middot

22a 5 Jornadas de Productos Fitosanitarios

PHYTOMA

POSTER TECNICO

Investigacion ydeteccion de metabortos fungicos con acrvdad bacte icida fungici a e insecticida

bull A B GIMENEZ FJ G~RC IA B AEIJO J ROSELLO Y MP SANTAMARINA

INTRODUCCION La producci6n actual de alimentos no

podria mantenerse sin el uso de los plashyguicidas y la posibilidad de afimentar a la poblaci6n mundial del siglo XXI serra utoshypica con una agricullura desprovista de meshydios para luchar contra los inseclos las mashylas hierbas los acaros las bacterias y honshygos fitopalogenos etc (PRIMO YUFf RA 199 1) Sin embargo la rnayoria de los plashyguicidas actuales lienen grandes inconveshynientes par su loxicidad a par los daflos ecol6gicos que producen As pues se hashycen necesarias medidas para disminuir el riesgo y desarrolar nuevas lecnologlas

Una soluci6n serla el descubrimiento de nuevas productos que sean selectvos para especies delerminadas de liseclos a para un grupo de especies afines y que no 10 sean para insectos beneficiosos ni para el media amb ente ni 16xicos para otras especies de vida Actualmenle proshydue lOS obtenidos a partir de microorga shynismos estan siendo empfeados como plashyguicidas (fungicidas bactericidas insecshyticidas y herbicidas) en la protecci6n de los cultivos (CROMBIE 1999 MARRONE

1999 YAMAGUCHI 1992) Los metabolitos secundarios de p ro shy

cedencia ftlngic8 que p resen lan ac livishydades biof6gicas esi8n siendo consideshyrados como potentes plaguicidas Adeshymas muchos de elias tienen la venlaja soshybre los convencionales de que son efecshytivos a concentraciones mtJY bajas no son persistenles y no causaf1 dano en el meshydia ambienle Actualmente hay ya muchas especies fungicas que estan siendo utilishyzadas en la lucha biol6g ieB contra insecshylOS son los l1ongos enfomopat6genos As tenemos como Beauveria bassi ana Vershyticillium lecani Metarllizium anisopliae Hirshysutella tllomsoni Ascllersonia aleyrodis Penicill ium cllrisogenum P aurantiogrishyseum y Zoopllthora radicans ya se emshyplean en muchas partes del mundo para combalif plagas de inseclos Son sabre todo los generos Penicill ium y Aspergillus los que aparecen como mayores producshytores de sustancias de este tipo (CANTIN

1998 CASTILLO 1999 CROMBIE 1999)

n este trabajo se ha realizado un estudio general de diferenshytes cepas fungicas que se han aislado y purificado a partir de materiaes contaminados con objeto de determinar si algunas de elias eran productoras de metabolitos con actividad bioshy

loglca Para ello se han seguido los pasos siguientes 1 Aisamiento purificacion e identificacJon de las cepas fungicas 2 Oeteccion meshydiante tests de antibiosis de las cepas que presentaban actividad anshytibiotica 3 Seleccion de aquelas cepas de mayor actividad para la reshyalizacion de sus respectivDs extractos y 4 Estudio de las actividades bactericida fungicida e insecticida de las cepas seleccionadas Se han conseguido asilar cepas de Penicillium que presentaban actividades bactericidas fungicidas e insecticidas inleresantes

Materially metodos

Organismos empleados

Los microorganismos que se ernpleashyron en los diferentes bioensayos para la determinaci6n de las actividades baclerishycida y fungicida procedfan en su mayorfa de la Coleccion Espanola de Cultivos Ti shypo (CECT) aunque tambien habia algushynos p rocedentes de la ETSIA de Lleishyda (Cultivos Reus RE y Microbiologia Tecshynologia Alirnentos Lleida MTAL)

Se ensayaron 66 capas fungicas para detectar su posible producci6n de metashybolitos secundar ios con aetividad antishybiotica 52 procedian de mohos aislados de cereales (trigo y maiz) 3 de contamishynacion ambiental y el resto procedfan de la CECT can pacos datos sabre los misshymos La distribuci6n de aislamientas par generas fue 23 de Aspergillus 28 de Peshynicillium 3 de Fusarium y 1 de Alternashyria

Para la determinaci6n de la act ividad insecticida se utilizaron insectos de la esshypeeia Oncopeitus fasciatus procedenles de una colonia mantenida en ellaboratoshyrio a 29degC de temperatura y una humedad relativa del 65-70 Estos insectos se alishymentaron can pipas de gi rasol descasshyearadas y el agua se administro en peshyquerios tubas lapados con algodon

Las cepas bacterianas se mantuvieshyron en agar nutritivo (AN) y caldo nutritivo (CN) mientras que las fungicas en agar patata glucosada (PDA)

Aislamiento purificacion e identimiddot ficaci6n de mohos

EI aislamiento de los cultivos se realishyze a partir de frutos 0 semi lias que preshysentaban una contaminacion fungica Esshylas muestras se esterilizaron primero p~r inmersion en una soluci6n a1575 de hi shypoclorilo s6dico dUrante 1 min A contishynuacien se seearon eon papel esteri l La muestra 0 una porcien de la misma se coshy16 siempre en condiciones asepticas en una placa Petri con media de culiivo adeshycuado Las p laeas S8 mantuvieron a 24C durante 5 dias a cabo de los cuales se examinaron para comprobar el crecimiento fungica y proceder pasteriormenle a SU

aislamiento e identificaci6n Para el aislamiento y la identificacion

de los mohas se emplearon las tradishycionales lecnicas del cultivo de extreshymos de hitas cultivos de esporas 0 culshytivos de diluciOn dependiendo en cada casa del tipo y aspecto del moho a pushyrificar

La identificacion de los mohos se reshyal ize en base a sus caraciel1sticas morshy1016gicas y culturales Sa realize hasta el taxon genero y los metbdos empleados fueron de tipo microsc6pico (examen de cu ltivos in vivo y examen de cultivos en partaobjetoS) y macrosc6pico (estudio de los caracleres morfol6gicos y cultushyrales al crecer los sobre medios especishyfices como Agar Czapek 0 Agar Extracshy10 de Malta)

PHYTOMA Espanamiddot NIl 121 AGOSiOlSEPTIEMBRE 2000132

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Ensayos preliminares

Para delectar la posible presencia de metabolitos secundarios fungicos con acshytividades antibi6ticas se real izaron unos ensayos preliminares mediante el Test de Antibiosis 0 de Wickerham segun el proshycedimiento clasico Para elio se sembr6 por estria una suspensi6n de esporas del hongo a ensayar en un lade de la placa (a modo de cuerda de c ircunlerencia) y se incubo a 28 degC durante 4-5 dias a lin de

TABLA 1 Resultados obtenidos con el test de Wic k erham en los cultivos de momiddot

hos que presentaron una mayor actividad antibi6tica Tres fueron las cepas de Aspergillus mas activas las denominadas A02T A03T Y A22T (T aisladas de trigo) 5 de Penicillium P09M P10M P22M P24M Y P26C (M aisladas de maiz y C contaminacion ambiental)i y las dos cepas CECT 2275 Y 2278 de P expansum (la cepa 2278 esta resenada como productora de micotoxinas no asi la 2275 EI signo - indica que el moho no ha inhibido el crecimiento bacterianoi los nushymeros indican un grado de inhibici6n entre 0 y 4 siendo el 4 una inhimiddot bici6n completa ND no determinado

perrnitir el crecimiento del hongo y la proshyduccion de an tibiOtico Despues sa semshybreron por estrfa cruzada los organismos prueba (bacterias) y se incubaron a su temperatura optima (30-35degC) durante 24h para permitir su desarrollo Finalmente se observo si se habia producido inhibicion del crecimiento de los organismos prueshyba Se considero que se habia producido inhibic ion cuando la distancia entre honshygo y bacteria era de 2 cm 0 mas

Las bacterias ensayadas en este bioshyensayo ueron Agrobacterium tumefaciens (CECT 472) Pseudomonas solanacearum (CECT 125) Xanthomonas campestris (CECT 97) Bacillus subtilis (CECT 356) Escherichia coli (CECT 434) Escherichia coli (CECT 943) Serratia marcescens (CECT 977) Staphylococcus aureus (CECT 239) y Streptomyces albus (CECT 3077)

Obtenci6n de extractos fungicos

Las cepas fungicas aisladas se semshybraron en tubos de agar inclinado de PDA y se incubaron a 28 QC durante 1 0 2 se shymanas Transcurrido et tiempo de incu shybaci6n los cultivos se agitaron con 5 ml de agua destilada mas Tween 80 (005) esteril hasta obtener suspensiones de comiddot nidios de aproximadamentel x 10 conishydiosml contados en camara de Thoma

Se prepararon matraces Erlenmeyer de 500 ml de capacidad con 100 ml de medio de cultivo cada uno de elias Los medios de cultivo empleados lueron el Anshytibiotic Test Broth y caldo Patata Glucoshysada Cada matraz se inocula con 1 ml de

~ 7A 1IMMtIdIIn ~JI JC~tlEo _shy amp ~H ~21

3535 3S35 A02T - -- - -25 A03T I 2-0 30 05 - --- - I

40 30 - 25 25A22T 15 - - -30 30 P09M 30 35 0 20 18 10 I 10

20 10 25 P10M OS 10-- --

j NO l S NONOP22M 20 30 fffi1 0 25 I NONO l O Pl4M 20 25 NO NO25 -35 ND20 P-2IiC 40 35 35 30 0 0

IN

I 40 4 0 40 40 40 40 0 0 0

2275

C8p 40 40 4 0 4 0 40 40 0 0 0

2278t I TABLA 2

Extractos fungicos realizados a parti r de las cepas que presentaron mayor actividad en los ensayos preliminares En todos los casos se empleo el caldo del cultivo y el disolvente de extraccion fue dicloromiddot metano

NUnlero de Extcto Cepa fungica Medio de Cultivo

1

2

P_09M

P09M

PDA

Wickerhanl

3

4

P10M

P1 0M

PDA

Wickerham

5

6

P24M

P24M

PDA

W i ckerham

7

a P26M

P_26M

PDA

Wickerham

la suspension de conidios y sa incubo dushyrante 7-14 dias a 28degC

Transcurrido el tiempo de incubacion se procedi6 en cada matraz a la separashycion del micelio y del caldo metabolico mediante filtraci6n a traves de papel Whatshyman nil 4 Cada caldo se lIevo a un emshybudo de decantaci6n y se Ie practicaron 3 lavados can 50 ml de diclorometano reshycogiendo la fase inferior en lin matraz de 250 mi Estos extractos de diclorometano se concentraron en rotavapor y se secashyrOn bajo uente de nitrogeno Posteriorshy

mente se redisolvieron en ciclohexano acetona 0 en mezcla de ambos segun la solubilidad del extracto en cuestion

Determinacion de la actividad bacmiddot tericida de los extractos fUngicos

EI metodo consiste en medir la inhibishyci6n del crecimiento bacteriano impregshynando aifcuotas de los diferentes extracshytos en discos de papel EI medio empleashydo para los ensayos lue el Agar MuellershyHinton Las bacterias ensayadas (Agroshy

bacterium lumefaciens CECT 472 Esshycherichia coli CECT 943 Pseudomonas solanacearum CECT 125 Serratia marcesshycens CECT 977 YXanlhomonas campesshytris CECT 97) se hic ieron crecer en calshydo nutri tivo durante 24 h a la temperatura adecuada para cada una de elias Tras la incubaci6n se procedio a la inoculaci6n por vertido de as ml de suspension bacshyteriana junto con 25 ml de Agar MueJl ershyHinton en p lacas Petri Tras la sol idificamiddot c ion del medio se colocaron sobre su sushyperficie discos previamente impregnados

PHYTOMA Espaiia bull N~ 122 Oc rUBAE 2000 133

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TABLA 3 Actlvldad bactericida de los dierentes extractos ampinglcos selecciomiddot nados frente a 5 bacterias testlgo Los discos contenran dos concenmiddot traciones dlstintas de axtracto (50 mg y 100 mg) Como se observa a la concentracion de 50 mg por disco no hay inhibici6n del crecimienmiddot to bacteriano (halos de 5 mm) pero a la concentraci6n de 100 mg por disco se detecta cierta actividad antibacteriana en algunos extractos especialmente los n 1 2 Y 6 Los resultados se expresan en mm de inhibicion alrededor del disco

II ltN ~m_

x___ Ps__

__CltIII s_____

50shy 100_ lIOd lOO d 111 _ I 100_ M_ 100_ 1IOGtd 100UAid I 5 0 5 11 5 10 5 0 5 I 2 5 bull 5 11 5 10 5 11 5 9 3 5 5 5 5 5 5 bull 5 11

bull 5 5 5 5 5 5 5 I 5 11 5 5 5 5 5 5 5 5 bull 5 8 8 5 II 5 11 5 5 5 I 10 8 7 5 5 S 5 5 5 5 bull 5 S e 5 5 5 5 5 I 5 S I 8 5 11

TABLA 4

Actividad fungicida de los dierentes extractos fampingicos seleccionamiddot dos rente a 5 hongos tesligo Los discos contenian dos concentramiddot ciones distintas de extracto (50 mg y 100 mg) Se aprecia una consi derable actividad de los extractos 1 2 3 Y 7 frente al hongo CUl1Iua ria ritoii a concentraciones de 100 mg por disco que sigue siendo immiddot portante a la de 50 mgd para los extractos 3 y 7 Los extractos 1 y 2 han mostrado tambien actividad frente al hongo Aspergillus versicomiddot or As como el extracto 3 que logro crear un halo de inhibici6n de 17 mm en el crecimiento del hongo Aspergillus candidus a una conmiddot centracion de 50 mgd Los resultados se expresan en mm de inhibimiddot cion alrededor del disco

N Extacto Asf18lrlllus WfSkoIcI PenlcllNum grlllUm 10 aid tOO CIId 50 aid tOO aid

1 17 19 5 5 2 12 17 5 5 3 5 5 5 5 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 7 5 5 5 5 8 5 5 5 5

AspwvflluS __ CurvuMf trIfoJII 8of1)t1$ dn_

10 IIafd 100 aid 50old tOO UiiIiI 101rilif 100 uaId

5 10 11 27 5 S 5 10 11 20 5 5 17 111 22 ze 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 9 5 5 5 5 5 5 5 5 22 27 5 5 5 5 5 5 5 5

con los diferentes extraclos fUngicos Pashyra cada exlracto se emplearon dos conshycentraciones de 50 y 100 mg respectivashymente Los extractos procedentes de culshytivos fungicos en medio Wickerham y en medio Patata Glucosada 5e ensayaron por separado Todas las pruebas se realizashyron por duplicado y can SjJS blancos coshyrrespondientes

Las placas se incubaron a la temshyperatura 6ptima para el crecimiento de cashyda bacteria y la lectura se realiz6 despues de 24 h midiendo el halo de inhibicion proshyducido

Detenninacion de la actividad funmiddot gicHhI de los extractos fUngicos

EI metoda similar al anterior consiste en medir la inhibici6n del crecimiento funshygico Los ensayos so rcalizaron con t10nshygas testigo (Bolrylis cinerea CECT 2100 Curvularia trifoli CECT 2863 Aspergillus

candidus CR 100 Aspergillus versicolor CECT 2890 Y Penicillium griseofulvum MTAL 388) Yel media empleado IUe el PDA Los hongos ensayados se hicieron crecer en PDA durante 6 dras a 25C y a par tir de estos cullivos se prepararon suspensiones de esporas inocufandose par vertido 5 ml de estas suspensiones en placas Petri can 20 ml de PDA Sofidificashydo al agar se colocaron en la superfic ie del misrno los discos previamente imshypregnados con los extractos fungicos Pashyra cada extracto se emplearon dos conshycentraciones de 50 y 100 mg respectivashymente Los extractos procedentes de culshytivos fungicos en medio Wickerham y en medio Patata Glucosada se ensayaron por separado Todas las pruebas se reaf izashyron par duplicado y con sus blancos coshyrrespond ientes

Las ptacas se incubaron a 28degC Y la lectura se realizo a los 5 dras midiendo ef halo de inhibicion producido

Determinacion de la actividad inmiddot secticida de los extractos fUngicos

Los extractos fungicos secos de reshydisolvieron en disolventes adecuados (ci shyclohexano acetona 0 en mezcla de amshybos en las proporciones que precisara cada extracto) consiguiendo una conshycentraci6n de 250 mgml Se colocaron 130 ml de est as disoluciones en placas Petri y se redisolvieron con 2 ml del disolshyvente previamente empleado Se dejo evashyparar el disolvente en cada pfaca queshydando un deposito residual de extracto de aproximadamente 500 mgcm2_

Seguidamente se cofocaron en cada placa 15 ninlas de tercer estadio de Onshycopeltus fasciaus jun to con pipas de gishyraso l descascaradas y un tuba de agua tapado con algod6n Las placas se ceshyrraron y se incubaron a 60-70 de hushymedad relativa y 29degC de temperatura y en fotoperiodo continuo Los insectos se mantuvieron en esas condiciones 3 dias pasados los cuales se estudi6 la toxicidad del eXlracto contando los individuos que habian muerlo y calculando el porcentashyje de mortalidad Paralelamente se hicieshyron blancos can placas que contenian s6shy10 el d isolvente empleado para ver la poshysibte toxicidad del m ismo

Los supervivientes a los 3 dias de conshytacto con el extracto en la placa se transshyfirieron a unos frascos sin tralar donde se estudio su evoluci6n tras observar cutlles alcanzaban et estado adulto y los adultos precoces

Toxicidad retardada

A los 3 dias de haber side inlroducishydos en los frascos sin tratar se volvian a can tar e l numero de individuos muertos Este nuevo porcentaje de mortalidad nos indicaba la toxicidad tardia del extracto

Resultados y discusi6n

Deteccion de la actividad antimiddot biotica de las distintas cepas ampin gicas aisladas (Test de Wickermiddot ham)

Se aislaron y cnsayaron 66 cepas funshygicas para detee tar su posible producCion de metabolitos secundarios con actividad antibi6tica Entre las cepas aisladas se enshycontraron 23 de Aspergillus 28 de Penishycillium 3 de Fusarium y 1 de Alternaria

Tras los ensayos de antibiosis de esshylas cepas aisladas se detec taron 12 ceshypas de Aspergillus can actividad (eI57) 22 de Penicillium (el 73) y ninguna de los otros generos

PHYTOMA Espanamiddot N~ 122 OCTUBAE 2000134

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En la Tabla 1 se resumen las capas mas activas encontradas Fueron las deshynominadas A02T A03T Y A22T del geshynero Aspergillus LCl P09M P1OM P22M P2IM y P28C del genero Penicillium De las cepas procedentes de la CECT so seshylecciQnaron Penicillium expansum CECT 2275 YCECT 2278 Las dos cepas de P expansum ensayadas inhibieron por comshypleto el crecimiento de la totalidad de las bacterias conlra las que se probaron 10 que indica que producen metabolitos fuertemente activos P expansum CECT 2278 esta resefiado en el calalog o de la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo coshymo p roductor de las micotoxinas patulina y cilrinina En cambio la cepa CECT 2275 no aparece como productora de ning(1I1 tipo de micotoxina de modo que los meshytabolitos causantcs de la inhibicion son en principio illteresantes

Los extraclos f(tngicus para detrmi middot nm las actiltidades bacteric idas fungic ishydas e insecticidas se realizaron a partir de los aislamientos que en conjunto mayor actividad mostraron en el test de Wickershyham Fueron los denominados P09M P1OM P24M YP26C Cada uno de elias se sembro en PDA y en Wickerham pashyra posleriormente extraer sus caldos meshylabolicos y realizar los biosensayos En la Tabla 2 se observa la relacion de extracmiddot tos obtenidos a partir de estos aislamienshytos

Estudio de la actividad bacterici da de los extractos fUngicos

Los extractos fungicos seleccionados se ensayaron frente a 5 bacterias Agroshybacterium tumefaciens Xanhomonas campestris Pseudomonas solanacearum Escherichia coli y Serratia marcescens Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3 Como se observa a concenshytraciones de 50 mg por disco no presenshytan actividad pero a 100 mg por disco alshygunos de los extractos presentan activishydades inleresantes

Estudio de Ia actividad fungicida de los extractos fungicos

Para estudiar la capacidad fungicida de los distintos extractos fungicos se enshysayaron estos frente a diversos hongas algunos de eos productores de micotoshyxinas y otros importantes pat6genos veshygetales Los hongos empleados fueron Aspergillus versicolor Aspergillus candishydus Penicillium griseofulvum Curvularia trifolii y Botryis cinerea

Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla 4 Se aprecia una considera-

TABLA 5 Actividad insecticida frente a Oncopeltu5 fasciafus 15 ninfas de tershycer estadio se pusieron en contacto con cada extracto a una conshycentracion de 500 mgcm2bull La cepa P24M (extracto numero 6) es la que mayor actividad ofrecio como insecticida Los eJdractos 1 y 2 han sido los que mayor toxicidad retardada pre$entaron lIegando el numiddot mero 2 a acabar con la totalidad de individuos Los insectos tratados con el extracto n 1 resultaron aparentemente resistentes al mismo al finalizar el periodo de tratamiento Sin embargo tras permanecer 3 dias en obselVacion en frascos sin tratar se vio que 9 de los 15 mushyrieron TD toxicidad directa TR toxicidad retardada

NG inicial de I Tercer dia (TO) Tercer dia en fraseos sin tratar

Ndeg de extracto (iJR)Individuol

Ndeg de muertes

1 15 0 2 15 10 5 15 2 6 15 12

Blanco 15 0

Mortalidad () Ndeg de muertes Mortalidad()

0 9 60 666 15 100 133 2 133 80 12 80 0 0 0

ble actividad de los extractos 1 2 3 Y 7 frente al hongo Curvularia Iffolii a conshycentraciones de 100 mg por disco que sishygue siendo importante a la de 50 mgd pashyra los extrac tos 3 y 7 Los exlractos 1 y 2 han mostrado tambien actividad frente al hongo Aspergillus versicolor Asi como el extracto 3 que logro crear un 11alo de inshyhibici6n de 17 mm ell el crecimiento del hongo Aspergillus candidus a una conshycentraci6n de 50 mgd

Estudio de la actividad insectici da de los extractos fungicos

Cuatro de los extraclos fungicos los nQ 1 2 5 y 6 fueron probados frente al inshysecto Ollcopeltus fascialus a una conshycentraci6n de 500 mgcm Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 5 Las rnayores actividades S9 dieron en las ceshypas que fueron cultivadas sobre media de Wickerham La cepa P24M (extracto nushymere 6) es la que mayor actividad ofrece como insecticida Los extractos 1 y 2 han sido los que mayor toxic idad retardada presentaron lIegando el numero 2 a acashybar con la totalidad de individuos Los inshysectos tratados can el extracto nQ 1 resulshytaron aparentemente resistentes al misshyrna al finalizar el periodo de tratamiento Sin embargo lras permanecer 3 dias en observaci6n en frascos sin tratar se vio que 9 de los 15 murieron

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Departamento de Biologia Vegeta Escuea Universitarla de Ingenie~d

Tecnica Agricola do la Universidad Polltecnica de Valencia

PHYTOMA Espana bull NQ 122 OCTUBRE 2000 135

Fe de errores

En la pagina 134 en la leyenda de la tabla 3

Donde dice (50 y 100 mg) debe decir (50 y 100 1g) Donde dice la concentraci6n de 50 mg debe decir la concentraci6n de 50 1g Donde dice la concentraci6n de 100 mg debe decir la concentraci6n de 100 1g

En la pagina 134 en la leyenda de la tabla 4

Donde dice (50 y 100 mg) debe decir (50 y 100 1g) Donde dice a concentraciones de 100 mg debe decir a concentraciones de 100 1g Donde dice 50 mgd debe decir 50 1gd Donde dice a una concentraoi6n de 50 mg debe decir a una concentraci6n de 50 I1g

En la pagina 134 en el texto Primera columna linea 3

Donde dice 50 y 100 mg debe decir 50 y 100 1g

En la pagina 134 en el texto Segunda columna linea 14

Donde dice 50 y 100 mg debe decir 50 y 100 1g

En la pagina 134 en el texto Tercera columna linea 10

Donde dice 130 ml debe decir 130 III

En la pagina 134 en el texto Tercera columna Iinea 15

Donde dice 500 mgcm2 debe decir 500 Ilgcm2

En la pagina 135 en la leyenda de la tabla 5

Donde dice 500 mgcm2 debe decir 500 Ilgcm2

En la pagina 135 en el texto Primera columna tercer parrafo lineas 8 y 9

Donde dice 50 mg debe decir 50 1g Donde dice 100 mg debe decir 100 1g

En la pagina 135 en el texto Segunda columna primer parrafo lineas 4 y 11

Donde dice 50 mgd debe decir 50 1gd Donde dice 50 mgml debe decir 50 1gml

En la pagina 135 en el texto Segunda columna segundo parrafo linea 4

2Donde dice 500 mgcm debe decir 500 Ilgcm2

22as Jornadas de Productos Fitosanitarios PHYTOMA

TABLA 3 Actlvldad bactericida de los dierentes extractos ampinglcos selecciomiddot nados frente a 5 bacterias testlgo Los discos contenran dos concenmiddot traciones dlstintas de axtracto (50 mg y 100 mg) Como se observa a la concentracion de 50 mg por disco no hay inhibici6n del crecimienmiddot to bacteriano (halos de 5 mm) pero a la concentraci6n de 100 mg por disco se detecta cierta actividad antibacteriana en algunos extractos especialmente los n 1 2 Y 6 Los resultados se expresan en mm de inhibicion alrededor del disco

II ltN ~m_

x___ Ps__

__CltIII s_____

50shy 100_ lIOd lOO d 111 _ I 100_ M_ 100_ 1IOGtd 100UAid I 5 0 5 11 5 10 5 0 5 I 2 5 bull 5 11 5 10 5 11 5 9 3 5 5 5 5 5 5 bull 5 11

bull 5 5 5 5 5 5 5 I 5 11 5 5 5 5 5 5 5 5 bull 5 8 8 5 II 5 11 5 5 5 I 10 8 7 5 5 S 5 5 5 5 bull 5 S e 5 5 5 5 5 I 5 S I 8 5 11

TABLA 4

Actividad fungicida de los dierentes extractos fampingicos seleccionamiddot dos rente a 5 hongos tesligo Los discos contenian dos concentramiddot ciones distintas de extracto (50 mg y 100 mg) Se aprecia una consi derable actividad de los extractos 1 2 3 Y 7 frente al hongo CUl1Iua ria ritoii a concentraciones de 100 mg por disco que sigue siendo immiddot portante a la de 50 mgd para los extractos 3 y 7 Los extractos 1 y 2 han mostrado tambien actividad frente al hongo Aspergillus versicomiddot or As como el extracto 3 que logro crear un halo de inhibici6n de 17 mm en el crecimiento del hongo Aspergillus candidus a una conmiddot centracion de 50 mgd Los resultados se expresan en mm de inhibimiddot cion alrededor del disco

N Extacto Asf18lrlllus WfSkoIcI PenlcllNum grlllUm 10 aid tOO CIId 50 aid tOO aid

1 17 19 5 5 2 12 17 5 5 3 5 5 5 5 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 7 5 5 5 5 8 5 5 5 5

AspwvflluS __ CurvuMf trIfoJII 8of1)t1$ dn_

10 IIafd 100 aid 50old tOO UiiIiI 101rilif 100 uaId

5 10 11 27 5 S 5 10 11 20 5 5 17 111 22 ze 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 9 5 5 5 5 5 5 5 5 22 27 5 5 5 5 5 5 5 5

con los diferentes extraclos fUngicos Pashyra cada exlracto se emplearon dos conshycentraciones de 50 y 100 mg respectivashymente Los extractos procedentes de culshytivos fungicos en medio Wickerham y en medio Patata Glucosada 5e ensayaron por separado Todas las pruebas se realizashyron por duplicado y can SjJS blancos coshyrrespondientes

Las placas se incubaron a la temshyperatura 6ptima para el crecimiento de cashyda bacteria y la lectura se realiz6 despues de 24 h midiendo el halo de inhibicion proshyducido

Detenninacion de la actividad funmiddot gicHhI de los extractos fUngicos

EI metoda similar al anterior consiste en medir la inhibici6n del crecimiento funshygico Los ensayos so rcalizaron con t10nshygas testigo (Bolrylis cinerea CECT 2100 Curvularia trifoli CECT 2863 Aspergillus

candidus CR 100 Aspergillus versicolor CECT 2890 Y Penicillium griseofulvum MTAL 388) Yel media empleado IUe el PDA Los hongos ensayados se hicieron crecer en PDA durante 6 dras a 25C y a par tir de estos cullivos se prepararon suspensiones de esporas inocufandose par vertido 5 ml de estas suspensiones en placas Petri can 20 ml de PDA Sofidificashydo al agar se colocaron en la superfic ie del misrno los discos previamente imshypregnados con los extractos fungicos Pashyra cada extracto se emplearon dos conshycentraciones de 50 y 100 mg respectivashymente Los extractos procedentes de culshytivos fungicos en medio Wickerham y en medio Patata Glucosada se ensayaron por separado Todas las pruebas se reaf izashyron par duplicado y con sus blancos coshyrrespond ientes

Las ptacas se incubaron a 28degC Y la lectura se realizo a los 5 dras midiendo ef halo de inhibicion producido

Determinacion de la actividad inmiddot secticida de los extractos fUngicos

Los extractos fungicos secos de reshydisolvieron en disolventes adecuados (ci shyclohexano acetona 0 en mezcla de amshybos en las proporciones que precisara cada extracto) consiguiendo una conshycentraci6n de 250 mgml Se colocaron 130 ml de est as disoluciones en placas Petri y se redisolvieron con 2 ml del disolshyvente previamente empleado Se dejo evashyparar el disolvente en cada pfaca queshydando un deposito residual de extracto de aproximadamente 500 mgcm2_

Seguidamente se cofocaron en cada placa 15 ninlas de tercer estadio de Onshycopeltus fasciaus jun to con pipas de gishyraso l descascaradas y un tuba de agua tapado con algod6n Las placas se ceshyrraron y se incubaron a 60-70 de hushymedad relativa y 29degC de temperatura y en fotoperiodo continuo Los insectos se mantuvieron en esas condiciones 3 dias pasados los cuales se estudi6 la toxicidad del eXlracto contando los individuos que habian muerlo y calculando el porcentashyje de mortalidad Paralelamente se hicieshyron blancos can placas que contenian s6shy10 el d isolvente empleado para ver la poshysibte toxicidad del m ismo

Los supervivientes a los 3 dias de conshytacto con el extracto en la placa se transshyfirieron a unos frascos sin tralar donde se estudio su evoluci6n tras observar cutlles alcanzaban et estado adulto y los adultos precoces

Toxicidad retardada

A los 3 dias de haber side inlroducishydos en los frascos sin tratar se volvian a can tar e l numero de individuos muertos Este nuevo porcentaje de mortalidad nos indicaba la toxicidad tardia del extracto

Resultados y discusi6n

Deteccion de la actividad antimiddot biotica de las distintas cepas ampin gicas aisladas (Test de Wickermiddot ham)

Se aislaron y cnsayaron 66 cepas funshygicas para detee tar su posible producCion de metabolitos secundarios con actividad antibi6tica Entre las cepas aisladas se enshycontraron 23 de Aspergillus 28 de Penishycillium 3 de Fusarium y 1 de Alternaria

Tras los ensayos de antibiosis de esshylas cepas aisladas se detec taron 12 ceshypas de Aspergillus can actividad (eI57) 22 de Penicillium (el 73) y ninguna de los otros generos

PHYTOMA Espanamiddot N~ 122 OCTUBAE 2000134

22as Jornadas de Productos Fitosanitarios PHnOMA

En la Tabla 1 se resumen las capas mas activas encontradas Fueron las deshynominadas A02T A03T Y A22T del geshynero Aspergillus LCl P09M P1OM P22M P2IM y P28C del genero Penicillium De las cepas procedentes de la CECT so seshylecciQnaron Penicillium expansum CECT 2275 YCECT 2278 Las dos cepas de P expansum ensayadas inhibieron por comshypleto el crecimiento de la totalidad de las bacterias conlra las que se probaron 10 que indica que producen metabolitos fuertemente activos P expansum CECT 2278 esta resefiado en el calalog o de la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo coshymo p roductor de las micotoxinas patulina y cilrinina En cambio la cepa CECT 2275 no aparece como productora de ning(1I1 tipo de micotoxina de modo que los meshytabolitos causantcs de la inhibicion son en principio illteresantes

Los extraclos f(tngicus para detrmi middot nm las actiltidades bacteric idas fungic ishydas e insecticidas se realizaron a partir de los aislamientos que en conjunto mayor actividad mostraron en el test de Wickershyham Fueron los denominados P09M P1OM P24M YP26C Cada uno de elias se sembro en PDA y en Wickerham pashyra posleriormente extraer sus caldos meshylabolicos y realizar los biosensayos En la Tabla 2 se observa la relacion de extracmiddot tos obtenidos a partir de estos aislamienshytos

Estudio de la actividad bacterici da de los extractos fUngicos

Los extractos fungicos seleccionados se ensayaron frente a 5 bacterias Agroshybacterium tumefaciens Xanhomonas campestris Pseudomonas solanacearum Escherichia coli y Serratia marcescens Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3 Como se observa a concenshytraciones de 50 mg por disco no presenshytan actividad pero a 100 mg por disco alshygunos de los extractos presentan activishydades inleresantes

Estudio de Ia actividad fungicida de los extractos fungicos

Para estudiar la capacidad fungicida de los distintos extractos fungicos se enshysayaron estos frente a diversos hongas algunos de eos productores de micotoshyxinas y otros importantes pat6genos veshygetales Los hongos empleados fueron Aspergillus versicolor Aspergillus candishydus Penicillium griseofulvum Curvularia trifolii y Botryis cinerea

Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla 4 Se aprecia una considera-

TABLA 5 Actividad insecticida frente a Oncopeltu5 fasciafus 15 ninfas de tershycer estadio se pusieron en contacto con cada extracto a una conshycentracion de 500 mgcm2bull La cepa P24M (extracto numero 6) es la que mayor actividad ofrecio como insecticida Los eJdractos 1 y 2 han sido los que mayor toxicidad retardada pre$entaron lIegando el numiddot mero 2 a acabar con la totalidad de individuos Los insectos tratados con el extracto n 1 resultaron aparentemente resistentes al mismo al finalizar el periodo de tratamiento Sin embargo tras permanecer 3 dias en obselVacion en frascos sin tratar se vio que 9 de los 15 mushyrieron TD toxicidad directa TR toxicidad retardada

NG inicial de I Tercer dia (TO) Tercer dia en fraseos sin tratar

Ndeg de extracto (iJR)Individuol

Ndeg de muertes

1 15 0 2 15 10 5 15 2 6 15 12

Blanco 15 0

Mortalidad () Ndeg de muertes Mortalidad()

0 9 60 666 15 100 133 2 133 80 12 80 0 0 0

ble actividad de los extractos 1 2 3 Y 7 frente al hongo Curvularia Iffolii a conshycentraciones de 100 mg por disco que sishygue siendo importante a la de 50 mgd pashyra los extrac tos 3 y 7 Los exlractos 1 y 2 han mostrado tambien actividad frente al hongo Aspergillus versicolor Asi como el extracto 3 que logro crear un 11alo de inshyhibici6n de 17 mm ell el crecimiento del hongo Aspergillus candidus a una conshycentraci6n de 50 mgd

Estudio de la actividad insectici da de los extractos fungicos

Cuatro de los extraclos fungicos los nQ 1 2 5 y 6 fueron probados frente al inshysecto Ollcopeltus fascialus a una conshycentraci6n de 500 mgcm Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 5 Las rnayores actividades S9 dieron en las ceshypas que fueron cultivadas sobre media de Wickerham La cepa P24M (extracto nushymere 6) es la que mayor actividad ofrece como insecticida Los extractos 1 y 2 han sido los que mayor toxic idad retardada presentaron lIegando el numero 2 a acashybar con la totalidad de individuos Los inshysectos tratados can el extracto nQ 1 resulshytaron aparentemente resistentes al misshyrna al finalizar el periodo de tratamiento Sin embargo lras permanecer 3 dias en observaci6n en frascos sin tratar se vio que 9 de los 15 murieron

BIBLIOGRAFiA CANTmiddotN A M OYA P MIRANDA MA PRI

MO J Y PRIMO-yu FERA E 1998 Isolashylion of N-(2-mehy-3-oxodecanoyl)pyshy

rrole and Nmiddot(2-methyl-3-oxodec-Bshyenoyl)pyrrole two new natural products from Penicillium brevicompaclum and synthesis of analogues with insecticishydal and fungiCidal activity Journal of Agricultural amp Food Chemistry 46 (11) 4748-4753

CASTILLO MA MOYA p CANTiN A MIshy

RANDA MA PRIMO J YPRIMO-YUFERI E 1999 Inseelicidal anti-juvenile horshymaneurogt and fungicidal activities of orshyganic extracts from different Penicillium species and tileir isolated active comshyponents Journal of Agricultural amp Foshyod Chemistry 47 (5) 2120-21 24

C ROMBIE L 1999 Natural produc t cf1eshymislry and its part in the defence againsl insects and fungi in agricultushyre Pesticide Science 55(8) 76 1-774

M ARRONE P G 1999 Microbi8 pesticides and nalural products as alternatives Outlook on Agriculture 23(3) 149-154

PRIMO YUFEAA E 1991 Ecologia quimica Nuevos meodos en la lucha contra inshysecos Ediciones Mundi-PrensaBanshyco de Credito y Ahorro Madrid ISBN 84-7 114-341-0

YAMAGUCHI I 1992 Natural products as agrochemical and leads Extended Summary SCI Pesticide Group Symshyposium Novel approaches in agroshychemical research III Pestic Sci 35 391-392

Departamento de Biologia Vegeta Escuea Universitarla de Ingenie~d

Tecnica Agricola do la Universidad Polltecnica de Valencia

PHYTOMA Espana bull NQ 122 OCTUBRE 2000 135

Fe de errores

En la pagina 134 en la leyenda de la tabla 3

Donde dice (50 y 100 mg) debe decir (50 y 100 1g) Donde dice la concentraci6n de 50 mg debe decir la concentraci6n de 50 1g Donde dice la concentraci6n de 100 mg debe decir la concentraci6n de 100 1g

En la pagina 134 en la leyenda de la tabla 4

Donde dice (50 y 100 mg) debe decir (50 y 100 1g) Donde dice a concentraciones de 100 mg debe decir a concentraciones de 100 1g Donde dice 50 mgd debe decir 50 1gd Donde dice a una concentraoi6n de 50 mg debe decir a una concentraci6n de 50 I1g

En la pagina 134 en el texto Primera columna linea 3

Donde dice 50 y 100 mg debe decir 50 y 100 1g

En la pagina 134 en el texto Segunda columna linea 14

Donde dice 50 y 100 mg debe decir 50 y 100 1g

En la pagina 134 en el texto Tercera columna linea 10

Donde dice 130 ml debe decir 130 III

En la pagina 134 en el texto Tercera columna Iinea 15

Donde dice 500 mgcm2 debe decir 500 Ilgcm2

En la pagina 135 en la leyenda de la tabla 5

Donde dice 500 mgcm2 debe decir 500 Ilgcm2

En la pagina 135 en el texto Primera columna tercer parrafo lineas 8 y 9

Donde dice 50 mg debe decir 50 1g Donde dice 100 mg debe decir 100 1g

En la pagina 135 en el texto Segunda columna primer parrafo lineas 4 y 11

Donde dice 50 mgd debe decir 50 1gd Donde dice 50 mgml debe decir 50 1gml

En la pagina 135 en el texto Segunda columna segundo parrafo linea 4

2Donde dice 500 mgcm debe decir 500 Ilgcm2

22as Jornadas de Productos Fitosanitarios PHnOMA

En la Tabla 1 se resumen las capas mas activas encontradas Fueron las deshynominadas A02T A03T Y A22T del geshynero Aspergillus LCl P09M P1OM P22M P2IM y P28C del genero Penicillium De las cepas procedentes de la CECT so seshylecciQnaron Penicillium expansum CECT 2275 YCECT 2278 Las dos cepas de P expansum ensayadas inhibieron por comshypleto el crecimiento de la totalidad de las bacterias conlra las que se probaron 10 que indica que producen metabolitos fuertemente activos P expansum CECT 2278 esta resefiado en el calalog o de la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo coshymo p roductor de las micotoxinas patulina y cilrinina En cambio la cepa CECT 2275 no aparece como productora de ning(1I1 tipo de micotoxina de modo que los meshytabolitos causantcs de la inhibicion son en principio illteresantes

Los extraclos f(tngicus para detrmi middot nm las actiltidades bacteric idas fungic ishydas e insecticidas se realizaron a partir de los aislamientos que en conjunto mayor actividad mostraron en el test de Wickershyham Fueron los denominados P09M P1OM P24M YP26C Cada uno de elias se sembro en PDA y en Wickerham pashyra posleriormente extraer sus caldos meshylabolicos y realizar los biosensayos En la Tabla 2 se observa la relacion de extracmiddot tos obtenidos a partir de estos aislamienshytos

Estudio de la actividad bacterici da de los extractos fUngicos

Los extractos fungicos seleccionados se ensayaron frente a 5 bacterias Agroshybacterium tumefaciens Xanhomonas campestris Pseudomonas solanacearum Escherichia coli y Serratia marcescens Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3 Como se observa a concenshytraciones de 50 mg por disco no presenshytan actividad pero a 100 mg por disco alshygunos de los extractos presentan activishydades inleresantes

Estudio de Ia actividad fungicida de los extractos fungicos

Para estudiar la capacidad fungicida de los distintos extractos fungicos se enshysayaron estos frente a diversos hongas algunos de eos productores de micotoshyxinas y otros importantes pat6genos veshygetales Los hongos empleados fueron Aspergillus versicolor Aspergillus candishydus Penicillium griseofulvum Curvularia trifolii y Botryis cinerea

Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla 4 Se aprecia una considera-

TABLA 5 Actividad insecticida frente a Oncopeltu5 fasciafus 15 ninfas de tershycer estadio se pusieron en contacto con cada extracto a una conshycentracion de 500 mgcm2bull La cepa P24M (extracto numero 6) es la que mayor actividad ofrecio como insecticida Los eJdractos 1 y 2 han sido los que mayor toxicidad retardada pre$entaron lIegando el numiddot mero 2 a acabar con la totalidad de individuos Los insectos tratados con el extracto n 1 resultaron aparentemente resistentes al mismo al finalizar el periodo de tratamiento Sin embargo tras permanecer 3 dias en obselVacion en frascos sin tratar se vio que 9 de los 15 mushyrieron TD toxicidad directa TR toxicidad retardada

NG inicial de I Tercer dia (TO) Tercer dia en fraseos sin tratar

Ndeg de extracto (iJR)Individuol

Ndeg de muertes

1 15 0 2 15 10 5 15 2 6 15 12

Blanco 15 0

Mortalidad () Ndeg de muertes Mortalidad()

0 9 60 666 15 100 133 2 133 80 12 80 0 0 0

ble actividad de los extractos 1 2 3 Y 7 frente al hongo Curvularia Iffolii a conshycentraciones de 100 mg por disco que sishygue siendo importante a la de 50 mgd pashyra los extrac tos 3 y 7 Los exlractos 1 y 2 han mostrado tambien actividad frente al hongo Aspergillus versicolor Asi como el extracto 3 que logro crear un 11alo de inshyhibici6n de 17 mm ell el crecimiento del hongo Aspergillus candidus a una conshycentraci6n de 50 mgd

Estudio de la actividad insectici da de los extractos fungicos

Cuatro de los extraclos fungicos los nQ 1 2 5 y 6 fueron probados frente al inshysecto Ollcopeltus fascialus a una conshycentraci6n de 500 mgcm Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 5 Las rnayores actividades S9 dieron en las ceshypas que fueron cultivadas sobre media de Wickerham La cepa P24M (extracto nushymere 6) es la que mayor actividad ofrece como insecticida Los extractos 1 y 2 han sido los que mayor toxic idad retardada presentaron lIegando el numero 2 a acashybar con la totalidad de individuos Los inshysectos tratados can el extracto nQ 1 resulshytaron aparentemente resistentes al misshyrna al finalizar el periodo de tratamiento Sin embargo lras permanecer 3 dias en observaci6n en frascos sin tratar se vio que 9 de los 15 murieron

BIBLIOGRAFiA CANTmiddotN A M OYA P MIRANDA MA PRI

MO J Y PRIMO-yu FERA E 1998 Isolashylion of N-(2-mehy-3-oxodecanoyl)pyshy

rrole and Nmiddot(2-methyl-3-oxodec-Bshyenoyl)pyrrole two new natural products from Penicillium brevicompaclum and synthesis of analogues with insecticishydal and fungiCidal activity Journal of Agricultural amp Food Chemistry 46 (11) 4748-4753

CASTILLO MA MOYA p CANTiN A MIshy

RANDA MA PRIMO J YPRIMO-YUFERI E 1999 Inseelicidal anti-juvenile horshymaneurogt and fungicidal activities of orshyganic extracts from different Penicillium species and tileir isolated active comshyponents Journal of Agricultural amp Foshyod Chemistry 47 (5) 2120-21 24

C ROMBIE L 1999 Natural produc t cf1eshymislry and its part in the defence againsl insects and fungi in agricultushyre Pesticide Science 55(8) 76 1-774

M ARRONE P G 1999 Microbi8 pesticides and nalural products as alternatives Outlook on Agriculture 23(3) 149-154

PRIMO YUFEAA E 1991 Ecologia quimica Nuevos meodos en la lucha contra inshysecos Ediciones Mundi-PrensaBanshyco de Credito y Ahorro Madrid ISBN 84-7 114-341-0

YAMAGUCHI I 1992 Natural products as agrochemical and leads Extended Summary SCI Pesticide Group Symshyposium Novel approaches in agroshychemical research III Pestic Sci 35 391-392

Departamento de Biologia Vegeta Escuea Universitarla de Ingenie~d

Tecnica Agricola do la Universidad Polltecnica de Valencia

PHYTOMA Espana bull NQ 122 OCTUBRE 2000 135

Fe de errores

En la pagina 134 en la leyenda de la tabla 3

Donde dice (50 y 100 mg) debe decir (50 y 100 1g) Donde dice la concentraci6n de 50 mg debe decir la concentraci6n de 50 1g Donde dice la concentraci6n de 100 mg debe decir la concentraci6n de 100 1g

En la pagina 134 en la leyenda de la tabla 4

Donde dice (50 y 100 mg) debe decir (50 y 100 1g) Donde dice a concentraciones de 100 mg debe decir a concentraciones de 100 1g Donde dice 50 mgd debe decir 50 1gd Donde dice a una concentraoi6n de 50 mg debe decir a una concentraci6n de 50 I1g

En la pagina 134 en el texto Primera columna linea 3

Donde dice 50 y 100 mg debe decir 50 y 100 1g

En la pagina 134 en el texto Segunda columna linea 14

Donde dice 50 y 100 mg debe decir 50 y 100 1g

En la pagina 134 en el texto Tercera columna linea 10

Donde dice 130 ml debe decir 130 III

En la pagina 134 en el texto Tercera columna Iinea 15

Donde dice 500 mgcm2 debe decir 500 Ilgcm2

En la pagina 135 en la leyenda de la tabla 5

Donde dice 500 mgcm2 debe decir 500 Ilgcm2

En la pagina 135 en el texto Primera columna tercer parrafo lineas 8 y 9

Donde dice 50 mg debe decir 50 1g Donde dice 100 mg debe decir 100 1g

En la pagina 135 en el texto Segunda columna primer parrafo lineas 4 y 11

Donde dice 50 mgd debe decir 50 1gd Donde dice 50 mgml debe decir 50 1gml

En la pagina 135 en el texto Segunda columna segundo parrafo linea 4

2Donde dice 500 mgcm debe decir 500 Ilgcm2

Fe de errores

En la pagina 134 en la leyenda de la tabla 3

Donde dice (50 y 100 mg) debe decir (50 y 100 1g) Donde dice la concentraci6n de 50 mg debe decir la concentraci6n de 50 1g Donde dice la concentraci6n de 100 mg debe decir la concentraci6n de 100 1g

En la pagina 134 en la leyenda de la tabla 4

Donde dice (50 y 100 mg) debe decir (50 y 100 1g) Donde dice a concentraciones de 100 mg debe decir a concentraciones de 100 1g Donde dice 50 mgd debe decir 50 1gd Donde dice a una concentraoi6n de 50 mg debe decir a una concentraci6n de 50 I1g

En la pagina 134 en el texto Primera columna linea 3

Donde dice 50 y 100 mg debe decir 50 y 100 1g

En la pagina 134 en el texto Segunda columna linea 14

Donde dice 50 y 100 mg debe decir 50 y 100 1g

En la pagina 134 en el texto Tercera columna linea 10

Donde dice 130 ml debe decir 130 III

En la pagina 134 en el texto Tercera columna Iinea 15

Donde dice 500 mgcm2 debe decir 500 Ilgcm2

En la pagina 135 en la leyenda de la tabla 5

Donde dice 500 mgcm2 debe decir 500 Ilgcm2

En la pagina 135 en el texto Primera columna tercer parrafo lineas 8 y 9

Donde dice 50 mg debe decir 50 1g Donde dice 100 mg debe decir 100 1g

En la pagina 135 en el texto Segunda columna primer parrafo lineas 4 y 11

Donde dice 50 mgd debe decir 50 1gd Donde dice 50 mgml debe decir 50 1gml

En la pagina 135 en el texto Segunda columna segundo parrafo linea 4

2Donde dice 500 mgcm debe decir 500 Ilgcm2