Rapport de validation

VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION

Analysemethode Méthode d’analyse

Diagnostic de Ralstonia solanacearum et Clavibacter michiganensis sepedonicus sur tubercule de pomme de terre et boutures de Pélargonium

LAB 21 I-MET-PHY-081-082-v04 et les instructions associées (LAB_21_I-MET-PHY-081-082-Extr-v04, LAB_21_I-MET-PHY-081-082-Isol-v04, LAB_21_I-MET-PHY-081-082-PCR-v03, LAB_21_I-MET-PHY-081-082-IF-v03).

Techniek Technique

Extraction, PCR, isolement, immunofluorescence

Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices

Tubercules de pomme de terre Boutures de Pélargonium

Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaptation

19/08/2013

• Résumé des critères de performance :

Sensibilité : 5.103 CFU/ml en extrait concentré. Spécificité : Clavibacter m. sepedonicus et R. solanacearum sont distinguées l’une

de l’autre. Répétabilité et Reproductibilité : même performance obtenue par au moins 2

analystes différents à des moments différents.

• La validation répond aux exigences de la procédure LAB 00 P180

• Le laboratoire qui veut appliquer cette méthode doit démontrer que les critères ci-dessous

sont respectés pour les combinaisons matrices/paramètres :

Sensibilité : comme spécifié dans le Journal officiel de l’Union européenne L 206/36 : Directive 2006/63/CE de la Commission du 14 juillet 2006 modifiant les annexes II à VII de la directive 98/57/CE du Conseil concernant la lutte contre Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. et le Journal officiel de l’Union européenne L 182/1-43 : Directive 2006/56/CE de la Commission du 12 juin 2006 modifiant les annexes de la directive 93/85/CEE du Conseil concernant la lutte contre le flétrissement bactérien de la pomme de terre.

Participation à un test interlaboratoire incluant les 2 bactéries et obtention de résultats corrects.

• Historique de validation:

LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-20 1/2

Edition Révision par/date Motif de la révision Modifications 1 S. Léonard / 10 - 2013 Adaptation au nouveau

template de la procédure de validation.

Adaptation au nouveau template de la procédure de validation.


FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAGx SECTIE - SECTION: Phytopathologie

VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d’analyse

Diagnostic de Ralstonia solanacearum et Clavibacter michiganensis sepedonicus sur tubercule de pomme de terre et boutures de Pélargonium LAB 21 I-MET-PHY-081-082-v04 et les instructions associées (LAB_21_I-MET-PHY-081-082-Extr-v04, LAB_21_I-MET-PHY-081-082-Isol-v04, LAB_21_I-MET-PHY-081-082-PCR-v03, LAB_21_I-MET-PHY-081-082-IF-v03).

Techniek Technique

Extraction, PCR, isolement, immunofluorescence

Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices

Tubercules de pomme de terre Boutures de Pélargonium

Type validatie Type de validation

Secondaire

Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction)

Léonard Sandrine, chef de section

Opgesteld door Rédaction par

Léonard Sandrine Chef de section 21/10/13

Signatures: Sé

Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction)

Remacle Vincent, Willems Stéphanie, Delcorps Viviane : techniciens Mélissa Palacios : étudiant

Periode van validatie Période de validation

Start - Début: septembre 2009 Einde - Fin: octobre 2013

Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par

Naam – Nom : Defeijt Franck Functie - Fonction: Responsable LFSAGx Datum - Date: 19/08/2013

Handtekeningen - Signatures: Sé

Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P 00 180.



• But et domaines d’application : détecter R. solanacearum et C. m. sepedonicus dans un extrait d’échantillon de 200 tubercules de pommes de terre ou d’un échantillon de 25 à 100 boutures de Pélargonium (pour cette dernière matrice R. solanacearum uniquement) avec un seuil minimum de 5 103 CFU/ml. Les documents de référence décrivant les tests sont - Journal officiel de l’Union européenne L 206/36 : Directive 2006/63/CE de la Commission du 14

juillet 2006 modifiant les annexes II à VII de la directive 98/57/CE du Conseil concernant la lutte contre Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

- Bulletin OEPP 2004 34, 173-178 PM 7/21(1): Protocoles de diagnostic pour les organismes réglementés : Ralstonia solanacearum.

- Journal officiel de l’Union européenne L 182/1-43 : Directive 2006/56/CE de la Commission du 12 juin 2006 modifiant les annexes de la directive 93/85/CEE du Conseil concernant la lutte contre le flétrissement bactérien de la pomme de terre.

- Bulletin OEPP 2006 36, 99-109 PM 7/59(1): Diagnostic : Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Il s’agit d’une méthode qualitative (résultat de type « présence/absence »), de screening et partiellement de confirmation (des tests de confirmation sont inclus dans la méthode), normalisée pour certains tests et dérivée pour d’autres.

• Méthodes d’analyses : voir LAB 21 I-MET-PHY-081-082-v04, LAB_21_I-MET-PHY-081-082-Extr-v04, LAB_21_I-MET-PHY-081-082-IF-v03, LAB_21_I-MET-PHY-081-082-Isol-v04 et LAB_21_I-MET-PHY-081-082-PCR-v03.

• Moyens : Etuves, hottes à flux laminaires, réfrigérateurs, congélateurs, centrifugeuses, spectrophotomètre, bain thermostatique, thermocycleur, microscope à fluorescence et autre matériel courant de laboratoire. Souches de référence R. solanacearum LMG2299, LMG2499 et C. m. sepedonicus LMG2889 et LMG2899. Abréviations : Ralstonia = Ralstonia solanacearum ; Clavibacter = Clavibacter michiganensis sepedonicus ; nm = nanomètre ; µl = microlitre ; DO = densité optique ; CFU ou UFC = colony forming unit ; PBS = tampon phosphate buffered saline ; bp = paires de bases nucléotidiques.

• Paramètres de validation et données brutes:

Table des matières 1 CULTURE : VÉRIFICATION DE LA CORRÉLATION ENTRE DENSITÉ OPTIQUE ET CFU .............. 4

1.1 PROCÉDÉ ............................................................................................................................................... 4



1.2 TESTS RALSTONIA SOLANACEARUM ............................................................................................................. 4 1.3 TESTS CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SEPEDONICUS ...................................................................................... 6 1.4 SYNTHÈSE ET CONCLUSIONS ...................................................................................................................... 7

2 CULTURE : VÉRIFICATION CROISSANCE ET ASPECT DES BACTÉRIES SUR MILIEUX YPGA, SMSA ET MTNA ............................................................................................................................................... 9

3 CULTURE : IMPACT DE LA RÉFRIGÉRATION SUR LA VIABILITÉ DE CLAVIBACTER ................. 9

4 SÉRO-AGGLUTINATION ....................................................................................................................... 10

5 PCR .......................................................................................................................................................... 11

5.1 TESTS DE NOVEMBRE-DÉCEMBRE 2009 ..................................................................................................... 12 5.1.1 Clavibacter .................................................................................................................................. 12 5.1.2 Ralstonia ..................................................................................................................................... 13 5.1.3 Conclusion ................................................................................................................................... 15

5.2 TEST DE JUIN 2011 : COMPARAISON SENSIBILITÉ AVEC OU SANS EXTRACTION VIA KIT NUCLEOSPIN PLANT II ........ 16

6 IMMUNOFLUORESCENCE .................................................................................................................... 17

6.1 TESTS RÉALISÉS EN DÉCEMBRE 2009......................................................................................................... 17 6.2 DÉTERMINATION DU TITRE DES ANTICORPS PRIMAIRES (JUIN 2011) ............................................................... 19

7 EXTRACTION : COMPARAISON FILTRATION ET CENTRIFUGATION .......................................... 24

8 SOMME DES DIFFÉRENTS TESTS ........................................................................................................ 25

8.1 TESTS DE MAI 2010 ................................................................................................................................ 25 8.2 TESTS DE NOVEMBRE 2010 ...................................................................................................................... 26

8.2.1 Ralstonia ..................................................................................................................................... 26 8.2.2 Clavibacter .................................................................................................................................. 27

8.3 TESTS D’AVRIL 2011 .............................................................................................................................. 28

9 RING-TESTS ............................................................................................................................................ 28

9.1 TEST ILT2 EN 2010................................................................................................................................ 28 9.2 TEST PHYTOPAS EN 2012 ....................................................................................................................... 28 9.3 TEST ILC3 EN 2012 ............................................................................................................................... 29

10 MATRICE BOUTURES DE PÉLARGONIUM ..................................................................................... 29

10.1 TEST DE JUIN 2013 ................................................................................................................................ 29 10.1.1 Préparation des échantillons ......................................................................................................... 29 10.1.2 Dopage des échantillons ............................................................................................................... 30 10.1.3 Isolement sur milieu SMSA ............................................................................................................ 30 10.1.4 PCR classique .............................................................................................................................. 33 10.1.5 Conclusion ................................................................................................................................... 35

10.2 TEST D’OCTOBRE 2013 ........................................................................................................................... 35



1 Culture : vérification de la corrélation entre densité optique et CFU Donnée à vérifier : selon le Journal officiel de l’Union européenne, pour Ralstonia une DO à 600 nm de 0,15 et pour Clavibacter une DO à 600 nm de 0,20 correspondent à 108 UFC/ml. 1.1 Procédé

1) Prélèvement Suspension d’une ou plusieurs colonies, repiquées depuis 48 à 96 heures sur milieu YPGA, dans 450 µl de PBS.

2) Mesure de la DO - 200 µl de suspension dans 1800 µl de PBS dans une cuvette semi-micro (dilution 10X). - Préparation de 2000µl de PBS pour le blanc. - Mesure de la DO (600nm). - Mesure de la DO et ajustement par dilution à 0,20 pour Clavibacter et 0,15 pour Ralstonia.

3) Dilutions avant étalement

100 µl de la suspension mère dans 900µl de PBS donne une dilution 10-1. Homogénéisation, puis 1µl de la première dilution dans 9µl de PBS donne une dilution de 10-2, ainsi de suite jusqu’à une dilution de 10-7.

4) Etalement - Dépôt de 333 µl des dilutions 10-4 à 10-7 en triplicat sur milieu non sélectif YPGA. - Incubation 2 à 6 jours pours les deux bactéries, à 23°C pour Clavibacter et 28°C pour Ralstonia.

5) Comptage des colonies ∑colonies des trois boîtes d’une dilution donnée = nombre UFC/ml Facteur de dilution * 1.1

Moyenne : ∑ colonies de chaque dilution nombre de dilutions

1.2 Tests Ralstonia solanacearum Expérience du 12/10/09

Souche D.O. mesurée Dilution PBS (µl) Suspension (µl) LMG2299

0,419

0,419/0,150 = 2,79

((2,79*2000)-200)= 5380

200

LMG2294 0,246 0,246/0,150 = ((1,64*2000)- 200



1,64 200)= 3080 Dénombrement souche LMG2299 après 2 jours

-4 -5 -6 -7 1 >200 >200 63 6 2 >200 >200 84 4 3 >200 >200 219 10

Total 1,9.108 UFC 1,8.108 UFC

Moyenne : 1,9.108 UFC/ml Dénombrement souche LMG2294 après 2 jours -4 -5 -6 -7

1 >200 146 9 2 2 >200 83 10 0 3 >200 92 16 0

Total 3,2.107 UFC 2.107 UFC Moyenne : 2,5.107 UFC/ml Expérience répétée les 14/10/09 et 15/10/09

Souche D.O. mesurée Dilution PBS (ml) Suspension (µl)

LMG2299

0,373 0,373/0,150 = 2,49

((2,49*2000)-200) = 4773

200

LMG2294

0,294 0,294/0,150 = 1,96

((1,96*2000)-200) = 2740

200

Dénombrement souche LMG2299 après 5 jours

-4 -5 -6 -7 1 >200 >200 37 8 2 >200 >200 28 0 3 >200 >200 43 0

Total 9,8.107 UFC 7,2.107 UFC Moyenne : 8,5.107 UFC/ml



Dénombrement souche LMG2294 après 5 jours -4 -5 -6 -7

1 >200 145 4 1 2 >200 >200 24 0 3 >200 91 16 0

Total 4.107 UFC 9,1.106 UFC Moyenne : 2,5.107 UFC/ml 1.3 Tests Clavibacter michiganensis sepedonicus Expérience du 26/10/09


0,712 0,712/0,20 = 3,56

((3,56*2000)-200) = 6920

200

Dénombrement souche LMG2899 après 8 jours

-4 -5 -6 -7 1 >200 >200 124 16 2 >200 >200 114 21 3 >200 >200 90 11

Total 2,9.108 UFC 4,36.108 UFC Moyenne : 3,6.108 UFC/ml Expérience du 5/11/09


0,503 0,503/0,20 = 2,515

((2,515*2000)-200) = 4830

200

Souche D.O. mesurée Dilution PBS (µl) Suspension (µl)

LMG2889 0,551

0,551/0,20 = 2,755

((2,755*2000)-200) = 5310

200




1 >200 135 47 9 2 >200 >200 51 2 3 >200 >200 47 2

Total 1,3.108 UFC 1,2.108 UFC Moyenne : 1,3.108 UFC /ml Dénombrement souche LMG2889 après 7 jours -4 -5 -6 -7

1 >200 >200 170 24 2 >200 >200 80 34 3 >200 >200 60 15

Total 2,8.108 UFC 6,6.108 UFC Moyenne : 4,7.108 UFC/ml Expérience du 12/11/09


0,524 0,524/0,20 = 2,62

((2,62*2000)-200) = 5040

200


1 >200 >200 120 8 2 >200 >200 137 10 3 >200 >200 147 17

Total 3,7.108 UFC 3,2.108 UFC Moyenne : 3,5.108 UFC/ml

1.4 Synthèse et conclusions



Pour les 4 souches testées une valeur logarithmique proche de 8 est obtenue, signifiant un ordre de grandeur de 108 UFC/ml pour Ralstonia lorsque la DO à 600 nm est de 0,15 et pour Clavibacter lorsque la DO à 600 nm est de 0,20. Cela correspond bien aux valeurs indiquées par le Journal Européen. Pour le travail au labo, seront retenues les valeurs suivantes : DO600nm = 0,15 pour Ralstonia LMG 2299 : 1,4.108 UFC/ml DO600nm = 0,15 pour Ralstonia LMG 2294 : 2,5.107 UFC/ml DO600nm = 0,20 pour Clavibacter LMG 2899 : 2,5.108 UFC/ml DO600nm = 0,20 pour Clavibacter LMG 2889 : 4,1.108 UFC/ml

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

LMG 2299 LMG 2294 LMG 2899 LMG 2889

log

Souche Mesure 1

(107 UFC/ml)

Mesure 2 (107 UFC/ml)

Moyenne (107 UFC/ml)

Log 1 Log 2 Log moyen Ecart-type

log des mesures

Ecart-type par

rapport à la donnée attendue (log = 8)

LMG 2299 19 8,5 13,8 8,3 7,9 8,1 0,3 0,1

LMG 2294 2,5 2,5 2,5 7,4 7,4 7,4 0 0,4

LMG 2899 36 13 24,5 8,6 8,1 8,4 0,4 0,2

LMG 2889 47 35 41 8,7 8,5 8,6 0,1 0,4



2 Culture : vérification croissance et aspect des bactéries sur milieux YPGA, SMSA et MTNA

YPGA (milieu nutritif non sélectif) - 1ers essais en octobre 2009 avec les souches de Ralstonia LMG2299, LMG2294, et Clavibacter

LMG2899 et 2889 : l’aspect des colonies est rond, plat, lisse, couleur crème à jaunâtre, comme décrit dans la littérature.

- 2ème essais lors de la validation de la corrélation densité optique et CFU (voir point 1). La corrélation avec la DO et la durée de croissance (2 à 6 jours) sont conformes à ce qui est indiqué dans le Journal européen : l’utilisation du milieu YPGA est considérée valide.

MTNA (milieu semi-sélectif Clavibacter) -1ers essais en octobre 2009 avec les souches de référence. - 2ème essais en décembre 2009 avec les souches de référence. - Essais suivants (fin 2009 à 2010) à partir d’extraits des pomme de terre dopés avec souches de référence. Les colonies sont visibles après 6 jours à 23°C, d’aspect rond et couleur crème à jaune. Dans le cas d’extraits dopés, les colonies de Clavibacter sont dans certains tests masquées par les saprophytes et une incubation de 2 semaines peut être nécessaire. SMSA (milieu semi-sélectif Ralstonia) - 1ers essais en octobre 2009 avec les souches de référence. - 2ème essais en décembre 2009 avec les souches de référence. - Essais suivants (fin 2009 à 2013) à partir d’extraits de pommes de terre dopés avec souches de référence. Les colonies sont visibles après 3 jours à 28°C, d’aspect petit, rond, mauve. Après une semaine, la couleur vire au rouge et la texture est plus fluide et irrégulière, un halo blanc est éventuellement visible sur le pourtour des colonies.

3 Culture : impact de la réfrigération sur la viabilité de Clavibacter Janvier 2010 Pour la macération des talons, il est possible soit d’agiter à 23°C pendant 4 heures, soit de stocker un jour (16 à 24 heures) sans agitation au réfrigérateur. Le test ici vise à vérifier que la réfrigération ne remet pas en cause la viabilité de la bactérie. Le test est réalisé avec 2 souches de Clavibacter (LMG2899 et LMG2889) et 2 milieux (YPGA et MTNA). Une solution de 104 CFU/ml est préparée, et la moitié incubée au frigo, et l’autre moitié dans l’agitateur. Ensuite des dilutions sont préparées jusqu’à 10-3 et 50µl de chaque dilution étalée sur les milieux. Après 12 jours d’incubation à 23°C, les colonies sont comptées.



Souche LMG2899

Dilution Agitation 23°C 4h Réfrigération 2°C 24h MTNA YPGA MTNA YPGA

100 >200 >200 >200 >200 10-1 >200 >200 >200 >200 10-2 108 102 60 76 10-3 10 11 8 18

Total moyen (CFU/ml)

20,8.104 21,2.104 14.104 25,6.104

Souche LMG2889

Dilution Agitation 23°C 4h Réfrigération 2°C 24h MTNA YPGA MTNA YPGA

100 >200 >200 >200 >200 10-1 129 163 107 86 10-2 14 16 4 17 10-3 1 1 4 2

Total moyen (CFU/ml)

2,5.104 2,8.104 3,6.104 3.104

Conclusion : on retrouve le même ordre de grandeur (log = 4) de colonies que la macération ait été faite sous agitation 4h à 23°C ou au réfrigérateur sans agitation 24h à 2°C. L’un ou l’autre procédé peut alors être utilisé de manière égale.

4 Séro-agglutination Sérum Express d’Adgen Phytodiagnostics Clavibacter Sérum Express d’Adgen Phytodiagnostics Ralstonia Novembre-décembre 2009 Une fraction de colonie est resuspendue en PBS et 10µl mélangé avec une goutte (10µl) de sérum, ou directement une fraction de colonie dans la goutte de sérum.

Souche autre Souche Ralstonia

Souche Clavibacter

Sérum Ralstonia

Sérum Clavibacter

Réaction

LMG2889 x positif

LMG2899 x positif LMG2889 x négatif, légère

réaction LMG2299 x positif



LMG2294 x positif Contrôle positif

kit x négatif

Contrôle positif kit

x négatif, légère réaction


x positif

LMG2299 x négatif


x positif

Contrôle négatif kit

x négatif

Contrôle négatif kit

x négatif

LMG5076 Pseudomonas syringae

x négatif

LMG6872 Burkholderia andropogonis

x négatif

Spécificité : la réaction d’agglutination est spontanée pour Clavibacter (<10 secondes), par contre plus lente pour Ralstonia (> 30 secondes), surtout pour les colonies plus grosses et rouges. Elle est spécifique ; une légère réaction est visible avec le sérum Ralstonia sur Clavibacter mais insuffisante pour prêter à confusion. Aucune réaction n’est visible pour Pseudomonas et Burkholderia (espèces présentes naturellement sur végétaux). Les tests fonctionnent également sur des colonies récupérées après dopages de pommes de terre. Sensibilité : le test fonctionne pour des suspensions de souche de référence en PBS à 104 CFU/ml.

5 PCR Amorces choisies parmi celles proposées par le Journal européen : Pastrik et al. 2002 pour Ralstonia et Pastrik et al. 2000 pour Clavibacter.

→ Ralstonia : amorce sens Rs-1-F, amorce antisens RS-1-R, amorce sens contrôle interne NS-S-F, amorce

antisens contrôle interne NS-6-R. → Clavibacter : amorce sens PSA-1, amorce antisens PSA-R, amorce sens contrôle interne NS-7-F,

amorce antisens contrôle interne NS-8-R.



Kit d’extraction de l’ADN : Nucleospin Plant II de Machery-Nagel. 5.1 Tests de novembre-décembre 2009

5.1.1 Clavibacter

Echantillons de PDT dopés par Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus.

Date du prélèvement: 3/12/09Date de l’extraction et de l’électrophorèse: 4/12/09

Puit 3: LMG 2889 à 10⁶ UFC/ml

Puit 6: LMG 2889 à 10⁴ UFC/ml

Puit 8: LMG 2899 à 10⁶ UFC/ml

Puit 10: LMG 2899 à 10⁴UFC/ml

Taille théorique des bandes : 502 bp pour Clavibacter et 377 bp pour l’ADN de plante (contrôle interne). On remarque dans le 3ème puit que la bande plante est beaucoup plus faible. C’est expliqué par la difficulté lors de l’homogénéisation du culot. Celui-ci était très difficile à décoller. Il y a donc eu une perte lors de la phase d’extraction de l’ADN de plante pour cet échantillon, mais l’ADN est tout de même détecté. Pour le reste, les résultats correspondent à ce qui est attendu, à environ 30 nucléotides près (toutes les bandes ont une taille estimée > 30 bp), dû à un temps de migration insuffisant, impliquant un biais du calcul des tailles sur base du marqueur. Une digestion par enzyme de restriction devrait confirmer que l’ADN amplifié est bien celui recherché. Restriction avec enzyme Bgl II des amplicons:



Le résultat attendu est la scission de l’amplicon 502 bp en 2 bandes de 220 bp et 282 bp. Une bande non restreinte d’ADN végétal doit par ailleurs apparaître sur le gel PCR à 377 bp. Cela implique donc un profil à 3 bandes. Ici l’ADN végétal est figuré par la bande à +/- 470 observée dans les 3 derniers échantillons, et non dans le 1er échantillon étant donné que peu d’ADN végétal a été récupéré (voir gel PCR). Comme dans le cas précédent, un temps de migration insuffisant implique une surestimation de la taille. Pour les 3 premiers échantillons, 2 bandes supplémentaires +/- 350 et 300 sont observées, correspondant à la restriction de l’amplicon de Clavibacter. Dans le dernier échantillon seule la bande à +/- 300 est visible, car la quantité d’ADN amplifiée à la base est faible. Ainsi la restriction confirme l’identité des amplicons. Un temps de migration supérieur est toutefois requis.

5.1.2 Ralstonia



25-11-09: Clavi-Ralsto pdt (Manip Mélissa)5000 CFU/ml Filtres 40µm+büchnerKit Nucleospin plant IIPCR multiplex Pastrik et al.

Piste 1: marqueur Track itPistes 2-4-11-13: videPiste 7: contrôle – extraction: pdt sans bactéries

ClaviPiste 3: Clavi pdtPistes 5-6: contrôle +: bactéries pures 1000 CFU/mlPiste 8: contrôle – PCR: mix sans ADNTailles attendues: -Clavi: 502 bp-Contrôle interne plante: 377 bp

RalstoPistes 9-10: Ralsto pdt (2 échantillons identiq)Piste 12: contrôle +: bactéries pures 1000 CFU/mlPiste 14: contrôle – PCR: mix sans ADNTailles attendues: -Ralsto: 718 bp-Contrôle interne plante: 310 bp

Les tailles attendues sont : 718bp pour l’amplicon Ralstonia et 310 bp pour l’amplicon végétal. Ces profils sont bien observés pour les pistes 9 et 10, à environ une dizaine de bases près. On obtient également une bande à +/- 700 pour la piste 12 mais pas d’ADN végétal puisqu’il s’agit d’une PCR sur souche pure. Remarquons que la bande est déjà visible alors que la concentration bactérienne est faible (1000 CFU/ml), suggérant une bonne sensibilité du test. Un temps de migration légèrement supérieur serait également à appliquer ici comme pour Clavibacter (ci-dessus). Restriction avec enzyme Bsm I des amplicons :



Puit 13 : Ralstonia 5000 UFC/ml Puit 14 : Ralstonia 1000 UFC/ml Les bandes attendues sont : 548 bp et 170 bp. Nous avons des résultats proches de ces deux valeurs soient : 581 bp et 176bp pour le puit 13 et 581 bp pour le puit 14. Pour ce dernier la deuxième bande 170 bp n’est pas visible, car il y avait peu d’ADN au départ, mais son existence est attestée par déduction mathématique entre les résultats du gel PCR et de ce gel-ci.

5.1.3 Conclusion

La PCR sur Clavibacter et Ralstonia fonctionne comme attendu dans le cadre de nos tests, sur des pommes de terre dopées à 104 CFU/ml, et même à 5.103 CFU/ml pour Ralstonia. Pour une meilleure précision sur la taille des bandes, une migration plus longue, à savoir sur 9 cm de gel, devrait être appliquée.



5.2 Test de juin 2011 : comparaison sensibilité avec ou sans extraction via kit Nucleospin Plant II (Test fait avec Clavibacter) Du tampon concentré de pomme de terre a été dopé avec différentes concentrations de Clavibacter LMG2889 et soumis à une PCR. Puits 1: marqueur Track it 50bp Puits 2 à 11: une extraction d’ADN a été réalisée avec le kit NucleoSpin Plant II sur tampon concentré dopé avant la PCR, les concentrations en CFU/ml sont respectivement de 106 (2), 105 (3), 104 (4), 104 (duplicat) (5), 5.103 (6), 5.103 (duplicat) (7), 103 (8), 103 (duplicat) (9), 102 (10), 0 (contrôle négatif) (11). Puits 12 à 17: pas d’extraction d’ADN mais ébouillantage 4 min puis congélation -20°C du tampon concentré dopé avant la PCR, les concentrations en CFU/ml sont respectivement de 107 (12), 106 (13), 105 (14), 104 (15), 103 (16), 0 (controle négatif) (17). Puits 18: contrôle positif: ADN de Clavibacter LMG2889 extrait sur 106 CFU/ml ayant déjà fonctionné dans des PCR précédentes. Puits 19 et 20: contrôles négatifs: mix PCR et tampon de concentration PBII.

Observations

- Les contrôles positifs et négatifs sont OK. - Clavibacter est détecté pour toutes les concentrations testées quand extraction d’ADN avec le kit, la

+ faible étant 102 CFU/ml. - Clavibacter est détecté uniquement pour les 3 concentrations les + élevées quand pas d’extraction

d’ADN, la + faible étant 105 CFU/ml.



- De l’ADN végétal est détecté dans tous les échantillons soumis à l’extraction d’ADN. L’intensité des

bandes est inversément proportionnelle à celle des bandes Clavibacter comme prévu par Pastrik et al. (sans doute question de disponibilité en nucléotides?).

- Des traces correspondant à l’ADN végétal apparaissent pour les échantillons non soumis à l’extraction d’ADN, mais elles sont quantitativement non significatives (<25 unités pixels) sauf le puits 17 de justesse (26 unités).

- Des traces de bandes à ± 220bp apparaissent dans les échantillons soumis à l’extraction d’ADN, d’identité inconnue mais quantitativement non significatives (<25 unités pixels).

Conclusion: l’extraction d’ADN de Clavibacter m. sepedonicus sur tampon concentré de pomme de terre avec le kit NucleoSpin Plant II permet de détecter par PCR au minimum 102 CFU/ml, ce qui satisfait à la Directive européenne qui exige une sensibilité minimale de 103 à 104 CFU/ml.

6 Immunofluorescence 6.1 Tests réalisés en décembre 2009

a. Dilution 10-3, 10-4 et 10-5 d’un extrait concentré de pomme de terre dopé par Clavibacter 5.103 CFU/ml. Déposer 20 µl de chaque sur un puits d’une lame au téflon. Prévoir sur la lame des contrôles positifs et négatifs (kit).

b. Passer plusieurs fois à la flamme chauffante et sécher la lame avec de la vapeur d’eau.

c. Déposer ensuite 20µl d’anticorps (dilué 1/100) sur chaque puits.

d. Placer la lame dans une boîte dont le fond est recouvert d’un papier humide. Attendre +/- 30 min.

e. Rincer premièrement au PB- Tween 20 0,1 % pendant +/- 5 min puis au PBS durant le même

temps à l’aide des cuvettes.

f. Déposer 20 µl de conjugué (dilué 1/160ème au PB) sur chaque puits.

g. Placer la lame à nouveau dans la boîte humide et les placer dans un endroit obscure durant +/- 30 min.

h. Rincer la lame durant 5 min à nouveau au PB Tween 20 0,1 % et ensuite avec le PBS durant le

même temps.

i. Déposer 20 µl du milieu de montage « Citifluor » et observation au microscope.



Agrandissement 100x, plus faible dilution ; Clavibacter marquée bien visible dans le macérat de pomme de terre. Spécificité : sérum testé sur Ralstonia, Pseudomonas syringae LMG 5076 et Burkholderia andropogonis LMG 6872. Pas de marquage net visible.



Agrandissement 100x, plus faible dilution, Pseudomonas syringae LMG 5076 (gauche) et Burkholderia andropogonis LMG 6872 (droite). Pas de marquage net. Conclusion : le sérum permet de détecter Clavibacter dans un macérat de pomme de terre à 5.103 CFU/ml et présente une spécificité par rapport à des bactéries proches.

6.2 Détermination du titre des anticorps primaires (juin 2011) Ce test est à faire pour chaque nouveau batch (kit) utilisé au laboratoire. Lorsque l’on ouvre un nouveau kit, on s’assure qu’au moins 1 kit de réserve est disponible dans le réfrigérateur. Si ce n’est pas le cas, on passe commande d’un kit de réserve. Exemple : ici nous ouvrons un nouveau kit, la référence du batch est notée sur le tube : (PI)1-Meng-A et la date de péremption sur le document annexé au kit, ici 10/2011. Le fabricant préconise une dilution 100x des anticorps = T, ce qui permet de faire 250 réactions avec 1 kit. On teste 2T, T, T/2 et T/4 sur le contrôle positif du kit ainsi que sur de l’extrait concentré de pomme de terre non dopé (contrôle négatif) et dopé. Le dopage est fait avec C. m. sepedonicus souche de référence LMG2889 à une concentration de 5.105 CFU/ml et en option des dilutions 10x et 100x de ce dopage, ce qui correspond à des concentrations en bactéries respectivement de 5.104 CFU/ml et 5.103 CFU/ml. En effet, selon la Directive européenne, le titre est défini comme la plus forte dilution à laquelle la réaction fonctionne encore de manière optimale sur 105 à 106 CFU/ml.

• Pour la préparation du tampon concentré de pomme de terre à la place des 200 talons, 200 cubes de chair de pomme de terre de ± 25 mm2 peuvent être prélevés sur un échantillon de routine déclaré indemne de la bactérie.

• Pour le dopage du tampon une suspension de Clavibacter en PBS est utilisée. Cette suspension est réalisée à partir d’une culture sur boîte YPGA récente (maximum 2 semaines).

Observation des lames de microscopie



Les lames sont observées avec l’objectif 100x à immersion en huile et un filtre pour fluorescence FITC. On s’assure que les contrôles négatifs ne comportent pas de bactéries. On observe au moins les 4 puits correspondant aux contrôles positifs du kit et les 4 puits correspondant aux dopages 5.105 CFU/ml, et on compare la qualité du marquage selon les dilutions d’anticorps. Le meilleur marquage est celui qui délimite nettement le contour bactérien, de manière continue (pas de « pointillés ») mais sans surcharge, dont l’intensité est confortable pour le regard, c’est-à-dire pas de surbrillance et à l’inverse pas de photobleaching trop important (fluorescence qui disparaît trop vite sous le rayon lumineux d’excitation). Par ailleurs, le bruit de fond sur la lame doit être minimum, et les bactéries recherchées doivent se démarquer des autres éléments en présence. Si un cas se présente où il est estimé que deux dilutions différentes d’anticorps donnent des marquages équivalents, tenir compte du marquage pour lequel la dilution en anticorps est la plus forte. Dans le cas du batch (PI)1-Meng-A, entamé en juin 2011, le meilleur marquage est obtenu avec T/2 (voir photos ci-après). Il faut donc diluer 200x les anticorps primaires du kit pour l’utilisation (et non 100x comme prévu par le fabricant, ce qui permettra de faire 500 réactions avec le kit au lieu de 250 !).

DILUTION FINALE A UTILISER : 200x

Contrôle positif du kit, 2T



Pdt dopée, 2T

Contrôle positif du kit, T



Pdt dopée, T

Contrôle positif du kit, T/2



Pdt dopée, T/2

Contrôle positif du kit, T/4



7 Extraction : comparaison filtration et centrifugation Test de janvier 2010 Dopage de talons de pommes de terre avec 106 CFU/ml de Clavibacter souche LMG2889 et Ralstonia souche LMG2299 puis extraction soit par FILTRATION (filtre papier+entonnoir büchner), soit par CENTRIFUGATION (centrifugation 10 minutes 180 rpm + centrifugation 10 minutes 10000 rpm). Résumé des résultats

Clavibacter Ralstonia Filtration Centrifugation Filtration Centrifugation

IF + + + + Etalement + + + + PCR + + + +

IF + + + + Etalement + + + + PCR + + + +

Pdt dopée, T/4



Conclusion Les 2 techniques d’extraction fonctionnent. Pour Ralstonia un nombre de cellule globalement plus élevé est détecté en IF (estimation visuelle non quantifiée) avec la technique de centrifugation. En PCR, l’intensité de la bande d’ADN est par contre légèrement plus élevée avec la technique de filtration. Pour Clavibacter, en PCR, l’intensité de la bande d’ADN est légèrement plus élevée avec la technique de centrifugation. Pour la suite des analyses, la technique d’extraction par CENTRIFUGATION est retenue pour sa facilité de mise en œuvre.

8 Somme des différents tests Des échantillons de pomme de terre sont dopés avec Clavibacter ou Ralstonia et les différents tests (extraction, étalement, séro-agglutination, PCR, IF) sont tous appliqués à chaque échantillon. On en déduit la sensibilité du test, et répétabilité et reproductibilité sont en même temps validés puisque sont menées différentes expériences avec l’intervention de différents opérateurs (V. Remacle en tant que technicien prncipal, S. Willems en tant qu’assistante pour extraction et étalement, S. Léonard en tant que chef de section supervisant). En pratique les différents tests sont utilisés pour chaque échantillon selon un arbre de décision, et un résultat finale unique de type « présence/absence » est donné pour chaque bactérie. 8.1 Tests de mai 2010 Dopage de talons de pommes de terre ou de tampon seul avec 103 et 104 CFU/ml de Clavibacter souche LMG2889 et Ralstonia souche LMG2299. Résumé des résultats Clavibacter Ralstonia

Pommes de t.

Tampon seul

Pommes de t.

Tampon seul

Concentration bactérienne

103 CFU/ml IF + Non testé Non testé Non testé

Etalement - - + - PCR - - - -

104 CFU/ml IF + Non testé + Non testé

Etalement - - - - PCR + + + +

Conclusion

- La sensibilité de la PCR est de 104 CFU/ml pour les 2 bactéries.



- La sensibilité de l’IF est de 103 CFU/ml pour Clavibacter (1 échantillon testé) et de 104 CFU/ml

pour Ralstonia (1 échantillon testé, et 103 CFU/ml non testé).

La sensibilité de l’étalement est non déterminée et > 104 CFU/ml pour les 2 bactéries (a fonctionné seulement 1 fois à 103 CFU/ml pour 1 échantillon Ralstonia mais jamais pour 104 CFU/ml). 8.2 Tests de novembre 2010

Lors de la mise en place de l’analyse, une option maximaliste quand aux tests à mettre en œuvre dans la méthode a été prise avec proposition d’un allégement futur.

Après un an de recul nous proposons pour la reprise des analyses à l’automne un schéma simplifié de l’analyse comprenant un test d’isolement et un test PCR comme prévu par la directive 2006/63/CE.

Nous avons également testé les bandelettes test Agdiagnostic. Les tests Agdia reposent sur le principe du flux latéral, sa sensibilité est supérieure à 105 bactéries par ml ce qui en fait un test fiable au niveau de l’identification des colonies, de plus la bande positive obtenue peut faire l’objet d’une confirmation par PCR.

Ces bandelettes pourraient être utilisées à 2 niveaux :

1. Lors de la présence suspectée de tubercules contaminés.

2. Lors de la confirmation de colonies isolées.

8.2.1 Ralstonia

Tests

Nous avons réalisé une validation avec un seuil de détection compris entre 103 et 104 bactéries par ml. Un échantillon est dopé à 5.103 et un autre à 104 CFU/ml au départ du tampon de macération. La quantité de bactéries ajoutées est basée sur l’utilisation de la densité optique. Un blanc est mis en œuvre en commun avec la validation Clavibacter michiganensis sepedonicus (voir point suivant). Au niveau PCR un test d’inhibition est réalisé au départ d’un macérat connu pour être négatif auquel on ajoute de l’ADN avant extraction de l’ADN.

Les extraits obtenus ont fait l’objet d’un étalement sur milieu SMSA et d’une PCR, les colonies isolées ont permis de tester le test Agdia et on fait l’objet d’une PCR.

Résultats

Analyses Ralstonia 5.103 Ralstonia 104 Blanc



Lims 10413673 Lims 10413672 Lims 10413674

Etalement sur SMSA Présence Présence Absence

PCR macérat Présence Présence Absence

PCR Agdia Présence Présence Absence

PCR sur colonie isolée Présence Présence Absence

Conclusions Présence Présence Absence

Test d’inhibition : pas d’inhibition (Pour les résultats détaillés voir fiche échantillon suivant N° Lims). Conclusion Tant la PCR que l’étalement ont une sensibilité au moins de 5.103 CFU/ml. L’adoption du nouveau schéma simplifié d’analyse est faisable.

8.2.2 Clavibacter

Tests

Nous avons réalisé une validation avec un seuil de détection compris entre 103 et 104 bactéries par ml. Un échantillon est dopé à 5 103 et un autre à 104 bactéries par ml au départ du premier tampon de macération. La quantité de bactéries ajoutées est basée sur l’utilisation de la densité optique. Un blanc est mis en œuvre en commun avec la validation Ralstonia solanacearum (voir ci-dessus). Au niveau PCR un test d’inhibition est réalisé au départ d’un macérat connu pour être négatif auquel on ajoute de l’ADN avant extraction de l’ADN.

Les extraits obtenus ont fait l’objet d’un étalement sur MTNA (prévu en cas de présomption de présence) d’un test en IF et d’une PCR, les colonies isolées à 104 ont permis de tester le test Agdia et on fait l’objet d’une PCR.

Résultats

Analyses Cms 5.103 Cms 104 Blanc

Lims 10413670 Lims 10413671 Lims 10413674

Etalement sur MTNA Absence Présence Absence

PCR macérat Présence Présence Absence

IF Présence Présence Absence

PCR Agdia (Non testé) Présence Absence



PCR sur colonie isolée (Non testé) Présence Absence

Conclusions Présence Présence Absence

Test d’inhibition : pas d’inhibition (Pour les résultats détaillés voir fiche échantillon suivant N° Lims). Conclusion Tant la PCR sur macérat que l’immunofluorescence ont une sensibilité au moins de 5.103 CFU/ml. L’adoption du nouveau schéma simplifié d’analyse est faisable. 8.3 Tests d’avril 2011 Dopage de 3 échantillons de pommes de terre avec Clavibacter ou Ralstonia à 103 – 104 – 105 CFU/ml, puis extraction et PCR (Clavibacter) et étalement (Ralstonia). PCR Clavibacter Échantillons n°11141118 (103), 11141119 (104) et 11141120 (105) Résultats : PCR positive pour les 3 échantillons. Etalements Ralstonia sur SMSA Échantillons n°11141115 (103), 11141116 (104) et 11141117 (105) Résultats : étalement positif pour les 3 échantillons. Conclusion Sensibilité de la PCR Clavibacter : au moins 103 CFU/ml. Sensibilité de l’étalement Ralstonia sur SMSA : au moins 103 CFU/ml.

9 Ring-tests 9.1 Test ILT2 en 2010 Détection de Clavibacter et Ralstonia dans des tubercules de pomme de terre. 14 échantillons : 10 macérat dopés ou non (0, 104, 105, 106 CFU/ml) et 4 contrôles. Tests réussis : étalement Ralstonia, PCR Ralstonia, PCR Clavibacter, IF Clavibacter. (accessoirement réussi aussi IF Ralstonia). 9.2 Test PhytoPAS en 2012 Détection de Clavibacter et Ralstonia par PCR et déctection de Clavibacter par IF. 12 extraits contenant de l’ADN et 8 puits avec bactéries fixées sur lame de microscopie.



Tests réussis : PCR Ralstonia, PCR Clavibacter. IF Clavibacter réussi seulement pour les concentrations supérieures à 105 CFU/ml. 9.3 Test ILC3 en 2012 Détection de Clavibacter et Ralstonia dans des tubercules de pomme de terre. 10 échantillons : macérats dopés ou non (0 - 2,5.102 - 4.103 - 5.104 - 2,5.103 – 2,5.104 – 105 – 2,5.105 CFU/ml). Tests réussis : PCR Ralstonia, PCR Clavibacter (accessoirement réussi aussi PCR en temps réel Ralstonia et PCR en temps réel Clavibacter). L'IF Clavibacter a été réussi sur le plan qualitatif (présence/absence) mais pas quantitatif (comptage des cellules), ceci dit en routine notre méthode ne demande pas de quantitatif.

10 Matrice Boutures de Pélargonium But : montrer que l’on détecte R. solanacearum sur la matrice Pélargonium, avec la même méthode que pour la matrice pomme de terre. L’analyse est déjà validée pour la détection de R. solanacearum sur tubercule de pomme de terre, il s’agit donc de montrer ici qu’il n’y a pas d’effet matrice défavorable avec Pélargonium. 10.1 Test de juin 2013 (test par S. Léonard) Dopage de 4 échantillons de Pélargonium avec R. solanacearum LMG 9576 :

- 1 échantillon de 25 segments dopé à 5.103 CFU/ml (n° 13251071 = « A1 ») - 1 échantillon de 100 segments dopé à 5.103 CFU/ml (n°13251072 = « A2 ») - 1 échantillon de 25 segments dopé à 104 CFU/ml (n°13251073 = « B1 ») - 1 échantillon de 100 segments dopé à 104 CFU/ml (n°13251074 = « B2 »)

puis tests d’isolement sur milieu semi-sélectif SMSA et PCR classique sur ADN extrait par kit Nucleospin. (Pour détails voir fiches de suivi des échantillons).

10.1.1 Préparation des échantillons

Des plants de Pélargonium (10 pots, mix de différentes variétés) sont achetés dans le commerce (« Jardins et loisirs ») le 04/06/13 et les tiges (si possible parties basses, les parties hautes portant les fleurs sont évitées) sont découpées en tronçons de 1 cm. Les tronçons sont brièvement désinfectés à l’alcool 70% comme prévu par la procédure. 4 plants choisis au hasard dans le mix sont utilisés pour créer le groupe A, ç-à-d. que 125 segments de tiges sont découpés et répartis en 2 pots (25 segments pour A1 et 100 segments pour A2). La même opération est répétée pour créer les échantillons B1 et B2.



10.1.2 Dopage des échantillons

La souche de référence de R. solanacearum LMG 9576 a été décongelée du -80°C le 28/05/13 (une matinée sur glace) et étalée sur SMSA et placée à l’étuve 28°C. Le 4 juin, soit après 7 jours d’incubation, les bactéries se sont multipliées en quantité suffisante pour le dopage. Resuspension de la souche dans 450µl PBS 100µl + 900µl PBS : DO600 nm = 0,668 → 0,668 x 10 = 6,68 Si une DO600 de 0,15 = 2.108 CFU/ml (validation précédente), on a ici (6,68/0,15) x 2.108 = 89,07.108 CFU/ml Dilution 1000x en 3 étapes : 50µl + 450µl PBS (dil10x) ; de cela reprendre 50µl + 450µl PBS (dil100x) ; de cela reprendre 50µl + 450µl PBS (dil1000x) → on a alors une suspension à 89,07.105 CFU/ml = tube « mère ». ♠ Dopage 5.103 CFU/ml : les segments sont dans 40 ml de tampon PBI et la dose de dopage est de 100µl,

donc il faut une concentration finale dans le pot de 5.103 x 40,1 ml = 200,5.103 CFU Il faut donc s’arranger pour avoir 200,5.103 CFU dans les 100µl de dopage, donc une suspension de dopage à 200,5.104 CFU/ml . Or on a 89,07.105 CFU/ml dans le tube mère, donc il faut diluer 890,7/200,5 = 4,44x → je prépare 250µl de cette suspension ç-à-d. mettre (250/4,44) = 56,3µl de tube mère + (250 – 56,3) soit 193,7µl de PBS = 250µl de suspension à 200,5.104 CFU/ml = tube « fille A ».

⇒ Du tube fille A, je prélève 100µl à déposer dans le pot de macération de segments de Pélargonium A1, afin d’avoir un dopage à 5.103 CFU/ml.

⇒ Idem pour le pot A2.

♠ Dopage 104 CFU/ml : les segments sont dans 40 ml de tampon PBI et la dose de dopage est de 100µl,

donc il faut une concentration finale dans le pot de 104 x 40,1 ml = 40,1.104 CFU Il faut donc s’arranger pour avoir 40,1.104 CFU dans les 100µl de dopage, donc une suspension de dopage à 40,1.105 CFU/ml . Or on a 89,07.105 CFU/ml dans le tube mère, donc il faut diluer 89,07/40,1 = 2,22x → je prépare 250µl de cette suspension ç-à-d. mettre (250/2,22) = 112,6µl de tube mère + (250 – 112,6) soit 137,4µl de PBS = 250µl de suspension à 40,1.105 CFU/ml = tube « fille B ».

⇒ Du tube fille B, je prélève 100µl à déposer dans le pot de macération de segments de Pelargonium B1, afin d’avoir un dopage à 104 CFU/ml.

⇒ Idem pour le pot B2. Les pots sont ensuite mis sous agitation pour la macération.

10.1.3 Isolement sur milieu SMSA

Vérification de la concentration cellulaire des suspensions utilisées pour le dopage En parallèle du dopage une fraction des suspensions filles est étalé sur SMSA pour s’assurer que la concentration bactérienne utilisée est bien de l’ordre de 5.103 ou 104 CFU/ml. Les boîtes sont incubées 6 jours à 28°C. Je réalise des dilutions jusqu’à 10.000x des suspensions fille A et B, en procédant de 10 en 10 : 10µl suspension + 90µl PBS (dil10x) ; de cela prendre 10µl + 90µl PBS (dil100x) ; de cela prendre 10µl + 90µl PBS (dil1000x) ; de cela prendre 10µl + 90µl PBS (dil1000x). J’étale 50µl des dil 100x à 10.000x sur SMSA.



Pour la suspension fille A (dopage 5.103), on est censé avoir 200,5.104 CFU/ml. Donc dans 50µl on aurait (200,5/20) soit 10,025.104 CFU soit 100.250 cellules → pour la dil100x on peut attendre 1002 CFU, pour la dil1000x 100 CFU et pour la dil10.000x 10 CFU. Pour la suspension fille B (dopage 104), on est censé avoir 40,1.105 CFU/ml. Donc dans 50µl on aurait (40,1/20) soit 10,025.104 CFU soit 200.500 cellules → pour la dil100x on peut attendre 2005 CFU, pour la dil1000x 200 CFU et pour la dil10.000x 20 CFU. Comptage des colonies après 6 jours d’incubation (10/06/13) : Les colonies sont bien visibles, ∼ 1-2 mm de diamètre.

Suspension 5.103 Suspension 104 Nb CFU

attendu Nb CFU obtenu

Concentration réelle utilisée

pour le dopage

(CFU/ml)

Nb CFU attendu

Nb CFU obtenu

Concentration réelle utilisée

pour le dopage

(CFU/ml) Dil100x 1002 253 1,26.103 2004 537 2,7.103

Dil1000x 100 32 1,60.103 200 68 3,4.103

Dil10.000x 10 6 2,99.103 20 8 3,4.103 Moyenne 1,95.103 3,17.103 Moyenne arrondie à

l’unité

2.103

3.103

(253x100)x20 = 506.000 CFU/ml dans le tube fille A donc 50.600 CFU/100µl. Cela mis dans 40,1ml de tampon correspond à (50.600/40,1) soit 1261,8 CFU/ml soit 1,26.103 CFU/ml. (32x1000)x20 = 640.000 CFU/ml dans le tube fille A donc 64.000 CFU/100µl. Cela mis dans 40,1ml de tampon correspond à (64.000/40,1) soit 1596 CFU/ml soit 1,60.103 CFU/ml. (6x10000)x20 = 1.200.000 CFU/ml dans le tube fille A donc 120.000 CFU/100µl. Cela mis dans 40,1ml de tampon correspond à (120.000/40,1) soit 2992,5 CFU/ml soit 2,99.103 CFU/ml. (537x100)x20 = 1.074.000 CFU/ml dans le tube fille B donc 107.400 CFU/100µl. Cela mis dans 40,1ml de tampon correspond à (107.400/40,1) soit 2678,3 CFU/ml soit 0,27.104 CFU/ml soit 2,7.103 CFU/ml. (68x1000)x20 = 1.360.000 CFU/ml dans le tube fille B donc 136.000 CFU/100µl. Cela mis dans 40,1ml de tampon correspond à (136.000/40,1) soit 3391,5 CFU/ml soit 0,34.104 CFU/ml soit 3,4.103 CFU/ml. (8x10000)x20 = 1.600.000 CFU/ml dans le tube fille B donc 160.000 CFU/100µl. Cela mis dans 40,1ml de tampon correspond à (160.000/40,1) soit 3390 CFU/ml soit 0,34.104 CFU/ml soit 3,4.103 CFU/ml. Conclusion : la concentration cellulaire utilisée pour les dopages, tant « 5.103 » que « 104 » est de l’ordre de 103 CFU/ml, à savoir respectivement de 2.103 et 3.103 CFU/ml. Les concentrations réelles utilisées sont donc légèrement inférieures aux concentrations théoriques. Détection de R. solanacearum Les échantillons A1, A2, B1 et B2 sont traités comme des échantillons de routine (voir procédures).



En bref : macération sous agitation, filtration stomacher, centri pour éliminer la terre, centri pour précipiter les bactéries, resuspension en 1,5ml de PBII, dilution 10x et 100x en PBS, étalement de 50µl des dil 100, 10-1 et 10-2 et incubation 6 jours à 28°C. Détection et comptage des colonies après 6 jours d’incubation (10/06/13) : Détection : des colonies sont présentes sur toutes les boîtes, même pour les dilutions les plus grandes. Elles

sont bien visibles, ∼ 1-3 mm de diamètre. La morphologie correspond bien à celle connue pour la souche dans les conditions d’utilisation du labo (voir photos ci-dessous), à savoir des colonies mauves foncées relativement plates et d’aspect plutôt « sec », avec un halo clair visible par transparence, d’autant moins marqué que les colonies sont grosses; le milieu est légèrement décoloré par les bactéries. En plus de la morphologie, le test sérologique est positif (tant pour bandelettes Agdia qur sérum Adgen phytodiagnostics ; plus marqué avec les bandelettes).

Comptage :

Dopage « 5.103 » (2.103 en réalité) Nb

CFU attendu

Nb CFU obtenu A1

Rendement Nb CFU obtenu A2

Rendement

Dil1x : 100 2673 Très nombreuses

colonies, incomptable

indéterminé Très nombreuses


indéterminé

Dil10x : 10-1 267 97 36% 98 37%

Dil100x : 10-2 27 11 41% 12 44% Moyenne 38,5% 40,5%

Dopage « 104 » (3.103 en réalité) Nb

CFU attendu

Nb CFU obtenu A1

Rendement Nb CFU obtenu A2

Rendement

Dil1x : 100 4010 Très nombreuses


indéterminé Très nombreuses


indéterminé



Dil10x : 10-1 401 183 46% 212 53% Dil100x : 10-2 40 21 52,5% 37 92,5%

Moyenne 49% 73% Nb CFU attendu : 2.103 CFU/ml dans 40,1ml → reconcentré dans 1,5ml soit (2.103 x (40,1/1,5)) = 53.467 CFU/ml. Dans 50µl on attend alors 2673 CFU. Dans une dil10x on aurait 267 CFU, et dans une dil100x on aurait 27 CFU. Nb CFU attendu : 3.103 CFU/ml dans 40,1ml → reconcentré dans 1,5ml soit (3.103 x (40,1/1,5)) = 80.200 CFU/ml. Dans 50µl on attend alors 4010 CFU. Dans une dil10x on aurait 401 CFU, et dans une dil100x on aurait 40 CFU. On observe que :

- Il y a toujours une perte de CFU entre le dopage et ce qu’on récupère par culture en final, probablement pour raison mécanique au cours des manipulations (filtration, centrifugation,…), et peut-être pour raison de viabilité cellulaire, par exemple un impact négatif de l’éthanol utilisé pour la désinfection des boutures (?). Le rendement le plus faible est de 38%, ce qui signifie que le seuil de détection pourrait théoriquement descendre jusqu’à 2 CFU/ml* donc 1000x plus performant que demandé par la directive (103 -104 CFU/ml).

- Le rendement apparaît meilleur quand il y a plus de segments de tiges ; la différence est peu marquée pour le dopage 2.103 (seulement 1 colonie en plus quand 100 segments) mais plus visible pour le dopage 3.103. Il se pourrait que plus de matière végétale contribue à retenir plus de bactéries par ex. dans le culot bactérien après centrifugation.

*En effet avec 38,5% de rendement, on détecterait 1 CFU sur la boîte dil100 s’il y a 1 x 38% soit 2,6 CFU par 50µl de tampon concentré, ç-à-d. 2,6 x 20 x 1,5 = 78 CFU/ml de tampon concentré ou 78/40 = 2 CFU/ml de tampon non concentré (pot de 40 ml). Conclusion de l’isolement sur SMSA : pour les 4 échantillons testés on récupère la bactérie avec un seuil de détection ≤ 2.103 CFU/ml.

10.1.4 PCR classique

Extraction Comme pour les analyses de routine 666µl de tampon concentré par échantillon est congelé puis soumis à extraction via kit Nucleospin Plant II de Machery-Nagel. 2 contrôles négatifs sont inclus dans la série pour vérifier qu’il n’y a pas de cross-contamination pendant l’extraction. → Constatation : pour les 2 échantillons à 100 segments il y a plus de « crasses » sur le filtre des colonnes d’extraction que pour les échantillons à 25 segments. Amplification PCR Comme pour les échantillons de routine le protocole de PCR multiplex classique de Pastrik et al. 2002 (directive EU) est appliqué.



Résultat : Pour les 4 échantillons une amplification est détectée par électrophorèse, et les 2 contrôles négatifs d’extraction sont bien négatifs (photo électrophorèse page suivante).

Echantillon Intensité de la bande « Ralstonia » sur gel

A1 2295

A2 216 B1 2457 B2 592

On observe que :

- Toutes les bandes sont largement au-dessus du seuil de détection (25 unités). La bande la plus faible est (216/25) = 8,6x plus marquée que le seuil. Le seuil de détection pourrait dès lors théoriquement descendre jusqu’à (2000/8,6) = 2,3.102 CFU/ml.

- L’intensité des bandes est plus marquée pour les 2 échantillons à 25 segments : bande A1 est 10x plus intense que A2, et bande B1 est 4x plus intense que B2. Cela est probablement dû à une perte d’ADN lors de l’extraction à cause du bouchage des colonnes par les « crasses » plus nombreuses pour les échantillons à 100 segments (voir point 4.1).

Restriction des amplicons Comme pour les échantillons de routine une restriction enzymatique BSMI est utilisée pour confirmer la nature des amplicons. Résultat : pour les 4 échantillons la restriction a confirmé la nature des amplicons (photo électrophorèse

page suivante).



Conclusion du point PCR : pour les 4 échantillons testés on détecte la bactérie avec un seuil de détection ≤ 2.103 CFU/ml.

10.1.5 Conclusion

Nous avons montré dans cette mini-validation que nous pouvons détecter R. solanacearum à partir de Pélargonium dopés, via isolement sur milieu SMSA et via PCR classique, avec un seuil de détection ≤ 2.103 CFU/ml. Cela satisfait à la sensibilité exigée par la Directive Européenne (103-104 CFU/ml). 10.2 Test d’octobre 2013 Les tests sur Pélargonium de juin ont été répétés en octobre par un autre technicien (V. Remacle), les résultats montrent une sensibilité similaire.


Documents

Rapport de validation