Embed Size (px)
Citation preview
316 DEUTSCHE ZEITSCHRIFT FÜR SPORTMEDIZIN Jahrgang 52, Nr. 11 (2001)
Originalia Nachweis von HES in Humanurin
Since January 2000, plasma volume expanders like hydroxyethyl starch
(HES) have been banned by the International Olympic Committee (IOC).
The therapeutic administration is indicated in cases of hypovolaemic
shocks and disturbances in capillary blood circulation. In endurance
sports it is claimed to be used to elevate the amount of body fluid and
to decrease hematocrit and hemogobine values. The determination of
administered HES for doping analysis purposes is performed by means
of two methods, which consist of the degradation of the polymer and
subsequent derivatization of the resulting monomers. In a rapid screen-
ing procedure the per-trimethylsilyl derivatives of glucose and hy-
droxyethylated glucose (HEG) are generated which are analysed by gas
chromatography and mass spectrometry. Here, the exogenous mono-
saccharides of 2- and 3-HEG are identified by the unambiguous frag-
ment ions m/z 235, 248 and 261. The proof of the polysaccharide struc-
ture of the metabolites of HES is given by a confirmation method based
on the degradation and derivatization to partially methylated alditol
acetates (PMAAs). The free hydroxy groups of the polymer are methy-
lated, the polysaccharide is hydrolysed, the resulting monosaccharides
reduced to the corresponding alditols, the hydroxy groups of which are
finally acetylated. The generated products are analysed and identified
by means of gas chromatography and mass spectrometry. By means of
these two methods six athletes participating at the 2001 nordic world
championships in Lahti (Finland) could be convicted of using HES.
Key words: HES, gas chromatography, mass spectrometry, doping
analysis
Summary
M. Thevis, G. Opfermann, W. Schänzer
Nachweis des Plasmavolumenexpanders Hydroxyethylstärkein Humanurin
Determination of the plasma volume expander hydroxyethyl starch in human urine
Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln
Seit Januar 2000 sind Plasmavolumenexpander wie Hydroxyethylstär-
ke (HES) durch das Internationale Olympische Komitee im Sport verbo-
ten. Therapeutisch werden diese zur Behandlung hypovolämischer
Schockzustände und auch zur Durchblutungsförderung eingesetzt, im
Sport jedoch zur unphysiologischen Erhöhung des intravenösen Kör-
perflüssigkeitsvolumens und zur Senkung von Hämatokrit- bzw. Hämo-
globinwerten. Der Nachweis der Applikation von HES erfolgt in der Do-
pinganalytik mit Hilfe zweier Methoden, welche auf der Degradierung
des Polymers und der anschließenden Derivatisierung der Monomere
basieren. Dazu werden in einer schnellen Screening-Prozedur die per-
trimethylsilyl-Derivate der Glucose und der hydroxyethylierten Gluco-
se (HEG) erzeugt und mittels Gaschromatographie und Massen-
spektrometrie detektiert. Dabei werden die endogen nicht vorkommen-
den 2- bzw. 3-HEG mit Hilfe der eindeutige Fragmentionen m/z 235, 248
und 261 identifiziert. Der Nachweis einer polysacchariden Struktur der
Metaboliten der Hydroxyethylstärke wird anschließend in einer Bestäti-
gungsmethode durch Bildung der teilweise methylierten Alditol-Aceta-
te (PMAAs) erbracht. Das Polymer wird dazu an allen freien Hydroxy-
gruppen methyliert, hydrolysiert, zu Alditolen reduziert und an-
schließend an verbleibenden Hydroxygruppen acetyliert. Die
resultierenden Produkte wurden mit Hilfe der Massenspektrometrie
identifiziert. Mittels dieser Methoden konnten bei der nordischen Ski-
weltmeisterschaft 2001 in Lahti (Finnland) sechs Athleten des Dopings
überführt werden.
Schlüsselwörter: HES, Gaschromatographie, Massenspektrometrie,
Dopinganalytik
Zusammenfassung
Plasmavolumenexpander wie Hydroxyethylstärke (HES)werden seit vielen Jahren als Ersatz für Albumin im Falle hy-povolämischer Schockzustände, zur Blutverdünnung, Be-handlung von Verbrennungen (3) und auch als Gefrierschutztiefgekühlter Blutproben (8) verwendet. Ihr Gebrauch imAusdauersport wurde 1998 im deutschen Leichtathletikver-band bekannt, jedoch wurde damals die Verabreichung nichtvon nationalen und internationalen medizinischen Kommis-sionen geahndet. Seit Januar 2000 ist die Verwendung vonPlasmavolumenexpandern durch das Internationale Olympi-sche Komitee (IOC) verboten (4) und die akkreditieren Do-
Einleitungpinglaboratorien testen Urinproben der Athleten auf derenPräsenz. Dazu sind sowohl schnelle als auch informative undbeweiskräftige Analysemethoden notwendig, die im allge-meinen auf gaschromatographischen und massen-spektrometrischen Nachweisverfahren basieren, deren Ent-wicklung und Anwendung dargestellt werden soll.
Hydroxyethylstärke ist ein Polysaccharid auf der Basis derAmylose, einem Polymer aus 1,4-verknüpfter Glucose mitVerzweigungen am Kohlenstoff C-6 zu ca. 6% (5). Die Was-serstoffe der Hydroxygruppen an C-2, C-3 und C-6 sind zu-dem, je nach Präparat, zwischen 35 und 70% durch Hy-droxyethylgruppen ersetzt. Dabei entfallen ca. 70% der Sub-stitution auf C-2, 10% auf C-3 und 20 % auf C-6. Diebevorzugte Verwendung von HES im Vergleich zu anderen
Jahrgang 52, Nr. 11 (2001) DEUTSCHE ZEITSCHRIFT FÜR SPORTMEDIZIN 317
Nachweis von HES in Humanurin Originaliamöglichen Plasmaersatzmitteln bzw. –volumenexpandernwie Albumin, Dextran oder Gelatine ist einerseits durch diebessere Verfügbarkeit (1-2), andererseits durch die gute Ver-träglichkeit mit geringfügiger Antigenität basierend auf derStrukturverwandtschaft mit dem humanen Glycogen zu er-klären (9).
Der Metabolismus des Polysaccharids besteht im wesent-lichen aus Spaltung des Makromoleküls mit einem durch-schnittlichen Molekulargewicht von ca. 350.000 Dalton (10)in kleinere Makromoleküle, die ab einer Größe von ca.60.000 Dalton die Niere passieren können und so über denUrin ausgeschieden werden (6-7). Verantwortlich für diesenAbbau ist die α-Amylase, die je nach Substitutionsgrad derHydroxyethylstärke schneller oder langsamer arbeitet.
UntersuchungsgutIm Rahmen der Methodenentwicklung zum Nachweis vonHES in Humanurin wurden sowohl die Referenzverbindung(HETASTARCH, 6% Hydroxyethylstärke in 0.9% NaCl-Lö-sung, Sigma Deisendorf) nach Verdünnung (1:20), Urinpro-ben von Patienten 12-24 Stunden nach intravenöser Be-handlung mit HES (500 ml 6% Hydroxyethylstärke in 0.9%
Material und Methoden
NaCl-Lösung) als auch Urine ohne Plasmavolumen-expanderbehandlung untersucht. Die Urinproben wurden bei4°C aufbewahrt und nach 24 Stunden, 1 Woche bzw. 4 Wo-chen vermessen, ohne signifikante Veränderungen des Ana-lysenergebnisses zu beobachten.
ProbenvorbereitungScreening Methode (11): Zum schnellen Screening der Pro-ben werden lediglich 20 µl Urin bzw. Lösung der Referenz-verbindung benötigt, die einer Hydrolyse mit verdünnterSalzsäure unterzogen werden. Dabei wird die Polysaccharid-struktur der Hydroxyethylstärke zerstört und aufgrund desanomeren Zentrums an C-1 je zwei Isomeren der resultie-renden Monosaccharide erhalten (Abb. 1). Diese werden mitN-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid (MSTFA) zu denper-TMS-Produkten derivatisiert und mittels Gaschromato-graphie und Massenspektrometrie (GC/MS) analysiert.
Bestätigungsmethode (12): Zur Bestätigung des polymerenUrsprungs detektierter Monosaccharide eines verdächtigenScreening-Ergebnisses werden Urinproben in einer zweitenProzedur aufgearbeitet. Dazu werden verschiedene Derivati-sierungsschritte benötigt: (1) Permethylierung, (2) Hydroly-se, (3) Reduktion und (4) Acetylierung, wodurch die teilwei-se methylierten Alditol-Acetate (partially methylated alditolacetates, PMAAs) erhalten werden. Im ersten Schritt werdendie freien Hydroxygruppen des Polysaccharids vollständigmethyliert, worauf im zweiten Schritt die Hydrolyse erfolgt.Die resultierenden teilweise methylierten Monosaccharidewerden daraufhin im dritten Schritt durch Reduktion in diekorrespondierenden Alditole überführt und anschließend imvierten Schritt an den verbleibenden freien Hydroxygruppenacetyliert (Abb. 2).
Die Analyse der Referenzverbindung mit Hilfe der Scree-ning-Methode führt zu einem Chromatogramm, welches dieerwarteten Signale der TMS-Derivate der α- und β-Isomerender Glucose, 3-hydroxyethylierte Glucose (3-HEG), 2-hy-droxyethylierte Glucose (2-HEG) und 6-hydroxyethylierteGlucose (6-HEG) beinhaltet. Die auftretenden Peaks konntender derivatisierten Glucose, der 3-HEG, der 2-HEG und der6-HEG zugeordnet werden aufgrund der Massenspektren mitindividuellen Fragmentionen und Mengenverhältnissen imTotalionenchromatogramm (TIC). Die Massenspektren der α-D-Isomeren sind in Abbildung 3 dargestellt. Gemeinsam istallen Verbindungen unter anderem das Auftreten der Ionenm/z 191, 204 und 217, welche auch bei anderen Monosac-chariden wie Galactose oder Mannose beobachtet werden.Deren postulierte Struktur und der damit verbundene Mas-senanstieg der Fragmentionen bei zusätzlicher Hydroxy-ethylierung der 2- bzw. 3-HEG ermöglicht die gezielte Suchenach Monosacchariden der Hydroxyethylstärke. Der Auszugdieser Ionenspuren ruft vier deutliche Signale der Isomerender 3- und 2-HEG hervor. Diese basieren auf m/z 235, 248und 261, welche die korrespondierenden Ionen zu m/z 191,
Ergebnisse und DiskussionAbbildung 1: Durch Hydrolyse wird das Polymer in Monosaccharide ge-spalten, unter anderem in die α- und β-Isomeren der Glucose, 2-hydroxy-ethylierte Glucose (2-HEG), 3-hydroxyethylierte Glucose (3-HEG) und 6-hydroxyethylierte Glucose (6-HEG). Diese werden zu den entsprechendenper-TMS Derivaten umgesetzt: 1 = per-TMS-Glucose, 2 = per-TMS 2-HEG, 3 = per-TMS 3-HEG und 4 = per-TMS 6-HEG.
318 DEUTSCHE ZEITSCHRIFT FÜR SPORTMEDIZIN Jahrgang 52, Nr. 11 (2001)
Originalia Nachweis von HES in Humanurin
204 und 217 nach Inkrement um 44 Dalton durch Hydroxy-ethylierung des Glucosekerns sind. Diese sind im Humanu-rin ohne Applikation von HES (blank) bislang nicht detek-tiert worden. Dazu wurden mehr als 400 Urinproben ver-schiedener Athleten unterschiedlicher Ausdauersportarten(Speedskating, Radfahren, Mittel-/Langstreckenlauf, Ski-langlauf) mit verschiedenen Medikationen und Nahrungser-gänzungen (laut Begleitschreiben der Dopingkontrolle) un-tersucht und keine falsch positiven Ergebnisse erhalten.
Die Bestätigung der Ergebnisse verdächtiger Proben nacherfolgter Screening-Messung wurde mittels Degradierungund Derivatisierung des Polysaccharids zu PMAAs durchge-führt. Im TIC einer HES Ausscheidungsstudienprobe sind 11Signale identifiziert worden, von denen 10 ausschließlichvon der Hydroxyethylstärke resultieren. Signal 1 ist dasPMAA der freien urinären Glucose (1,5-Diacetyl-2,3,4,6-te-tramethylglucitol), welches auch in blank-Urinproben detek-tiert wird. Das intensivste Signal stammt von der 1,4-ver-knüpften Glucose (1,4,5-Triacteyl-2,3,6-trimethylglucitol),während kleinere Peaks aus terminaler 2-substituierter Glu-cose (1,5-Diacetyl-2-methoxyethyl-3,4,6-trimethylglucitol),unvollständig methylierter 1,4-verknüpfter Glucose und ter-minaler 3- oder 6-substituierter Glucose herrühren. WeitereSignale entsprechen den PMAAs der 1,4-verknüpften 3-, 2-und 6-hydroxyethylierten Glucose (1,4,5-Triacetyl-3-
methoxyethyl-2,6-dimethylglucitol, 1,4,5-Triacetyl-2-me-thoxyethyl-3,6-dimethylglucitol bzw. 1,4,5-Triacetyl-6-me-thoxyethyl-2,3-dimethylglucitol) und den PMAAs der zu-sätzlich 6-verknüpften (oder unvollständig methylierten) 2-hydroxyethylierten Glucose, der 2,3-bisubstituiertenGlucose (1,4,5-Triacetyl-2,3-bismethoxyethyl-6-methylglu-citol) bzw. der 2,6-bisubstituierten Glucose (1,4,5-Triacetyl-2,6-bismethoxyethyl-3-methylglucitol).
In den Massenspektren der PMAAs der 1,4-verknüpftenGlucose, der 3-, 2- und 6-hydroxyethylierten Glucose wirddie Hydroxyethylierung der polymerisierten Glucose insbe-sondere durch das Inkrement der zwei Fragmentionen m/z117 und m/z 233 mit 44 Dalton im Vergleich zur nicht-hy-droxyethylierten Glucose deutlich. Da ein Hauptfragmentie-rungsschritt der electron impact (EI) Ionisierung der Bruchder Bindung zwischen C-2 und C-3 ist und daher die Ionenm/z 117 bzw. m/z 233 resultieren, liegt bei der Substitutiondes Kohlenstoffs 2 ein Shift von m/z 117 nach m/z 161 vor.Das Ion m/z 233 bleibt unverändert. Im Falle der 3- bzw. 6-Substitution dagegen wird m/z 117 nicht erhöht, jedoch m/z233 nach m/z 277 durch das Inkrement von 44 Massenein-heiten verschoben.
Zudem wurden massenspektrometrische Untersuchungender Analyten mittels chemischer Ionisation und Vergleichdeuterierter Verbindungen durchgeführt, die zum einen Auf-
Abbildung 2: Das Verfahren der Bestätigungsmethode basiert auf der Permethylierung des Polysaccharids mit anschließender Hydrolyse zu teilweise methylier-ten Monosacchariden. Die vier wichtigsten sind hier dargestellt und weisen aufgrund der ehemaligen Verknüpfung an C-1 und C-4 freie Hydroxygruppen andiesen Positionen auf. Alle weiteren Hydroxygruppen bleiben methyliert. Durch Reduktion werden die korrespondierenden Alditole erhalten mit einer weiterenHydroxygruppe an C-5. Durch anschließende Acetylierung werden die PMAAs generiert.
Jahrgang 52, Nr. 11 (2001) DEUTSCHE ZEITSCHRIFT FÜR SPORTMEDIZIN 319
Nachweis von HES in Humanurin Originalia
schluss über das jeweilige Molekulargewicht gaben, zum an-deren der Strukturbestätigung und Fragmentierungsauf-klärung dienten.
Die beschriebenen Methoden ermöglichen die Bestim-mung von Hydroxyethylstärke in Humanurin mit einerNachweisgrenze von 30 ng/µl. Da ein effektiver Einsatz derPlasmavolumenexpander wenige Stunden vor einem Wett-kampf erfolgt und somit sehr hohe Konzentrationen von HESin Urinproben nach dessen Beendigung auftreten, ist dieses
Detektionslimit ausreichend. Über die zeitliche Nachweis-grenze des Plasmavolumenexpanders im Urin können zurZeit noch keine genauen Angaben gemacht werden, da die-se von verschiedenen Parametern abhängig ist, wie z.B.Menge der Applikation, wiederholte Infusion oder Einmal-applikation und Zeitraum der Anwendung. Diesbezüglichwurden noch keine eigenen Studien durchgeführt. Aus derLiteratur (13) ist bekannt, dass die Volumenexpansion desPlasmas nach Verabreichung von 500ml 6%iger Hydroxy-ethylstärke etwa 9% beträgt und nach ca. 48 Stunden wie-der den Basiswert erreicht. Bei diesen Untersuchungen lagdie Plasmakonzentration von HES bei einer kalkuliertenHalbwertzeit von 2,8 Tagen (7) nach 72 Stunden noch bei4500 ng/µl während zu diesem Zeitpunkt bereits über 50%der applizierten Menge Hydroxyethylstärke renal ausge-schieden wurden und zudem die renale Eliminierungrate in-nerhalb der ersten 12 Stunden rapide abfiel. Daher könnteauch die Möglichkeit des Nachweises von Plasmavolumen-expandern in Blutproben in Erwägung gezogen werden.
Mit Hilfe der dargestellten Analytik wurde seit 1998 inneun Dopingkontrollproben Hydroxyethylstärke nachgewie-sen, die in Tabelle 1 aufgelistet sind. Die Nummern 1-2 wur-den vor dem vom IOC ausgesprochenen Verbot analysiertund daher nicht von Sanktionen des entprechenden Ver-bands gefolgt. Die Urinproben 3-9 dagegen wurden im Früh-jahr 2001 untersucht und folglich mit einem positiven Be-fund berichtet. Die mit Hilfe verschiedener Kalibrierstan-dards geschätzten Urinkonzentrationen variierten von ca.80 ng/µl bis 104.000 ng/µl.
Die entwickelten Methoden zum Nachweis der Hydroxy-ethylstärke in Humanurin wurden anhand mehrerer Aus-scheidungsstudien getestet und mit Urinproben zahlreicherAthleten verschiedender Sportarten verglichen, die keineHES-Behandlung erhielten. In keinem Fall lag ein falsch po-sitives Ergebnis vor und jeder Ausscheidungsversuch wurdeeindeutig in beiden Verfahren als positiv erkannt. Mit Hilfedieser Prozeduren konnten u.a. Infusionen von HES bei Ath-leten der nordischen Skiweltmeisterschaften 2001 in Lahti(Finnland) nachgewiesen werden, einschließlich solcher, dienach Angabe der Athleten bis zu 7 Tage zurücklagen. DieAnalysenergebnisse wurden zusätzlich durch das Einge-ständnis des Gebrauchs des Plasmaexpanders HEMOHES,welcher aus Hydroxy-ethylstärke besteht, vonden Athleten bestätigt.Die Applikation wurdenach Aussage einesSportlers vor jedemWettkampf erneutdurchgeführt, was aufden zeitlich begrenztenvolumensteigernden Ef-fekt des Plasmavolumen-expanders zurückzu-
Schlussfolgerungen
Probennr. Jahr geschätzteKonzentration
in ng/µl
1 1998 30002 1998 18003 2001 750004 2001 1040005 2001 3506 2001 2507 2001 1358 2001 1009 2001 80
Tabelle 1: Geschätzte HES-Konzentrationenin Urinproben von Dopingkontrollen (1998-2001)
Abbildung 3: EI-Massenspektren der PMAAs von 1,4-verknüpfter Glukose(A), 2-HEG (B), 3-HEG (C) und 6-HEG (D). Die Hydroxyethylierung wird ins-besondere durch das Inkrement von 44 Dalton der Fragmentationen m/z 117bzw. m/z 233 bei Substitution an C-2 zu m/z 161 (s. Massenspektrum 2-HEG, B) bzw. m/z 277 bei Substitution an C-3 oder C-6 (s. Massenspektren3- oder 6-HEG, C und D).
320 DEUTSCHE ZEITSCHRIFT FÜR SPORTMEDIZIN Jahrgang 52, Nr. 11 (2001)
Originalia Nachweis von HES in Humanurin
führen ist. Begründet wurde der Einsatz mit der Notwendig-keit der Reduktion erhöhter Hämoglobin- und Hämatokrit-werte, die eine Starterlaubnis des Athleten nicht zugelassenhätten.
Die Möglichkeit der Identifizierung von Hydroxyethyl-stärke ist nur ein Teilbereich der notwendigen Analyse vonPlasmavolumenexpandern. Die Anwendung weiterer poly-saccharidbasierter Medikamente wie beispielsweise Dextran(1,6-verknüpfte Glucose) kann möglicherweise in die be-schriebenen Prozeduren aufgenommen werden, wozu jedochnoch weitere Studien nötig sind. Diese können eventuellauch auf andere analytische Systeme übertragen werden wiez.B. Flüssigchromatographie/ Massenspektrometrie (LC/MS).Andere aminosäurebasierte Plasmavolumenexpander wieOxypolygelatine oder Albumin dagegen bedürfen definitivanderer Nachweisverfahren.
DanksagungWir danken Herrn Dr. Willi Jansen (Dominikus Krankenhaus,Düsseldorf) für die Bereitstellung der Urinproben nach HES-Applikationen und dem Bundesinstitut für Sportwissen-schaft, Köln, für finanzielle Unterstützung.
(1) Boldt J: Volumenersatz beim schwerkranken Intensivpatienten. Anaesthe-sist 47 (1998) 778-785
(2) Brecher ME, Owen HG, Bandarenko N: Alternatives to Albumin: StarchReplacement for Plasma Exchange. J Clin Apheresis 12 (1997) 146-153.
(3) FachInfo: HAES-steril“ 3%/6%/10%. BPI Service GmbH, Fachinformati-onsverzeichnis 1998; 3 (Compact Disc)
(4) International Olympic Committee: IOC List of Classes of Prohibited Sub-stances and Methods of Doping, Lausanne, 2000
Literatur
(5) Kulicke WM, Roessner D, Kull W: Characterization of Hydroxyethyl Starchby Polymer Analysis for Use as a Plasma Volume Expander. Starch/Stärke12 (1993) 445-450.
(6) Metcalf W, Papadopoulos A, Tufaro R, Barth A: A Clinical Physiologic Stu-dy of Hydroxyethyl Starch. Surg Gynec Obstet 131 (1970) 255-267.
(7) Mishler JM, Borberg H, Emerson PM, Gross R: Hydroxyethyl Starch. AnAgent for Hypovolaemic Shock Treatment II. Urinary Excretion in NormalVolunteers Following Three Consecutive Daily Infusions. Br J Clin Phamac4 (1977) 591-595.
(8) Mishler JM, Parry ES: Transfusion of Hydroxyethylated Amylopectin-Pro-tected Frozen Blood in Man. Vox Sang 36 (1979) 337-341.
(9) Nitsch E: Volumenersatz mit künstlichen Kolloiden. Anästhesiol Intensiv-med Notfallmed Schmerzther 33 (1998) 255-260.
(10) Salmon JB, Mythen MG: Pharmacology and Physiology of Colloids. BloodReviews 7 (1993) 114-120.
(11) Thevis M, Opfermann G, Schänzer W: Detection of the plasma volumeexpander hydroxyethyl starch in human urine. J Chromatogr B 744(2000) 345-350.
(12) Thevis M, Opfermann G, Schänzer W: Mass spectrometry of partially me-thylated alditol acetates derived from hydroxyethyl starch. J Mass Spec-trom 35 (2000) 77-84.
(13) Yacobi A, Stoll RG, Sum CY, Lai CM, Gupta SD, Hulse JD: Pharmacokine-tics of Hydroxyethyl Starch in Normal Subjects. J Clin Pharmacol 22(1982) 206-212
KorrespondenzadresseMario Thevis
Institut für BiochemieDeutsche Sporthochschule KölnCarl-Diem-Weg 6, 50933 Köln
Fax.: 0221-4973236Email: [email protected]
