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EFETORES NA INTERAO PLANTA-PATGENOS

Dalio, Ronaldo J. D.1; Magalhes, Diogo M.1; Atlio, Lsia B.1; Rodrigues,

Carolina M.1; Breton, M ichle C.1; Pichi, Simone 1; Pascholati , Srgio F .2;

Machado, Marcos A.1

1 Laboratrio de Biotecnologia de Citros, Centro de Citricultura Sylvio Moreira, IA

Cordeirpolis-SP

2 Departameto de Nematologia e Fitopatologia, Escola Superior de Agricultura Lus

de Queiroz, USP, Piracicaba-SP

RESUMO

Durante milhes de anos convivendo no mesmo ambiente, plantas e patgenos

desenvolveram um complexo sistema de interao entre eles. Patgenos utilizam umgrande nmero de estratgias para superar a barreiras de defesas e iniciarem a

colonizao nos tecidos do hospedeiro. Enquanto isso, as plantas apresentam um

complexo sistema de defesa para impedir a invaso dos patgenos e, em consequncia,

o desenvolvimento de doena. Esta batalha resulta em uma constante presso de

seleo entre os organismos envolvidos. Neste captulo so apresentados os principais

componentes envolvidos na interao planta-patgeno, que vo desde a ativao de

defesa desencadeada por reconhecimento de padres moleculares associados aospatgenos (PAMPs), o papel fundamental de efetores e protenas de resistncia para o

desenvolvimento de doenas, as ferramentas de bioinformtica utilizadas para

predio de candidatos a genes efetores no genoma dos patgenos e o potencial uso

dos efetores na proteo da agricultura e ecossistemas naturais.

SUMMARY

Millions of years coexisting in the same environment developed a complexinteractions system between plants and pathogens. A large number of strategies are

used by pathogens to break the plant defense barriers in order to invade and colonize

plant tissues. At the same time a profusion of other strategies are used by plants to

avoid or minimize the pathogen invasion and development. As a consequence of this

battle there is a constant selection pressure in both organisms involved, resulting in a

strategy game which will never have a final winner. Here we reviewed the main

components involved in plant pathogen interaction from the Pathogen-Associated

Molecular Pattern (PAMP) and their recognition by PAMP receptors activating


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defense, the role of effectors and Rproteins and their importance to help pathogens

and plants respectively in this eternal war for survival, the bioinformatic tools to

predict putative effectors and its potencial use to protect crops and natural ecosystems.

INTRODUO

Milhes de anos de convvio no mesmo ambiente favoreceu o desenvolvendo

de complexo sistema de comunicao entre plantas e microrganismos. Para toda

interao planta-microrganismo, a troca de sinais representa a primeira e fundamental

etapa. Assim, a habilidade de perceber e responder a sinais do ambiente

fundamental para a sobrevivncia (Tyleret al., 2006).

Patgenos apresentam a habilidade de reconhecer sinais das plantas para

iniciar a infeco (Dalio et al., 2014). Por sua vez, as plantas esto expostas

constantemente a mudanas no ambiente, ataque de pragas e doenas. Diferentemente

dos animais, plantas no apresentam um sistema imune adaptativo e nem clulas de

defesa mveis, como os macrfagos (Chisholm et al., 2006), no entanto

desenvolveram um sistema imune simples, porm eficiente, que ativado aps o

reconhecimento de sinais da presena do microrganismo (Gassmann & Bhattacharjee,

2012; Dalio, 2013).

Os processos de reconhecimento pelo sistema imune de plantas podem ser

dividido em duas frentes: (i) aqueles associados imunidade desencadeada por

PAMPs ou MAMPs (pathogen or microbe associated molecular patterns), e (ii)

aqueles associados imunidade desencadeada por efetores. O primeiro usualmente

denominado PTI (PAMP-triggered immunity) e o segundo ETI (effector-triggered

immunity) (Jones & Dangl, 2006). Os PAMPs ou MAMPs, so reconhecidos por

receptores PRRs (PAMP-recognition receptor) localizados na superfcie da

membrana celular ou interior da clula, que desencadeiam uma cascata de transduo

de sinal ativando a resposta de defesa (Hogenhoutet al., 2009). Este tipo de sistema

de defesa permite que as plantas respondam rpida e eficientemente a uma gama

ampla de patgenos (Rouxet al., 2014).

Patgenos adaptados so capazes de secretar um arsenal de protenas que

podem suprimir PTI, resultando em susceptibilidade desencadeada por efetores (ETS,

effector-triggered susceptibility) (Birchet al., 2009).


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Os processos envolvido na resposta ETI envolvem a secreo de efetores para

suprimir essa resposta. No entanto, plantas podem apresentar protenas de resistncia

(R) que reconhecem estes efetores resultando em defesa (Howden & Huitema, 2012).

O reconhecimento de efetores por protenas R pode ser direto (modelo gene-a-gene) (Owaldet al., 2014) ou indireto (modelo guarda) (Jones & Dangl, 2006).

Enquanto patgenos emergem novos efetores para manipular os processos de

defesa das plantas, estas emergem novas protenas R, o que sugere uma constante e

indefinida corrida armamentista na interao planta-patgeno (Fig. 1) (Coll et al.,

2011).

Figura 1:Representao esquemtica da co-evoluo entre plantas e patgenos.Sob ataque de patgenos, PAMPs ativam PRRs nos hospedeiros, resultando emcascata de sinais, usualmente atravs de fatores de transcrio como os WRKY, queleva a defesa. Este processo denominado PTI. Patgenos virulentos podem secretar

efetores que suprimem o reconhecimento de PAMPs e PTI, o que resulta emsusceptibilidade. Este processo denominado ETS. Por outro lado, plantas podemapresentar genes que codificam protenas de resistncia (R), que reconhecem osefetores e desencadeiam defesa. Este processo denominado ETI. Sob presso deseleo, os patgenos alteram ou desenvolvem novos efetores para escapar doreconhecimento por protenas R, o que resulta em uma nova fase ETS. Desse modo, a

presso de seleo passa para as plantas. Novos genes R podem emergir edesencadear uma nova ETI, restaurando a imunidade. Estes processos podem serepetir indefinidamente (Dalio, 2013).


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Aps reconhecimento de um PAMP ou efetor, o sistema imune das plantas

ativado atravs de vias de sinalizao semelhantes, baseadas em mudanas nos nveis

de clcio no citoplasma, rpida produo de espcies reativas de oxignio e cascata de

sinalizao via MAP-quinases (mitogen activated protein kinases). A amplificao

desses sinais se d por hormnios reguladores como cido saliclico (SA), cido

jasmnico (JA) e o etileno (ET) resultando na ativao de fatores de transcrio, entre

eles os da super-famlia WRKY, e de genes de defesa, protenas-PR, (pathogenesis-

related proteins) fitoalexinas, lignificao de tecidos, deposio de calose e outros

reforos da parede celular (Grant & Lamb, 2006).

evidente que o reconhecimento do patgeno seja fundamental para qualquer

relao susceptvel ou de resistncia. Poucas protenas efetoras j foram descritas, noentanto vrios PAMPs/MAMPs j so comprovadamente envolvidas nas relaes de

reconhecimentos entre plantas e microrganismos (Newmanet al., 2013).

Sabe-se que os patgenos apresentam diversas estratgias de ataque ao

hospedeiro e que inmeros efetores tem potencial para manipular a defesa das plantas.

No entanto, isso contrasta com o que se v na natureza, onde resistncia regra e

doena exceo, em outras palavras, uma dada espcie de planta pode ser resistente

para a maioria dos patgenos e suscetvel a apenas alguns. Isto se d em funo derelaes no-compatveis e chamada de resistncia de no-hospedeiro (non-host

resistance). Este captulo, no entanto, foca em relaes compatveis e interao

patgeno-hospedeiro, focando em efetores e seu papel na ativao ou bloqueio de

respostas de defesa das plantas.

O entendimento e manipulao de componentes chave envolvidos em

mecanismos de defesa das plantas, como PAMPs, PRRs, efetores e genes de

resistncia, podem levar ao desenvolvimento de novas estratgias para o controle dedoenas na agricultura (Raffaele & Kamoun, 2012).

IMUNIDADE DESENCADEADA POR PAMPS (PTI)

As plantas inicialmente percebem a presena de microrganismos a partir de

receptores de reconhecimento de padres moleculares PRRs (pattern recognition

receptors). Esses receptores so protenas transmembranas pertencentes classe das

protenas receptor-like (RLPs) ou quinases receptor-like (RLKs) e apresentam


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geralmente repeties ricas em leucina (LRRs) ou motivo de lisina (Lysm) no

domnio extracelular, o qual est envolvido com o reconhecimento dos sinais (BECK

et al.2012).

Os PRRs esto presentes na superfcie das clulas e so capazes de reconhecer

PAMPs e ativar resposta de defesa contra os patgenos em potencial. Os PAMPS

foram inicialmente definidos como molculas provenientes dos microrganismos

altamente conservadas e que apresentam funo essencial em sua sobrevivncia

(MEDZHITOVand JANEWAY1997). Muitas vezes, essas molculas so provenientes de

microrganismos no patgenos, portanto o termo (MAMP) tambm utilizado. Tanto

PAMPs ou MAMPs so capazes de atuar como molculas elicitoras e desencadear

respostas de defesa basal. Da mesma forma, os PRRs podem tambm reconhecerperfis moleculares associados a insetos herbvoros (HAMPs) (MITHFERand BOLAND

2008) ou mesmo danos resultantes (DAMPs, damage-associated molecular patterns)

que so molculas liberadas pelas prprias clulas do hospedeiro quando so expostas

ao ataque por pragas ou microrganismos (MAet al.2012).

Molculas de diferentes classes e pertencentes a diferentes microrganismos

foram identificadas como PAMPs/MAMPs, incluindo os peptdeos bacterianos

flagelina e fator Tu de elongamento (EF-Tu), o peptdeo de fungo xilanase induzida

por etileno (EIX) e oligossacardeos de fungos, como as glucanas ou fragmentos de

quitina da parede celular. Tambm foram identificados como PAMPs/MAMPs

eptopos mais complexos, como glicoprotenas de oomicetos ou lipopolissacarideos e

peptideoglicanas de bactrias (SHAN et al. 2007). Com a deteco dos

PAMPS/MAMPS, as protenas PRRs ativam na planta a resposta de imunidade

desencadeada por PAMPs (PTI, de PAMP- Triggered Immunity) e esta representa a

primeira linha do sistema de imunidade das plantas (Tabela 1).

Tabela 1: PAMPs, MAMPs, DAMPs e HAMPs j descritos e seus respectivosreceptores PRRs envolvidos em respostas de defesa tipo PTI.

MAMP/DAMP/HAMP Planta responsiva Receptor Referncia

Bactrias

PeptideoglicanaArroz Lyp4/Lyp6 (LIUet al.2012)

Arabidopsis Lym1/Lym3 (WILLMANNet al.2011)

Lipopolissacardeo (LPS) Arabidopsis, tabaco, Desconhecido (ZEIDLERet al.2004)


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pimenta

FlagelinaArabidopsis, tomate,

arroz, tabacoFLS2

(GMEZ-GMEZand

BOLLER2000)

Ax21 Arroz Xa21 (WANGet al.2013)

Fator Tu de elongao (EF-Tu)

Brassicaceae EFR (KUNZEet al.2004)

Oomicetos

Transglutaminase Batata, salsa Desconhecido (BRUNNERet al.2002)

-glucanas Soja GBP (FLIEGMANNet al.2004)

Fungos

Xilanase Tabaco, tomate Eix1/Eix2 (RONand AVNI2004)

Invertase Tomate Desconhecido (BASSEet al.1992)-glucanas Arroz Desconhecido (YAMAGUCHIet al.2000)

Quitina

Arroz CEBiP/CERK1 (SHINYAet al.2012)

Arabidopsis CERK1 (MIYAet al.2007)

Arabidopsis LYK4 (WANet al.2012)

Sinais da prpria planta

PEPR1/2 Arabidopsis AtPep (KROLet al.2010)

ATP extracelular Tomate LecRK-1.9 (CHOIet al.2014)

Herbvoros

Conjugado de cidos graxos e

aminocidos (FAC)Tabaco Desconhecido (HALITSCHKEet al.2001)

Insetinas Feijo de corda Desconhecido (SCHMELZet al.2007)

A protena PRR mais estudada a FLS2 (Flagelin Sensing 2) que foi

inicialmente identificada em Arabidopsis e possui a capacidade de reconhecer um

eptopo de 22 aminocidos (flg22) na poro conservada N-terminal da protenaflagelina que compe o flagelo, estrutura primariamente envolvida com a locomoo

em bactrias. A flagelina representa um exemplo consistente com a definio de

PAMP, ou seja, essencial para a motilidade bacteriana, apresenta-se conservada em

um grande grupo (bactrias que se locomovem por flagelo) e representa um fator de

virulncia comprovado e necessrio para a patogenicidade bacteriana (RAMOSet al.

2004). O eptopo flg22 reconhecido pela maioria das espcies de plantas e o

receptor FLS2 foi identificado em plantas como arroz, tomate e Nicotianabenthamiana, alm de Arabidopsis (BOLLERand FELIX2009). Outros exemplos bem


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caracterizados de PRRs incluem o EFRque reconhece o eptopo elf18 de EF-Tu em

bactrias, o receptor CERK1 que reconhece peptideoglicanas bacterianas, Xa21 que

reconhece protena sulfatada AX21 em Xanthomonas, alm do receptor CEBip que

reconhecem regies de quitina em fungos ou LEIX1/2 que percebem xilanases em

fungos (Dardick, Schwessinger, and Ronald 2012).

A resposta de imunidade do tipo PTI se d por ligao fsica entre o domnio

extracelular do receptor (PRR) com o eptopo do ligante (PAMP/MAMP), o que

ocasiona uma mudana na estrutura do receptor e concomitante ativao da cascata de

sinalizao citoplasmtica pelo domnio intracelular do receptor. A percepo

microbiana rapidamente ativa o influxo de ions de clcio (Ca 2+) para dentro das

clulas, o que modifica o pH local e regula a sinalizao inicial de eventos queocorrem dentro de segundos a minutos, como o efluxo de nions, a produo de

espcies reativas de oxignio (ROS) e expresso de genes envolvidos com

biossntese de peptdeos e compostos antimicrobianos. Estas respostas so

principalmente mediadas por protenas quinases dependentes de clcio (CDPKs) e co-

reguladas pela cascata de sinalizao por protenas quinases ativadas por mitgenos

(MAPKs), as quais podem ser posteriormente moduladas por calmodulina (CAM). O

aumento de Ca2+

tambm regula respostas tardias que podem ocorrer horas ou diasaps contato com o patgeno, o que inclui a produo de cido saliclico (SA),

fitoalexinas, camalexinas e outros compostos de defesa pela regulao genica. A

ativao de genes de defesa tambm pode sofrer regulao por fatores de transcrio,

como por exemplo aqueles pertencentes famlia WRKY (MONAGHAN and ZIPFEL

2012). O complexo de sinalizao descrito, principalmente regulado por Ca2+,

apresenta uma viso geral de resposta PTI que contribuem para a defesa das plantas

contra bactria, fungos e oomicetos. Entretanto, outras respostas podem estar

associadas, incluindo a produo de etileno, o fechamento de estmatos ou a

deposio de calose ou lignina na parede celular e, alm disso, em vrios desses

processos h a formao de molculas que potencialmente podem atuar como

mensageiros secundrios (SA, ROS, etileno, clcio, etc) em diversas outras vias

metablicas, o que torna a resposta ainda mais complexa (Z IPFEL and ROBATZEK

2010).

SUSCETIBILIDADE DESENCADEADA POR EFETORES (ETS)


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At recentemente, muito pouco se sabia sobre a biologia dos efetores e

principalmente sobre as bases moleculares da interao planta-patgeno. O

conhecimento era limitado a estruturas de infeco especializadas, sintomatologia,

secreo de enzimas hidrolticas e toxinas. Com o avano de tcnicas moleculares e

sequenciamento, muita informao tem sido levantada e a fitopatologia est

avanando no entendimento das estratgias de infeco dos patgenos e mecanismos

de defesa das plantas. Inicialmente, foram elucidadas das funes bioqumicas de

algumas molculas efetoras de bactrias. Depois, o conceito de efetores foi

extrapolado de bactria patognicas para fungos, oomicetos e nematoides, que

tambm tiveram a funo bioqumica de alguns de seus efetores elucidadas e

finalmente, com mtodos computacionais e bioinformtica baseados em

sequenciamento de genomas tem sido possvel predizer candidatos a efetores numa

gama imensa de microrganismos. Estas informaes em conjunto levaram a

comunidade cientfica a aceitar os efetores como fatores essenciais para a

compreenso dos processos por trs de qualquer interao planta-patgeno.

EFETORES

Estudos envolvendo bactrias Gram-negativas com sistema de secreo tipo

III (T3SS) revelaram que estas bactrias secretam protenas no interior das clulas que

desencadeiam reaes de hipersensibilidade. Essas molculas foram portanto

chamadas de fatores de avirulncia. No entanto, as mesmas protenas cunhadas como

fatores de avirulncia foram encontradas contribuindo para a virulncia em relaes de

susceptibilidade. Deste modo, havia um impasse no uso do termo avirulncia porque

ele no era correto em todos os casos, demonstrando a necessidade de um termo

neutro. Da surgiu o termo efetores resolvendo o impasse e vem sendo aceito e

utilizado na fitopatologia.Alguns autores ainda insistem em definir efetores como molculas que

suprimem a defesa das plantas. Como j mencionado acima, este tipo de definio no

correta porque alguns efetores apresentam dualidades em sua funo dependendo do

hospedeiro, ou seja, pode ser relacionado tanto a patogenicidade ou ativao de

resistncia. Por muito tempo a definio mais aceita, proposta por Kamoun, 2009 era:

Efetores, molculas secretadas por um microrganismo que alteram a estrutura/funo

do hospedeiro. Esta definio perdeu um pouco de espao porque nem todos osefetores so secretados e nem sempre o organismo alvo um hospedeiro. Nesse


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sentido a definio de efetores mais correta e atual : molculas liberadas ou

associadas a um organismo que modificam a fisiologia de outro organismo.

Os efetores so divididos em apoplsticos e citoplasmticos em funo do

local de atuao. Os efetores secretados pelos patgenos durante a infeco podem se

acumular na superfcie exposta da clula ou nos espaos intercelulares (Fig. 2), sendo

classificados como efetores apoplsticos, e os efetores intracelulares ou

citoplasmticos, que so os que podem se translocar atravs da membrana celular e

tem contato direto com compartimentos subcelulares ou organelas (Block et al., 2008).

A estrutura tpica de um efetor citiplasmtico est representada na figura 3.

Os processos utilizados por bactrias fitopatognicas para inserir seus efetores

no interior das clulas dos hospedeiros so mais conhecidos quando comparados aos

de oomicetos e fungos. Os tipos de secreo de protenas em bactrias tm sido

bastante estudados ao longo do tempo. No entanto, pouco ainda se sabe sobre o

trafego de efetores para fungos e oomicetos. Sabe-se que alguns efetores apresentam

motivos especiais em sua cadeia que utilizam a prpria maquinaria da planta para

adentrarem no interior da clula, porm estes processos ainda no esto totalmente

esclarecidos e so necessrios novos mtodos que permitam a deteco e a

visualizao do trfego destes efetores at a clula hospedeira (PETREand KAMOUN2014).

Uma vez translocados no citoplamasma da planta, os efetores podem trafegar

para diferentes compartimentos subcelulares, incluindo organelas e vrios sub-

compartimentos da clula. Um grande nmero de efetores se acumula no ncleo da

planta como os TAL de Xanthomonas, SAP11 de fitoplasma, e CRNs e Crinklers de

Phytophthora que utilizam a importina para mediar a entrada no ncleo da planta

(Vandenackerveken, 1996; Bai et al., 2009; Schornack et al., 2010). O efetor TAL de

Xanthomonasatua diretamente no ncleo e ativa no hospedeiro genes envolvidos em

processos diversos como os que definem o tamanho das clulas, transporte de

acares e processos epigenticos (CHENet al.2010; DESOUZAet al.2012).

Em Phytophthora os efetores apoplsticos esto, geralmente, associados

inibio enzimtica (e.g. hidrolases) (TIANet al.2004, 2005, 2007; DAMASCENOet al.

2008), enquanto que o modo de ao dos efetores citoplasmticos em diferentescompartimentos sub-celulares ainda se obscura. Os efetores citoplasmticos so


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protenas modulares que carregam peptdeos N-terminais seguidos por motivos

conservados como os RxLR (R: arginina; x: qualquer aminocido; L: leucina; R:

arginina) (TYLERet al.2006; BIRCHet al.2006, 2008; KAMOUN2006, 2007, 2009;

MORGANand KAMOUN2007; WINet al.2007) (Fig. 3).

O motivo RxLR viabiliza a entrada de protenas que contem tal motivo no

interior da clula (BHATTACHARJEE et al. 2006; WHISSON et al. 2007; DOU et al.

2008; GROUFFAUDet al.2008). Um dos efetores RxLR mais estudados at ento o

AVR3a deP. infestans. O AVR3a suprime morte celular induzida pela elicitina INF-

1, tambm secretada porP. infestans. Em suma, INF-1 teria caractersticas de um

padro molecular associado ao patgeno (PAMP) que induziria morte celular. Em

contrapartida, o AVR3a suprime a ao deste PAMP, contribuindo para a virulnciado patgeno (BOSet al.2009).

Figura 2:Esquema ilustrativo da suscetibilidade desencadeada por efetores (ETS).Os patgenos de plantas como fungos, bactrias, oomicetos, vrus e nematidescolocam efetores no exterior da clula vegetal, os efetores apoplsticos (EA).Enquanto que os efetores citoplasmticos (EC) so liberados diretamente no interiorda clula, se ligando a diferentes protenas dos hospedeiros (alvos dos efetorescitoplasmticos (AEC). (Adaptado de (WIN et al. 2012b). Tanto os efetoresapoplsticos quanto os citoplasmticos tem o potencial de suprimir respostas dedefesa das plantas.


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Figura 3: Estrutura tpica de um efetor citoplasmtico. Todos os efetores,citoplasmticos ou apoplsticos apresentam um peptdeo sinal na posio N-terminalda molcula, condio obrigatria para todas as molculas secretadas. Os efetorescitoplasmticos apresentam ainda um motivo especial tambm na posio N-terminal.Motivos comuns so os RxLR e CRN que esto relacionados a translocao destesefetores pro interior da clula (estes motivos esto ausentes em efetores apoplsticos).

Na regio C-terminal encontra-se o domnio do efetor que est relacionado a sua

atividade/funo.ALVOS DOS EFETORES

Algumas atividades tpicas de efetores em inibio de defesa ou inibio do

reconhecimento da infeco pela planta incluem (GHREand ROBATZEK2008):

Inibio de enzimas (hidrolases) no apoplasto,

Inibio de ativao de PRRs,

Inibio de cascatas de sinalizao mediadas por MAP-quinases, Modificao do transcriptoma relacionado a respostas de defesa,

Reprogramao transcricional,

Degradao de componentes/protenas relacionadas a defesa,

Interferncia na secreo de protenas e trfego vesicular,

Secreo orquestrada de efetores

Os efetores precisam estar no local certo e no tempo certo para uma

colonizao de sucesso. Fungos fitopatognicos como Colletotrichum higginsianume

C. graminicola, infectando Arabidopsis thaliana e milho, respectivamente, usam

reguladores de transcrio para sntese e secreo de diferentes conjuntos de efetores

e importantes enzimas para as diferentes fases de infeco. A fase biotrfica

aumentada por efetores e enzimas do metabolismo secundrio, considerando que na

fase necrotrfica h a liberao de hidrolases e transportadores (OCONNELL et al.

2012). Em C. higginsianuma regulao ainda mais refinada sendo que no perodo


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anterior entrada do patgeno so liberados efetores ChCEs para preparar a entrada

na clula hospedeira (KLEEMANN et al. 2012). No oomiceto Phytophthora, vrios

efetores RxLR so induzidos no estdio de germinao do esporo ou na fase inicial da

infeco, e vrias protenas Nep1- indutoras de necrose (NLPs), so expressas em

estgios posteriores a infeco, sugerindo que contribuam para a fase necrotrfica

(QUTOBet al.2002; HAASet al.2009). Em P. infestans, um efetor conhecido como

SNE1 expresso durante a fase biotrfica, para suprimir morte celular que se

expressa durante a fase necrotrfica da infeco (KELLEYet al.2010). Uma vez que

os efetores chegam ao local certo nas clulas hospedeiras, no momento certo, eles

podem interagir com protenas do hospedeiro para exercer as suas funes para que a

invaso e colonizao sejam bem sucedidas (WINet al.2012a).

IMUNIDADE DESENCADEADA POR EFETORES (ETI)

A ETI ativada aps o reconhecimento por parte do hospedeiro de efetores

dos patgenos. Essas protenas dos patgenos so reconhecidas pelas protenas

intracelulares R dos hospedeiros, as quais possuem domnios NB-LRR (nucleotide

bindingleucin rich repeat) (Fig. 4) (WINet al.2012a). Esse reconhecimento pode ser

atravs da interao direta, e altamente especfica, entre as protenas

hospedeiro/patgeno de acordo com a teoria gene a gene (Flor, 1971; Boller & Felix,

2009). Contudo, os efetores podem ser reconhecidos de forma indireta, conhecida

como teoria guarda (Flor, 1971; Jones & Takemoto, 2004). Nesse reconhecimento

indireto, as protenas R reconhecem efetores ligados a protenas da planta chamadas

alvos de efetores de patgenos representados na Figura 4 como alvo dos efetores

citoplasmticos (AEC). A maior evidncia dessa teoria guarda foi encontrada no

sistema R/Avr entreArabidopsis thalianaePseudomonas syringaepv. Tomato,onde

RIN4 modificada pela Avr dessa bactria e essa modificao ativa a protena R

(RPM1) resultando na resistncia dessa planta (MACKEYet al.2002).


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Figura 4.Resposta da planta ao ataque de patgenos (bactrias, fungos e oomicetos)mostrando a imunidade desencadeada por efetor (ETI). Os patgenos secretam osefetores para dentro da planta hospedeira (efetores citoplasmticos, EC) atravs dosistema de secreo do tipo III, no caso das bactrias, ou por estruturas de infecoespecializadas chamadas de haustrios, por fungos e oomicetos. Os efetores trafegam

por vrios compartimentos, ligando-se, e manipulando diferentes protenas doshospedeiros chamadas de alvo. Este quando est localizado no citoplasma dohospedeiro designado como alvo dos efetores citoplasmticos (AEC). Em interaesincompatveis, os receptores intracelulares (NBS-RR) induzem a ETI aps oreconhecimento dos EC e/ou as interaes com AEC evitando assim a doena(Adaptado de Win et al., 2012b).

A maioria dos genesR codifica para uma protena que apresenta um domnio

central de ligao a nucleotdeos (NB), outro com regies repetidas ricas em leucina

(LRR), o qual medeia o reconhecimento de diversos efetores de todas as classes de

patgenos de plantas, e um terceiro domnio varivel no N-terminal que pode ser TIR

(Toll/Interleucina-1) ou CC (Coiled-coil) (Elmore et al., 2011; Gururani et al., 2012)

(Figura 5).

Alm das classes TIR e CC das protenas R, existem mais seis que sedestacam. Dentre elas est a eLRR que possui um domnio LRR extracelular ligado a

um domnio transmembrana (TrD) (GURURANIet al.2012) (Figura 5). A quarta classe

a LRR quinase, a qual apresenta um domnio intracelular de quinases serina/treonina

citoplasmticos, um domnio extracelular LRR e um domnio transmembrana (TrD)

(Afzal et al., 2008; Gururani et al., 2012) (Figura 5).

A quinta classe representada pelas protenas R que possuem um domnio

TrD, qual est ligado um domnio CC (WIN et al. 2012b) (Figura 5). Genes R

contendo os domnios LRR, seguido pelo domnio TrD ligado ao domnio PEST


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(prolina-glicina-serina-treonina) para degradao proteica, alm de pequenos motivos

de ECS (domnio de sinalizao celular de endocitose) representam a sexta classe

(GURURANIet al.2012).

A stima classe representada pelas protenas R que contm os domnios TIR-

NBS-LRR, alm de ter na extenso C-terminal um domnio putativo de sinal de

localizao nuclear (NLS) e um domnio WRKY, qual possui uma regio de 60

aminocidos que definida pela sequencia conservada WRKYGQK na regio N-

terminal, associada um motivozinc-finger(THOMMAet al.2011) (Figura 5).

E a ltima classe representada pelos genes R enzimticos, os quais no

possuem nenhum dos domnios LRR e NBS, como por exemplo, o geneHm1de milho

que fornece proteo contra o fungo patognico Cochliobolus carbonum(JOHALand

BRIGGS1992) (Figura 5).

Figura 5.Principais classes dos genes de resistncia de plantas baseado nos domniosfuncionais. NBS - stio de ligao a nucleotdeos; LRR - regies repetidas ricas emleucina; TIR - Toll/Interleucina-1; CC - Coiled-coil; TrD - domnio transmembrana;PEST - domnio de degradao proteica (prolina-glicina-serina-treonina); ECS -domnio de sinalizao celular de endocitose; NLS - sinal de localizao nuclear;WRKY e HM1 -uma redutase que inativa uma toxina (Adaptado de Win et al.,2012b).

Diferentes patgenos como bactrias, fungos, oomicetos e vrus que produzem

efetores para atacar diferentes plantas, que por sua vez, usam seus genes de resistncia

para evitar a doena (Tabela 2).


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Tabela 2.Interao dos efetores de diferentes patgenos com os genes Rde diversos

hospedeiros (Adaptado de (WINet al.2012b).

Patgenos Hospedeiros Efetores gene RBactrias

Xanthomonas oryzae Oryza sativa Avr-Xa1 Xa1

Xanthomonas oryzae Oryza sativa Avr-Xa21 Xa21

P. syringae Arabidopsis thaliana AvrRpm1 RPM1

P. syringae Arabidopsis thaliana AvrRpt2 RPS2

P. syringae Arabidopsis thaliana AvrPphB RPS5

FungosBlumeria graminis Hordeum vulgarae AvrMla Mla

Fusarium oxysporium

Lycopersicum

esculentum Avr1 I2

Melamspora lini Linum usitatissimum AyrL LMagnoporthe grisea Oryza sativa Avr-Pita Pi-ta

Puccinia graminis f sp.tritici Hordeum vulgarae Avr-Rpg1 Rpg1

OomicetosBremia lactucae Lactuca sativa Avr3 Dm3

Perenospora parasitica A. thaliana

AvrB,

AvrRPP1A RPP1

Phytophthora infestans Solanum tuberosum Avr1 R1

P. infestans Solanum demissum Avr3a R3a

Phytophthora sojae Glycine maxAvr1a, Avr3a

and Avr3c,Rps1a, Rps3a,

Rps3c

VrusBean dwarf mosaic

virus Phaseolus vulgaris Bdm BV1 protein

Cucumber mosaic virus A. thaliana

Vpg (viral

genomeelinked

protein)

At-eIF4E1

(cum1)

Potato virus X Solanum tuberosum Coat protein Rx1, Rx2

Soybean mosaic virus Glycine max

Hc-Pro and

P3 cistron Rsv1Turnip mosaic virus Arabidopsis thaliana VPg At-eIF(iso)4E

Quando a ETI ativada, a planta desencadeia uma rpida morte celular no

stio de infeco conhecida como reao de hipersensibilidade (HR, hypersensitive

response) (WINet al.2012a). Associada a HR, outras resposta de defesa so ativadas

como alteraes nos nveis de clcio no citoplasma, produo de espcies reativas de

oxignio e cascata de sinalizao via quinases. A amplificao desses sinais se d de

modo similar a PTI, por mensageiros secundrios como cido saliclico (SA), cido


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jasmnico (JA) e o etileno (ET) resultando na ativao de fatores de transcrio de

genes de defesa e, subsequentemente, na resistncia sistmica adquirida ou resistncia

sistmica induzida (TSUDAand KATAGIRI2010a).

Quando ocorre ETI, a resposta imune das plantas mais prolongada e possui

uma sinalizao dominante em relao PTI. Tsuda & Katagiri (2010b) propuseram

que a ETI tem uma rede de setores interligados, ou seja, quando o setor primrio,

por exemplo, o da via do SA comprometido por efetores de patgenos algum outro

setor como o da via do JA ativada garantindo assim a resistncia da planta ao ataque

do patgeno. Contudo, esse tipo de resistncia pode ser rapidamente superado pelo

patgeno atravs da aquisio de novos efetores, ou pela perda ou diversificao do

stio de reconhecimento do gene R para evitar a ETI (JONES and DANGL 2006).

Entretanto, a seleo natural resulta em novos alelos dos NB-LRR, que por sua vez,

podem reconhecer um desse novos efetores resultando novamente em ETI (JONESand

DANGL2006).

COMO PROCURAR EFETORES NO GENOMA DO PATGENO?

Secretadas na interface intercelular entre o patgeno e a planta ou translocadas

para o citoplasma das clulas hospedeiras, as molculas efetoras fazem parte de um

complexo arsenal molecular que o patgeno utiliza para colonizar os tecidos da planta

hospedeira (STERGIOPOULOS and WIT 2009). O fato destas protenas serem

obrigatoriamente secretadas do patgeno para o hospedeiro tornou-se a principal

caracterstica na sua busca, primeiramente in vivo, analisando o secretoma destes

microrganismos, e mais tarde in silico, na minerao de dados em busca destas

sequencias nos genomas dos patgenos.

Os primeiros experimentos realizados pelos fitopatologistas tinham como

objetivo conhecer um pouco mais sobre o secretoma dos patgenos e a natureza de

potenciais das protenas efetoras. Para tanto, a primeira estratgia utilizada foi a

clonagem molecular. O primeiro gene Avr clonado, em 1984, foi da bactria P.

syringaepv. Glycinea (STASKAWICZet al.1984), mais tarde, em 1991, foi a vez do

primeiro geneAvrde fungo, Cladosporium fulvum(VANKANet al.1991), e em 2004

o geneAvrdo oomicetoP. infestans(TIANet al.2004).


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Mas a necessidade de se conhecer melhor o sistema de secreo destas

protenas fez com que tcnicas de imunolocalizao e utilizao de transformantes

fossem empregadas nestes estudos, permitindo visualizar a complexidade dos

secretomas de fitopatgenos e seus hospedeiros, catalogar estes secretomas e fornecer

novos dados para elucidar os processos apoplsticos e a natureza do conjunto de

efetores secretados.

Simultaneamente, com a evoluo das tecnologias visando obter maior

nmero de dados, algumas abordagens para caracterizao de efetores em larga escala

se iniciaram. Uma destas abordagens o sistema de armadilha de sinal de secreo

em levedura (YSTsecretion trap library), onde feita uma biblioteca contendo a

seqncia codante completa do gene para expresso e outra onde as sequencias quecodificam o primeiro e segundo aminocido da protena, que so retirados via

oligonucleotdeos iniciadores (primers), por reao em cadeia da polimerase (do

ingls, polymerase chain reaction - PCR) tornando esta protena inativa quando

subclonada em vetor de expresso de protenas e expressas em leveduras. Para o

oomiceto P. infestans, forma identificados 23 genes que codificam protenas

secretadas, e todas estas protenas estavam localizadas nas folhas do hospedeiro e no

no miclio cultivado in vitro(LEEet al.2006). Para o fungo Uromyces fabae, foramencontrados 62 genes que codificam protenas secretadas pelo haustrio e 42 genes

que codificam protenas secretadas em esporos germinados, das quais 28 delas

apresentaram similaridade com protenas encontradas somente na ordem Uredinales,

indicando um possvel papel na virulncia e especificidade de hospedeiro (Link &

Voegele, 2008).

Associando esta tcnica ao sequenciamento, foi atribuda caracterizao de

efetores em larga escala uma nova abordagem, a clonagem de fragmentos genmicosdiretamente do sistema de secreo onde o DNA genmico do patgeno

fragmentado aleatoriamente em fragmentos de tamanho desejado, clonados em vetor e

sequenciados a fim de se identificar clones de DNA genmico nicos. Para U. maydis

estirpe haploide selvagem Um521, fragmentos do genoma com ~300pb foram

sequenciados e foi possvel identificar 52 clones nicos. A fim de se testar o papel

destes genes na infeco, foi utilizada a tcnica de mutantes nulos (knock-outs) para

diferentes genes. O knock-out duplo para genes envolvidos na patogenicidade noafetaram o crescimento da levedura, o acasalamento, a formao de hifas areas e a


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hidrofobicidade de superfcie, no entanto, o desenvolvimento patognico em plantas

logo aps a penetrao foi afetado, levando a perda da patogenicidade (KLEINet al.

1996).

Com o surgimento da tcnica de microarranjo (microarray), a avaliao da

expresso global de genes diferencialmente expressos em plantas infectadas com o

patgeno permitiu a identificao de genes que codificam protenas secretadas

durante o crescimento e infeco do patgeno (MOSQUERAet al.2009) e a descoberta

de novos locus associados a efetores. EmP. infestans, foi possvel descrever um novo

locus de avirulncia utilizando esta tcnica (QUTOBet al.2006), e emPectobacterium

atrosepticum foram caracterizadas protenas associadas ao sistema de secreo tipo

IV (MATTINEN et al. 2008) e protenas do qurum sensing, sistema que controla aproduo de enzimas de degradao de parede celular e outros fatores de virulncia

deste patgeno, principalmente aos fatores ligados sua disperso (LIUet al.2008).

Esta abordagem permite avaliar protenas efetoras envolvidas na penetrao do

patgeno na clula hospedeira (DOEHLEMANNet al.2008), na inibio da sntese de

resposta imune inata do hospedeiro (FONTANA et al. 2011), predio de novos

efetores cuja anotao dos domnios no est associada patogenicidade (SAUNDERS

et al. 2012) e a identificao de protenas efetoras associadas ao desenvolvimentosimbintico com o hospedeiro (PLETTet al.2014). Apesar da tcnica de microarray

ser considerada obsoleta para algumas reas da biologia molecular, para a descoberta

de novos efetores e elucidar sua forma de atuao na clula hospedeira, esta tcnica se

mostra bastante eficiente e ainda bastante utilizada.

Entretanto, o uso do sequenciamento na obteno do genoma completo dos

patgenos, primeiro pela metodologia de Sanger, depois pelo sequenciamento de nova

gerao (next generation sequence) que permitiram o aumento exponencial daquantidade de dados gerados e a possibilidade de se minerar novos genes candidatos a

efetores em diversas espcies de patgenos. As plataformas de sequenciamento mais

usadas atualmente para estes estudos so a 454 pirosequenciamento (454 Life Science

Roche Diagnostic), baseado na deteco do pirofosfato liberado na incorporao do

nucleotdeo na cadeia de DNA sintetizada; e sequenciamento Illumina (Illumina

sequencing Solexa), baseado na deteco dos nucleotdeos previamente marcados

com um fluorfo, durante a sntese da cadeia. Ambos geram sequencias curtas,entretanto, os fragmentos gerados pelo pirosequenciamento um pouco maior que o


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gerado pelo sequenciamento Illumina, 700 pb contra de 50 a 300 pb, conferindo uma

maior acurcia dos dados, 99,9% contra 98% obtidos no sequenciamento Illumina. O

pirosequenciamento gera um menor nmero de dados, cerca de um milho de

fragmentos, enquanto o Illumina gera mais de 3 milhes de fragmentos. Isto torna o

sequenciamento Illumina mais demorado, de um a 10 dias, dependendo do tamanho

do fragmento gerado; em contrapartida, o pirosequenciamento pode ser realizado em

24 horas. Em termos de custo, o sequenciamento Illumina mais vantajoso: US$ 0,05

a 0,15 por milho de bases, enquanto que, no pirosequenciamento o custo de

US$ 10 (LIUet al.2008; QUAIL et al.2012). Outro aspecto vantajoso de ambas as

plataformas a sua aplicao no s no sequenciamento de genomas mas tambm no

sequenciamento de transcriptoma do organismo, metodologia esta denominada

RNAseq.

O emprego desta tcnica, tanto na genmica como na transcriptmica, tem

gerado muitos trabalhos com fitopatgenos e a sua interao com o hospedeiro,

visando principalmente, a busca por molculas efetoras e a resposta adaptativa da

planta a estas molculas, evidenciando a coevoluo deste sistema. Como exemplo

desta abordagem, podemos citar a descoberta de um gene de virulncia envolvido na

induo de tumor em uma planta lenhosa (RODRGUEZ-PALENZUELA et al. 2010);microevoluo e relao filogentica de efetores P. syringae na adaptao ao

hospedeiro (CAI et al. 2011); anlise de polimorfismo das protenas candidatas a

efetoras secretadas pelo haustrio de Puccinia striiformis f. sp. tritici (CANTUet al.

2013); a identificao de genes candidatos a efetores no transcriptoma do nematoide

do n da raiz do arroz Meloidogyne graminicola(HAEGEMANet al.2013); busca por

genes efetores expressos na interao com o hospedeiro, no transcriptoma de

Melampsora lini(NEMRIet al.2014); comparao entre genomas da mesma espcie a

qual pertence o patgeno, avaliando a conservao das protenas efetoras ao longo do

tempo evolutivo (QI et al. 2011); e a identificao de efetores de domnio

caracterizado, como os RXLR, no genoma de patgenos de grande impacto na

economia agrcola (THAKURet al.2013).

Para que estas diversas abordagens tivessem sucesso, simultaneamente ao

aparecimento do sequenciamento de nova gerao, diversas ferramentas de

bioinformtica foram desenvolvidas, visando analisar o secretoma dos patgenospermitindo a predio de protenas efetoras e a minerao destas a partir de domnios


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caracterizados, como os RXLR. As ferramentas desenvolvidas para a predio de

protenas efetoras so baseadas nas caractersticas do peptdio sinal (do ingls,

secretion signal target) das protenas pertencentes aos cinco tipos de sistema de

secreo descrito para patgenos (PRESTON et al. 2005). O peptdeo sinal uma

pequena sequencia de aminocidos (entre 15 e 60), localizada na poro N-terminal

da protena, com a funo de marcar as protenas que sero exportadas pelo aparato de

secreo, seja atravs da interao direta com os componentes citoplasmticos ou

periplasmticos da maquinaria de secreo, ou atravs de um intermedirio, como as

chaperonas.

O peptdeo sinal Sec/SRPse caracteriza por compartilhar pequenas sequencias

que apresentam caractersticas em comum, como uma sequencia de carga positiva naporo N-terminal, uma sequencia de aminocidos hidrofbicos de 7 a 15

aminocidos e uma sequencia polar que contm o stio de clivagem AXA. Similares

a este, o peptdeo sinal TAT-especficosso um pouco mais longos, apresentam de 26

a 52 aminoacidos, devido a presena de uma regio N-terminal a mais. Estes

peptdeos apresentam o motivo S(T)-RRxhhh, onde h um resduo hidrofbico, e so

menos hidrofficos do que seus homlogos Sec, apresentando uma alta carga negativa

na poro N-terminal e positiva na poro C-terminal. Apesar da dificuldade de secaracterizar peptdeos sinais vinculados ao sistema de secreo tipo III superada

pela estrutura conservada destas protenas efetoras em mltiplos gneros de micrbios

patognicos de plantas. Estudo de mutao por deleo mostrou que a informao

essencial para a secreo destas protenas est localizada no 10 e 15 primeiros

aminocidos (PRESTON et al. 2005). Muitas das protenas de secreo do tipo III

requerem uma chaperona para sua secreo, que, a exemplo da protena HopPtoV que

necessita da ligao da chaperona ShcV na poro N-terminal de sua sequencia, entre

os aminocidos 76 e 125 (WEHLING et al. 2004). A fim de se identificar padres

associados com estas protenas, observou-se um vis nos primeiros 50 resduos de

aminocidos, com uma frequncia maior de serina e prolina nas primeiras cinco

posies, alm de um aminocido hidrofbico na posio 3 ou 4 e a falta de nas

primeiras 12 posies (GUTTMANet al.2002; PETNICKI-OCWIEJAet al.2002; ALFANO

and COLLMER2004), e ento foi possvel estabelecer parmetros para o treinamento

de mquina (learning machine) para seleo destas protenas a partir de um banco de

dados de protenas.


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Para os sistemas de secreo tipo I, II e V, as tentativas de se criar uma

ferramenta de bioinformtica para predio destas protenas no tem sido bem

sucedidas, pois, a exemplo do sistema de secreo tipo II, o sinal para que a protena

seja secretada depende da estrutura secundria ou terciria da protena. Alguns

estudos indicam que cada protena se dobrou e apresentou o motivo de secreo sua

maneira, o que resulta num alto grau de especificidade com a exoenzima, que ir atuar

neste motivo; e at comparaes estruturais tridimensionais de protenas secretadas

pelo mesmo sistema no revelam um padro de secreo unificado (BOULEY et al.

2001; CHAPONet al.2001). Alm disto, existem outros fatores a serem considerados,

como a proximidade dos genes que codificam para a maquinaria de transporte,

homologia com protenas ou domnios identificados previamente, e a presena de

sequencia promotora a montante do gene (do ingls, upstream).

A bem pouco tempo atrs, o sistema de secreo tipo IV tambm se

enquadrava neste panorama. Entretanto, atualmente, foram desenvolvidas algumas

ferramentas capazes de predizer protenas do sistema de secreo tipo IV, um sistema

homlogo aos sistemas de conjugao e ao sistema VirB de A. tumefaciens,

facilitando a translocao de DNA, e secretando tanto cidos nuclicos quanto

protenas. A disponibilidade destas ferramentas hoje s possvel graas aosequenciamento de diversos genomas de patgenos, pois so baseadas na triagem

feita nestes genomas associados a natureza bioqumica destas molculas. Basicamente,

o learning machine feito baseado nas seguintes caractersticas: busca pelo motivo

RRRSNTTTTY em 300 pb, denominado de novo motif search; homologia com

molculas efetoras conhecidas; presena de domnios eucariticos (no total, so 58

domnios); protenas com domnio de funo desconhecida (DUF); busca por

peptdeo sinal de localizao nuclear (NLS, do ingls, nuclear localization signal);

probabilidade com P>0,095 da protena possuir um sinal de localizao mitocondrial;

presena de um resduo de cistena seguido de dois resduos alifticos e um quarto

aminocido (CaaX); probabilidade de formao de estrutura em espiral nos 28

resduos da protena; basicidade C-terminal; hidrofobicidade da poro C-terminal e

global; e a presena do bloco EEXXE nos 30 aminocidos da poro C-terminal

(MEYERet al.2013).

Na Tabela 3 esto sumarizadas algumas destas ferramentas disponveis, tantopara anlises via internet, quanto para instalao da ferramenta na mquina.


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possvel observar o tipo de algoritmo utilizado para o desenvolvimento destas

ferramentas; para o sistema de secreo tipo III, com caractersticas mais bem

definidas, so utilizados principalmente o Modelo oculto de Markov (Hidden Markov

Model HMM), Mquina de vetores de suporte (Support Vector Machine) e Redes

neurais (do ingls, Neural Networks); enquanto que o sistema de secreo tipo IV,

mais complexo, utiliza uma forma modular escrita em Perl (linguagem de

programao estvel e multiplataforma).

Para facilitar ainda mais o uso de ferramentas de bioinformtica e possibilitar

ao usurio agrupar vrios softwares numa nica interface, surge o software Galaxy,

que executado na plataforma Linux/Unix e fornece ao usurio uma interface

baseada em navegador (COCKet al. 2013). Para a predio de sistemas de secreoem protenas h um repositrio (WHISSON et al. 2007) que contem as ferramentas

SignalP (PETERSENet al.2011), para a predio de peptdeo sinal; TMHMM, para a

predio de domnios trans-membrana(KROGHet al.2001); PSORTb (YUet al.2010),

para protenas de arquea/bactrias; WoLF PSORT (HORTON et al. 2007), para

protenas fngicas, animais e de plantas; Promoter , para promotores eucariticos para

polimerase II; e Oomycete RXLR motifs (WINet al.2007; WHISSONet al.2007), para

predio de motivos RXLR; onde o usurio entra com o arquivo fasta na pgina doGalaxy e o resultado mostrado na mesma interface, com possibilidade de download

dos dados.

Tabela 3 Ferramentas de bioinformtica desenvolvidas para predio de peptdeossinais (secreo) na poro N-terminal das protenas (adaptado de Preston et al.,2005)

Ferramenta Referncia Tipo de Algoritmo Sistema deSecreo

Caminho

CELLO v.2.5 (YU and LIN2004)

Mquina de vetores desuporte

Tipo III http://cello.life.nctu.edu.tw/

Phobius (KLL et al.2007)

Modelo oculto deMarkov

Tipo III http://phobius.binf.ku.dk/

PSORT-bv.3.0

(YU et al.2010)

Modelo oculto deMarkov eMquina de vetores desuporte

Tipo III http://psort.org/psortb/index.html

SigCleave (VON HEIJNE1986)

Matriz de contagem(Scoring matrix)

Tipo III http://emboss.sourceforge.net/

Parte do pacote deprogramas EMBOSS
http://cello.life.nctu.edu.tw/http://cello.life.nctu.edu.tw/http://phobius.binf.ku.dk/http://phobius.binf.ku.dk/http://psort.org/psortb/index.htmlhttp://psort.org/psortb/index.htmlhttp://psort.org/psortb/index.htmlhttp://emboss.sourceforge.net/http://emboss.sourceforge.net/http://emboss.sourceforge.net/http://emboss.sourceforge.net/http://psort.org/psortb/index.htmlhttp://psort.org/psortb/index.htmlhttp://phobius.binf.ku.dk/http://cello.life.nctu.edu.tw/


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SignalP4.1 (PETERSENet al.2011)

Redes neurais eModelo oculto deMarkov

Tipo III http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

SPEPlip (FARISELLIet al.2003)

Redes neurais Tipo III http://gpcr.biocomp.unibo.it/predictors/requer autenticao para o

usoSubLoc 1.0 (GUO et al.

2004)Mquina de vetores desuporte

Tipo III http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/~guotao/predict.html

Effective (JEHL et al.2011)

Banco de dados. Uneanotao motivos dediversos genomas peloPfam e SignalP para

predio de sinal desecreo

Tipo III http://effectors.org/

Galaxy (COCK et al.2013)

Interface baseada emnavegador. Usa

repositrios comalgumas ferramentas de

predio de protenassecretadas

Tipo III eIV

https://usegalaxy.org/

S4TE (MEYER etal.2013)

Perl Tipo IV http://sate.cirad.fr/

T4SE (WANGet al.2014)

Mquina de vetores desuporteMatriz de contagem(Scoring matrix)

Tipo IV http://biocomputer.bio.cuhk.edu.hk/softwares/T4SEpre/

T4EffPred (ZOU et al.2013)

Mquina de vetores desuporteMatriz de contagem(Scoring matrix)

Tipo IV http://bioinfo.tmmu.edu.cn/T4EffPred/prediction.html

OS EFETORES NA AGRICULTURA

Desde os primrdios da agricultura, fitopatgenos causam devastadoras

epidemias que afetaram a humanidade (AGRIOS 2004). A seleo de culturas

resistentes a doenas tem sido prtica comum no melhoramento de plantas. Para isso,

por um longo perodo o que foi feito em quase todas as culturas foi introduzir genesde resistncia a doenas (R) em novas variedades. Hoje sabido que os genes R esto

presentes em clusters multignicos e podem ocorrer naturalmente como verdadeiros

alelos atravs de variantes da gentica original (DANGLet al. 2013). A ativao da

funo de cada uma das protenas R feita pelo produto dos genes efetores de um

patgeno especfico de virulncia (FLOR 1971). Como mencionado anteriormente,

vrios efetores podem ser expressos por um nico patgeno e a diversidade de

efetores em uma populao de qualquer espcie patognica pode ser muito grande

(RAFFAELEet al.2010; BALTRUSet al.2011).
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/http://gpcr.biocomp.unibo.it/predictors/http://gpcr.biocomp.unibo.it/predictors/http://gpcr.biocomp.unibo.it/predictors/http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/~guotao/predict.htmlhttp://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/~guotao/predict.htmlhttp://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/~guotao/predict.htmlhttp://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/~guotao/predict.htmlhttp://effectors.org/http://effectors.org/https://usegalaxy.org/https://usegalaxy.org/http://sate.cirad.fr/http://sate.cirad.fr/http://biocomputer.bio.cuhk.edu.hk/softwares/T4SEpre/http://biocomputer.bio.cuhk.edu.hk/softwares/T4SEpre/http://biocomputer.bio.cuhk.edu.hk/softwares/T4SEpre/http://bioinfo.tmmu.edu.cn/T4EffPred/prediction.htmlhttp://bioinfo.tmmu.edu.cn/T4EffPred/prediction.htmlhttp://bioinfo.tmmu.edu.cn/T4EffPred/prediction.htmlhttp://bioinfo.tmmu.edu.cn/T4EffPred/prediction.htmlhttp://bioinfo.tmmu.edu.cn/T4EffPred/prediction.htmlhttp://biocomputer.bio.cuhk.edu.hk/softwares/T4SEpre/http://biocomputer.bio.cuhk.edu.hk/softwares/T4SEpre/http://sate.cirad.fr/https://usegalaxy.org/http://effectors.org/http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/~guotao/predict.htmlhttp://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/~guotao/predict.htmlhttp://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/~guotao/predict.htmlhttp://gpcr.biocomp.unibo.it/predictors/http://gpcr.biocomp.unibo.it/predictors/http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/


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No campo, a utilizao da maioria dos alelos do gene R pode ser de curta

durao, isto porque a sua implantao em monocultura foi selecionada para variantes

do patgeno, em que o alelo correspondente do efetor, sofreu mutao ou se perdeu.

Efetores so fatores de virulncia, mas cada um contribuindo parcialmente para a

virulncia. Efetores independentes podem atuar de forma redundante podendo assim,

alterar uma mesma via de sinalizao do hospedeiro. Portanto os genes efetores

podem ser perdidos sem causar impacto significativo na virulncia do patgeno.

Excees a este princpio so os efetores fundamentais, definidos operacionalmente

por sua ampla distribuio na populao de um determinado patgeno e sua

contribuio para a virulncia do mesmo (DANGLet al. 2013). As bases genmicas

so utilizadas para identificar efetores fundamentais e defini-los como funcionalmente

novos alelos R e suas atividades so usados como estratgia promissora para a

pesquisa e implantao de plantas resistentes a doenas.

Em 1986 foi demonstrado o sucesso da construo de uma planta transgnica

resistente doena. Esta planta apresentava expresso constitutiva de uma sequencia

gnica da protena da capa viral que conferiu resistncia ao vrus atravs de pequenos

RNAs. Hoje, este mecanismo conhecido e amplamente aplicvel para a inibio da

replicao viral (LINDBOand DOUGHERTY1991). A tabela 4 mostra um exemplo de

hbridos de abbora que adquiriram resistncia multiviral atravs da combinao de

genes da capa proteica de trs tipos diferentes de vrus. Em 1994, uma estratgia

semelhante foi implantada para combater o vrus da mancha anelar do mamoeiro, que

em testes de campo demonstrou excelente eficcia e frutos de alta qualidade (Tabela

4). Hoje este fruto aprovado para venda no Hava, Canad e Japo. No final de 1990,

desde a aprovao e comercializao dessas duas culturas, nenhuma nova cultura

modificada para resistncia a doena chegou ao mercado. A tabela 4 mostra algumas

pesquisas em outras culturas que apresentaram sucesso e ainda com potencial para

reduo de perdas de produo e insumos qumicos associados doena.

Outra estratgia para obteno de plantas resistentes a doena durvel o uso

de efetores alvos. Para isso, mesmo nos genomas de plantas mais complexas,

atualmente o uso da gentica e genmica uma realidade facilitando assim o

isolamento de gene R (PERIYANNAN et al. 2013; SAINTENAC et al. 2013). Com as

tecnologias rpidas e de baixo custo de sequenciamento de DNA, um novo patgeno

pode ser isolado e seu genoma gerar informaes com impacto sobre estratgias demelhoramento para um durvel controle de doenas de planta (VLEESHOUWERSet al.


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2011). Sendo agora possvel definir os genomas de isolados patognicos de plantas

infectadas e tambm de maneira rpida e eficiente, definir o complemento do efetor.

Usando ensaios de co-expresso transiente seguida por melhoramento de marcador

assistido ou desenvolvimento de transgnico, possvel definir os efetores

fundamentais que facilitam a identificao de genes R ativados pelos seus efetores

correspondentes de germoplasma selvagem. Esses novos genes R podem ser

validados pelo mtodo de edio de genoma que usa efetor ativador de transcrio de

nucleases (TALEN) (SCHORNACK et al. 2013) e tecnologia de repeties de

agrupados de palndromo curto intervalados regularmente (CRISPR) (JINEK et al.

2013; GAJet al.2014).

de grande importncia que a funo de qualquer gene R apenas ser durvel

se o efetor que o ativa estiver presente na estirpe patognica que a virulncia est

tentando ser controlada. Como por exemplo, o controle da doena da ferrugem tardia

da batata no qual o conhecimento do contedo de efetores em locais do patgeno

isolado pode informar a implantao do gene R ou tratamento qumico para o controle

desta doena (VLEESHOUWERSet al.2011).

O emprego de receptores de sistema imune tambm uma estratgia usada na

agricultura. Existem duas classes de receptores imunes e atualmente seguem duas

estratgias principais. A primeira para transferir PRRs que detectam produtos

microbianos comuns em espcies que no as tem. Isto , identificao funcional das

PRRs e sua transferncia para uma espcie receptora que no tenha um receptor

ortlogo e que poderia fornecer um caminho geral para exemplos adicionais de

repertrio ampliados de PRRs (DANGLet al.2013). Por exemplo, o receptor PRR EF-

Tu (EFR) reconhece o fator de traduo de alongamento EF-tu bacteriano. A

implantao de EFR em Nicotianabenthamianaou SolanumLycopersicum(tomate),

que no pode reconhecer o EF-Tu, conferiu resistncia a uma ampla gama de

patognicos bacterianos (LACOMBEet al.2010).

A segunda estratgia conhecida como estratgia de empilhamento no qual

explora respostas imunes em contextos em que vrios genes NLR so implantados

simultaneamente. Cultivares geradas por qualquer melhoramento molecular de DNA

assistido ou por transferncia gnica deve proporcionar resistncia mais durveis a

doenas porque a evaso de patgeno exigir mutaes em mltiplos genes efetores.

O acesso a uma enorme diversidade gentica permitido devido aos avanos emsequenciamento de DNA das principais culturas e seus parentais para uma grande


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quantidade de genes NLR funcionalmente dirigidos contra diferentes efetores

fundamentais (DANGLet al.2013). Baseado na descoberta do gene efetor avrBs2da

bacteria Xanthomonas perforans, agente causal da doena da pinta bacteriana do

pimento e do tomate, possibilitou a procura de um gene R potencialmente durvel.

Este gene encontrado na maioria das espcies de Xanthomonas que causam doena

e necessrio para a aptido do patgeno (KEARNEYand STASKAWICZ1990). Plantas

de tomates foram transformadas com o geneBs2, que um gene NLR isolado de uma

pimenta selvagem, Capsicuum chacoensee este, inibiu o crescimento de estirpes do

patgeno que foram transformadas com o gene avrBs2. Foram realizados ensaios de

campo com essas plantas transgnicas que expressam Bs2 de tomate, sem o uso de

produtos qumicos bactericidas, essas plantas demostraram robusta resistncia paraX.

perforans(HORVATHet al.2012).

Outra classe de genes relacionados resistncia de plantas a doena e que tem

evoludo para agregar funes de virulncia do patgeno criando armadilha para

impedir a proliferao do patgeno so chamados de executores e estes so

contrastantes aos PRRs e NLRs. Como por exemplo, em Xanthomonas e Ralstonia

foram identificados efetores de ativao de transcrio (TAL) que so protenas

secretadas dentro das clulas da planta que se ligam no DNA e ativam a expresso de

genes de acolhimento para melhorar a virulncia do patgeno (SCHORNACK et al.

2013). A expresso de um gene executor s ocorre pela induo de um efetor TAL

especfico e eles no so expressos na ausncia de infeco. Transformaes

utilizando genes executores foi demonstrado com sucesso em plantas de pimenta

(RMERet al.2009) e arroz (HUMMELet al.2012).

Estes foram alguns exemplos de aplicao dos efetores como ferramenta para

desenvolver novas variedades de plantas resistentes a doenas. Muitos so os desafios

e a rea a ser explorada ainda grande, porm as perspectivas de melhora dessas

estratgias avanam significativamente por causa dos estudos moleculares minuciosos

e continuo do sistema imunolgico das plantas cada vez mais rpido e com

tecnologias de sequenciamento de genomas cada vez mais baratas.


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Tabela 4. Exemplo de publicaes de culturas transformadas para resistncia doenas e situao atual das plantas.Ano de publicao Cultura Resistencia a Doena Mecanismo Estado de desenvolvimento2012 Tomate Pinta bacteriana geneR da pimenta 8 anos de ensaios em campo2012 Arroz Crestamento bacteriano e risca

bacterianaTransformada com geneE Laboratrio

2012 Trigo Bolor quebradio geneR do trigo superexpressado 2 anos de ensaio em campo ato momento da publicao

2011 Maa Crosta da Maa por fungus Gene tionina da cevada 4 anos de ensaio em campo ato momento da publicao

2011 Batata Virus Y da Batata Resistncia derivada depatgeno

1 ano de ensaio em campo at omomento da publicao

2010 Maa Fogo da ferrugem Protena antibacteriana da traa 12 anos de ensaio em campo ato momento da publicao

2010 Tomate Resistncia multibacteriana PRR deArabidopsis Escala de Laboratrio2010 Banana Murcha por Xanthomonas Gene raro de pimenta 2 anos em ensaio de campo2010 Laranja doce Resistncia/tolerncia

Xanthomonas axonopodispv. citriXa21 Green house

2009 Batata Requeima Genes R de parentais selvagens 3 anos em ensaio de campo2009 Batata Requeima Genes R de parental selvagem 2 anos de ensaio em campo at

o momento da publicao2008 Batata Requeima Genes R de parental selvagem 2 anos de ensaio em campo at

o momento da publicao2008 Ameixa Varola da ameixa Resistncia derivada de

patgenoRegulamentao aprovada, semvendas comerciais

2005 Arroz Risca bacteriana geneR do milho Laboratrio2002 Cevada Ferrugem da Haste Gene RLK da cultivar de

cevada resistenteLaboratrio

2001 Laranja doce Resistncia/tolerncia aPhytophthora citrophthora

PR-5 Green house

1997 Mamo Vrus da mancha anelar Resistncia derivada depatgeno

Aprovada e vendidacomercialmente desde 1998,vendido no Japo desde 2012

1995 Abbora Mosaico de trs vrus Resistncia derivada depatgeno

Aprovada e comercialmentevendida desde 1994.

1993 Batata Vrus X da batata Enzima induzida por interferondeMammalian

3 anos de ensaio em campo ato momento da publicao

Fonte: (DANGLet al.2013); e as informaes sobre laranja doce: (F AGOAGAet al.2001; MENDESet al.2010)


29/40

LITERATURA CITADA

AFZALA. J., WOODA. J., LIGHTFOOTD. a, 2008 Plant receptor-like serine threonine

kinases: roles in signaling and plant defense. Mol. Plant. Microbe. Interact. 21:50717.

AGRIOSG., 2004Plant pathology. Elsevier Academic Press.

ALFANOJ. R., COLLMERA., 2004 TYPE III SECRETION SYSTEM EFFECTORPROTEINS: Double Agents in Bacterial Disease and Plant Defense. Annu. Rev.Phytopathol. 42: 385414.

BAIX., CORREAV. R., TORUOT. Y., AMMARE.-D., KAMOUNS., HOGENHOUTS.A., 2009 AY-WB phytoplasma secretes a protein that targets plant cell nuclei.

Mol. Plant. Microbe. Interact. 22: 1830.

BALTRUSD. a, NISHIMURAM. T., ROMANCHUKA., CHANGJ. H., MUKHTARM. S.,CHERKISK., ROACHJ., GRANTS. R., JONESC. D., DANGLJ. L., 2011 Dynamicevolution of pathogenicity revealed by sequencing and comparative genomics of19 Pseudomonas syringae isolates. PLoS Pathog. 7: e1002132.

BASSEC. W., BOCKK., BOLLERT., 1992 Elicitors and suppressors of the defenseresponse in tomato cells. Purification and characterization of glycopeptideelicitors and glycan suppressors generated by enzymatic cleavage of yeastinvertase. J. Biol. Chem. 267: 1025810265.

BECKM., HEARDW., MBENGUEM., ROBATZEKS., 2012 The INs and OUTs ofpattern recognition receptors at the cell surface. Curr. Opin. Plant Biol. 15: 36774.

BHATTACHARJEES., HILLERN. L., LIOLIOSK., WINJ., KANNEGANTIT.-D., YOUNGC., KAMOUNS., HALDARK., 2006 The malarial host-targeting signal isconserved in the Irish potato famine pathogen. PLoS Pathog. 2: e50.

BIRCHP. R. J., BOEVINKP. C., GILROYE. M., HEINI., PRITCHARDL., WHISSONS.C., 2008 Oomycete RXLR effectors: delivery, functional redundancy anddurable disease resistance. Curr. Opin. Plant Biol. 11: 373379.

BIRCHP. R. J., REHMANYA. P., PRITCHARDL., KAMOUNS., BEYNONJ. L.,2006 Trafficking arms: oomycete effectors enter host plant cells. TrendsMicrobiol. 14: 811.

BLOCKA., LIG., FUZ. Q., ALFANOJ. R., 2008 Phytopathogen type III effectorweaponry and their plant targets. Curr. Opin. Plant Biol. 11: 396403.

BOLLERT., FELIXG., 2009 A renaissance of elicitors: perception of microbe-

associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognitionreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 60: 379406.


30/40

BOSJ. I. B., CHAPARRO-GARCIAA., QUESADA-OCAMPOL. M., MCSPADDENGARDENERB. B., KAMOUNS., 2009 Distinct amino acids of the Phytophthorainfestans effector AVR3a condition activation of R3a hypersensitivity andsuppression of cell death. Mol. Plant. Microbe. Interact. 22: 26981.

BOULEYJ., CONDEMINEG., SHEVCHIKV. E., 2001 The PDZ domain of OutC and theN-terminal region of OutD determine the secretion specificity of the type II outpathway of Erwinia chrysanthemi. J. Mol. Biol. 308: 205219.

BRUNNERF., ROSAHLS., LEEJ., RUDDJ. J., GEILERC., KAUPPINENS., RASMUSSENG., SCHEELD., NRNBERGERT., 2002 Pep-13, a plant defense-inducing

pathogen-associated pattern from Phytophthora transglutaminases. EMBO J. 21:66816688.

CAIR., LEWISJ., YANS., LIUH., CLARKEC. R., CAMPANILEF., ALMEIDAN. F.,STUDHOLMED. J., LINDEBERGM., SCHNEIDERD., ZACCARDELLIM., SETUBALJ.

C., MORALES-LIZCANON. P., BERNALA., COAKERG., BAKERC., BENDERC. L.,LEMANS., VINATZERB. a, 2011 The plant pathogen Pseudomonas syringae pv.tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomatoimmunity. PLoS Pathog. 7: e1002130.

CANTUD., SEGOVIAV., MACLEAND., BAYLESR., CHENX., KAMOUNS.,DUBCOVSKYJ., SAUNDERSD. G. O., UAUYC., 2013 Genome analyses of thewheat yellow (stripe) rust pathogen Puccinia striiformis f. sp. tritici reveal

polymorphic and haustorial expressed secreted proteins as candidate effectors.BMC Genomics 14: 270.

CHAPONV., CZJZEKM., HASSOUNIM. EL, PYB., JUYM., BARRASF., 2001 Type IIprotein secretion in gram-negative pathogenic bacteria: the study of thestructure/secretion relationships of the cellulase cel5 (formerly EGZ) fromErwinia chrysanthemi. J. Mol. Biol. 310: 10551066.

CHENL.-Q., HOUB.-H., LALONDES., TAKANAGAH., HARTUNGM. L., QUX.-Q.,GUOW.-J., KIMJ.-G., UNDERWOODW., CHAUDHURIB., CHERMAKD., ANTONYG., WHITEF. F., SOMERVILLES. C., MUDGETTM. B., FROMMERW. B.,2010 Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens.

Nature 468: 52732.

CHOIJ., TANAKAK., CAOY., QIY., QIUJ., LIANGY., LEES. Y., STACEYG.,2014 Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science 343: 2904.

COCKP. J. a, GRNINGB. a, PASZKIEWICZK., PRITCHARDL., 2013 Galaxy tools andworkflows for sequence analysis with applications in molecular plant pathology.PeerJ 1: e167.

DAMASCENOC. M. B., BISHOPJ. G., RIPOLLD. R., WINJ., KAMOUNS., ROSEJ. K.C., 2008 Structure of the glucanase inhibitor protein (GIP) family from

phytophthora species suggests coevolution with plant endo-beta-1,3-glucanases.Mol. Plant. Microbe. Interact. 21: 82030.


31/40

DANGLJ. L., HORVATHD. M., STASKAWICZB. J., 2013 Pivoting the Plant ImmuneSystem from Dissection to Deployment. Sci. 341 : 746751.

DARDICKC., SCHWESSINGERB., RONALDP., 2012 Non-arginine-aspartate (non-RD)kinases are associated with innate immune receptors that recognize conserved

microbial signatures. Curr. Opin. Plant Biol. 15: 35866.

DOEHLEMANNG., WAHLR., VRANESM., VRIESR. P. DE, KMPERJ., KAHMANNR.,2008 Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.J. Plant Physiol. 165: 2940.

DOUD., KALES. D., WANGX., JIANGR. H. Y., BRUCEN. a, ARREDONDOF. D.,ZHANGX., TYLERB. M., 2008 RXLR-mediated entry of Phytophthora sojaeeffector Avr1b into soybean cells does not require pathogen-encoded machinery.Plant Cell 20: 193047.

ELMOREJ. M., LINZ.-J. D., COAKERG., 2011 Plant NB-LRR signaling: upstreamsand downstreams. Curr. Opin. Plant Biol. 14: 36571.

FAGOAGAC., RODRIGOI., CONEJEROV., HINAREJOSC., TUSETJ., ARNAUJ., PINAJ.,NAVARROL., PEAL., 2001 Increased tolerance to Phytophthora citrophthora intransgenic orange plants constitutively expressing a tomato pathogenesis related

protein PR-5. Mol. Breed. 7: 175185.

FARISELLIP., FINOCCHIAROG., CASADIOR., 2003 SPEPlip: the detection of signalpeptide and lipoprotein cleavage sites. Bioinformatics 19: 24982499.

FLIEGMANNJ., MITHOFERA., WANNERG., EBELJ., 2004 An ancient enzyme domainhidden in the putative beta-glucan elicitor receptor of soybean may play anactive part in the perception of pathogen-associated molecular patterns during

broad host resistance. J. Biol. Chem. 279: 113240.

FLORH., 1971 Current status of the gene-for-gene concept. Annu. Rev. Phytopathol.:275296.

FONTANAM., BANGAS., BARRYK., SHENX., 2011 Secreted bacterial effectors thatinhibit host protein synthesis are critical for induction of the innate immune

response to virulent Legionella pneumophila. PLoS 7.

GAJT., GERSBACHC. A., BARBAS III C. F., 2014 ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31: 397405.

GHREV., ROBATZEKS., 2008 Breaking the barriers: microbial effector moleculessubvert plant immunity. Annu. Rev. Phytopathol. 46: 189215.

GMEZ-GMEZL., BOLLERT., 2000 FLS2: an LRR receptor-like kinase involved inthe perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Mol. Cell 5:10031011.


32/40

GROUFFAUDS., WESTP. VAN, AVROVAA. O., BIRCHP. R. J., WHISSONS. C.,2008 Plasmodium falciparum and Hyaloperonospora parasitica effectortranslocation motifs are functional in Phytophthora infestans. Microbiology 154:374351.

GUOT., HUAS., JIX., SUNZ., 2004 DBSubLoc: database of protein subcellularlocalization. Nucleic Acids Res. 32: D1224.

GURURANIM. A., VENKATESHJ., UPADHYAYAC. P., NOOKARAJUA., PANDEYS. K.,PARKS. W., 2012 Plant disease resistance genes: Current status and futuredirections. Physiol. Mol. Plant Pathol. 78: 5165.

GUTTMAND. S., VINATZERB. A., SARKARS. F., RANALLM. V, KETTLERG.,GREENBERGJ. T., 2002 A functional screen for the type III (Hrp) secretome ofthe plant pathogen Pseudomonas syringae. Science 295: 17221726.

HAASB. J., KAMOUNS., ZODYM. C., JIANGR. H. Y., HANDSAKERR. E., CANOL.M., GRABHERRM., KODIRAC. D., RAFFAELES., TORTO-ALALIBOT., BOZKURTT. O., AH-FONGA. M. V, ALVARADOL., ANDERSONV. L., ARMSTRONGM. R.,AVROVAA., BAXTERL., BEYNONJ., BOEVINKP. C., BOLLMANNS. R., BOSJ. I.B., BULONEV., CAIG., CAKIRC., CARRINGTONJ. C., CHAWNERM., CONTIL.,COSTANZOS., EWANR., FAHLGRENN., FISCHBACHM. A., FUGELSTADJ.,GILROYE. M., GNERRES., GREENP. J., GRENVILLE-BRIGGSL. J., GRIFFITHJ.,GRNWALDN. J., HORNK., HORNERN. R., HUC.-H., HUITEMAE., JEONGD.-H., JONESA. M. E., JONESJ. D. G., JONESR. W., KARLSSONE. K., KUNJETIS.G., LAMOURK., LIUZ., MAL., MACLEAND., CHIBUCOSM. C., MCDONALDH.,MCWALTERSJ., MEIJERH. J. G., MORGANW., MORRISP. F., MUNROC. A.,ONEILLK., OSPINA-GIRALDOM., PINZNA., PRITCHARDL., RAMSAHOYEB.,RENQ., RESTREPOS., ROYS., SADANANDOMA., SAVIDORA., SCHORNACKS.,SCHWARTZD. C., SCHUMANNU. D., SCHWESSINGERB., SEYERL., SHARPET.,SILVARC., SONGJ., STUDHOLMED. J., SYKESS., THINESM., VONDERVOORTP.J. I. VAN DE, PHUNTUMARTV., WAWRAS., WEIDER., WINJ., YOUNGC., ZHOUS., FRYW., MEYERSB. C., WESTP. VAN, RISTAINOJ., GOVERSF., BIRCHP. R.J., WHISSONS. C., JUDELSONH. S., NUSBAUMC., 2009 Genome sequence andanalysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans. Nature 461:3938.

HAEGEMANA., BAUTERSL., KYNDTT., RAHMANM. M., GHEYSENG.,2013 Identification of candidate effector genes in the transcriptome of the riceroot knot nematode Meloidogyne graminicola. Mol. Plant Pathol. 14: 37990.

HALITSCHKER., SCHITTKOU., POHNERTG., BOLANDW., BALDWINI. T.,2001 Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta(Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuata. III. Fattyacid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary andsufficient for herbivore-specifi. Plant Physiol. 125: 7117.

HEIJNEG. VON, 1986 A new method for predicting signal sequence cleavage sites.

Nucleic Acids Res. 14: 46834690.


33/40

HORTONP., PARKK.-J., OBAYASHIT., FUJITAN., HARADAH., ADAMS-COLLIERC.J., NAKAIK., 2007 WoLF PSORT: protein localization predictor. Nucleic AcidsRes. 35: W5857.

HORVATHD. M., STALLR. E., JONESJ. B., PAULYM. H., VALLADG. E., DAHLBECK

D., STASKAWICZB. J., SCOTTJ. W., 2012 Transgenic resistance conferseffective field level control of bacterial spot disease in tomato. PLoS One 7:e42036.

HUMMELA. W., DOYLEE. L., BOGDANOVEA. J., 2012 Addition of transcriptionactivator-like effector binding sites to a pathogen strain-specific rice bacterial

blight resistance gene makes it effective against additional strains and againstbacterial leaf streak. New Phytol. 195: 88393.

JEHLM.-A., ARNOLDR., RATTEIT., 2011 Effective--a database of predicted secretedbacterial proteins. Nucleic Acids Res. 39: D5915.

JINEKM., EASTA., CHENGA., LINS., MAE., DOUDNAJ., 2013 RNA-programmedgenome editing in human cells. Elife 2: e00471.

JOHALG. S., BRIGGSS. P., 1992 Reductase activity encoded by the HM1 diseaseresistance gene in maize. Science 258: 9857.

JONESJ. D. G., DANGLJ. L., 2006 The plant immune system. Nature 444: 3239.

JONESD. a, TAKEMOTOD., 2004 Plant innate immunitydirect and indirectrecognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr. Opin.Immunol. 16: 4862.

KLLL., KROGHA., SONNHAMMERE. L. L., 2007 Advantages of combinedtransmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.

Nucleic Acids Res. 35: W42932.

KAMOUNS., 2006 A Catalogue of the Effector Secretome of Plant PathogenicOomycetes. Annu. Rev. Phytopathol. 44: 4160.

KAMOUNS., 2007 Groovy times: filamentous pathogen effectors revealed. Curr.

Opin. Plant Biol. 10: 35865.

KAMOUNS., 2009 The Secretome of Plant-Associated Fungi and Oomycetes. In:Deising H (Ed.), lant Relationships , 2nd Edition - The Mycota V, Berlin, pp.173180.

KANJ. VAN, ACKERVEKENG. VAN DER, WITP. DE, 1991 Cloning andCharacterization of cDNA os Avirulence Gene avr9 of the Fungal PathogenCladosporium fulvum, Causal Agent of Tomato Leaf. Mol. Plant- 4: 5259.

KEARNEYB., STASKAWICZB. J., 1990 Widespread distribution and fitness

contribution of Xanthomonas campestris avirulence gene avrBs2. Nature 346:385386.


34/40

KELLEYB. S., LEES.-J., DAMASCENOC. M. B., CHAKRAVARTHYS., KIMB.-D.,MARTING. B., ROSEJ. K. C., 2010 A secreted effector protein (SNE1) fromPhytophthora infestans is a broadly acting suppressor of programmed cell death.Plant J. 62: 35766.

KLEEMANNJ., RINCON-RIVERAL. J., TAKAHARAH., NEUMANNU., LOREN VANTHEMAATE. VER, THEMAATE. V. L. VAN, DOESH. C. VAN DER, HACQUARDS.,STBERK., WILLI., SCHMALENBACHW., SCHMELZERE., OCONNELLR. J.,2012 Sequential delivery of host-induced virulence effectors by appressoria andintracellular hyphae of the phytopathogen Colletotrichum higginsianum. (BJHowlett, Ed.). PLoS Pathog. 8: e1002643.

KLEINR. D., GUQ., GODDARDa, ROSENTHALa, 1996 Selection for genes encodingsecreted proteins and receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 710813.

KROGHA., LARSSONB., HEIJNEG. VON, SONNHAMMERE. L. L., 2001 Predicting

transmembrane protein topology with a hidden markov model: application tocomplete genomes. J. Mol. Biol. 305: 567580.

KROLE., MENTZELT., CHINCHILLAD., BOLLERT., FELIXG., KEMMERLINGB.,POSTELS., ARENTSM., JEWORUTZKIE., AL-RASHEIDK. A. S., BECKERD.,HEDRICHR., 2010 Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologueAtPEPR2. J. Biol. Chem. 285: 1347113479.

KUNZEG., ZIPFELC., ROBATZEKS., NIEHAUSK., BOLLERT., FELIXG., 2004 The NTerminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity inArabidopsis Plants. 16: 34963507.

LACOMBES., ROUGON-CARDOSOA., SHERWOODE., PEETERSN., DAHLBECKD.,ESSEH. P. VAN, SMOKERM., RALLAPALLIG., THOMMAB. P. H. J., STASKAWICZB., JONESJ. D. G., ZIPFELC., 2010 Interfamily transfer of a plant pattern-recognition receptor confers broad-spectrum bacterial resistance. Nat Biotech 28:365369.

LEES.-J., KELLEYB. S., DAMASCENOC. M. B., ST JOHNB., KIMB.-S., KIMB.-D.,ROSEJ. K. C., 2006 A functional screen to characterize the secretomes of

eukaryotic pathogens and their hosts in planta. Mol. Plant. Microbe. Interact. 19:136877.

LINDBOJ., DOUGHERTYW., 1991 -derived resistance to a potyvirus: immune andresistant phenotypes in transgenic tobacco expressing altered forms of a

potyvirus coat protein nucleotide sequence. Mol. plant-microbe Interact. .

LINK T. I., VOEGELE R. T., 2008 Secreted proteins of Uromyces fabae: similaritiesand stage specificity. Mol. Plant Pathol. 9: 5966.

LIUH., COULTHURSTS., PRITCHARDL., 2008 Quorum sensing coordinates brute

force and stealth modes of infection in the plant pathogen Pectobacteriumatrosepticum. Pathog. 4.


35/40

LIUB., LIJ.-F., AOY., QUJ., LIZ., SUJ., ZHANGY., LIUJ., FENGD., QIK., HEY.,WANGJ., WANGH.-B., 2012 Lysin Motif-Containing Proteins LYP4 and LYP6Play Dual Roles in Peptidoglycan and Chitin Perception in Rice InnateImmunity. Plant Cell 24: 34063419.

MAY., WALKERR. K., ZHAOY., BERKOWITZG. a, 2012 Linking ligand perceptionby PEPR pattern recognition receptors to cytosolic Ca2+ elevation anddownstream immune signaling in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109:198527.

MACKEYD., HOLTB. F., WIIGA., DANGLJ. L., 2002 RIN4 interacts withPseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cell 108: 74354.

MATTINENL., SOMERVUOP., NYKYRIJ., NISSINENR., KOUVONENP., CORTHALSG.,AUVINENP., AITTAMAAM., VALKONENJ., PIRHONENM., 2008 Microarray

profiling of host-extract-induced genes and characterization of the type VIsecretion cluster in the potato pathogen Pectobacterium atrosepticum.Microbiology 154: 23872396.

MEDZHITOVR., JANEWAYC. a, 1997 Innate immunity: the virtues of a nonclonalsystem of recognition. Cell 91: 2958.

MENDESB. M. J., CARDOSOS. C., BOSCARIOL-CAMARGOR. L., CRUZR. B.,MOURO FILHOF. a. a., BERGAMIN FILHOa., 2010 Reduction in susceptibilityto Xanthomonas axonopodis pv. citri in transgenic Citrus sinensis expressing therice Xa21 gene. Plant Pathol. 59: 6875.

MEYERD. F., NOROYC., MOUMNEA., RAFFAELES., ALBINAE., VACHIRYN.,2013 Searching algorithm for type IV secretion system effectors 1.0: a tool for

predicting type IV effectors and exploring their genomic context. Nucleic AcidsRes. 41: 921829.

MITHFERA., BOLANDW., 2008 Recognition of herbivory-associated molecularpatterns. Plant Physiol. 146: 82531.

MIYAA., ALBERTP., SHINYAT., DESAKIY., ICHIMURAK., SHIRASUK., NARUSAKA

Y., KAWAKAMIN., KAKUH., SHIBUYAN., 2007 CERK1, a LysM receptorkinase, is essential for chitin elicitor signaling in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 104: 1961319618.

MONAGHANJ., ZIPFELC., 2012 Plant pattern recognition receptor complexes at theplasma membrane. Curr. Opin. Plant Biol. 15: 34957.

MORGANW., KAMOUNS., 2007 RXLR effectors of plant pathogenic oomycetes.Curr. Opin. Microbiol. 10.

MOSQUERAG., GIRALDOM. C., KHANGC. H., COUGHLANS., VALENTB.,

2009 Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4


36/40

as Biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. Plant Cell 21:127390.

NEMRIA., SAUNDERSD. G. O., ANDERSONC., UPADHYAYAN. M., WINJ.,LAWRENCEG. J., JONESD. a, KAMOUNS., ELLISJ. G., DODDSP. N., 2014 The

genome sequence and effector complement of the flax rust pathogenMelampsora lini. Front. Plant Sci. 5: 98.

OCONNELLR. J., THONM. R., HACQUARDS., AMYOTTES. G., KLEEMANNJ.,TORRESM. F., DAMMU., BUIATEE. A., EPSTEINL., ALKANN., ALTMLLERJ.,ALVARADO-BALDERRAMAL., BAUSERC. A., BECKERC., BIRRENB. W., CHENZ., CHOIJ., CROUCHJ. A., DUVICKJ. P., FARMANM. A., GANP., HEIMAND.,HENRISSATB., HOWARDR. J., KABBAGEM., KOCHC., KRACHERB., KUBOY.,LAWA. D., LEBRUNM.-H., LEEY.-H., MIYARAI., MOOREN., NEUMANNU.,

NORDSTRMK., PANACCIONED. G., PANSTRUGAR., PLACEM., PROCTORR. H.,PRUSKYD., RECHG., REINHARDTR., ROLLINSJ. A., ROUNSLEYS., SCHARDLC.

L., SCHWARTZD. C., SHENOYN., SHIRASUK., SIKHAKOLLIU. R., STBERK.,SUKNOS. A., SWEIGARDJ. A., TAKANOY., TAKAHARAH., TRAILF., DOESH.C. VAN DER, VOLLL. M., WILLI., YOUNGS., ZENGQ., ZHANGJ., ZHOUS.,DICKMANM. B., SCHULZE-LEFERTP., LOREN VAN THEMAATE. VER, MAL.-J.,VAILLANCOURTL. J., 2012 Lifestyle transitions in plant pathogenicColletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nat.Genet. 44: 10605.

PERIYANNANS., MOOREJ., AYLIFFEM., BANSALU., 2013 The gene Sr33, anortholog of barley Mla genes, encodes resistance to wheat stem rust race Ug99.Science (80-. ).: 783786.

PETERSENT. N., BRUNAKS., HEIJNEG. VON, NIELSENH., 2011 SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nat Meth 8: 785786.

PETNICKI-OCWIEJAT., SCHNEIDERD. J., TAMV. C., CHANCEYS. T., SHANL., JAMIRY., SCHECHTERL. M., JANESM. D., BUELLC. R., TANGX., COLLMERA.,ALFANOJ. R., 2002 Genomewide identification of proteins secreted by the Hrptype III protein secretion system of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99: 76527.

PETREB., KAMOUNS., 2014 How do filamentous pathogens deliver effector proteinsinto plant cells? (JM McDowell, Ed.). PLoS Biol. 12: e1001801.

PLETTJ. M., KEMPPAINENM., KALES. D., KOHLERA., LEGUV., BRUNA., TYLERB. M., PARDOA. G., MARTINF., 2014 A Secreted Effector Protein of Laccaria

bicolor Is Required for Symbiosis Development. Curr. Biol. 21: 11971203.

PRESTONG., STUDHOLMED. J., CALDELARII., 2005 Profiling the secretomes of plantpathogenic Proteobacteria. FEMS Microbiol. 29: 331360.


37/40

QIM., WANGD., BRADLEYC. a, ZHAOY., 2011 Genome sequence analyses ofPseudomonas savastanoi pv. glycinea and subtractive hybridization-basedcomparative genomics with nine pseudomonads. PLoS One 6: e16451.

QUAILM. a, SMITHM., COUPLANDP., OTTOT. D., HARRISS. R., CONNORT. R.,

BERTONIA., SWERDLOWH. P., GUY., 2012 A tale of three next generationsequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences andIllumina MiSeq sequencers. BMC Genomics 13: 341.

QUTOBD., KAMOUNS., GIJZENM., 2002 Expression of a Phytophthora sojaenecrosis-inducing protein occurs during transition from biotrophy tonecrotrophy. Plant J. 32: 36173.

QUTOBD., TEDMAN-JONESJ., GIJZENM., 2006 Effector-triggered immunity by theplant pathogen Phytophthora. Trends Microbiol. 14.

RAFFAELES., FARRERR., CANOL., 2010 Genome evolution following host jumps inthe Irish potato famine pathogen lineage. Science (80-. ). 330: 15403.

RAMOSH. C., RUMBOM., SIRARDJ.-C., 2004 Bacterial flagellins: mediators ofpathogenicity and host immune responses in mucosa. Trends Microbiol. 12:50917.

RODRGUEZ-PALENZUELAP., MATASI. M., MURILLOJ., LPEZ-SOLANILLAE.,BARDAJIL., PREZ-MARTNEZI., RODRGUEZ-MOSKERAM. E., PENYALVERR.,LPEZM. M., QUESADAJ. M., BIEHLB. S., PERNAN. T., GLASNERJ. D., CABOTE. L., NEENO-ECKWALLE., RAMOSC., 2010 Annotation and overview of thePseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 draft genome reveals thevirulence gene complement of a tumour-inducing pathogen of woody hosts.Environ. Microbiol. 12: 160420.

RMERP., RECHTS., LAHAYET., 2009 A single plant resistance gene promoterengineered to recognize multiple TAL effectors from disparate pathogens. Proc.

Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106: 2052631.

RONM., AVNIA., 2004 The Receptor for the Fungal Elicitor Ethylene-InducingXylanase Is a Member of a Resistance-Like Gene Family in Tomato. 16: 1604

1615.

SAINTENACC., ZHANGW., SALCEDOA., ROUSEM., TRICKH., AKHUNOVE.,DUBCOVSKYJ., 2013 Identification of Wheat Gene Sr35 That Confers Resitenceto Ug99 Stem Rust Race Group. Sciencexpress: 14.

SAUNDERSD., WINJ., CANOL., SZABOL., 2012 Using hierarchical clustering ofsecreted protein families to classify and rank candidate effectors of rust fungi.PLoS One 7.

SCHMELZE. a, LECLERES., CARROLLM. J., ALBORNH. T., TEALP. E. a,

2007 Cowpea chloroplastic ATP synthase is the source of multiple plant defenseelicitors during insect herbivory. Plant Physiol. 144: 793805.


38/40

SCHORNACKS., DAMMEM. VAN, BOZKURTT. O., CANOL. M., SMOKERM., THINESM., GAULINE., KAMOUNS., HUITEMAE., 2010 Ancient class of translocatedoomycete effectors targets the host nucleus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107:174216.

SCHORNACKS., MOSCOUM. J., WARDE. R., HORVATHD. M., 2013 EngineeringPlant Disease Resistance Based on TAL Effectors. Annu. Rev. Phytopathol. 51:383406.

SHANL., HEP., SHEENJ., 2007 Endless Hide-and-Seek: Dynamic Co-evolution inPlant-Bacterium Warfare. J. Integr. Plant Biol. 49: 105111.

SHINYAT., MOTOYAMAN., IKEDAA., WADAM., KAMIYAK., HAYAFUNEM., KAKUH., SHIBUYAN., 2012 Functional characterization of CEBiP and CERK1homologs in arabidopsis and rice reveals the presence of different chitin receptorsystems in plants. Plant Cell Physiol. 53: 16961706.

SOUZAT. A. DE, SOPRANOA. S., LIRAN. P. V. DE, QUARESMAA. J. C., PAULETTIB.A., PAES LEMEA. F., BENEDETTIC. E., 2012 The TAL effector PthA4 interactswith nuclear factors involved in RNA-dependent processes including a HMG

protein that selectively binds poly(U) RNA. (J Qiu, Ed.). PLoS One 7: e32305.

STASKAWICZB., DAHLBECKD., KEENN., 1984 Cloned avirulence gene ofPseudomonas syringae pv. glycinea determines race-specific incompatibility onGlycine max (L.) Merr. Proc. 81: 60246028.

STERGIOPOULOSI., WITP. de, 2009 Fungal effector proteins. Annu. Rev.Phytopathol. 47: 233263.

THAKURK., CHAWLAV., BHATTIS., SWARNKARM. K., KAURJ., SHANKARR., JHAG., 2013 De novo transcriptome sequencing and analysis for Venturiainaequalis, the d

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RAPP 2014 Dalio et al - final (1).pdf