Embed Size (px)
Citation preview
OFFICE DE LA BECHERCHE SCIENTIFIQUEET TECHNIQUE OUl1nE-MER
CENTRE DE BRAZZAVILLE
LABORATOIRE DE PHYTOPATHOLOGIE
RAPPO~ DE STAGE2° A.mée
t1'tfillet 1972BJHER Ber-nar-d
Rapport de Stage
20 Année
Les interactions entre le Phytophthora palmivora (Butl.) Butl.
et la plantule de l'Hibiscus sabdariffa L••
Production d'enzymes pectinolytiques in vitro par le
Phytophthora palmivora (Butl.) Butl...
BOHER Bernard
Elève O.R.S.T.O.M. 20 Année
BRAZZAVILLE 1 Juillet 1972 •
,"
,.
- 1 -
SOMMAIRE
INTRODUCTION....
PROVENANC~S DE L'HOTE ET DU PARASITE.
PREMIERE PARTIE
ETUDE PRELIMINAIRE DES METHODES D'INOCULATION ET DE DIVERS FACTEURS
INTE.RVENANT SUR LES RESULTkTS DE CES INOCUIATIONS I!
. 1) Inoculation par .suspe.~s:i:.o~.~,!lIL~.90s.J?OI;'_~ê.•
II) Inqc~l~tion par.b~oy~~ m~célien •
DEUXIEME PARTIE
ETUDE DES RELATIONS HÔTE-PARASITE ENTRE Hibiscus sabdariffa Et
Phytoph~hora palmivora (Butl.) Butl.
A) LE P.h.RASIT~
1) ~ncy.stemep.t. !le.. la_.z,o.o s~ore .e~ 'pénétrat.ion .5~ans .:l:~._Qrganesde l'hôte.
1) Encystement.
2) Pénétration au niveau du système radiculaire •
3) Pénétration au niveau des organes aériens •
4) Etude cytologique du cyste en germination •
II) Pénétration à partir du mycélium •
III) Colonisation des tissus de la plantule par le parasite •
B) L'HÔTE ~
l ) Réactions cellulaires après la pénétration •
II) Etude anatomique des réactions tissulaires au cours de l'in
fection •
III) EVolution de,~aeperméabal1té.ee~lnlairedans les hypocotyles
pendant la pathogénie •
IV) Augmentation de l'activité peroxydasique dans les tissus au
cours de l'infection.
V ) Evolution du contenu phénolique des tissus et de leur pH
au cours de l'infection.
TROISIEME PARTIE
L'EQUIPEMENT ENZYMATIQUE DU PARASITE
A) LES ENZYMBS PECTINOLYTIQUES
l ) Pectineméthylestérase
II) Polygalacturonase et polyméthylgalacturonase
I) Nature des enzymes
2) Influence de certains facteurs sur la production de PG.
et de PMG. •
3) Production de PG. par diverses souches du Phytophthora
palmivora •
4) Production de PG. sur broyats d'hypocotyles d'Hibiscus
sains et înoculés •
III) Production de Trans-élimînases •
- 2 -
- 3 -
INTRODUCTION
Le Phytophthora palmivora (Butl.) Butl. parasite de nombreuses
cultures tropicales est susceptible de se développer sur un grand nombre
de végétaux (1) • Notre travail a porté principalement sur le couple
hôte. - parasite, Phytophthora palmivora 1 Hibiscus sabdariffa,
Ce rapport est divisé en trois parties.
Dans la première partie nous avons traité des conditions réalisées lors
de l'inoculation et de leur influence sur l'évolution de la pathogénie,
La deuxième partie est consacrée à l'étude des relations hôte-parasite
sur le plan anatomique et biochimique. La troisième partie traite de la
production d'enzymes pectinolytiques par quelques souches du P~tophthora.
L'étendue du sujet traité ne nous a pas permis d'approfondir tou-
tes les.phases de l'action parasitaire; certaines études mériteraient
d'être complétées.
~
PROVENANCES DE L'HOTE ET DU PARASITE
Des plantules d'Hibiscus sabdariffa dont l'âge variait de six
à vingt jours après mise en germination ont été utilisées. Cette plante
communément appelée Roselle, Oseille de Guinée ou Bisap du Sénégal (2)
est cultivée en Afrique à des fins alimentaires (On consomme les feuilles
et les calices charnus).
Nous disposions de graines de la variété R.C.A. en provenance de la sta-
tion I.R.C.T. de Bouake.
L'origine et le signe de compatibilité des souches de Pnytophtho-
ra palmivora utilisées,sont donnés dans le tableau de la page suivante.
4 -
Agrum.e, Congo •..........................• Al
Agrume, C6te d'Ivoire •••••••••••••••••••• Al
" " ·..... .................. Al·." " ·...... ... .... ........ .. .. .. A2
" " .. .. .. .. .. . .. .. .. .. .. ........... A2~ .... . ... ·." " ....................... Al.. .. .. .. .. . .. .. .. .. .......
" " .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .................. Al.. ......
" " Al" ........................................... ..." " .. .. .. .. . .. .. .. .. .. ........................ ·.~
Cameroun
A2
A2
Al
SIGNE DE COMPTABILITE
••••••••• 1& •••••••
· ....' .
Côte d'Ivoire
ORIGINE
Roselle R. C.A.
Cacao,
Aubergine,
SOUCHE
K
L
570
FO
l
26
36
37
38
51
56
134
- 5 -
PREMIERE PARTIE
ETUDE PRELIMINAIRED~S METHOD~S D'INOCULATION ET DE DIVERS FACTEURS
INTERVEIDLNT SUR LES RESULTATS DE CESINOCU~TIONS
Nous avons mené cette étude en fonction du besoin, pour le La-
boratoire, de l'établissement d'une gamme différentielle d'hôtes pour le
Phytophthora palmivora.
Trois possibilités d'obtention des plants à inoculer se présen-
taient~
- culture aseptique en tubes sur vermiculite imbibée de milieu
minéral de SHIVE and ROBBINS.
- culture en serre sur terre, en bacs à alimentation en eau cons-
tante.
- culture dans des pots sur vermioulite imbibée de milieu miné-
ral de SHIVE and ROBBINS dans un local à température et humi-
dité régulées.
La première méthode a été rapidement abandonnée car la forte
humidité régnant, dans les tubes provoquait une augmentation de la sen-
sibilité des plants et par là une difficulté dans l'évaluation des diffé-
rences d'agressivité entre certaines souches (Ce phénomène est facile à
constater pour les souches K et L en comparant les figures l et 2). La
seconde méthode du fait des fortes variations climatiques intervenant l
lors des expériences donne des résultats très peu reproductibles. Nous
avons choisi la troisième qui permet l'obtention de plants d'une bonne
homogénéité de taille, et qui donne une bonne reproductibilité des ré-
sultats.
Les conditions de culture sont : Milieu minéral de SHlVE and
ROBBINS(3) sur vermiculite stérile (150 ml pour un pot contenant 10 plantules environ).
"!
- 6 -
Température 25°C ± 1°C - Humidité athmosphérique 80 %. Illumination par
tubes fluorescents (lumière du jour de luxe) 5000 lux au niveau des feuil-
les, périodicité : 12 h. 1 24 h••
Le matériel végétal choisi est la Roselle : Hibiscus sabdariffa.
Les graines sont stérilisées avant mise en germination par l'hypochlori-
te de Sodium.
Les plantules sont inoculées après 7 jours de croissance, sont con-
sidérés comme morts les plants présentant une perte de turgescence ayant
provoqué la cassure du collet. Les résultats obtenus portent sur deux ex
périences faisant intervenir 60 à 100 plants. Deux souches de Phytophthora
sont utilisées, la souche L très agressive et la souche K faiblement agres-
sive.
1) - Inoculation par suspension de zoospores
Les zoospores sont produites à partir de cultures sur décoction
de pois en boîte de Pétri. On provoque au préalable la formation de spo-
rocystes par immersion dans une solution saline (4) pendant une heure et
illumination pendant 24 à 48 h. La libération des zoospores est déclen-
chée dans l'eau par un séjour de vingt minutes à 16°c. La suspension dont
la teneur est évaluée à l'hématimètre, est apportée au pied des plants à
raison de 0,5 ml par plant.
1) Influence du milieu de production sur 11!qq('CSHlJ,'+e/
L'emploi de trois milieux de compositons différentes: extrait de
pois gélosé, Lima bean - agar, milieu minéral minimum glucosé (5) donne
des résultats identiques dans les trois cas. Le taux de mortalité est de
90 à 100 %dans le cas de la souche L et de 25 à JO %dans celui de la
souche K.
.
- 7 :..
2} Influence de la teneur de la suspension en zoospores.
Une suspension de zoospores de la souche L est apportée au pied
des plant~ aveè des concentrations de 500, 100, 50 e~ 25 zoospores par mmJ.
Dans les trois premiers cas le taux de mortalité est de 90 à 100 %, dans
le quatrième il n'est que de 60 % environ au sept~ème jour, d'autre part
on note un net retard dans l'apparition des symptômes. Il est donc néces
saire d'employer des suspensions de zoospores assez denses (100 à 500
zoospores par mmJ}.(Fi9 n03)'
3} Influence du volume d'inoculum délivré au pied des plants~
Nous avons employé des volumes de 0,5 ml, 1 ml et 2 ml contenant
le même nombre de zoospores : environ IxIaS unités. Avec les souches K
et L, on ne note aucune différence sur le taux de mortalité en fin d'ex
périence dans les trois cas.
4) Influence de l,gge des plants sur leur résistance à l'infec~
tion.
Des plants de Roselle sont inoculés à 7, 10 et 21 jours.
a) Inoculation par la souche agressive L~
Nous avons observé un retard dans l'apparition du taux de morta
lité maximum, chez les plants de 10 et 21 jours par rapport aux
plants de 7 jours ; ce taux de mortalité est plus faible dans
les deux premiers cas (75 %environ), mais il reste quand m~me
élevé.
b) Inoculation par la souche peu agressive K.
Le taux de mortalité se stabilise à 25 %pour des plants âgés de
7 jours (6 jours après inoculation), à 7 %pour ceux inoculés à
10 jours, il est nul pour ceux dont l'âge au moment de l'inocu
lation est de 21 jours. On note donc, l'acquisition, avec l'~ge,
d'une résistance à la souche K. Le phénomène est expliquable par
- 8 -
le développement important du cambium vasculaire 5 à 7 jours
après germination, développement dont résulte un épaississement
de la partie basse àe la tige.
II) - Inoculation par broyat D;l.ycélien.
Nous employons pour les inoculations, du mycélium, cultivé sur dé
coction de pois (70 g par litre) eh fioles diERLENMEYER. récolté après 5~
12 ou 32 jours de cultUre, lavé et broyé dans l'eau permutée, à raison de
l mg de poids sec par millilitre d'eau. Un léger retard se manifeste dans
l'apparition des symptômes en début d'expérience par rapport aux inocula
tions réalisées avec aes zoospores, cependant le taux de mortalité en
fin dt'expérience reste le même.
1) Influence de l'~ge de la culture mycélienne sur la virulence.
Les inoculations réalisées avec des cultures myc~lienhes âgées
de 5 jours montrent un taux de mortalité plus faible en fin d'expérience
que celles réalisées avec des cultures plus âgées (12 et 32 jours).
Le vieillissement du mycélium ne semble pas avoir d'influence sur sa vi
rulence. Il est difficile d'expliquer pourquoi le mycélium n'atteint sa
pleine virulence que tardivement. Nos études sur les enzymes pectinolyti
ques du parasite ont montré que la production de celles-ci atteignait
rapidement son maximum sur extrait de pois (2 à 3 jours après ensemence
ment.) Il semble donc que ces enzymes ne soient pas seuls à intervenir,
si ils interviennent, dans l'acquisition de l'agressivité par le mycélium
pendant la croissance. (Fi3n.4).
2) Influence du milieu de production des éléments mycéliens sur
la virulence. Nous avons testé le mycélium produit sur milieu minéral glu
cosé et sur extrait de pois, aucune différence notable n'a été décelée
entre les deux séries d'inoculations.
- 9 ~
Conclusion.
Nous avons choisi l'inoculation par suspension de zoospores qui
offre l'avantage d'une bonne reproductibilité et d'autre part se rappro
che le plus des phénomènes naturels. Cette méthode a néanmoins un incon
vénient majeur; la difficulté d'obtenir, dans des conditions stériles,
des suspensions de zoospores de titre suffisant, avec certaines souches
du Phytophthora.
- 10 -
7 8JO"'''6 Qpn~ iIlOCU\q+.oll
LK
51 2 3 4
Age cHft p1allt6 0 7
• 10
• 21 J-
0_0--0-0O~/ .-.
/
0 .f-·~.
o /,:Z~ o...••..••o
.0//...•y.... -.•.•.0 ••••••••• 0·· .
25
50
75
%100
Fig nO l Evolution de la mortalité en fonction de l'âge des plants,
inoculation par les souches K et L (Suspension de Zoospores)
0-0 L-K
6 7Jour:. Q pr .... Ji inoeu la ho"
..321
50
75
25
%100
Fig nO 2 Plants cultivés en tubes sur vermiculite t inoculés par K et L,
Hibiscus 7 jours (suspension de zoospores) : évolution de la
mortalité.
- Il -
100
50
25
0--0.---e
/Îll===ll=~_'_'-'_ll.,
,.///
0'" /... /.: /: /
:" / ~"1-+"'''' + ... . ~
• 1 1
: 1 •• 11·
:0/ ~.lr''' '"., ,/"'~ ...i ~
o / ,//: .
.1/ ,//: .,.'
// ,,: If
~~ ••••• , v·",)Il
75
50
%100
25
2 3 4 5 6 7Jour~ opr&$ inoeulQ+ion
Fig nO 3 Influence de la concentration de la suspension de zoospores
sur la mortalité. Souche L sur Hibiscus 7 jours.
of100
0-0 ZOUl'0r.$
75
50
25
2 ·3
A-A- Myc.elium-..-.
4 5
0'_ d. S jo."~
1 d.. 12 jour.
1 d.. ~2. jour~
6 7 8 9 10 Jour"(op.... Inoeul.~ion)
Fig nO 4 Comparaison de la virulence de broyats de cultures mycélien
nes d'~ges différents. Souche L sur Hibiscus 7 jours.
- 12 -
BIBLIOGRAPHIE Première partie
I) - CHEE K.H. : Rev. Appl. Mycol., , 1969 (48) , 7 , p.))7 •
2) - KERHARO J. ; Plantes médicinales et Phytothérapie, 1971 , T. V n0 4,
p.277 •
3) - HEWITT E.J. : Sand and Water cu1tur methods used in the study of plant
nutrition. Commonwealth agricu1tura1 Bureaux , Technical .ommunication
nO 22 , 1966 •
4) - DAH WU CHEN and ZENTMYER G.a. : Mycologia , 1970 (62) 2 , p.397 •
5) - HUGUENIN B. et BOCCAS B. : Ann. Phytopatho1. , 1971 , 3 () , p.353 •
-1,3-DEUXIEME. PARTIE
A
ETUDE DES RELATIONS HOTE - PARASITE ENTRE LE Phytophthora palmivora Et
lA PlANTULE D'Hibiscus sabdariffa.
A) LE P~SITE.
1) Encystement de la zoospore~et pénétration dans les organes de
l'hôte.
Techniques générales utilisées
Les zoospores sont obtenues par la méthode exposée dans la pre-
mdère partie. Nous avons utilisé pour cette étude les souches K et L. Les
plantules d'Hibiscus sabdariffa furent cultivées dans les conditions dé
crites lors du précédent chapitre. Pour mettre en contact hôte et zoos-
pores nous avons placé, soit les organes à tester, soit la plante entière,
dans la suspension de zoospores pendant ,30 minutes, après ce laps de temps
la plante était retirée et déposée sur un papier filtre humide en athmos-
phère saturée. Dans les cas d'observation en continù, les spécimens fu-
rent mis en chambre humide dans la suspension de zoospores. Les expérien-
ces furent réalisées à la température du laboratoire c'est-à-dire 22-2,3°C.
1) EnèYstement· ,. L
Lorsque la zoospore est libérée dans l'eau la durée de!..salqti-
lité varie considérablement avec les conditions de milieu ; une étude a
été menée par KOFFI en ce qui concerne l'influence de la température et
du pH (1). En général peu avant l'encystement les déplacements en ligne
droite de la zoospore se réduisent, de piriforme elle devient sphérique,
deux vacu01es à contenu très réfringeant apparaissent dans la cellule
Au niveau de l'un ou des deux flagelles on peut observer la for
mation d'un renflement identique à celui décrit par REICHLE (2) pour le
Phytophthora parasitica var. nicotianae ; ce renflement se déplace le
long du flagelle pour se fixer à son extrémité. (Photo n06, l, II et III).
On a alors deux alternatives :
- 44 -
soit le flagelle se sépare du corps de la zoospore, soit il se rétrac
te le renflement se rapprochant du corps de la cellule et étant finale
ment absorbé par celle-ci, ce dernier processus est le plus fr~quent.
2) Pénétration au niveau du système radiculaire.
Si dans une suspension de zoospores encore nageantes, on place
une radicelle d'Hibiscus sabdariffa , ~n note immédiatement un net tac
tisme des spores vers la zone d'élongation de la racine ainsi que vers
les régions où le rhizoderme a été lésé (Fig n07). Vingt minutes après
la mise en place de la racine dans la suspension, certaines spores com
mencent leurs proce~sus d'encystement au contact du rhizoderme ou des
poils absorbants. Une demi-heure à une heure après la mise en contact,
toutes les spores ont cessé de nager. La germination des cystes inter
vient dix à vingt minutes après le contact avec la racine. Un tube ger
minatif de 2 à 3 J{ environ de diamètre p~endi~aissance, généralement
dans la demi sphère faisant face au rhizoderme ; dans le cas où la zoos
pore est au contact de la racine un tropisme du tube germinatif se mani
feste vers la surface racinaire. Si la spore s'est encystée à un endroit
assez éloigné du rhizoderme (extrémité d'un poil absorbant par exemple),
le tropisme du tube germinatif n'est plus évident ; nous avons observé
de nombreuses spores dont le tube germinatif croissait en s'éloignant
de la racine. Au niveau des régions lésées du rhizoderme le tropisme
est beaucoup plus marqué, il se manifeste même quand la spore se trouve
assez éloignée de la lésion. La croissance du tube germinatif se pour
suit tant qu'il n'entre pas en contact avec une cellule de l'hôte et
tant que ~es réserves de la spore ou le milieu l~ permettent, quand le
contact e~t réalisé, il se forme un renflement nommé appressorium dont
le diamètre représente un tiers à la moitié de celui de la spore(Fig nO
19). Lorsque ce dernier a atteint sa taille définitive commence la péné
tration; le franchissement de la paroi cellulaire par l'hyphe de
Photo nO 5
- 15 -
zoospore peu avant l'encystement, on distingue les
deux grosses vacuoles au contenu réfringeant.
Photos no6 t l II III
1) Apparition de renflements à l'extrémité des
flagelles.
II) Rétraction de l'un des flagelles.
III) Perte d'un flagelle.
- 16 -
DISTANCE DE L· APEX mm.
10
7
5
3
1
10 20NOMBRE OE CYSTES
Fig nO 7 Exemples de répartition des cystes de la souche L sur une
extrémité racinaire d'Hibiscus sabdariffa.
1..
- :1;.7-
pénétration ne demande que deux à trois minutes. (Photo nOS). Il sem
ble qu'une pression mécanique élevée s~exerce sur la paroi de la cellu
le hôte au moment de la pénétration. On observe souvent un afÎaissement
de la paroi au point de pénétration (le phénomène est surtout visible
dans le cas où celle-ci échoue (phote n09). On peut remarquer sur cette
photo en a et en b l'aff~issement de la paroi, un premier essai de pé
nétration avait été tenté en a à partir de l'appressorium sans succès,
une autre tentative a été mise en oeuvre sans plus de réussite en b.
Nous avons constaté à plusieurs reprises cet échec à la pénétration
comme l'affaissement de la paroi de la cellule indique la présence
d'une poussée mécanique importante, on p,eut penser que cet échec est
le fait d'une déficience physiologique, absence d'enzymes adéquats par
exemple. La pénétration serait donc le résultat.'d'une combinaison de
moyens mécaniques et de moyens chimiques. J~u niveau des racines elle
se fait de façon intercellulaire ou sur toute la surface de la cellule.
L'hyphe de pénétration, si elle est intercellulaire, le reste ; dans
le cas où elle est intracellulaire, quand elle atteint la paroi cellu
laire tangentielle interne de la cellule, elle forme un nouvel appresso
rium, à partir duquel prend naissance une hyphe intercellulaire.
3) Pénétration dans les organes aériens de la plantule
AU niveau de certains organes aériens (hypocotyle, collet) la
pénétration, quand elle est possible, n'a lieu. que dans les régions" de
la surface épidermique séparant deux eellules. La pénétration dans-.
le-s~i;i"Bsuk:.:. -:, s'éffectue avec la même rapidité que eur la ra.:Lne
en réalité, il semble qu'il y ait écartement des parois cellulaires et
non perforation ,l'hyphe de pénétration s'enfonçant comme un coin dans
l'espace intercellulaire. Le parasite dans cette région n'aurait à fran
chir que la cuticule il se trouverait ensUite au niveau de la lamelle
4 H. 55 minutes
5 H. 02
- 18 -
4 H. 58
5 H. 00
Photo n08
Photo nO 9
Cyste de la souche L en pénétration sur une racine
d'Hibiscus.
Cyste de la souche L sur racine d'Hibiscus.
Echec à la pénétration.
b
Cl
... 19 -
E
D
C
.....,~ B
~"H- A
Fig nOIO : Souche L , pénétration dans un poil absorbànt dé racine
d'Hibiscus: A) Cyste, B) Tube germinatif, C) Appressorium
D) Hyphe de pénétration , E) paroi du poil •
.. o.: .. ·.. ·
...........
10 It--Fig nOll : Souche L sur feuille cotylédonnaire d'Hibiscus, .pénétration
dans le mésophylle par un stomate.
~-
moyenne, région propice à son développement, qui est principalement
intercellulaire.
Il est fort possible que la région intercellulaire soit plus
favorable que le reste de la surface cellulaire à la diffusion,vers
l'extérieur, de substances provenant de la cellule et crée un stimulus
pour le tube germinatif.
La pénétration directe de l'épiderme n'est pas possible sur
toute la surface de l'hypocotyle et des feuilles quand le plant a dé-
passé un certain âge. Dans le tableau de la page 21, nous décrivons
l'aptitude à la pénétration directe de la souche L sur divers ~rganes
de la plantule en fonction de son âge. On remarque tout d'abord que c
celle-ci est toujours possible quelque soit l'âge du plant au niveau de
la racine principale (a) ainsi que à celui du collet dans sa partie non
chlorophyllienne (b). Dans la partie du collet, chlorophyllienne (c) la
pénétration n'a lieu que si le plant est relativement jeune (3 et 6 jours).
Aux niveaux plus élevés de l'hypocotyle, la pénétration n'est popsible
que chez de très jeunes plants (3 jourS).a Si l'on étudie le comportement
des cystes au niveau des feuilles cotylédonnaires, on remarque que la
pénétration directe est impossible, les zoospores déposées à la surface
de l'épiderme (inférieur ou supérieur) germent en donnant un tube ger
minatif très long mais pas d'appressorium. Il est à noter que quand il
y a échec de la pénétration à la surface de l'hypocotyle c'est en géné
ral après la formation d'un appressorium, mais qui a souvent un aspect
anormal. Nos observations de la surface des épidermes de l'hypocotyle
et de la feuille (coloration de la cuticule p~ le Soudan III) ne nous
ont pas permis d'expliquer pour quelles raisons l'appressorium ne se
formait pas à la surface des feuillesa
La colonisation du mésophylle foliaire par le parasite se réa-
lise par les stomates ; des pelotons mycéliens sont facilement
0',- 21-
observables dans les chambres sous stomatiques une dizaine d'heures
après la mise en contact avec l'hôte. Dans certains cas la colonisa-
tion du mésophylle a lieu directement sans accumulation de mycélium
dans la chambre sous stomatique (Fig nOll). Sur l'hypocotyle quand la
pénétration ne peut avoir lieu directement elle se fait par l'inter-
médiaire de lésions apparaissant au pied des poils tecteurs très sou-
vent les zoospores s'amassent à la base de ces poils, le tube germina-
tif s'insinuant entre le poil et une cellule épidermique adjacente.
La tige d 'Hibiscus présente· 0 en outre des poils sécréteurs dont le
contenu se colore en rouge lorsque l'on emploie la réaction de mise
en évidence des tanins par l'acide nitreux (14) ; ces poils sont sou-
vent entièrement colonisés par le parasite et peuvent représenter une
source d'infection pour le cortex. La colonisation du parenchyme corti-
cal peut aussi se réaliser par les stomates.
f sup
--""iP=-_f inf
age a b c d f. sup. t. inf.
1 23 j. + + + + + + + + - - - -6 j. + + + + + + - + - - - -
14 j. + + + + - + - + - - - -
Aptitude à la pénétration de cystes de la sou.~e L, eurof.
différents organes de la plantule d'Hibiscus, en fonction
de son ~ge.
1) Pénétration.
2) Formation d'appres8orium.
-~-
4) Etude cytologique du cyste en pénétration.
a) Vacuome à contenu lipidique : il a été mis en évidence par
passage du matériel dans le Soudan III en solution alcoolique. Dans le
cyste avant germination il existe un petit nombre de vacuoles à contenu
lipidique, 4 à 10, de forte taille pour la plupart. Les vacuoles au cours
de l'émission du tube germinatif restent en général dans le cyate quel
ques unes de faible taille passent dans le tube et de là dans l'appresso
rium. Le rôle de réserve de ces vacuoles ne semble pas faire de doutes,
leur contenu lipidique étant vraisemblablement utilisé au cours de la
germination et de la pénétration.
b) Chondriome: Il est facile de mettre en évidence le site
d'action de la succinodeshydrogénase par la coloration au bleu de Tëtra
zoliuw (3) et par là les mitochondries dans lesquelles se manifeste cet
enzyme. Les mitochondries sont en nombre important dans la spore encystée
(photo n013),elles passent dans le tube germinatif avec le courant cyto
plasmique, très souvent on note une accumulation de ces .rganelles dans
l'appressorium avant la pénétration.
c) Appareil nucléaire : La coloration des noyaux a été réalisée
par le mélange de Giemsa déjà employé pour le Phytophthora. (4).
(Hydrolyse par Hcl 5Af pendant 10 minutes coloration quatre-heures).
Les zoospores dans leur majorité sont uninucléées , elles présen
tent dans de rares cas deux noyaux et sont alors remarquables par leur
forte taille. Le noyau<passe dans le tube germinatif quand celui-ci s'est
déjà bien développé (formation de l'appressorium en cours). Le matériel
coloré qui présente une forme ovoide dans le cyste s'allonge considérable
ment au cours du passage dans le tube germinatif. Nous n'avons que rare-
ment observé deux noyaux dans le tube germinatif ; les divisions semblent
peu fréquentes dans celui-ci.
- 23 -
Mitochondries dans la spore encystée et dans le cyste
en germination.
- 24 -
II) Pénétration à partir' du mycélium
Des plantules d'Hibiscus sabdariffa ~gées de 6 jours ont été mi
ses en contact avec du mycélium de la souche L, en croissance sur une
décoction de pois gelosée. Cinq.à six heures après mise en contact, au
niveau des radicelles, de nombreuses pénétrations sont en cours, celles
ci sont uniquement intercellulaires. Un appressorium de taille variable
se forme avant la pénétration (Fig n014). Au niveau du collet, les pé
nétrations directes avec appressorium sont moins fréquentes que sur la
racine : elles se rencontrent, sur l'hypocotyle, de moins en moins fré-
q~eoment, au fur et à mesure que Iton s'éloigne du collet.
En général dg nombreuses occasions de pénétration indirQcte se
présentent; poil tecteur rempu, épiderme déchiré à la suite de l'épaissi
ssement du cylindre central, stomates, elles sont exploitées par le mycé
lium, que l'exsudation de substances cellulaires à partir des lésions de
la cuticule, attire.
III) Colonisation des tissus de la plantule par le parasite
Vingt-quatre-heures après inoculation au collet, de plants ggés
de 7 jours, par la souche L, les premiers symptômes apparaissent. A ce
moment on trouve le parasite dans les régions où les cellules ont réagi,
il est intercellulaire avec une prédominance de la croissance dans le
sens vertical, le développement intracellulaire n'intervenant que plus
tard. Quarante-huit heures à soixante-douze heures après inoculation,
le mycélium a atteint la zone péricyclique, le liber et le xylèce on le
trouve dans les vaisseaux du bois passant d'un vaisseau à l'autre par
le biais des ponctuations, sa forme est applatie et large et il est
accolé contre la paroi lignifiée. La colonisation s'étend verticalement
et on trouve du mycélium jusqu'à un à deux centimètres au-dessus du collet.
Dans les parties souterraines le parasite a colonisé tout le système ra-
~5-
diculaire. Lorsque les inoculations sont faites ~ec la souche K, la
progression est moins rapide et le mycélium n'atteint que rarement le
cylindre central,il demeure dans le parenchyme cortical et son développe-
ment dans le sens vertical est moins ~mportant que celui de L.
En ce qui concerne la colonisation des radicelles après inocu-
lation par zoospores, nous n'avons pas observé de différence entre la
vitesse de la colonisation par le mycélium de K et par celui de L ;
vingt-quatre heures après mise en contact avec les zoospores la coloni-
sation de la radicelle était totale dans les deux cas.
A la lumière de ces observations on peut penser que la diffé
1rence d agressivité entre les souches K et L réside essentiellement dans
la différence de l'aptitude de l'une et l'autre souche à subir sans dom
mages les réactions de défense de la plante hôte, principalement dans la
région péricyclique. Il est difficile d'invoquer une déficience physio
logique de la souche K, si l'on considère qu'elle est capable de péné-
trer dans les organes de la plante avec un même pourcentage de réussite
que L et de coloniser les tissus de la radicelle où les réactions de
défense sont inexistantes.
A la surface des organes colonisés (20 heures après inoculation
pour les radicelles, 48 h à 72 h en ce qui concerne le collet apparais
sen~ des bouquets de sporocystes.
Quelques fois lors des inoculatioBs par la souche K nous avons
observé, une semaine après inoculation, la formation de chlamydospores
dans la région sous-épidermique au collet.
- 26 -
Fig n014 : Mycélium de la souche L en pénétration sur une racine
d'Hibiscus ; l~s points de pénétration sont indiqués par une flèche.
Fig n015 : Souche L sur Tomate Marmande, réaction des cellules épider
miques du collet à la présence de l'hyphe de pénétration.
a) Hyphe de pénétration.
- 27 -
A
B. L'HOTE
l - Réactions cellulaires lors de la pénétration
En ce qui concerne la racine d'Hibiscus sabdariffa, nos obser-
vat ions n'ont pas permis de mettre en évidence des réactions importantes
au cours des premières heures qui suivent la pénétration; Le seul phé-
nomène remarqué, et encore n'est-il pas général, est le déplacement de
la partie cytoplasmique contenant le noyau, vers le lieu où s'effectue
la pénétration. La même absence de réactions est observable au niveau
des cellules épidermiques du collet et de l'hypocotyle.
(Dans cette région par contre, chez la plantule de tomate Marmande, il
se produit au contact de l'hyphe de pénétration, un dépôt de matériel,
d'aspect granuleux, Fig nO 15 ; il ne semble pas que ce dépôt ait pour
origine une dégradation de la paroi cellulaire de l'hôte, car, une limi-
te nette existe entre la paroi et ce dépôt. Il est possible qu'il s'a-
gisse d'un changement de structure du cytoplasme induit par des sécré-
tions du parasite, diffusant au travers de la paroi).
Les premières réactions de brunissement et de précipitation du
contenu cellulaire, n'apparaissent que dix à vingt-quatre heures après
inoculation, elles se manifestent qu'au niveau du collet et de l'hypocoty-
le, pas dans les tissus de la racine. Elles interessent en premier lieu
les cellules épidermiques, qui réagissent vivement, l'extension du bru-
nissement se faisant plus rapidement dans le sens vertical que dans le
sens horizontal" sans doutes à la suite d'une colonisation par le para-
site plus rapide dans le premier sens. Deux à trois jours après l'inocu-
lat ion au collet le brunissement est important dans toute la région épi-
dermique, dans le parenchyme cortical en quelques endroits et dans l'an-
neau péricyclique où les réactions sont t~ès affirmées.
- 28 -
Le brunissement se propage verticalement jusqu'à un tiers de la
hauteur de l'hypocotyle.
Des réactions identiques se manifestent lors de la colonisation
par K ou par L (un peu moins intenses avec K).
Lors des inoculations par la souche )6, dans les cas optimums,
la pénétration a lieu et la réaction des cellules épidermiques suffit
à arrêter le développement du parasite.
Dans la majorité des cas, l'attaque par la souche L est trop ra
pide pour permettre à l'hôte de mettre en place des dispositifs de dé
fense, efficaces. L'étude des phénomènes de réaction tissulaire lors de
l'infection est plus facile lorsque l'on utilise la souche K. Les plants
avaient à l'inoculation un ~ge variant de sept à dix jours. Quatre à
sept jours après l'inoculation, des coupes faites auçcollet et dans les
parties basses de l'hypocotyle montrent dans la région cambiale vascu
laire, une augmentation de la vitesse de division des cellules. Ce phé
nomène est particulièrement sensible en face des zones du parenchyme cor
tical colonisées par le parasite. Il a pour résultat un épaississement
localisé de l'anneau libérien secondaire.
Dans le même temps, des groupes de cellules entrent en division
dans la zone péricyclique, toujours en regard des lésions corticales
ces divisions s'étendent aux cellules parenchymateuses de façon à
ceinturer complètement la région parasitée (Fig n016). Dans le paren
chyme cortical, certains groupes de cellules à contenu précipité et brun,
au niveau desquelles on trouve quelques fois le ~célium du parasite,
sont comprimés et réduits par la division des cellules parenchymateuses
environnantes, jusqu'à disparaître complètement (Fig n017). Il est à
- 29 -
noter que le processus de division est plus intense du côté interne que
du côté externe, la partie lésée étant a~~si repoussée vers l'extérieur.
Une vingtaine de jours après l'inoculation la situation se présente com
me la décrit la figure nOlS ; on remarque que le parasite n'a pas pu
atteindre le cylindre central et qu'il se trouve confiné dans des régions
de faible importance, isolées des parties saines par des zones de divi
sions cellulaires. Lorsque les inoculations sont réalisées avec la sou
che L, la vitesse de colonisation de cette souche ne permet pas à l'hôte
de développer de tels dispositifs de défense. La croissance du mycélium
est constamment en avance sur les manifestations de préoipitation du con
tenu des cellules de l'hâte. Le parasite gagne rapidement le cylindre cen
tral perturbant le transport de la sève et provoquant la mort de la plan
te.
- )0 -
Fig nOlG : Hibiscus sabdariffa inoculé à l'~ge de 10 jours par la sou
che K. Coupe transversale dans l'hypocotyle (partie basse) 10 jours
après inoculation.
a) Régions occupées par le parasite
b) Cellules en division~ autour des zones lésées.
------ -
•epiderme
'-.A-.,d:!"+-""","+-~-,"..,..4'---"+-------I--ab
cyl. cent.-Fig n017 : Divisions cellulaires au contact des zones lésées du
parenchyme cortical.
a) Zone initialement occupée par le parasite.
b) Divisions cellulaires.
- 31 -
- 32 .:..
_---..::s:::~---~-- a
~..........__-~~---b
>"'~~--""""ilT~'--- C
0~r--r-d-J~::::::f~~-_---tf"--e
.2
Fig nOlS Hibiscus sabdariffa inoculé à l'~ge de 10 jours par la souche K.
Coupe transversale dans l'hypocotyle (partie basse), 20 jours
après inoculation.
a) Barenchyme cortical, b) fibres, c) anneau lib'rien
d) bois, e) moëlle.
I) Zones occupées par le parasite.
2) Zones de divisions cellulairese
- )) -III) Evolution de la perméabilité cellulaire dans les hypocotyles au
cours de l'infection par la souche L.
L'altération de la perméabilité cellulaire dans les tissus in-
fectés se manifeste par une excrétion plus ou moins importante de com-
posés divers en particulier de composés ionisés. On peut avoir une idée
de l'importance de cette excrétion en mesurant à intervalles réguliere
la conductivité de l'eau dans laquelle des hypocotyles sont mis en sus-
pension. (5).
Des Hypocotyles d'Hibiscus, inoculés à 7 jours, sont récoltés
7h, 12h, 24h et 44h après inoculation, lavés à l'eau permutée section-
nés à ) cm au-dessus du collet et leurs racines enlevées, ils sont ensui-
te placés par quatre dans des bêchers contenant 10 ml d'eau permutée.
La conductivité de la solution est mesurée immédiatement puis à inter-
valles réguliers, elle est exprimée en micro Siemens par mg de poids sec.
Résultats : les résultats sont exprimés par le graphique n019, sur celui-
ci, les nombres portés en ordonnée correspondent à la différence entre
la conductivité de la solution contenant les hypocotyles inoculés et
celles de la solution contenant les témoins,à un temps donné.
On remarque que 7 heures après inoculation une différence de con-
ductivité entre inoculés et témoins est sensible d0nc avant l'apparition
des symptômes macroscopiques. Cette augmentation de la conductivité res-
te la même jusque 24h après inoculation ; 44h après inoculation, la diffé-
rence de conductivité entre inoculés et témvins s'est considérablement
accrue. Il semble que la première phase du phénomène, faible augmenta-I
tion de la conductivité, soit le fait de la réaction des cellules épider-,
miques à la présence du parasite. Nous a~ons vu qu'il se déplace très ra-
pidement dans le sens vertical et a tendance à coloniser les assises
épidermiques et sous-jacentes avant de s'enfoncer dans les tissus.
- 34 -
L'augmentation de la libération d'électrolytes se manifestant
à 44h serait un signe annonciateur de la mort du plant par perte de tur
gescence qui intervient 48 à 72h après inoculation ; la cause en serait
la colonisation par le mwcélium, du cylindre central, la présence du
champignon dans les vaisseaux provoquant une altération de la circulation
de la sève et par là une rupture de l'équilibre osmotique, suivie de la
mort généralisée des cellules.
On sait par les travaux de MOUNT et BhTEMAN (6) sur Erwinia caro
tovora que la perte d'électrolytes par les tissus de pomme de terre peut
être provoquée par immersion de ceux-ci dans une solution contenant une
polygalacturonate Trans-éliminase obtenue à partir de filtrats de cul
tures du pathogène. Nous avons testé des filtrats de culture de Phytoph
thora. Des hypocotyles d'Hibiscus étant mis en suspension dans du filtrat
dialysé, et la conductivité du filtrat mesurée périodiquement, aucune
différence sensible n'a été notée entre la perte d'électrolytes par des
hypocotyles placés dans le filtrat et par les témoins placés dans de l'eau
permutée. Nous n'avons donc pas pu faire de rapport entre polygalactupona
se et altération de la perméabilité cellulaire.
Cependant, il est à noter que la production d'enzymes pectinoly
tiques in vitro par le Phytophthora palmivora est faible (voir troisième
partie) ; d'autre part nous n'avons pas obtenu à partir de filtrat, la
macération des tissus d'hypocotyles. Ceci pourrait expliquer l'échec de
notre expérience.
- 35 -
~ siemens /mg
~f-44Heures
5
4 t/"./3 ./2 / 24H..-
f ,,=+=="-===i=-12 H. - 7H.1
.---~ -1------f---15 35 55 75 95 155 minutes
Fig n019 : Lib~ration de composés ionisés par des bypocotyles
d'Hibiscus à des temps variables après l'inoculation par la souche L.
... 36 -
IV) Augmentation de l'activité peroxydasigue dans les hypocotyles
d'Hibiscus au cours de l'infection.
a) Techniques
Des plantules âgées de 10 jours sont inoculées par la souche L
ou par la souche K (Suspension de zoospores) et récoltées à des interval-
les de temps réguliers après l'inoculation. Les plantules sont lavées à
lleau permutée et immédiatement coupées transversalement au microtome à
congélation. Des coupes de 120~ d'épaisseur sont ainsi réalisées à dif-
férentes hauteurs sur le collet et l'hypocotyle, et, placées dans un mi-
lieu de réaction (7) contenant :
- Solution aqueuse de chlorure d'ammonium saturée •••.•••• - l ml
... E" D" T"A" 5 %dans l' eau """""""""""",,""""""""""""""""""" - l ml
H202 3 %dans l' eau" """""""""""""""""""""""""""""""""." - 2 ml
- Dichlorhydrate de Benzidine solution aqueuse saturée ••• - 9 ml
Une à deux minutes après immersion, une coloration bleue se manifeste au
ni7eau des sites d'action de la peroxydase. Des sections témoins sont
obtenues par passage avant coloration dans une solution de cyanure de
potassium 0,1 M.
b) Résultat~
Chez les plantules saines une coloration bleue est observable
au niveau de l'assise épidermique et dans la région péricyclique (voirnO .to
photosn021) en ce qui concerne le collet et les parties basses de l'hypo-
cotylè (région a), dans certains ?as une faible coloration apparaît dans
les cellules libériénnes. Aux niveaux b et c on observe plus qu'une t~ès
faible coloration dans les cellules épidermiques et quelque·'fois dans
celles du péricycle.
Trente heures après inoculation par la souche L, une coloration
bleu.e est obtenue dans les cellules des 1.l:i.ili:ar1J primaire et secondaire au
- 37 -
niveau a, et en dessous indiquant la présence d'une activité peroxydasi~u~.
que, rien n'est à signaler aux niveaux b et c. Quarante-huit heures après
inoculation cette activité est devenue très importante dans les cellules
libériennes, elle s'est intensifiée dans celles du péricycle, une faible
activité est présente dans le parenchyme cortical et dans la moëlle.
Ces phénomènes se manifestent jusqu'au niveau b seulement. L'ac
tivité peroxydasique libérienne se maintient jusqu'à la mort des plants
qui intervient pour 80 % des individus une semaine après inoculation.
L'activité peroxydasique cesse progressivement dans les cellules du pa
renchyme cortical et du péricycle, au cours de la progression du parasite;
le contenu des cellules prenant alors un aspect granuleux et brunâtre.
Il est à noter que les réactions de brunissement les plus marquées appa
raissent dans les cellules de l'épiderme et de l'assise péricyclique,
cellules où l'activité peroxydasique est importante chez le plant sain.
Une semaine après inoculation ; dans les hypocotyles de plants ayant
résisté à l'attaque, on note que l'activité peroxydasique dans le liber
et le pericycle, est très élevée et intéresae tout l'hypocotyle jusqu'à
l'insertion des feuilles cotylédonnaires.
Lorsque les inoculations sont réalisées avec la souche K, les
mêmes phénomènes se produisent mais avec un certain retard; l'apparition
de l'activité peroxydasique dans le liber n'est décelable que quarante
huit heures après inoculation. 80 %des plants restent vivants une se
maine après l'inoculation j on note alors la présence d'une forte acti
vité peroxydasique dans le liber et le péricycle jusqu'aux niveaux b ou
c. Le mycélium du champignon reste isolé dans le parenchyme cortical
les groupes de cellules à contenu brun et dans lesquelles on peut obser
ver le parasite, sont entourés par un halo de cellules montrant, une for
te activité peroxydasique.
- 38 -
L'augmentation de l'activité peroxydasique dans les tissus de
l'hypocotyle se manifeste en dehors de tout contact avec le myc ~ium
contrairement à ce que montrent les travaux de ~~WELL et BATEMAN (8)
sur le couple hôte-parasite : Haricot/Rhizoctonia solani. La précipita-
tion du contenu cellulaire, ne se réalise qu'en présence du mycélium au
contact des cellules intéressées. dans les parties basses de l'hypocotyle
et au collet (niveau a) ; pendant les dernières phases de la maladie,le
brunissement s'étend à des niveaux plus élevés sans que le mycélium y
soit présent.
Phloème Pericycle Parenchymecortical
sain inoc. s. in. s. in.a +- ++ + ++ - -Ab - - + + - -a - +++ + ++ - +Bb - +++ + ++ - +a +- +++ + +++ - ++Cb - +++ + ++ - ++c - ++ - ++ - +
Activité peroxydasique dans les tissus de plantules d'Hibiscussabdariffa âgées de 10 jours au cours de l'infection par la souche L
A : 30 heures après inoculation. B : 3 jours après.C : une semaine après; a,b,c : niveaux des sections.
Concll;!sion
La présence d'une forte activité peroxydasique dans certains
tissus du plant sain d'Hibiscus semble être un facteur favorable à
l'établissement de réactions de défense; un exemple en est donné par la
réaction d'hypersensitivité qui se manifeste dans les cellwles épider-
miques vis-à-vis de la souche 36. Lorsque l'on inocule de jeunes collets
- )9 -
d'Hibiscus par du mwcélium de cette souche, on observe en effet, autour
des points de pénétration, 24 heures après inoculation, des cellules épi
dermiques à contenu brun et précipité au niveau desquelles, le mycélium
est en voie de dégénérescence. Les souches virulentes comme K et L sont
capables de franchir cette première barrière ; elles se heurtent alors
à la seconde représentée par la zone péricycle-phloème dont l'activité
peroxydasique a considérablement augmenté pendant le premier otade de
l'infection (colonisation du parenchyme cortical). Dans la région péricy
clique, la précipitation du contenu cellulaire et l'accumulation de com
posés d'origine phénolique bloque la progression de la souche K mais pas
celle de la souche L qui colonise le cylindre central perturbant le trans
port de la sève et provoquant la mort du plant.
Le rôle de la peroxydase dans la résistance au parasitisme ne
semble pas faire de doutes, de nombreux auteurs l'ont mis en évidence,
FEHRMAN et Dll~MOND en particulier (9) ont montré que chez la pomme de
terre une correlation nette existe entre la présence de peroxydases dans
certains organes et leur résistance au Phytophthora.
La formation de barrières protectrices d'origine phénolique, par
la plante, étant conditionnée par la présence de substrats, mais aussi
par l'activité üxydative du milieu cellulaire, on peut penser, que~ la
forte augmentation de l'activité peroxydasique dans les tissus de
l'Hibiscus au cours de l'infection, est favorable à l'établissement de
telles barrières. Ces barrières confèrent à la plantule une résistance
vis-à-vis de certaines souches, peu agressives (K) ou avirulentes ()6),
du parasite.
V) Evolution du contenu phénolique des tissus de l'hypocotyle et de l~
~H au cours de l'infection.
1) Contenu phénolique des tissus
- 40 -
La présence d'un parasite dans les tissus végétaux provoque
généralement une augmentation de la biosynthèse des composés phénoliques
(10) ; ce phénomène s'est vu confirmé dans les hypocotyles d'Hibiscus
FJ!h d~JZ2ffa ..
a) 19.chp..i9J.!.§p-'
Les plants inoculés à la jours par K ou par L sont récoltés à
intc~valles de temps réguliers, lavés, excisés et plongés dans l'alcool
à 95° bouillan-~ pendant 5 minutes ; ils sont ensuite extraits deux fois,
après b~oy~ge, dans l'alcool à 95 0 bouillant. L'alcool ayant été évaporé
sous pression réduite, l'extrait est remis en solution dans l'alcool à
70° et débarrassé de la· chlorophylle par le tetrachlorure de carbone.
I.c docage des com!,)o3és phénoliques est réalisé par l'emploi du réactif
de :FOT·IN 1 CIOCALTEU (MERCK) suivant la méthode de SIMMONS et ROSS (11).
La mésu~e àe la densité optique est faite à 730 nm.
Les résultats sont traduits par la figure n023, la teneur en
phénols y est exprimée par la densité optique multipliée par cent et
raoenée au poids sec de tissus extraits en mg.
On observe que dans les hypocotyles sains se produit une baisse
constante de la teneur en phénols des tissus, au cours de la croissance.
Il semble possible d'expliquer ce phénomène par l'entrée en fonctionne
ment, une semaine après germination du cambium vacculA.i.ro ainsi quP pa.~'
la formation de paquets de fibres dans la zone péricyclique. De ces deux
V.r-OCPSf.:ll::; "l.·~::.Jlll.l,~~·::di; llnA lignjfü~al;:ion importante qui pourrait provo
C?nel' la polymèrisation de certains phénols, Rn Ij gnj nAR, non extraites
par li alcool. De.ns les plants inoculés par la souche L, dès le deuxième
JOUI ap~ès l'inoculation, un ralentissement de la baisse de teneur en
phénols est sensible ; après le quatrième jour cette teneur cesse de
- 41-
baisser. Des résultats encore partiels, nous permettent de penser que
le même phénomène se produit lors de l'inoculation par K. Il est vrai-
semblable qu'une accumulation de composés phénoli~ll~s:c a lieu dans les
tissus qui sont au contact du parasite, équilibrant en partie le défi-
cit da~à la croissance.
Six jours après inoculation par la souche L, la quantité de ta-
nins condensés, dans les tissus, a augmenté par rapport au témoin ce
fait a été mis en évidence par la transformation des tanins de la frac-
tion méthanol 50 % (12) en anthocyanes dosables colorimètriquement par
la méthode de MASQU1LIER (13)
" ~> I~' .' _' )
Densité optique mesurée à 550 nm. ramenée au poids sec
2° EssaL •.•.•.
1° Essai ...... 19,0
17,0
inoculé par L(cinq,jours après
• . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . • • • • • • 33,5
.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30,5
inoculation)
Evaluation de la teneur des tissus en tanins condensés
Quelques études histûchimiques ont été menées pour localiser les
composés phénoliques apparaissant en réponse à l'infection. La réaction
préconisée par REEVE (14) pour mettre en évidence les tanins à catéchol
a été utilisée: à des sectiomfraîches on ajoute successivement, un
volume de nitrite de sodium 10 %, un volume d'urée 20 % et un volume
d'acide acétique à 10 % dans l'eau, on laisse reposer trois à quatre
min~tGs et on npporte six volumes de soude 2N, une coloration rouge céri-
se se développe indiquant la présence de tanins à catéchol. Dans les hypo-
cotyles inoculés par K ou par L,cette coloration apparaît au niveau de
quelques assises de cellules dans la zone péricyclique (assises de cellu-
les formées à la suite des phénomènes de divisions décrits dans le cha-
pitre II). Cette coloration est visible sur la photo n022. Auoun pré-
- 42 -
c.Lpité ne se ::orme avec le sulfate de fer ferrique dans cette zone.
L1emploi de la vanilline en solution dans l'acide chlorhydrique concen
~:ré provoque l'apparition d'une couleur rouge vive aux mêmes endroits
laissant supposer la présence de Flavanediols 3,4 (Leucoanthocyanidines)
ou de"Flavanols 3 (Catéchines). Le maintien des coupes, pendant une
het':"'), ~:3.t1S ~GS VepGUr3 chlorhydriques, donne une coloration rouge aux
tissus ~éricycliques; confirmant d'après JACQUEMIN (16) la présence de
flavanediols mais n'excluant pas celle de catéchines, (seuls les flava
nediols sont transformés en anthocyanidines par les vapeurs chlorhydri
ques).
En résumé : il apparaît dans la zone péricyclique, au cours de
l'in~oction, des cellules à contenu riche en flavanediols 3,4 et peut
être 8n cat~chineG. Ces phénols sont ils condensés ou non? Il est dif
f~.c:n'3 (:'e J.' 2.ffi::-mer car la réaction de REEVE l'indique mais n'est pas
confirmée par la précipitation au sulfate de fer.
Au cours de l'infection le pH des tissus parasités par la sou
che L augmente sensiblement, il passe de pH 5,7 à pH 6,3 trois jours
après inoculation. Dans les tissus des témoins le pH reste aux environs
YJ) .9.pnclusioll
La présence du parasite dans les tissus de Ithôte provoque une
pert~rbation importante de sa physiologie. Les quelques réactions de dé
::o:1se mises en évidence chez l' Hibiscus ( activation des divisions cel
lulrjres, augmentation de l'activité peroxydasique, accumulation de
composén phénoli~ues ) sont suffisantes pour préserver la plantule des
- 43 -
attaques de souches peu agressives. Par quels moyens la plantule freine
t-elle le développement de ces souches ? Ceux-ci restent à déterminer
avec plus de précision. Il serait intéressant d'étudier l'action des
composés nouveaux apparaissant dans les cellules de l'hôte lors de l'in
fection, sur le comportement de ces souches in vitro.
- 44 -
A
Localisation de l'activité peroxydasique dans le collet
d'Hibiscus âgé de 12 jours. A) Sain. B) 48 h. après inocu
lation par L.
a) Zone péricyclique. b) liber secondaire.
- 45 -
Activité peroxydasique dans l'épiderme du collet de
d'Hibiscus sain âgé de 10 jours.
a.
Photo n022 Coloration de la région péricyclique par la réaction de
R1EVE ; Bibiscus inoculé par K à 10 jour, 7 jours après
inoculation.
a) bpiderme. b) Paquet de fibres.
0.0.mg.
22
18
14
10
0····0 SAIN._. INoe.
t---i.... ~.
".'. '.
....~
- 46 -
o 2 4 6 jours
Fig n023 : Evolution du contenu phéno1ique total des tissus d'hypocoty1es
d'Hibiscus sains et inoculés par L au cours de la croissance. Inocu1a-
tion à 10 jours par suspension de zoospores.
PH6,5
6
5
••••0. '.
.....0· '0
•••••0· •
••0' e-e-e.:..:.:.:.:.:.. e __e
inocule
temoin
1 2 3 4 5 Jours
Fig nO 24 Evolution du pH des tissus (broyat). Mêmes conditions que
1 - 47 -
BILBIOGRAPHIE Deuxième partie
l ) D. KOFFI - Etude des interactions entre le Phytophthora palmivora(Butl.)
Butl. et ses plantes hôtes. Thèse soutenue à la faculté des
sciences d'Orsay" Janvier 1971 •
2 ) R.E. REICHLE - Arch. Mikrobiol. , 66 , (3) , 1970 , p. 340 .•
3 ) L.E. WALKER l P. ABBOT and M.A. GOOn~Y - Annals of Botany NS. , 32 ,
1968 , p. 132 •
4 ) B. HUGUENIN et B. BOCCAS - CR. Ac. Sciences Paris , D , 1970 , T.271 ,
p. 660 •
5 ) ~~I MING TAN, A.R. WEINHOLD and J.G. HANCOCK
Phytopathology , 58., (2) , 1968 , p. 240 •
6 ) M.S. MOUNT, D.F. BATEMAN'and H.G. BASHAM
Phytopathology , 60 , (6) , 1970 , p. 924 •
7 ) R. MARTIN ALVAREZ and DAN 0 KING - Amer. J. Bot. , 56 t (2) , 1969 ,
p. 180 •
8 ) D.P. ffiAXWELL and D.F. BATEM~N - Phytopathology , 57 t (2) , 1967 ,
p. 131 •
9 ) H. FEHFm~N and A.E. DIMMOND - Phytopathology, 57 , (1) , 1967 ; p.69 •
10 ) R.N. GOODMi\N , Z. KI~.LY and M. ZkITLIN - The biochemistry and physiolo
gy of infectious plant disease , D.V~N NOSTRAND t New York,
1967 •
Il, ) î"T. J. SIMlVIONS and P•• F. ROSS - Phyto pathology , 61 , (10) t 1971 , P. 1261 •
12 ) HILLIS et SV/AIN , cités dans P. RIBEREAU-GA.YON "' Les composés phénoli-
ques des végétaux , DUNOD , Paris , 1968 , p.198 •
13 ) ~\SQUELlhR , cité dans P. RIBER~U-GAYON , p.194 •
14 ) REEVE - 1951 , cité dans W.A. JENSEN , p.206.
15 ) if.A. JENSEN - Bü tanical Histochemistry , W.H. Freeman and Co , San Fran
cisco , 1962 •
~6 ) H. JACQUEMIN - Plantes Médicinales et Phytothérapie , 1970., T. IV
nO 3 et 4 •
- 48 -
TROISIEME PARTIE
L'EQUIPEMENT ENZYMATIQUE DU PARASITE LES ENZYMES PECTINOLYTIQUES.
La production de Pectine méthyl estérase (P.M.E.), de Polygalac
turonase (P.G.) et de Polyméthylgalacturonase (P.M.G.) par le P~ytophthora
palmivora a été mise en évidence par TARJOT (1) ; hKINREFON (2 et 3) a étu
dié la production de divers enzymes pectinolytiques en fonction des condi
tions de culture. Les travaux récents de MANTRI et DESHPANDE (17) sur le
Phytophthora rubra ainsi que de TRIQUE ET RAVISE (4) sur le Phytophthora pal
mivora ont montré l'importance des Trans-éliminases dans l'arsenal enzymati
que du parasite. Notre étude a porté sur la productionJ~nzymes pectinolyti
ques par les souches couramment utilisées au laboratoire.
Techniques
Nous avons utilisé les milieux de culture suivante.
Milieu l : Décoction de pomme de terre ("Moussline" du commerce 15 g / litre)
+ glucose l %
Milieu 2
Milieu 3
Milieu 4
Décoction de pomme de terre + glucose 0,5 %+ Pectine de citrus
0,5 %'
Milieu minéral minimum (5) + glucose l %. + chlorhydrate de thia-
mine 1 mg / litre
Milieu minéral minimum + glucose 0,5 %+ Pectine de citrus 0,5 %.
+ chlorhydrate de thiamine 1 mg par litre.
Les cultures étaient réalisées dans des fioles d'ERLENMEYER de
100 ml à raison de 20 ml par fiole, l'ensemensement fa:t avec des fragments
de cultures sur décoction de pois gélosée, prélevés s~ le front de croissan
ce du thalle. Les fioles étaient placées à 26°C à l'otscurité. Le liquide de
culture était récupéré par filtration sur verre frité. le mycélium lavé à
l'eau permutée était pesé après dessèchement. Le filt~at était mis à dialyser
contre de l'eau pendant une nuit à 4°C; conservé à cette température, il
était utilisé le plus rapidement possible (2 jours de conservation maximum).
Avant utilisation une centrifugation à 10.000 g pendant 15 minutes était
opérée.
- 49 -
l - Production de Pectineméthylestérase
Cet enzyme catalyse le processus de déméthylation des pectines,
son action est parfois nécessaire pour fournir un substrat favorable à
d'autres enzymes pectinolytiques.
Nous avons utilisé, pour mesurer son activité, la méthode qui
consiste à évaluer par titrimétrie la quantité de groupes carboxyles li-
bérés dans le milieu de réaction.
Le milieu comprenait
Pectine de citrus 1,2 %dans NeCl 0,25 M ••.....•.... 15 ml
Filtrat dialysé 10 ml
Incubation - l2h à 30°C - Activité exprimée en mg de méthanol libérés
dans le milieu.
SOUCHE.S ACTIVITE
51 0,97 mg
26 0,44
36 3,09
K . 0,35.L 0,6'(
FO 0,43
:...
SOUCHES ACTIVITE
l 1,09
570 0,52
134 1,32
56 0,63
38 1,24
37 0,65
..
Moyenne de 6 mesures
La production de P.M.E. est donc peu importante, on ne note que
de faibles différences entre les souches testées ; seule se distingue
la souche 36, nous verront qu'il en est de même en ce qui concerne la
production de Polygalacturonase.
-50-
II - Production de Polygalacturonase et de Polyméthyl galacturonase
L'activité de cet enzyme a été principalement mesurée par la
méthode viscosimétrique (6). Le milieu de réaction était composé de :
- Substrat l %dans tampon citrate NaOH,
citrate HCl ou Tris HCl •••••••.•••••••••••••••••••••••• 10 ml
- Filtrat dialysé ..... ~ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 ml
- Quelques gouttes de Toluène
Incubation 4 OU 8 heures à 30°C.
L'activité est évaluée par la différence entre le temps d'écou
lement du témoin (Filtrat 4 ml + Substrat 10 ml, chauffés 10 minutes à
100°C) et le temps d'écoulement de l'essai, différence exprimée en pour
centage du temps d'écoulement du témoin. La mesure du temps d'écoulement
est fai'tè'cdans des viscosimètres de type CANNON - FENSKE (taille 300).
Nous avons utilisé dans certains cas le test à l'acide Thiobarbiturique
l'absorption étant mesurée à 550 nm pour détecter les produits des
Trans-éliminases et à 51j nm pour l'activité Polygalacturonase.
l - Nature de l'enzyme
La polygalacturonase produite par le parasite est susceptible
de dégrader le polypectate de sodium et l'acide polygalacturonique, la
polyméthylgalacturonase, les pectines de pomme (Labosi) et de citrus
(N.B.C.). Le pH optimum des deux enzymes se situe aux environs de 5,
l'activité décroit rapidement lorsque le pH s'éloigne de sa valeur
optimale (Fig n026).
Dans le cas OÙ le substrat employé est l'acide Polygalacturoni
que l'activité (mesurée par l'emploi de l'acide thiobarbiturique) est
maximum à pH 6, cependant elle reste forte entre pH 5 et pH 8
(Fig nO 27).
- 51 -
L'analyse chromatographique du milieu de digestion montre qu'à
pH 5 il n'y a pas 0U peu de production d'acide galacturonique décelable,
(sur la fig n~25 la présence de cet acide dans le milieu témoin est vrai-
semblablement due à son existance dans les filtrats de culture), il y a
par contre production de polymère8~de l'acide galacuronique, sans doutes
les di - (1) tri - (2) et tetramère (J) de cet acide. Le spectre d'ab-
sorption des produits de dépolymérisation de l'acide Polygalacturonique
après réaction avec l'acide Thiobarbiturique (Fig n028) présente un pic
à 515 nm environ indiquant une activité Polygalacturonase. Un épaulement
à 550 nm suggère la présence de produits résultants de l'action d'une
Polygalacturonate trans-éliminase.
D'après ces résultats, on peut penser que les enzymes produits
in vitro par le parasite sur les milieux testés sont une Bndopolygalac-
turonase (Endo PG.) et une Endopolyméthylgalacturonase (Endo PMG.). Il
est possible que des Trans-éliminases agissent conjointement~avec~cel~q-ci
les-ci.
i?) - Influence de certains facteurs sur la production de Polyga-
lacturonase et de Polyméthylgalacturonase
La présence d'un inducteur (composé pectique) est nécessaire à
la production de P.G. et de P.M.G. en quantité importante.
Avec le milieu 4 et la souche L nous avons obtenu les résultats
suivants après 10 jours de culture.
Milieu de cultureGlucose seul l % ..Glucose :0,5 %Pectine Citrus 0,5 %
EnzymePG.PMG •PG.PMG.
21,2 %4,J4 %
72,0 %48,4 %
Activité •4,J4 %mg;1,07 %mg:15,J %mg:10,J %mg:
Moyenne de 6 mesures
- Incubation 8h à JOoc - pH 5. Substrats: Polypectate de NaPectine Citrus l %
... 52 -
On constate qu'une faible partie de l'activité enzymatique est
constitutive le reste étant adaptatif.
b) présence de glucose dans les milieux
La souche L a été cultivée sur le milieu 4 sans glucose et sur
le même milieu avec du glucose 1 %(Fig n0 29). L'absence de sucre dans!
le milieu est favorable à une production rapide de P.G., mais cette pro-
duction se stabilise rapidement à un niveau faible. L'addition de glucose
provoque un démarrage plus lent de la production,mais lui permet d'attein-
dre des valeurs plus élevées que dans le cas précédent. Cet effet favori-
sant du glucose a été confirmé sur le milieu 2. Sur ce milieu après (
7 jours de culture on a obtenu les résultats suivants.
Activité P.G.
Milieu 2 Glucose 0 %0,5 %I,O %1,8 %
l4,O(·%I';":'-::é l',c.
38,8 %35.,5 %28,3 %
~
..
- Incubation 4 heures à 30°C pH5, Substrat Polypectate de Na 1%
D'après ces résultats, le glucose semble avoir un effet inhibi-
teur, en début de croissance, mais il est nécessaire qu'il soit présent
pour provoquer un développement dumycélium et quand il vient à s'épui-
ser dans le milieu il permet une meilleure production d'enzyme.
Ces conclusions s'opposent à celles tirées par d'autres cher-
cheurs sur la production de P.G. par divers parasites (7,8,15). Pour le
Phytophthora palmivora, AKINREFON a montré que le glucose avait en effet
inhibiteur sur la production de P.G. mais que sa présence dans les mi-
~ieux favorisait la sécrétion d' 0< L Arabino-furanosidase et d'un fac-
teur de macération, d'après TRIQUE et RAVISE le lucose n'aurait
..
53 -
aucune action sur la production de lyase par ce champignon.
d) - production de P.G. en cours de croissance
En ce qui concerne le milieu 2 la courbe de production d'enzyme
(fig nO~l) montre un maximum atteint après une dizaine de jours de cul
ture, la production se stabilise ensuite. Il est à noter que le mycélium
même âgé est susceptible de produire une bonne quantité de P.G.
3) Production de PG. par diverses souches du Phytophthora pal-
mivora
Cette production a été évaluée, par la méthode viscosimètrique,
après 10 jours de culture sur le milieu 2. Les résultats sont présentés
sur la figure n030. La production est assez homogène et en général fai
ble par rapport à ce que l'on enregistre chez d'autres pathogènes.
Certaines souches se distinguent par une production élevée : K, 570, L,
36, Il n'existe aucune correlation entre virulence ou agressivité et
production de PG. in vitro ; L très agressivepour un grand nombre de
plantules et K peu agressiyeont sensiblement la même production, 36 avi
rulente contre l'Hibiseus et d'autres plantules est l'une des souches
les plus productrices. Des travaux récents de KEEN et ERWIN (9) ont mon
tré que dans le cas du Verticillium albo-atrum il n'y avait aucun~rap
port entre production de polygalactll"DOnaSe in vitro et virulence sur
le coton.
4) Production de PG. sur broyats d'Hypocotyles d'Hibiscus sains
et inoculés.
La souche K et la souche L ont été cultivées sur des broyats
d'hypocotyles (400 à 450 mg de poids frais de tissus broyés dans 10 ml
d'eau permutée). Les hypocotyles étaient soit sains, soit inoculés à
10 jours et récoltés à 14 jours. Une .semaine après ensemencement le dé-
•
- 54 -veloppement mycélien était bon. Nous avons obtenus les résultats suivants:
J~ctivité mesure viscosimètrique
Souche L Souche K
:Broyat d' Hibiscus:sains. 21,0 % 14,3 %
:Broyat d'Hibiscus:inoculés. 19,8 % 20,4 % ...
Incubation 4h. à 30o e, pH 5 Substrat Polypectate de sodium l %
Le broyat n'est pas plus favorable à L qu'à K pour l'induction
de PG., aucune différence de production n'existe entre. les cultures sur
broyat de plants sains ou inoculés.
III) Product~2n de Trans-éliminases
D'après TRIQUE et RAVISE (4) c'est à ces enzymes qu'est imputable
la plus grande partie de l'activité pectinolytique du Phytophthora pal-
miv~~~. Nous avons vu que la production de Polygalacturonate trans-élimi-
nase sur le milieu 4 pouvait être indiquée par l'épaulement à 550 nm sur
le spectre d'absorption des produits de dépolymérisation de l'acide poly-
galacturonique. Ré~emment nous avons décelé une faible activité polyga-
lacturonate trans-éliminase dans des filtrats de culture de la souche L
en présence de broyat d'Hibi~Il est vraisemblable que le pH du mi-
lieu a un rôle à jouer dans la détermination du type d'enzyme produit.
Les milieux 1,2,3 et 4 ont en fin de culture un pH de l'ordre de pH 4,5 -
pH 5, qui est favorable à l'action de la PG. (7,11,13,14). Le broyat
d' Hibiseus a tm pH plus élevé, entre 6 et 7 et on sait que les trans-éli-
rninasfls ont en général des pH optimums neutres ou basiques(7,10,12,13,14).
,
•
- 55 -
IV) Production d'enzymes pectinolytiques in vivo.
De multiples extractions à partir d'hypocoty1es parasités
d'Hibiscus sabdariffa n'ont pas permis de œettre en évidence la présence
d'enzymes pectino1ytiques dans les tissus parasités.
V) Conclusion
D'après ces quelques expériences nous pouvons conclure qu'une
EndoPG., une EndoPMG. et peut être une Endopolygalacturonate Trans-é1i
minase sont produites par le Phytophthora palmivora in vitro. Cette p~o
duction est faible par rapport à celle d'autres pathogènes et il n'y a
aucune corrélation entre la production de ces enzymes in vitro et la vi
rulence ou l'agressivité ; ce dernier fait est en accord avec les reche"
ches faites sur d'autres parasites (9, 18). Des études plus apprq~~ndies'
sur la production de ferments pectiques in vivo restent à entreprendre.
·.
Fig nO 25
- 56 -
0 80 0)
0....
8 ....
0 0 0 0K L T a. galacturonique
Chromatogramme des milieux de réaction
Milieu de réaction : Acide polygalacturoniq~e l %dans tampon citrate de sodium pH : 5 •.• 10 ml
Filtrat : cultures âgées de 10 jours surmilieu 5 4 ml
Incubation 12 h. à )0 oc
•
K=Souche K ; L = Souche L ; T = Témoin
Développement: Acétate d'éthyle, Acide acétique, Eau
Révélation : Acide phtalique, aniline •
I/I/I 12h.
A. e_ P,à,., 57 -0- -0 PoIYl'.~tot, d. 50d'um
•
40
20
2 3 4 5 Il 7 8 9 pH
Influence du pH du milieu de réaction sur les activités P.G.
et P.M.G. de filtrats de culture du Phytophthora palmivora
Incubation 8 heures à 30 oc.
9 pH87654
DO. •
20 /\_.•
/•10
• Fig n027: Influence du pH du milieu de réaction sur l'activité PG. d'un
filtrat de culture du Ph.ytophthora palmivora. Mesure de la den
sité optique à 515 nm après réaction avec l'acide thiobarbitu
rique.
• ..; 58
l'
0.0.
50
40
30
20
550 500 nm
:-.~ ."
•
•
Fig n028 . Spectre d'absorption des produits ·de dépolimérisation de
l'acide polygalacturonique par la PG. de la souche L•
._. glucose 0
Act./mg
10
Q·······u 1 %
00
00
.' o' .Jo_·
000
00
• e_5
3
off
5 8 12
JOURS
•
Production de PG. sur le milieu 4 en présence et en T'aosen-
ce de glucose. Souche L. Incubation 4 heures à )ooC. Substrat
polypectate de sodium•
•
"Act.
%rJ 100
60
20
SOUCHES
'0 ~00' 00.
r:;
1... .. ...
K L 26 36 570
Il: r1r1 :..FO 1 2 37 51 5& 134
Act.%par mg.
10 ]]
6
2
- 59 -
Fig nO 31
Production de PG. par quelques souches du Phytophthora palmi
YQr~ sur le milieu 2. Incubation 4 heures à 30°C, pH 5.Substrat polypectate de Na.
Moyenne de 6 mesures.
Act.60 /0_0 050 040
30
/020 010
2 • cs 12 15 20 27 jours
Production de PG. en cours de croissance sur le milieu 2
Incubation 4 heures à 30°C - Substrat Polypectate de Na
- Moyenne de 3 mesures.
..
- 60 -
BIBLIOGRAPHIE Troisième chapitre
1)- T~RJOT : Conférence internationale sur les recherches cacaoyères
Abidjan. 1965
2)- ~KINRbFON O.A. : Ann. Bot. NS. 1969 (33) 439-450
3)- AKINRB.FON O.A •. : J. Gen. Microbiol. GB 1968 (51) 67-74'
4)- TRIQUE B. et RAVISE À. : CR. Ac. Sciences • Pari~ Serie 1971 •
1805-08 ."
5)- HUGUENIN B. et BOCCAS B. Ann. de Phytopathologie INRA • 1970 • 353
373 •
6)- HANCOCK T.J. , MILLAR R.L. , and LORBEER J.W•
. Phytopathology , 1964 (54) , 8 , p.928
7)- AYERS W.A. and PAPAVIZAS G.C. and DIEM AF.
Phytopathology 1966 (56) 9 • 1006-1011
8)- BIENH WL. and DIMOND AE. Phytopathology 1970 (60) 9 • 1284
9)- KEEN RT. and ERWIN DC. Phytopathology 1971 (61) 2 • 198-203
10)- GARIBALDI A. and BATEMJ~N D.F. , Physiol. Pl. Path. , 1971 , l , p.25 •. "
Il)- CHAN Y.O. and SACKSTON W.E. : Cano J. Bot. 1970 , 6 , .p.l073 •
12)- AYERS W.A. , PAPAVIZA G.C. , PAPAVIU~ G.C. and LUMSDEN R.D. ,
Phytopathology , 1969 (59) , 7 , p.925 •
13)- UNBEHAUM L.M. and MOOR~ L.D. : Phytopathology , 1970 (60 , 2 , p.304 •
14)- WANG C.Y.C. and PINCKARD J.A. : Phytopathology , 1971 (61) , 9 , p.l118 •
15)- HORTON J.C. and KEEN N.T. : Phytopathology , 1966 (56) , 8 , p.908 •
16)- PATIL S.S. and DIMON~ A~E. : Phytopathology , 1968 (58) , 5, p.676 •
17)- MAJ~TRI J.M. and DESHPAND~ K.B. : Proc. Indian Aead. Sei. Sect. B 72
(3) p. 129 •
18)- MoRRAL R.A.A. , DUCZEK L.J. and SHEARD J.W. : Cano J. Bot. 1972 (50)
4 , p.767 •
