqueter les tubes de microcentrifugation de 1,5 ml.• Pour le traitement de plusieurs échantillons, nous recommandons de préparer un

mélange Proteinase K-Lysis Buffer : prémélanger 5 µl de Proteinase K (20 mg/ml) avec 50 µl de Lysis Buffer pour chaque échantillon (utiliser un récipient propre de taille appropriée pour le mélange). Multiplier les volumes par le nombre d’échantillons plus 10 % pour les pertes. Bien mélanger pour disperser la Proteinase K dans le Lysis Buffer. Utiliser immédiatement ou conserver sur glace jusqu’au moment de l’utilisation.

Homogénéisation et enrichissement primaire

1. Diluer l’échantillon avec du bouillon tétrathionate (Bouillon TT) selon un rapport 1:9 dans un sac à filtre type Stomacher (Nasco WhirlPak Cat. no. B01488WA ou équivalent) ; par exemple, diluer 25 grammes d’échantillon avec 225 ml de bouillon TT.

2. Homogénéiser l’échantillon dans un mélangeur de laboratoire Stomacher® 400 (ou équivalent) pendant 1 minute environ à vitesse normale.

3. Incuber l’échantillon à 37 ± 1 °C pendant 16 à 20 heures dans des conditions statiques.

Enrichissement secondaire

1. Diluer l’échantillon enrichi avec l’eau peptonnée tamponnée (EPT) selon un rapport 1:9 ; Transférer 1 ml d’échantillon dans 9 ml d’EPT dans un récipient approprié.

2. Incuber l’échantillon à 37 ± 1 °C pendant 5 ± 1 heures dans des conditions statiques.

3. Mélanger brièvement l’échantillon pour s’assurer que les bactéries se trouvent dans la solution ; par exemple, mélanger au vortex pendant 5 secondes environ.

4. Procéder à la préparation des échantillons.

Remarque : Conserver les enrichissements EPT pour confirmer les positifs présumés à 5+/- 3°C pendant 72 h maximum.

Préparation d’échantillons à l’aide du PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K

IMPORTANT ! Lors de la manipulation des échantillons, respecter les techniques d’asepsie appropriées afin d’éviter toute contamination croisée.

1. Insérer une colonne de centrifugation dans un tube étiqueté.

2. Charger 750 µl d’échantillon enrichi dans la colonne de centrifugation et boucher la colonne.


Chapitre 2 PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp.Préparation d’échantillons à l’aide du PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K2

3. Charger le tube avec la colonne de centrifugation dans la microcentrifugeuse. Orienter la charnière du bouchon du tube vers l’intérieur du rotor (voir la figure de droite ci-dessous). Sinon, la charnière du bouchon gênera la mise en place du couvercle du rotor.

4. Microcentrifuger le tube pendant 3 minutes à 12 000 – 16 000 × g.

5. Retirer le tube de la microcentrifugeuse, puis éliminer la colonne de centrifugation usagée.

6. Aspirer, puis éliminer le surnageant.

IMPORTANT ! Retirer le surnageant de manière aussi complète que possible, y compris tous les excédents de liquide éventuels sur les côtés du tube. Éliminer les gouttelettes en cerclant l’intérieur du tube avec la multipipette et en l’enfonçant dans le surnageant en vue de son élimination par aspiration.

7. Ajouter 55 µl du mélange PK Lysis Buffer (50 µl de Lysis Buffer + 5 µl de Proteinase K) par échantillon au culot.

Remarque : Voir les instructions de préparation du mélange Proteinase K-Lysis Buffer lors du traitement de plusieurs échantillons dans « Avant de commencer », page 23.

IMPORTANT ! Conserver le mélange Proteinase K-Lysis Buffer sur glace jusqu’au moment de son utilisation.

8. Remettre en suspension en retournant la pipette ou mélanger au vortex jusqu’à ce que le culot soit bien dispersé dans le mélange Lysis Buffer.

9. Transférer le mélange Proteinase K-Lysis Buffer contenant le culot bactérien remis en suspension dans un tube propre de 1,5 ml. Le culot doit être bien dispersé dans le Lysis Buffer avant le transfert.

IMPORTANT ! Le mélange Lysis Buffer doit être transféré dans un tube propre. Pendant le transfert, le résidu gras sera laissé sur les côtés du tube d’origine. Éviter tout contact avec cette graisse et transférer uniquement le Lysis Buffer contenant le culot remis en suspension dans un tube propre.

Positionnement incorrect du bouchon du tube

Positionnement correct du bouchon du tube


Chapitre 2 PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp.Préparation d’échantillons à l’aide du PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K 2

10. Boucher le tube, puis incuber à 56 ± 1 °C pendant 30 minutes environ pour activer la Proteinase K.

11. Incuber à 97 ± 2 °C pendant 10 minutes.

12. Laisser l’échantillon refroidir pendant 2 minutes approximativement à température ambiante.

13. Microcentrifuger le tube pendant 1 minute à 12 000 – 16 000 × g pour réduire la condensation après l’étape de chauffage à 97 ± 2 °C.

14. Ajouter 250 µl d’eau de qualité PCR sans nucléase. Bien mélanger.

IMPORTANT ! Utiliser de l’eau de qualité PCR-clean (Part no. AM9938). L’eau traitée en autoclave ne doit pas être considérée comme de l’eau de qualité PCR-clean.

15. Microcentrifuger le tube à 12 000 – 16 000 × g pendant 90 ± 30 secondes afin de réduire toutes les matières particulaires dérivées de la colonne de centrifugation, qui peuvent interférer avec l’amplification. L’ADN microbien est en phase aqueuse.

Remarque : Les échantillons peuvent être conservés à 5 ± 3 °C pendant toute une nuit, ou en dessous de -18 °C pendant une période prolongée. Avant l’exécution de la PCR, les échantillons stockés doivent être centrifugés pendant 1 minute environ à vitesse maximale afin de culotter les matières particulaires dans la colonne.

16. Poursuivre la PCR ou stocker le tube à une température inférieure à -18 °C.

IMPORTANT ! Pour la PCR, ajouter 30 µl de surnageant aux billes lyophylisées. Pour obtenir les instructions détaillées, se reporter au protocole MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit (voir « MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit », page 29).

IMPORTANT ! En cas d’inhibition de la PCR, indiquée par l’absence d’amplification de la cible ou de l’IPC, diluer l’échantillon avec de l’eau. Nous recommandons l’ajout de 5 µl d’échantillon et de 25 µl d’eau aux billes lyophylisées pour lever l’inhibition. Voir « Résolution des problèmes », page 26 pour plus de détails.


Chapitre 2 PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp.Résolution des problèmes2


Éviter la couche supérieure contenant des débris d’échantillon.

Prélever l’échantillon au centre.

Éviter les matières particulaires dans la colonne.

Dans les échantillons alimentaires à forte teneur en

matières grasses, une couche supérieure

contenant des débris peut se former sur

l’échantillon d’ADN. Éviter la couche supérieure et

le fond du culot en prélevant l’échantillon destiné à

la PCR dans la partie centrale transparente.


L’inhibition de la PCR est indiquée par l’absence de détection de réaction IPC.

Le surnageant n’a pas été suffisamment éliminé de l’échantillon avant l’ajout du Lysis Buffer.

Diluer l’échantillon dans de l’eau selon un rapport 1:5 ou 1:10 afin de diluer les inhibiteurs de la PCR. Si la PCR est toujours inhibée, répéter la préparation des échantillons.

Le filtrat de la colonne de centrifugation est dans l’échantillon. Le filtrat contenant des matières particulaires peut inhiber la PCR.

Centrifuger l’échantillon pour séparer les particules du filtrat avant de transférer l’échantillon vers la réaction PCR.

La matrice est associée aux composants inhibiteurs de la PCR.

Dans la mesure où les matières fécales sont hétérogènes et varient selon les sources, il y a une forte probabilité de complications. Cette étape offre une solution aidant à l’élimination des composants inhibiteurs de la PCR.

Prélaver le culot bactérien avant de charger la colonne Rapid Spin :

1 – Transférer 750 µl d’échantillon dans un tube de microcentrifugation propre.

2 – Centrifuger le tube à 12 000 – 16 000 × g pendant 3 minutes.

3 – Éliminer le surnageant.

4 – Remettre en suspension le culot dans 650 µl d’eau distillée stérile.

5 – Charger l’échantillon remis en suspension dans la colonne Rapid Spin.


Chapitre 2 PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp.Résolution des problèmes 2

Le culot bactérien est séparé du tube, ce qui complique son évitement pendant l’aspiration.

Le temps d’attente était trop long avant l’aspiration du surnageant, ce qui a entraîné la dissipation du culot bactérien.

Répéter la centrifugation et éliminer le surnageant immédiatement après.

Le culot bactérien est très petit et difficile à voir.

Éliminer le surnageant soigneusement, en en laissant jusqu’à 50 µl, afin d’éviter l’aspiration du culot.



Chapitre 2 PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp.Résolution des problèmes2

3


MicroSEQ® Salmonella spp.Detection Kit


Présentation

L’utilisation du MicroSEQ® Salmonella spp. Real-Time PCR Detection Kit a été validée avec les échantillons de production primaire.


Contenu du kit Le MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit (Cat. no. 4403930) contient des réactifs pour 96 réactions. Les composants du kit et leurs conditions de conservation sont décrits dans le tableau ci-dessous. Pour plus d’informations sur le contenu du kit, se reporter à la section « Matériel fourni » de la notice qui accompagne le kit.


Remarque : Des réactifs peuvent être expédiés séparément, selon des conditions de stockage des différentes parties du kit.

Élément Couleur du bouchon Description Référence Conservation

MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit (Partie 1 sur 2)

Vert (portoir) Salmonella spp. Assay Beads, 96 tubes en barettes de 8 tubes (96 réactions/kit), douze barettes de 8 tubes

4403870 5 ± 3 °C ; garder à l’abri de la lumière et de l’humidité‡

‡ Toute exposition excessive à la lumière peut affecter le fonctionnement des sondes fluorescentes. Fermer la poche hermétiquement après chaque retrait d’une bande de 8 tubes afin de la protéger contre l’humidité.

S/O MicroAmp® Optical 8-Cap Strips, douze barettes de 8 tubes

Pathogen Detection Negative Control (Partie 2 sur 2)

Rouge Pathogen Detection Negative Control, 1 tube, 1,5 ml (Part no. 4403926)

4403927 5 ± 3 °C


Chapitre 3 MicroSEQ® Salmonella spp. Detection KitMatériel et équipement3

Matériel non inclus Le tableau suivant indique le matériel et l’équipement nécessaires pour l’utilisation du MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit (mais non inclus). Sauf indication contraire, bon nombre des éléments indiqués sont disponibles auprès des principaux fournisseurs de matériel de laboratoire (MLS, Major Laboratory Supplier).

Instruments, équipement, consommables et réactifs‡

‡ L’utilisation du matériel indiqué ici avec ce kit a été validée. Les résultats peuvent varier en cas d’utilisation de produits de substitution d’autres fournisseurs.

Élément Source

Instruments

Applied Biosystems® 7500 Fast Real-Time PCR System

Contacter le représentant local de Life Technologies.

StepOne™ Real-Time PCR System

StepOnePlus™ Real-Time PCR System

Équipement

Microcentrifugeuse de laboratoire Eppendorf 5415D ou équivalent

Bloc chauffant MLS

Seau à glace MLS

Centrifugeuse de plaque Eppendorf 5804 ou équivalent

Vortex MLS

7500 Fast Precision Plate Holder for MicroAmp® Tube Strips (à utiliser avec le 7500 Fast Real-Time PCR System§)

§ Inclus dans le kit de démarrage.


MicroAmp® Fast 48-Well Tray (à utiliser avec le StepOne™ Real-Time PCR System)


MicroAmp® 96-Well Tray for Veriflex™ Blocks (à utiliser avec le StepOnePlus™ Real-Time PCR System)


MicroAmp® 96-Well Base Life Technologies Cat. no. N8010531

Multipipettes :• À piston• À air comprimé• Multicanal

MLS

Consommables

Embouts de pipette résistant aux aérosols MLS

Gants jetables MLS

MicroAmp® Multi-removal Tool Life Technologies Cat. no. 4313950

MicroAmp® Fast 8-Tube Strip, 0,1 ml Life Technologies Cat. no. 4358293

MicroAmp® Optical 8-Cap Strip, 300 bandes Life Technologies Cat. no. 4323032

Réactifs

Eau filtrée stérile sans DNase MLS


Chapitre 3 MicroSEQ® Salmonella spp. Detection KitPréparation de la PCR 3

Préparation de la PCR

Pour préparer la PCR, il convient de créer un fichier d’exécution et de préparer les billes lyophylisées et les échantillons. La procédure exacte à suivre varie selon l’utilisation ou non de RapidFinder™ Express Software. Life Technologies recommande l’utilisation du 7500 Fast Real-Time PCR System avec le RapidFinder™ Express Software ; voir « StepOne™ et StepOnePlus™ Systems », page 39 pour plus d’informations sur l’exécution de réactions à l’aide d’autres instruments. Ce protocole décrit la procédure qui n’utilise pas RapidFinder™ Express Software. Nous recommandons l’utilisation de RapidFinder Express Software pour suivre les instructions pas à pas en ligne de configuration des dosages, suivie de l’analyse automatique des données.

IMPORTANT ! En cas d’utilisation de RapidFinder™ Express Software, se reporter aux instructions décrites aux sections « Création ou modification du fichier d’exécution » et « Pipetage des échantillons » de RapidFinder™ Express Software Online Help.

Préparation de la PCR

Création d’un fichier d’exécution

1. Dans Sequence Detection System Software, créer un fichier d’exécution : Dans la liste déroulante Assay, sélectionner Absolute Quantification (Standard Curve). Pour plus d’informations sur la création d’un fichier d’exécution, consulter la documentation qui accompagne l’instrument.

2. Alors que Quencher Dye est réglé sur (none) ou (Non Fluorescent), créer ou sélectionner les fluorochromes FAM™ et VIC®.

3. Associer les fluorochromes FAM™ et VIC® à chaque réaction.

Remarque : Le colorant FAM est utilisé pour détecter la cible ; le colorant VIC sert à détecter le contrôle positif interne (IPC).

4. Définir les conditions de cyclage thermique comme indiqué dans le tableau ci-dessous. Pour plus d’informations, se reporter au 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System Absolute Quantitation Using Standard Curve Getting Started Guide (Pub. no. 4347825) ou au StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Presence/Absence Experiments Getting Started Guide (Pub. no. 4376787).

Pour les instruments 7500 Fast

Étape Activation des enzymes PCR

SUSPENSION Cycle (40 cycles)

Dénaturation Hybridation/extension

Temp. 95 °C 95 °C 60 °C

Durée 2 min 3 s 30 s


Chapitre 3 MicroSEQ® Salmonella spp. Detection KitPréparation de la PCR3

5. Régler le Sample Volume sur 30 µl.

6. Sélectionner le mode d’exécution approprié pour le système en fonction du tableau suivant :

Figure 1 Onglet Instrument de 7500 Fast System SDS Software avec le mode d’exécution réglé sur Fast 7500.

Pour les instruments StepOne™ et StepOnePlus™

(non inclus dans les études de validation AOAC ou AFNOR)

Étape Activation des enzymes PCR

SUSPENSION Cycle (40 cycles)

Dénaturation Hybridation/extension

Temp. 95 °C 95 °C 60 °C

Durée 2 min 1 s 20 s

Système Mode d’exécution

7500 Fast‡

‡ La figure 1 illustre un exemple de l’onglet Instrument dans 7500 Fast System SDS Software.

Fast 7500

StepOne Fast

StepOnePlus Fast


Chapitre 3 MicroSEQ® Salmonella spp. Detection KitPréparation de la PCR 3

Préparation des billes lyophylisées

AVERTISSEMENT ! DANGER CHIMIQUE. MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit (Partie 1 sur 2).

ATTENTION ! DANGER CHIMIQUE. Pathogen Detection Negative Control (Partie 2 sur 2).

1. Ouvrir la poche de stockage contenant les billes de dosage (découper au niveau de l’entaille dans l’angle supérieur de la poche de stockage, au-dessus de la bande de fermeture à glissière).

IMPORTANT ! Ne pas retirer le déshydratant de la poche de stockage.

2. Retirer le nombre approprié de tubes individuels ou de barrettes de 8 tubes (un tube pour chaque réaction qui devrait être exécutée).

3. Placer les tubes sur de la glace ou dans un bloc froid.

4. Refermer la poche de stockage à l’aide de la bande de fermeture à glissière, puis la conserver à 5 ± 3 °C.

Préparation des échantillons et des contrôles

1. Placer les échantillons et les contrôles sur de la glace ou dans un bloc froid. Décongeler complètement.

IMPORTANT ! Les réactifs doivent être décongelés sur de la glace ou dans un bloc froid.

2. Éliminer la condensation après la décongélation des échantillons et avant leur ouverture afin d’éviter toute contamination croisée.

a. Pour les échantillons PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit, centrifuger la plaque à 1 000 – 2 000 × g pendant 90 ± 30 secondes.

b. Pour les échantillons PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit, microcentrifuger les tubes à 12 000 à 16 000 × g pendant 90 ± 30 secondes afin de réduire toutes les matières particulaires dérivées de la colonne de centrifugation, qui peuvent interférer avec l’amplification. L’ADN microbien est en phase aqueuse.

c. Pour le Pathogen Detection Negative Control et les contrôles positifs contenus dans les tubes de microcentrifugation, agiter les tubes au vortex, puis réduire la vitesse de centrifugation.

Remarque : Les échantillons à analyser et les échantillons de contrôle positif sont à la charge de l’utilisateur. Le kit inclut un contrôle négatif (Pathogen Detection Negative Control).


Chapitre 3 MicroSEQ® Salmonella spp. Detection KitPréparation de la PCR3

3. Ajouter 30 µl de l’échantillon préparé ci-dessus à chaque bille lyophylisée. Commencer par distribuer tous les échantillons inconnus et poursuivre avec les contrôles négatifs, puis les contrôles positifs. Les billes se dissolvent en 1 à 5 secondes. Mélanger en aspirant et en distribuant délicatement plusieurs fois. (Il est également possible d’agiter les tubes de dosage au vortex après les avoir bouchés à la fin de la dernière étape.)

IMPORTANT ! Utiliser un nouvel embout de pipette pour chaque échantillon. Remettre en suspension le contenu en le pipetant et le rejetant délicatement plusieurs fois, en maintenant l’embout de la pipette au fond du tube afin de réduire la formation d’aérosol et le risque de contaminations croisées. Si un vortex est disponible, mélanger les tubes bouchés au vortex jusqu’à la dissolution du culot.

Remarque : Ajouter 30 µl de l’échantillon PrepSEQ® Rapid Spin Kit ou 30 µl de l’échantillon PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit à chaque bille de dosage. Le PrepSEQ® Rapid Spin Kit fournit 300 µl d’échantillon, tandis que le PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit fournit ~100 µl d’échantillon. Utiliser 30 µl du Pathogen Detection Negative Control par réaction de contrôle négatif. Si d’autres méthodes de préparation d’échantillons sont utilisées et moins de 30 µl d’échantillon sont disponibles, ajouter de l’eau au volume de l’échantillon jusqu’à parvenir à 30 µl pour chaque type de réaction.

IMPORTANT ! Boucher les tubes, en fermant chacun d’eux avec les barrettes de capuchons optiques transparents fournis dans le kit. Ne pas utiliser les tubes ou les bouchons de couleur pour les réactions du kit. Les tubes ou les bouchons de couleur peuvent affecter les mesures des signaux des colorants pendant la PCR en temps réel.

Remarque : Les billes de dosage contiennent tous les composants nécessaires pour chaque réaction.

Préparation des tubes pour le 7500 Fast System, le StepOne™ System et le StepOnePlus™ System

Les barrettes de 8 tubes (contenant les billes de dosage) fournies sont compatibles avec le 7500 Fast System, le StepOne™ System et le StepOnePlus™ System. Pour plus d’informations sur l’utilisation du StepOne™ System et du système StepOnePlus™ System, voir Annexe A, page 39.

1. En cas d’utilisation de barettes de 8 tubes avec un maximum de sept réactions, ajouter des tubes vides supplémentaires, comme requis, de sorte que chaque barrette contienne un ensemble complet de 8 tubes.

Remarque : Les barrettes de 8 tubes distribuent de manière uniforme la charge de serrage appliquée aux barrettes de tubes d’échantillon pendant le traitement, réduisant ainsi le risque de renversement des tubes. Ajouter des tubes vides, si nécessaire, pour compléter une barrette de 8 tubes dans une colonne (voir la figure présentée à la page suivante).

2. Boucher les tubes, en fermant chacun d’eux les capuchons de barrettes optiques transparents fournis dans le kit. Boucher les tubes avec les capuchons de barrette utilisant la MicroAmp® 96-Well Base (Cat. no. N8010531) et le MicroAmp® Cap Installing Tool (Handle, Cat. no. 4330015) pour éviter tout renversement, flexion ou erreur d’alignement des tubes. Vérifier que les barrettes sont bien droites et que chaque tube est aligné sur le tube adjacent.


Chapitre 3 MicroSEQ® Salmonella spp. Detection KitExécution des réactions 3

3. S’assurer que les réactions sont bien mélangées.

IMPORTANT ! L’homogénéisation peut s’effectuer en pipetant le mélange et en le rejetant délicatement plusieurs fois. Maintenir l’embout de la pipette au fond du tube afin de réduire la formation d’aérosol et le risque de contaminations croisées ou, si un vortex est disponible, mélanger le contenu des tubes de dosage.

4. S’assurer que les réactifs se trouvent au fond des tubes. Le cas échéant, ralentir la centrifugation du contenu des tubes à 2 000 × g pendant 20 secondes à l’aide d’une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de plaque.Passer à l’« Exécution des réactions », page 35.

Exécution des réactions

Le traitement de tubes ou d’une plaque implique l’utilisation d’un Applied Biosystems Sequence Detection System (SDS) ou d’un Real-Time PCR System pour l’analyse des échantillons. La procédure exacte à suivre varie selon l’utilisation ou non de RapidFinder™ Express Software. Ce protocole décrit la procédure qui n’utilise pas RapidFinder Express Software. Nous recommandons l’utilisation de RapidFinder Express Software pour suivre les instructions pas à pas en ligne de configuration des dosages, suivie de l’analyse automatique des données.

IMPORTANT ! En cas d’utilisation de RapidFinder™ Express Software, se reporter aux instructions décrites à la section « Start Instrument Run » de RapidFinder™ Express Software Online Help RapidFinder™ Express Software Online Help.

Avant de commencer

S’assurer que l’instrument est correctement installé et étalonné. Pour plus d’informations sur l’étalonnage, consulter la documentation qui accompagne l’instrument.

Exécution des réactions de 8 tubes sur le 7500 Fast System (uniquement) sans RapidFinder™ Express Software

Pour les barrettes de 8 tubes sur le 7500 Fast System :

Il est recommandé d’utiliser le 7500 Fast Precision Plate Holder for MicroAmp® Tube Strips (Cat. no. 4403809).

En cas d’utilisation des barrettes de 8 tubes MicroAmp, si la colonne 1 (extrémité gauche) et la colonne 12 (extrémité droite) ne sont pas utilisées, insérer dans ces colonnes deux barrettes de 8 tubes vides complètement bouchées.

Remarque : Les barrettes de 8 tubes bouchées vides distribuent de manière uniforme la charge de serrage appliquée aux barrettes de tubes d’échantillon pendant le traitement, réduisant ainsi le risque de renversement des tubes.


Chapitre 3 MicroSEQ® Salmonella spp. Detection KitAffichage des résultats3

1. Insérer délicatement deux barrettes de 8 tubes contenant des échantillons ou plus, en allant du centre de support de plaques vers la périphérie. Cette configuration réduit les risques de flexion ou d’erreur d’alignement des barrettes de tubes.

Remarque : Deux à douze barrettes de 8 tubes au maximum peuvent être traitées simultanément. Si les échantillons se trouvent dans un nombre impair de tubes d’échantillon, une barrettes de 8 tubes vides bouchés devra être ajoutée pour équilibrer la charge.

IMPORTANT ! Toujours utiliser un total de 8 tubes par colonne. Il peut s’avérer nécessaire d’ajouter de nouveaux tubes vides dans une colonne.

2. Ouvrir le fichier d’exécution correspondant à la plaque de réaction créée à la section « Création d’un fichier d’exécution », page 31.

3. Démarrer l’exécution.

IMPORTANT ! Pour éviter les faux positifs en raison de l’amplification de matières dans votre zone de travail, ne pas ouvrir les tubes après l’amplification.

Affichage des résultats

Présentation Le mode d’affichage des résultats varie selon l’instrument utilisé. Se reporter au manuel d’utilisation de l’instrument de PCR en temps réel ou au RapidFinder™ Express Software Online Help pour savoir comment analyser les données et afficher les résultats.

IMPORTANT ! En cas d’utilisation de RapidFinder™ Express Software, se reporter aux instructions décrites à la section « Viewing Results » de RapidFinder™ Express Software Online Help.

Procédure générale sans RapidFinder™ Express Software

La procédure générale d’affichage des résultats à partir de MicroSEQ® Pathogen Detection Kits implique :

• l’affichage des tracés d’amplification de toutes les réactions ;• la définition des valeurs de base et de seuil ;


Chapitre 3 MicroSEQ® Salmonella spp. Detection KitAffichage des résultats 3

• la vérification du signal des colorants FAM™ (spécifique à la cible) et VIC® (PIC) de chaque échantillon. Le tableau suivant sert de référence de base pour l’interprétation des résultats :

Ressources d’affichage des résultats

Pour plus d’informations sur l’analyse des données, consulter :

• le guide de l’utilisateur de l’instrument approprié ;• RapidFinder™ Express Software Online Help.

Il n’est pas recommandé d’utiliser une méthode de la même principe pour analyser les échantillons et confirmer les résultats. En cas d’utilisation de MicroSEQ® Pathogen Detection System pour analyser les échantillons, il est recommandé d’avoir recours aux méthodes de culture et biochimiques pour confirmer les résultats. Se reporter à l’échantillon EPT enrichi (« Enrichissement secondaire », page 16 et respecter la norme ISO 6579:2002 (E), et le protocole de confirmation (voir « Références », page 47).

Confirmation des résultats

Dans le cadre de la certification NF Validation, tous les échantillons identifiés comme positifs par la méthode MicroSEQ® Salmonella spp. doivent être confirmés, à partir du bouillon d’enrichissement ETP, en effectuant l’un des tests suivants :

• Par la mise en oeuvre des tests classiques décrits dans les méthodes normalisées par le CEN, l’ISO ou la NF U47-100 à partir de colonies (en incluant l'étape de purification). Pour effectuer la confirmation, il faut repartir du bouillon d’enrichissement ETP.

• En effectuant un deuxième enrichissement dans le bouillon Rappaport-Vassiliadis Soya Peptone (RVS) à partir de l’enrichissement primaire (0,1 ml d’ETP dans 10 ml de bouillon RVS) : incuber à 41,5 ± 1 °C pendant 24 ± 3 h et isoler sur de la gélose de xylose-lactose désoxycholate (XLD) ou toute autre gélose sélective. Effectuer ensuite un test latex sur les colonies caractéristiques observées ou effectuer une galerie biochimique sur les colonies purifiées caractéristiques de Salmonella.

• Utilisation de toute autre méthode certifiée par « NF Validation » de principe différent de la méthode MicroSEQ® Salmonella spp. Le protocole validé de la seconde méthode devra être respecté dans son ensemble, c’est à dire que toutes les étapes antérieures à l’étape intermédiaire de laquelle on repart pour la confirmation doivent être communes aux deux méthodes.

En cas de résultats discordants (positifs avec la méthode alternative, non confirmés par un des moyens décrits précédemment), le laboratoire devra mettre en œuvre les moyens suffisants pour s’assurer de la validité du résultat rendu.

Signal du colorant FAM™ (cible)

Signal du colorant VIC® (IPC)

Résultat

+ +, – Positif

– + Négatif

– – Voir « Résolution des problèmes », page 38


Chapitre 3 MicroSEQ® Salmonella spp. Detection KitRésolution des problèmes3


Observation Cause possible Action

Aucun signal (IPC ou spécifique à la cible) n’est détecté dans les puits inconnus.

Une inhibition de la PCR s’est produite. Diluer l’échantillon dans de l’eau selon un rapport 1:5 ou 1:10 afin de diluer les inhibiteurs de la PCR et répéter l’analyse. Si la PCR est toujours inhibée, répéter la préparation des échantillons.

Pour plus d’informations, se reporter à la section « Résolution des problèmes » de PrepSEQ® Nucleic Acid Extraction Kit Protocol en page 19 et PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit Protocol en page 26.

Aucun signal spécifique à la cible n’est détecté dans les puits de contrôle positif.

Une erreur de pipetage s’est produite (aucun contrôle positif n’a été ajouté).

Répéter l’analyse. Veiller à pipeter le contrôle positif dans tous les puits de contrôle positif.

Aucun signal IPC n’est détecté mais un signal spécifique à la cible est détecté.

Un nombre de copies élevé de l’ADN cible existe dans les échantillons, ce qui entraîne une amplification préférentielle de l’ADN spécifique à la cible.

Aucune action n’est requise.

Un signal spécifique à la cible est détecté dans les puits de contrôle négatif.

Une contamination croisée s’est produite. Répéter l’analyse avec des aliquots frais de tous les réactifs et nettoyer le matériel de pipetage.

Si le contrôle négatif présente toujours une contamination, répéter l’analyse avec un nouveau kit.

Si le contrôle négatif présente toujours une contamination, contacter le service d’assistance technique d’Applied Biosystems.

Dans les puits de contrôle négatif, un signal spécifique à la cible est détecté, mais aucun signal IPC n’est détecté.

Une contamination croisée et un des événements suivants se sont produits :• Un nombre de copies élevé de l’ADN cible

existe dans les échantillons, ce qui entraîne une amplification préférentielle de l’ADN spécifique à la cible.

• Un problème est survenu lors de l’amplification IPC.

Examiner les échantillons inconnus pour déterminer la présence d’un signal IPC. Si un signal IPC est bien présent dans les échantillons inconnus, l’amplification IPC ne pose pas problème.

Répéter l’analyse avec des aliquots frais de tous les réactifs et nettoyer le matériel de pipetage.

Aucun signal IPC n’est détecté, mais un signal spécifique à la cible est détecté dans les puits de contrôle positif.

Un nombre de copies élevé de l’ADN cible existe dans les échantillons, ce qui entraîne une amplification préférentielle de l’ADN spécifique à la cible.

Aucune action n’est requise.

A


StepOne™ et StepOnePlus™ Systems

Exécution des réactions de 8 tubes sur le StepOne™ System

1. Placer le MicroAmp® Fast 48-Well Tray (Cat. no. 4375282) sur le bloc chauffant du StepOne™ System.

2. Charger les barrettes de 8 tubes horizontalement. Par exemple, dans la rangée C, charger une barrette de 8 tubes dans les colonnes 1 à 8. Il est recommandé de charger au moins une barrette de 8 tubes. Il n’est nécessaire d’équilibrer les barrettes de tubes sur le plateau.





Annexe A StepOne™ et StepOnePlus™ SystemsExécution des réactions de 8 tubes sur le StepOnePlus™ SystemA

Exécution des réactions de 8 tubes sur le StepOnePlus™ System

1. Placer le MicroAmp® 96-Well Tray for Veriflex™ Blocks (Cat. no. 4379983) sur le bloc chauffant du StepOnePlus™ System.

2. Charger les barrettes de 8 tubes verticalement. Par exemple, charger les barrettes de 8 tubes dans les rangées A à H des colonnes 1 et 2. La charge minimale recommandée est de deux barrettes de 8 tubes (16 tubes), qui doivent être placées dans des colonnes adjacentes, par exemple dans les colonnes 1 et 2. Il n’est nécessaire d’équilibrer les barrettes de tubes sur le plateau.




B


Bonnes pratiques en matière de PCR

Prévention des contaminations et des amplifications non spécifiques

Présentation Les tests PCR exigent la mise en œuvre de pratiques de laboratoire spéciales afin d’éviter les amplifications de faux positifs. Le débit élevé et la répétition de ces dosages peuvent entraîner l’amplification d’une seule molécule d’ADN.

Bonnes pratiques de laboratoire en matière de PCR

Lors de la préparation d’échantillons pour l’amplification PCR :

• Utiliser des zones de travail séparées, du matériel dédié et des consommables réservés pour :

– Préparation des échantillons– Configuration de la PCR– Amplification PCR– Analyse des produits PCR

Remarque : Les salles peuvent être simulées à l’aide d’une table de PCR ou d’une paillasse propre disponible auprès des principaux fournisseurs de matériel de laboratoire.

• Porter des gants et une blouse de laboratoire propres (qui n’ont pas été portés précédemment lors de la manipulation de produits PCR amplifiés ou pendant la préparation d’autres échantillons).

• Changer systématiquement de gants en cas de doutes quant à leur contamination possible et avant de quitter la zone de travail.

• Ne jamais introduire de produits amplifiés PCR dans la zone de configuration de la PCR.

• Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon et plaques de réaction avec soin. Ne pas éclabousser ou vaporiser les échantillons PCR.

• Maintenir les composants et les réactifs bouchés dans la mesure du possible.• Utiliser des embouts de pipette à piston ou résistant aux aérosols.• Après utilisation, nettoyer régulièrement les paillasses et l’équipement du

laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 %, puis les rincer avec de l’éthanol à 70 % pour éliminer l’eau de Javel résiduelle.

IMPORTANT ! Pour éviter les faux positifs dus à des contaminations croisées :· Préparer et fermer tous les tubes d’échantillons de contrôle négatif et inconnus

avant de procéder au pipetage du contrôle positif.· Ne pas ouvrir les tubes après l’amplification.· Utiliser différents ensembles de multipipettes lors du pipetage des échantillons de

contrôle négatif et positif et inconnus.


Annexe B Bonnes pratiques en matière de PCRPrévention des contaminations et des amplifications non spécifiquesB

Configuration de plaques suggérées

• Laisser une rangée libre entre les différentes cibles si l’espace le permet.• Placer au moins un puits entre des échantillons inconnus et des échantillons de

contrôle, si possible. • Placer au moins un puits entre les contrôles négatifs et les contrôles positifs,

si possible.• Placer les réplicats d’un échantillon pour la même cible l’un à côté de l’autre.• Commencer par les échantillons inconnus et placer les contrôles à la fin de la rangée

ou de la colonne.• Placer les contrôles positifs dans l’une des rangées ou colonnes extérieures,

si possible.• Tenir compte du fait que les capuchons se présentent par barrettes de 8 ou 12.

C


Sécurité

AVERTISSEMENT ! SÉCURITÉ GÉNÉRALE. Toute utilisation de ce produit non conforme aux indications fournies dans le guide de l’utilisateur peut provoquer des blessures corporelles ou endommager l’instrument ou le dispositif. S’assurer que toute personne utilisant ce produit a pris connaissance des consignes de sécurité générale en vigueur dans les laboratoires ainsi que des informations de sécurité décrites dans le présent document.· Avant d’utiliser un instrument ou un dispositif, lire les informations de

sécurité décrites dans le guide de l’utilisateur fourni par le fabricant de l’instrument ou du dispositif en question, et veiller à bien les comprendre.

· Avant de manipuler des produits chimiques, lire toutes les fiches de données de sécurité (FDS) qui s’appliquent, et s’assurer de bien le comprendre, et porter les équipements de protection appropriés (gants, blouses, lunettes de protection, etc.). Pour obtenir les FDS, se reporter à la section « Documentation et support » du présent document.


Annexe C SécuritéSécurité chimiqueC

Sécurité chimique

AVERTISSEMENT ! PRÉCAUTIONS GÉNÉRALES EN CAS DE MANIPULATION DE PRODUITS CHIMIQUES. Pour minimiser les risques, veiller à ce que le personnel du laboratoire lise attentivement et mette en œuvre les consignes de sécurité générales relatives à l’utilisation et au stockage des produits chimiques et à la gestion des déchets qui en découlent, décrites ci-dessous. Consulter également la FDS appropriée pour connaître les précautions et instructions particulières à respecter :· Lire et comprendre les fiches de données de sécurité (FDS) fournies par le

fabricant avant de stocker, manipuler ou utiliser les matériaux dangereux ou les produits chimiques. Pour obtenir les FDS, se reporter à la section « Documentation et support » du présent document.

· Limiter les contacts avec les produits chimiques. Porter des équipements de protection appropriés lors de la manipulation des produits chimiques (par exemple : lunettes de sûreté, gants ou vêtements de protection).

· Limiter l’inhalation des produits chimiques. Ne pas laisser les récipients de produits chimiques ouverts. Ils ne doivent être utilisés qu’avec une ventilation adéquate (par exemple, sorbonne).

· Vérifier régulièrement l’absence de fuite ou d’écoulement des produits chimiques. En cas de fuite ou d’écoulement d’un produit, respecter les directives de nettoyage du fabricant recommandées sur la fiche de données de sécurité.

· Manipuler les déchets chimiques dans une sorbonne.· Veiller à utiliser des récipients à déchets primaire et secondaire. (Le récipient

primaire contient les déchets immédiats, le récipient secondaire contient les fuites et les écoulements du récipient primaire. Les deux récipients doivent être compatibles avec les matériaux mis au rebut et conformes aux exigences locales, nationales et communautaires en matière de confinement des récipients.)

· Une fois le récipient à déchets vidé, il doit être refermé hermétiquement avec le couvercle fourni.

· Caractériser (par une analyse si nécessaire) les déchets générés par les applications, les réactifs et les substrats particuliers utilisés dans le laboratoire.

· Vérifier que les déchets sont convenablement stockés, transférés, transportés et éliminés en respectant toutes les réglementations locales, nationales et/ou communautaires en vigueur.

· IMPORTANT ! Les matériaux représentant un danger biologique ou radioactif exigent parfois une manipulation spéciale, et des limitations peuvent s’appliquer à leur élimination.

Manipulation spécifique des produits chimiques

AVERTISSEMENT ! DANGER CHIMIQUE. MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit (Partie 1 sur 2). Nocif en cas d’ingestion ou d’inhalation. Risque de provoquer l’irritation des yeux, de la peau et de l’appareil respiratoire. Ne pas goûter ou ingérer. Éviter de respirer la vapeur. Lire la FDS applicable et suivre les consignes de manipulation. Utiliser avec une ventilation adéquate. Éviter tout contact avec les yeux, la bouche et la peau. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.


Annexe C SécuritéSécurité en matière de dangers biologiques C

Sécurité en matière de dangers biologiques

AVERTISSEMENT ! RISQUE BIOLOGIQUE. Les échantillons biologiques tels que les tissus, les fluides corporels, les agents infectieux et le sang humain ou animal présentent un risque de transmission de maladies infectieuses. Suivre toutes les réglementations locales, nationales et/ou communautaires en vigueur. Porter les équipements de protection appropriés, notamment des lunettes de protection, un masque facial, des vêtements/blouses de laboratoire et des gants. Toutes les tâches doivent être réalisées dans des installations équipées de manière adéquate en utilisant les équipements de sécurité appropriés (par exemple, des dispositifs de confinement physique). Avant toute manipulation de matières potentiellement infectieuses, il convient de former les opérateurs conformément aux réglementations en vigueur et aux besoins de l’entreprise/institution. Lire et respecter les consignes applicables et/ou les exigences réglementaires issues des ressources suivantes : Aux États-Unis :· Instructions du Ministère de la Santé et des Services sociaux des États-Unis,

publiées dans le document Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Biosécurité dans les laboratoires microbiologiques et biomédicaux), disponible à l’adresse : www.cdc.gov/biosafety

· Occupational Safety and Health Standards, Bloodborne Pathogens (Normes sur la santé et la sécurité au travail, Pathogènes transmissibles par le sang) (29 CFR§1910.1030), disponible à l’adresse : www.access.gpo.gov/nara/cfr/waisidx_01/29cfr1910a_01.html

· Protocoles du programme de biosécurité de l’entreprise/institution pour la manipulation et l’utilisation des matières potentiellement infectieuses.

· Des informations complémentaires relatives aux consignes de sécurité sur les risques biologiques sont disponibles à l’adresse : www.cdc.gov

Dans l’Union européenne :Consulter les réglementations et la législation locales relatives à la prévention des risques biologiques et à la sécurité biologique, ainsi que les meilleures pratiques publiées dans le document Laboratory Biosafety Manual (Manuel de sécurité biologique en laboratoire) (troisième édition) de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS), disponible à l’adresse : www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/WHO_CDS_CSR_LYO_2004_11/en/

CAS Produit chimique Consigne

26628-22-8 Azoture de Sodium‡

‡ Présent dans la formule du Pathogen Detection Negative Control.

L’azoture de sodium peut réagir avec les canalisations en plomb et en cuivre pour former desazotures métalliques hautement explosifs.

50-01-1 Chlorhydrate de guanidine

Libère des gaz toxiques en cas de contact avec des acides ou de l’eau de javel. NE PAS AJOUTER d’acides ou d’eau de javel à des déchets liquides contenant ce produit.

593-84-0 Isothiocyanate de guanidine

Libère des gaz toxiques en cas de contact avec des acides ou de l’eau de javel. NE PAS AJOUTER d’acides ou d’eau de javel à des déchets liquides contenant ce produit.

http://www.cdc.gov/biosafety

http://www.access.gpo.gov/nara/cfr/waisidx_01/29cfr1910a_01.html

http://www.access.gpo.gov/nara/cfr/waisidx_01/29cfr1910a_01.html

http://www.cdc.gov

http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/WHO_CDS_CSR_LYO_2004_11/en/





Annexe C SécuritéSécurité en matière de dangers biologiquesC


Références

Association of Analytical Communities (AOAC). http://www.aoac.org. 2010. Accessed November 2010.

Association Française pour la Normalisation (AFNOR). http://www.afnor-validation.com. 2010. Accessed November 2010.

ISO 6579:2002 (E). Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of Salmonella spp.

ISO 6887, parts 1 through 4. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination.

ISO 7218:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs – General requirements and guidance for microbiological examinations.

ISO 16140:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative methods.

NF EN ISO 6579:2002/Amd 1:2007: Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for the detection of Salmonella spp. Detection of Salmonella spp. in animal faeces and in environmental samples from the primary production stage.

NF U47-100: French norm on isolation and identification of Salmonella spp. in the environment and samples from animal productions: « Recherche par l’isolement et l’identification de tout sérovar ou de sérovar(s) spécifié(s) de salmonelles dans l’environnement des productions animales » (Detection by streaking of any Salmonella serotypes in primary production samples).

http://www.aoac.org

http://www.afnor-validation.com


Références


Documentation et support

Obtention d’une FDS

Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse www.lifetechnologies.com/support.

Remarque : Pour obtenir les FDS des produits chimiques non distribués par Life Technologies, contacter le fabricant concerné.

Obtention de certificats d’analyse

Le certificat d’analyse indique les informations détaillées relatives aux contrôles qualité et aux données de qualification de chaque produit. Les certificats d’analyse sont disponibles sur notre site Web. Aller à l’adresse www.lifetechnologies.com/support et rechercher le certificat d’analyse en fonction du numéro de lot de produit, qui est imprimé sur l’emballage.

Obtention d’assistance

Pour obtenir les informations les plus récentes sur les services et le support technique dans tous les pays, aller à l’adresse :

www.lifetechnologies.com/support ou www.lifetechnologies.com/foodsafety

Notre site Web permet d’effectuer les actions suivantes :

• Obtenir les numéros de téléphone et de télécopie du support technique et des sites commerciaux partout dans le monde

• Rechercher un sujet dans le forum aux questions (FAQ)• Poser une question directement au support technique• Rechercher des documents utilisateur, des FDS, des séquences et des cartes

vectorielles, des notes d’application, des formules, des manuels, des certificats d’analyse, des citations et d’autres documents de support sur les produits

• Obtenir des informations sur les formations proposées à nos clients• Télécharger des mises à jour et correctifs de logiciels

http://www.lifetechnologies.com/support







http://www.lifetechnologies.com/foodsafety


Documentation et support Support relatif à la sécurité alimentaire

Support relatif à la sécurité alimentaire

Site Web : www.lifetechnologies.com/foodsafety

E-mail du support : [email protected]

Téléphone (En Amérique du Nord) : 1-800-500-6885

Téléphone (Dans le reste du monde) : Accéder à www.lifetechnologies.com/contactus.html et sélectionner le pays approprié dans le menu déroulant.

Garantie limitée

Life Technologies Corporation et/ou ses filiales garantissent leurs produits comme décrit dans les Termes et conditions de vente généraux de Life Technologies, disponibles sur le site Web de Life Technologies à l’adresse www.lifetechnologies.com/termsandconditions. Pour toute question, contacter Life Technologies à l’adresse www.lifetechnologies.com/support.


http://www.lifetechnologies.com/foodsafety

mailto:[email protected]



http://www.lifetechnologies.com/contactus

http://www.lifetechnologies.com/contactus

goto:www.lifetechnologies.com/termsandconditions

http://www.lifetechnologies.com/termsandconditions



Headquarters5791 Van Allen Way | Carlsbad, CA 92008 USA | Phone +1 760 603 7200 | Toll Free in USA 800 955 6288For support visit lifetechnologies.com/support or email [email protected]

lifetechnologies.com

3 June 2013


http://www.lifetechnologies.com

mailto: [email protected]

Documents

Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in …tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/4484068.pdfReal-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples Catalog