8/14/2019 Plant Physiol. (1978) 62, 510-515

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P l a n t P h y s i o l . ( 1 9 7 8 ) 6 2 , 5 1 0 - 5 1 5

P h o t o s y n t h e t i c a n d C a r b o h y d r a t e M e t a b o l i s m i n I s o l a t e d L e a fC e l l s o f D i g i t a r i a p e n t z i i 1 g 2

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n D e c e m b e r 2 , 1 9 7 7 a n d i n r e v i s e d f o r m J u n e 6 , 1 9S A L A B . M B A K U , 3 GEORGE J . F R I T Z , 4 AND G E O R G E BOWESD e p a r t m e n t s o f A g r o n o m y a n d B o t a n y , U n i v e r s i t y o f F l o r i d a , G a i n e s v i l l e , F l o r i d a 3 2 6 1 1

ABSTRACTM e s o p h y l i c e l l s a n d b u n d l e s h e a t h s t r a n d s w e r e i s o l a t e d r a p i d l y f r o ml e a v e s o f t h e C 4 s p e c i e s D f g l t a r l p e n t d i S t e n t . ( s l e n d e r s t e m d l i g t g r a s s ) b y

a c h o p p i n g a n d d i e r e n t i a l f i l t r a t i o n t e c h n i q u e . R a t e s o f C O 2 f i x a t i o n i nt h e l i g h t b y n e s o p h y l l a n d b u n d l e s h e a t h c e l l s w i t h o u t a d d e d e x o g e n o u ss u b s t r a t e s w e r e 6 . 3 a n d 5 4 . 2 i n c r o m o l e s o f C O M p e r m i l l g r a m o f c h l o r o -p h y U p e r h o u r , r e s p e c t i v e l y . h e a d d i t i o n o f p y r u v a t e o r p h e n o l p y -r u v a t e t o t h e n e s o p h y U c e l l s i n c r e a s e d t h e r a t e s t o 1 5 . 2 a n d 8 2 4 . 6 m i c r o -m o l e s o f C O 2 p e r m i l l i g r a m o f c h o o p h b y l l p e r h o u r , r e s p e c t i v e l y . T h ea d d i t i o n o f r i b o s e 5 - p h o s p h a t e i n c r e a s e d t h e r a t e f o r b u n d l e s h e a t h c e l l s t o1 0 6 . 8 m l c r o m o l e s o f C O 2 p e r m i l g r a m o f c h l o r o p h y l l p e r h o u r . T h e s er a t e s a r e c o m p a r a b l e t o t h o s e r e p o r t e d f o r c e l l s I s o l a t e d b y o t h e r m e t h o d s .T h e K m ( H C O s ) f o r m e s o p h y l l c e l s w a s 0 . 9 m M ; f o r b u n d l e s b e a t h c e l l sI t w a s 1 . 3 UM a t l o w , a n d 4 0 mm a t h i g h e r HCO- c o n c e n t r a t i n s . A f t e r2 h o u r s o f p h o t o s y n t e s i s b y m yll c e l l s i n 1 4 C O 2 a n d ph eno-p y r u v a t e , 8 8 % o f t h e I n c o r p o r a t e d 1 4 C w a s f o u n d i n o r g a n i c a c i d s a n d 0 . 8 %i n c a r b o b y d r a t e s ; f o r b u n d l e s h e a t h c e l l s i n c u b a t e d i n r i b o s e 5 - p h o s p h a t ea n d A T P , m o r e t h a n 5 8 % o f i n c o r p o r a t e d 1 4 C w a s f o u n d i n c a r b o h y d r a t e s ,m a i n l y s t a r c h , a n d 3 2 % i n o r g a n i c a c i d s . T h e s e f i n d i n g s , t o g e t h e r w i t h t h es t i m u l a t i o n o f C O 2 f i x a t o n b y _ p h s o e n o l p y r u v a t e f o r m e s o p h y l l c e l l sa n d b y r i b o s e 5 - p h o s p h a t e p l u s ATP f o r b u n d l e s h e a t h c e l l s , a n d t h el o c a t i o n o f p h o s p h o e n o l p y r u v a t e a n d r l b u i o s e b i s p h o s p h a t e c a r b o x y l a s e sI n m e s o p h y l l a n d b u n d l e s h e a t h c e l l s , r e s p e c t i v e l y , a r e i n a c c o r d w i t h t h es c h e m e o f C 4 p h o t o s y n t b e s i s w h i c h p l a c e s t h e C a l v i n c y c l e i n t h e b u n d l es h e a t h a n d C 4 a c i d f o r m a t i o n I n m e s o p h y l l c e l l s .S t a r c h a n d r e d u c i n g s u g a r s w e r e p r e s e n t i n b o t h m e s o p b y l l a n d b u n d l es b e a t h c e l s f o l l o w i n g a p e r i o d o f p b o t o s y n t h e s i s b y w h o l e l e a v e s . H o w e v e r ,w h e n I s o l a t e d c e l l s w e r e e x p o s e d t o 1 4 C O 2 I n t h e l i g h t , e v e n w i t h a p p r o -p r i a t e e x o g e n o u s s u b s t r a t e s , o n l y b u n d le s h e at h c e l l s a c c u m u l a t e d a p p r e -c i a b l e a m o u n t s o f l a b e l e d c a r b o h y d r a t e s . I n c u b a t i o n o f m e s o p h y l l c e l l s i nt h e l i g h t w i t h ATP a n d e i t h e r p y r u v a t e a n d i n o r g a n i c p h o s p h a t e , o rp h o s p h o e n o l p y r u v a t e , o r 3 - p h o s p b o g l y c e r a t e r e s u l t e d i n l a r g e I n c r e a s e s i nt o t a l c a r b o b y d r a t e s . T h e 3 - p h o s p h o g l y c e r a t e t r e a t m e n t p r o d u c e d t h e g r e a t -e s t I n c r e a s e . T h e s e r e s u l t s c o u i d n o t b e e x p l a i n e d o n t h e b a s i s o f i n c r e a s e dC O 2 f i x a t i o n . T h e y s u g g e s t t h a t m e o p h y l l c e l l s a r e a b l e t o m e t a b o l i z ee x o g e n o u s l y s u p p l e 3 - c a r b o n c o m p o u n d s t o c a r b o h y d r a t e s , d e s p i t e t h ea p p a r e n t i n a b i l i t y o f t h e s e c e l l s t o u t i l i z e C O M f o r t h i s p u r p o s e , a n d s u p p o r tt h e v i e w t h a t i n t h e w h o l e l e a f 3 - p h o s p b o g l y c e r a t e i s t r a n s p o r t e d f r o mb u n d l e s h e a t h t o m e s o p b y l l c e l l s , w h e r e I t i s r e d u c e d t o c a r b o h y d r a t e .

S u c r o s e a n d s u c r o s e - p h o s p h a t e s y n t h e t a s e s a n d i n v e r t a s e w e r e l o c a l i z e dm a i n l y I n b u n d l e s h e a t h c e U s . A D P - G l u c o s e s t a r c h s y n t h e t a s e a n d a m y l a s ew e r e p r e s e n t m a i n l y I n b u n d l e s h e a t h c e l l s w h e r e a s s t a r c h p h o s p b o r y l a s ew a s p r e s e n t m a h l y I n m e s o p h y l l c e l l s .

1 F l o r i d a A g r i c u l t u r a l E x p e r i m e n t S t a t i o n J o u r n a l S e r i e s N o . 9 5 4 .' T h i s r e p o r t i s b a s e d o n a d i s s e r t a t i o n p r e s e n t e d b y S . B . M . t o t h eG r a d u a t e C o u n c i l o f t h e U n i v e r s i t y o f F l o r i d a i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h er e q u i r e m e n t s f o r t h e P h . D . d e g r e e ; t h e r e s u l t s r e p o r t e d h e r e w e r e o b t a i n e dd u r i n g t h e t e n u r e ( b y S . B . M . ) o f a f e l l o w s h i p g r a n t f r o m t h e A g e n c y f o rI n t e r n a t i o n a l D e v e l o p m e n t .' A d d r e s s : D e p a r t m e n t o f B i o l o g y , U n i v e r s i t y o f Z a i r e , P . O . B o x 1 1 5 ,K i n s h a s a X I , Z a i r e .4 To whom r e q u e s t s f o r r e p r i n t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .

I t i s now g e n e r a l l y a c c e p t e d t h a t a m a j o r f e a t u r e o f C 4 p h o t os y n t h e s i s i s a c o m p a r t m e n t a t i o n o f c a r b o n m e t a b o l i s m b e t w e em e s o p h y l l a n d b u n dl e s h e a t h c e l l s ( 3 , 7 ) . T h e i n i t i a l f i x a t i o n oa t m o s p h e r i c C O 2 i n l e a v e s o f C 4 p l a n t s o c c u r s i n m e s o p h y l l c e l lP E P ' i s c a r b o x y l a t e d b y PE P c a r b o x y l a s e , a n d O AA t h u s f o r m ei s a m i n a t e d t o a s p a r a t e o r r e d u c e d t o m a l a t e . T h e s e C 4 d i c a rb o x y l i c a c i d s a r e t r a n s p o r t e d t o a d j o i n i n g b u n d l e s h e a t h c e l lw h e r e d e c a r b o x y l a t i o n o c c u r s a n d t h e r e l e a s e d C O 2 i s r e f i x e d bRuBP c a r b o x y l a s e i n t h e r e d u c t i v e p e n t o s e p h o s p h a t e p a t h w a yT h i s c o m p a r t m e n t a l i z a t i o n b e t w e e n m e s o p h y l l a n d b u n d l e s h e a tc e l l s h a s l e d t o t h e p r o p o s a l ( 1 7 ) t h a t t h e r e a c t i o n s o f t h e Cp a t h w a y s e r v e t o c o n c e n t r a t e C O 2 i n b u n d l e s h e a t h c e l l s .T h e f o r e g o i n g m o d e l e m p h a s i z e s t h a t m e s o p h y l l c e l l s i n Cp l a n t s f u n c t i o n a s a b i o c h e m i c a l p u m p , s h u t t l i n g C O 2 f r o m t he x t e r n a l a t m o s p h e r e t o b u n d l e s h e a t h c e l l s , w h e r e i t i s r e d u c e dc a r b o h y d r a t e . I t i s a l s o k n o w n t h a t m e s o p h y l l c e l l s o f s o m e Cs p e c i e s c a n a c c u m u l a t e s t a r c h , t h e u s u a l e n d p r o d u c t o f p h o t o s y nt h e t i c c a r b o n r e d u c t i o n . W h e r e a s C 4 s p e c i e s s u c h a s Z e a m a y s (1 1 ) , S o r g h u m s u d a n e n s e ( 2 , 1 1 ) , C h l o r i s g a y a n a ( 1 1 ) , a n d A r i s t ia d s c e n s i o n i s ( 2 ) h a v e b e e n r e p o r t e d t o a c c u m u l a t e s t a r c h i n b u n d ls h e a t h r a t h e r t h a n m e s o p h y l l c e l l s , o t h e r C 4 s p e c i e s i n c l u d iD i g i t a r i a d e c u m b e n s ( 1 8 ) , D . s a n g u i n a l i s a n d C y n o d o n d a c t y l o n ( 4M u h l e n b e r g i a r a c e m o s a ( 2 1 ) , a n d C y p e r u s a l b o m a e g i n a t u s ( 1r e p o r t e d l y a c c u m u l a t e s t a r c h i n b o t h b u n d l e s h e a t h a n d m e s o p h y lc e l l s . T h e d e t a i l s b y w h i c h c a r b o n f i x e d i n i t i a l l y i n t o C 4 a c i d sm e t a b o l i z e d i n t o c a r b o h y d r a t e s i n m e s o p h y l l c e l l s h a v e y e t t o be l u c i d a t e d . I n t h i s p a p e r we p r e s e n t c o m p a r a t i v e d a t a on t h e C Of i x a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s a n d c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m o f i s o l a tm e s o p h y l l a n d b u n d l e s h e a t h c e l l s f r o m D i g i t a r i a p e n t z i i , a s p e c iw h i c h i s c a p a b l e o f a c c u m u l a t i n g s t a r c h i n b o t h c e l l t y p e s .M u c h o f t h e r e c e n t k n o w l e d g e a b o u t t h e m e c h a n i s m o f Cp h o t o s y n t h e s i s i s b a s e d o n s t u d i e s w i t h m e s o p h y l l p r o t o p l a s t s a nb u n d l e s h e a t h c e l l s i s o l a t e d b y e n z y m i c m e t h o d s ( 1 6 , 1 9 , 2 7 ) .t h i s s t u d y we u s e d a r a p i d c h o p p i n g t e c h n i q u e f o r i s o l a t i o nm e s o p h y l l c e l l s a n d b u n d l e s h e a t h s t r a n d s w i t h o u t t h e n e e d fe n z y m e d i g e s t i o n , a p r o c e d u r e w h i c h r e t a i n s i n t a c t t h e c e l l w a li n b o t h t y p e s o f c e l l s .

MATERIALS AND METHODSP l a n t M a t e r i a l . T h e p e r e n n i a l t r o p i c a l f o r a g e g r a s s D . p e n t zS t e n t . ( s l e n d e r s t e m d i g i t g r a s s ) wa s g r o w n i n s o i l i n a g r e e n h o ua n d a l s o i n a g r o w t h c h a m b e r a t 3 2 C u n d e r a 1 7 h r d a y . P l at o p s w e r e c u t b a c k p e r i o d i c a l l y . O n l y t h e t e r m i n a l 1 6 cm o f f u ld e v e l o p e d l e a v e s w a s u s e d a s e x p e r i m e n t a l m a t e r i a l . G r e e n h o up l a n t s w e r e u s e d f o r t h e C O 2 f i x a t i o n e x p e r i m e n t s . I n s t u d i e sc a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m , g r o w t h c h a m b e r p l a n t s were h a r v e s te i t h e r a t t h e e n d o f t h e 1 7 - h r l i g h t p e r i o d ( l i g h t - t r e a t e d p l a n t s )5 A b b r e v i a t i o n s : ADPG: A D P - g l u c o s e : D C P I P : d i c h l o r o p h e n o l i n dp h e n o l ; OAA: o x a l o a c e t a t e ; P E P : p h o s p h o e n o l p y r u v a t e ; PGA: 3 - p h o s p hg l y c e r a t e ; R 5 P : r i b o s e 5 - p h o s p h a t e ; R u B P : r i b u l o s e 1 , 5 - b i s p h o s p h a tUDPG: U D P - g l u c o s e .5 1 0

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C 4 PHOTOSYNTHESIS I N ISOLATED LEAF CELLSa f t e r 2 4 - h r d a r k n e s s ( d a r k - t r e a t e d p l a n t s ) .M e s o p h y l l c e l l s a l s o were i s o l a t e d f r o m l e a v e s o f 3 - t o 5 - w e e k -o l d s o y b e a n ( G l y c i n e max L . , v a r . H a r d e e ) grown u n d e r t h e s amec o n d i t i o n s as t h o s e u s e d f o r D . p e n t z i i .C e l l I s o l a t i o n . A p p r o x i m a t e l y 8 g o f l e a v e s wa s r i n s e d w i t hd i s t i l l e d H20 a n d c u t t r a n s v e r s e l y i n 4 - c m s e g m e n t s . The s e g m e n t swere m a i n t a i n e d a t 4 C , a n d w a s h e d w i t h 4 0 ml o f i c e - c o l di s o l a t i o n medium w h i l e b e i n g c h o p p e d a t 6 5 0 s t r o k e s / m i n f o r 5m i n w i t h a p l a n t t i s s u e c h o p p e r c o n s i s t i n g o f a razor b l a d e s e c u r e dt o t h e e n d o f a m o t o r - d r i v e n v e r t i c a l arm (YEDA S c i e n t i f i cI n s t r u m e n t C o . , R e h o v o t , I s r a e l ) . The i s o l a t i o n medium a t pH 8c o n t a i n e d 0 . 3 3 M D - s o r b i t o l , 5 0 mM T r i c i n e - N a O H , 2% ( w / v )P V P - 4 0 , 2 mM Na2EDTA, 2 mm N a N O 3 , 5 mM M g C l 2 , mMM n C l 2 , 5 mm K 2 H P O 4 , a n d 1 0 mM / 3 - m e r c a p t o e t h a n o l . A f t e rc h o p p i n g , t h e u n m a c e r a t e d t i s s u e wa s d i s c a r d e d a n d t h e r e le a s e dc e l l s were washed t h r o u g h a 3 5 - m e s h s t a i n l e s s s t e e l s i e v e w i t h 1 0ml o f i c e - c o l d i s o l a t i o n m e d i u m . M e s o p h y l l a n d b u n d l e s h e a t hc e l l s t h e n were s e p a r a t e d a t 0 C b y d i f f e r e n t i a l f i l t r a t i o n ( 1 3 ) .M e s o p h y l l c e l l s were c o l l e c t e d on a 2 0 - , u m n y l o n s c r e e n ; b u n d l es h e a t h s t r a n d s were c o l l e c t e d o n a n 8 0 - , u m n y l o n s c r e e n . B o t hm e s o p h y l l c e l l s a n d b u n d l e s h e a t h s t r a n d s were s u s p e n d e d a t pH8 i n i c e - c o l d s u s p e n s i o n medium c o n s i s t i n g o f 0 . 3 3 M D - s o r b i t o l ,5 0 mM T r i s - H C l , I mm N a 2 E D T A , 3 mM M g C l 2 , 1 mi M n C l 2 , 2mM N a N O 3 , I mm K 2 H P O 4 , a n d 5 mm DTT. A l i g h t m i c r o s c o p ewa s u s e d r o u t i n e l y t o m o n i t o r t h e h o m o g e n e i t y o f t h e c e l l prepa-r a t i o n s . C h l was d e t e r m i n e d b y t h e method o f Arnon ( 1 ) .S o y b e a n m e s o p h y l l c e l l s were i s o l a t e d f r o m 6 g o f m a t u r e l e a v e sc u t t r a n s v e r s e l y i n t o 2-cm s e g m e n t s u s i n g t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e df o r m e s o p h y l l c e l l s o f D . p e n t z i i .1 4 C O 2 I n c o r p o r a t i o n by I s o l a t e d C e l l s . CO 2 f i x a t i o n b y t h ei s o l a t e d c e l l t y p e s wa s d e t e r m i n e d b y 1 4 C O 2 i n c o r p o r a t i o n i n t oa c i d - s t a b l e p r o d u c t s i n s a t u r a t i n g l i g h t ( 1 0 0 , u E / m 2 s e c , 40-700n m ) and d a r k . The a s s a y s o l u t i o n f o r m e s o p h y l l c e l l s o f D . p e n t z i ic o n t a i n e d , e x c e p t a s s p e c i f i e d , i n 1 m l : 5 0 mm T r i s - H C l ( p H 8 ) ,0. I mMNa2EDTA, 1 0 mM M g C l 2 , 1 2 mm P E P , a n d c e l l s u s p e n s i o n( 5 - 1 2 , u g o f C h l ) . The s o l u t i o n s were s h a k e n g e n t l y f o r 1 5 m i n a t3 2 C i n a n i l l u m i n a t e d w a t e r b a t h , a n d t h e n N a H ' 4 C O 3 ( 0 . 1

M C i / 1 L m o l ) was i n j e c t e d t o i n i t i a t e t h e r e a c t i o n a n d t o g i v e a f i n a lc o n c e n t r a t i o n o f 5 mm. A f t e r 6 m i n , 0 . 1 ml o f 6 N HCl s a t u r a t e dw i t h 2 , 4 - d i n i t r o p h e n y l h y d r a z i n e wa s i n j e c t e d t o h a l t t h e r e a c t i o n .The s o l u t i o n s were f l u s h e d w i t h a i r t o remove u n i n c o r p o r a t e d' 4 C O 2 , a l i q u o t s were t a k e n , and t h e r a d i o a c t i v i t y was d e t e r m i n e db y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n s p e c t r o s c o p y . I n a s s a y s o f D . p e n t z i i b u n d l es h e a t h s t r a n d s a n d s o y b e a n m e s o p h y l l c e l l s , T r i s a n d PEP i n t h ea b o v e a s s a y s o l u t i o n were r e p l a c e d w i t h 5 0 mm H E P E S ( p H 8 ) , 5mM R S P , a n d 5 mm ATP. The r e a c t i o n wa s i n i t i a t e d w i t hN a H 1 4 C O 3 t o g i v e a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 mM , a n d t e r m i n a t e da f t e r 6 min w i t h 6 N a c e t i c a c i d . A l l o t h e r c o n d i t i o n s were s i m i l a rt o t h o s e i n t h e m e s o p h y l l c e l l a s s a y .E n z y m e A s s a y s . R u B P and PE P c a r b o x y l a s e a c t i v i t i e s i n t h ew h o l e l e a f a n d i s o l a t e d c e l l e x t r a c t s were m e a s u r e d b y t h e m e t h o do f Bowes a n d O g r e n ( 5 ) , e x c e p t t h a t r e a c t i o n s were r un a t 3 2 Cand were h a l t e d a f t e r 3 m i n b y t h e i n j e c t i o n o f 6 N HCI s a t u r a t e dw i t h 2 , 4 - d i n i t r o p h e n y l h y d r a z i n e . A l s o , 0 . 4 mm R uBP wa s u s e d i nt h e a s s a y f o r R u B P c a r b o x y l a s e a n d 5 mm PE P i n t h e PE Pc a r b o x y l a s e a s s a y .F o r a s s a y s o f t h e enzymes i n v o l v e d i n c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m,c e l l and l e a f e x t r a c t s we r e p r e p ar e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d s o fDownton and Hawker ( 9 , 1 0 ) . I n v e r t a s e , a m y l a s e , A D P G - s t a r c hs y n t h e t a s e ( p r i m e d a c t i v i t y ) , a n d s t a r c h p h o s p h o r y l a s e w e r e a s -s a y e d b y t h e m e t h o d s o f Downton a n d H a w k e r ( 9 , 1 0 ) . A s s a y s f o rsucrose a n d s u c r o s e - P s y n t h e t a s e s we re c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t ot h e methods o f L y n e a n d ap R e e s ( 2 2 ) .E x t r a c t i o n a n d I d e n t i f l c a t i o n o f 1 4 C - l a b e l e d C o m p o u n d s . A f t e re x p o s u r e t o N a H ' 4 C O 3 , c e l l s we r e e x t r a c t e d w i t h h o t 8 0 % o ( v / v )e th a nol fo r 20 m i n , c e n t r i f u g e d , and t he s u p e r n a t a n t s d e c a n t e d .For de te rmin a tion s of OAA, some s a m p l e s we re e x t r a c t e d withethanol c o n t a i n i n g 2 , 4 - d i n i t r o p h e n y l h y d r a z i n e . W a s h i n g with

e t h a n o l w a s r e p e a t e d u n t i l t h e t i s s u e s a m p l e s w e r e c l e a r e d o fp i g m e n t s . T h e e t h a n o l - s o l u b l e e x t r a c t s w e r e c o m b i n e d , d r i e d a t3 5 C , a n d w a s h e d w i t h p e t r o l e u m e t h e r . T h e e x t r a c t s w e r e d i s -s o l v e d i n a s m a l l v o l u m e o f w a t e r , c e n t r i f u g e d , a n d 0 . 2 m l o f 0 . 5M g l y c i n e - N a O H ( p H 1 0 ) c o n t a i n i n g 1 0 mM M g C l 2 , 5 A l o f t o l u e n e ,a n d 8 u n i t s o f a l k a l i n e p h o s p h a t a s e w a s a d d e d t o t h e s u p e r n a t a n t s .T h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d f o r 2 4 h r a t 3 7 C a n d t h e n p a s s e ds e q u e n t i a l l y t h r o u g h Dowex 5 0 - X 8 ( h y d r o n i u m f o r m ) a n d DowexI - X 8 ( f o r m a t e f o r m ) c o l u m n s ( I x 1 0 c m ) . A f t e r e l u t i n g t h e s u g a r sw i t h w a t e r , t h e a m i n o a c i d s w e r e e l u t e d f r o m Dowex 5 0 w i t h 2 NNH40H a n d t h e o r g a n i c a c i d s w e r e e l u t e d f r o m Dowex I w i t h4 0 % o f o r m i c a c i d . T h e s u g a r , a m i n o a c i d , a n d o r g a n i c a c i d e l u a t e sw e r e d r i e d , t a k e n u p i n a s m a l l v o l u m e o f w a t e r , s e p a r a t e d b yTLC ( 2 3 , 2 8 ) , a n d t h e i n d i v i d u a l c o m p o n e n t s t h e n w e r e i d e n t i f i e db y c o - c h r o m a t o g r a p h y w i t h a u t h e n i c c o m p o u n d s . T h e r a d i o a c t i v -i t y i n t h e s p o t s w a s d e t e r m i n e d b y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n s p e c t r o s c o p y .P l a n t t i s s u e r e s i d u e s w h i c h r e m a i n e d a f t e r e t h a n o l e x t r a c t i o nw e r e d r i e d a n d t h e n t a k e n u p i n 0 . 1 M a c e t a t e b u f f e r ( p H 4 . 8 ) , a n dh o m o g e n i z e d . T h e h o m o g e n a t e s w e r e i n c u b a t e d w i t h a m y l o g l u -c o s i d a s e ( S i g m a ) a t 5 5 C f o r 9 0 m i n t o c o n v e r t s t a r c h t o g l u c o s e .A f t e r c e n t r i f u g a t i o n t h e r a d i o a c t i v i t y i n t h e s u p e r n a t a n t ( g l u c o s e )a n d t h e p e l l e t w a s d e t e r m i n e d . I n a l l e x p e r i m e n t s t h e p e l l e tc o n t a i n e d l e s s t h a n 0 . 0 1 % o f t h e t o t a l 1 4 C i n c o r p o r a t e d .

C a r b o h y d r a t e A n a l y s e s . I n s t u d i e s o f c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s mb y i s o l a t e d m e s o p h y l l c e l l s , t h e a s s a y c o n d i t i o n s w e r e s i m i l a r t ot h o s e d e s c r i b e d f o r t h e ' 4 C o 2 i n c o r p o r a t i o n s t u d i e s , e x c e p tN a H ' 4 C O 3 w a s o m i t t e d a n d t h e a s s a y s o l u t i o n s w e r e f l u s h e dg e n t l y w i t h a i r d u r i n g t h e c o u r s e o f t h e r e a c t i o n . A f t e r 9 0 - m i ni n c u b a t i o n w i t h v a r i o u s s u b s t r a t e s , t h e c e l l s w e r e k i l l e d w i t h h o t8 0 % e t h a n o l a n d e x t r a c t e d a s d e s c r i b e d a b o v e . A f t e r t h e e x t r a c t sw e r e c l e a r e d o f p i g m e n t s , t h e y w e r e d i s s o l v e d i n 5 m l o f w a t e ra n d c e n t r i f u g e d . T h e s u p e r n a t a n t s w e r e d e i o n i z e d w i t h Dowex5 0 - X 8 ( h y d r o n i u m f o r m ) , n e u t r a l i z e d , a n d t h e r e du c i n g s u g a rc o n t e n t d e t e r m i n e d b y t h e c o p p e r r e a g e n t m e t h o d ( 2 6 ) . G l u c o s ew a s d e t e r m i n e d b y t h e g l u c o s e o x i d a s e m e t h o d ( G l u c o s t a t , W o r t h -i n g t o n B i o c h e m i c a l C o r p . ) . S u c r o s e a l s o w a s d e t e r m i n e d b y t h eg l u c o s e o x i d a s e m e t h o d , b y a n a l y z i n g b e f o r e a n d a f t e r a 2 - h ri n c u b a t i o n w i t h i n v e r t a s e . S t a r c h i n t h e e t h a n o l e x t r a c t e d r e s i d u e sw a s h y d r o l y z e d t o g l u c o s e a s d e s c r i b e d a b o v e , a n d t h e r e l e a s e dg l u c o s e d e t e r m i n e d b y t h e g l u c o s e o x i d a s e m e t h o d .

R E S ULTSM i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f D . p e n t z i i l e a f s e c t i o n s i n d i c a t e dt y p i c a l C 4 a n a t o m y . T h e C 4 n a t u r e o f t h i s p l a n t w a s f u r t h e rc o n f i r m e d b y m e a s u r e m e n t s o f PE P a n d RuBP c a r b o x y l a s e a c t i v -i t i e s i n t h e w h o l e l e a f a n d i n i s o l a t e d l e a f c e l l s ( T a b l e I ) . PEPc a r b o x y l a s e a c t i v i t y p r e d o m i n a t e d i n t h e w h o l e l e a f , a n d o v e r 92%o f t h e a c t i v i t y w a s l o c a t e d i n m e s o p h y l l c e l l s . I n c o n t r a s t , RuBPc a r b o x y l a s e a c t i v i t y w a s t o t a l l y c o n f i n e d t o b u n d l e s h e a t h c e l l s .1 4 C 0 2 I n c o r p o r a t i o n b y I s o l a t e d C e l l s . I s o l a t e d c e l l s w e r e c a -p a b l e o f s u b s t a n t i a l C O 2 f i x a t i o n w h e n s u p p l i e d w i t h s u b s t r a t e s :

PEP f o r m e s o p h y l l c e l l s a n d R5P + ATP f o r b u n d l e s h e a t h c e l l s( F i g . 1 ) . B u n d l e s h e a t h c e l l s e x h i b i t e d l i n e a r i n c o r p o r a t i o n f o ro v e r 9 0 m i n . T h e i n i t i a l r a t e o f i n c o r p o r a t i o n w i t h m e s o p h y l l c e l l sw a s h i g h e r , b u t d e p a r t e d f r o m l i n e a r i t y a f t e r o n l y 1 0 t o 1 5 m i n .T h i s w a s n o t d u e t o a l a c k o f s u b s t r a t e s , b u t may b e a n i n h i b i t i o ne f f e c t d u e t o a c c u m u l a t i o n o f C 4 a c i d s . T h e pH o p t i m a f o r C O 2i n c o r p o r a t i o n b y m e s o p h y l l a n d b u n d l e s h e a t h c e l l s w e r e pH 7 . 5a n d 8 . 2 , r e s p e c t i v e l y ; t h e c u r v e s w e r e b r o a d r a t h e r t h a n s h a r pT a b l e I . P E P a n d R u B P C a r b o x y l a s e A c t i v i t y i n t h e W h ol e L e a fa n d i n I s o l a t e d L e af C el ls o f D . p e n t z i i .

Tissue ~ ~ ~ ~ P E P R u B PT i s s u e C a r b o x y l a s e C a r b o x y l a s er M n o l C O 2 / m g C h l - h r

W h o l e l e a f 9 0 7 . 1 2 4 . 9M e s o p h y l l c e l l s 1 3 8 6 . 9 0B u n d l e s h e a t h c e l l s 1 2 2 . 2 1 2 7 . 6

5 1 1l a n t P h y s i o l . V o l . 6 2 , 1 9 7 8

8/14/2019 Plant Physiol. (1978) 62, 510-515

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MBAKU, F R I T Z , AND B O W E Sp e a k s ( d a t a n o t s h o w n ) . B u n d l e s h e a t h c e l l s h a d a t e m p e r a t u r eo p t i m u m o f a b o u t 3 5 C . On t h e o t h e r h a n d , i n c r e a s i n g t e m p e r a -t u r e s u p t o t h e h i g h e s t e m p l o y e d ( 4 5 C ) i n c r e a s e d t h e f i x a t i o n r a t eo f m e s o p h y l l c e l l s ( d a t a n o t s h o w n ) . T e m p e r a t u r e s b e l o w 2 0 Cr e d u c e d f i x a t i o n b y m e s o p h y l l c e l l s t o a g r e a t e r e x t e n t t h a n f o u n df o r b u n d l e s h e a t h c e l l s . M e s o p h y l l c e l l s i s o l a t e d f r o m s o y b e a n , aC 3 p l a n t , e x h i b i t e d a s i m i l a r t e m p e r a t u r e r e s p o n s e t o t h a t o f t h eb u n d l e s h e a t h c e l l s o f D . p e n t z i i .F i g u r e 2 s h o w s d o u b l e r e c i p r o c a l p l o t s o f t h e C O 2 f i x a t i o n r a t ev e r s u s N a H C O 3 c o n c e n t r a t i o n f o r i s o l a t e d c e l l s . T h e V m . x f o rm e s o p h y l l c e l l s w a s 4 7 5 , u m o l o f C 0 2 / m g o f Ch h r ; t h e a p p a r e n tK m ( H C O 3 ) w a s 0 . 9 m m , w h i c h i s s i m i l a r t o t h a t r e p o r t e d f o r D .

1 4 0

E 6

2 0 /

2 0 40 6 0 80 1 0 0T i m e ( m i n )

F I G . 1 . T i m e c o u r s e o f ' 4 C 0 2 i n c o r p o r a t i o n b y i s o l a t e d l e a f c e l l s o f D .p e n t z i i . M e s o p h y l l c e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 0 m M P E P a n d b u n d l e s h e a t hc e l l s w i t h 5 mM R 5 P a n d 5 mM AT P i n t h e l i g s h t . A t i n t e r v a l s , 0 . 2 - m la l i q u o t s w e r e r e m o v e d f r o m t h e 2 . 5 - m l r e a c t i o n m i x t u r e s a n d a s s a y e d .

-c( -u

C - )E

7 - o M e s o p h y l l c e l l s

< ; 0 ~ ~ ~ K m ( H C O 3 ) 0 . 9 mM

- 1 . 0 0 1 . 0 2 . 0

- 1 0 0 1 0 2 . 0( m M N a H C 0 3 ) - '

F I G . 2 . D o u b l e r e c i p r o c a l p l o t s o f r a t e s o f 1 4 C 0 2 i n c o r p o r a t i o n v e r s u sb i c a r b o n a t e c o n c e n t r a t i o n f o r i s o l a t e d l e a f c e l l s o f D . p e n t z i i i n t h e l i g h t .

s a n g u i n a l i s m e s o p h y l l c e l l s i s o l a t e d b y e n z y m i c t e c h n i q u e s ( 2 0 )B u n d l e s h e a t h c e l l s e x h i b i t e d m o r e c o m p l e x k i n e t i c s ; a t l oHCO3 c o n c e n t r a t i o n s a V m . . o f 5 0 , u m o l o f C 0 2 / m g o f C h l - ha n d a n a p p a r e n t K m ( H C O - ) o f 1 . 3 mm w e r e f o u n d . A t h i g h eHCO3 l e v e l s t h e V m . e x t r a p o l a t e d t o 2 5 0 , u m o l o f C 0 2 / m g oC h l h r a n d t h e a p p a r e n t K m ( H C O 3 ) t o 4 0 mm ( F i g . 2 ) . S i m i l a r lh i g h Km v a l u e s h a v e b e e n r e p o r t e d f o r m e c h a n i c a l l y i s o l a t em a i z e b u n d l e s h e a t h c e l l s ( 6 ) , a l t h o u g h F a r i n e a u ( 1 5 ) o b t a i n e dv a l u e a s l o w a s 0 . 4 m m .F i g u r e 3 s h o w s t h e e f f e c t o f i n c r e a s i n g PEP a n d R 5 P c o n c e nt r a t i o n s o n C O 2 f i x a t i o n b y m e s o p h y l l a n d b u n d l e s h e a t h c e l lr e s p e c t i v e l y . I n t h e a b s e n c e o f P E P , f i x a t i o n b y m e s o p h y l l c e lw a s l o w . A c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 t o 1 2 mm PEP w a s r e q u i r e d f omaximum f i x a t i o n . A 1 5 - m i n p r e i n c u b a t i o n p e r i o d w i t h PE P w af o u n d t o s t i m u l a t e s u b s e q u e n t C O 2 f i x a t i o n b y a s m u c h a s 1 0 0 % oL o n g e r i n c u b a t i o n t i m e s r e d u c e d t h e s t i m u l a t i o n . I n c r e a s i n g c o nc e n t r a t i o n s o f R5P u p t o 1 0 m m , i n t h e p r e s e n c e o f A T P , s t i m u l a t eC O 2 f i x a t i o n b y b un d l e s h e a t h c e l l s ( F i g . 3 ) . E v e n i n t h e a b s e n co f a d d e d R 5 P , b u n d l e s h e a t h c e l l s e x h i b i t e d s u b s t a n t i a l f i x a t i or a t e s .C e l l s w e r e r o u t i n e l y i s o l a t e d a t i c e b a t h t e m p e r a t u r e . T a b l es h o w s t h a t m e s o p h y l l c e l l s o f D . p e n t z i i g e n e r a l l y e x h i b i t e dg r e a t e r c a p a c i t y f o r C O 2 f i x a t i o n i n b o t h t h e l i g h t a n d d a r k w h e

i s o l a t e d a t l o w t e m p e r a t u r e a n d a l s o s h o w s t h e e f f e c t o n C Of i x a t i o n o f s u p p l y i n g m e s o p h y l l c e l l s w i t h v a r i o u s s u b s t r a t e s ia d d i t i o n t o N a H C O 3 . T h e a d d i t i o n o f p y r u v a t e s t i m u l a t e d C Of i x a t i o n , e s p e c i a l l y i n t h e l i g h t , a n d t h i s w a s m o r e t h a n d o u b l ef o r c e l l s i s o l a t e d a t 4 C b y a d d i n g P i a s w e l l . T h e a d d i t i o n o f ATp r o d u c e d a f u r t h e r r a t e i n c r e a s e . PE P a l o n e w a s t h e m o s t e f f e c t ii n s t i m u l a t i n g C O 2 f i x a t i o n . ( T h e e x p l a n a t i o n f o r t h e f a c t t h a t t ha d d i t i o n o f p y r u v a t e + P i + A T P , t h e s u b s t r a t e s o f p y r uv a t e500

z1- ) 30 0E

C - ,

E

1 0 0

0 5 . 0 1 0 . 0 1 5 . 0 2 0 . 0PE P o r R5P ( m M )F I G . 3 . E f f e c t o f i n c r e a s i n g PE P a n d R 5 P c o n c e n t r a t i o n s i n t h e l i go n C O 2 f i x a t i o n r a t e s o f m e s o p h y l l a n d b u n d l e s h e a t h c e l l s r e s p e c t i v e li s o l a t e d f r o m D . p e n t z i i .

T a b l e I I . T h e E f f e c t s o f T e m p e r a t u r e D u r i n g I s o l a t i o n , a n d t h eA d d i t i o n o f V a r i o u s M e t a b o l i t e s o n C O 9 F i x a t i o n b yD . p e n t z i i M e s o p h y l l C e l l s i n t h e L i g h t a n d D a r k .T h e n e t a b o l i t e s w e r e a d d e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 5 m M .

M e t a b o l i t e I s o l a t e d a t4 C I s o l a t e d a t 2 5 C

L i g h t D a r k L i g h t D a r kc m o l C 0 2 / m g C h l h r

N o n e 1 . 3 0 . 6 0 . 9 0 . 4P y r u v a t e 7 . 7 1 . 9 3 . 1 1 . 3P y r u v a t e + P i 1 6 . 1 1 . 2 3 . 8 1 . 0P y r u v a t e + P i + A T P 2 6 . 6 4 . 8 3 1 . 1 1 9 . 6P E P 3 8 1 . 1 3 2 9 . 5 3 2 6 . 0 2 7 2 . 0

P l a n t P h y s i o l . V o l . 6 2 , 1 9 75 1 2

8/14/2019 Plant Physiol. (1978) 62, 510-515

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C 4 PHOTOSYNTHESIS I N ISOLATED LEAF CELLSd i k i n a s e , w a s n o t a s e f f e c t i v e a s PEP i s n o t r e a d i l y a p p a r e n t b u tmay h i n g e o n a r e l a t i v e l y l o w p e r m e a b i l i t y o f m e s o p h y l l c e l l s t oP i a n d / o r p y r u v a t e a n d a l s o o n h i g h PEP c a r b o x y l a s e a c t i v i t y . ) I na l l i n s t a n c e s , C O 2 f i x a t i o n i n t h e l i g h t w a s s u b s t a n t i a l l y g r e a t e rt h a n i n t h e d a r k , e v e n w h e n a n e x o g e n o u s s u p p l y o f ATP w a sp r e s e n t .T a b l e I I I s h o w s t h e e f f e c t o f v a r i o u s m e t a b o l i t e s o n t h e C O 2f i x a t i o n r a t e s o f i s o l a t e d m e s o p h y l l a n d b u n d l e s h e a t h c e l l s . F o rc o m p a r i s o n t h e r e s p o n s e o f s o y b e a n c e l l s a l s o i s i n c l u d e d . M e s o -p h y l l c e l l s o f D . p e n t z i i h a d l o w f i x a t i o n r a t e s i n t h e l i g h t a n d d a r ki n t h e a b s e n c e o f e x o g e n o u s s u b s t r a t e s , w h e r e a s b u n d l e s h e a t hc e l l s h a d c o m p a r a t i v e l y h i g h r a t e s i n t h e l i g h t . R5P w a s e s p e c i a l l ye f f e c t i v e i n s t i m u l a t i n g f i x a t i o n b y b u n d l e s h e a t h c e l l s b u t h a dl i t t l e e f f e c t o n D . p e n t z i i m e s o p h y l l c e l l s . I n t h e d a r k , R5P a l o n eh a d l i t t l e e f f e c t o n C O 2 f i x a t i o n b y b u n d l e s h e a t h c e l l s b ut w i t hATP a d d e d , c o n s i d e r a b l e f i x a t i o n r e s u l t e d . T h e a d d i t i o n o f PEPi n c r e a s e d t h e r a t e a p p r o x i m a t e l y 5 0 % o i n t h e l i g h t a n d s e v e r a l f o l di n t h e d a r k . T h i s i n c r e a s e b y PEP may r e f l e c t t h e s m a l l a m o u n t o fPEP c a r b o x y l a s e a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h b u n d l e s h e a t h c e l l s ( T a -b l e I ) . P y r u v a t e h a d n o s t i m u l a t o r y e f f e c t . S o y b e a n m e s o p h y l lc e l l s s h o w e d s i m i l a r r e s p o n s e s t o D . p e n t z i i b u n d l e s h e a t h c e l l s ,a l t h o u g h t h e d e g r e e o f s t i m u l a t i o n b y R5P a n d R 5 P + ATP w a sg r e a t e r .

C a rb o h y d ra t e M e t a b o l i s m S t u d i e s . M i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o fD . p e n t z i i l e a f s e c t i o n s w i t h 1 2 / K I s o l u t i o n i n d i c a t e d t h a t b o t hb u n d l e s h e a t h a n d m e s o p h y l l c e l l s w e r e c a p a b l e o f a c c u mu l at i n gs t a r c h . T h e s e i n i t i a l o b s e r v a t i o n s w e r e c o n fi r me d b y c a r b o h y d r a t ea n a l y s e s ( T a b l e I V ) o f w h o l e l e a v e s a n d i s o l a t e d c e l l s o b t a i n e df r o m p l a n t s s u b j e c t e d t o e i t h e r a 1 7 - h r l i g h t p e r i o d ( l i g h t - t r e a t e d )o r a 2 4 - h r d a r k p e r i o d ( d a r k - t r e a t e d ) . A l t h o u g h much o f t h ec a r b o h y d r a t e w a s l o c a t e d i n b u n d l e s h e a t h c e l l s , m e s o p h y l l c e l l so f l i g h t - t r e a t e d p l a n t s a l s o c o n t a i n e d a p p r e c i a b l e q u a n t i t i e s o fc a r b o h y d r a t e . T h e d a r k t r e a t m e n t r e d u c e d t h e s t a r c h c o n t e n t o fb o t h c e l l t y p e s b y m o r e t h a n 9 5 % b u t t h e l e v e l s o f t o t a l r e d u c i n gs u g a r s w e r e s o m e w h a t i n c r e a s e d ( T a b l e I V ) . T h e s u c r o s e c o n t e n to f t h e i s o l a t e d c e l l s a n d w h o l e l e a v e s w a s b e lo w t h e l e v e l o fd e t e c t i o n , p o s s i b l y b e c a u s e o f t h e r e l a t i v e l y l o w l i g h t i n t e n s i t yu s e d i n t h e g r o w t h c h a m b e r ( 2 4 0 , u E / m 2 . s e c , 4 0 0 - 7 0 0 n m ) . I n t h ef o l l o w i n g e x p e r i m e n t s , c e l l s w e r e i s o l a t e d f r o m p l a n t s e x p o s e d t oe i t h e r t h e l i g h t o r d a r k t r e a t m e n t d e s c r i b e d a b o v e .T a b l e V s h o w s t h e d i s t r i b u t i o n o f " 4 C i n o r g a n i c c o m p o u n d s

T a b l e I I I . T h e E f f e c t o f V a r i o u s M e t a b o l i t e s o n C O 2 F i x a t i o n i n t h e L i g h ta n d D a r k b y I s o l a t e d L e a f C e l l s o f D . p e n t z i i a n d S o y b e a n .T h e m e t a b o l i t e s w e r e a d d e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 5 n M .

D . p e n t z i i S o y b e a nM e s o p h y l l C e l l s B u n d l e S h e a t h C e l l s M e s o p h y l l C e l l s

M e t a b o l i t eL i g h t D a r k L i g h t D a r k L i g h t D a r k

p m o l C 0 2/ m g C h l* h rN o n e 6 . 3 6 . 6 5 4 . 2 3 . 1 6 7 . 6 3. 7P y r u v a t e 1 5 . 2 1 1 . 0 5 6 . 8 3 . 1 5 3 . 8 2 . 7P E P 8 2 4 . 6 6 0 8 . 1 8 1 . 8 1 7 . 7 1 0 2 . 1 6 . 0R i b o s e - 5 - P 7 . 9 6 . 8 1 0 6 . 8 4 . 2 1 6 4 . 7 1 0 . 2R i b o s e - 5 - P + A T P 1 2 . 1 1 0 . 5 1 8 5 . 0 8 6 . 0 4 0 5 . 3 1 1 0 . 2

T a b l e I V . T h e C a r b o h y d r a t e C o n t e n t o f W h o l e L e a v e s a n d I s o l a t e d L e a f C e l lsf r o m L i g h t a n d D a r k T r e at e d P l a n ts o f D . p e n t z i i .L e a v e s w e r e c o l l e c t e d f o r c e l l i s o l a t i o n a n d c a r b o h y d r a t e a n a l y s e s a f t e rt h e p l a n t s were e x p o s e d t o a 1 7 h r l ig ht p e ri o d o r a 2 4 h r d a r k p e r i o d .

L i g h t T r e a t e d D a r k T r e a t e dT o t a l T o t a lT i s s u e G l u c o s e R e d u c i n g S t a r c h G l u c o s e R e d u c i n g S t a r c hS u g a r s S u g a r s

v i m o l h e x o s e / m g C h lW h o l e l e a f 2 7 2 2 2 2 1 4 1 2 3 0 3 8M e s o p h y l l c e l l s 2 1 1 1 5 5 1 1 0 1 3 8 2B un d l e s h e a t h c e l ls 1 31 7 2 6 3 3 4 4 3 1 1 1 0 1 7

T a b l e V . D i s t r i b u t i o n o f 1 4 C I n c o r p o r a t e d i n t o I s o l a t e d M e s o p h y l la n d B un dl e S h e at h C el l s o f D . p e n t z i i .T h e 4 m l r e a c t i o n m i x t u r e s c o n t a i n e d 1 0 m M N aH 14 C O a n d 1 0 n M P E P( m e s o p h y l l c e l l s ) o r 5 m M R 5 P a n d 5 m M A T P ( b u n d l e s h e a i h c e l l s ) . A2 h r i n c u b a t i o n i n t h e l i g h t w a s u s e d . L e a v e s were c o l l e c t e d f o r c e l li s o l a t i o n f r o m l i g h t t r e a t e d p l a n t s . T h e p r o d u c t a n a l y s e s a n d o t h e re x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e s were a s d e s c r i b e d i n M at e r i a ls a n d M e t h o d s .

P r o d u c t M e s o p h y l l C e l l s B u n d l e S h e a t h C e l l s% o f 1 4 C i n c o r p o r a t e d

T o t a l O r g a n i c A c i d sM a l a t eO x a l o a c e t a t eT o t a l A m i n o A c i d sA s p a r t a t eT o t a l S u g a r sG l u c o s eF r u c t o s eS u c r o s eT o t a l C a r b o h y d r a t e sS t a r c h

8 84 14 00 . 0 70 . 0 20 . 1 500 . 1 30 . 0 2

3 1 . 7

4 . 0

1 5 . 8

0 . 8 1 5 8 . 60 . 6 3 4 2 . 8

f o l l o w i n g a 2 - h r e x p o s u r e o f i s o l a t e d c e l l s t o N a H ' 4 C O 3 i n t h el i g h t . F o r m e s o p h y l l c e l l s , 8 8 % o f t h e r a d i o a c t i v i t y w a s i n o r g a n i ca c i d s , w h i l e o n l y 0 . 8 % w a s i n c o r p o r a t e d i n t o c a r b o h y d r a t e s . I nc o n t r a s t , b u n d l e s h e a t h c e l l s i n c o r p o r a t e d m o r e t h an 5 8 % o f t h er a d i o a c t i v i t y i n t o c a r b o h y d r a t e s , m a i n l y s t a r c h , a n d o n l y 3 2 % i n t oo r g a n i c a c i d s . A s i m i l a r , l o w e r l e v e l o f 1 4 C i n c o r p o r a t i o n i n t oo r g a n i c a c i d s ( a s o p p o s e d t o c a r b o h y d r a t e s ) a l s o h a s b e e n r e p o r t e df o r b u n d l e s h e a t h c e l l s o f m a i z e d u r i n g a 5 - m i n e x p o s u r e t o " ' C O 2i n t h e l i g h t ( 6 ) . I t a p p e a r s t h a t a l t h o u g h i s o l a t e d b u n d l e s h e a t hc e l l s c a n s y n t h e s i z e c a r b o h y d r a t e f r o m C 0 2 , m e s o p h y l l c e l l s o f D .p e n t z i i i n i s o l a t i o n f r o m t h e r e m a i n d e r o f t h e l e a f t i s s u e a r ei n c a p a b l e o f c a r b o h y d r a t e s y n t h e s i s f r o m C O 2 .I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t c e r t a i n m e t a b o l i c i n t e r m e d i a t e s p r o -d u c e d i n b u n d l e s h e a t h c e l l s o f C 4 p l a n t s ma y b e t r a n s p o r t e d t oa n d r e d u c e d i n m e s o p h y l l c e l l s , e v e n t u a l l y f o r m i n g s u g a r s a n ds t a r c h ( 3 , 2 4 ) . To t e s t t h i s h y p o t h e s i s , m e s o p h y l l c e l l s i s o l a t e df r o m d a r k - t r e a t e d p l a n t s w e r e i n c u b a t e d i n t h e l i g h t w i t h s e v e r a lm e t a b o l i c i n t e r m e d i a t e s a n d t h e n a n a l y z e d f o r c a r b o h y d r a t e c o n -t e n t . C O 2 f i x a t i o n r a t e s a l s o w e r e d e t e r m i n e d o n s i m i l a r c e l ls a m p l e s i n t h e p r e s e n c e o f t h e m e t a b o l i t e s . T h e e n d o g e n o u sc a r b o h y d r a t e c o n t e n t o f d i f f e r e n t c e l l p r e p a r a t i o n s v a r i e d s o m e -w h a t , w h i c h a c c o u n t s f o r t h e d i f f e r e n c e s i n t o t a l c a r b o h y d r a t e sa m o n g c o n t r o l s t o w h i c h n o m e t a b o l i t e s w e r e a d d e d .I n c u b a t i o n o f m e s o p h y l l c e l l s w i t h e i t h e r p y r u v a t e + P i o r PEPr e s u l t e d i n a s l i g h t i n c r e a s e i n t o t a l r e d u c i n g s u g a r s , a s c o m p a r e dt o t h e c o n t r o l , b u t n o i n c r e a s e i n s t a r c h ( T a b l e V I , e x p e r i m e n t A ) .S u p p l y i n g PG A d i d n o t i n c r e a s e t h e t o t a l c a r b o h y d r a t e c o n t e n tb u t d i d p r o d u c e a s l i g h t i n c r e a s e i n s t a r c h , a t t h e e x p e n s e o f t o t a lr e d u c i n g s u g a r s . When t h e c e l l s w e r e s u p p l i e d w i t h A T P , i na d d i t i o n t o p y r u v a t e + P i , o r PEP o r P G A , t h e r e w e r e l a r g ei n c r e a s e s i n t o t a l r e d u c i n g s u g a r s a n d t o a l e s s e r e x t e n t i n c r e a s e si n s t a r c h ( T a b l e V I , e x p e r i m e n t B ) . Of t h e m e t a b o l i t e s a d d e d ,PG A + ATP p r o d u c e d t h e g r e a t e s t s t i m u l a t i o n i n t o t a l r e d u c i n gs u g a r s a n d s t a r c h . T h e a d d i t i o n o f ATP a l o n e o n l y i n c r e a s e d o n l ys l i g h t l y t h e t o t a l r e d u c i n g s u g a r s a n d s t a r c h . C o n c e n t r a t i o n s o fPG A a b o v e 5 mm w e r e l e s s e f f e c t i v e i n s t i m u l a t i n g c a r b o h y d r a t ep r o d u c t i o n ( d a t a n o t s h o w n ) .A l l o f t h e m e t a b o l i t e s w h i c h w e r e a d d e d , e x c e p t ATP a l o n e ,p r o d u c e d s o m e i n c r e a s e i n t h e C O 2 f i x a t i o n r a t e . M e s o p h y l l c e l l si s o l a t e d f r o m d a r k - t r e a t e d p l a n t s g e n e r a l l y h a d a h i g h e r C O 2f i x a t i o n c a p a c i t y t h a n t h o s e f r o m l i g h t - t r e a t e d p l a n t s ; t h i s a c c o u n t sf o r t h e h i g h r a t e s o f C O 2 f i x a t i o n i n T a b l e V I .An i n d i c a t i o n o f t h e r e l a t i v e p h o t o r e d u c t i o n c a p a c i t y o f t h ei s o l a t e d c e l l s , w i t h o u t e x o g e n o u s m e t a b o l i t e s , w a s d e r i v e d f r o mm e a s u r e m e n t s o f H i l l a c t i v i t y u s i n g DCPIP a s t h e e l e c t r o n a c c e p -t o r . B o t h m e s o p h y l l a n d b u n d l e s h e a t h c e l l s o f D . p e n t z i i h a d r a t e si n e x c e s s o f 1 , 5 0 0 , u m o l o f DCPIP r e d u c e d / m g o f C h l h r , a sc o m p a r e d t o a b o u t 1 , 2 5 0 f o r i s o l a t e d s o y b e a n m e s o p h y l l c e l l s .T a b l e V I I s h o w s t h e d i s t r i b u t i o n o f a c t i v i t y o f s e v e r a l e n z y m e s

P l a n t P h y s i o l . V o l . 6 2 , 1 9 7 8 5 1 3

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MBAKU, F R I T Z , AND BOWEST a b l e V I . T h e E ff e c t o f V a r i o u s M e t a b o l i t e s o n C a r b o h y d r a t e C o n t e n t a n d C 0 2F i x a t i o n b y I s o l a t e d M e s o p h y l l C e l l s o f D . p e n t z i i .

C e l l s w e r e i n c u b a t e d i n t h e l i g h t f o r 9 0 m i n i n 4 m l r e a c t i o n m i x t u r e sw i t h v a r i o u s m e t a b o l i t e s , t h e n e x t r a c t e d w i t h 8 0 % e t ha n o l a n d a n a l y z e d f o rc a r b o h y d r a t e c o n t e n t . T h e c o n c e n t r a t i o n o f p y r u v a t e , P E P a n d P i w a s 1 0 mM .T h e c o n c e n t r a t i o n o f P G A a n d A T P w as 5 n M . F o r C O 2 f i x a t i o n m e a s u r e m e n t s ,s a m p l e s o f t h e c e l l s w e r e a s s a y e d w i t h 5 m M N a H 1 4 C 0 3 . L e a v e s w e r e c o l l e c t e dfo r c e l l i s o l a t i o n f ro m d ar k t r e a t e d p l a n t s . O t h e r e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n sa n d a n al y se s w e r e a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . E x p e r i m e n t s A , B ,a n d C w e r e p e r f o r m e d o n d i f f e r e n t c e l l p r e p a r a t i o n s .Metabol i te

T o t a l T o t a l C 0 2S t a r c h G l uc os e R e d u c i n g C a r b o h y d r a t e s F i x a t i o n

S u g a r sx m o l h e x o s e / m g C h l

Experiment A:NonePyruva te + PiPEPP G AExperiment B:NonePyruvate + Pi + ATPPEP + ATPPGA + ATP

1 . 81 . 51 . 52 . 6

1 . 52 . 52 . 85.7

6. 02. 84.65 .5

8 .64.72. 43. 1

E x p e r i m e n t C :N o n e 2 . 0 7 . 3A T P 1 . 0 1 8 . 8

7 3 . 79 2 . 28 8 . 57 1 . 9

8 8 . 52 0 0 . 02 0 7 . 82 7 0 . 5

1 4 3 . 41 5 2 . 2

7 5 . 59 3 . 79 0 . 07 4 . 5

9 0 . 02 0 2 . 52 1 0 . 62 7 6 . 2

1 4 5 . 4 0 . 81 5 3 . 2 0 . 9

VII. Activities ofVarious Enzymes Associated with CarbohydrateWholeLeafandinIsolated Leaf cells ofD . pentzii.Enzyme extractswere prepared from isolated cells and whole leaves of

light treatedplants. The ADPG-starch synthetase values rep res ent primedactivity.

E n z y m e Whole M e s o p h y l l Bundle SheathCells Cells

p m o l / m g Chl*hrU D P G - s u c r o s e - P s y n t h e t a s eU D P G - s u c r o s e s y n t h e t a s eI n v e r t a s eA D P G - s t a r c h s y n t h e t a s eA u y l a s eStarch phosphorylase

5 . 90 . 12 7 8 . 51 0 . 12 4 1 . 09.8

0

75.73 8 1 410.2

a s s o c i a t e d w i t h c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m i n t h e t wo c e l l t y p e s .T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t f o r most o f t h e enzymes a s s a y e d moret h a n 9 0 % o o f t h e a c t i v i t y wa s l o c a t e d i n b u n d l e s h e a t h c e l l s . S t a r c hp h o s p h o r y l a s e wa s a n e x c e p t i o n i n t h a t t h i s enzyme a p p e a r e d t ob e l o c a l i z e d m a i n l y i n m e s o p h y l l c e l l s . T h e l o w l e v e l s o f U DP G-sucrose s y n t h e t a s e may b e a f a c t o r c o n t r i b u t i n g t o t h e l o w s u c r o s el e v e l s i n t h e t i s s u e s .

DISCUSSIONC e l l i s o l a t i o n b y t h e c h o p p i n g a n d f i l t r a t i o n m e t h o d u s e d i nt h i s s t u d y h a d s e v e r a l a d v a n t a g e s . T h e m e t h o d was r a p i d a n d

gave e a s i l y r e p r o d u c i b l e r e s u l t s ; o n l y 2 0 t o 3 0 m i n was r e q u i r e d t oo b t a i n r e l a t i v e l y l a r g e q u a n t i t i e s o f b o t h c e l l t y p e s f r o m t h e s a m et i s s u e s a m p l e ; t h e c e l l s were f r e e o f p o s s i b l e d e l e t e r i o u s e f f e c t s o fm a c e r a t i o n enzymes or i m p u r i t i e s c o n t a i n e d t h e r e i n ; c e l l wallswere r e t a i n e d i n t a c t ; p l a s m o l y z i n g c o n d i t i o n s were a v o i d e d . T h ec e l l p r e p a r a t i o n s were h o m o g e n e o u s a s j u d g e d b y l i g h t m i c r o s c o p ya n d l o c a l i z a t i o n s t u d i e s o f t h e c a r b o x y l a t i o n enzymes. R a t e s o fCO 2 f i x a t i o n b y b o t h c e l l t y p e s , w i t h a n d w i t h o u t exogenouss u b s t r a t e s , were s i m i l a r t o or i n excess o f t h o s e r e p o r t e d f o r c e l l si s o l a t e d b y o t h e r m e t h o d s ( 1 6 , 2 0 , 2 5 ) . A s h a s b e e n f o u n d i n o t h e rc e l l i s o l a t i o n s t u d i e s ( 2 0 ) , p y r u v a t e - i n d u c e d CO 2 f i x a t i o n b y t h ei s o l a t e d m e s o p h y l l c e l l s wa s l o w , i n d i c a t i n g l o w r a t e s o f ATPp r o d u c t i o n i n t h e s e c e l l s . To d a t e , o n l y m e s o p h y l l c e l l e x t r a c t sappear c a p a b l e o f high r a t e s o f p y r u v a t e - d e p e n d e n t CO 2 f i x a t i o ni n t h e a b s e n c e o f c o m p o u n d s t o i n d u c e n o n c y c l i c e l e c t r o n t r a n s -p o r t ( 1 4 , 2 0 ) .F o r t h e two c e l l t y p e s i s o l a t e d f r o m D . p e n t z i i t h e d i f f e r e n ta c t i v a t i o n e f f e c t s upon CO 2 f i x a t i o n b y e xo g eno us o r g a n i c s u b -s t r a t e s , t h e s e p a r a t e l o c a t i o n s o f t h e t wo m a j o r c a r b o x y l a t i o n

e n z y m e s , a n d t h e d i f f e r e n c e s i n t h e m a j o r p r o d u c t s o f p h o t o s y nt h e s i s a r e a l l i n a c c o r d w i t h t h e s c h e m e o f C 4 p h o t o s y n t h e s i s w h i cp l a c e s t h e C a l v i n c y c l e i n b u n d l e s h e a t h c e l l s a n d t h e f o r m a t io f C 4 a c i d s l a r g e l y i n m e s o p h y l l c e l l s ( 3 , 7 ) .C O 2 F i x a t i o n i n t o C a r b o h y d r a t e s . A p p r e c i a b l e l e v e l s o f r e d ui n g s u g a r s a n d s t a r c h w e r e f o u n d i n b o t h m e s o p h y l l a n d b u n d ls h e a t h c e l l s i s o l a t e d f r o m D . p e n t z i i f o l l o w i n g a p e r i o d o f p h o ts y n t h e s i s b y w h o l e l e a v e s ( T a b l e I V ) . I n c o n t r a s t , w h e n i s o l a tc e l l s w e r e a l l o w e d t o p h o t o s y n t h e s i z e i n 1 4 C 0 2 , e v e n w i t h aa p p r o p r i a t e e x o g e n o u s s u b s t r a t e , o n l y b u n d l e s h e a t h c e l l s a c cm u l a t e d a p p r e c i a b l e a m o u n t s o f l a b e l i n c a r b o h y d r a t e s ( T a b l e VT h i s s u g g e s t s t h a t a l t h o u g h l e a v e s o f D . p e n t z i i a r e a b l e t o a c cm u l a t e s t a r c h i n m e s o p h y l l c e l l s , o n l y b u n d l e s h e a t h c e l l s p o s s ea l l o f t h e c o m p o n e n t s n e c e s s a r y t o m a n u f a c t u r e c a r b o h y d r a tf r o m C 0 2 .M e t a b o l i s m o f E x o g e n o u s S u b s t r a t e s i n t o C a r b o h y d r a t e s . Ic u b a t i n g i s o l a t e d m e s o p h y l l c e l l s o f D . p e n t z i i i n t h e l i g h t w iPG A d i d n o t i n c r e a s e t h e t o t a l c a r b o h y d r a t e c o n t e n t , a l t h o up y r u v a t e + P i o r P E P d i d p r o d u c e a s m a l l i n c r e a s e ( T a b l e V IH o w e v e r , t h e a d d i t i o n o f A T P , w h i c h b y i t s e l f h a d l i t t l e e f f e c t oc a r b o h y d r a t e a c c u m u l a t i o n , i n c o m b i n a t i o n w i t h p y r u v a t e + Po r P E P , o r P G A , r e s u l t e d i n l a r g e i n c r e a s e s i n t h e c a r b o h y d r ac o n t e n t o f t h e c e l l s . T h e s e l a r g e i n c r e a s e s c o u l d n o t b e e x p l a i no n t h e b a s i s o f i n c r e a s e d C O 2 f i x a t i o n b e c a u s e , e x c e p t f o r P E Pt h e s m a l l s t i m u l a t i o n o f C O 2 f i x a t i o n b r o u g h t a b o u t b y t h e a d d ec o m p o u n d s ( T a b l e V I ) w a s i n s u f f i c i e n t t o a c c o u n t f o r t h e a m o u no f c a r b o h y d r a t e f o r m e d . I n t h e c a s e o f P E P , t h e a n a l y s i s o f tp h o t o s y n t h e t i c p r o d u c t s i n m e s o p h y l l c e l l s ( T a b l e V ) i n d i c a tt h a t o n l y a s m a l l f r a c t i o n o f t h e l a b e l f r o m ' 4 C O 2 a c c u m u l a t e dc a r b o h y d r a t e s . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t m e s o p h y l l c e l l s o fp e n t z i i m e t a b o l i z e d t h e e x o g e n o u s l y s u p p l i e d 3 - c a r b o n c o m p o u n dt o c a r b o h y d r a t e s , d e s p i t e t h e a p p a r e n t i n a b i l i t y o f t h e s e c e l l su t i l i z e C O 2 f o r t h i s p u r p o s e .T h e m o s t e f f e c t i v e s u b s t r a t e w a s P G A , i n c o m b i n a t i o n w iA T P , s u g g e s t i n g t h a t t h e c a r b o h y d r a t e p r o d u c t i o n o b s e r v e d i n tm e s o p h y l l c e l l s o f w h o l e l e a v e s ( T a b l e I V ) c o u l d h a v e r e s u l tf r o m t h e t r a n s p o r t o f s o m e o f t h e PG A f r o m t h e b u n d l e s h e ac e l l s a n d i t s s u b s e q u e n t r e d u c t i o n i n t h e m e s o p h y l l c e l l s . I f s us t a n t i a l a m o u n t s o f PGA w e r e i n v o l v e d , a p o r t i o n o f t h e r e d u ct r i o s e w o u l d h a v e t o r e t u r n t o t h e b u n d l e s h e a t h i n o r d e rr e g e n e r a t e R u B P i n t h e C a l v i n c y c l e . T h e H i l l r e a c t i o n a c t i v i t yt h e m e s o p h y l l c e l l s w a s f o u n d t o b e g r e a t e r t h a n t h a t o f i s o l a ts o y b e a n m e s o p h y l l c e l l s , w h i c h f u r t h e r s u p p o r t s t h e p o s s i b i l it h a t s o m e r e d u c t i o n o f PG A m i g h t o c c u r i n t h e m e s o p h y l l c e l l sD . p e n t z i i . T h e s e o b s e r v a t i o n s a l s o s u p p o r t t h e p r o p o s a l t h a tt h o s e C 4 p l a n t s w i t h l o w P S I I a c t i v i t y i n t h e b u n d l e s h e a t h c e l lt h e PG A p r o d u c e d t h e r e m a y b e t r a n s p o r t e d a n d r e d u c e d i n tm e s o p h y l l c e l l s ( 1 4 , 2 4 ) .T h e o b s e r v a t i o n t h a t 3 - c a r b o n c o m p o u n d s c a n b e u t i l i z e d bi s o l a t e d m e s o p h y l l c e l l s t o f o r m c a r b o h y d r a t e s p r o v i d e s o nc i r c u m s t a n t i a l e v i d e n c e f o r t h e i r i n v i v o i n v o l v e m e n t i n t h e p rp o s e d s h u t t l e b e t w e e n b un dl e s h e a t h a n d m e s o p h y l l c e l l s . T hp o s s i b i l i t y e x i s t s t h a t h e x o s e s , f o r e x a m p l e , a l s o m a y b e t r a np o r t e d f o r c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m . I n t h i s r e g a r d , m e s o p h yc e l l s o f C 4 p l a n t s m a y b e s i m i l a r t o l e a f g u a r d c e l l s . T h e l a t ta s s i m i l a t e C O 2 i n t o m a l a t e b u t c a n n o t r e d u c e C O 2 t o C a l v i n c y ci n t e r m e d i a t e s ; i n s t e a d , t h e r e i s a t r a n s f e r o f s u g a r s f r o m p a l i s aa n d s p o n g y p a r e n c h y m a t i s s u e s t o e p i d e r m a l t i s s u e a n d a c o n v es i o n o f s u g a r s t o s t a r c h i n g u a r d c e l l s ( 8 ) .T h e r e q u i r e m e n t o f m e s o p h y l l c e l l s f o r e x o g e n o u s ATP i n o r dt o f o r m c a r b o h y d r a t e s , d e p s i t e t h e i n c u b a t i o n o f t h e c e l l s i n tl i g h t , i s c o n s i s t e n t w i t h t h e f a c t t h a t m e s o p h y l l c e l l s i s o l a t e d f rC 4 p l a n t s c h a r a c t e r i s t i c a l l y e x h i b i t l o w r a t e s o f p y r u v a t e - d e p e ne n t C O 2 f i x a t i o n ( 2 0 ) . T h i s h a s b e e n a t t r i b u t e d t o i n s u f f i c i e n t ATp r o d u c t i o n b y t h e i s o l a t e d c e l l s f o r t h e e f f e c t i v e o p e r a t i o n o f tp y r u v a t e P i d i k i n a s e r e a c t i o n ( 2 0 ) . H u b e r a n d E d w a r d s ( 2r e p o r t e d t h a t OAA a n d P G A a d d e d i n c o m b i n a t i o n w i t h p y r u v ap r o d u c e d a s u b s t a n t i a l s y n e r g i s t i c s t i m u l a t i o n o f C O 2 f i x a t i o n

9 . 8 1 0 . 2

P l a n t P h y s i o l . V o l . 6 2 , 1 91 4

8/14/2019 Plant Physiol. (1978) 62, 510-515

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P l a n t P h y s i o l . V o l . 6 2 , 1 9 7 8 C 4 PHOTOSYNTHESIS I N IS OLATE D LE AF CE LLS 5 1 5D . s a n g u i n a l i s m e s o p h y l l c e l l s . T h e y p r o p o s e d t h a t t h e a d d i t i o n o fp y r u v a t e + O AA i n d u c e s t h e p a r a l l e l p r o d u c t i o n o f ATP a n dNADP H ( v i a n o n c y c l i c p h o t o p h o s p h o r y l a t i o n ) b y e n a b l i n g ADPa n d NADP+ t o b e r e g e n e r a t e d t h r o u g h t h e c o n v e r s i o n o f p y r u v a t et o PEP a n d O AA t o m a l a t e , r e s p e c t i v e l y . T h u s , i t i s p o s s i b l e t h a tt h e m e s o p h y l l c e l l s i n t h e p r e s e n t s t u d y , s u p p l i e d o n l y w i t hp y r u v a t e + P i , o r P E P , o r P G A , h a d l o w r a t e s o f n o n c y c l i cp h o t o p h o s p h o r y l a t i o n a n d t h e r e f o r e d i d n o t g e n e r a t e s u f f i c i e n tATP t o s u p p o r t t h e r e a c t i o n s o f c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m t h a tr e q u i r e i t s i n p u t . I t i s u n c l e a r w h y t h e a d d i t i o n o f A T P , w h i c h i nc o m b i n a t i o n w i t h p y r u v a t e s t i m u l a t e d c a r b o h y d r a t e f o r m a t i o n ,d i d n o t u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s a l s o a p p r e c i a b l y s t i m u l a t e PEPf o r m a t i o n a n d h e n c e C O 2 f i x a t i o n .C a r b o h y d r a t e M e t a b o l i s m E n z y m e s . I n g e n e r a l , t h e a c t i v i t i e s o ft h e e n z y m e s a s s o c i a t e d w i t h c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m w e r e c o n -s i d e r a b l y h i g h e r t h a n t h o s e r e p o r t e d f o r c e l l s i s o l a t e d f r o m m ai z e( 9 ) . A s i n m a i z e b u n d l e s h e a t h c e l l s o f D . p e n t z i i a p p e a r t o b e t h em a j o r r e p o s i t o r y o f e n z y m e s o f c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m ( T a b l eV I I ) . P h o s p h o r y l a s e i n D . p e n t z i i w a s a n e x c e p t i o n , w i t h o v e r 7 -f o l d h i g h e r a c t i v i t y i n t h e m e s o p h y l l c e l l s a s c o m p a r e d t o t h eb u n d l e s h e a t h c e l l s . I n t h i s r e s p e c t D . p e n t z i i d i f f e r s f r o m b o t hm a i z e ( 9 ) a n d D . s a n g u i n a l i s ( 1 2 ) . T h e a c t i v i t y o f A D P G - s t a r c hs y n t h e t a s e i n D . p e n t z i i m e s o p h y l l c e l l s , a l t h o u g h l e s s t h a n 1 0 % o o ft h a t i n t h e b u n d l e s h e a t h c e l l s , w a s s t i l l h i g h e r t h a n t h a t r e p o r t e df o r e i t h e r c e l l t y p e i n m a i z e ( 9 ) a n d D . s a n g u i n a l i s ( 1 2 ) , a n dt o g e t h e r w i t h t h e h i g h p h o s p h o r y l a s e a c t i v i t y c o u l d a c c o u n t f o rt h e s t a r c h f o r m u l a t i o n t h a t o c c u r s i n D . p e n t z i i m e s o p h y l l c e l l s .T h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n m a i z e a n d D . p e n t z i i i n e n z y m e c o n t e n to f i s o l a t e d c e l l s may b e r e l a t e d t o t h e f a c t t h a t m a i z e d o e s n o ta c c u m u l a t e m u c h s t a r c h i n t h e m e s o p h y l l c e l l s u n d e r n o r m a ld a y l e n g t h s ( 9 ) w h e r e a s D . p e n t z i i d o e s .

LITERATURE CITED1 . ARNON D I 1 9 4 9 C o p p e r e n z y m e s i n i s o l a t e d c h l o r o p l a s t s . P o l y p h e n o l o x i d a s e i n B e t a v u l g a r i s .P l a n t P h y s i o l 2 4 : 1 - 1 52 . B I S A L P U T R A T , WJS D O W N T O N , EB T R E G U N N A 1 9 6 9 T h e d i s t r i b u t i o n a n d u l t r a s t r u c t u r e o fc h l o r o p l a s t s i n l e a v e s d i f f e r i n g i n p h o t o s y n t h e t i c c a r b o n m e t a b o l i s m . I . W h e a t , s o r g h u m ,a n d A r i s t i d a ( G r a m i n e a e ) . C a n J B o t 4 7 : 1 5 - 2 13 . B L A C K CC J R 1 9 7 3 P h o t o s y n t h e t i c c a r b o n f i x a t i o n i n r e l a t i o n t o n e t C O 2 u p t a k e . Annu R e vP l a n t P h y s i o l 2 4 : 2 5 3 - 2 8 64 . B L A C K CC J R , HH M O L L E N H A U E R 1 9 7 1 S t r u c t u r e a n d d i s t r i b u t i o n o f c h l o r o p l a s t s a n d o t h e ro r g a n e l l e s i n l e a v e s w i t h v a r i o u s r a t e s o f p h o t o s y n t h e s i s . P l a n t P h y s i o l 4 7 : 1 5 - 2 35 . B O W E s G , WL O G R E N 1 9 7 2 O x y g e n i n h i b i t i o n a n d o t h e r p r o p e r t i e s o f s o y b e a n r i b u l o s e - 1 , 5 -d i p h o s p h a t e c a r b o x y l a s e . J B i o l Chem 2 4 7 : 2 1 7 1 - 2 1 7 66 . C H O L L E T R , WL OGREN 1 9 7 3 P h o t o s y n t h e t i c c a r b o n m e t a b o l i s m i n i s o l a t e d m a i z e b u n d l e

s h e a t h s t r a n d s . P l a n t P h y s i o l 5 1 : 7 8 7 - 7 9 27 . C H O L L E T R , WL O G R E N 1 9 7 5 R e g u l a t i o n o f p h o t o r e s p i r a t i o n i n C 3 a n d C 4 s p e c i e s : B o t R e v 4 1 :1 3 7 - 1 7 98 . D I T T R I C H P , K R A s c H K E 1 9 7 7 U p t a k e a n d m e t a b o l i s m o f c a r b o h y d r a t e s b y e p i d e r m a l t i s s u e .P l a n t a 1 3 4 : 8 3 - 9 09 . DOWNTON W J S , J S HAWKER 1 9 7 3 E n z y m e s o f s t a r c h a n d s u c r o s e m e t a b o l i s m i n Z e a m a y sl e a v e s . P h y t o c h e m i s t r y 1 2 : 1 5 5 1 - 1 5 5 61 0 . D O W N T O N W J S , J S HAWKER 1 9 7 3 E n z y m e s o f s t a r c h m e t a b o l i s m i n l e a v e s a n d b e r r i e s o f V i t i sv i n i f e r a P h y t o c h e m i s t r y 1 2 : 1 5 5 7 - 1 5 6 3

1 1 . D O W N T O N W J S , EB T R E G U N N A 1 9 6 8 C a r b o n d i o x i d e c o m p e n s a t i o n - i t s r e l a t i o n t o p h o t o s y n -t h e t i c c a r b o x y l a t i o n r e a c t i o n s , s y s t e m a t i c s o f t h e G r a m i n e a e , a n d l e a f a n a t o m y . C a n J B o t4 6 : 2 0 7 - 2 1 51 2 . E D W A R D S G E , CC B L A C K 1 9 7 1 P h o t o s y n t h e s i s i n m e s o p h y l l c e l l s a n d b u n d l e s h e a t h c e l l si s o l a t e d f r o m D i g i t a r i a s a n g u i n a l i s ( L . ) S c o p . l e a v e s . I n MD H a t c h , CB O s m o n d , R O S l a t y e r ,e d s , P h o t o s y n t h e s i s a n d P h o t o r e s p i r a t i o n . W i l e y - I n t e r s c i e n c e , Ne w Y o r k , p p 1 5 3 - 1 6 81 3 . E D W A R D S G E , CC B L A C K J R 1 9 7 1 I s o l a t i o n o f m e s o p h y l l c e l l s a n d b u n d l e s h e a t h c e l l s f r o mD i g i t a r i a s a n g u i n a l i s ( L . ) S c o p . l e a v e s a n d a s c a n n i n g m i c r o s c o p y s t u d y o f t h e i n t e m a l l e a fc e l l m o r p h o l o g y . P l a n t P h y s i o l 4 7 : 1 4 9 - 1 5 61 4 . E D W A R D S G E , SC H U B E R , S B K u , CKM R A T H N A M , M G u r E R R E z , BC MAYNE 1 9 7 6 V a r i a t i o ni n p h o t o c h e m i c a l a c t i v i t i e s o f C 4 p l a n t s i n r e l a t i o n t o C O 2 f i x a t i o n . I n R H B u r r i s , CC B l a c k ,e d s , C O 2 M e t a b o l i s m a n d P l a n t P r o d u c t i v i t y . U n i v e r s i t y P a r k P r e s s , B a l t i m o r e , p p 8 3 - 1 1 21 5 . F A R I N E A U J 1 9 7 5 P h o t o a s s i m i l a t i o n o f C O 2 b y i s o l a t e d b u n d l e s h e a t h s t r a n d s o f Z e a m a y s . I .S t i m u l a t i o n o f C O 2 a s s i m i l a t i o n b y a d d i n g v a r i o u s i n t e r m e d i a t e s o f t h e p h o t o s y n t h e t i c c y c l e ;e v i d e n c e f o r a d e f i c i e n t p h o t o s y s t e m I I a c t i v i t y . P h y s i o l P l a n t 3 3 : 3 0 0 - 3 0 91 6 . G u T I E R R E z M , R K A N A I , S C H u B E R , S B K u , G E EDWARDS 1 9 7 4 P h o t o s y n t h e s i s i n m e s o p h y l lp r o t o p l a s t s a n d b u n d l e s h e a t h c e l l s o f v a r i o u s t y p e s o f C 4 p l a n t s . I . C a r b o x y l a s e s a n d C O 2f r x a t i o n s t u d i e s . Z P f l a n z e n p h y s i o l 7 2 : 3 0 5 - 3 1 9

1 7 . H A T C H MD 1 9 7 1 T h e C 4 - p a t h w a y o f p h o t o s y n t h e s i s . E v i d e n c e f o r a n i n t e r m e d i a t e p o o l o fc a r b o n d i o x i d e a n d t h e i d e n t i t y o f t h e d o n o r C 4 - d i c a r b o x y l i c a c i d . B i o c h e m J 1 2 5 : 4 2 5 - 4 3 2

1 8 . H I L L I A R D J H , SH W E S T 1 9 7 0 S t a r c h a c c u m u l a t i o n a s s o c i a t e d w i t h g r o w t h r e d u c t i o n a t l o wt e m p e r a t u r e i n a t r o p i ca l p l a n t . S c i e n c e 1 6 8 : 4 9 4 - 4 9 61 9 . H U B E R S C , G E E D W A R D S 1 9 7 5 An e v a l u a t i o n o f s o m e p a r a m e t e r s r e q u i r e d f o r t h e e n z y m a t i ci s o l a t i o n o f c e l l s a n d p r o t o p l a s t s w i t h C O 2 f i x a t i o n c a p a c i t y f r o m C 2 a n d C 4 g r a s s e s . P h y s i o lP l a n t 3 5 : 2 0 3 - 2 0 92 0 . H U B E R S C , G E EDWARDS 1 9 7 5 C 4 p h o t o s y n t h e s i s : l i g h t - d e p e n d e n t C O 2 f i x a t i o n b y m e s o p h y l lc e l l s , p r o t o p l a s t s , a n d p r o t o p l a s t e x t r a c t s o f D i g i t a r i a s a n g u i n a l i s . P l a n t P h y s i o l 5 5 : 8 3 5 - 8 4 42 1 . L A E T S C H , WM 1 9 7 4 C h l o r o p l a s t s t r u c t u r a l r e l a t i o n s h i p s i n l e a v e s o f C 4 p l a n t s . I n MD H a t c h ,CB O s m o n d , R O S l a t y e r , e d s , P h o t o s y n t h e s i s a n d P h o t o r e s p i r a t i o n . W i l e y - I n t e r s c i e n c e , Ne wY o r k , p p 3 2 3 - 3 4 92 2 . L Y N E R L , T A P R E E S 1 9 7 2 S u c r o s e m e t a b o l i s m i n s t e l e a n d c o r t e x i s o l a t e d f r o m r o o t s o f P i s u ms a t i v u m . P h y t o c h e m i s t r y 1 1 : 2 1 7 1 - 2 1 7 62 3 . M Y E R S WR, KY HUANG 1 9 6 9 T h i n l a y e r c h r o ma t o gr a ph y o f c i t r i c a c i d c y c l e c o m p o u n d s .M e t h o d s E n z y m o l 1 3 : 4 3 1 - 4 3 42 4 . S A L I N M L , CC B L A C K J R 1 9 7 4 3 - P h o s p h o g l y c e r i c a c i d a s a H i l l o x i d a n t , w i t h o u t C O 2 f i x a t i o n ,i n m e s o p h y l l c e l l s i s o l a t e d f r o m D i g i t a r i a s a n g u i n a l i a ( L . ) S c o p . , a C 4 p l a n t . P l a n t S c i L e t t 2 :3 0 3 - 3 0 82 5 . S E R V A I T E S J C , WL O G R E N 1 9 7 7 R a p i d i s o l a t i o n o f m e s o p h y l l c e l l s f r o m l e a v e s o f s o y b e a n f o rp h o t o s y n t h e t i c s t u d i e s . P l a n t P h y s i o l 5 9 : 5 8 7 - 5 9 02 6 . S P I R o R G 1 9 6 6 A n a l y s i s o f s u g a r s f o u n d i n g l y c o p r o t e i n s . M e t h o d s E n z y m o l 8 : 3 - 2 62 7 . U S U D A H , R K A N A I , S M I Y A C H I 1 9 7 5 C a r b o n d i o x i d e a s s i m i l a t i o n a n d p h o t o s y s t e m I Id e f i c i e n c y i n b u n d l e s h e a t h s t r a n d s i s o l a t e d f r o m C 4 p l a n t s . P l a n t C e l l P h y s i o l 1 6 : 4 8 5 - 4 9 42 8 . VOMHOF DW , TC T U C K E R 1 9 6 5 T h e s e p a r a t i o n o f s i m p l e s u g a r s b y c e l l u l o s e t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y . J C h r o m a t o g r 1 7 : 3 0 0 - 3 0 6