Non-Genomic Action of the Mineralocorticoid

7/28/2019 Non-Genomic Action of the Mineralocorticoid

1/9

T h e c l a s s i c a l g e n o m i c m e c h a n i s m o f s t e r o i d h o r m o n e a c t i o n

i n v o l v e s b i n d i n g t o i n t r a c e l l u l a r r e c e p t o r s , t r a n s c r i p t i o n a n d

p r o t e i n s y n t h e s i s . Y e t a l d o s t e r o n e c a n a l s o i n d u c e a n o n -

g e n o m i c r e s p o n s e b y i n t e r f e r i n g w i t h m e c h a n i s m s o f

r e g u l a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r p H o r c a l c i u m ( O b e r l e i t h n e r e t a l .

1 9 8 7 ; V i l e l l a e t a l . 1 9 9 2 ; C o o p e r & H u n t e r , 1 9 9 4 ; G e k l e e t

a l . 1 9 9 6 ; D o o l a n & H a r v e y , 1 9 9 6 ) , i n t r a c e l l u l a r g e n e r a t i o n o f

i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e ( I P 3

) ( C h r i s t e t a l . 1 9 9 3 ) a n d

p r o t e i n k i n a s e C ( P K C ) a c t i v a t i o n ( D o o l a n & H a r v e y , 1 9 9 6 ) .

T h e s e n o n - g e n o m i c a c t i o n s o f a l d o s t e r o n e a r e t h o u g h t t o b e

m e d i a t e d b y a p l a s m a m e m b r a n e r e c e p t o r ( W e h l i n g e t a l .

1 9 9 2 ) . P r e v i o u s s t u d i e s h a v e a l s o r e v e a l e d t h a t a l d o s t e r o n e

a c t s w i t h i n s e v e r a l m i n u t e s o n p l a s m a m e m b r a n e K

c o n d u c t a n c e o f d i f f e r e n t c e l l s ( O b e r l e i t h n e r e t a l . 1 9 8 7 , 1 9 8 9 ;

U r b a c h e t a l . 1 9 9 6 ) . O n e i m p o r t a n t t a r g e t o f a l d o s t e r o n e

d u r i n g t h i s e a r l y r e s p o n s e i s p l a s m a m e m b r a n e N a H

e x c h a n g e ( O b e r l e i t h n e r e t a l . 1 9 8 7 ; V i l e l l a e t a l . 1 9 9 2 ;

C o o p e r & H u n t e r , 1 9 9 4 ) . R e c e n t l y , w e h a v e s h o w n t h a t a n

e l e v a t i o n i n c y t o s o l i c C a s e r v e s a s a s e c o n d m e s s e n g e r i n

t h e s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y i n i t i a t e d b y a l d o s t e r o n e f o r

r a p i d N a H e x c h a n g e a c t i v a t i o n i n M a d i n D a r b y c a n i n e

k i d n e y - C 1 1 ( M D C K - C 1 1 ) c e l l s ( G e k l e e t a l . 1 9 9 6 ) . T h i s c e l l

c l o n e s h a r e s m a n y p r o p e r t i e s w i t h r e n a l c o l l e c t i n g d u c t

e p i t h e l i u m , i n c l u d i n g g e n o m i c s e n s i t i v i t y t o a l d o s t e r o n e

( V a l e n t i c h , 1 9 8 1 ; G e k l e e t a l . 1 9 9 4 b ; W

u n s c h e t a l . 1 9 9 5 ) .

F u r t h e r m o r e , w e c o u l d s h o w t h a t a l d o s t e r o n e i n d u c e s

c y t o s o l i c a c i d i f i c a t i o n i n M D C K - C 1 1 c e l l s w h e n N a H

e x c h a n g e i s i n a c t i v a t e d , p r o b a b l y v i a h e t e r o t r i m e r i c G -

p r o t e i n s a n d P K C ( G e k l e e t a l . 1 9 9 7 b ) . W e h y p o t h e s i z e d t h a t

t h e r e i s a f u n c t i o n a l c r o s s - t a l k b e t w e e n N a H e x c h a n g e

a n d t h e a l d o s t e r o n e - s e n s i t i v e a c i d i f i c a t i o n m e c h a n i s m . S i n c e

b o t h a l d o s t e r o n e - i n d u c e d a c i d i f i c a t i o n a n d N a H e x c h a n g e

a f f e c t c y t o s o l i c p H , b u t i n o p p o s i t e d i r e c t i o n s , i t i s d i f f i c u l t

t o d e m o n s t r a t e t h e d e p e n d e n c e o f N a H e x c h a n g e o n t h e

a c i d i f i c a t i o n m e c h a n i s m b y d e t e r m i n a t i o n o f c y t o s o l i c p H .

I n t h e p r e s e n t s t u d y w e d e t e r m i n e d t h e n o n - g e n o m i c e f f e c t s

o f a l d o s t e r o n e o n c y t o s o l i c s o d i u m a n d s h o w t h a t

a l d o s t e r o n e l e a d s t o a n e t h y l - i s o p r o p a n o l a m i l o r i d e ( E I P A ) -

s e n s i t i v e i n c r e a s e i n c y t o s o l i c s o d i u m a n d c e l l v o l u m e ,

w h i c h a r e b o t h i n h i b i t e d b y Z n , v i a i n t e r a c t i o n a t t h e

p l a s m a m e m b r a n e .

J o u r n a l o f P h y s i o l o g y ( 1 9 9 8 ) , 5 1 1 . 1 , p p . 2 5 5 2 6 3

2 5 5

N o n - g e n o m i c a c t i o n o f t h e m i n e r a l o c o r t i c o i d a l d o s t e r o n e o n

c y t o s o l i c s o d i u m i n c u l t u r e d k i d n e y c e l l s

M i c h a e l G e k l e , S t e f a n S i l b e r n a g l a n d S t e f a n W

u n s c h

P h y s i o l o g i s c h e s I n s t i t u t , U n i v e r s i t y o f W

u r z b u r g , W

u r z b u r g , G e r m a n y

( R e c e i v e d 1 8 D e c e m b e r 1 9 9 7 ; a c c e p t e d a f t e r r e v i s i o n 8 M a y 1 9 9 8 )

1 . T h e m i n e r a l o c o r t i c o i d a l d o s t e r o n e i s e s s e n t i a l f o r t h e r e g u l a t i o n o f e l e c t r o l y t e h o m e o s t a s i s ,

e x t r a c e l l u l a r v o l u m e a n d b l o o d p r e s s u r e . A s a s t e r o i d h o r m o n e t h e c l a s s i c a l w a y o f a c t i o n i s

g e n o m i c . P r e v i o u s l y w e r e p o r t e d a n o n - g e n o m i c a c t i o n o f a l d o s t e r o n e o n c y t o s o l i c C a a n d

p H i n r e n a l e p i t h e l i a l ( M D C K ) c e l l s . I n p a r a l l e l , a l d o s t e r o n e i n d u c e s Z n - s e n s i t i v e c y t o s o l i c

a c i d i f i c a t i o n w h e n e x t r a c e l l u l a r N a i s a b s e n t .

2 . W e n o w s h o w t h a t a l d o s t e r o n e ( E C 5 0 , 7 1 0

1 1

m o l l ) i n d u c e s a n o n - g e n o m i c i n c r e a s e i n

c y t o s o l i c s o d i u m i n M D C K c e l l s . T h e m e m b r a n e - i m p e r m e a b l e a l d o s t e r o n e b o v i n e s e r u m

a l b u m i n ( B S A ) c o n j u g a t e e x e r t e d t h e s a m e e f f e c t . T h e e f f e c t o f a l d o s t e r o n e w a s c o m p l e t e l y

a b o l i s h e d b y i n h i b i t i o n o f N a H e x c h a n g e w i t h e t h y l - i s o p r o p a n o l a m i l o r i d e ( E I P A ) .

A l d o s t e r o n e - i n d u c e d N a i n f l u x e x c e e d e d H e f f l u x m o r e t h a n 1 0 - f o l d .

3 . O m i s s i o n o f e x t r a c e l l u l a r C a , i n h i b i t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C o r p r e t r e a t m e n t w i t h p e r t u s s i s

t o x i n r e d u c e d t h e e f f e c t o f a l d o s t e r o n e s i g n i f i c a n t l y . Z n ( I C 5 0

, 3 3 1 0

6

m o l l ) , b u t n o t

o u a b a i n , a b o l i s h e d t h e i n c r e a s e i n N a a l m o s t c o m p l e t e l y .

4 . T h e a l d o s t e r o n e - i n d u c e d i n c r e a s e i n c y t o s o l i c s o d i u m w a s a c c o m p a n i e d b y a n E I P A - a n d

Z n - s e n s i t i v e c e l l s w e l l i n g .

5 . T h u s , p h y s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s o f a l d o s t e r o n e i n d u c e a n o n - g e n o m i c i n c r e a s e i n c y t o s o l i c

s o d i u m c o n c e n t r a t i o n b y a c t i v a t i o n o f N a H e x c h a n g e . A l d o s t e r o n e e x e r t s i t s e f f e c t , a t

l e a s t i n p a r t , a t t h e p l a s m a m e m b r a n e v i a i n t e r a c t i o n w i t h a G - p r o t e i n - c o u p l e d m e c h a n i s m .

6 . T h e s i m u l t a n e o u s a c t i v a t i o n o f t h e a c i d i f i c a t i o n m e c h a n i s m a n d N a H e x c h a n g e b y

a l d o s t e r o n e a l l o w s a d r a m a t i c s o d i u m i n f l u x w i t h o u t e x c e s s i v e c h a n g e s i n c y t o s o l i c p H a n d

l e a d s t o c h a n g e s i n c e l l v o l u m e .

7 7 2 8

K e y w o r d s : A l d o s t e r o n e , S o d i u m , C e l l v o l u m e

) by guest on April 29, 2013jp.physoc.orgDownloaded from J Physiol (
http://jp.physoc.org/http://jp.physoc.org/http://jp.physoc.org/


2/9

M E T H O D S

C e l l c u l t u r e

M D C K c e l l s w e r e o b t a i n e d a t p a s s a g e 5 3 f r o m t h e A m e r i c a n T y p e

C u l t u r e C o l l e c t i o n ( R o c k v i l l e , M D , U S A ) . I n t h i s s t u d y w e u s e d a

s u b t y p e d e n o m i n a t e d C 1 1 ( M D C K - C 1 1 ) w h i c h h a s b e e n c l o n e d

r e c e n t l y i n o u r l a b o r a t o r y ( G e k l e e t a l . 1 9 9 4 b ) . T h e C 1 1 s u b t y p e

r e s e m b l e s t h e i n t e r c a l a t e d c e l l s o f t h e c o l l e c t i n g d u c t . T h i s c e l l t y p e

h a s b e e n s h o w n t o b e a l d o s t e r o n e s e n s i t i v e i n t h e c l a s s i c a l w a y

( G e k l e e t a l . 1 9 9 4 b ) . C e l l s w e r e s e e d e d i n p l a s t i c c u l t u r e d i s h e s

( g r o w t h a r e a , 7 5 c m ; N u n c , W i e s b a d e n , G e r m a n y ) i n 1 0 m l

M i n i m u m E s s e n t i a l M e d i u m w i t h E a r l e s s a l t s , n o n - e s s e n t i a l a m i n o

a c i d s a n d _ g l u t a m i n e ( M E M m e d i u m , B i o c h r o m K G , B e r l i n ,

G e r m a n y ) a n d c u l t u r e d u n d e r s t a n d a r d c e l l c u l t u r e c o n d i t i o n s

( 3 7 C , 5 % C O ) . T h e M E M m e d i u m w a s s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 %

f e t a l c a l f s e r u m ( B i o c h r o m K G ) a n d 2 4 m m o l l N a H C O . T h e

m e d i u m w a s c h a n g e d t h r e e t i m e s a w e e k a n d t h e c e l l s w e r e s p l i t

o n c e a w e e k . F o r t h e m e a s u r e m e n t o f c y t o p l a s m i c p H c e l l s w e r e

s e e d e d o n t h i n g l a s s m i c r o s c o p e c o v e r s l i p s p r e t r e a t e d w i t h p o l y - l -

l y s i n e ( 0 1 g l ; S e r v a , H e i d e l b e r g , G e r m a n y ) . A l l e x p e r i m e n t s

w e r e p e r f o r m e d a t 3 7 C u n d e r b i c a r b o n a t e - f r e e c o n d i t i o n s .

D e t e r m i n a t i o n o f c e l l u l a r s o d i u m , p H a n d v o l u m e

I n t r a c e l l u l a r s o d i u m a n d p H o f s i n g l e c e l l s w a s d e t e r m i n e d u s i n g

t h e s o d i u m - s e n s i t i v e d y e S B F I o r t h e p H - s e n s i t i v e d y e B C E C F

( M o l e c u l a r P r o b e s , E u g e n e , O R , U S A ) a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e

( T h o m a s e t a l . 1 9 7 9 ; W e i n e r & H a m m , 1 9 8 9 ; D r e h e r & R o c h a t ,

1 9 9 2 ; S c h l a t t e r e t a l . 1 9 9 6 ) . I n b r i e f , c e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h

M E M c o n t a i n i n g 5 1 0

6

m o l l S B F I A M o r 2 1 0

6

m o l l

B C E C F A M f o r 6 0 o r 5 m i n , r e s p e c t i v e l y . T h e n t h e c o v e r s l i p s

w e r e r i n s e d f o u r t i m e s w i t h s u p e r f u s i o n s o l u t i o n t o r e m o v e t h e

d y e - c o n t a i n i n g m e d i u m . T h e c o v e r s l i p s w e r e t r a n s f e r r e d t o t h e

s t a g e o f a n i n v e r t e d A x i o v e r t 1 0 0 T V m i c r o s c o p e ( Z e i s s ,

O b e r k o c h e n , G e r m a n y ) a n d a l l o w e d t o e q u i l i b r a t e f o r 1 5 m i n .

E x c i t a t i o n l i g h t s o u r c e w a s a 1 0 0 W m e r c u r y l a m p . T h e e x c i t a t i o n

w a v e l e n g t h s w e r e 3 3 4 n m 3 8 0 n m f o r s o d i u m m e a s u r e m e n t s a n d

4 6 0 n m 4 8 8 n m f o r p H m e a s u r e m e n t s . T h e e m i t t e d l i g h t w a s

f i l t e r e d t h r o u g h a b a n d p a s s f i l t e r ( 5 1 5 5 6 5 n m ) . T h e d a t a

a c q u i s i t i o n r a t e w a s o n e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y r a t i o e v e r y 2 s .

I m a g e s w e r e d i g i t i z e d o n - l i n e u s i n g a v i d e o - i m a g i n g s o f t w a r e

( A t t o f l u o r , Z e i s s , O b e r k o c h e n , G e r m a n y ) . A f t e r b a c k g r o u n d

s u b t r a c t i o n , f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y r a t i o s w e r e c a l c u l a t e d . p H

c a l i b r a t i o n w a s p e r f o r m e d a f t e r e a c h e x p e r i m e n t b y t h e n i g e r i c i n

( S i g m a ) t e c h n i q u e ( T h o m a s e t a l . 1 9 7 9 ; W e i n e r & H a m m , 1 9 8 9 ) ,

u s i n g a t l e a s t t h r e e c a l i b r a t i o n s o l u t i o n s i n t h e r a n g e f r o m p H 6 8 t o

7 8 . T h e c a l i b r a t i o n s o l u t i o n s c o n t a i n e d 1 1 5 m m o l l K C l a n d

3 0 m m o l l N a C l . S o d i u m c a l i b r a t i o n w a s p e r f o r m e d a f t e r e a c h

e x p e r i m e n t w i t h n y s t a t i n a c c o r d i n g t o S c h l a t t e r e t a l . ( 1 9 9 6 ) .

F i g u r e 1 A s h o w s a t y p i c a l c a l i b r a t i o n t r a c i n g a n d F i g . 1 B s h o w s a

c a l i b r a t i o n c u r v e . C u r v e f i t t i n g w a s p e r f o r m e d b y t h e l e a s t - s q u a r e

m e t h o d u s i n g S i g m a P l o t 2 . 1 s o f t w a r e ( J a n d e l S c i e n t i f i c , C o r t e

M a d e r a , C A , U S A ) . F o u r t o s i x c e l l s w e r e e v a l u a t e d p e r c o v e r s l i p .

I n t r a c e l l u l a r n o n - b i c a r b o n a t e b u f f e r i n g p o w e r ( ) w a s d e t e r m i n e d

b y t h e s e q u e n t i a l a d d i t i o n o f k n o w n a m o u n t s o f a c i d t o t h e c e l l s

a n d t h e r e s u l t i n g c h a n g e s i n c y t o s o l i c p H , i n t h e a b s e n c e o f

e x t r a c e l l u l a r s o d i u m ( B o r o n , 1 9 9 2 ; C o o p e r & H u n t e r , 1 9 9 4 ) . C e l l s

w e r e e x p o s e d f o r 5 m i n t o 2 0 m m o l l N H C l . S u b s e q u e n t l y t h e

N H C l c o n c e n t r a t i o n w a s r e d u c e d s t e p w i s e t o z e r o , r e s u l t i n g i n

i n t r a c e l l u l a r H d e l i v e r y b e c a u s e N H 3

l e a v e s t h e c e l l a n d N H

d i s s o c i a t e s . T h e d e p e n d e n c e o f o n c y t o s o l i c p H i n o u r c e l l s i s

g i v e n b y = 2 1 5 2 7 p H . I n i t i a l p r o t o n e f f l u x w a s c a l c u l a t e d

b y m u l t i p l y i n g w i t h t h e i n i t i a l c h a n g e ( 6 0 s ) i n c y t o s o l i c p H .

C e l l v o l u m e w a s m o n i t o r e d w i t h a n i n v e r t e d 3 5 Z e i s s m i c r o s c o p e

( 6 3 0 m a g n i f i c a t i o n ) a n d t h e J A V A v i d e o - i m a g i n g s o f t w a r e

( J a n d e l ) a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( K e r s t i n g e t a l . 1 9 9 1 ; G e k l e e t a l .

1 9 9 4 a ) . A s d e s c r i b e d b y K e r s t i n g e t a l . ( 1 9 9 1 ) , c h a n g e s i n c e l l

d i a m e t e r c a n b e u s e d t o c a l c u l a t e c h a n g e s i n c e l l v o l u m e u s i n g t h e

e q u a t i o n f o r a r o t a t i n g e l l i p s o i d . I n o r d e r t o e s t i m a t e c h a n g e s i n c e l l

v o l u m e a f t e r a l d o s t e r o n e a p p l i c a t i o n , w e d e t e r m i n e d t w o

p e r p e n d i c u l a r d i a m e t e r s f o r e a c h c e l l a t t h e d i f f e r e n t t i m e s o f t h e

m e a s u r e m e n t a n d r e l a t e d t h e m t o t h e d i a m e t e r a t t i m e = 0 m i n

( = 1 0 0 % ) . T o m o n i t o r t h e v o l u m e c e l l s h a d t o b e u s e d 4 6 h a f t e r

M . G e k l e , S . S i l b e r n a g l a n d S . W

u n s c h

J . P h y s i o l . 5 1 1 . 1

2 5 6

F i g u r e 1 . S B F I c a l i b r a t i o n

A , o r i g i n a l t r a c i n g o f a c a l i b r a t i o n p r o c e d u r e , a s d e s c r i b e d i n

M e t h o d s . C y t o s o l i c s o d i u m w a s c l a m p e d t o d i f f e r e n t

c o n c e n t r a t i o n s w i t h n y s t a t i n ( 1 0 m o l l ) a n d t h e

f l u o r e s c e n c e r a t i o ( 3 3 4 n m 3 8 0 n m ) d e t e r m i n e d . B , m e a n

v a l u e s f r o m 2 5 c a l i b r a t i o n p r o c e d u r e s . C u r v e f i t t i n g y i e l d e d

t h e d e p i c t e d l o g a r i t h m i c r e g r e s s i o n c u r v e , t h a t c a n b e

r e a r r a n g e d t o d e t e r m i n e t h e s o d i u m c o n c e n t r a t i o n f r o m a n y

g i v e n r a t i o v a l u e s .



3/9

s e e d i n g , b e c a u s e d e t e r m i n a t i o n o f t h e h o r i z o n t a l d i a m e t e r s c o u l d

b e b e s t p e r f o r m e d i n t h e s u b c o n f l u e n t s t a t e . T w o t o t h r e e c e l l s w e r e

e v a l u a t e d p e r c o v e r s l i p . F u r t h e r m o r e , w e c o m p a r e d t h e v a l u e s

o b t a i n e d b y t h e v i d e o - i m a g i n g m e t h o d w i t h t h o s e d e r i v e d f r o m

c h a n g e s i n f l u o r e s c e n t i n t e n s i t y ( R a a t e t a l . 1 9 9 6 ) .

M a t e r i a l s

A l d o s t e r o n e , a l d o s t e r o n e - 1 8 , 2 1 - d i a c e t a t e , s t a u r o s p o r i n e , Z n C l ,

a c t i n o m y c i n D , c y c l o h e x i m i d e , c a l p h o s t i n C , n y s t a t i n , p e r t u s s i s

t o x i n ( P T X ) , a l d o s t e r o n e - 1 8 , 2 1 - d i a c e t a t e b o v i n e s e r u m a l b u m i n

( B S A ) c o n j u g a t e a n d n i g e r i c i n w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a .

S B F I A M a n d B C E C F A M w e r e o b t a i n e d f r o m M o l e c u l a r P r o b e s .

E I P A ( e t h y l - i s o p r o p a n o l a m i l o r i d e ) w a s k i n d l y p r o v i d e d b y

H . J . L a n g ( H o e c h s t , F r a n k f u r t , G e r m a n y ) . A l l o t h e r a p p l i e d

c h e m i c a l s w e r e o f a n a l y t i c a l g r a d e a n d o b t a i n e d f r o m M e r c k .

R i n g e r s o l u t i o n w a s c o m p o s e d o f ( m m o l l ) : N a C l , 1 4 1 0 ; K C l , 4 0 ;

C a C l , 1 0 ; M g C l , 1 0 ; H e p e s , 1 0 ; a n d g l u c o s e , 5 ( p H 7 4 a t 3 7 C ) .

S t a t i s t i c s

T h e d a t a a r e p r e s e n t e d a s m e a n v a l u e s s . e . m . n g i v e s t h e n u m b e r

o f c e l l s i n v e s t i g a t e d . B e t w e e n f o u r a n d e i g h t c e l l s w e r e i n v e s t i g a t e d

p e r c o v e r s l i p . S i g n i f i c a n c e o f d i f f e r e n c e w a s t e s t e d b y S t u d e n t s

p a i r e d o r u n p a i r e d t t e s t a s a p p l i c a b l e . D i f f e r e n c e s w e r e c o n s i d e r e d

s i g n i f i c a n t i f P < 0 0 5 .

R E S U L T S

A l d o s t e r o n e i n d u c e s a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t n o n -

g e n o m i c i n c r e a s e i n t h e c y t o s o l i c s o d i u m

c o n c e n t r a t i o n

F i g u r e 2 s h o w s t h e r a p i d e f f e c t o f 1 0 m o l l a l d o s t e r o n e

o n t h e c y t o s o l i c s o d i u m c o n c e n t r a t i o n . U n d e r c o n t r o l

c o n d i t i o n s t h e s o d i u m c o n c e n t r a t i o n w a s 9 1 m m o l l

( n = 1 5 0 ) , a v a l u e s i m i l a r t o t h e s o d i u m c o n c e n t r a t i o n i n

w i l d - t y p e M D C K c e l l s d e t e r m i n e d w i t h i o n - s e n s i t i v e

m i c r o e l e c t r o d e s ( W o j n o w s k i & O b e r l e i t h n e r , 1 9 9 1 ) . A f t e r

a p p l i c a t i o n o f 1 0

8

m o l l a l d o s t e r o n e t h e s o d i u m

c o n c e n t r a t i o n s t a r t e d t o r i s e w i t h i n 1 2 m i n ( F i g . 2 A ) a n d

r e a c h e d p l a t e a u v a l u e s o f a p p r o x i m a t e l y 4 0 m m o l l

( F i g . 2 B ) . A t t h e s a m e t i m e a l d o s t e r o n e i n d u c e d a c y t o s o l i c

a l k a l i n i z a t i o n b y 0 1 5 0 0 5 p H u n i t s ( n = 3 0 ) , a s a l r e a d y

r e p o r t e d b e f o r e ( G e k l e e t a l . 1 9 9 6 ) . T h e i n i t i a l r a t e o f

s o d i u m e n t r y , J N a , w a s 2 0 5 m m o l l m i n ( n = 1 5 0 ) .

B y c o n t r a s t , t h e i n i t i a l r a t e o f p r o t o n e f f l u x , J

H , w a s o n l y

1 5 0 3 m m o l l m i n ( n = 3 0 ) . I n t h e p r e s e n c e o f

1 0 m o l l E I P A , a n i n h i b i t o r o f N a H e x c h a n g e , t h e

e f f e c t o f a l d o s t e r o n e o n c y t o s o l i c s o d i u m w a s a l m o s t

c o m p l e t e l y a b o l i s h e d ( F i g s 2 A a n d 6 ) . T h e e f f e c t o f

a l d o s t e r o n e o n c y t o s o l i c s o d i u m w a s a t l e a s t p a r t i a l l y

r e v e r s i b l e . T e n m i n u t e s a f t e r r e m o v a l o f a l d o s t e r o n e t h e

c y t o s o l i c s o d i u m c o n c e n t r a t i o n d r o p p e d s i g n i f i c a n t l y t o

2 5 5 m m o l l ( n = 4 0 , s e e a l s o F i g . 7 ) .

F u r t h e r m o r e , t h e e f f e c t o f a l d o s t e r o n e o n c y t o s o l i c s o d i u m

w a s c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t , a s s h o w n i n F i g . 3 .

C o n c e n t r a t i o n s a s l o w a s 1 0 m o l l a l d o s t e r o n e i n d u c e d a

s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n c y t o s o l i c s o d i u m . T h e c o n c e n t r a t i o n

o f a l d o s t e r o n e t h a t i n d u c e d a h a l f - m a x i m a l i n c r e a s e i n

s o d i u m w a s 7 1 0 m o l l , a v a l u e w i t h i n t h e p h y s i o l o g i c a l

r a n g e o f a l d o s t e r o n e . A c t i n o m y c i n D ( 1 0 m o l l ; a n

i n h i b i t o r o f t r a n s c r i p t i o n ) a s w e l l a s 1 0 m o l l c y c l o -

h e x i m i d e ( 2 0 m i n p r e i n c u b a t i o n ; a n i n h i b i t o r o f t r a n s l a t i o n )

d i d n o t a f f e c t t h e a l d o s t e r o n e - i n d u c e d r i s e i n c y t o s o l i c

s o d i u m s i g n i f i c a n t l y ( N a = 2 9 8 m m o l l a n d 3 4

7 m m o l l , r e s p e c t i v e l y ; n = 3 0 f o r b o t h ) .

E v i d e n c e f o r a n a c t i o n o f a l d o s t e r o n e a t t h e p l a s m a

m e m b r a n e

I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r a l d o s t e r o n e h a s t o c r o s s t h e

c e l l m e m b r a n e i n o r d e r t o e x e r t i t s a c t i o n o n c y t o s o l i c

s o d i u m , w e c o m p a r e d t h e e f f e c t o f a m e m b r a n e - i m p e r m e a b l e

a l d o s t e r o n e B S A c o n j u g a t e ( 7 3 k D a ) w i t h t h e e f f e c t o f

A l d o s t e r o n e r a i s e s c y t o s o l i c s o d i u m

J . P h y s i o l . 5 1 1 . 1

2 5 7

F i g u r e 2 . A l d o s t e r o n e - i n d u c e d s o d i u m i n c r e a s e

A , r e p r e s e n t a t i v e t r a c i n g o f t h e e f f e c t o f 1 0 m o l l

a l d o s t e r o n e o n t h e c y t o s o l i c s o d i u m c o n c e n t r a t i o n . I n t h e

p r e s e n c e o f t h e N a H e x c h a n g e i n h i b i t o r E I P A

( 1 0 m o l l ) o n l y a s m a l l c h a n g e i n t h e c y t o s o l i c s o d i u m

c o n c e n t r a t i o n c a n b e o b s e r v e d . B , b a r g r a p h o f t h e m e a n

c y t o s o l i c s o d i u m c o n c e n t r a t i o n s u n d e r c o n t r o l c o n d i t i o n s a n d

a f t e r r e a c h i n g a n e w s t e a d y s t a t e d u r i n g a l d o s t e r o n e

( 1 0 m o l l ) a p p l i c a t i o n . * P < 0 0 5 v e r s u s c o n t r o l . n = 1 5 0 .



4/9

f r e e a l d o s t e r o n e ( i n t h i s c a s e w e u s e d a l d o s t e r o n e - 1 8 , 2 1 -

d i a c e t a t e b e c a u s e t h e c o n j u g a t e a l s o c o n t a i n e d a l d o s t e r o n e -

1 8 , 2 1 - d i a c e t a t e ) . A s s h o w n i n F i g . 4 , t h e m e m b r a n e -

i m p e r m e a b l e c o n j u g a t e e x e r t e d v i r t u a l l y t h e s a m e e f f e c t

( N a = 2 5 7 m m o l l ; n = 2 8 ) c o m p a r e d w i t h f r e e

a l d o s t e r o n e . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t a l d o s t e r o n e a c t s a t t h e

o u t e r s i d e o f t h e p l a s m a m e m b r a n e . I n o r d e r t o t e s t t h e

p o s s i b i l i t y t h a t t h e e f f e c t o f t h e c o n j u g a t e w a s i n p a r t d u e t o

u n c o u p l e d a l d o s t e r o n e , w e r e p e a t e d t h e e x p e r i m e n t s a f t e r

d i a l y s i s o f t h e c o n j u g a t e . A l d o s t e r o n e B S A w a s d i a l y s e d

u s i n g m i c r o c o n c e n t r a t o r s ( m e m b r a n e c u t - o f f , 1 0 k D a ;

A m i c o n I n c . , B e v e r l y , M A , U S A ) i n a m a n n e r t h a t r e d u c e d

a n y c o m p o u n d w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t < 1 0 k D a

a p p r o x i m a t e l y 2 5 0 0 - f o l d . T h u s , i f 1 0 % o f t h e a l d o s t e r o n e

h a d b e e n u n c o u p l e d , t h e c o n c e n t r a t i o n o f u n c o u p l e d

h o r m o n e a f t e r d i a l y s i s w o u l d b e l e s s t h a n 1 0

1 2

m o l l a n d

t h e o b s e r v e d e f f e c t , i f m e d i a t e d b y u n c o u p l e d a l d o s t e r o n e ,

s h o u l d b e s u b s t a n t i a l l y s m a l l e r . H o w e v e r , u s i n g t h e d i a l y s e d

c o n j u g a t e w e o b s e r v e d v i r t u a l l y t h e s a m e e f f e c t ( N a =

3 2 9 m m o l l ; n = 2 5 ) c o m p a r e d w i t h t h e c o n j u g a t e

p r i o r t o d i a l y s i s .

T h e e f f e c t o f a l d o s t e r o n e i s d e p e n d e n t o n e x t r a c e l l u l a r

c a l c i u m

O m i s s i o n o f e x t r a c e l l u l a r C a p r e v e n t e d t h e a l d o s t e r o n e -

i n d u c e d i n c r e a s e i n c y t o s o l i c s o d i u m . I n t h e a b s e n c e o f

e x t r a c e l l u l a r C a t h e c h a n g e o f c y t o s o l i c s o d i u m

c o n c e n t r a t i o n i n d u c e d b y 1 0 m o l l a l d o s t e r o n e w a s

1 5 1 m m o l l ( n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m z e r o ;

n = 2 5 ) . R e c e n t l y , w e h a v e s h o w n t h a t i n t h e a b s e n c e o f

e x t r a c e l l u l a r C a a l d o s t e r o n e d o e s n o t a f f e c t t h e c y t o s o l i c

C a c o n c e n t r a t i o n i n o u r c e l l s , w h e r e a s i t i n d u c e s a n

i n c r e a s e d i n f l u x o f C a u n d e r c o n t r o l c o n d i t i o n s ( G e k l e e t

a l . 1 9 9 6 ) . T h u s , t h e d a t a p r e s e n t e d h e r e s h o w t h a t

a l d o s t e r o n e i n c r e a s e s c y t o s o l i c s o d i u m v i a a C a - d e p e n d e n t

a c t i v a t i o n o f N a H e x c h a n g e .

I n h i b i t i o n o f P K C a n d G - p r o t e i n s r e d u c e s t h e e f f e c t

o f a l d o s t e r o n e

I n h i b i t i o n o f P K C b y e i t h e r 1 0 m o l l s t a u r o s p o r i n e o r

1 0 m o l l c a l p h o s t i n C r e d u c e d t h e a l d o s t e r o n e - i n d u c e d

s o d i u m i n c r e a s e s i g n i f i c a n t l y . I n t h e p r e s e n c e o f

s t a u r o s p o r i n e t h e a l d o s t e r o n e - i n d u c e d s o d i u m i n c r e a s e w a s

8 3 m m o l l ( n = 2 2 ) a n d i n t h e p r e s e n c e o f c a l p h o s t i n C

i t w a s 7 2 m m o l l ( n = 4 1 ) . S i n c e P K C i s i n v o l v e d i n t h e

a l d o s t e r o n e - i n d u c e d a c i d i f i c a t i o n u n d e r N a - f r e e c o n d i t i o n s

( G e k l e e t a l . 1 9 9 7 b ) , t h e s e r e s u l t s s u p p o r t t h e c r o s s - t a l k

b e t w e e n N a H e x c h a n g e a n d p r o t o n e n t r y d u r i n g t h e

n o n - g e n o m i c a c t i o n o f a l d o s t e r o n e . P r e i n c u b a t i o n o f t h e

c e l l s w i t h 0 5 m g l P T X f o r 5 h r e d u c e d t h e e f f e c t o f

a l d o s t e r o n e s i g n i f i c a n t l y . I n c e l l s p r e i n c u b a t e d w i t h P T X ,

s o d i u m i n c r e a s e d b y 1 6 5 m m o l l ( n = 4 0 ) , w h e r e a s t h e

i n c r e a s e i n t h e r e s p e c t i v e c o n t r o l g r o u p w a s 3 5 5 m m o l l

( n = 4 0 ) . T h u s , t h e e f f e c t o f a l d o s t e r o n e o n c y t o s o l i c s o d i u m

i n v o l v e s t h e a c t i v a t i o n o f h e t e r o t r i m e r i c G - p r o t e i n s .


u n s c h

J . P h y s i o l . 5 1 1 . 1

2 5 8

F i g u r e 3 . C o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c e o f t h e a l d o s t e r o n e e f f e c t o n

c y t o s o l i c s o d i u m

T h e h a l f - m a x i m u m e f f e c t o c c u r s a t 0 0 7 n m o l l ( E C ) , i . e . i n t h e

p h y s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n r a n g e . n = 4 0 1 5 0 .

F i g u r e 4 . E f f e c t o f a l d o s t e r o n e B S A c o n j u g a t e

T h e m e m b r a n e - i m p e r m e a b l e a l d o s t e r o n e B S A c o n j u g a t e

e x e r t s a s i m i l a r e f f e c t c o m p a r e d w i t h f r e e a l d o s t e r o n e o n

c y t o s o l i c N a . T h e c o n c e n t r a t i o n a p p l i e d w a s 1 0 m o l l

f o r t h e c o n j u g a t e a n d f o r f r e e a l d o s t e r o n e . P r i o r t o t h e

a d d i t i o n o f t h e c o n j u g a t e , t h e c e l l s w e r e s u p e r f u s e d w i t h

R i n g e r s o l u t i o n c o n t a i n i n g 1 0 m o l l B S A . T o t a l

n u m b e r o f c e l l s i n v e s t i g a t e d = 2 8 .



5/9

Z i n c b u t n o t o u a b a i n i n h i b i t s t h e e f f e c t o f a l d o s t e r o n e

I n t h e p r e s e n c e o f t h e c l a s s i c a l N a K - A T P a s e i n h i b i t o r

o u a b a i n ( 1 0 m o l l ) , a l d o s t e r o n e s t i l l i n d u c e d a n i n c r e a s e

i n c y t o s o l i c s o d i u m , a s s h o w n i n F i g s 5 A a n d 6 A . O u a b a i n

( 1 0 m o l l ) i t s e l f l e d t o a n i n c r e a s e i n s o d i u m t o

8 5 7 m m o l l ( n

= 4 5 ) . T h u s , t h e a c t i o n o f a l d o s t e r o n e i s

n o t a b o l i s h e d b y a n i n c r e a s e i n c y t o s o l i c s o d i u m d u e t o

N a K - A T P a s e i n h i b i t i o n . T h e d a t a p r e s e n t e d h e r e s h o w

t h a t a l d o s t e r o n e i n c r e a s e s c y t o s o l i c s o d i u m v i a a c t i v a t i o n o f

N a H e x c h a n g e .

P r e v i o u s l y , w e s h o w e d t h a t Z n r e d u c e s t h e a l d o s t e r o n e -

i n d u c e d a c i d i f i c a t i o n , w h i c h o c c u r s i n t h e a b s e n c e o f

e x t r a c e l l u l a r N a , s i g n i f i c a n t l y ( G e k l e e t a l . 1 9 9 7 b ) . I n t h e

p r e s e n t s t u d y w e s h o w t h a t a l d o s t e r o n e h a s a s i g n i f i c a n t l y

s m a l l e r e f f e c t o n c y t o s o l i c N a i n t h e p r e s e n c e o f Z n

( F i g s 5 B , 6 A a n d B ) . Z n i s r e p o r t e d t o e x e r t t w o d i f f e r e n t

a c t i o n s i n t h e l o w m i c r o m o l a r r a n g e : ( i ) i t b l o c k s p l a s m a

m e m b r a n e p r o t o n c o n d u c t a n c e ( L u k a c s e t a l . 1 9 9 3 ) a n d ( i i ) i t

i s a n i n h i b i t o r o f t h e N a K - A T P a s e ( S e g e l e t a l . 1 9 8 1 ) . I t s

i n h i b i t o r y a c t i o n o n t h e N a K - A T P a s e i s s h o w n b y t h e

r i s e i n c y t o s o l i c s o d i u m a f t e r Z n a p p l i c a t i o n ( F i g . 5 B ) .

Z n ( 1 0 m o l l ) l e d t o a n i n c r e a s e i n s o d i u m t o

6 1 6 m m o l l ( n = 6 6 ) . I n t h e p r e s e n c e o f 1 0 m o l l

o u a b a i n , Z n a p p l i c a t i o n i n d u c e d o n l y m i n o r c h a n g e s i n

c y t o s o l i c s o d i u m ( + 7 3 m m o l l ; n = 6 3 ) . T h e s e d a t a a r e

i n g o o d a g r e e m e n t w i t h i t s i n h i b i t o r y a c t i o n o n t h e

N a K - A T P a s e ( S e g e l e t a l . 1 9 8 1 ) . I n o r d e r t o u n m a s k t h e

p o s s i b l e i m p o r t a n c e o f t h e a l d o s t e r o n e - i n d u c e d a c i d i f i c a t i o n

( G e k l e e t a l . 1 9 9 7 b ) f o r t h e o b s e r v e d c h a n g e s i n c y t o s o l i c

N a , w e c o m p a r e d t h e e f f e c t o f a l d o s t e r o n e i n t h e p r e s e n c e

o f Z n w i t h t h e e f f e c t i n t h e p r e s e n c e o f o u a b a i n . A s s h o w n

i n F i g . 6 A , t h e a l d o s t e r o n e - i n d u c e d i n c r e a s e i n c y t o s o l i c

s o d i u m i n t h e p r e s e n c e o f o u a b a i n w a s 5 - f o l d h i g h e r

c o m p a r e d w i t h t h e e f f e c t i n t h e p r e s e n c e o f Z n . B e c a u s e

t h e r e a r e r e p o r t s t h a t Z n m i g h t i n t e r a c t w i t h C l a n d C a

c h a n n e l s ( B u s s e l b e r g , 1 9 9 5 ; A r i s p e e t a l . 1 9 9 6 ; K

u r z e t a l .

1 9 9 7 ) , a l b e i t w i t h l o w e r a f f i n i t y ( h i g h m i c r o m o l a r r a n g e ) , w e

d e t e r m i n e d t h e h a l f - i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n ( I C 5 0

) o f Z n

o n a l d o s t e r o n e - i n d u c e d s o d i u m i n c r e a s e . T h e I C 5 0

o f Z n

f o r t h e a l d o s t e r o n e - i n d u c e d r i s e i n c y t o p l a s m i c s o d i u m w a s

3 3 1 0 m o l l , a s s h o w n i n F i g . 6 B . T h i s v a l u e i s s i m i l a r

t o t h e i n h i b i t i o n c o n s t a n t f o r p r o t o n c u r r e n t s i n h u m a n

e o s i n o p h i l s ( S c h r e n z e l e t a l . 1 9 9 6 ) , b u t a b o u t 1 0 0 - f o l d l o w e r

c o m p a r e d w i t h t h e I C 5 0

v a l u e s f o r Z n - i n d u c e d C l o r C a

c h a n n e l b l o c k a d e ( B u s s e l b e r g , 1 9 9 5 ; A r i s p e e t a l . 1 9 9 6 ;

K

u r z e t a l . 1 9 9 7 ) . T h e s e d a t a r u l e o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t

t h e e f f e c t o f Z n w a s d u e t o t h e i n h i b i t i o n o f t h e N a K -

A T P a s e , C l o r C a c h a n n e l s .

A l d o s t e r o n e i n d u c e s a c e l l v o l u m e i n c r e a s e

I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e i n c r e a s e i n c y t o s o l i c

s o d i u m i s a c c o m p a n i e d b y c h a n g e s i n c e l l v o l u m e , w e

e s t i m a t e d r e l a t i v e c h a n g e s i n c e l l v o l u m e a s d e s c r i b e d i n

M e t h o d s . M e a n c e l l d i a m e t e r u n d e r c o n t r o l c o n d i t i o n s w a s

2 1 1 0 1 1 0 m ( n = 8 6 ) . A s s h o w n i n F i g . 7 , t h e

a p p l i c a t i o n o f 1 0 m o l l a l d o s t e r o n e i n d u c e d a s i g n i f i c a n t

i n c r e a s e i n c e l l v o l u m e w i t h a s i m i l a r t i m e c o u r s e c o m p a r e d

w i t h t h e c h a n g e s i n c y t o s o l i c s o d i u m .

A s i m i l a r a l d o s t e r o n e - i n d u c e d i n c r e a s e i n c e l l v o l u m e c a n

a l s o b e d e r i v e d f r o m t h e c h a n g e i n s o d i u m - i n d e p e n d e n t


J . P h y s i o l . 5 1 1 . 1

2 5 9

F i g u r e 5 . E f f e c t o f o u a b a i n a n d Z n o n t h e a c t i o n o f

a l d o s t e r o n e

A ,r e p r e s e n t a t i v e t r a c i n g o f t h e e f f e c t o f 1 0 m o l l a l d o s t e r o n e

o n t h e c y t o s o l i c s o d i u m c o n c e n t r a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f

1 0 m o l l o u a b a i n . T o t a l n u m b e r o f c e l l s i n v e s t i g a t e d = 5 0 .

B , r e p r e s e n t a t i v e t r a c i n g o f t h e e f f e c t o f 1 0 m o l l a l d o s t e r o n e

o n t h e c y t o s o l i c s o d i u m c o n c e n t r a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f

1 0 m o l l Z n . T o t a l n u m b e r o f c e l l s i n v e s t i g a t e d = 5 0 . T h e

e f f e c t o f a l d o s t e r o n e i n t h e p r e s e n c e o f Z n w a s s i g n i f i c a n t l y

s m a l l e r c o m p a r e d w i t h t h e e f f e c t i n t h e p r e s e n c e o f o u a b a i n ( s e e

F i g . 6 ) .



6/9

f l u o r e s c e n c e o f S B F I a t a n e x c i t a t i o n w a v e l e n g t h o f 3 8 8 n m .

F l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y 1 m i n a f t e r a d d i t i o n o f a l d o s t e r o n e

a m o u n t e d t o 8 9 2 % a n d a f t e r 3 m i n t o 8 3 3 % o f t h e

v a l u e j u s t b e f o r e t h e a d d i t i o n ( n = 2 0 ) . T h i s r e d u c t i o n i n

f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y c a n b e i n t e r p r e t e d a s a d e c r e a s e i n

d y e c o n c e n t r a t i o n d u e t o a n i n c r e a s e i n c e l l v o l u m e a n d

c o r r e s p o n d s t o t h e c h a n g e i n c e l l d i a m e t e r , a s s u m i n g t h e

g e o m e t r y o f a r o t a t i n g e l l i p s o i d ( K e r s t i n g e t a l . 1 9 9 1 ; R a a t

e t a l . 1 9 9 6 ) . A n i n c r e a s e i n d i a m e t e r o f 7 % c o r r e s p o n d s t o

a n i n c r e a s e i n v o l u m e o f 2 0 % . T h u s , t h e r e d u c t i o n i n

f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y b y 1 7 % i s i n g o o d a g r e e m e n t w i t h

t h e c h a n g e s i n c e l l d i a m e t e r .


u n s c h

J . P h y s i o l . 5 1 1 . 1

2 6 0

F i g u r e 6 . I n h i b i t i o n o f t h e a c t i o n o f a l d o s t e r o n e

A , b a r g r a p h o f t h e m e a n a l d o s t e r o n e - i n d u c e d c h a n g e s i n c y t o s o l i c

s o d i u m u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e

s u b s t a n c e s w e r e a s f o l l o w s : a l d o s t e r o n e , 1 0 m o l l ; E I P A ,

1 0 m o l l ; Z n , 1 0 m o l l ; o u a b a i n , 1 0 m o l l . * P < 0 0 5

v e r s u s c o n t r o l . T h e n u m b e r s i n p a r e n t h e s e s g i v e t h e n u m b e r o f

c e l l s i n v e s t i g a t e d . B ,

d o s e r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p o f t h e i n h i b i t o r y

a c t i o n o f Z n . H a l f - m a x i m u m i n h i b i t i o n o c c u r r e d a t a

c o n c e n t r a t i o n o f 3 3 1 0 m o l l . n = 2 5 5 0 .

F i g u r e 7 . R e v e r s i b l e e f f e c t o f 1 0 m o l l a l d o s t e r o n e o n c e l l v o l u m e a n d c y t o s o l i c s o d i u m

A s d e s c r i b e d i n M e t h o d s , t h e c e l l d i a m e t e r w a s d e t e r m i n e d a s a n i n d i r e c t m e a s u r e o f c e l l v o l u m e . C e l l

d i a m e t e r s w e r e n o r m a l i z e d a n d t h e d i a m e t e r a t t i m e = 0 m i n ( b e f o r e a d d i t i o n o f a l d o s t e r o n e ) r e p r e s e n t s

1 0 0 % . T h e a p p l i c a t i o n o f a l d o s t e r o n e i n d u c e d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n c e l l d i a m e t e r ( 0 , n = 2 0 ) . T h e c e l l

d i a m e t e r c h a n g e d o v e r a s i m i l a r t i m e c o u r s e c o m p a r e d w i t h t h e c y t o s o l i c s o d i u m c o n c e n t r a t i o n (

, n = 5 0 ) .

T h e e f f e c t o n c e l l d i a m e t e r w a s c o m p l e t e l y r e v e r s i b l e , a n d t h e e f f e c t o n c y t o s o l i c s o d i u m w a s p a r t i a l l y

r e v e r s i b l e . * P < 0 0 5 v e r s u s 1 0 0 % .



7/9

I n t h e p r e s e n c e o f 1 0 m o l l E I P A o r 1 0 m o l l Z n n o

s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n c e l l v o l u m e c o u l d b e o b s e r v e d . A f t e r

t h e a d d i t i o n o f a l d o s t e r o n e , t h e c e l l d i a m e t e r w a s 1 0 1 1 %

c o m p a r e d w i t h t h e d i a m e t e r i n t h e p r e s e n c e o f E I P A a n d

1 0 0 1 % ( n = 1 4 ) c o m p a r e d w i t h t h e d i a m e t e r i n t h e

p r e s e n c e o f Z n , p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f a l d o s t e r o n e

( n= 3 0 ) . I n t h e p r e s e n c e o f o u a b a i n ( 1 0 m o l l ) t h e r e w a s

s t i l l a d e t e c t a b l e a l d o s t e r o n e - i n d u c e d i n c r e a s e i n c e l l v o l u m e

( 1 0 4 1 % , n = 1 2 ; P < 0 0 5 v e r s u s 1 0 0 % ) .

D I S C U S S I O N

S t a r t i n g f r o m t h e d a t a o f p r e v i o u s s t u d i e s w e h y p o t h e s i z e d

t h a t t h e r e m a y b e a f u n c t i o n a l l i n k b e t w e e n t h e a l d o s t e r o n e -

i n d u c e d a c t i v a t i o n o f N a H e x c h a n g e a n d t h e a l d o s t e r o n e -

s e n s i t i v e a c i d i f i c a t i o n m e c h a n i s m ( L u k a c s e t a l . 1 9 9 3 ) . I n

o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h i s h y p o t h e s i s f u r t h e r w e d e t e r m i n e d

t h e n o n - g e n o m i c e f f e c t s o f a l d o s t e r o n e a s w e l l a s t h e

p o s s i b l e u n d e r l y i n g m e c h a n i s m s o n c y t o s o l i c s o d i u m

c o n c e n t r a t i o n i n M D C K - C 1 1 c e l l s . I n a d d i t i o n w e t r i e d t o

d e t e r m i n e w h e t h e r s o d i u m i n f l u x i s a c c o m p a n i e d b y v o l u m e

c h a n g e s i n e p i t h e l i a l c e l l s .

O u r d a t a c l e a r l y s h o w t h a t a l d o s t e r o n e l e a d s t o a n o n -

g e n o m i c a n d p a r t i a l l y r e v e r s i b l e i n c r e a s e i n c y t o s o l i c s o d i u m

c o n c e n t r a t i o n . T h i s e f f e c t o c c u r s i n t h e p h y s i o l o g i c a l

c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f a l d o s t e r o n e ( E C = 0 0 7 n m o l l ;

W e h l i n g , 1 9 9 7 ) , i n d i c a t i n g i t s p h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e .

T h e N a H e x c h a n g e i n h i b i t o r E I P A a b o l i s h e d t h e

a l d o s t e r o n e - i n d u c e d i n c r e a s e i n c y t o s o l i c s o d i u m a l m o s t

c o m p l e t e l y . T h u s , w e c a n c o n c l u d e t h a t a l d o s t e r o n e i n d u c e d

t h e r i s e o f c y t o s o l i c s o d i u m v i a a n a c t i v a t i o n o f N a H

e x c h a n g e ( N o e l & P o u y s s

e g u r , 1 9 9 5 ) . F u r t h e r m o r e , o u r d a t a

s t r o n g l y i n d i c a t e t h a t a l d o s t e r o n e a c t s a t t h e p l a s m a

m e m b r a n e . T h e m e m b r a n e - i m p e r m e a b l e a l d o s t e r o n e B S A

c o n j u g a t e e x e r t e d v i r t u a l l y t h e s a m e e f f e c t s c o m p a r e d w i t h

f r e e a l d o s t e r o n e . B e c a u s e i t i s h i g h l y u n l i k e l y t h a t t h e

a l d o s t e r o n e B S A c o n j u g a t e i s t a k e n u p i n t h i s s h o r t p e r i o d

o f t i m e t o a s i m i l a r e x t e n t c o m p a r e d w i t h d i f f u s i o n o f f r e e

a l d o s t e r o n e , w e c o n c l u d e t h a t a l d o s t e r o n e a c t s a t t h e o u t e r

s i d e o f t h e p l a s m a m e m b r a n e ( i t h a s b e e n s h o w n t h a t t h e

e n d o c y t i c a c t i v i t y o f M D C K c e l l s w i t h r e s p e c t t o B S A i s

v e r y l o w ; G e k l e e t a l . 1 9 9 7 a ) .

W h i l e t h e p r e v i o u s l y r e p o r t e d a l d o s t e r o n e - i n d u c e d c y t o s o l i c

a l k a l i n i z a t i o n ( N a H e x c h a n g e a c t i v a t i o n ) w a s d e p e n d e n t

o n e x t r a c e l l u l a r C a ( G e k l e e t a l . 1 9 9 6 ) , t h e a l d o s t e r o n e -

i n d u c e d c y t o s o l i c a c i d i f i c a t i o n w a s s e n s i t i v e t o t h e i n h i b i t i o n

o f P K C o r h e t e r o t r i m e r i c G - p r o t e i n s a n d t o Z n ( G e k l e e t

a l . 1 9 9 7 b ) . F r o m t h e a l d o s t e r o n e - i n d u c e d c y t o s o l i c a l k a l i n i z -

a t i o n a n d t h e c y t o s o l i c H b u f f e r c a p a c i t y ( s e e M e t h o d s ) w e

e s t i m a t e d t h e i n i t i a l p r o t o n e f f l u x a s 1 5 m m o l l m i n ) .

S i n c e f o r e a c h p r o t o n l e a v i n g t h e c e l l v i a N a H e x c h a n g e

o n e s o d i u m i o n e n t e r s t h e c e l l s , s o d i u m i n f l u x s h o u l d b e i n

t h e s a m e r a n g e . B y c o n t r a s t , t h e r e a l a l d o s t e r o n e - i n d u c e d

s o d i u m i n f l u x w a s m u c h h i g h e r ( 2 0 m m o l l m i n ) . A n


J . P h y s i o l . 5 1 1 . 1

2 6 1

F i g u r e 8 . C e l l m o d e l o f t h e r a p i d , n o n - g e n o m i c , a c t i o n o f a l d o s t e r o n e

A l d o s t e r o n e i n d u c e s a s i m u l t a n e o u s a c t i v a t i o n o f N a H e x c h a n g e a n d a n a c i d i f i c a t i o n m e c h a n i s m

( p o s s i b l y a c o n d u c t i v e p a t h w a y f o r H a c r o s s t h e p l a s m a m e m b r a n e ) ( G e k l e e t a l . 1 9 9 7 b ) . T h e i n t e r a c t i o n o f

a l d o s t e r o n e a t t h e p l a s m a m e m b r a n e i s t r a n s d u c e d b y C a ( G e k l e e t a l . 1 9 9 6 ) a n d P K C , p r o b a b l y v i a a

h e t e r o t r i m e r i c G - p r o t e i n ( G ) , i n t o t h e c e l l . T h e r e b y s u b s t a n t i a l s o d i u m e n t r y , w i t h o u t e x c e s s i v e

a l k a l i n i z a t i o n o f t h e c y t o p l a s m , i s p o s s i b l e . S u b s e q u e n t l y , w a t e r f o l l o w s a l o n g t h e o s m o t i c g r a d i e n t a n d t h e

c e l l s w e l l s .



8/9

e x p l a n a t i o n f o r t h i s a p p a r e n t d i s c r e p a n c y i s t h e s i m u l t a n e o u s

a c t i v a t i o n o f N a H e x c h a n g e a n d a p o t e n t i a l l y a c i d i f y i n g

m e c h a n i s m , a s f o r e x a m p l e p r o t o n i n f l u x ( G e k l e e t a l .

1 9 9 7 b ) . T h e r e b y , l a r g e a m o u n t s o f s o d i u m c o u l d e n t e r t h e

c e l l v i a N a H e x c h a n g e w i t h o u t c a u s i n g d e l e t e r i o u s p H

c h a n g e s . I f o u r h y p o t h e s i s o f a f u n c t i o n a l i n t e r a c t i o n b e t w e e n

N a H e x c h a n g e a n d t h e a l d o s t e r o n e - s e n s i t i v e a c i d i f i c a t i o n

m e c h a n i s m i s t r u e , i n h i b i t i o n o f P K C o r G - p r o t e i n s a s w e l l

a s t h e a d d i t i o n o f Z n s h o u l d r e d u c e t h e r i s e i n c y t o s o l i c

N a s i g n i f i c a n t l y ( G e k l e e t a l . 1 9 9 6 b , 1 9 9 7 b ) . A s s h o w n i n

t h e p r e s e n t s t u d y , t h i s w a s i n d e e d t h e c a s e . T h e r e i s s o m e

e v i d e n c e t h a t t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f Z n m i g h t i n v o l v e

t h e i n h i b i t i o n o f a p l a s m a m e m b r a n e c o n d u c t i v e p a t h w a y , a s

a l r e a d y s h o w n e a r l i e r ( G e k l e e t a l . 1 9 9 7 b ) . T h e I C 5 0

v a l u e

f o r Z n d e t e r m i n e d i n t h e p r e s e n t s t u d y , a s w e l l a s t h e l a c k

o f e f f e c t o f o u a b a i n o n a l d o s t e r o n e - i n d u c e d N a i n c r e a s e

m a k e i t h i g h l y u n l i k e l y t h a t Z n e x e r t e d i t s e f f e c t v i a

i n t e r a c t i o n w i t h C l o r C a c h a n n e l s ( B u s s e l b e r g , 1 9 9 5 ;

A r i s p e e t a l .

1 9 9 6 ; K

u r ze t a l .

1 9 9 7 ) o r t h e N a K - A T P a s e

( S e g e l e t a l . 1 9 8 1 ) . A c o m b i n e d a c t i v a t i o n o f N a H

e x c h a n g e a n d a n a c i d i f i c a t i o n m e c h a n i s m h a s a l s o b e e n

d e s c r i b e d i n p l a t e l e t s ( C a v a l l i n i e t a l . 1 9 9 6 ) a n d m a c r o p h a g e s

( D e m a u r e x e t a l . 1 9 9 5 ) . I n b o t h c a s e s t h e a c i d i f i c a t i o n

m e c h a n i s m w a s d e s c r i b e d a s a p r o t o n c o n d u c t a n c e p a t h w a y .

I n p l a t e l e t s , a r a c h i d o n i c a c i d a c t i v a t e d s i m u l t a n e o u s l y a

p r o t o n c o n d u c t a n c e p a t h w a y a n d t h e N a H e x c h a n g e r

( C a v a l l i n i e t a l . 1 9 9 6 ) . B e c a u s e t h e a c i d i f i c a t i o n m e c h a n i s m

s t i m u l a t e d b y a l d o s t e r o n e a l s o s h o w e d s o m e c h a r a c t e r i s t i c s

o f a p r o t o n c o n d u c t a n c e p a t h w a y ( G e k l e e t a l . 1 9 9 7 b ) , i t i s

c o n c e i v a b l e t h a t a l d o s t e r o n e a c t s i n a s i m i l a r w a y o n M D C K

c e l l s a s d o e s a r a c h i d o n i c a c i d o n p l a t e l e t s . C l c o u l d s e r v e a s

a c o u n t e r i o n f o r H i n f l u x i n M D C K - C 1 1 c e l l s , b e c a u s e

5 0 % o f p l a s m a m e m b r a n e c o n d u c t a n c e i s d u e t o C l

c o n d u c t a n c e ( a u t h o r s u n p u b l i s h e d w h o l e - c e l l p a t c h c l a m p

d a t a ) . O f c o u r s e , t h e f i n a l e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l p r o o f f o r t h e

a c t i v a t i o n o f a p r o t o n c o n d u c t a n c e c a p a b l e o f m e d i a t i n g t h e

a l d o s t e r o n e - i n d u c e d a c i d i f i c a t i o n h a s t o b e p r o v i d e d i n

f u t u r e s t u d i e s .

W e c o n c l u d e t h a t t h e e f f e c t o f a l d o s t e r o n e o n c y t o s o l i c

s o d i u m i n v o l v e s t h e c o m b i n e d s t i m u l a t i o n o f C a i n f l u x a n d

P K C , w h i c h t h e n a c t i v a t e N a H e x c h a n g e a n d t h e

a l d o s t e r o n e - s e n s i t i v e a c i d i f i c a t i o n m e c h a n i s m ( F i g . 8 ) . A t

l e a s t p a r t o f t h i s a c t i v a t i o n o c c u r s v i a h e t e r o t r i m e r i c

G _ p r o t e i n s . T h u s , t h e a c t i o n o f a l d o s t e r o n e a t t h e o u t e r

p l a s m a m e m b r a n e s e e m s t o b e t r a n s d u c e d i n t o t h e c e l l , a t

l e a s t i n p a r t , b y a m e c h a n i s m i n v o l v i n g G - p r o t e i n s .

T h e a l d o s t e r o n e - e v o k e d i n f l u x o f s o d i u m s h o u l d b e

a c c o m p a n i e d b y a n i n c r e a s e i n c e l l v o l u m e i f i t i s n o t

i n s t a n t a n e o u s l y b a l a n c e d b y t h e e f f l u x o f o t h e r i o n s ( L a n g e t

a l . 1 9 9 3 ; L a n g & P a u l m i c h l , 1 9 9 5 ) . O u r v o l u m e e s t i m a t i o n s

s h o w t h a t a l d o s t e r o n e i n d e e d s t i m u l a t e s a n E I P A - a n d

Z n - s e n s i t i v e v o l u m e i n c r e a s e ( F i g . 7 ) . C e l l v o l u m e , b e s i d e s

b e i n g a p a r a m e t e r t h a t c e l l s h a v e t o m a i n t a i n c o n s t a n t

w i t h i n n a r r o w l i m i t s t o s u r v i v e , a f f e c t s d i v e r s e c e l l u l a r

f u n c t i o n s a n d c a n a c t a s a n i n t r a c e l l u l a r m e s s e n g e r ( L a n g e t

a l . 1 9 9 3 ; L a n g & P a u l m i c h l , 1 9 9 5 ) . A l t e r a t i o n s o f c e l l v o l u m e

p l a y a r o l e , f o r e x a m p l e , i n t h e r e g u l a t i o n o f p r o t e i n a n d

g l y c o g e n m e t a b o l i s m , i n t h e r e g u l a t i o n o f t r a n s e p i t h e l i a l

e l e c t r o l y t e t r a n s p o r t ( K e r s t i n g e t a l . 1 9 9 1 ; L a n g e t a l . 1 9 9 3 ;

L a n g & P a u l m i c h l , 1 9 9 5 ) , i n t h e a c c u m u l a t i o n o f o r g a n i c

c o m p o u n d s a s , f o r e x a m p l e , a m i n o a c i d s a n d o s m o l y t e s

( R o y & M a l o , 1 9 9 2 ; L a n g e t a l . 1 9 9 3 ) a n d i n t h e a c t i v a t i o n

o f m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e s ( P o s a s & S a i t o , 1 9 9 7 ) .

T h e c o m b i n e d a c t i v a t i o n o f N a H e x c h a n g e a n d t h e

a c i d i f i c a t i o n m e c h a n i s m b y a l d o s t e r o n e i n c r e a s e s c e l l v o l u m e .

T h i s i n c r e a s e i n v o l u m e p e r s e m a y e l i c i t f u r t h e r n o n -

g e n o m i c a c t i o n s o f a l d o s t e r o n e .

F r o m t h e d a t a o f o u r p r e s e n t s t u d y w e c o n c l u d e t h a t

a l d o s t e r o n e e x e r t s i t s n o n - g e n o m i c e f f e c t s v i a i n t e r a c t i o n a t

t h e o u t e r s i d e o f t h e p l a s m a m e m b r a n e . I t l e a d s t o a r a p i d

a c t i v a t i o n o f N a H e x c h a n g e a n d a n a c i d i f i c a t i o n

m e c h a n i s m ( p o s s i b l y a p r o t o n c o n d u c t i v e p a t h w a y ) i n

p a r a l l e l , t h e r e b y s t i m u l a t i n g m a r k e d s o d i u m e n t r y ( F i g . 8 ) .

A s a c o n s e q u e n c e c e l l v o l u m e i n c r e a s e s a n d m a y s e r v e a s a n

i n t r a c e l l u l a r m e s s e n g e r f o r n o n - g e n o m i c a l d o s t e r o n e a c t i o n .

T h i s m e c h a n i s m d e p e n d s o n a n i n c r e a s e d C a i n f l u x ( G e k l e

e t a l . 1 9 9 6 ) a n d , m o s t p r o b a b l y , o n t h e G - p r o t e i n - m e d i a t e d

s t i m u l a t i o n o f P K C .

A r i s p e , N . , P o l l a r d , H . B . & R o j a s , E . ( 1 9 9 6 ) . Z n i n t e r a c t i o n w i t h

A l z h e i m e r a m y l o i d b e t a p r o t e i n c a l c i u m c h a n n e l s . P r o c e e d i n g s o f t h e

N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U S A 9 3 , 1 7 1 0 1 7 1 5 .

B o r o n , W . F . ( 1 9 9 2 ) . C o n t r o l o f i n t r a c e l l u l a r p H . I n T h e K i d n e y , e d .

S e l d i n , D . W . & G i e b i s c h , G . , p p . 2 1 9 2 6 3 . R a v e n P r e s s , N e w

Y o r k .

B u s s e l b e r g , D . ( 1 9 9 5 ) . C a l c i u m c h a n n e l s a s t a r g e t s i t e s o f h e a v y

m e t a l s . T o x i c o l o g y L e t t e r s 8 2 , 2 5 5 2 6 1 .

C a v a l l i n i , L . , C o a s s i n , M . , B o r e a n , A . & A l e x a n d r e , A . ( 1 9 9 6 ) .

A r a c h i d o n i c a c i d a c t i v a t e s a p r o t o n c o n d u c t a n c e p a t h w a y a n d t h e

N a H e x c h a n g e r i n p l a t e l e t s . B i o c h e m i c a l J o u r n a l 3 1 9 , 5 6 7 5 7 4 .

C h r i s t , M . , E i s e n , C . , A k t a s , J . , T h e i s e n , K . & W e h l i n g , M .

( 1 9 9 3 ) . T h e i n o s i t o l - 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e s y s t e m i s i n v o l v e d i n r a p i d

e f f e c t s o f a l d o s t e r o n e i n h u m a n m o n o n u c l e a r l e u k o c y t e s . J o u r n a l o f

C l i n i c a l E n d o c r i n o l o g y a n d M e t a b o l i s m 7 7

, 1 4 5 2 1 4 5 7 .

C o o p e r , G . J . & H u n t e r , M . ( 1 9 9 4 ) . N a H e x c h a n g e i n f r o g e a r l y

d i s t a l t u b u l e : e f f e c t o f a l d o s t e r o n e o n t h e s e t - p o i n t . J o u r n a l o f

P h y s i o l o g y 4 7 9 , 4 2 3 4 3 2 .

D e m a u r e x , N . , O r l o w s k i , J . , B r i s s e a u , G . , W o o d s i d e , M . &

G r i n s t e i n , S . ( 1 9 9 5 ) . T h e m a m m a l i a n N a H a n t i p o r t e r s N H E - 1 ,

N H E - 2 a n d N H E - 3 a r e e l e c t r o n e u t r a l a n d v o l t a g e i n d e p e n d e n t , b u t

c a n c o u p l e t o a n H c o n d u c t a n c e . J o u r n a l o f G e n e r a l P h y s i o l o g y

1 0 6 , 8 5 1 1 1 .

D o o l a n , C . M . & H a r v e y , B . J . ( 1 9 9 6 ) . M o d u l a t i o n o f c y t o s o l i c

p r o t e i n k i n a s e C a n d c a l c i u m i o n a c t i v i t y b y s t e r o i d h o r m o n e s i n r a t

d i s t a l c o l o n . J o u r n a l o f B i o l o g i c a l C h e m i s t r y 2 7 1

, 8 7 6 3 8 7 6 7 .

D r e h e r , D . & R o c h a t , T . ( 1 9 9 2 ) . H y p e r o x i a i n d u c e s a l k a l i n i z a t i o n

a n d d o m e f o r m a t i o n i n M D C K e p i t h e l i a l c e l l s . A m e r i c a n J o u r n a l o f

P h y s i o l o g y 2 6 2 , C 3 5 8 3 6 4 .

G e k l e , M . , G o l e n h o f e n , N . , O b e r l e i t h n e r , H . & S i l b e r n a g l , S .

( 1 9 9 6 ) . R a p i d a c t i v a t i o n o f N a H - e x c h a n g e b y a l d o s t e r o n e i n

r e n a l e p i t h e l i a l c e l l s r e q u i r e s C a a n d s t i m u l a t i o n o f a p l a s m a

m e m b r a n e p r o t o n c o n d u c t a n c e . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l

A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U S A 9 3 , 1 0 5 0 0 1 0 5 0 4 .


u n s c h

J . P h y s i o l . 5 1 1 . 1

2 6 2



9/9

G e k l e , M . , M i l d e n b e r g e r , S . , F r e u d i n g e r , R . , S c h w e r d t , G . &

S i l b e r n a g l , S . ( 1 9 9 7 a ) . A l b u m i n e n d o c y t o s i s i n O K c e l l s :

D e p e n d e n c e o n a c t i n a n d m i c r o t u b u l e s , r e g u l a t i o n b y p r o t e i n

k i n a s e s . A m e r i c a n J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 2 7 2 , F 6 6 8 6 7 7 .

G e k l e , M . , S i l b e r n a g l , S . & O b e r l e i t h n e r , H . ( 1 9 9 7 b ) . T h e

m i n e r a l o c o r t i c o i d a l d o s t e r o n e a c t i v a t e s a p r o t o n c o n d u c t a n c e i n

c u l t u r e d k i d n e y c e l l s . A m e r i c a n J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 2 7 3 ,

C 1 6 7 3 1 6 7 8 .

G e k l e , M . , V o g t , R . , O b e r l e i t h n e r , H . & S i l b e r n a g l , S . ( 1 9 9 4 a ) .

T h e m y c o t o x i n o c h r a t o x i n A d e r a n g e s p H h o m e o s t a s i s i n

M a d i n D a r b y c a n i n e k i d n e y c e l l s . J o u r n a l o f M e m b r a n e B i o l o g y

1 3 9 , 1 8 3 1 9 0 .

G e k l e , M . , W

u n s c h , S . , O b e r l e i t h n e r , H . & S i l b e r n a g l , S .

( 1 9 9 4 b ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t w o M D C K - c e l l s u b t y p e s a s a m o d e l

s y s t e m t o s t u d y p r i n c i p a l a n d i n t e r c a l a t e d c e l l p r o p e r t i e s . P f l

u g e r s

A r c h i v 4 2 8 , 1 5 7 1 6 2 .

K e r s t i n g , U . , W o j n o w s k i , L . , S t e i g n e r , W . & O b e r l e i t h n e r , H .

( 1 9 9 1 ) . H y p o t o n i c s t r e s s - i n d u c e d r e l e a s e o f K H C O i n f u s e d r e n a l

e p i t h e l o i d ( M D C K ) c e l l s . K i d n e y I n t e r n a t i o n a l 3 9 , 8 9 1 9 0 0 .

K

u r z , L . L . , W a g n e r , S . , G e o r g e , A . L . & R

u d e l , R . ( 1 9 9 7 ) .

P r o b i n g t h e m a j o r s k e l e t a l m u s c l e c h l o r i d e c h a n n e l w i t h Z n a n d

o t h e r s u l f h y d r y l - r e a c t i v e c o m p o u n d s . P f l

u g e r s A r c h i v 4 3 3 ,

3 5 7 3 6 3 .

L a n g , F . & P a u l m i c h l , M . ( 1 9 9 5 ) . P r o p e r t i e s a n d r e g u l a t i o n o f i o n

c h a n n e l s i n M D C K c e l l s . K i d n e y I n t e r n a t i o n a l 4 8 , 1 2 0 0 1 2 0 5 .

L a n g , F . , R i t t e r , M . , V

o l k l , H . & H

a u s s i n g e r , D . ( 1 9 9 3 ) . T h e

b i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f c e l l v o l u m e . R e n a l P h y s i o l o g y a n d

B i o c h e m i s t r y 1 6 , 4 8 6 5 .

L u k a c s , G . L . , K a p u s , A . , N a n d a , A . , R o m a n e k , R . & G r i n s t e i n ,

S . ( 1 9 9 3 ) . P r o t o n c o n d u c t a n c e o f t h e p l a s m a m e m b r a n e : p r o p e r t i e s ,

r e g u l a t i o n , a n d f u n c t i o n a l r o l e . A m e r i c a n J o u r n a l o f P h y s i o l o g y

2 6 5 , C 3 1 4 .

N o e l , J . & P o u y s s i g u r , J . ( 1 9 9 5 ) . H o r m o n a l r e g u l a t i o n , p h a r m a c o l o g y ,

a n d m e m b r a n e s o r t i n g o f v e r t e b r a t e N a H e x c h a n g e r i s o f o r m s .

A m e r i c a n J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 2 6 8 , C 2 8 3 2 9 6 .

O b e r l e i t h n e r , H . , K e r s t i n g , U . , S i l b e r n a g l , S . , S t e i g n e r , W . &

V o g e l , U . ( 1 9 8 9 ) . F u s i o n o f c u l t u r e d d o g k i d n e y ( M D C K ) c e l l s : I I .

R e l a t i o n s h i p b e t w e e n c e l l p H a n d K c o n d u c t a n c e i n r e s p o n s e t o

a l d o s t e r o n e . J o u r n a l o f M e m b r a n e B i o l o g y 1 1 1 , 4 9 5 6 .

O b e r l e i t h n e r , H . , W e i g t , M . , W e s t p h a l e , H . - J . & W a n g , W .

( 1 9 8 7 ) . A l d o s t e r o n e a c t i v a t e s N a H e x c h a n g e a n d r a i s e s

c y t o p l a s m i c p H i n t a r g e t c e l l s o f t h e a m p h i b i a n k i d n e y . P r o c e e d i n g s

o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U S A 8 4 , 1 4 6 4 1 4 6 8 .

P o s a s , F . & S a i t o , H . ( 1 9 9 7 ) . O s m o t i c a c t i v a t i o n o f t h e H O G M A P K

p a t h w a y v i a S t e 1 1 p M A P K K K : S c a f f o l d r o l e o f P b s 2 p M A P K K .

S c i e n c e 2 7 6 , 1 7 0 2 1 7 0 5 .

R a a t , N . J . H . , D e S m e t , P . , V a n D r i e s s c h e , W . , B i n d e l s , R . J . M . &

V a n O s , C . H . ( 1 9 9 6 ) . M e a s u r i n g v o l u m e p e r t u r b a t i o n o f p r o x i m a l

t u b u l a r c e l l s i n p r i m a r y c u l t u r e w i t h t h r e e d i f f e r e n t t e c h n i q u e s .

A m e r i c a n J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 2 7 1 , C 2 3 5 2 4 1 .

R o y , G . & M a l o , C . ( 1 9 9 2 ) . A c t i v a t i o n o f a m i n o a c i d d i f f u s i o n b y a

v o l u m e i n c r e a s e i n c u l t u r e d k i d n e y ( M D C K ) c e l l s . J o u r n a l o f

M e m b r a n e B i o l o g y 1 3 0 , 8 3 9 0 .

S c h l a t t e r , E . , H a x e l m a n s , S . & A n k o r i n a , I . ( 1 9 9 6 ) . C o r r e l a t i o n

b e t w e e n i n t r a c e l l u l a r a c t i v i t i e s o f C a a n d N a i n r a t c o r t i c a l

c o l l e c t i n g d u c t a p o s s i b l e c o u p l i n g m e c h a n i s m b e t w e e n

N a K _ A T P a s e a n d b a s o l a t e r a l K c o n d u c t a n c e . K i d n e y a n d

B l o o d P r e s s u r e R e s e a r c h 1 9 , 2 4 3 1 .

S c h r e n z e l , J . , L e w , D . P . & K r a u s e , K . - H . ( 1 9 9 6 ) . P r o t o n c u r r e n t s

i n h u m a n e o s i n o p h i l s . A m e r i c a n J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 2 7 1 ,

C 1 8 6 1 1 8 7 1 .

S e g e l , G . B . , S i m o n , W . , L i c h t m a n , A . H . & L i c h t m a n , M . A .

( 1 9 8 1 ) . T h e a c t i v a t i o n o f l y m p h o c y t e p l a s m a m e m b r a n e ( N a , K ) -

A T P a s e b y E G T A i s e x p l a i n e d b e t t e r b y z i n c t h a n b y c a l c i u m

c h e l a t i o n . J o u r n a l o f B i o l o g i c a l C h e m i s t r y 2 5 6 , 6 6 2 9 6 6 3 2 .

T h o m a s , J . A . , B u c h s b a u m , R . N . , Z i m n i a k , A . & R a c k e r , E . ( 1 9 7 9 ) .

I n t r a c e l l u l a r p H m e a s u r e m e n t s i n E h r l i c h a s c i t e s t u m o r c e l l s

u t i l i z i n g s p e c t r o s c o p i c p r o b e s g e n e r a t e d i n s i t u . B i o c h e m i s t r y 1 8 ,

2 2 1 0 2 2 1 8 .

U r b a c h , V . , v a n K e r k h o v e , E . , M a g u i r e , D . & H a r v e y , B . J .

( 1 9 9 6 ) . R a p i d a c t i v a t i o n o f K A T P

c h a n n e l s b y a l d o s t e r o n e i n

p r i n c i p a l c e l l s o f f r o g s k i n . J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 4 9 1 , 1 1 1 1 2 0 .

V a l e n t i c h , J . D . ( 1 9 8 1 ) . M o r p h o l o g i c a l s i m i l a r i t i e s b e t w e e n t h e d o g

k i d n e y c e l l l i n e M D C K a n d t h e m a m m a l i a n c o r t i c a l c o l l e c t i n g

t u b u l e . A n n a l s o f t h e N e w Y o r k A c a d e m y o f S c i e n c e s 3 7 2 , 3 8 4 4 0 5 .

V i l e l l a , S . , G u e r r a , L . , H e l m l e - K o l b , C . & M u r e r , H . ( 1 9 9 2 ) .

A l d o s t e r o n e a c t i o n s o n b a s o l a t e r a l N a H e x c h a n g e i n

M a d i n D a r b y c a n i n e k i d n e y c e l l s . P f l

u g e r s A r c h i v 4 2 2 , 9 1 5 .

W e h l i n g , M . ( 1 9 9 7 ) . S p e c i f i c , n o n g e n o m i c a c t i o n s o f s t e r o i d h o m o n e s .

A n n u a l R e v i e w o f P h y s i o l o g y 5 9 , 3 6 5 3 9 3 .

W e h l i n g , M . , C h r i s t , M . & T h e i s e n , K . ( 1 9 9 2 ) . M e m b r a n e r e c e p t o r s

f o r a l d o s t e r o n e : a n o v e l p a t h w a y f o r m i n e r a l o c o r t i c o i d a c t i o n .

A m e r i c a n J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 2 6 3 , E 9 7 4 9 7 9 .

W e i n e r , I . D . & H a m m , L . L . ( 1 9 8 9 ) . U s e o f f l u o r e s c e n t d y e B C E C F

t o m e a s u r e i n t r a c e l l u l a r p H i n c o r t i c a l c o l l e c t i n g t u b u l e . A m e r i c a n

J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 2 5 6 , F 9 5 7 9 6 4 .

W o j n o w s k i , L . & O b e r l e i t h n e r , H . ( 1 9 9 1 ) . H y p e r t o n i c i t y i n f u s e d

M a d i n D a r b y c a n i n e k i d n e y c e l l s : t r a n s i e n t r i s e i n N a H C O

f o l l o w e d b y s u s t a i n e d K C l a c c u m u l a t i o n . P f l

u g e r s A r c h i v 4 1 9 ,

4 3 5 0 .

W

u n s c h , S . , G e k l e , M . , K e r s t i n g , U . , S c h u r i c h t , B . &

O b e r l e i t h n e r , H . ( 1 9 9 5 ) . P h e n o t y p i c a l l y a n d k a r y o t y p i c a l l y

d i s t i n c t M a d i n - D a r b y c a n i n e k i d n e y c e l l c l o n e s r e s p o n d d i f f e r e n t l y

t o a l k a l i n e s t r e s s . J o u r n a l o f C e l l u l a r P h y s i o l o g y 1 6 4 , 1 6 4 1 7 1 .

A c k n o w l e d g e m e n t s

W e t h a n k R u t h F r e u d i n g e r a n d S i g r i d M i l d e n b e r g e r f o r t h e i r

e x c e l l e n t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e .

C o r r e s p o n d i n g a u t h o r

M . G e k l e : P h y s i o l o g i s c h e s I n s t i t u t , U n i v e r s i t

a t W

u r z b u r g ,

R

o n t g e n r i n g 9 , 9 7 0 7 0 W

u r z b u r g , G e r m a n y .

E m a i l : m i c h a e l . g e k l e @ m a i l . u n i - w u e r z b u r g . d e


J . P h y s i o l . 5 1 1 . 1

2 6 3


Documents

Non-Genomic Action of the Mineralocorticoid