Quimioluminiscencia: una interesante alternativa para la detección

Ars Pharmaceutica, 42:1; 81-107, 2001

81QUIMIOLUMINISCENCIA: UNA INTERESANTE ALTERNATIVA PARA LA DETECCIÓN ANALÍTICA EN SISTEMAS DE FLUJO

Quimioluminiscencia: una interesante alternativapara la detección analítica en sistemas de flujo

Unfamiliar though exciting analytical detection in flowing streams:chemiluminescence

GARCÍA-CAMPAÑA, AM.1, BAEYENS WRG2; ZHANG X3; ALÉS F1, GÁMIZ L1.

1 University of Granada, Faculty of Sciences, Dept. of Analytical Chemistry,Avda. Fuentenueva s/n, E-18071 Granada, Spain

2 Ghent University, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Dept. of Pharmaceutical Analysis,Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent, Belgium

3Tsinghua University, Dept. of Chemistry, Analysis Center, Tsinghua Yuan, Beijing 100084, P. R. China

RESUMEN

El estudio del tipo de interacción involucrada en la formación de dispersiones sólidas de tolbutamida con distintasproporciones de acetamida y propianamida, ha requerido del diseño y validación de un método analítico por cromatografíalíquida de alta eficacia (CLAE) que permita cuantificar la proporción de los transportadores en mezclas físicas y endispersión sólida. El método resultó ser lineal, preciso y exacto en el intervalo de concentración de 100-1,56 µµµµµg/mLpara tolbutamida y 50-0,781 µµµµµg/mL para acetamida y propianamida.PALABRAS CLAVE: tolbutamida, propianamida, acetamida, cromatografía líquida, CLAE.

ABSTRACT

The interest to design and validate a high performance liquid chromatography method for quantification of tolbutamide,acetamide and propianamide in solid dispersions, was to find a relation among the amount of carriers and the activesubstance in solid dispersions, in order to further investigate the drug-carrier interaction pattern responsible of soliddispersion formation. The method was lineal, precise and accurate in the concentration range between 100.0 - 1.56 µµµµµg/mL for tolbutamide and 50.0 - 0.78 µµµµµg/mL for acetamide and propianamide.KEY WORDS: tolbutamide, propianamide, acetamide, HPLC.

INTRODUCCIÓN

El uso analítico de la quimioluminiscencia (QL)está experimentando un creciente interés, ya querepresenta una alternativa simple, barata y sen-sible para cuantificar una gran variedad de com-puestos.

Desde hace unos treinta años, el fenómeno dela luminiscencia -originalmente una curiosidaddel laboratorio físico-, se ha convertido en unarama de la espectrometría aplicada, dentro de laquímica analítica. Debido a la nueva instrumen-

INTRODUCTION

Chemiluminescence(CL)-based analysis isgrowing fast offering simple, low cost and sen-sitive means of measuring a variety of compounds.

Since over 30 years, the phenomenon ofluminescence -originally a curiosity in the phy-sical laboratory- has provided a well-establishedand widely applied spectrometric branch of analy-tical chemistry. Owing to elegant new instru-mentation and especially to new techniques, someof which entirely new and some borrowed from

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GARCÍA-CAMPAÑA AM, BAEYENS WR, ZHANG X, ALÉS F, GÁMIZ L.

tación y, especialmente a la incorporación detécnicas modernas, algunas nuevas y otras toma-das de otras disciplinas, la QL y la bioluminis-cencia (BL) se aplican de forma rutinaria en elanálisis tanto cuali- como cuantitativo.

Aunque el fenómeno de la QL se conoce desde300 años a.C., el desarrollo de aplicaciones ana-líticas es relativamente reciente. Debido a su altasensibilidad y selectividad, los métodos basadosen detecciones QL suponen una herramientaanalítica de gran utilidad. La primera aplicaciónde la QL como técnica analítica la llevó a caboErdey en 1957, que estudió el uso de variassustancias, como luminol, lofina y lucigenina,como indicadores volumétricos. Las investiga-ciones sobre el potencial analítico de la QL paraanálisis de rutina datan de los años 70, en elcaso de reacciones en fase gaseosa, y de la dé-cada de los 80 para reacciones en fase líquida.Desde entonces, los métodos quimioluminiscen-tes han sido más ampliamente utilizados, funda-mentalmente en análisis bioquímico y ambien-tal, y el número de publicaciones y comunicacionessobre el tema ha ido incrementando de formaexponencial desde la celebración del primer Sim-posium Internacional sobre Bioluminiscencia yQuimioluminiscencia, celebrado en Bruselas en1978. De hecho, en el desarrollo de métodos QLpueden diferenciarse dos periodos: una primeraetapa (1928-1940) caracterizada por la búsquedade nuevos compuestos o sistemas quimiolumi-niscentes, por medio de modificaciones quími-cas de estructuras bien conocidas, y, desde la 2ªGuerra Mundial hasta el presente, un avance enla instrumentación, junto con el desarrollo deconceptos teóricos de los, a veces, complejosprincipios de la QL.

Las grandes aplicaciones analíticas de la QLcomo método de detección en inyección en flu-jo, cromatografía líquida (CL) y electroforesiscapilar (EC), junto con el gran potencial del in-munoensayo, hacen de esta técnica un campo deinvestigación muy interesante en una ampliavariedad de disciplinas, que incluyen técnicas deseparación en análisis químico, biológico, far-macéutico, biomédico y alimentario, control decalidad, etc.

Las tendencias más actuales en química ana-lítica implican la aplicación de la QL como sis-tema de detección, combinada con EC comométodo previo de separación, proporcionando unaselectividad y sensibilidad analítica excelentes y

other disciplines, CL and bioluminescence canbe routinely applied to qualitative and quantita-tive analytical problems.

Although the luminescence phenomena areknown since over 300 years before Christ, thedevelopment of CL analytical applications isrelatively recent. Due to its high sensitivity andselectivity, CL-based detection has become qui-te a useful analytical technique. The first appli-cation of CL as analytical tool was carried outby Erdey in 1957, who studied the use of severalsubstances as luminol, lophine and lucigenine asvolumetric indicators. Investigations on the po-tentials of CL for analytical routine applicationsdate from the seventies for gas phase and fromthe eighties for liquid phase reactions. Since then,CL methods have been more widely used, main-ly in biochemical and environmental analysis,the number of articles and communications ex-ponentially increasing since the first Biolumi-nescence and Chemiluminescence InternationalSymposium held in Brussels back in 1978. Infact, the development of CL methods can bedifferentiated in two stages: a first period (1928-1940) characterized by the search of new chem-iluminescing compounds or systems by meansof chemical modifications of well-known struc-tures and, since the 2ndWorld War until to-day,a growing progress in the instrumentation toge-ther with the development of theoretical conceptson the often complex CL principles.

The powerful analytical applications of CL asa detecting tool in flow injection, column liquidchromatographic and in capillary electrophoreticseparating systems, together with the potentialsin immunoassays make this technique a mostinteresting field of research for scientists in awide variety of disciplines, including separatio-nal sciences in chemistry, biology, pharmaceuti-cal, biomedical and food analysis, the variousquality control areas, etc.

A recent trend in analytical chemistry invol-ves the application of CL as detection system incombination with capillary electrophoresis as priorseparation methodology, providing excellent analy-tical sensitivity and selectivity and allowing theresolution and quantification of various analytesin relatively complex mixtures [1 ].

Until the nineties, chemiluminometric detec-tion was not applied after capillary electrophore-tic separation, but fast developments from someimportant research groups and companies have



permitiendo la resolución y cuantificación de variosanalitos en mezclas relativamente complejas [1 ].

Hasta la década de los noventa, la detecciónpor QL no había sido acoplada a la EC, pero enestos últimos años, se han publicado importantesdesarrollos por parte de algunas compañías ygrupos de investigación, por lo que se esperanfuturas contribuciones sobre el tema.

El número de reacciones quimioluminiscen-tes citadas en bibliografía, con aplicaciones enquímica, biomedicina, alimentación, medioam-biente y toxicología, se ve incrementado anual-mente.

Combinado con separaciones por cromatografíalíquida de alta resolución (CLAR) , se han em-pleado varias reacciones quimioluminiscentes,entre otras con peroxioxalato, luciferasa, lucige-nina y luminol, siendo la más común la reaccióncon peroxioxalato en detección post-columnaacoplada a cromatografía líquida, tanto conven-cional como empleando microcolumnas. Asimis-mo, se han empleado sistemas de flujo continuocon detección basada en QL, para la determina-ción de varios fármacos y analitos de interésbiológico.

Hoy en día, el interés analítico de la QL estáaumentando considerablemente debido a las ven-tajas ya comentadas, como bajos límites de de-tección, rangos dinámicos amplios, alta sensibi-lidad y la gran versatilidad de los métodos QL.Recientemente, las investigaciones se están cen-trando especialmente en el desarrollo de produc-tos quimioluminiscentes para aplicaciones dediagnóstico clínico; así, la QL es hoy en día unposible sustituto del marcado isotópico, rempla-zando así el uso de radioisótopos. La QL se aplicatambién en el control de calidad de productoscárnicos y residuos, existiendo igualmente apli-caciones en la medida del ozono ambiental.

Considerablemente ventajosa resulta la sensi-bilidad que ofrecen las reacciones basadas enQL en diversos ámbitos del análisis aplicado,por ejemplo en la determinación de compuestosprohibidos en diversas matrices. Así, el interésde la QL en química analítica en la última déca-da queda demostrado por el número de artículospublicados en revistas de gran prestigio (Analy-tical Chemistry, The Analyst, Analytica ChimicaActa, Fresenius’ Zeitschrift für Analytische Che-mie, Journal of Microcolumn Separations, Jour-nal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,entre otras) y por la aparición de una revista

been noticed in these last years; hence furtherdevelopments are expected.

The number of reactions producing CL citedin the literature is increasing annually, with analy-tical applications in chemical, biomedical, food,environmental and toxicological disciplines. Incombination with HPLC separations, several CLreactions have been used, amongst others, pe-roxyoxalate, firefly luciferase, lucigenin and lu-minol, the peroxyoxalate reaction being the mostcommonly used CL-based system for post-co-lumn detection in conventional and in microco-lumn LC set-ups. Continuous flow CL-baseddetection of several analytes has been widelyapplied by several groups for the determinationof diverse biological compounds and drugs.

Today, analytical interest in the application ofCL is growing considerably due to the cited advan-tages as low detection limits, wide dynamic ran-ges, high sensitivity and the versatility of chemilu-minometric methods. Recently, increasing interestwas focussed on CL products for life sciences re-search; in clinical diagnostics, for example, CL isnowadays suggested as a sensitive substitute forisotopic labelling, replacing radioisotopes. CL isapplied as well in the quality control of meat pro-ducts and residues and future projects are focussedon environmental ozone measurements.

The sensitivity offered by CL-based reactionsis often needed, for example in the assay of illi-cit compounds within various matrices. Moreover,the interest in analytical CL for the last decadecan be illustrated by the number of publishedpapers in prestigeous analytical journals (e.g.,Analytical Chemistry, The Analyst, AnalyticaChimica Acta, Fresenius’ Zeitschrift für Analy-tische Chemie, Journal of Microcolumn Separa-tions, Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis, to name a few) and by the existence ofa dedicated specific journal, the Journal of Bio-logical and Chemical Luminescence.

It is clear that the need for improving detec-tion technology is nowadays related to the gene-ral trend in analytical chemistry to miniaturizeand thus reduce waste volumes of organic sol-vents in separational set-ups, and by using moreaqueous systems, studying smaller samples atincreasingly lower concentrations. As the CLtechnique may provide improvement in thesesituations, the instrumentation for CL measure-ments and the coupling with a selective physicalor chemical interface to achieve selective mea-

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específica: Journal of Biological and ChemicalLuminescence.

Siguiendo la tendencia general en químicaanalítica, la mejora en los métodos de detecciónestá dirigida actualmente a la miniaturización y,por lo tanto, a reducir el gasto de disolventesorgánicos en métodos de separación, empleandomás sistemas acuosos y volúmenes de muestramenores con concentraciones inferiores. Comolas técnicas quimioluminiscentes pueden propor-cionar mejoras en estas situaciones, la instru-mentación para medidas quimioluminiscentes yel desarrollo de acoplamientos con interfacesselectivas físicas o químicas que permitan medi-das selectivas están también dirigidos a conse-guir este fin, de modo que puedan eliminarse lasdesventajas de las técnicas basadas en medidasdirectas de QL (como falta de selectividad odependencia de factores físico-químicos). Así, seestán publicando progresivamente avances espe-cíficos en cromatografía, EC, inmunoensayo yen el uso de reactores enzimáticos. Desde estepunto de vista, los sistemas miniaturizados (“mi-crochip”) son muy atractivos, ya que puede re-solver el problema de los límites de detecciónpoco satisfactorios característicos de estos siste-mas.

Asimismo, el problema del gasto de disol-vente está potenciando gradualmente el uso desistemas analíticos de separación miniaturizados,tales como la cromatografía líquida capilar y decolumnas de pequeño diámetro (“narrow-bore”)frente a la CLAR, cromatografía en capa fina dealta resolución miniaturizada, y recientemente EC.Debido a que la QL puede resolver las limitacio-nes en la detección en estos casos, resulta previ-sible el desarrollo de este acoplamiento en lapróxima década. Como ejemplo, puede mencio-narse un sistema descrito recientemente, basadoen detección quimioluminiscente de enzimas yque emplea la técnica denominada “microensayoa través de electroforesis” (EMMA, electrophore-tically mediated microassay), que permite la de-tección de enzimas a niveles de zeptomoles, tantoen capilares abiertos como en canales realizadosen microchips, detectándose la oxidasa y catalasaa niveles de 9000 moléculas y empleando unainstrumentación relativamente económica.

Sin ninguna duda, cuando se compara con otrosmétodos de detección convencionales y potentes(fluorescentes o electroquímicos), la detecciónQL es una técnica en pleno desarrollo y sus avances

surements is likewise aimed at. In this way, di-sadvantages of direct CL-based techniques (e.g.,lack of selectivity, sensitivity to various physi-co-chemical factors) are avoided. Specific deve-lopments in chromatography, capillary electro-phoresis, immunoassay and the use of enzymereactions are being progressively reported. Mi-crochip-sized systems are attractive from this pointof view, as the problem of modest to unsatisfac-tory detection limits characteristic for these sys-tems may be overcome.

Moreover, the problem of waste disposal isgradually forcing analytical separating systems intominiaturization, e.g., narrow-bore and capillaryliquid chromatography versus high performanceliquid chromatography (HPLC), miniaturized highperformance thin layer chromatography (HPTLC),and, for recent years, capillary electrophoresis.

As the CL phenomenon may be applied tosolve the problem of detection limitations inparticular in narrow-bore liquid chromatographicand capillary electrophoretic set-ups, not usinghazardous labels, the former technique is boundto be thoroughly explored for the coming deca-de. As an example, it may be mentioned that inrecent years a CL-based detection system usingEMMA (electrophoretically mediated microas-say) of enzymes was described, allowing thedetection of enzymes at the zeptomole level inboth open tubular capillaries and channels inmicrofabricated devices, oxidase and catalase beingdetected at levels of 9000 molecules employinginexpensive instrumentation.

Without any doubt, when compared to other,conventional and powerful detection modes (fluo-rescence, electrochemical), CL detection is adeveloping technique and advances are focusedon the development of new detectors that areinstrumentally simpler than existing ones and thatoffer the ability to detect various types of analytesat trace levels.

FUNDAMENTALS OFCHEMILUMINESCENCE

Chemiluminescence is defined as the emis-sion of electromagnetic radiation (usually in thevisible or near infrared region) produced by achemical reaction.

When this emission originates from livingorganisms or from chemical systems derived from


85UNFAMILIAR THOUGH EXCITING ANALYTICAL DETECTION IN FLOWING STREAMS: CHEMILUMINESCENCE

se dirigen hacia el desarrollo de nuevos detecto-res más simples que los ya existentes y que ofrez-can la posibilidad de determinar varias clases deanalitos a niveles traza.

FUNDAMENTOS DE LA QL

La QL se define como la emisión de radia-ción electromagnética (normalmente en la regióndel visible o del infrarrojo cercano) producidapor una reacción química. Cuando esta emisiónproviene de organismos vivos o sistemas deriva-dos de ellos, se denomina bioluminiscencia. Ambosfenómenos son procesos luminiscentes que se hanidentificado tradicionalmente mediante un prefijoque identifica la fuente de energía responsable delinicio de la emisión de radiación electromagnéti-ca. Actualmente, los procesos de luminiscencia sehan incluido en la lista de fenómenos luminiscen-tes, como se indica en la Tabla 1.

Como la intensidad de emisión es función dela concentración de las especies químicas impli-cadas en la reacción QL, las medidas de la inten-sidad de emisión pueden emplearse con finesanalíticos. Una ventaja de las técnicas QL es quepermiten emplear una instrumentación básicabastante sencilla, ya que el sistema óptico norequiere fuente externa de excitación. La QL sedescribe a menudo como una técnica de “ campooscuro” : la ausencia de niveles altos de luz defondo, que sí ocurren en espectrofotometría yfluorimetría, reduce el ruido y permite mejorarlos límites de detección. La instrumentación paramedidas de QL varía desde sistemas muy sim-ples hasta instrumentación más compleja, pudién-dose usar un fluorímetro simplemente con la fuentede excitación apagada.

No obstante deben considerarse algunas limi-taciones en el análisis por QL, como la depen-dencia de la emisión quimioluminiscente de va-rios factores ambientales que deben sercontrolados, la falta de selectividad, ya que unreactivo quimioluminiscente no se limita a unúnico analito, y finalmente, como ocurre en otrossistemas de detección en flujo, la emisión qui-mioluminiscente no es constante sino que varíacon el tiempo (el flash de luz está compuesto deuna señal que se produce tras la mezcla de losreactivos, alcanza un máximo y después cae hastala línea de base), y este perfil de emisión frenteal tiempo puede variar ampliamente en diferen-

it, it is named bioluminescence (BL). Both phe-nomena are luminescence processes that have beentraditionally distinguished from related emissio-ns by a prefix that identifies the energy sourceresponsible for the initiation of emission of elec-tromagnetic radiation. Contemporary luminescenceprocesses have been added to the list of lumines-cence phenomena, as can be seen in Table 1.

Because the emission intensity is a functionof the concentration of the chemical species in-volved in the CL reaction, measurement of emis-sion intensities can be used for analytical purpo-ses. An advantage of CL techniques is that it ispossible to employ rather simplified basic ins-trumentation, as the optical system requires noexternal light source. CL is often described as adark-field technique: the absence of strong bac-kground light levels, such as found in spectro-photometry and fluorimetry, reduces noise sig-nals and leads to improved detection limits.Instrumentation for CL measurements ranges fromsimple to very complex, that is, allowing the useof a fluorometer by turning off the excitationsource, or applying the facilities offered by moresophisticated systems.

However, some limitations are to be conside-red in CL analysis, such as the dependence ofthe CL emission on several environmental fac-tors that hence must be controlled, the lack ofselectivity because a CL reagent is not limited tojust one unique analyte, and finally, like othermass flow detection approaches, since CL emis-sion is not constant but varies with time (lightflash composed of a signal increase after reagentmixing, passing through a maximum, then decli-ning to the baseline), and this emission versustime profile can widely vary in different CLsystems, care must be taken so as to detect thesignal in flowing streams at strictly defined pe-riods.

2.1. Mechanisms of chemiluminescence reactions

In general, a chemiluminescent reaction canbe generated by two basic mechanisms (Figure1). In a direct reaction, two reagents, usually asubstrate and an oxidant in the presence of somecofactors, react to form a product or intermedia-te, sometime in presence of a catalyst. Thensome fraction of the product or intermediate willbe formed in an electronically excited state, whichcan subsequently relax to the ground state with

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tes sistemas quimioluminiscentes, por lo que hayque extremar el cuidado para detectar la señal ensistemas en flujo, midiendo en periodos de tiem-po bien definidos.

2.1. Mecanismos de las reacciones QL

En general, una reacción QL puede generarsemediante dos mecanismos básicos (Figura 1).En una reacción directa, dos reactivos, normal-mente un substrato y un oxidante en presenciade algunos cofactores, reaccionan para formarun producto o intermedio de la reacción, algunasveces en presencia de un catalizador. Después,

emission of a photon. The substrate is the CLprecursor, which is converted into the electroni-cally excited molecule, responsible for lightemission or acting as the energy transfer donorin indirect CL. The catalyst, enzyme or metalion, reduces the activation energy and providesan adequate environment for producing high CLefficiency of the process. Cofactors sometimesare necessary to convert one or more of the subs-trates into a form capable of reacting and inte-racting with the catalyst, or to provide an effi-cient leaving group if bond cleavage is requiredto produce the excited emitter. On the contrary,indirect or sensitised CL is based on a process of

Producidos por irradiación

,E�� ;�� +�� %�� '��% ��F��+��

� Fluorescencia: Emisión de vida corta a partir de un estado singlete electrónicamenteexcitado

� ��;�� +��9 �0�� ;��&� ��β49 �,�� ;��&� ��α/E��2�� ;��&� ��γ��#��GProducidos por calentamiento

49 0�� ;�� *9 �� ;�� #�� 0E�� ;��-��- �� Producidos por reordenamientos estructurales en sólidos

,E��%� ��;�� <E 0�� ;�� .��0E�� ;�� Producidos por fenómenos eléctricos

,E�� ;�� 7��<E�� ;�� 0E �� ;��+�� /E ��.� ��;�� Producidos por reacciones químicas

,E <� ��;��%� ��<E H�� ;��3�&��

� � ��3�� ;� �� 3�� '� �� +�� &��

� H�� ;��

TABLA I. Clasificación de los fenómenos luminiscentes.

TABLA I. Classification of luminescence phenomena.



parte del producto o intermedio pasa a un estadoelectrónicamente excitado, que puede a continua-ción relajarse hasta el estado fundamental conemisión de un fotón. El substrato es el precursorQL, que se convierte en la molécula excitadaelectrónicamente, responsable de la emisión deluz, o bien actúa para transferir la energía en laQL indirecta. El catalizador, enzima o ion me-tálico, reduce la energía de activación y propor-ciona el ambiente adecuado para la producciónde una alta eficiencia QL durante el proceso.Los cofactores son necesarios en ocasiones paraconvertir uno o más de los substratos en unaforma capaz de reaccionar e interaccionar con elcatalizador, o para proporcionar un grupo “ sa-liente” eficaz cuando se requiere un marcado paraproducir el emisor excitado. Por el contrario, laQL indirecta o sensibilizada se basa en un pro-ceso de transferencia de energía de la especieexcitada a un fluoróforo. En el caso de molécu-las que no pueden emitir directamente QL, esteproceso permite transferir su exceso de energíaa un fluoróforo que a su vez es excitado, vol-viendo a su estado fundamental con la emisiónde un fotón. Todas estas etapas dan lugar a unagran variedad de aplicaciones prácticas de la QLen la fase sólida, líquida y gaseosa.

transfer of energy of the excited specie to a fluo-rophore. This process makes it possible for tho-se molecules that are unable to be directly invol-ved in CL reactions to transfer their excess ofenergy to a fluorophore that in turn is excited,releasing to its ground state with photon emis-sion. All of these paths lead to a great variety ofpractical uses of CL in solid, gas and liquid phases.

2.2. Requirements for chemiluminescence emission

For a chemical reaction to produce light, itshould meet some essential requirements:

a) the reaction must be exothermic to produ-ce sufficient energy to from the electronicallyexcited state. In this sense, for CL to occur theenergetic requirements can be established in ter-ms of ∆G (Kcal.mol-1 ):

λλ ex

4

ex

102.86. =

hc G - ≥∆

where λex

is the long-wavelength limit (nano-meters) for excitation of the luminescent spe-cies. Because most of the CL reactions producephotons in the range 400 (violet) – 750 (red) nm,

A + B + (Cofactores)

(precursorquimioluminiscente)

(oxidante)

catalizador

QUIMIOLUMINISCENCIADIRECTA

P*

(Intermediario o Producto) QUIMIOLUMINISCENCIA

SENSIBILIZADA O DE TRANSFERENCIA DE ENERGÍA

P + hν P + F*

F + hν

FF

FIGURA 1.- Tipos de reacciones en QL (P: producto; F: sustancia fluorescente).

FIGURE 1.- Types of CL reactions (P: product; F: fluorescing substance).

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2.2. Requisitos de la emisión QL

Para que una reacción química emita luz, debereunir algunos requisitos básicos:

a) la reacción debe ser exotérmica y producirla suficiente energía para formar el estado elec-trónicamente excitado. En este sentido, para queocurra una reacción quimioluminiscente, los re-quisitos energéticos pueden establecerse en tér-minos de ∆G (Kcal.mol-1):

the creation of the electronically excited stateand the generation of CL in the visible regionrequire around 40-70 Kcal.mol-1. This exother-mic condition is associated to redox reactionsusing oxygen and hydrogen peroxide or similarpotential oxidants.

b) the reaction pathway must be favourableto channel the energy for the formation of anelectronically excited state. In case the chemicalenergy is lost as heat, e.g., via vibrational androtational energy ways, the reaction will not bechemiluminescent.

c) photon emission must be a favourable deac-tivation process of the excited product in rela-tion to other competitive non-radiative processesthat may appear in low proportion, such as mo-lecular dissociation, chemical reaction with othersspecies, intra- or intermolecular energy transfer,isomerization or physical quenching. In the caseof sensitised CL, both the efficiency of energytransfer from the excited species to the fluoro-phore and the fluorescence efficiency of the lat-ter must be substantial.

In all luminescent processes, the intensity ofthe produced emission depends on the efficiencyof generating molecules in the excited state, whichis represented by the quantum efficiency (quan-tum yield) and the rate of the reaction. In thecase of CL reactions, the intensity can be expre-ssed as:

λλ ex

4

ex

102.86. =

hc G - ≥∆

dt

dA- = I CLCL φ

donde λex

es la longitud de onda límite (nanó-metros) para la excitación de las especies lumi-niscentes. Como la mayoría de las reaccionesquimioluminiscentes producen fotones en el ran-go comprendido entre 400 (violeta) - 750 (rojo)nm, la formación del estado electrónicamenteexcitado y la generación de QL en la región delvisible requiere alrededor de 40-70 Kcal.mol-1.Esta condición exotérmica se asocia a las reac-ciones redox que emplean oxígeno, peróxido dehidrógeno u oxidantes de potenciales similares.

b) El camino de reacción debe ser favorablea canalizar la energía hacia la formación de unestado electrónicamente excitado. En el caso deque la energía química se disipe en forma decalor, mediante vibraciones o rotaciones mole-culares, la reacción no será quimioluminiscente.

c) la emisión de un fotón debe ser un procesode desactivación del producto excitado favorableen relación a otros procesos no radiantes quepueden aparecer en pequeña proporción, comodisociación molecular, reacciones químicas conotras especies, transferencia de energía intra- ointermolecular, isomerización o atenuación físi-ca. En el caso de QL sensibilizada, tanto la efi-cacia y energía de transferencia de las especiesexcitadas al fluoróforo como la eficacia de lafluorescencia de este último deben ser conside-rables.

En todos los procesos luminiscentes, la inten-sidad de la emisión producida depende de laeficacia al generar moléculas en el estado exci-tado, lo cual viene representado por la eficienciacuántica (rendimiento cuántico) y la velocidadde la reacción. En el caso de reacciones quimio-luminiscentes, la intensidad puede expresarsecomo:

being ICL

the CL emission intensity (photons/seconds), φ

CL, the CL quantum yield and (- dA/

dt) the rate at which the CL precursor A is con-sumed. Higher values of quantum yields areusually associated with BL reactions whereasin most of the CL reactions used for analyticalpurposes, φ

CL ranges from 0.001-0.1, and even

very inefficient systems with much lower quan-tum yields can be used in analysis based on thealmost complete absence of background emis-sion. This is the case of ultraweak CL reactio-ns, in which φ

CL can be less than 0.001 (often

10-3-10-8 and sometimes 10-9-10-15). UltraweakCL is produced from oxidative reactions in li-ving cells and the emitted signals are mostlybetween 103-106 times less intense than thosefrom luminous organisms. It is invisible to the



donde IQL

es la intensidad de emisión quimio-luminiscente (fotones/segundo), φ

QL es el rendi-

miento cuántico y (- dA/dt) la proporción en laque el precursor quimioluminiscente, A, es con-sumido. Los valores altos de rendimiento cuán-tico se asocian normalmente con reacciones deBL, mientras que en la mayoría de las reaccio-nes quimioluminscentes empleadas para finesanalíticos, φ

QL varía entre 0.001-0.1, e incluso

sistemas bastante ineficaces, con rendimientoscuánticos inferiores, pueden emplearse en análi-sis basados en la ausencia casi absoluta de emi-sión de fondo. Tal es el caso de reacciones qui-mioluminiscentes ultradébiles, en las que φ

QL puede

ser inferior a 0.001 (a menudo 10-3-10-8 y algu-nas veces 10-9-10-15). La QL ultradébil se produ-ce a partir de reacciones de oxidación en célulasvivas y las señales emitidas son a menudo 103-106 veces menos intensas que las de organismosluminosos, siendo invisibles a simple vista. Estetipo de QL incluye un grupo de reacciones qui-mioluminiscentes que, al menos en células vi-vas, implica cierto número de intermediariosoxigenados y que juega un papel importante enciertos tipos de activación celular, en los sistemasde defensa del cuerpo y en enfermedades corona-rias. Se han detectado en gran variedad de órga-nos intactos, células aisladas y tejidos homogé-neos de vertebrados, invertebrados y plantas, y envarias reacciones in vitro. La QL ultradébil seasocia a algunas importantes funciones celulares,como la respiración mitocondrial, fotosíntesis,división celular o fagocitosis, entre otras [2 ].

2.3. Factores que influyen en la emisión QL

Las medidas de QL están fuertemente influen-ciadas por aquellos factores experimentales queafectan al rendimiento cuántico y a la velocidadde reacción, como son:

— La estructura química del precursor qui-mioluminiscente, no solamente la parte quecontiene al grupo excitado electrónicamente,sino también las cadenas laterales.— La naturaleza y concentración de otrassustancias que afectan el proceso de QL yque favorecen otros procesos competitivosno radiantes.

naked eye. This kind of CL in fact includes agroup of CL reactions which, at least in livingcells, involve a number of oxygen intermedia-tes and that play an important role in certaintypes of cell activation, in the defense systemof the body and in ischaemic heart diseases. Ithas been detected from a wide variety of intactorgans, isolated cells and tissue homogenatesfrom vertebrates, invertebrates, plants, and fromseveral reactions in vitro. The ultraweak CL isassociated with some important cellular func-tions, such as mitochondrial respiration, pho-tosynthesis, cell division or phagocytosis, amongstother [1 ].

2.3. Factors influencing chemiluminescenceemission

Because of the cited dependence of CL in-tensity upon various parameters, CL measure-ments are strongly modified by experimentalfactors that affect quantum yield and rate ofreaction, such as:

— the chemical structure of the CL pre-cursor, not only the central portion con-taining the electronically excited group,but also the side chain

— the nature and concentration of othersubstrates affecting the CL pathway andfavouring other non-radiative competi-tive processes

— the selected catalyst— the presence of metal ions, specially

transition metals involved in the proces-sing of the oxidant

— the temperature— pH and ionic strength— the hydrophobicity of the solvent and

solution composition (as example, theφ

CL of luminol oxidized in dimethylsul-

phoxide (DMSO) is 0.05 compared with0.01 in water, the colours being blue-violet (425 nm) and blue-green (480-502 nm), respectively)

— the presence of energy transfer accep-tors.

2.4. Characteristics of chemiluminescence asanalytical technique

Because the reaction rate is a function of thechemical concentration, CL techniques are suita-

dt

dA- = I CLCL φ

90



— El catalizador seleccionado.— La presencia de iones metálicos, espe-cialmente metales de transición implica-dos en el proceso de oxidación.— La temperatura— pH y fuerza iónica— La hidrofobicidad del disolvente y lacomposición de la disolución (por ejem-plo, la φ

QL del luminol oxidado en dime-

tilsulfóxido (DMSO) es 0.05 comparadocon 0.01 en agua, siendo los colores azul-violeta (425 nm) y verde-azulado (480-502nm), respectivamente)— La presencia de aceptores de la energíatransferida

2.4. Características de la QL como técnica ana-lítica

Como la velocidad de la reacción es funciónde las concentraciones de reactivos, la QL es unatécnica adecuada para el análisis cuantitativo. Lautilidad de los sistemas quimioluminiscentes enquímica analítica se basa en algunas característi-cas especiales, que se comentan a continuación.

a) La técnica comprende simultáneamentecaracterísticas cinéticas y luminiscentes, por loque proporciona una alta sensibilidad y un am-plio rango dinámico. Si φ

QL es lo suficientemen-

te alta, se pueden alcanzar límites de detecciónexcelentes, en el rango de los femtomoles. Comoejemplo, en la fase gaseosa, los límites de detec-ción habituales son de 10 pmol de NO emplean-do ozono, y 0.1 pmol para compuestos sulfura-dos empleando una llama de hidrógeno seguidade ozono; en la fase líquida, puede detectarsehasta 1 fmol de fluoróforo empleando el sistemaquimioluminiscente con peroxioxalato, y 0.1 fmolde peroxidasa usando luminol. En comparacióncon otras técnicas espectrométricas, la QL esaproximadamente 105 veces más sensible que laespectrometría de absorción y al menos 103 vecesmás sensible que la fluorimetría.

b) Comparada con los procesos de fotolumi-niscencia, no se requiere fuente de excitaciónexterna, lo que ofrece algunas ventajas, como laausencia de dispersión y señales fotoluminiscen-tes de fondo, la desaparición de problemas rela-cionados con la inestabilidad de la fuente exter-na, reducción de interferencias debidas a procesosde excitación no selectivos, y una instrumenta-ción más simple.

ble for quantitative analysis. The usefulness ofCL systems in analytical chemistry is based onsome special characteristics cited hereafter.

a) As the technique simultaneously compri-ses kinetic and luminescence features, it provi-des high sensitivity and wide dynamic ranges.Excellent detection limits, in the range of femto-moles, can be reached if φ

CL is high enough. As

an example, in the gas phase, typical detectionlimits are of 10 pmol NO using ozone, and 0.1pmol for sulfur compounds using a hydrogen flamefollowed by ozone; in the liquid phase down to1 fmol of the fluorophore may be detected usingthe peroxyoxalate CL system, and 0.1 fmol pe-roxidase when using luminol. In comparison toother spectrometric techniques, CL is approxi-mately 105 times more sensitive than absorptionspectrometry and at least 103 times more sensiti-ve than fluorimetry.

b) Compared to photoluminescence processes,no external light source is required, which offerssome advantages such as the absence of scatte-ring or background photoluminescence signals,the absence of problems related to instability ofthe external source, reduction of interferencesdue to a non-selective excitation process, and asimple instrumentation.

c) Selectivity and linearity are most depen-dent on the reaction and reaction conditions cho-sen. As for photoluminescence processes, ab-sorption or emission radiation by the analyte,products or concomitants can cause nonlinearityor spectral interferences.

d) The technique is versatile for the determi-nation of a wide variety of species that can par-ticipate in the CL process, such as: CL substra-tes or CL precursors responsible for the excitedstate; the necessary reagent for the CL reaction(usually an oxidant); some species that affectsthe rate or efficiency of the CL reaction: activa-tors such as catalysts (enzymes or metal ions) orinhibitors such as reductants that inhibit the CLemission; fluorophores in the case or sensitizedCL; some species that are not directly involvedin the CL reaction but that can react with otherreagents in coupled reactions to generate a pro-duct which is a reactant in the CL reaction; spe-cies that can be derivatized with some CL pre-cursors or fluorophores, being determined by director sensitized CL.

e) Depending of the nature of the analyte andthe CL reaction, the increase or decrease of CL



c) La selectividad y la linealidad son másdependientes de la reacción y de las condicionesde reacción escogidas. Como ocurre con los pro-cesos fotoluminiscentes, la absorción o emisiónde radiación por el analito, producto o cofacto-res, pueden causar pérdida de linealidad o inter-ferencias espectrales.

d) La técnica es versátil para la determina-ción de una amplia variedad de especies quepueden participar en el proceso quimioluminis-cente, como: substratos o precursores quimiolu-miniscentes responsables del estado excitado; elreactivo necesario para la reacción (normalmen-te un oxidante); algunas especies que afectan lavelocidad o la eficacia de la reacción: activado-res, como catalizadores (enzimas o iones metá-licos), o inhibidores, como reductores que dis-minuyen la emisión quimioluminiscente;fluoróforos en el caso de QL sensibilizada; algu-nas especies que no están directamente implica-das en la reacción QL pero que pueden reaccio-nar con otros reactivos en reacciones acopladaspara generar un producto que es un reactivo enla reacción QL; especies que pueden formarderivados con algún precursor quimioluminiscenteo fluoróforo, determinándose mediante QL di-recta o sensibilizada.

e) Dependiendo de la naturaleza del analito yde la reacción QL, el incremento o disminuciónde la intensidad de QL estará directamente rela-cionada con la concentración de analito.

f) Las reacciones quimioluminiscentes pue-den acoplarse fácilmente como método de detec-ción en cromatografía, EC o inmunoensayo, pro-porcionando información cualitativa o cuantitativasobre una gran variedad de especies en las fasesgaseosa y líquida.

Como regla empírica, es probable que uncompuesto exhiba QL cuando él o su productoderivado muestren propiedades fluorescentes. Esposible que la oxidación de tal especie produzcaQL, aunque hay muchas excepciones a esta reglageneral.

PRINCIPALES REACCIONES CLEN FASE LÍQUIDA

3.1. Acilhidracidas

El ejemplo más conocido en reacciones di-rectas es la oxidación del luminol (5-amino-2,3-

intensity will be directly related to the analyteconcentration.

f) CL reactions can be easily coupled asdetection technique in chromatography, capilla-ry electrophoresis or immunoassay, providingqualitative or quantitative information of a largevariety of species in the gas and liquid phases.

As an empirical rule, CL behavior may bepredicted in the case a compound or its deriva-tization product show fluorescence properties. Itis possible that oxidation of such a specie mayproduce CL, but there are many exceptions tothis general rule.

MAIN LIQUID-PHASE CL REACTIONS

3.1. Acyl Hydrazides

The best know example in direct reactions isthe oxidation of luminol (5-aminophthalylhydra-zide) in alkaline medium, to produce excited 3-aminophthalate ion (Figure 2). Oxidants such aspermanganate, hypochlorite, or iodine can be usedbut most useful is hydrogen peroxide. The reac-tion is catalysed by metal ions (Fe(II), Cu(II),Co(II), amongst others), ferricyanide or somemetallocomplexes (hemin, haemoglobin and pe-roxidases). In this sense, this reaction has beenapplied for the determination of catalysts suchas metal ions or enzymes (peroxidases, hematiccompounds, etc.), certain oxidants, inhibitors orsubstances that are easily oxidised and are deter-mined indirectly measuring the decreased CLemission. Also, luminol has been extensively usedin medico-legal investigations in presumptive teststo detect trace quantities of blood which are notvisible to the naked eye, e.g., areas intentionallywiped clean of blood, washed clothes, dark sur-faces, etc. [2 ]. In fact, the application of freshluminol by spraying -after allowing the previousapplications to dry- can reactivate the lumines-cence, and hematin can be detected in a dilutionof 1:108.

3.2. Imidazoles

Lophine (2,4,5-triphenylimidazole) is the mostrepresentative of the imidazole CL precursors. Ayellow light is produced by oxidation of lophinewith peroxide-hypochlorite or peroxide-hexano-

92



dihidro-1,4-ftalazinediona) en medio alcalino, paraproducir el ión 3-aminoftalato excitado (Figura2). Pueden utilizarse varios oxidantes, tales comoel permanganato, hipoclorito o yodo, aunque elmás usado es el peróxido de hidrógeno. La reac-ción es catalizada por iones metálicos (Fe(II),Cu(II), Co(II), entre otros), ferricianuro o algu-nos metalocomplejos (hemina, hemoglobina yperoxidasas). Esta reacción ha sido aplicada enla determinación de iones metálicos que actúancomo catalizador, enzimas (peroxidasas, compues-tos hemáticos, etc), ciertos oxidantes, inhibido-res o sustancias que son fácilmente oxidables yque son determinadas indirectamente por la dis-minución de emisión quimioluminiscente. Tam-bién el luminol se ha usado ampliamente en in-vestigaciones criminales para detectar cantidadestrazas de sangre, que no son visibles a simplevista, tales como restos de sangre seca inclusocon varios años de antigüedad, en ropas lavadas,superficies intencionadamente limpiadas, super-ficies oscuras, etc. [2 ]. De hecho, la aplicaciónde un spray con luminol sobre la superficie ainvestigar puede producir una luminiscencia ca-paz de detectar hematina a dilución de 1:108.

3.2. Imidazoles

La lofina (2,4,5-trifenilimidazol) es el precursorquimioluminiscente más representativo de estos

cyanoferrate (III) and O2, in aqueous alkaline

medium, to the hydroperoxide, from which exci-ted state diaroylarylamidines are formed via adioxetane structure that then emits light (Figure3) [3 ]. Determination of Co(II), Cr(III), Cu(II),Fe(CN)

63-, MnO

4-,ClO-, amongst others have been

carried out using this system. Recently, hydroxyla-mmonium chloride was found to enhance the CLemission of the lophine-Co(II)-H

2O

2 system, allo-

wing a very sensitive determination of Co(II)[4 ].

3.3. Acridinium esters

Lucigenin (10,10'-dimethyl-9,9'-biacridiniumnitrate) is one of the more efficient CL substan-ces which emits an intense green emission whenoxidised in an alkaline medium [5 ]. Other acri-dinium derivatives have been shown to produceCL emission upon hydrogen peroxide oxidationof aqueous alkaline solutions. The main reactionproduct is N-methylacridone, acting as an activeintermediate in the mechanism proposed by Rauhutet al. [6 , 7 ] (Figure 4). Due to the reactionproduct being water-insoluble, the addition of asmall amount of a surfactant, such as sodiumdodecyl sulphate, prevents precipitation [8 ]. Theapplication of this reaction has permitted thedetermination of several ions, oxidants or reduc-tors, such as ascorbic acid [9 ].

OO

O

NHNH

O

NN

NN

O

O

O

O

OH

+ + h ( = 425 nm)

NH2

N2

O

O

OO

NH2

NH2

NH2

o2 o2

FIGURA 2.- Mecanismo propuesto para la reacción del luminol.

FIGURE 2.- Proposed mechanism for the luminol CL reaction



compuestos. Cuando la lofina es oxidada, en mediobásico, por peróxido-hipoclorito o peróxido-hexacianoferrato (III) y O

2 a hidroperóxido, a

partir del cual se forman diaroilarilamidinas enestado excitado a través de una estructura dedioxetano, que es la responsable de la emisiónde la luz (Figura 3) [3 ]. Utilizando este sistemase ha llevado a cabo determinaciones de Co(II),Cr(III), Cu(II), Fe(CN)

63-, MnO

4-, ClO-, entre otros.

Recientemente, se ha encontrado que el clorurode hidroxilamonio aumenta la emisión quimio-luminiscente del sistema lofina-Co(II)-H

2O

2, per-

mitiendo una determinación muy sensible de Co(II)[4 ].

3.3. Ésteres de acridinio

La lucigenina (nitrato de 10,10’ -dimetil-9.9’ -biacridinio) es uno de los compuestos quimiolu-miniscentes más eficientes, que emite una inten-sa luz verde cuando se oxida en medio básico[5 ]. Otros derivados del acridinio producenemisión quimioluminiscente al ser oxidados porperóxido de hidrógeno en disolución acuosa al-calina. El producto final de la reacción es la N-metilacridona, que actúa como intermediario activoen el mecanismo propuesto por Rauhut y col.[6 ,7 ] (Figura 4). Debido a que este producto esinsoluble en agua, la adición de pequeñas canti-dades de un surfactante, tal como dodecilsulfatosódico puede utilizar para evitar la precipitación[8 ]. La aplicación de esta reacción ha permitido

3.4. Tris (2,2’-bipyridine) ruthenium (III)

Another CL system frequently applied invol-ves the use of Ru(bpy)

32+ which produces an orange

emission at 610 nm from excited state[Ru(bpy)

32+]* that can be obtained by different

reactions which imply electron transfer and re-generation of the Ru(bpy)

32+ species:

* By reaction of Ru(bpy)3

3+ and Ru(bpy)3

+

Ru(bpy)3

3+ + Ru(bpy)3

+ ? [Ru(bpy)3

2+]* * By reaction of Ru(bpy)

3+ with certain

oxidantsRu(bpy)

3+ + ox ? [Ru(bpy)

32+]* + ox_

* By reaction du Ru(bpy)3

3+ with cer-tain reductants

Ru(bpy)3

3+ + red ? [Ru(bpy)3

2+]* + red+

For these reactions the CL intensity is linear-ly proportional to the concentration of any of thereagents, allowing their determination by suita-ble adjustment of the remaining reagent concen-trations. The solvent usually applied in CL de-terminations based on these reactions includeacetonitrile-water, methanol-water and acetone-water [10 ]. Recently, the higher CL emissiongenerated by a similar complex, Ru(phen)

32+ (phen

= 1,10-phenanthroline) during oxidation ofRu(phen)

32+ by Ce(IV) in sulphuric acid medium

was investigated, allowing the establishment ofa CL method for the analysis of nucleic acids,which enhances the CL emission [11 ].

N

N

O 2KOH

N

N

O

H

OH

N

NOO

¨

N

N̈*OO h

( = 525 nm)

FIGURA 3.- Mecanismo propuesto para la reacción de la lofina.

FIGURE 3.- Proposed mechanism for the lophine CL reaction.

94



la determinación de varios iones, oxidantes oreductores como el ácido ascórbico [9 ].

3.4.Tris(2,2’-bipiridina) rutenio (III)

Otro sistema quimioluminiscente frecuente-mente usado es el del complejo Ru(bpy)

32+, cuyo

estado excitado [Ru(bpy)3

2+]* produce una emi-sión naranja a 610 nm. El estado excitado puedeconseguirse por diversas reacciones que impli-can la transferencia de un electrón y regenera-ción de la especie Ru(bpy)

32+ :

3.5. Peroxyoxalates

In relation to indirect CL, one of the moreefficient non-biological systems that are frequentlyused is based on the so-called peroxyoxalate CLreaction (PO-CL), which involves the hydrogenperoxide oxidation of an aryl oxalate ester in thepresence of a fluorophore. The reaction is sug-gested to follow a CIEEL (chemically initiatedelectron exchange luminescence mechanism) viaa high-energy intermediate, 1,2-dioxetanedione,which forms a charge complex with the fluoro-

N +

N+

NaOH

CH 3

CH 3 CH 3

CH3

N

N

OO

N

CH 3

O

+N

CH 3

O

h ( = 470 nm )*

H2O2

FIGURA 4.- Mecanismo propuesto para la reacción de la lucigenina.

FIGURE 4.- Proposed mechanism for the lucigenin CL reaction.

* Por reacción de Ru(bpy)3

3+ y Ru(bpy)3

+

Ru(bpy)3

3+ + Ru(bpy)3

+ → [Ru(bpy)3

2+]**Por reacción de Ru(bpy)

3+ con ciertos oxi-

dantesRu(bpy)

3+ + ox → [Ru(bpy)

32+]* + ox-

*Por reacción de Ru(bpy)3

3+ con ciertos re-ductores

Ru(bpy)3

3+ + red → Ru(bpy)3

3+ + red+

Para estas reacciones la intensidad de QL eslinealmente proporcional a la concentración decualquiera de los reactivos, lo que permite sudeterminación ajustando adecuadamente la con-centración de los restantes reactivos que intervie-nen en ella. Los disolventes que se utilizan en las

phore, donating one electron to the intermediate[12 ]. This electron is transferred back to thefluorophore raising it to an excited state and li-berating light characteristics typical for the fluo-rophore nature (Figure 5). Bis-(2,4,6,-trichlorophenyl)oxalate (TCPO) and bis-(2,4-dinitrophenyl)oxalate (DNPO) are commonlyused oxalates. The main disadvantage of thissystem resides in the insolubility of the above-mentioned compounds in water and their insta-bility towards hydrolysis, which requires the useof organic solvents such as acetonitrile, dioxane,tert-butanol and ethyl acetate. This reaction canbe used to determine a great number of speciessuch as hydrogen peroxide, compounds that arehighly fluorescent (e.g. polycyclic aromatic hydro-



determinaciones quimioluminiscentes basadas enestas reacciones suelen ser acetonitrilo-agua, me-tanol-agua y acetona-agua [10 ]. Recientemente,se ha investigado un complejo similar, Ru(phen)

32+

(phen= 1,10 fenantrolina), que genera una mayoremisión durante la oxidación de Ru(phen)

32+ por

Ce(IV) en medio ácido sulfúrico, permitiendo elestablecimiento de un método quimioluminiscen-te para el análisis de ácidos nucleicos, con ungran aumento de la emisión de QL [11 ].

3.5. Peroxioxalatos

En QL indirecta, uno de los sistemas no bio-lógicos más frecuentemente utilizados se basaen la reacción quimioluminiscente de los pe-roxioxalatos (PO-CL), que supone la oxidaciónpor peróxido de hidrógeno de un éster aril oxa-lato en presencia de un fluoróforo. La reacciónparece que sigue un mecanismo denominado“ luminiscencia de intercambio electrónico ini-ciada químicamente” (CIEEL, chemically initia-ted electron exchange luminescence mechanism)a través de un intermediario de alta energía, la1,2-dioxietanodiona, que forma un complejo decarga con el fluoróforo, donando un electrón alintermediario [12 ]. Este electrón es transferidoal fluoróforo, que alcanza un estado excitado yal regresar al estado fundamental, produce unaemisión característica propia de la naturaleza delfluoróforo (Figura 5). El bis-(2,4,6-triclorofenil)oxalato y el bis-(2,4-dinitrofenil) oxalato son losmás corrientemente usados. La principal desven-taja de este sistema reside en la insolubilidad deestos compuestos en agua y su inestabilidad porhidrólisis, por lo que se requiere el uso de disol-ventes orgánicos, tales como, acetonitrilo, dioxano,terbutanol y acetato de etilo. Esta reacción seaplica a la determinación de un gran número decompuestos como peróxido de hidrógeno, sus-tancias altamente fluorescente (ej. hidrocarburosaromáticos policíclicos) o compuestos que nosiendo fluorescente pueden convertirse en fluo-rescentes, por reacción química con cloruro dedansilo (aminoácidos, esteroides, aminas alifáti-cas, ácidos carboxílicos, etc.) o con fluorescami-na (catecolaminas) [13 ].

3.6. Reacciones bioluminiscentes

Los sistemas bioluminiscentes más utilizadosdesde el punto de vista analítico, son los basados

carbons) or compounds that do not exhibit nati-ve fluorescence but can be derivatized chemica-lly using dansyl chloride (amino acids, steroids,aliphatic amines, carboxylic acids, etc.) or fluo-rescamine (catecholamines) [13 ].

3.6. Bioluminescent reactions

The analytically most widely applied BL sys-tems are based on the firefly luciferin-luciferasereaction and the systems derived from the fireflyPhotinus pyralis and certain marine bacteria(Vibrio harvey and Photobacterium fischeri).Luciferases are stabilized by proteins such asalbumin. In the former system, the hydrophobicenzyme luciferase catalyses the air oxidation ofluciferin in the presence of ATP, which is con-sumed as a substrate to yield light emission at562 nm [14 ]. The presence of Mg(II) is neces-sary for the luciferase activity to be triggered. Adetailed scheme is reported in Figure 6. Consi-dering the stoichiometry of the reaction, for oneATP molecule consumed approximately onephoton is emitted. This property, together withthe high nucleoside specificity of the enzyme,makes this reaction an ideal analytical systemfor assaying ATP presence, ATP production orconsumption in dependence of enzymatic activi-ty, and for quantification of substrates linked tothe ATP metabolism. ATP detection is an alter-native to detect contamination from micro-orga-nisms, food residues or human contact on surfa-ces. The advantage of ATP measurements in theevaluation of cleanliness lies in the ability todetect this product’ s residues and organic debrisin addition to living micro-organisms. This sys-tem is being widely applied in the Quality Ma-nagement and Assurance field to increase safetyof foods [15 ] and in a wide range of fields suchas environmental quality control [16 ], monito-ring systems at sludge and sewage water plants[17 ], pharmaceutical and cosmetics industries [18 ,19 ], vitality and quality of biomasses involvedin fermentation processes [20 ], bacterial conta-mination in sterile areas (surgical rooms) or micro-organisms contribution to alterations affectingartistic works [21 ]. Several commercial kits areavailable and also directly usable on the fieldwith portable instruments [22 ].

96



en la reacción luciferina-luciferasa y los siste-mas derivados de la luciérnaga Photinus pyralisy ciertas bacterias marinas (Vibrio harvey yPhotobacterium fischeri). Las luciferasas se es-tabilizan por proteínas como la albúmina. En elprimer sistema, la enzima hidrofóbica luciferasacataliza la oxidación por el aire de la luciferinaen presencia de ATP, que se consume comosustrato para emitir luz a 562 nm [14 ]. Es nece-saria la presencia de Mg(II) para que la lucife-

3.7. Direct oxidations

In the last years, there has been a develop-ment of new CL reactions by testing the analytewith a wide range of strong oxidants, such asMnO

4- (in acidic and alkaline medium), ClO-,

Ce(IV), H2O

2, IO

4-, Br

2, N-bromosuccinimide, and

reductants, under different ranges of chemicalconditions [23 ]. Usually, if oxidation of themolecule is known to give a fluorescent product,

or if the analyte itself has a typical structure thatmight be fluorescent, there is a possibility thatoxidation of the analyte will produce CL emis-sion. Some of the first applications were the CLdetermination of morphine [24 ], buprenorphinehydrochloride [25 ] and the benzodiazepine lo-prazolam [26 ], using a flow injection analysis(FIA) assembly. In these cases, the sample con-taining the drug was injected into a phosphoricacid stream that was subsequently merged withthe oxidant stream, offering an extremely sim-ple, economic and effective experimental proce-dure. Since then, a wide range of such reactionshave been reported mainly in the analysis of drugs[27 ]. Sensitizers, micellar media or catalysts canbe added to these systems in order to enhancethe CL emission. As example, penicillamine [28 ],tiopronin [29 ] and cefadroxil [30 ] have beendetermined in presence of quinine sulphate; fo-lic acid [31 ], captopril [32 ], hydrochlorothiazi-de [33 ], phenothiazines [34 ] or furosemide [35 ]using rhodamines 6G or B and hydrazine in pre-sence of dichlorofluoresceine [36 ]. Quinine sul-

TCPO (pH = 5 - 9)

R: R:

DNPO (pH < 3.5)

O

OOCCO.-

F

F .+F* + 2 CO2

F + h

F: fluoróforo

R O C C O R

O O+

OO

OCCOR OH C CO O

O O

H2O2

ClCl

ClNO2

NO2

FIGURA 5.- Posible camino de reacción para el sistema de peroxioxalatos.

FIGURE 5.- Possible reaction pathway for the PO-CL system.

rasa muestre su actividad. Un detallado esquemase muestra en la Figura 6. Considerando la es-tequiometría de la reacción, por cada moléculade ATP consumida se emite aproximadamenteun fotón. Esta propiedad, junto con la alta espe-cificidad de la enzima por el nucleótido, hacenque esta reacción sea un sistema analítico idealpara detectar la presencia de ATP, su produc-ción o consumo, que depende de la actividadenzimática y para cuantificar substratos relacio-nados con el metabolismo del ATP. La detec-ción de ATP es una alternativa para detectar lacontaminación por microorganismos, residuos enalimentos o restos de contacto humano en super-ficies. Este sistema se emplea en el ámbito de lagestión y garantía de la calidad para aumentar lahigiene de los alimentos [15 ] y en otros campos,tales como en control de calidad ambiental [16 ],en el seguimiento de plantas de lodos y aguasresiduales [17 ], en la industria farmacéutica yde cosméticos [18 , 19 ], en la calidad y vitalidadde la biomasa implicada en procesos de fermen-tación [20 ], en la contaminación bacteriana de



áreas estériles o en el deterioro de obras artísti-cas por microorganismos[21 ]. Se han comercia-lizados varios kits de reactivos, para usarlos di-rectamente en el sistema adecuado medianteinstrumentos portátiles con este fin [22 ].

3.7. Oxidaciones directas

En los últimos años, se han desarrollado nue-vas reacciones quimioluminiscentes por reaccióndel analito en cuestión con oxidantes fuertes, talescomo MnO

4- ( en medio ácido y alcalino), ClO-

, Ce(IV), H2O

2, IO

4-, Br

2, N-bromosuccinimida,

y con reductores, en diferentes condiciones quí-micas [23 ]. Normalmente, si se conoce que laoxidación de la molécula da un producto fluo-rescente, o si el analito en si mismo, tiene unaestructura que permita la emisión fluorescente,hay posibilidad de que la oxidación del mismo

phate and Rhodamine 6G were simultaneouslyused for the determination of tiopronin [37 ]. Also,in the presence of the cationic surfactant cetyl-trimethyl ammonium bromide (CTAB), tetracycli-ne was determined with high sensitivity [38 ].These reactions have been mainly applied todeveloped CL-based flow injection methods.

BASIC INSTRUMENTATION

Measurement of light emitted from chemicalor biochemical reactions is related to the con-centration of participant species: the rate of lightoutput is directly related to the amount of lightemitted and, accordingly, proportional to theconcentration of the specific specie. For thisreason, the measurement of light is an indicatorof the amount of analyte and the basic instru-

FIGURA 6.- Representación esquemática de la reacción de la luciferasa de luciérnaga. ATP, trifosfato de adenosina;PP

i, pirofosfato; AMP, monofosfato de adenosina.

FIGURE 6.- Schematic representation of the firefly luciferase reaction. ATP, adenosine triphosphate; PPi,

pyrophosphate; AMP, adenosine monophosphate.

(LH2 )

Forma reducida dela D-luciferina

(OL)

Forma oxidada de laoxiluciferina

ATP + LH2 PPi

LH2

AMPLuciferasa Luciferasa

Luciferasa Luciferasa

O2

CO2

LIGHT

AMP + OL

AMP OL*AMP OL

N

S S

N

HO H

H

CO2H

N

S S

N O

H

H

98



produzca emisión de QL. Algunas de las aplica-ciones de estos últimos sistemas han sido ladeterminación quimioluminiscente de morfina[24 ], hidrocloruro de buprenorfina [25 ] y labenzodiazepina loprazolam [26 ] mediante análi-sis por inyección en flujo (FIA). En estos casos,la muestra conteniendo el fármaco se inyectabaen el canal por donde circula una disolución deácido fosfórico que posteriormente se mezclabacon el oxidante, proporcionando un procedimientosumamente simple, económico y efectivo. Desdeentonces, un gran número de este tipo de reac-ciones han sido publicadas, principalmente en elanálisis de fármacos[27 ]. Para aumentar la emi-sión de QL se han añadido a estos sistemas sen-sibilizadores, medios micelares o catalizadores.Como ejemplos podemos citar la determinaciónde penicilamina [28 ], tiopronina [29 ], cefadroxil[30 ] en presencia de sulfato de quinina; ácidofólico [31 ], captopril [32 ], hidroclorotiazida [33 ],fenotiazinas [34 ] o furosemida [35 ] usando ro-daminas 6G o B e hidracina en presencia dediclorofluoresceína [36 ]. El sulfato de quinina yla rodamina 6G se han utilizado conjuntamentepara la determinación de tiopronina [37 ]. Tam-bién, en presencia de un surfactante catiónico,bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) se hadeterminado tetraciclina con una alta sensibili-dad [38 ]. Todas estas reacciones han sido apli-cadas principalmente a métodos por inyecciónen flujo con detección quimioluminiscente.

INSTRUMENTACIÓN BÁSICA

La medida de la luz emitida por una reacciónquímica o bioquímica está relacionada con laconcentración de las especies participantes: laproducción total de luz está directamente rela-cionada con la cantidad de luz emitida y, conse-cuentemente, es proporcional a la concentraciónde la especie concreta. Por esta razón, la medidade luz emitida es un indicador de la cantidad deanalito presente y al instrumento básico que escapaz de realizar estas medidas se le llama lumi-nómetro. Una de las ventajas más importantesde la QL como técnica analítica es la simplici-dad de la instrumentación, que incluye comocomponentes principales: una célula de reacción,un compartimento cerrado a la luz, un dispositi-vo de inyección y mezcla de reactivos y/o demuestra, un detector de luz y un sistema de ad-

mentation for these measurements is named aluminometer. One of the most important advan-tages of CL as analytical technique is the simpli-city of this instrumentation, which includes asprincipal components: a reaction cell, a light-tight housing, a device for introducing and mixingthe reagents and/or the sample, a light detectorand an acquisition and signal processor system(Figure 7). In the housing a sample chamberholds the reaction cell (a test tube, a microplate,a flow-cell, etc.) in order to present the lumines-cencing sample to the detector. This chambermust be sealed from ambient light to minimizepotential interferences and it must be positionedas close to the detector as possible to maximizeoptical efficiency. Additional mirrors, lenses,and other devices can be used to increase theangle of collection and to obtain high opticalefficiency which is desirable for an optimumsignal-to-noise ratio, allowing rapid and precisemeasurements. The function of the housing is tomaintain the mixture of sample and CL reagentsat an adequate temperature and in the completedark in order to isolate the external light fromthe detector. Usually no monochromator is re-quired because the CL intensity arises from onespecies and other substances would hardly affectthe spectral distribution of the light emitted.

In CL techniques, after mixing of the rea-gents and the sample, the CL reaction starts andthe emission intensity is being produced, decrea-sing once the reactants are consumed. This im-plies a transient character of the CL emission, ofwhich the time scale depends on the specificreaction, and which can range from a short flashto a continuous glow. This fact is crucial for theselection of the most convenient systems of re-agent addition.

4.1. Introduction of sample and reagents

Depending on the configuration of the deviceand the method for sample and reagents intro-duction, it is possible to classify the systems intostatic (batch or discrete sampling instrument) orflowing streams.

In static systems, discrete portions of the CLreagent and the sample are mixed rapidly in thereaction cell, often at a controlled temperature.Usually the final reagent which initiates the CLreaction is added with a syringe or using anautomatic injector in order to provide a more



quisición y procesador de señal (Figura 7). Enel compartimento cerrado se coloca la célula dereacción (un tubo de ensayo, un microplato, unacélula de flujo, etc.) con objeto de que toda laluminiscencia sea captada por el detector. Estecompartimento debe estar sellado a luz ambien-tal para evitar posibles interferencias y se debecolocar tan cerca como sea posible del detectorpara conseguir una máxima eficiencia óptica.Espejos, lentes y otros dispositivos adicionalesse pueden utilizar para aumentar el ángulo dedetección y conseguir una alta eficiencia óptica,al objeto de obtener una relación señal-ruidoóptima; así, se obtiene un instrumento rápido ypreciso. La función del compartimento es man-tener la mezcla de reactivo y muestra, a unatemperatura adecuada y en completa oscuridad afin de aislar el detector de la luz externa. Nor-malmente no es necesario el uso de monocroma-dores porque la intensidad de QL que surge deuna de las especies no se ve apenas afectada ensu distribución espectral, por la presencia de otrasespecies.

reproducible injection speed and volume and asynchronization of data collection in relation tothe initiation of the reaction. Mixing of sampleand reagents is provided by the force of injec-tion, although a magnetic stirring bar and stirrercan be used. In this case, the whole CL intensityvs. reaction time profile is monitored. Depen-ding on the situation, the analytical signal can betaken as the maximum CL intensity (peak heig-ht), the signal after some fixed delay time fromthe point of mixing, the integral of the signalover some time period, or the integral of theentire peak (full area). All of these are correla-ted with the analyte concentration. This appro-ach is used in selective reactions in solution phaseshowing high quantum yields or long time emis-sion, such as bioluminescent reactions, CL im-munoassay or nucleic acid assays.

Continuous flow CL systems are used in gas-phase and solution-phase reactions. The sampleand the CL reagents are continuously pumpedand mixed together using a merging zones flow-injection manifold and sent to a flow-cell or mixed

FIGURA 7.- Configuración esquemática de un luminómetro.

FIGURE 7.- Schematic configuration of a basic luminometer.

DETECTOR AMPLIFICADOR REGISTRO

FUENTE DE ALTO VOLTAJECÁMARA DE

MUESTRA

CÉLULA DE REACCIÓN

SISTEMA DE INTRODUCCIÓN DE MUESTRA Y REACTIVOS

ALOJAMIENTO

100



En las técnicas de QL, una vez mezclados losreactivos y la muestra comienza la reacción qui-mioluminiscente y la intensidad de la emisiónque se está produciendo, disminuye una vez quelos reactantes se han agotado. Esto supone queel carácter de la emisión quimioluminiscente estransitorio, y que la escala de tiempo depende dela reacción en cuestión, que va de un corto flasha una emisión continua. Este hecho es crucialpara la selección del sistema más convenientepara la incorporación de los reactivos.

4.1. Introducción de la muestra y los reactivos

Dependiendo de la configuración del disposi-tivo y del método de introducción de muestra yreactivos, los sitemas pueden clasificarse en:estáticos (introducción de cantidades discretas dereactivos y muestra en un recipiente) o sistemasen flujo.

En los sistemas estáticos, pequeñas porcionesde muestra y reactivo CL se mezclan rápidamen-te en la cubeta de reacción, frecuentemente atemperatura controlada. Normalmente el reacti-vo final que inicia la reacción CL se adicionacon una jeringa o usando un inyector automáticopara conseguir una velocidad y volumen de in-yección más reproducibles y una mejor sincroni-zación de la adquisición de datos desde el iniciode la reacción. La mezcla de los reactivos y lamuestra se produce por la fuerza de la inyec-ción, aunque a veces, se puede utilizar un agita-dor magnético. En estos casos, se registra la curvacompleta de intensidad de emisión de QL enfunción del tiempo de reacción. Dependiendo dela situación, la señal analítica puede ser tomadacomo la intensidad máxima de QL (altura máxi-ma del pico), la señal después de un tiempo fi-jado desde el momento de la mezcla, la integralde la señal en un determinado periodo tiempo ola integral del pico completo (el área completa).En cualquiera de los casos, las medidas estaránrelacionadas de manera lineal con la concentra-ción de analito. Esta técnica se usa en reaccionesselectivas en disolución que muestran un altorendimiento cuántico o un largo tiempo de emi-sión, como las reacciones bioluminiscentes, elinmunoensayo quimioluminiscente o ensayos deácidos nucleicos.

Los sistemas de QL en flujo continuo se usanen reacciones en disolución y en fase gaseosa.La muestra y los reactivos son continuamente

and the emission observed in an integral reactor-flow cell. The signal is observed when the cellis totally filled with the reaction mixture, at afixed period after mixing. In this case, it is possibleto obtain a constant and reproducible signal, easierto measure, which represents the integrated outputover the residence time of the reaction mixturein the cell. Optimum sensitivity is achieved byadjusting the flow rate, the observation cell vo-lume and transfer channel volumes, with the aimof the observed portion of emission profile oc-curring at the maximum of the CL intensity vs.time profile. As disadvantages of this approachare to be mentioned the high reagent consumption,the fact that no kinetic information is obtainedand that only a very small portion of the totalCL intensity is measured for slow reactions.

In the flow injection mode, the analyte ca-rrier stream and the reagent stream flow conti-nuously; the sample containing the analyte isinjected and the carrier transports it into the reac-tion and detection zone. The signal is acquiredas a narrow peak, which corresponds to the por-tion of analyte passing though the cell. Depen-ding of the situation, it is possible to inject notonly the sample, but also other CL reagents, e.g.,in the case of more expensive chemicals. Thismethodology shows as advantage the low con-sumption of analyte or CL reagents and the smallervolume of the cell, so as to prevent excessivedilution; the signal is highly reproducible andprecise because it corresponds to the height ofthe peak; moreover it is possible -in given cases-to adapt on-line chemical treatments to improveselectivity (Figure 8).

4.2. Reaction cell

Depending on the CL reaction that is carriedout in the liquid, solid or gas phases it is possi-ble to use different reaction cells, being the es-sential requirement for their design that themaximum intensity must be reached while thestream containing the analyte and the CL rea-gent is in front of the detector. It is a verycritical variable because both in static and flowmethods the magnitude of the CL intensity isproportional to the volume of the cell. Usuallyit is possible to apply any material that transmitslight in the visible range and that is compatiblewith the sample, such as glass, quartz or evenacrylic or other plastics. Polystyrene is not re-



bombeados y mezclados a través de un conector,en donde se produce la mezcla, que está muypróximo a la célula en donde se realiza la detec-ción. La señal se observa cuando la célula estátotalmente llena con la mezcla de reacción, a untiempo predeterminado después de la mezcla. Enestos casos, es posible obtener una señal cons-tante y reproducible muy fácil de medir, y querepresenta la emisión total de la mezcla de reac-ción durante el tiempo que está en la célula. Elóptimo de sensibilidad se consigue ajustando lavelocidad de flujo y el volumen entre el puntode mezcla y el punto de observación con objetode conseguir el perfil máximo de intensidad CLen función del tiempo. Como desventajas de estatécnica destacan el alto consumo de reactivo, elhecho de que no se obtenga ninguna informa-ción cinética y que solamente una pequeña por-ción de la intensidad de QL total es la que semide cuando las reacciones son lentas.

En el modo de inyección de flujo, el analitose incorpora a una disolución portadora, el reac-tivo va por una línea aparte y fluye constante-mente; la muestra es inyectada en la disoluciónportadora y a través de conectores o válvulas semezcla con el reactivo, para producir la reacciónde QL, muy cerca de la zona de detección. Enestas condiciones, la señal se obtiene como unpico estrecho que se corresponde con la alícuotade analito inyectada. Dependiendo de la situa-ción, es posible llevar a cabo, no sólo la inyec-ción de muestra sino que también, en el caso deque los reactivos quimioluminiscentes sean ca-ros, incorporarlos del mismo modo que la mues-tra, con objeto de evitar un consumo grande delos mismos. Esta metodología tiene la ventaja deun bajo consumo, tanto de muestra como dereactivos y la utilización de una célula de menorvolumen, evitando así una dilución excesiva; laseñal es muy reproducible y precisa ya que sepuede conseguir que se corresponda con la máximaaltura del pico; además, es posible - en algunoscasos- incorporar tratamientos químicos “ on line”para alcanzar una mayor selectividad (Figura 8).

4.2. Célula de reacción

El tipo de célula de reacción va depender deque la reacción de QL se lleve a cabo en faselíquida, sólida o gaseosa, siendo un requerimien-to esencial para su diseño que el máximo deintensidad se produzca cuando la mezcla anali-

commended because it can build up static elec-tricity which may contribute to elevated back-ground levels. More transparent cell materialsallow more light to reach the detector, resultingin better detection limits.

In the case of flow CL measurements in theliquid phase, the cell design most frequently usedis a long spiral cell (about 1 cm) which is loca-ted as close to the detector as possible. The largevolume is required due to the need to collect agreater amount of emitted light and because thethin size required (50-100 µm) minimizes bandbroadening and provides a thin optical path toreduce inner filtering effects of the CL emission.With the purpose to minimize sample dispersion,usually the injection valve and the cell must beplaced as close to one another as possible.

4.3. Detector

There are four basic requirements for thedetector, which constitutes the critical part ofthe luminometer [2]:

a) it must be able to detect a light signal overseveral orders of magnitude of intensity (fromjust a few photons per second to tens of millionsof photons per second),

b) it must be sensitive at least over the spec-tral range 400-600 nm, and ideally over the com-plete range of the visible spectrum (i.e. 380-750nm) and even into the UV and IR regions. If itssensitivity varies with wavelength, as is usuallythe case, then it must be possible to correct thedata for this,

c) the signal output presented by the detectorshould be directly related to the light intensityreaching it, ideally linearly over the entire sen-sitivity range. The signal from the detector shouldbe produced in a form which can be easily dis-played, recorded, and analyzed,

d) the speed of response of the detector mustbe much faster than the rate of the CL reaction,if the signal output is not to be a distorted ver-sion of the true signal.

Light is detected by photosensitive devicesthrough the generation of photocurrent. PMTsare the detection devices more frequently usedin CL because of their high gains making themsuitable for low light-level detection [39 ,40 ].However, they must be operated with very sta-ble power supplies to keep the total gain cons-

102



to-reactivo quimioluminiscente esté frente aldetector. Es una variable muy crítica porque tan-to en los métodos estáticos como los de flujos,la magnitud de la intensidad de QL es propor-cional al volumen de la célula. Normalmente, esposible usar cualquier material que sea transpa-rente a la luz en la región del visible y que seacompatible con la muestra, tales como vidrio,cuarzo, plástico acrílico u otros. El poliestirenono es aconsejable, porque adquiere con muchafacilidad electricidad estática y puede produciruna señal alta de fondo. Las células construidascon los materiales más transparentes permiten lallegada de una mayor cantidad de luz al detec-tor, consiguiéndose con ello unos mejores lími-tes de detección.

En el caso de los métodos de inyección enflujo, el diseño más frecuente de la célula es enespiral (de aproximadamente 1 cm), colocándoselo más cerca posible del detector. Para minimizarel ensanchamiento de banda y reducir los efectosde filtro interno en la emisión de QL se necesitaque la célula tenga un grosor pequeño (50-100 ?m) y una superficie relativamente grande ya que lacantidad de luz emitida es directamente propor-cional al volumen de la misma. Con objeto dereducir la dispersión de la muestra, generalmentela válvula de inyección y la célula se deben colo-car tan cerca una de otra como sea posible.

tant. There are two different configurations forPMTs depending on their position in relation tothe reaction cell: either to the side (“ side-on”configuration) or underneath the reaction cell(“ end-on” configuration). Side-on PMTs are usua-lly more economical than end-on models and theirvertical configuration takes up less space thanthe end-on versions. However, end-on PMTs havea large photocathode area and offer a greateruniformity of light collection and of the respon-se [41 ].

Other detection modes in bright CL or BLreactions are multichannel detectors, which pro-vide simultaneous detection of the dispersed ra-diation and produce a permanent image of a widearea. Photographic films or plates are emulsionsthat contain silver halide crystals in which inci-dent photons produce stable clusters of silver atomswithin the crystals. Internal amplification is pro-vided in the development process by an electrondonor which reduces the remaining silver ions tosilver atoms within the exposed crystals. A com-plexing agent is used to remove the unexposedsilver ions. The photographic detection is anintegrating process in that the output (density ofsilver) is a result of the cumulative effect of theentire incident radiation during the exposing time.The image is constituted by many thousands ofgrains on each square cm of film, being neces-

FIGURA 8.- Diagrama esquemático de un dispositivo FIA para el análisis de glucosa incorporando un reactorenzimático con detección basada en la reacción del luminol.

FIGURE 8.- Schematic diagram for an FIA manifold for the analysis of glucose incorporating an enzymatic reactorwith detection based on the luminol reaction.

ml/min

Tampón 1.5

[Fe(CN)6]3-

1.5Luminol

1.5

Glucosa

Reactor Enzimático D

Detector



sary only 10 to 100 photons to produce a deve-lopable grain. The main limitations are: non-linearity of the response over the wide range oflight intensities required to observe CL, restric-ted dynamic range reciprocity failure and adja-cent effects. More efficient imaging devices forCL are vidicon cameras and charged coupleddevices (CCDs), which have been recently in-corporated in CL instrumentation.

4.4. Signal conditioning, manipulation and readout

The photoanodic current from the PMT is firstconverted to voltage with an operational ampli-fier in the current-to-voltage configuration. Of-ten, after further voltage amplification the rea-dout signal from the analog transducers isconverted to digital because of the digital do-main allowing the signal to be treated with hig-hly accurate digital methods or with software ina microcomputer. The increasing use of compu-ter-controlled CL instruments allows the easykeyboard control of instrumental parameters, andthe analytical response is stored in memory forlater manipulation. Even specific software hasbeen designed for specialized applications suchas kinetics studies and measurements, flow sys-tems CL studies, CL detectors coupled to HPLCor GC, etc.

MAIN CHEMILUMINESCENCEAPPLICATIONS

In the last few years, analytical interest in theuse of CL systems in analytical (including phar-maceutical analytical) chemistry is growing ex-ponentially, mainly in gas and liquid-phases;however, CL applications in the solid phase aremore limited. Table 2 shows some of the appli-cations of the more widely used CL systems.

4.3. Detector

Hay cuatro requerimientos básicos para eldetector, que constituye la parte crítica del lumi-nómetro [2] :

a) debe ser capaz de detectar una señal lumi-nosa de varios órdenes de magnitud de intensi-dad (desde unos pocos fotones por segundo adecenas de millones por segundo),

b) debe ser sensible al menos en la regiónespectral de 400-600 nm, idealmente en la re-gión completa del visible (380-750 nm) inclusoen la regiones pertenecientes al UV e IR,

c) la señal registrada por el detector debe estarrelacionada directamente con la intensidad de luzque ha llegado a él, idealmente directamenteproporcional en todo el rango de sensibilidadrequerido. La señal producida por el detector debepoder ser fácilmente leída, registrada y analiza-da,

d) la velocidad de respuesta del detector debeser más rápida que la velocidad de la reacciónde QL, si no, la señal será una versión distorsio-nada de la señal original.

La luz es detectada por dispositivos fotosen-sibles que generan una fotocorriente. Los foto-multiplicadores son los detectores más común-mente utilizados en QL debido a su alta ganancia,que posibilita la detección de bajos niveles deluz [39 ,40 ]. Sin embargo, deben estar conecta-dos a un estabilizador de corriente para podermantener constante la ganancia total. Hay dosconfiguraciones posibles para los fotomultipli-cadores dependiendo de su posición con respec-to a la célula de reacción: en disposición lateral(configuración “ side-on” ) o frontalmente a la célulade reacción (configuración “ end-on” ). Los foto-multiplicadores “ side-on” suelen ser más baratosque los “ end-on” y su configuración vertical haceque ocupen menos espacio que los últimos. Sinembargo, los “ end-on” tienen un fotocátodo conmayor área y ofrecen una uniformidad superioren la detección y en la respuesta de la señalluminosa [41 ].

Otros modos de detección en reacciones quepresentan QL o BL intensa son los detectoresmulticanales, que proporciona la detección si-multanea de la radiación dispersada y produceuna imagen permanente de un área amplia. Seusan películas o placas fotográficas que constande emulsiones que contienen cristales de halurode plata, de modo que cuando inciden fotones

104



sobre ellas se produce una cascada estable deátomos de plata en el interior del cristal. Laamplificación interna en el desarrollo del proce-so se consigue a través de un donor de electro-nes, que reduce los iones de plata restantes aátomos de plata dentro de los cristales que hanestado expuesto a la emisión. Suele utilizarse unagente complejante utilizar para eliminar los ionesplata que no han reaccionado. La detección foto-gráfica es un proceso integrante en el que la señalde salida (densidad de plata en la película) es elresultado del efecto acumulativo de la radiaciónincidente total durante el tiempo de exposición.La imagen está constituida por muchos miles degranos de plata por cada cm2 de película, siendonecesario solamente de 10 a 100 fotones paraproducir el desarrollo de los granos de plata. Lasprincipales limitaciones son: la no linealidad delas respuestas en un amplio rango de intensida-des de luz necesarias para observar la emisiónde QL, rango dinámico limitado por fallo dereciprocidad y efectos adyacentes. Otros dispo-sitivos más eficientes para la obtención de imá-genes en QL son las cámaras vidicon y los dis-positivos de carga acoplada (CCDs, chargedcoupled devices), que recientemente han sidoincorporados a la instrumentación en QL.

4.4. Acondicionamiento de la señal, manipula-ción y lectura

La corriente fotoanódica procedente del foto-multiplicador es convertida en primer lugar envoltaje con un amplificador operacional en laconfiguración corriente-a-voltaje. A menudo,después de la amplificación del voltaje, la señalde salida de los transductores analógicos se con-vierte a digital, porque en modo digital es posi-ble tratar la señal con métodos digitales muyexactos o con un programa en un microordena-dor. El uso de ordenadores que controlan losinstrumentos en QL, hace posible el control delos parámetros instrumentales de forma fácil, através del teclado del ordenador y el almacena-miento de la respuesta analítica en la memoriadel mismo para una posterior manipulación.Actualmente existen algunos programas diseña-dos para aplicaciones específicas, tales comomedidas y estudios cinéticos, estudio de siste-mas quimioluminiscentes en flujo, para detecto-res quimioluminiscentes acoplados a cromatografíaliquida o de gases, etc.



Fase Reactivo Analito�� I*

�� I* =��%��I

�� I*� ��7�� I

��

�� =4 0��.�� =4��I* 0��.��3�� #�� - �� #� �� F��

J0�J��E'� 0�J��E'� ��J��E'� K�J��E'0�J��E'� 1�J��E'� 0�J��E'� 0�J�$E'��J�$E'�0 I�'��J0�E

*�E0��=��-��+��I+��J=4I4'�I4'��4'��9E

Inhibidores (Ag(I), Ce(IV),Ti(IV), V(V), etc.)

Sustancias fácilmente oxidables eindirectamente determinadas

(ácido ascórbico, ácidocarboxílico, aminas, etc.)

��=4I4

J� ��'��9E�� #��

�3�� ,�� J,�J�E'�<J��E'�0�J��E'�0�J��E'0�J��E'�0�J��E'��J��E'�1�J��E'��9I+��J=4I4'�I4'��9E��=4I4

0�� J0�J��E'��J��E'� 1�J$E'� -�� %�'�� '��.8��'��9E

�3�� 2�J%�#E**� ,�� -��

�3�� +�+� �� I+��J=4I4''��9E� �� J"��%��-�� & ��'��9E0�� J��-��'��'�� -��'�-��%�+& ��'�� '��9E

�&3�� I+��1�I5�'�0 I�

'�0�J�$E'��I5�'��9

/�� 7� �� J�� 8��E

�� I4�#�� &��

TABLA II. Algunas aplicaciones de los principales sistemas de QL.

TABLA II. Common applications of the main CL systems.

106



PRINCIPALES APLICACIONESQUIMIOLUMINISCENTES

En los últimos años, el interés en el uso desistemas quimioluminiscentes en química analí-tica (incluyendo el campo del análisis farmacéu-tico) está creciendo exponencialmente, principal-mente en fase líquida y gaseosa; sin embargo,las aplicaciones en fase sólida son más limita-das. En la Tabla 2 se recogen algunas aplicacio-nes de los sistemas quimioluminiscentes másfrecuentemente utilizados.

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Quimioluminiscencia: una interesante alternativa para la detección