Příprava předmětu byla podpořena

projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie -

Detektory - I

HPLC - Detektory

A.Braithwaite and F.J.Smith;Chromatographic Methods, Fifth edition, BlackieAcademic & Professional 1996

Colin F. Poole and Salwa K. Poole;Chromatography Today, Elsevier Amsterdam 1995

www.esainc.com

Melissa J. Wilcox, Raaidah Saari-Nordhaus

Application Note, A sensitive, flexible, dual-modeevaporative light scattering detector

1.2.4. Detektory pro HPLC

• Ideální detektor by měl mít následující vlastnosti:

� Vysokou citlivost

� Vysokou selektivitu nebo univerzálnost

� Dobrou stabilitu a reprodukovatelnost

� Lineární odezvu několik řádů

� Malý vnitřní objem

� Rychlou odezvu

� Nezávislou odezvu na změně teploty a tlaku

� Nedestruktivní detekci

� Spolehlivost

• Neexistuje tak univerzální a citlivý detektor jako je FIDv plynové chromatografii

• Často detektor nezaznamenává všechny látky

• Je nutno provést kalibraci detektoru-obvykle pro každou složkuzvlášť

• V HPLC se především používají následující typy detektorů:

� Optické

� Elektrochemické

� Hmotnostní

1.2.4.1. Optické detektory

• Nejužívanější detektor

• Zdroje záření:

� Nízkotlaká rtuťová lampa s maximem 254 nm, pro měřenína 254 nm, případně na 280 nm + filtry

� Deuteriová lampa, pro měření v oblastiod 190 nm – 400 nm

� Wolframová lampa, pro měření v oblastiod 400 nm do 700 nm

� Xenonová lampa, pro měření v oblastiod 190 nm – 800 nm

• Odezva detektoru závisí na složce a na použité vlnové délce,Beer-Lambert => A=ε*d*cε je molární absorpční koeficient [l mol-1 cm-1], d je síla kyvety[cm], c je látková koncentrace [mol l-1]

U aromatických složek se molární absorpční koeficienty měníaž o 3 řády podle struktury molekuly a počtu jader

Fotometrický detektor - měření na jedné vlnové délce

• Detekce aromátů a látek majících dvojné vazby

• Objem analytické cely - ~5 µl-10 µl

• Optická dráha ~ 1 cm

• Lze užít pro gradientové separace

• Dobrý dynamický rozsah 104-105

• Malá citlivost na nestabilitu průtoku a teploty

• Šířka pásu ~ 8 - 10 nm, vliv na citlivost a na L-B zákon

• Podle konstrukce detektoru malá nebo relativně velká citlivost

k indexu lomu solventu

Konstrukce měrné cely je velmi podstatná

Komerčně jsou vyráběny detektory umožňující programováníměřící vlnové délky v čase => zvýšení citlivosti a selektivitydetekce

Detektor s proměnnou vlnovou délkou

Některé detektory umožňují současné měření při dvou vlnovýchdélkách => možnost ověření čistoty píku

PDA detektor (Photodiode-Array)

• Umožňuje kontinuální skenování celého spektra eluátu po dobu analýzy bez zastavování toku

• Reverzní optika – viz schéma

• Detektor nemá žádné pohyblivé díly – vysoká spolehlivost a přesnost

• Celé spektrum záření z cely je rozkládáno holgrafickou mřížkou na záření o jednotlivých vlnových délkách

• Záření o vymezených vlnových délkách dopadá na lineární pole až 1024 fotodiod na křemíkovém čipu, každá fotodioda má spektrální rozlišení ~ 1.2 nm

• Absorpční spektra jsou produkována velkou rychlostí - 0.01 sec na 1 spektrum

• Spektra jsou vynesena např. jako funkce vlnové délky a času, 3D mapa je nastavitelná podle všech os, umožní prohlížení v různých úhlech, ale existuje ještě mnoho různých 2D způsobů prohlížení dat

• Spektra jsou používána k identifikaci složek - knihovny spekter

• Spektra jsou také důležitá při kontrole čistoty píku – algoritmy

PDA detektor

Fluorimetrický detektor

• Konstrukčně podobný fotometrickým detektorům

• Měří se fluorescenčí záření - látka je excitována zářenímo určité vlnové délce a emituje záření s vyšší vlnovou délkou

• Detektor je vybaven filtry v excitační a emisní části,monochromátory nebo kombinací filtru a monochromátoru

• Obvykle pravoúhlé uspořádání s parabolických zrcadlem prozlepšení citlivosti

• Zdrojem záření je xenonová nebo deuteriová výbojka

• Možnost snímání excitačního a emisního spektra

• Látky vykazující fluorescenci mají obvykle konjugovanoucyklickou strukturu, např. PAH

• Mnoho nefluoreskujících látek je možno vhodně derivatizovat

• Výhody:� Vysoká citlivost – 10 – 1000 x lepší než fotometrický detektor� Vysoká selektivita� Linearita ~ 103

� Malá citlivost na změny teploty a průtoku

• Nevýhody:� Pokud je při použité vlnové délce absorbance eluentu většínež 0.05 může dojít ke koncentračnímu zhášení, proto sepoužívají rozpouštědla neabsorbující v UV oblasti, alifatickéuhlovodíky, alifatické alkoholy, některé ethery apod.

2,3-diaminophenazine (DAP) - CARBAMATE