Nucleotide sequence of human monocyte interleukin 1 precursor cDNA

Nucleotide sequence of human monocyte interleukin 1 precursor cDNA

Isabel Doch

Philip E. Auron, Andrew C. Webb, Lanny J. Rosenwasser, Steven F. Mucci, Alexander Rich, Sheldon M. Wolff, Charles A.

DinarelloProceedings of the National Academy of Sciences, USA

Vol.81, pp. 7907-7911, Dezember 1984Immunology

ÜbersichtÜbersicht

• Autor• Wissensstand vor Publikation• Experiment• Heutiger Wissensstand• Entstandene (Therapie-)Möglichkeiten• Zusammenfassung

Charles DinarelloCharles Dinarello

• US-amerikanischer Mediziner• Professor an der Universität

von Colorado• Forscher auf dem Gebiet der

Cytokine (IL-1)• „Gründungsvater der Cytokin-

Biologie“• U.a. Träger des Paul-Ehrlich-

Preises 2010

Charles Dinarello, 2010

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Wissensstand vor PublikationWissensstand vor Publikation

• IL-1: sekretierte Moleküle von stimulierten mononuklearen Phagozyten (Monocyten bzw. Macrophagen)

• Stimulation durch z.B. LPS gramm-negativer Bakterien

• Vielfältige biologische IL-1 Aktivität bekannt

• Mediator von Fieber• Induktion der Synthese von Akute-Phase

Proteinen (z.B. C-reaktives Protein)• Steigerung der Lymphocytenproliferation und

Lymphokinproduktion

• Induktion der Synthese von Prostaglandin E2 und Kollagenase

Wissensstand vor PublikationWissensstand vor Publikation

Wissensstand vor PublikationWissensstand vor Publikation

• 15.000-20.000 Mr Proteine mit IL-1 Aktivität

• Unklar ob IL-1 Aktivität auf einzelnem Molekül oder einer Familie verschiedener Substanzen beruht

• Keine AS-Sequenz bekannt• Klonierung und Sequenzierung von cDNA

noch in Anfangsphase

SchlüsselexperimentSchlüsselexperiment

→Kann eine IL-1 cDNA isoliert und sequenziert werden?

→Weist Translationsprodukt der entsprechenden mRNA IL-1 Aktivität auf?

Gewinnung der mRNAGewinnung der mRNA

• Isolierung und Kultivierung von humanen Monocyten

• Stimulierung der Zellen mit Endotoxin aus E. coli

• Lyse und Dichtegradientenzentrifugation• Isolierung der mRNA durch Bindung an

oligo(dT)-cellulose

Erstellung einer cDNA BankErstellung einer cDNA Bank

• Umschreiben der mRNA aus stimulierten Monocyten in cDNA mittels reverse Transkriptase

• Einbringen in Vektoren

→cDNA Bank

Klone mit stimulationsspezifischer cDNAKlone mit stimulationsspezifischer cDNA

Stimulierte Monocyten

Unstimulierte Monocyten

mRNAstim mRNAunstim

32P cDNAstim32P cDNAunstim

→ Klone mit stimulations-spezifischer cDNA

Hybrid-selektionierte mRNAHybrid-selektionierte mRNA

• Selektionierung von mRNA durch Hybridisierung mit cDNA der stimulationsspezifischen cDNA Klone

• Translation dieser mRNA• In vitro mit Hasen-Reticulocyten Lysat• Radioaktive Markierung durch [35S]Methionin• Immunpräzipation mit Hasen Anti-human IL-1

polyklonalem Serum

Hybrid-selektionierte mRNA liefert mit anti IL-1 immunpräzipierbare Proteine mit ~ 35.000 Mr

Hybrid-selektionierte mRNA liefert mit anti IL-1 immunpräzipierbare Proteine mit ~ 35.000 Mr

MarkerWasser

Proteine der unselektionierten mRNA von stimulierten Monocyten

Proteine der Hybrid-selektionierten mRNA

IL-1 Activity AssayIL-1 Activity Assay

• Injektion der Hybrid-selektionierten mRNA in Xenopus Oocyten

• Abtrennung des Oocytenüberstands und Fraktionierung

• Zugabe von T-Zell Klonen Stimulation der Proliferation durch IL-1→Maß für Aktivität

IL-1 Activity AssayIL-1 Activity Assay

• Keine Aktivität mRNA von

unstimulierten Monocyten

Hybrid-selektionierte mRNA durch cDNA eines Kontrollklons

• Aktivität mRNA von stimulierten

Monocyten Hybrid-selektionierte

mRNA

Sequenz der IL-1 Vorläufer cDNASequenz der IL-1 Vorläufer cDNA

→Codiert für Protein mit 269 AS, 30.747 Mr → Vorläufer-Protein→Start-Codon mit konservierter Sequenz (C-C-R-C-C-A-T-G-G)→N-Terminus ohne für Sekretionsproteine typisches hydrophobe Signal

Heutiger WissensstandHeutiger Wissensstand

• Dinarello sequenzierte die cDNA von IL-1β• Caspase-1 katalysiert die Prozessierung des IL-

1β Vorläufer-Proteins in seine reife sezernierte Form

• IL-1 Familie– Neben IL-1β noch viele weitere Vertreter bekannt, z.B

IL-1α, IL-1ra(Antagonist), IL-18,…– Mit entsprechenden Rezeptoren

Cytokinbasierende TherapienCytokinbasierende Therapien

• Gezielte Blockade der biologischen Aktivität von IL-1 durch– Antikörper gegen IL-1– Bindung an IL-1 Rezeptoren

• Diabetes– IL-1β schädlich für Insulin-produzierende Zellen

• Rheumatoide Arthritis• Junevile idopathische Arthritis• Chronisch-entzündliche Darmerkrankung• Schuppenflechte

ZusammenfassungZusammenfassung

• IL-1 besitzt wichtige immunologische Funktionen• Werden von einem einzigen Protein vermittelt• IL-1 cDNA codiert für ein Vorläufer-Protein

(30,747 Mr)

• Prozessierung des Vorläufer-Proteins in biologisch aktive Form (15.000-20.000 Mr)

• Sequenzierung ermöglichte verschiedene Therapiemöglichkeiten– Besonders bei autoinflammatorischen Krankheiten

QuellenangabeQuellenangabe

• Philip E. Auron, Andrew C. Webb, Lanny J. Rosenwasser, Steven F. Mucci, Alexander Rich, Sheldon M. Wolff, Charles A. Dinarello. 1984. Nucleotide sequence of human monocyte interleukin-1 precursor cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7907-7911

• Theresa T. Pizarro, Fabio Cominelli. 2007. Cloning IL-1 and the Birth of a New Era in Cytokine Biology. The Journal of Immunology. 178: 5411-5412