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Page 1 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Preparación de muestras en matrices
alimenticias: SPE y QuEChERS
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Page 2 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Sección de aplicaciones
Análisis de Seguridad Alimentaria
QuEChERS:
Quick, Easy, Cheap, Effective, Robust and Safe , QuEChERS (Rápido, Fácil,Barato,Efectivo, Robusto y Seguro, RaFaBERS)
• Método AOAC 2007.01
• Método EN 15662 (2008)
• PAHs y tensioactivos en pescados
• Pesticidas en Te Verde
Extracción Líquido/Líquido en Soporte Sólido (Chem Elut)
• Método Lutz-Alder
• Pesticidads Acidos
• Método de Multi-residue de pesticidas en mieles
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Page 3 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Sección de aplicaciones II
Análisis de Seguridad Alimentaria
SPE: Extracción en Fase Sólida
Lista de positivos Japonesa
Plaguicidas en productos agrícolas
Extracción de Micotoxinas
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Page 4 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
¿Qué es QuEChERS (pronunciado “Catchers”)
• Quick, Easy, Cheap, Effective, Robust and Safe , QuEChERS
(Rápido, Fácil,Barato,Efectivo, Robusto y Seguro, RaFaBERS)
• Desarrollado conjuntamente por la USDA (2003) y por las Agencias Reguladoras de
Alimentos Europeas (método prEn 15662: 2007)
• Metodología para una extracción simplificada de un gran número de residuos de
pesticidas multiclase y multiresiduo en frutas y vegetales
• QuEChERS es un método de preparación de muestra rápido para hacer screening de
analitos de interés, no para concentrar muestra.
• QuEChERS está todavía en los comienzos, y se está adoptando en todo el mundo.
Page 4
Catalogo QuEChERS : Publicación #5990-3562EN
Método Luke o SPE tradicional QuEChERS Beneficio
Tiempo estimado para
procesar 6 muestras (min)
120 30 4x más rápido
Solvente usado (mL) 90 mL 10mL 9 x menos solvente
Desechos clorados (mL) 30 mL Ninguno Más seguro, más
ecológico, menos costo
Equipo especializado, material
de vidrio
Embudo, baño de agua,
contenedores de 200mL ,
evaporador, etc.
Ninguno No se necesitan
consumibles adicionales
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Page 5 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Primer Paso- Extracción
Representación Gráfica de los pasos QuEchERS 1) Pesar la muestra
2) Añadir
homogeneizadores
cerámicos
2) Añadir estandares
3) Vortex
4) Añadir ACN (1% AA)
5) Vortex
6) Añadir sales
7) Agitar 1 min
8) Centrifugar
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Page 6 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Segundo Paso – SPE Dispersiva
Page 6
1) Elegir d-SPE
2) Transferir
alícuota
3) Vortex 1 min
4) Centrifugar
5) Analizar
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Page 7 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Qué hace únicos los kit Agilent SampliQ para
QuEChERS
Fácil selección de Producto: Kits de QuEChERS
Identificados por método y matriz
Apoyo técnico: más de 23 notas de aplicación de
QuEChERS:
• Todo disponible en la página web:
www.agilent.com/sampliQ
• Compendio de Aplicaciones QuEChERS
para alimentos: 5990-4977EN
• Seminarios y demostraciones en todo el
mundo.
Agilent Restricted
Page 7
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Page 8 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Selección del Método: AOAC y EN
15 g de muestra homogeneizada 10 g de muestra homogeneizada
Añadir 15 mL ACN (1% AA), vortex Añadir 10 mL ACN, vortex
Añadir Sales AOAC de Extracción, agitar Añadir Sales EN de Extracción, agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a tubo d-
SPE AOAC Transferir 1 u 6 mL a tubo d-
SPE EN
Transferir a Vial de
Análisis
Analizar por GC/MS o LC/MS/MS* * Require dilución antes del análisis
AOAC 2007.01 EN 15662
Vortex
Centrifugar
Centrifugar
Transferir a Vial de Análisis
Vortex
Centrifugar
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Page 9 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Calidad del empaquetamiento= Reproducibilidad
Page 9
Empaquetar las sales separadamente permite a
los usuarios añadir la muestra antes de añadir
las sales para:
- Prevenir reacciones exotérmicas
- Impedir la degradación de la muestra
-Asegurar las máximas recuperaciones
Empaquetamiento de 3 capas resistente
al agua y UV
Sales empaquetadas bajo corriente de
nitrógeno ( no vacío)
Reduce la aglutinación de las sales,
aumentando la capacidad de vertido
Todos los ingredientes escritos en el
paquete
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Page 10 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
0
10
20
30
40
50
60
0 10 20 30 40 50 60
Te
mp
era
tu
re
ºC
Time (seconds)
AOAC Add Buffered Salts to Sample
AOAC Sample Added to Buffered Salt
0
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30
40
50
60
0 10 20 30 40 50 60
Te
mp
era
ture
ºC
Time (seconds)
EN Add Buffer Salts to Sample
EN Sample Added to Bufferd Salt
Se observa un incremento sustancial de temperatura (aumento de aprox 25 ºC
para el método AOAC y approx 10 ºC para el método EN ) cuando se añade la
muestra a la sal de extracción en el tubo de 50 mL PP frente a cuando se
añade la sal de extracción de una bolsa anhidra a la muestra.
AOAC EN
Truco: Minimizar Reacciones Exotérmicas en la adición de las sales
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Page 11 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Mejoras Agilent en la Extracción de Muestras
Añadir Sales de Extracción a las frutas/vegetales triturados
• Consistencia en la agitación, cada uno agita de manera diferente
• Variabilidad en las aplicaciones QuEChERS,en las recuperaciones
y RSDs
• Homogeneizadores Cerámicos SampliQ
• Reducen el tiempo de agitación de 1 minute a <20
segundos!
• Extracción Consistente de la muestra con las sales
• Rompe los aglomerados de sales.
• Facilita la homogeinización con los angulos de corte
• Incrementa la recuperación de pesticidas de la muestra
• 3 tamaños diferentes: uno para el tubo de extracción de 50 mL y
dos para los tubos de dispersión de de 15 y 2 mL
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Page 12 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
0
20
40
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80
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240
0 10 20 30 40 50 60 70
Pe
rce
nt
Re
co
ve
ry
Time in Seconds of Shaking Extract with Ceramic Homogenizers
Ahorre tiempo con homogeneizadores cerámicos: 20 segundos de agitación es suficiente
Organophosphates Carbamates Benzimidazoles Anilinopyrimidines
Neonicotinoids Triazoles Strobilurins
TRUCO: Mejorar la eficacia de la agitación
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Page 13 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Consejo: Fuerza Iónica- Tamponamiento de la Sal
• Método Tamponado AOAC
Condiciones de tamponamiento relativamente fuertes por
el acetato (pH 4.8)*
• Método tamponado EN
Condiciones de tamponamiento más débiles por el citrato
(pH 5-5.5)**
• Tamponando a pH 5 durante la extración se obtienen
recuperaciones óptimas (> 70%) para ciertos plaguicidas
dependientes del pH ( e.g. pimetrozina, imazalil, tiabendazol)
*S.J. Lehotay, K. Mastovska, A.R. Lightfield, J. AOAC Int. 88 (2005), 615-629 & 60A
** M. Anastassiades, E. Scherbaum, B. Tasdelen, D. Stajnbaher, in: H. Ohkawa, H. Miyagawa, P. W. Lee
(Eds.), Crop Protection, Public Health, Environmental Safety, Wiley-VCH, 2007, p.439.
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Page 14 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
• 50 mg PSA, 50 mg C18, 7.5 mg GCB, 150 mg MgSO4 (2 mL)*
• 400 mg PSA, 400 mg C18, 60 mg GCB, 1200 mg MgSO4 (15 mL)*
• El extracto más limpio , para todas las matrices sin afectar inaceptablemente las
recuperaciones, incluso para pesticidas planares.
(S. Lehotay: J. Chromatography A 1217 (2010), 2548-2560)
*Disponible en Agilent * PSA = Primary Secondary Amines GCB = Graphitized Carbon Black
CONSEJO: Elija el kit dispersivo Correcto (d-SPE)
►d-SPEUniversal (SPE-dispersiva-)◄
• MgSO4 se encuentra en todos los kits dispersivos, retira el agua
restante
• PSA* para retirar acidos orgánicos
• C18 para retirar grasas y lípidos
• GCB* para retirar pigmentos y clorofilas
Los fundamentos
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Page 15 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Agilent Restricted
Page 15
Aplicaciones QuEChERS en 2010: más alla de
los Pesticidas en Frutas y Vegetales
Aprenda hoy más en www.agilent.com/chem/SampliQ
Aplicación Literatura Kit QuEChERS
usados
Fármacos Veterinarios(antibioticos)
en tejidos animales
5990-5085EN
5990-5086EN, 5990-5395EN
5982-5650
5982-4921
PAHs en Pescado 5990-5441EN, 5990-6668EN
5982-5755
5982-5158
Pesticidas en Aceite de Oliva 5990-5553EN 5982-5550
5982-5122
PAH‟s en Suelos (sedimentos) 5990-5452EN , 5990-6324EN
5982-5755
5982-5156
Acrilamidas en Frituras 5990-5988EN , 5990-5940EN 5982-5850
5982-5022
Pesticidas en Alimentos Infantiles 5990-5028EN 5982-5755
5982-5158
PCBs en Pescados y Aceite de
Pescado
5990-6236EN 5982-5755
5982-5158
Hormonas en camarones y gambas 5990-6589EN 5982-5650
5982-4956
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Page 16 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Agilent Restricted
Page 16
Aprenda hoy más en www.agilent.com/chem/SampliQ
Aplicación Literatura Kit QuEChERS
usados
Pesticidas en Te verde 5990-6400EN
5982-5650
5982-5356
Pesticidas en residuos de manzana 5990-3938EN , 5990-4468EN,
5990-3937EN, 5990-4068EN,
5990-4073EN
5982-5650
5982-5021 y 5982-5056
Universal d-SPE. Pesticidas en
lechuga y manzana
5990-6558EN
5982-5755
5982-0028
Pesticidas en Aceites Esenciales 5990-6432EN
Pesticidas planares en espinacas 5990-4247EN 5990-4248EN
5990-4305EN 5990-4395EN
5982-5755
5982-5222
5982-5258
Fármacos en compuestos biológicos Próxima Publicación
Aplicaciones QuEChERS en 2010: más alla de
los Pesticidas en Frutas y Vegetales
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Page 17 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
25 ng/mL 250 ng/mL 500 ng/mL
Analitos %Recuperación RSD (n=6) %Recuperación RSD (n=6) %Recuperación RSD (n=6)
Naftaleno 80.35 3.29 96.77 4.23 98.64 1.88
Acenaftileno 95.28 2.30 103.36 2.80 101.02 2.27
Acenaftaleno 92.28 2.51 101.18 2.87 100.69 2.34
Fluoreno 95.98 2.99 105.94 2.82 105.00 1.28
Fenantreno 100.51 3.46 104.93 2.71 103.25 1.70
Antraceno 107.38 3.51 105.95 3.45 105.38 1.74
Fluoranteno 113.27 3.87 105.76 3.33 103.64 1.81
Pirene 113.55 3.51 103.99 3.24 102.29 1.94
Benzo[a]antraceno 129.79 3.41 101.45 3.91 100.61 3.24
Criseno 116.75 4.01 98.55 4.17 95.95 5.61
Benzo[b]fluoranteno 131.20 3.70 98.77 4.08 98.08 3.24
Benzo[k]fluoranteno 139.45 2.52 99.13 3.98 95.31 4.54
Benzo[a]pireno 125.30 3.68 95.33 3.89 96.82 1.80
Indeno[1,2,3-cd]pireno 119.51 3.47 94.57 3.23 93.71 2.55
Dibenzo[a,h]antraceno 126.35 3.54 98.55 3.50 98.85 2.24
Benzo[g,h,i]perileno 114.91 4.93 97.30 3.37 95.63 1.83
PAHs en Pescado Pargo Rojo fortificado
Lutjanus campechanus
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Page 18 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Plaguicidas en Te Verde fortificado con QuEChERS
10 ng/g 50 ng/g 250 ng/g
Analitos %Recuperación RSD (n=6) %Recuperación % RSD (n=6) %Recuperación
% RSD
(n=6)
Acefato 80.5 5.4 91.7 2.9 88.9 8.2
Pimetrozina 43.1 3.0 42.2 3.4 43.4 9.8
Carbendazima 114.6 11.6 97.6 2.0 105.0 6.2
Tiabendazol 98.1 6.9 90.4 2.4 81.7 5.8
Imidacloprid 104.3 11.7 108.6 2.5 93.9 7.9
Imazalil 97.5 4.4 87.8 5.6 92.4 4.6
Propoxur 98.1 2.4 110.2 1.7 107.8 3.9
Carbaril 89.7 11.2.14 104.9 3.3 108.1 5.2
Ciprodinil 84.9 2.1 92.5 3.7 93.9 5.5
Etoprofos 103.4 3.1 111.2 3.2 104.9 5.7
Penconazol 108.7 2.9 94.3 4.5 89.8 3.3
Kresim-metil 105.7 12.4 96.4 2.5 99.2 5.5
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Page 19 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Cromatogramas MRM de muestra fortificada con 50 ng/g extraida con el método EN . Identificación de
picos: 1. Acefato 2. Pimetrozina, 3. Carbendazim, 4. Tiabendazol, 5. Imidacloprid, 6. Imazalil, 7. Propoxur, 8.
Carbaril, 9. Ciprodinil, 10. Etoprofos, 11. Penconazol, 12. Kresoxim-metil, Est. Interno: TPP
Plaguicidas en Te Verde: LC/MS/MS
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Page 20 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Extracción Líquido/Líquido en Soporte Sólido (SLE)
Ventajas en el flujo de trabajo
• Método simple y general.
• Sin emulsiones
• Menos cristalería (especialmente con muestras grandes)
• Amplio rango de analitos extraidos
• Posibilidad de automatización
• Altas tasas de recuperación y eluyentes más limpios
Productos disponibles
ChemElut: Cartuchos empaquetados con sorbente
„hydromatrix „ , tierra de diatomeas.
Hydromatrix: Sorbente a granel suelto para usar en
aplicaciones dispersivas o personalizadas.
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Page 22 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Aplicaciones de alimentación (Lutz Alder)
Matrices típicas: pepino, limòn, harina de trigo, avellanas y pasas.
Flujo de trabajo
Añadir agua a 10g
de muestra. Total
presente más
añadida:10mL
Homogeneizar
con 20mL metanol
(+centrifugación)
Añadir solución NaCl a
una alicuota y empapar
en tierra de diatomeas.
Eluir con CH2Cl2
Evaporar a sequedad
y reconstituir en
metanol.
LC-ESI-MS/MS
Pesticidas ácidos
Pesticidas neutros
Método “antíguo”: tierra de diatomeas no
tamponada en cartucho de 5mL
Método Modificado: tierra de diatomeas
tamponada (pH 4.5) en cartucho de 3mL
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Page 23 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
>100 analitos: 23 clases de sustancias
Carbamates (incl. metabolites) Sulfonyl ureas Organophosphates Other (14 substance classes)
3,4,5-Trimethacarb (Landrin) Amidosulfuron Acephate Atrazin
3-Hydroxycarbofuran Bensulfuron-methyl Demeton-S-methyl Azoxystrobin
Bendiocarb Chlorsulfuron Demeton-S-methyl-sulfon Bromoxynil
Carbaryl Cinosulfuron Dimethoat Clethodim
Carbofuran Flazasulfuron Fosthiazate Clethodim-imin-sulfon
Desmethylformamido-pirimicarb Iodosulfuron Methamidophos Clethodim-imin-sulfoxid
Desmethyl-pirimicarb Metsulfuron-methyl Monocrotophos Clethodim-sulfon
Ethiofencarb Nicosulfuron Omethoat 5-Hydroxy-clethodim-sulfon
Ethiofencarbsulfon Primisulfuron-methyl Oxydemeton-methyl Clethodim-sulfoxid
Ethiofencarbsulfoxid Prosulfuron Vamidothion Cyprodinil
Fenoxycarb Rimsulfuron Daminozid
Furathiocarb Thifensulfuron-methyl Benzimidazoles Desmedipham
Methiocarb (Mercaptodimethur) Triasulfuron 5-Hydroxythiabendazol Fenhexamid
Pirimicarb Tribenuron-methyl Carbendazim Fenpropiomorph
Promecarb Triflusulfuron-methyl Thiabendazol Florasulam
Propamocarb Thiophanat-methyl Fludioxonil
Propoxur Benzoyl ureas Imazalil
Flufenoxuron Urea herbicides Ioxynil
Oxim-carbamates (incl. metabolites) Diflubenzuron Diuron Iprovalicarb
Aldicarb Teflubenzuron Isoproturon Isoxaflutole
Aldicarb-sulfoxid Hexaflumuron Linuron Metalaxyl
Aldoxycarb (Aldicarb-sulfon) Triflumuron Metamitron
Butocarboxim Neonicotinoids Metolachlor
Butocarboxim-sulfoxid Oxyalkanoic acids Imidacloprid Phenmedipham
Butoxycarboxim 2,4-D Thiacloprid Pymetrozin
Methomyl MCPA Pyridat
Oxamyl Mecoprop-P Pyridat Metabolit
Thiodicarb Fluazifop-P-butyl Pyrimethanil
Thiofanox Haloxyfop-ethoxyethyl Quinmerac
Thiofanox-sulfon Haloxyfop-methyl Spiroxamine
Thiofanox-sulfoxid Quizalofop-ethyl Tebuconazol
Tebufenozid
Trabajo realizado por Lutz Alder y Jeannette Klein, BgVV Berlin
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Page 24 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Datos de recuperación
Recoveries of 109 pesticides
Lemon without cleanup at 0.01mg/kg
33
0 1
9
15
33
16
2 0 0 0 00
10
20
30
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n.m
.
0-2
0%
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-40
%
40
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%
60
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80
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0%
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0-1
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%
12
0-1
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%
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0-1
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%
16
0-1
80
%
18
0-2
00
%
>2
00
%
nu
mb
er
of
pesti
cid
es
Recoveries of 109 pesticides Lemon with
ChemElut at 0.01 mg/kg
12
48 10
2116
2 1 2 0 1
40
0
10
20
30
40
n.m
.
0-2
0%
20-4
0%
40-6
0%
60-8
0%
80-1
00%
100-1
20%
120-1
40%
140-1
60%
160-1
80%
180-2
00%
>200%
nu
mb
er
of
pesti
cid
es
Trabajo desarrollado por Lutz Alder y Jeannette Klein, BgVV Berlin
Excelentes recuperaciones y bajos RSDs
Solamente dos analitos altamente ácidos no se recuperan
Recuperaciones de 109 pesticidas
Limón sin cleanup a 0.01 mg/kg
Recuperaciones de 109 pesticidas
Limón con ChemElut a 0.01 mg/kg
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Page 25 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
La aplicación muestra el desarrollo y validación de 17 plaguicidas
y metabolitos de diferentes clases químicas.
Insecticidas: Carbofurano (Ca), Metiocarb (Mh), Pirimicarb (Pi), Dimetoato (Dm), Fipronil (Fi),
Imidacloprid (Im)
Herbicidas: Amidosulfuron (Am), Rimsulfuron (Ri), Atrazine (At), Simazine (Si), Cloroturon
(Ch), Linuron (Li), Isoxaflutol (Is), Metosulam (Mo)
Fungicidas: Dietofencarb (De)
Metabolitos: Metiocarb sulfoxido (Mhs), 2-Hidroxitertbutilazina (TOH)
Analisis Multiresiduos de Plaguicidas en Mieles
Slide Headline
Page 26 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Nota de AplicaciónSI-01002
Comparación de recuperaciones
de plaguicidas entre Extracción
Líquido/Líquido en Soporte Solido
(SLE) en Chem Elut y Extracción
Clásica liquido-liquido (LLE).
14 de17 compuestos
exhibieron mayores
recuperaciones con
SLE.
3 compuestos
indetectables fueron
detectados con SLE
SLE mejora la LLE
Slide Headline
Page 27 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Bond Elut Plexa
Un nueva clase de Material Polimérico SPE
Slide Headline
Page 28 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
La Familia Bond Elut Plexa
Bond Elut Plexa
Polímero No-polar con una superficie hidroxilada es la mejor opción para un amplio rango de analitos básicos, neutros y ácidos.
Bond Elut Plexa PCX
Basado en Plexa, conun intercamiador catiónico fuerte, específicamente diseñado para proporcionar resultados más efectivos para compuestos básicos con un amplio rango de pKa y logP
Bond Elut Plexa PAX
basado en Plexa, con un intercambiador aniónico fuerte, específicamente diseñado para proporcionar resultados más efectivos en compuestos ácidos con un amplio rango de pKa y logP
Slide Headline
Page 29 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Como funciona Bond Elut Plexa
Aplicación de Muestra Lavado
Largas Proteínas
endógenas no pueden
acceder a los poros
Los analitos permanecen
enlazados fuertemente
con el núcleo
hidrofóbico del polímero
La estructura del poro
está diseñada especialmente
para permitir un elución excelente
El analito es
transferido
dentro
del polímero
con una
cinética
excelente
Componente hidrofílico
del polímero
permitiendo una
excelente transferencia
de fase Las Proteínas
endógenas
son eliminadas
Se obtiene
un extracto limpio
Slide Headline
Page 30 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
•Plexa – Una nueva clase de Polímero
Las drogas
polares y no
polares enlazan
con la parte
hidrofóbica del
final del poro en
la estructura de
SDVB
Hay un ligando hidroxilado en la superficie de y en
las zonas superficiales de los poros. En el interior
de los poros hay material hidrofóbico. A diferencia
de otros materiales poliméricos del mercado, no hay
grupos amida derivados de la n-vinyl pyrrolidona que
contribuyen al mantenimiento en la superficie de
interferencias de la matriz.
Proteínas excluidas La frecuencia de los
grupos OH se reduce
Grupos OH Hidrofílicos
DVB Hidrofóbico
Cambio en polaridad
Slide Headline
Page 31 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Como funciona
Bond Elut Plexa PCX
CARGA Superficie hidrofílica permite una
excelente transferencia de fase
de los analitos básicos a los
lugares de intercambio catiónico
del polímero
LAVADO Los analitos se mantienen
fuertemente enlazados al
polímero mediante
interacciones iónicas fuertes
ELUCIÓN El cambio de pH permite la
elución de los analitos de
los sitios de intercambio catiónico
Las largas Proteínas
endógenas no pueden
acceder a los poros
Interferencias como lípidos
se pueden lavar sin perder
analitos básicos
Analitos limpios con una
recuperación elevada
Slide Headline
Page 32 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Recuperaciones con Plexa frente a Otro Polímero
Analyte Plexa
Other
Polymer pKa LogP
Albuterol 97.9 115.4 5.9 1.3
Atenolol 97.0 94.0 4.2 4.2
Loratadine 71.0 49.0 5.7 1.5
Metoprolol 92.0 74.0 5.7 1.5
Naltrexone 85.7 13.0 4.9 5.2
Pravastatin 85.0 59.0 4.9 5.2
Propranolol 55.0 35.0 4.9 5.2
Zolpidem 93.0 96.8 9.9 3.4
Plexa proporciona unas recuperaciones absolutas iguales o mejores
que otros polímeros para compuestos con un amplio rango de pKa y
logP
•Condiciones: Recuperación Absoluta a partir de plasma humano (vs. patrón postextracción.)
•Condiciones básicas de carga, n=6, 200 ng/ml
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Page 33 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Recuperación Absoluta vs. Recuperación Relativa
Recuperación Absoluta (AR)
1 - Plasma + ISTD + fármaco
2 - Extracción
3 - Inyección
Comparado con:
Fase Móvil+ ISTD + fármaco
– No extracción, no hay
pérdidas en las
recuperaciones
– No plasma, no hay efectos
de matriz
Recuperación Relativa (RR)
1 - Plasma + ISTD + fármaco
2 - Extracción
3 – Inyección
Comparado con:
Un gráfico de farmacos de control
extraidos (recta de calibración)
– Los fármacos son los mismos y se
deberían extraer con las mismas
eficiencias
– Si las curvas de calibración se hacen
con datos de recuperación del 80%, y los
desconocidos se recuperan al 80%, las
recuperaciones relativas mostrarán un
100%!!
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Page 34 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
•Recuperación Absoluta vs. Recuperación Relativa
• Recuperaciones relativas
– Se añaden concentraciones conocidas de patrón en la matriz, extraen(SPE), y luego se crea una recta de calibración
– Se usa la recta de calibración para calcular las concentraciones del compuesto desconocido
– Se puede enmascarar los efectos de la supresión iónica
• SI el patrón se extrae al 80% de recuperción, y el desconocido también, se mostrarán resultados de recuperación del 100%.
• Las recuperaciones Absolutas no “suprimen” estos efectos
– Se compara un desconocido con el patrón inyectado directamente
• Pequeñas diferencias entre las recuperaciones absolutas vs. relativas es indicativo de la mayor limpieza del extracto o de características de extracción superiores
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Page 35 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Recuperación Absoluta vs. Recuperación Relativa
Recuperación Absoluta
Recuperación Relativa
Pequeñas diferencias entre AR y RR indican mayor eficiencia de extracción y menor
périda de señal debidoa la supresión iónica.
Diferencias mayores indican problemas de sensibilidad debidas a baja eficiencia de
extracción o supresión iónica
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Page 36 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
•Efectos de Matriz
Definición de Efectos de Matriz(Matuszewski, 2003)
1. Efecto de Matriz absoluto.
Diferencia entre la respuesta de analitos igualmente
concentrados(patrones)en el disolvente y en extractos de matriz.
Caso 1. Supresión de señal:
Este es el más habitual.
Caso 2.. Aumento de la señal
Se puede observar cuando la muestra patrón contiene un número muy
grande de analitos mientras que el extracto de matriz contiene un único
analito.
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Page 37 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Cómo identificar la Supresión Iónica.
Experimento de Infusión post-columna
37
Bomba Masas
Muestra (matriz) inyectada
Columna
Jeringa de Infusión Señal MS
Tiempo
Muestra (matriz) (SPE)
Gradiente. Solo analito
Isocrático. Solo analito
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Page 38 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Precisión mejorada - Supresión iónica reducida
PCX
Otro Polimero La superioridad del Bond Elut PLexa PCX es
evidente en la eliminación de la supresión iónica
inducida por la matriz.
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Page 39 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Consejo: Evaluación de la Supresión Iónica
Forma Sencilla:
Comparara las recuperaciones
absoluta y relativa (si la diferencia es
>10% después de n = 3 entonces
tenemos un efecto de matriz
significativo.
Comprehensivo:
Hacer un experimento de infusión
post columna isocratico o gradiente
(preferido)
Adicionalmente:
Monitorizar la transición 184184
para lípidos
Recuperación Absoluta
Recuperación Relativa
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Page 40 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Bases/Neutros
Acondicionamiento: 500 μL MeOH 500 μL Agua
Aplicar la muestra: Acuosa c/ 2% NH4OH
Lavado: 500 μL 5% MeOH
Elución: 500 μL MeOH
Acidos
Acondicionamiento: 500 μL MeOH
500 μL Agua
Aplicar la Muestra: Acuosa
c/ 1% HCO2H
Lavado: 500 μL 5% MeOH
Elución: 500 μL MeOH
Metodología Plexa Sencilla
Métodos para 30 mg Plexa en placa de 96 pocillos
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Page 41 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Metodología Plexa PCX
Bases
Acondicionamiento: 500 μL MeOH
500 μL Agua
Aplicar la Muestra: Acuosa
c/ 2% ac. fosfórico
Lavado Ácido: 500 µL 2% ácido fórmico
Lavado Neutro: 500 µL MeOH:ACN (1:1 v/v)
Elución: 500 µL 5% NH3 en
MeOH:ACN (1:1)
Métodos para 30 mg Plexa en placa de 96 pocillos
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Page 42 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Bond Elut Carbon: Analisis de Plaguicidas
Bond Elut Carbon:
Optimizado para el Análisis de Plaguicidas
• Excelente retención para orgánicos
pequeños, incluyendo aquellos demasiado
polares para ser retenidos en C18 o SPE
polimérica.
• La eliminación de la clorofila y otros
pigmentos produce menos interferencias.
• Más amplia retención y más fácil elución de
los analitos en toda la escala de polaridad,
para mejorar el análisis de residuos múltiples.
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Page 43 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Bond Elut Carbon/NH2 y Bond Elut Si
Lista de Positivos Japonesa: Extracción con disolventes a partir de alimentos, seguido por:
Método I
Acondicionar un cartucho silica gel con carbon
grafito/aminopropilsilanizado ( 500mg/500mg) con
10 ml de acetonitrilo/tolueno (3:1) (Bond Elut
Carbon/NH2 , 500mg/500mg, 6ml, Nº Catalogo:
12252202). Aplicar la solución obtenida del paso
de la extracción al cartucho y eluir el cartucho con
20ml de acetonitrilo/tolueno (3:1)
Recoger el volumen total de eluyente. Concentrar el
eluyente a 1 ml o menos a 40ºC o menor. Añadir 10
ml de acetona y concentrar a 1 ml o menos a 40ºC
o menor. Añadir 5 ml de acetona a la solución
concentrada y concentrar a sequedad
Disolver el residuo en metanol para hacer una
solución de 4 ml. Usar esto como solución de test
Método II
Acondicionar un cartucho de silica gel (500mg) con
5ml de metanol, 5 ml de acetona, y 10 ml de n-
hexano en este orden (Bond Elut Si, 500mg, 10 ml,
NºCatalogo: 14113036). Aplicar la solución obtenida
del paso de extracción anterior al cartucho.
Eluir el cartucho con 10 mL de
acetona/trietilamina/n-hexano (20:0.5:80), y
deshechar el eluyente.
Eluir el cartucho con 20 mL de
acetona/metanol (1:1). Recoger el volumen total
de eluyente.
Concentrar el eluyente a sequedad a 40ºC o
menos. Disolver el resíduo en metanol hasta 4 mL.
Usar esto como solución de test.
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Page 44 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Positivos Japoneses: Alimentos Sólidos
Para vegetales y alimentos
Extracción
Tamaño de muestra 10.0 g
Para granos, cereales y judias
Tamaño de muestra 20.0 g
Extracción
Bond Elut C18 (1 g)
1. Acondicionar con 10 mL de ACN
2. Aplicar 20mL extracto
3. Extraer con 2 mL de ACN
Eliminar agua con Na2SO4
Filtrar, concentrar
Bond Elut Carbon/NH2 6mL (500mg/500mg), P/N 12262202
1. Acondicionar con 10 mL de tolueno:ACN (1:3)
2. Aplicar 20mL extracto
3. Extraer con 10 mL de tolueno:ACN (1:3)
Concentrar
Análisis GC/MS(MS) (DB-35ms UI)
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Page 45 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Micotoxinas
Son metabolitos secundarios producidos por hongos microscópicos y que
contaminan una gran varidad de plantas de cultivo y sus frutos antes o
después de la cosecha, y que son capaces de causar enfermedad y
muerte en humanos y otros animales.
Clases principales de Micotoxinas:
Aflatoxinas B1,B2, G1 y G2 (Aspergillus)
Ocratoxina A (Penicillium verrucosum)
Patulina (otro Penicillium)
Fumonisinas
Tricotecenos: (e.g. Deoxinivalenol, HT-2)
Zearalenona y sus metabolitos Fusarium
Micotoxinas
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Page 46 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Bond Elut Mycotoxin
Técnicas Tradicionales
Columnas de Immunoafinidad (IAC)
Extracciones altamente selectivas con altas
recuperaciones, pero se necesitan columnas IAC
diferentes para cada toxina.
Cartuchos Carbon Vegetal-Alumina
Las recuperaciones de los analitos más polares se
ven a menudo comprometidas con este
procedimiento.
Una variedad de hongos Fusarium producen diferentes toxinas de la clase de
los tricotecenos. Los tricotecenos difieren mucho en polaridad y solubilidad.
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Page 47 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Bond Elut Mycotoxin
Una aproximación con SPE?
• Sorbente SPE para el clean-up cereales y alimentos
basados en cereales contaminados por toxinas de
Fusarium.
• Extracción en Fase Solida basada en un mecanismo
de intercambio ióncio.
• Unica columna y método para 12 Tricotecenos más
Zearalenona tipo A y B
• Excelente purificación : Las micotoxinas pasan el
cartucho, mientras que las impurezas se retienen en
el sorbente.
• Se pueden usar estandar interno para los cálculos de
recuperaciones.
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Page 48 -- Agilent Sample Preparation Tour 2011
Cereales: Extraer 25 g de muestra finamente molida con una solución de 100 mL
acetonitrilo/agua (80/20; v/v) mediante mezclado a alta velocidad durante 3
minutos. Luego Filtrar.
Vino y Cerveza: Desgasificar y Filtrar
• Pasar 4 mL del filtrado a través del cartucho Bond Elut Mycotoxin.
• Evaporar 2 mL del eluato a 50 C con una ligera corriente de nitrógeno.
• Reconstituir en 0.5 mL acetonitrilo/agua (20/80; v/v). Inyectar 10 µL en el
LC/MS/MS para analizar.
Notas de Aplicación 000295 y SI-01075
Metodologías Simples