Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidlers effekter på udvalgte terrestriske invertebrater

Niels Bohse HendriksenBjarne Munk Hansen

Danmarks Miljøundersøgelser

46

Indhold

Forord 3

Sammendrag 4

1 Indledning 6

2 Non-target invertebrater som testorganismer 8

2.1 Regnorme 8

2.1.1 Regnormene i Danmark 8

2.1.2 Regnorme og mikroorganismer 11

2.1.3 Regnorme og mikrobielt betingede sygdomme 14

2.1.4 Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidlers effekter på regnorme 16

2.1.5 Regnorme og B. thuringiensis 17

2.1.6 Regnorme og aktinomyceter 18

2.1.7 Regnorme og S. griseoviridis 18

2.2 Nematoder 19

2.2.1 Nematoder og B. thuringiensis 20

2.2.2 Nematoder og aktinomyceter 22

3 Diskussion og konklusioner 23

3.1 Regnorme 23

3.2 Nematoder 25

Referencer 26

Bilag

1 Metoder til undersøgelse af mikroorganismers effekt på regnorme 32

2 Effekten af udvalgte Bacillus thuringiensis-stammer på nematoden Panagrellus redivivus i et simpelt testsystem 34

3 Detektion af Streptomyces griseoviridis 43

45

Forord

Denne rapport er en del af Miljøstyrelsen's teknisk-videnskabelige viden-opbygning i relation til miljømæssig vurdering af mikrobiologiske plante-beskyttelsesmidler. Rapporten indeholder, dels en bred litteraturudredning vedrørende effekter på ikke-målgrupper af invertebrater (regnorme og nematoder), dels to eksperimentelle afsnit angående effekter af bakterien Bacillus thuringiensis på nematoder, og udvikling af et detektionssystem for aktinomyceten Streptomyces griseoviridis.

Styringsgruppen for projektet bestod af:

Claus Frier, Miljøstyrelsen (formand),Helle Haugaard, Miljøstyrelsen,Pernille Folker-Hansen, Dansk Erhvervsgartnerforening,Niels Bohse Hendriksen, Danmarks Miljøundersøgelser,Bjarne Munk Hansen, Danmarks Miljøundersøgelser.

Styregruppen takkes for et engageret samarbejde, Margit Møller takkes for veludført laboratoriearbejde, og Anne Winding takkes for gennemlæsning og kommentering af rapporten. "Bøg Madsen", Bjæverskov, donerede præparatet "Mycostop", et mikrobielt bekæmpelsesmiddel indeholdende S. griseoviridis, som anvendes mod plantepatogene svampe.

46

Sammendrag

Formålet med projektet er at beskrive det eksisterende metode- og videngrundlag vedrørende miljømæssig risikoanalyse af mikrobielle plantebeskyttelsesmidler i relation til terrestriske invertebrater med specielt henblik på regnorme og nematoder. Med hensyn til mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler så tager projektet udgangspunkt i Bacillus thuringiensis, bakterien der indgår i de mest anvendte mikrobiologiske insekticider, og Streptomyces griseoviridis, aktinomyceten der indgår i "Mycostop" et middel der virker antagonistisk overfor svampe.

I projektet beskrives indledningsvist regnormenes biologi samt forekomst og udbredelse i Danmark. Dernæst belyses regnormes interaktioner med mikroorganismer generelt, specielt bliver interaktionerne i fordøjelses-systemet beskrevet, idet litteraturen hovedsagligt beskæftiger sig med dette emne. Med udgangspunkt i dette beskrives det generelt, hvorledes mikroorganismer kan forårsage sygdom hos regnorme.Mulige invasionsveje for mikroorganismers infektion af regnorme kortlægges og mikroorganismer der er patogene overfor regnorme defineres som organismer, der kan trænge ind i coelomet og danne en blivende population i coelomvæsken. Der er i litteraturen beskrevet 12 forskellige mikroorganismer med patogene egenskaber overfor regnorme. Desuden belyses det hvorledes mikroorganismer kan påvirke regnorme indirekte ved at influere på faktorer, der har afgørende betydning for regnormes livsprocesser.

Med hensyn til B. thuringiensis findes der i litteraturen indikationer for, at nogle stammer kan være direkte patogene overfor regnorme, og at nogle andre stammer kan påvirke regnorme indirekte. Med hensyn til S. griseoviridis så findes der ingen litteratur, der beskæftiger sig med effekter på invertebrater.

Litteraturgennemgangen gør det klart, at såvel den generelle viden om mikroorganismers sygdomsfrembringende evne overfor regnorme, som den mere specifikke viden om enkelte mikroorganismers sygdomsfrembringende egenskaber, er fragmentarisk og utilstrækkelig til at danne et fast videnskabeligt fundament for risikoanalyse.

Med udgangspunkt i litteraturgennemgangen gives der anbefalinger for i hvilke tilfælde og hvilke typer af undersøgelser, der bør gennemføres i forbindelse med konkret risikoanalyse af et specifikt mikrobiologisk plantebeskyttelsesmiddel. Endvidere foreslåes en forskningsindsats, der vil gøre det muligt at definere mere specifikke undersøgelsesmetoder, og at formulere generelle kriterier for godkendelse af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler.

Den tilgængelige viden angående mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidlers effekt overfor nematoder er særdeles begrænset. Der findes dog en række data vedrørende effekter af B. thuringiensis på nematoder. Disse effekter synes enten at være en uspecifik effekt forårsaget af vegetative celler eller en mere specifik effekt forårsaget af specielle -endotoksiner. Den uspecifikke effekt kan påvirke såvel øg som juvenile og voksne nematoder. Der findes ingen oplysninger angående effekter af streptomyceter på nematoder og derfor heller ikke angående S. griseoviridis.

45

Det betyder, at det ikke er muligt at formulere specifikke anbefalinger for godkendelse af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler med hensyn til effekter på nematoder. Der skitseres derimod et testsystem, som vil kunne anvendes til identifikation af eventuelle effekter overfor nematoder ved anvendelse af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler, og det vurderes i hvilke tilfælde testsystemet bør finde anvendelse.

46

1 Indledning

EU-direktiv Mikrobiologisk bekæmpelse af skadevoldere i have-, land- og skovbrug kan i fremtiden forventes at blive et vigtigt alternativ til kemiske pesticider. Som en konsekvens heraf er der for nylig trådt en regulering af be-kæmpelsesmidler indeholdende mikroorganismer i kraft i Danmark og i det øvrige EU. EF-direktivet om markedsføring af plantebeskyttelsesmidler (91/414/EØF) er gennemført i dansk lovgivning ved bekendtgørelse nr. 768 af 23. august 1994 om bekæmpelsesmidler. Lovgivningen medfører at ethvert bekæmpelsesmiddel indeholdende mikroorganismer skal godkendes af myndighederne før det kan markedsføres og tages i anvendelse.

Godkendelseskriterier Af EF-direktivet og den danske lovgivning fremgår det, som det over-ordnede kriterium for godkendelse, at et plantebeskyttelsesmiddel kun kan godkendes, når det er tilstrækkeligt effektivt, ikke har uacceptable virkninger på planter eller på miljøet, ikke har skadelig virkning på menneskers eller dyrs sundhed eller påvirker grundvandet.

Ansøgningskrav For at sikre at disse overordnede kriterier for godkendelse overholdes, er der i bilag 5.2 til Miljø- og Energiministeriets bekendtgørelse nr. 768 om bekæmpelsesmidler opstillet en række krav til ansøgninger om godkendelse af salg eller import af sådanne midler. I "Vejledning fra Miljøstyrelsen, Nr. 8, Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler", bliver disse krav præciseret, på grundlag af en generel identifikation af relevante risici. Det enkelte middel indeholdende mikroorganismer vil, med udgangspunkt i oplysnings-kravene, blive analyseret af dels ansøgeren og dels de relevante myndigheder med henblik på identifikation og vurdering af risici (case by case).

I relation til miljøet er det primært følgende grundlæggende problemstil-linger ved anvendelse af det mikrobiologiske plantebeskyttelsesmiddel, der analyseres:

- mikroorganismens egenskaber og sandsynlige funktion i miljøet; - mikroorganismens muligheder for at overleve og etablere sig i mil-jøet, herunder mulighederne for genoverførsel;- mikroorganismens muligheder for at påvirke ikke-målgrupper af organismer i miljøet.

Analyse af disse problemstillinger er afgørende for vurdering af, hvorvidt det specifikke mikrobiologiske plantebeskyttelsesmiddel kan have uønskede effekter på miljøet.

Videnopbygning I forbindelse med med lovgivningens ikrafttræden har Miljøstyrelsen startet en teknisk-videnskabelig videnopbygning, som hidtil har resulteret i Miljøprojekt nr. 224 (1993) "Miljømæssig vurdering af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler", som primært er en udredning angående analyse-metoder; Arbejdsrapport nr. 18 (1994) "Toksiske metabolitter fra udvalgte mikroorganismer", som er en gennemgang af udvalgte mikroorganismers produktion af sekundære metabolitter; samt Miljøprojekt nr. 316 (1996) "Bacillus thuringiensis, Ecology and environmental effects of its use for microbial pest control", som har resulteret i generel videnopbygning og metodeudvikling angående denne mikroorganisme. Dette projekt skal ses som en videreførelse af denne teknisk-videnskabelige videnopbygning, hvis mål er i videst muligt omfang at få viden, som kan bruges til specifikation af

45

kriterier for godkendelse. Projektet beskæftiger sig i denne forbindelse primært med mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidlers mulighed for at påvirke ikke-målgrupper af organismer.

Plantebeskyttelsesmidler De mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler falder i dag primært indenfor to forskellige produktgrupper, som anvendes ved plantebeskyttelse:

- midler til bekæmpelse af skadevoldende invertebrater;- midler til bekæmpelse og forebyggelse af plantesygdomme.

Den første gruppe af midlers virkemåde er som hovedregel baseret på mikro-organismernes patogenicitet overfor de skadevoldende invertebrater, mens den anden gruppe af midlers virkemåde skyldes mikroorganismernes antago-nistiske effekt overfor sygdomsfremkalderen, parasitisme og/eller krydsbeskyttelse.

Formål og afgrænsning Formålet med projektet er at beskrive det eksisterende metode og viden-grundlag samt at supplere det eksisterende grundlag vedrørende miljø-mæssig risikoanalyse af mikrobielle plantebeskyttelsesmidler i relation til terrestriske invertebrater. I nærværende udredning vil mikroorganismers generelle effekter på regnorme, som er en ikke-målgruppe af invertebrater, blive belyst udfra litteraturen; desuden vil effekter overfor nematoder blive behandlet. Problematikken angående mikrobiologiske plantebeskyttelses-midlers effekt på ikke-målgrupper af invertebrater vil blive forsøgt belyst med en mikroorganisme ("aktivstof") fra hver af de to forskellige produkt-grupper. Disse aktivstoffer er bakterien Bacillus thuringiensis og aktinomy-ceten Streptomyces griseoviridis. B. thuringiensis er den mikroorganisme, der indgår i de mest anvendte mikrobiologiske insekticider og er det aktivstof, hvorom det videnskabelige kendskab er størst. S. griseoviridis er det aktivstof, der indgår i produktet Mycostop, som virker antagonistisk overfor svampe, og dermed benyttes til bekæmpelse af visse svampesyg-domme på planter. Baggrundsviden om denne aktinomycet er af væsentlig mindre omfang end om B. thuringiensis.

46

2 Non-target invertebrater somtestorganismer.

2.1 Regnorme

Allerede klassiske arbejder af Darwin (1881) og danskerne Müller (1878) og Bornebusch (1930) gjorde det klart, at regnorme udgør et meget vigtigt faunaelement i mange terrestriske økosystemer. I disse økosystemer spiller de en betydelig rolle ved (Christenen og Mather, 1994), at

Økologisk betydning - påvirke jordens fysiske og kemiske egenskaber på adskillige måder (be-luftning, vandledningsevne, vandkapacitet, aggregatdannelse, mineralisering af næringsstoffer);- påvirke planterødder og mikroorganismer, og dermed plantevækst;- udgøre en væsentlig fødekilde for en lang række dyr, inkluderende alt fra pattedyr til insekter,og dermed overordnet have stor betydning for stof-og energikredsløb.

Med dette som udgangspunkt er det fornuftigt at betragte regnorme som en gruppe af dyr, hvorom det er væsentligt at have et generelt kendskab og specielt i hvilken grad de kan påvirkes af et givent mikrobiologisk plante-beskyttelsesmiddel.

Effekt på regnorme Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler kan potentielt set påvirke regnor-me på flere forskellige måder, såvel direkte som indirekte, og dermed få betydelige konsekvenser for de økosystemer, hvori de anvendes; f.eks.

- reducere antallet og biomassen af regnorme (og/eller ændre deres artssam-mensætning) og dermed påvirke jordens frugtbarhed i en negativ retning;- påvirke regnormes vækst og fertilitet og dermed reducere antal og biomasse;- påvirke predatorer på regnorme ved reduktion i regnorme-biomasse.

Regnorme som testdyr Regnorme har en række egenskaber (Christensen og Mather, 1994), der gør dem ideelle som testorganismer:

- de er almindeligt forekommende i de fleste jorde;- de er relativt nemme at indsamle og identificere;- de er relativt nemme at håndtere i laboratoriet;- en række arter kan dyrkes i kulturer;- der findes en stor baggrundsviden om deres biologi og økologi;- de bliver benyttet som testorganismer overfor kemiske pesticider, hvilket betyder, at der eksisterer en erfaring i anvendelse af regnorme som testor-ganismer.

2.1.1 Regnormene i Danmark.Regnorme er saddelbørsteorme (Oligochaeta), som tilhører ledormene (Annelida). I Danmark forekommer der almindeligt 15 arter fra 9 slægter (Clausen, 1993); de tilhører alle familien Lumbricidae. Se tabel 2.1.

Økotyper De danske regnorme kan inddeles i tre forskellige økologiske typer efter deres vertikale udbredelse i jordbunden (Bouché, 1972; Lee, 1985, Clausen,1993):

45

- de epigæiske orme, der lever i relativt uomsatte planterester, førnelag og jordens allerøverste centimetre;- de anecike orme, der graver dybe gange i jorden, men primært søger deres føde på overfladen;- de endogæiske orme, der laver gangsystemer i jorden, og primært finder deres føde nede i jorden.

Epigæiske regnorme De epigæiske orme består af små, hurtigt voksende arter med en kraftig oftest rødbrun pigmentering. De har en relativt kort levetid, men en stor reproduktionsevne. Til gruppen hører D. octaedra, D. rubidus og L. castaneus, arter der primært findes i løvansamlinger, i gødning, i hen-rådnende træstubbe og grene og lignende steder. Til gruppen hører også E. fetida, som specielt er knyttet til kompost og desuden kan findes i møddin-ger. Den epigæiske art E. tetraedra findes generelt under meget fugtige omstændigheder.

Anecike regnorme De anecike orme består af store, langsomtvoksende arter, der oftest er brunligt pigmenterede. De har en lang levetid, men en forholdsvis lille reproduktionsevne. Til gruppen hører L. terrestris og A. longa. Disse arter findes primært på lokaliteter, hvor der tilføres rigelige mængder af organisk materiale til jordens overflade, f.eks. løvskove, græssede overdrev og enge, samt græsplæner.

Endogæiske regnorme De endogæiske orme er mindre ensartede end de to andre grupper. De omfatter såvel små som relativt store arter, der dog har det fællestræk, at de er upigmenterede eller svagt pigmenterede. De har en temmelig lang levetid og en forholdsvis lille reproduktionsevne. Det fremgår af tabel 2.1 hvilke arter, der hører til denne gruppe.

Krav til økosystem Regnormenes krav til deres omgivelser hænger naturligvis sammen med hvilken økotype de tilhører. De epigæiske arter er således ret uafhængige af fysisk/kemiske forhold i jorden, men er til gengæld afhængige af tilstede-værelsen af organisk materiale under nedbrydning. De to andre grupper af regnorme, som har en nærmere kontakt med jorden, påvirkes derimod af jordens fysisk/kemiske forhold med forskelle imellem de enkelte arters præferencer og tolerancer. Dette medfører, at forskellige typer af økosy-stemer ikke blot domineres af forskellige økotyper, men også varierer i artssammensætning (Lee, 1985).

Ernæringsbiologi Regnorme opdeles også i to forskellige typer med udgangspunkt i deres ernæringsbiologi (Lee, 1985):

- de detritivore regnorme, der primært konsumerer plantemateriale, som kun i nogen udstrækning er nedbrudt;- de geophage regnorme, der primært konsumerer jord og plantemateriale, der i større udstrækning er nedbrudt.

Dette betyder, at de detrivore regnorme, i den danske fauna, udgøres af epigæiske og anecike arter, mens de geophage udgøres af de endogæiske arter (Clausen, 1993). Se tabel 2.1.

Dyrket jord Traditionelt dyrket agerjord domineres af endogæiske orme, specielt er A. caliginosa almindelig, men arter som A. rosea og A. chlorotica kan også forekomme (Clausen,1993). På nogle lokaliteter vil de to anecike arter L. terrestris og A. longa også kunne findes (Andersen, 1987). Regnormenes antal varierer fra ganske få individer til flere hundrede pr. m² (Andersen

46

1983, 1987). Der findes ikke internationalt publicerede undersøgelser over regnormefaunaen i økologisk dyrket agerjord, men det må forventes, at anecike og epigæiske orme er mere almindelige end i den traditionelt dyrkede jord, og at antallet af individer er højere, fordi der anvendes forskellige former for organisk gødning, og fordi jorden bearbejdes mindre.

Tabel 2.1Almindeligt forekommende regnormearter i Danmark

Latinsk navn Dansk navn Øko-type Ernærings-type

Allolobophora chloroticaAporrectodea caliginosaAporrectodea longaAporrectodea roseaDendrobaena octaedraDendrodrilus rubidusEisenia fetidaEiseniella tetraedraHelodrillus oculatusLumbricus castaneusLumbricus festivusLumbricus rubellusLumbricus terrestrisOctolasion cyaneumOctolasion tyrtaeum

Grøn ormGrå ormLang ormRosa ormMosormStubormBrandormBækormDyndormLøv regnormMørk regnormSkov regnormStor regnormBlå ormMælket orm

EnEnAnEnEpEpEpEpEnEpEp, AnEp, AnAnEnEn

GeoGeoDeGeoDeDeDeDeGeoDeDeDeDeGeoGeo

Økotyper: En: Endogæisk, An: Anecik, Ep: Epigæisk.Ernæringstyper: Geo: Geophag; De: Detritivor.Danske navne efter Bornebusch (1928).

I intensivt drevne gartnerier, hvor der ikke anvendes kompost eller lignende, forventer vi, at regnormefaunaen primært består af endogæiske arter i et relativt begrænset antal. I dyrkningssystemer, hvor der anvendes kompost og jorddække, vil epigæiske og anecike regnorme have gode livbetingelser, og derfor sandsynligvis findes som betydelige populationer. I frugtplantager findes ofte en stor population af den anecike art: L. terrestris (Lee, 1985).

Overdrev og enge Anecike og endogæiske arter er de dominerende på overdrev og enge, mens artssammensætning sandsynligvis er afhængig af jordens fysisk-kemiske forhold. Under dyregødning (f.eks. kokasser) findes også epigæiske arter, samt de to overgangsformer (se tabel 2.1) L. rubellus og L. festivus (Holter 1979, 1983; Hendriksen, 1991). Individantallet og biomassen er ofte høj.

Løvskove I løvskove på muldjord findes alle tre økotyper af regnorme ofte i et stort antal med en høj biomasse og en stor artsdiversitet. Derimod er det hoved-sageligt epigæiske orme af arterne D. octaedra, D. rubidus og L. rubellus, i et begrænset antal, der findes i løvskove på morbund (Clausen, 1993). I nåleskove findes der et meget begrænset antal regnorme, primært den epigæiske art D. octaedra (Bornebusch, 1930).

Fysiske krav Regnormes aktivitet er bestemt af jordens temperatur og fugtighedsforhold. De fleste danske arter er aktive ved temperaturer imellem ca. 0 og 25C, så længe jorden er tilstrækkelig fugtig. Dette betyder, at regnormene i danske økosystemer primært er aktive i forårs og efterårsmånederne samt i den tidlige og sene sommertid. Hvis jorden er ved at tørre ud eller tem-peraturerne falder til under 0C vil ormene enten grave sig ned i dybere liggende jordlag eller forsøge at overleve i en inaktiv tilstand (Edwards og Lofty, 1977; Andersen, 1987).

2.1.2 Regnorme og mikroorganismer.

45

Regnorme lever i et miljø, hvor de er omgivet af et utal af mikroorganismer med en særdeles stor artsdiversitet. Litteraturen har hovedsagligt beskæftiget sig med mikroorganismernes interaktioner med regnormenes fordøjelsessystem. Figur 2.1 anskueliggør de forskellige typer af interaktio-ner.

Figur 2.1Interaktioner imellem regnormes fordøjelsessystem og mikroorganismer.(1) Mikroorganismer i føde(2) Mikroorganismer som lysereres i kro/tyggemave(3) Mikroorganismer med enzymer der medvirker ved nedbrydning(4) Mikroorganismer der passerer ind i tarmen(5) Mikroorganismer der går upåvirkede igennem tarmen(6) Mikroorganismer der lyseres i tarmen(7) Mikroorganismer der aktiveres(8) Mikroorganismer der deler sig(9) Midlertidigt residerende mikroorganismer(10) Residerende mikroorganismer(11) residerende mikroorganismer som koloniserer tarmmateriale(12) Mikroorganismer i fæces.

Fordøjelsessystem Regnorme konsumerer materiale, som indeholder varierende koncentrationer af mikroorganismer (1). Det konsumerede materiale blandes i kro og tyggemave med vand, slim, enzymer og måske antibakterielle faktorer. Dette medfører, at nogle mikroorganismer lyseres og sandsynligvis optages i tarmen (2); nogle af disse mikroorganismers enzymer kan medvirke ved nedbrydning af specifikke organiske komponenter i tarmen (3). Andre mikroorganismer vil overleve opholdet i den forreste del af fordøjelses-systemet og blive transporteret frem i tarmen (4). Disse kan: (5) gå upåvirkede igennem tarmen og blive udskilt med fæces, (6) blive lyseret og optaget af tarmen, (7) blive aktiveret fra en mindre til en mere aktiv tilstand, (8) dele sig, (9) eller fæstne sig til tarmvæggen i længere eller kortere tid, og eventuelt dele sig her (midlertidigt residerende mikroorganismer). Den mikrobielle produktion, der opnås ved vækst (8 & 9), kan blive lyseret og absorberet og/eller blive udskilt med fæces. I tarmen kan der også findes residerende mikroorganismer, som danner permanente, relativt stabile populationer. De kan være permanent fæstet til tarmvæggen (10) eller kunne kolonisere tarmmaterialet (11); disse bakterier vil i en vis udstrækning blive udskilt med fæces.

46

Mikrofloraen i fæces (12) vil således kunne bestå af: Mikroorganismer der går upåvirkede igennem for-døjelsessystemet (5); mikroorganismer der er blevet aktiveret (6); mikroorganismer der har delt sig og sandsynligvis dermed er blevet forøget i antal (8); samt residerende mikroorganismer, der har koloniseret tarmind-holdet (9, 11). Disse forskellige grupper af mikroorganismer vil findes i en blanding, der vil afhænge af hvilke mikroorganismer, der er blevet konsumeret, og deres skæbne i tarmen.

I det følgende vil det blive beskrevet hvilken evidens, der findes for de forskellige typer af relationer imellem regnorme og mikroorganismer, og eksempler på hvilke mikroorganismer, som er kendt for at udvise det beskrevne respons, vil blive givet.

Mikroorganismers skæbne En række mikroorganismer reduceres betydeligt i antal (mere end en faktor 100) under ophold i regnormes fordøjelsessystem (2), f.eks. mange svampe-hyfer (Domsch og Banse, 1972; Dash et al., 1979), de gram-negative-bakterier Eschericia coli (Brusewitz, 1959; Pedersen og Hendriksen, 1993), Serratia marcessens (Day, 1950) og Pseudomonas putida MM11 (Pedersen og Hendriksen, 1993) samt den gram-positive bakterie Bacillus mycoides (Day, 1950). Denne antalsmæssige reduktion, der sandsynligvis primært forårsages af en lysering af cellerne, synes primært at foregå i den foreste del af fordøjelsessystemet (Pedersen og Hendriksen, 1993). Det er ikke specifikt dokumenteret for regnorme, at nogle af de lyserede organismers proteoly-tiske enzymer medvirker ved nedbrydning af specifikke komponenter i tarmen (3); men det er kendt fra en række andre invertebrater (Martin, 1983), og resultater angående specifikke enzymers tilstedeværelse i tarmen hos den tropiske art Pontoscolex corethrurus (Zhang et al., 1993) giver en betydelig indirekte evidens herfor.

Effekt på sporer Det er primært sporer af såvel bakterier som svampe, der går upåvirkede igennem fordøjelsessystemet (5) (Brown, 1995), men også bakterien Aeromonas hydrophila (Pedersen og Hendriksen, 1993), som ikke danner sporer, blev ikke antalsmæssigt påvirket af passagen; dette kan dog være et nettoresultat af en kombination af bakteriel vækst og død i tarmen. Tilsvarende synes nogle bakterier i mindre aktive tilstandeat gå upåvirkede igennem tarmen (Fischer et al., 1995). Det er derimod kun dokumenteret med sikkerhed for P. fluorescens KTG (Clegg et al., 1995), at der sker et betydeligt fald i antal i selve tarmen (7).

Aktivering ved tarmpassage Det er ikke dokumenteret for en enkelt stamme af mikroorganisme, at den bliver aktiveret fra en mindre til en mere aktiv tilstand under tarmpassagen; men en række forhold taler for, at det er tilfældet for en række bakterier: (a) bakteriers dyrkbarhed forøges uden, at der samtidig sker en forøgelse i biomasse eller antal opgjort ved direkte tællinger (Daniel og Anderson, 1991; Pedersen og Hendriksen, 1993); (b) den mikrobielle respiration forøges i fæces uden en korresponderende forøgelse i bio-masse (Scheu, 1987) og (c) antallet af detekterbare bakterier, opgjort ved hjælp af rRNA-prober, forøges uden en tilsvarende forøgelse ved direkte tælling (Fischer et al., 1995).

Flere undersøgelser beskriver, at der sker en betydelig vækst af mikroorga-nismer i regnormes fordøjelsessystem (8), primært af bakterier og aktino-myceter (Brown, 1995). Men da de fleste undersøgelser ikke på en overbe-visende måde opgør antallet af mikroorganismer i det konsumerede materiale, og ikke tager højde for en eventuel lysering i tarmsystemets forreste del og ikke tager hensyn til en reaktivering i tarmen, er det vanskeligt at benytte denne evidens som udtryk for en reel vækst i regnor-

45

mes tarm. Pedersen og Hendriksen (1993) sandsynliggør dog, at der sker en vækst af bakterien Enterobacter cloacae imellem fortarm og bagtarm.

Mikroorganismer i tarm Det er sandsynligt, at der eksisterer residerende mikroorganismer i regnorme (10, 11), da Máriaglieti (1979) og Contreras (1980) overvejende fandt bakterier fra slægten Vibrio og aktinomyceten Streptomyces lipmanii i tarmmateriale fra E. lucens. Desuden fandt Jolly et al. (1993) og Vinceslas-Akpa og Loquet (1995) segmenterede filamentøse mikroorganismer fasthæf-tet til bagtarms epitelet af O. cyaneum, L. terrestris og E. foetida; disse organismer er ikke blevet bestemt, men ligner morfologisk, hvad der findes hos rotter og mus og dér kaldes segmenterede filamentøse bakterier. Henschke et al. (1989) giver evidens for, at bakterier også kan danne mid-lertidigt residerende populationer i tarmen, idet de kunne detektere P. fluore-scens DSM 50148 i fæces fra L. terrestris 50 døgn efter, at den var blevet konsumeret.

Mikroorganismer i fæces Mikrofloraen i fæces er primært blevet betragtet, som værende en afspejling af de mikroorganismer, der findes i det konsumerede materiale (Brown, 1995; Satchell, 1983; Edwards og Fletcher, 1988). De mange forskellige relationer der eksisterer imellem regnormes fordøjelsessystem og mikroorganismer, sandsynliggør, at dette er en alt for simpel betragtning af denne mikroflora. Efter defækation synes der først at ske en betydelig bak-teriel vækst efterfulgt af en vækst af svampe (Brown, 1995; Satchell, 1983; Fletcher og Edwards, 1987).

Mikroorganismer på orme Det er dog ikke kun regnormenes fordøjelsessystem, der kan påvirke mikroorganismer. Fra ormenes overflade udskilles slim, som indeholder labile organiske forbindelser, der kan fremme mikrobiel vækst, og deres ekskretionsprodukter indeholder mobiliserede næringsstoffer, der ligeledes vil påvirke mikroorganismerne (Scheu, 1991; Lee, 1985). Det er endvidere blevet sandsynliggjort, at Flavobacterium sp. og P. cepacia kan blive transporteret rundt i jord på regnormes overflade (Heijnen og Marinissen, 1995). Desuden vil regnormenes graveaktivitet og specielt de anecike regnormes transport af organisk materiale fra overfladen ned i jorden have en stor betydning for mikroorganismernes aktivitet (Hendriksen, 1996; Devliegher og Verstrate, 1995; Winding et al., submitted).

Mikroorganismers spredning Relationerne imellem regnorme og mikroorganismer antyder kraftigt, at regnorme kan have stor betydning for specifikke mikroorganismers over-levelse og spredning i jorden. Det er da også blevet vist, (1) at regnorme kan påvirke spredningen af en række plantepatogene mikroorganismer (Brown, 1995), (2) spredning og dermed sygdomsbekæmpelseseffektivitet af P. corrugata 2140R (en bakterie der kan bruges til bekæmpelse af svam-pesygdommen "Take-All") (Doube et al., 1994), (3) spredning og nodu-leringseffektivitet af rhizobier (Doube et al., 1994), samt (4) spredning og overlevelse af A. hydrophila (Hendriksen, 1995).

De mange forskellige interaktioner imellem regnorme og mikroorganismer, ikke mindst i deres fordøjelsessystem, må have en afgørende betydning for den enkelte mikroorganismes muligheder for at påvirke regnorme i en negativ retning. Det har dog ikke været muligt at finde undersøgelser som belyser samspillet imellem disse interaktioner og mikroorganismers patoge-ne egenskaber.

2.1.3 Regnorme og mikrobielt betingede sygdomme.

46

Patogen typer Mikroorganismer kan være patogene overfor regnorme, dvs de kan invadere regnorme og forårsage sygdom. Mikroorganismer er meget forskellige med hensyn til patogenecitet (evne til at forårsage sygdom). Dette kan dels skyldes forskelle i evnen til at invadere regnormene (trænge ind i regnorme-nes kropshule og/eller celler) og dels forskelle i deres evne til at være aktive i regnormes kropshule. Mikroorganismer kan opdeles i potentielle, fakultative og obligate patogener. Potentielle patogener er mikroorganismer, som kan invadere værten, uden at værten af andre årsager er svækket; mens fakultative patogener kan invadere værten, hvis den af andre grunde allerede er svækket. Såvel potentielle som fakultative patogener kan overleve og dele sig udenfor værterne, og de kan derfor også dyrkes på kunstige medier. Obligate patogener er derimod helt afhængige af levende celler for at over-leve, dele sig og være patogene. (Afsnittet er baseret på Tanada og Kaya, 1993). Meget lidt er reelt kendt angående mikroorganismers patogenecitet overfor regnorme.

Figur 2.2Mulige invasionsveje i regnorme for mikroorganismer (1) Vægge i fordøjelsessystemet(2) Epidermis(3) Dorsalporer(4) Nephridieporer(5) Kønsporer(6) Kokoners dannelse

Invasionsveje Dales og Kalaç (1992) definerer mikroorganismer, der er patogene for regnorme, som mikroorganismer, der kan trænge ind i coelomet, reproducere sig og danne en blivende population i coelomvæsken. Fig. 2.2 anskueliggør de forskellige invasionssveje, der må findes hos regnorme. Mikroorganismer kan blive konsumeret og invadere selve regnormen over tarmvæggen (1). Andre mikroorganismer kan ved hjælp af enzymer penetrere epidermis og på den måde trænge ind i ormen (2). På regnormes overflade findes åbninger ind til coelomhulen (dorsalporer (3) og nephridieporer (4)), hvorigennem mikroorganismer kan trænge ind. Desuden kan kønsorganerne invaderes igennem kønsporerne (5). En invasion af regnormenes kokoner kan tænkes primært at foregå under kokonernes dannelse (6). Af disse invasionsveje er kun tarmvæggen blevet dokumenteret som en sandsynlig invasionsvej til coelomet (Dales og Kalaç, 1992, Smirnoff og Heimpel, 1961). I coelom-væsken, primært fra E. fetida, er en række forskellige hemolytiske, hemoagglutinerende

45

og antibakterielle molekyler, samt celler med fagocytotiske egenskaber blevet identificeret (Valembois et al. 1986; Dales og Kalaç, 1992). Disse faktorer udgør et forsvarssystem imod bakterielle infektioner. På samme måde er der blevet isoleret bakterier fra kokoners lumen; i dette tilfælde også bakterier der er blevet udsat i den omgivende jord (Zachmann og Molina, 1993); disse bakterier vil sandsyn-ligvis kunne invadere kokonen under dens dannelse, som det er blevet postuleret for parasitiske mider (Gjelstrup og Hendriksen, 1991). Vækst i coelomvæsken er dels betinget af mikroorganismens mulighed for at dele sig, dels af regnormes forsvarssysstems mulighed for at bekæmpe organis-men, hvilket synes betinget af ikke-specifik phagocytose, som bliver hjulpet af forskellige antimikrobielle faktorer, samt muligvis af stoffer med opsoninlignende egenskaber (Dales og Kalaç, 1992). Mikroorganismer med patogene egenskaber synes således, at blive phagocyteret med en lavere hastighed end ikke-patogene mikroorganismer (Dales og Kalaç, 1992).

Mikrobielle toksiner Mikroorganismer kan også forårsage sygdom ved at danne stoffer, som er toksiske overfor organismen. I sådanne tilfælde er det ikke en nødvendig forudsætning for virkningen, at mikroorganismen invaderer organismen. Toxinet kan enten blive produceret og/eller tilført regnormens omgivelser eller blive produceret i regnormenes fordøjelsessystem og derfra påvirke organismen. Definitionsmæssigt findes der to forskellige typer af toxiner: (1) de anaboliske toksiner, som er stoffer, der produceres af selve mikroor-ganismen og (2) kataboliske toksiner, der produceres som en funktion af mikroorganismens nedbrydning af substrat, f.eks kan nedbrydning af kul-hydrat medføre dannelse af toksiske alkoholer.

Infektiv dosis En enkelt celle fra en mikroorganisme kan principielt skabe en infektion, men generelt set er dette meget sjældent tilfældet. I stort set alle tilfælde vil det kræve et minimum af infektive mikroorganismer, som invaderer organismen, før de forårsager en infektion. Denne infektive dosis udtrykkes ofte kvantitativt som letal dosis (LD), effektiv dosis (ED), eller infektiv dosis (ID) (Tanada og Kaya, 1993). Disse begreber er reelt endnu ikke taget i anvendelse i relation til regnorme.

Symptomer Efter en mikroorganismes invasion af en regnorm, og efterfølgende etable-ring, kan infektionen deles i følgende faser: inkubationsperioden, sygdom-mens udbrud, sygdommens højdepunkt og sygdommens ophør. Inku-bationsperioden strækker sig fra regnormen er blevet invaderet til de første tegn på sygdom er synlige. Sygdommens udbrud er tidspunktet, hvor de første tegn på sygdommen bliver synlige. Sygdommens højdepunkt er den periode, hvor regnormen udviser de maksimale tegn på sygdommen. Syg-dommen kan enten blive kronisk eller afsluttes ved at ormen dør eller den bliver rask. Tegnene på sygdom kan enten være karakterer der er (1) morfo-logisk erkendelige f.eks. pletter, blodudtrædninger, indsnøringer og lignen-de, (2) være erkendelige ved dyrenes aktivitet, (3) nedsættelse af vækstrate og/eller (4) fertilitet (kokonproduktionsrate) eller (5) død.

46

Tabel 2.2Mikroorganismer med patogene egenskaber overfor regnorme

Mikroorganisme Påvirket regnorm Reference

Corynebacterium diphteriaeBrevibacterium sp.Serratia marcescensBacillus megateriumArthrobacter sp.Serratia sp.Aeromonas sp.Aeromonas hydrophiliaYersenia ruckeriYersenia ruckeriBacillus thuringiensisEnterobacter aerogenes

L. terrestrisE. fetidaE. fetidaE. fetidaE. fetidaE. fetidaE. fetidaE. fetidaD. venataE. fetidaL. terrestrisH. suctoria

Cameron, 1932Roch, 1980Çotyk og Dales, 1984Valembois et al., 1986Valembois et al., 1986Valembois et al., 1986Valembois et al., 1986Valembois et al., 1986Çotyk og Kalaç , 1990Dales og Kalaç , 1992Smirnoff og Heimpel, 1963Rao et al. , 1983

Patogene mikroorganismer Kun ganske få mikroorganismer er dokumenteret patogene overfor regnor-me. Tabel 2.2 er en oversigt over de af os kendte eksempler. Det fremgår af tabellen, at den kun omfatter bakterier, men såvel grampositive som gramnegative. De første ti eksempler er bakterier, der kan forårsage død hos regnorme (primært E. fetida) ved injektion af bakterierne i coelomvæsken; det er ikke blevet undersøgt hvorvidt disse bakterier kan inficere regnorme på en mere naturlig måde. Hendriksen (1995) og Pedersen og Hendriksen (1993) har foretaget fodringsforsøg med A. hydrophila, de fandt ingen effekter på regnormene, så dette kan betyde, at der enten er forskelle imellem forskellige stammer af bakterierne eller at A. hydrophila ikke er invasiv. B. thuringiensis synes at kunne invadere coelomet efter konsump-tion og derved forårsage død. E. aerogenes er den eneste mikroorganisme, hvorom det med stor sikkerhed kan siges, at den er patogen overfor reg-norme (den tropiske art Hoplochaetella suctoria), idet en grundig under-søgelse har kundgjort, at E. aerogenes opfylder alle fire betingelser (Koch's postulater) for at kunne etablere en kausal sammenhæng imellem sygdom og mikroorganisme: (1) Den specifikke mikroorganisme skal kunne isoleres fra samtlige tilfælde af sygdommen; (2) mikroorganismen skal kunne dyrkes i kultur; (3) mikroorganismen skal kunne give ikke syge organismer sygdom-men eksperimentelt (smitteoverførsel); og (4) mikroorganismen skal også kunne isoleres fra de eksperimentelt smittede organismer (Tanada og Kaya, 1993). En patogen hyphomycet Exophiala jeanselmei er blevet isoleret fra naturligt inficerede O. tyrtaeum og E. foetida kokoner, og det er blevet vist eksperimentelt, at den kan inficere kokoner fra seks forskellige arter af regnorme (Vakili, 1993).

2.1.4 Mikrobiologiske bekæmpelsesmidlers indirekte effekter på regnorme.

Mikroorganismer kan påvirke regnorme indirekte ved at influere på faktorer, der har afgørende betydning for regnormes livsprocesser. Det kan f.eks. være: (1) produktion af kataboliske toksiner, (2) produktion af antibiotika, der påvirker den mikrobielle samfundsstruktur og dermed regnormes levevilkår, (3) påvirkning af nedbrydningsprocesser og stofkredsløb. Der findes ikke undersøgelser, der belyser en eller flere af disse problemstillinger.

45

2.1.5 Regnorme og Bacillus thuringiensis.Et mindre antal undersøgelser har beskrevet B. thuringiensis effekt på regnorme, men det er ikke muligt at drage endelige konklusioner angående denne bakteries patogenecitet overfor regnorme. Der findes dog en række indicier for, at B. thuringiensis kan påvirke regnorme, muligvis ved at være patogen.

"Blister-disease" Heimpel (1966) isolerede to stammer af B. thuringiensis fra E. foetida fra regnormekulturer, som udviste en "blister-disease". En sygdom der øjen-synligt fører til massedød i kulturerne. Stammerne blev begge henført til B. thuringiensis subsp. thuringiensis. Isoleringen af disse to stammer blev dog ikke fulgt op af eksperimentelle undersøgelser, som kunne have eftervist, hvorvidt disse isolater forårsagede sygdommen. Der mangler således en eksperimentel eftervisning af Koch's postulater. Çotyk og Dales (1984) injicerede dog en af stammerne i E. fetida i relativt høje koncentrationer (9 x 106/ml) uden at det forårsagede død; dette kan skyldes en række forskellige årsager, som ikke nødvendigvis er knyttet til bakteriens patogene egenskaber: F.eks. forskelle imellem forskellige populationer af E. fetida's respons, at stammen af B. thuringiensis har ændret sig ved gentagne opformeringer i kultur, eller at sporer og vegetative celler af B. thuringiensis giver forskelligt respons hos ormen.

B. t. subsp. thuringiensis Smirnoff og Heimpel (1961) undersøgte eksperimentelt effekten af det mikrobiologiske bekæmpelsesmiddel Thuricide, som indeholder B. thurin-giensis subsp. thuringiensis, på L. terrestris. De fandt, at høje ikke realistiske koncentrationer (1-20 vægt%) Thuricide iblandet jorden, svarende til ca. 4x108 - 8x109 B. thuringiensis/g jord, alle medførte 100% mortalitet i løbet af ca. 2 måneder, selv ved den laveste påvirkning. Histologiske under-søgelser af de døde orme viste, at B. thuringiensis invaderede coelomet via tarmvæggen og forårsagede død på grund af blodforgiftning. Krieg (1983; citeret i Addison (1993)) foreslår dog, at invasionen ikke var forårsaget af selve bakterien, men af diatomé-jorden som blev benyttet som bærestof i formuleringen af Thuricide.

B. t. subsp. galleriae Atlavinyte et al. (1982) undersøgte eksperimentelt effekten af det mikro-biologiske bekæmpelsesmiddel Entobacterin, som indeholder B. thuringi-ensis subsp. galleriae, på A. caliginosa. Deres resultater er desværre tve-tydige. De fandt således i ét eksperiment at Entobacterin ingen eller ringe effekt havde på ormene, mens det i at andet eksperiment havde en effekt på såvel overlevelse som vækst. Effekten var især udtalt med koncentrationer svarende til ½ og 1 gange feltdosis, mens 2 gange feltdosis havde en ringe effekt. Det blev ikke undersøgt, hvorvidt bakterien inficerede ormene. Det blev derimod vist, at mellemkoncentrationerne af Entobacterin negativt påvirkede parametre som nedbrydningsraten af halm, tæthederne af mider, collemboler, insektlarver og mikroorganismer (opgjort ved pladespredning) og visse jordbundskemiske parametre. Dette kunne antyde, at den viste effekt på A. caliginosa af Entobacterin snarere er en indirekte effekt end en mere direkte.

Der er endvidere blevet gennemført et par feltundersøgelser vedrørende B. thuringiensis effekt på regnorme (White, 1961 (citeret i Benz og Altweg, 1975); Benz og Altweg, 1975). Ingen af disse undersøgelser er gennemført på en sådan måde, at det er muligt at give en biologisk meningsfuld fortolkning af resultaterne, da de ikke angiver hvilke regnorme (økotyper), der er blevet fundet på lokaliteterne, og det dermed ikke kan vurderes, hvorvidt ormene reelt har været eksponeret for bakterierne.

46

B. thuringiensis i fæces Hendriksen (upubl.) fandt B. thuringiensis (identificeret v.h.a. kolonimorfo-logi og tilstedeværelse af krystaller) i fæces fra følgende arter af aktive regnorme indsamlet på forskellige lokaliteter: L. rubellus, L. festivus, L. terrestris, A. caliginosa, A. chlorotica, A. longa og O. cyaneum. Fore-komsten var mest talrig i de endogæiske arter. Dette antyder, at der fore-kommer stammer af B. thuringiensis i det materiale, som regnorme konsu-merer, og at denne forekomst ikke umiddelbart synes at påvirke regnormene.

B. thuringiensis varianter Da der findes mange forskellige underarter af B. thuringiensis, som producerer -endo-toxiner med forskellige egenskaber (Ellar, 1990), og da det enkelte isolat desuden kan producere en række andre stoffer med toksiske egenskaber, primært i den vegetative vækstfase (Hansen et al., 1996), er det meget sandsynligt, at der vil være stor variation imellem forskellige underarters og isolaters effekt på regnorme. Dette forhold kompliceres yderligere af, at det ikke med udgangspunkt i den tilgængelige viden er muligt at afgøre hvilke forhold (-endo-toksiner, andre toksiner, indirekte effekter) som er involveret i B. thuringiensis mulige effekt på regnorme.

2.1.6 Regnorme og aktinomyceterAktinomyceter er ofte blevet isoleret fra tarmmateriale fra regnorme (Brown, 1995); og det er sandsynligt, at nogle aktinomyceter kan vokse i tarmmiljøet (Parle, 1963). Især er forekomsten af aktinomyceter knyttet til regnorme blevet studeret i Centraleuropa (Contreras, 1980; Kristufek et al. 1990; Ravasz og Toth, 1990; Kristufek et al., 1993). Disse undersøgelser viser, (1) at det blandt aktinomyceterne især er arter fra slægten Streptomyces, der er almindeligt forekommende i tarmmaterialet, (2) at Streptomyces arterne der findes i regnormene oftest også er almindelige i jorden, men at forholdet imellem arterne varierer imellem regnorme og jord, (3) at der er forskel i Streptomycet-floraen imellem forskellige arter af regnorme, hvilket især synes knyttet til forskelle i økotyper, (4) at nogle få Streptomycet arter måske kan danne residerende populationer i tarmen hos regnorme.

2.1.7 Regnorme og Streptomyces griseoviridisStreptomyces griseoviridis er ikke blandt de isolater som er blevet isoleret og identificeret fra regnorme (adskillige hundrede isolater) (se ovenfor).

Det er, så vidt vides, aldrig blevet undersøgt, hvorvidt aktinomyceter kan påvirke regnorme i en negativ retning (være patogene eller på anden måde påvirke regnorme). Det er således ikke muligt med baggrund i litteraturen at udtale sig om, hvorvidt S. griseoviridis har potentiale for at have negative effekter på regnorme. Streptomyceter synes dog ikke at være stærkt virulente overfor invertebrater, da der ikke er beskrevet sygdomstilfælde hos invertebrater, der er sat i forbindelse med infektion med en art af Streptomyces (Korn-Wendisch og Kutzner, 1992). Med udgangspunkt i dette, og S. griseoviridis antibiotiske egenskaber (Lübeck, 1994), så synes indirekte effekter mere sandsynlige end direkte patogene effekter.

2.2 Nematoder

Diversitet Nematoder kan ikke på samme måde som regnorme betragtes som en gruppe af dyr med en relativt ensartet effekt på økosystemer. Nematoder er en dyregruppe, der indeholder arter, som regnes for at være skadedyr (en række

45

parasitære arter på såvel højere dyr som planter). Nematodarter, der parasiterer artropoder og mollusker, kan anvendes til biologisk bekæmpelse af en række forskellige arter af disse invertebrater og udnyttes i denne forbindelse kommercielt. Gruppen indeholder også en lang række fritlevende arter, der kan have andre mere gavnlige effekter på økosystemers funktion.

Funktion De fritlevende nematoder udgør imellem en og ti millioner individer/m² i de allerfleste terrestriske økosystemer (Nicholas, 1975), hvor deres biologiske rolle er at indgå i den terrestriske detritusfødekæde på flere forskellige niveauer og ved at påvirke mineralisering af næringsstoffer (Griffiths, 1994). De fritlevende nematoder er en yderst divers gruppe af dyr, der dels er vidt forskellige i en taksonomisk sammenhæng, dels har en meget forskelligartet ernæringsbiologi. Der kan f.eks. skelnes imellem bakterieædere, svampeædere, algeædere, rodsugere, predatorer og nematoder med et blandet fødeindtag (Nicholas, 1975). Nematoders forekomst og økologi i Danmark er øjensynligt ikke blevet undersøgt siden Nielsen (1949). Det må forventes, at den danske nematodfauna omfatter adskillige tusinde arter.

Derimod påvirker nematoder, i modsætning til regnorme, ikke direkte jordens kemiske og fysiske egenskaber, da de på grund af deres ringe størrelse ikke har jordbundsdannende egenskaber, som det er tilfældet med regnorme.

Effekt på nematoder Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler kan potentielt set påvirke nematoder på mange forskellige måder, f.eks. ved at reducere antallet (enten direkte eller ved nedsat vækst og fertilitet) og/eller ved at ændre artssammensætningen og dermed påvirke detritusfødekæden.

Nematoder som testdyr Nematoder har nogle egenskaber, der gør dem fornuftige at benytte som testorganismer i denne sammenhæng:

- de er almindeligt forekommende i de fleste jorder;- de er relativt simple at indsamle;- en række arter kan holdes i kultur, såvel xenisk som axenisk;- mange arter har en relativ kortvarig livscyklus, hvilket gør det nemmere at studere vækst og frugtbarhed.

Men desværre er der også en række egenskaber, der gør dem mindre egnede som testorganismer:

- det er en meget divers gruppe af dyr, bestående af mange arter, med mange forskellige typer af biologi;- det er yderst vanskeligt at identificere nematoder;- kendskabet til de fritlevende nematoders taxonomi, udbredelse, biologi og økologi er begrænset.

46

2.2.1 Nematoder og Bacillus thuringiensisEn række undersøgelser har klargjort, at der kan forventes en vis grad af påvirkning af nematoder ved anvendelse af B. thuringiensis. Repræsentanter for både fritlevende-, planteparasitiske- og zooparasitiske nematoder har vist sig, et eller flere steder i deres livscyklus at være følsomme, i større eller mindre grad, over for visse B. thuringiensis stammer.

Effekt på nematoders æg En række rapporter peger på, at B. thuringiensis -endotoksiner kan være toksiske især over for nematoders æg. Bottjer et al. (1985) undersøgte in vitro effekten af 30 sporulerede B. thuringiensis varieteter på æg fra den zooparasitiske Trichostrongylus colubriformis. Alle 30 varianter af bakterien viste sig at være toksiske overfor æggene. Den toksiske aktivitet af -endo-toksin berigede fraktioner varierede fra en LD50 på 0.025 til 2100 ng total protein per ml, dvs en variationsfaktor på 84000. To af de kommercielt anvendte B. thuringiensis varieteter, israelensis og kurstaki havde LD50 værdier på henholdsvis 1.27 og 62 ng totalprotein per ml. Yderligere undersøgelser med B. thuringiensis var. israelensis toksinpreparationer og æg fra seks zooparasitiske og en fritlevende nematod(er) viste toksisitet over for alle syv arter af nematoder med LD50 værdier i området 0.38-10.6 ng totalprotein per ml. B. thuringiensis letale effekt på nematoders æg er for T. colubriformis forårsaget af en ændring af strukturen af æggeskallen, hvilket medfører en ændret permeabilitet (Bone et al., 1987, Wharton og Bone, 1989). Bone et al. (1986) fandt ved bioassays med T. colubriformis og forskellige fraktioner af B. thuringiensis var. israelensis kulturer, at effekten på nematoders æg kan henføres til proteinkrystallen, som ikke kun indeholder insektspecifikke endotoksiner. Det blev også vist at toksisiteten kan henføres til et protein, da aktiviteten blev reduceret af proteolytiske enzymer. Yderligere fandt man, at den relevante fraktion ikke udviste effekt over for myggen Aedes aegypti, hvilket er et indicie for, at det ikke er de Diptera aktive toksiner, som udviser effekt på nematoders æg. På samme måde havde oprensede B. thuringiensis var. israelensis Diptera aktive proteiner ingen effekt over for nematoderne.

-exotoksin Visse B. thuringiensis typer, som f.eks. varieteten thuringiensis producerer -exotoxin, som kan udskilles i dyrkningsmediet. Dette toxin er en RNA syntese inhibitor (Bone, 1989). ß-exotoksin produceres ikke af hovedparten af de kommercielt anvendte stammer, som f. eks B. thuringiensis var. israelensis (Lisansky et al., 1993). Toksinet inhiberer æg-klækning og drab af andet trin larver af den plantepatogene nematod Meloidogyne spp. (Prasad et al., 1972). Ligeledes var -exotoksin årsag til, at væksten i kulturer af den fritlevende nematode Panagrellus redivivus blev signifikant hæmmet, at den tomat patogene Meloidogyne incognita ikke dannede galler på tomatrødder, og at den mycophage Aphelenchus avenae blev hæmmet markant i vækst (Ignoffo og Dropkin, 1977). Det kommercielle produkt Thuringiensin, som indeholder -exotoksin, var i stand til at reducere antallet af N. brasiliensis i tarmsystemet hos mus (Bone, 1989).

Effekt på larver og voksne Det er imidlertid ikke kun -exotoksin, som kan hæmme larver og voksne nematoder. Meadows et al. (1990) fandt således, at oprensede -endo-toksiner fra B. thuringiensis varieteterne israelensis, kurstaki, og morrisoni var i stand til effektivt at reducere den fritlevende nematod Turbatrix aceti i antal. Varieteten israelensis effekt på såvel larver som voksne nematoder var mere udtalt end kurstaki's; dette svarer til effekterne overfor æg, som er beskrevet tidligere.

45

Spore spiring I ovenstående undersøgelser er der arbejdet med mere eller mindre op-rensede toksiner. I nogle tilfælde er der anvendt såkaldt toksinberigede fraktioner, hvor sporerne er søgt fjernet ved gradient centrifugeringer. I disse tilfælde kan det ikke udelukkes, at effekterne på nematoderne er forårsaget af en kombination af toksiner og spirede B. thuringiensis celler. I forbindelse med en screening af B. thuringiensis isolater for aktivitet overfor nematoder fandt Borgonie et al. (1995) således spirende sporer i forbindelse med alle 12 arter af nematoder, uanset om spore-krystal blandingen var toksisk for nematoderne eller ej. Hyppigheden af sporespiring var nematodarts afhængig. I en anden rapport (Leyns et al., 1995), testedes aktiviteten af 128 forskellige B. thuringiensis spore-krystal preparationer over for juvenile og voksne Caenorhabditis elegans (en fritlevende nematod). Af de 128 B. thuringiensis isolater viste 109 stort set ingen effekt overfor nematoder, 16 isolater udviste en mortalitet på mellem 10 og 20%, mens tre isolater resulterede i mortaliteter på henholdsvis 21, 47 og 59%. I denne forsøgs-række blev der ikke observeret letale effekter over for nematoders æg. Dette skyldes sandsynligvis, at sporespiring og vækst var inhiberet i forsøgene, idet der var tilsat et antibiotikum. Det er derfor meget sandsynligt, at visse varianter af B. thuringiensis effekt overfor nematoders æg er knyttet til bakteriens spiring og vækst. I overensstemmelse hermed har vi observeret (se bilag 2), at alle afprøvede B. thuringiensis isolater var letale over for voksne Panagrellus redivivus når der ikke var tilsat et antibiotikum, mens kun få bakterier var letale når der var tilsat et antibiotikum.

Specifik aktivitet Flere af de bakterier, som vi har anvendt i testen over for P. redivivus, er tidligere blevet patenteret som B. thuringiensis stammer med en specifik aktivitet overfor nematoder (Edwards et al., 1990). Yderligere en række bakterier og gener med nematicidal aktivitet er søgt patenteret (Narva et al., 1991). Analyserne, som ligger til basis for patentet (Edwards et al., 1990), er blevet foretaget med spore-krystal blandinger, hvor sporene er blevet inaktivteret ved 60Co bestråling. Det fremgår ikke tydeligt af patentet, men vi skønner, at B. thuringiensis døde-sporer-krystal blandingen må have en tæthed på 108-1010 /krystaller per ml for at kunne inaktivere alle nematoderne ved in vitro bioassays. Det er således vist, at der findes specielle varieteter af B. thuringiensis, som udviser en aktivitet overfor nematoder, der er knyttet til specifikke toksiner, hvor man har kendskab til generne som koder for toksinerne. Det er blevet sandsynliggjort, at B. thuringiensis varieteter med gener kodende for disse toksiner er almindeligt forekommende i jord (Hansen et al., 1996).

Krystal proteiner Ved bioassays, med krystalberigede fraktioner, hvor eventuelle sporer er stråledræbte, anvendes omkring 150 nematoder og 100 g protein, hvilket resulterer i en mortalitet på 99-100%. Selv om voluminer ikke er angivet, skønnes det på baggrund af metodebeskrivelserne i andre rapporter ved-rørende B. thuringiensis-nematode bioassays, at proteinkoncentrationen er ca. 1 mg per ml. Disse proteinmænger er i størrelsesordenen 106 gange større end de LD50 værdier som Bottjer et al. (1985) fandt. Dette er endnu et indicium for, at af sporespiring og vækst har betydning for B. thuringiensis effekter på nematoder. Leyns et al. (1995) fandt også, at relativt høje doser er nødvendige for at se effekt på nematoder. Der var ingen effekt med en sporedensitet på 107 per ml, og først ved densiteter på over 108 var der signifikante effekter på nematoderne. Ved disse forsøg blev der, som tidligere nævnt, anvendt antibiotika. I vore egne bioassays blev der også anvendt antibiotika for at forhindre bakterievækst (bilag 2).

In vitro - in vivo Det skal understreges, at hovedparten af data, der er refereret hidtil i dette afsnit, er baseret på in vitro undersøgelser. Bone (1989) fandt, at et kom-

46

mercielt produkt baseret på B. thuringiensis var. israelensis havde lavere nematicidal aktivitet in vivo i mus inficeret med N. brasiliensis end in vitro. Det omvendte forhold gjorde sig gældende for et produkt, hvor toxiciteten var baseret på -exotoksin.

Sprøjte dosis I forbindelse med dosis-aktivitets forhold er det relevant at nævne, at umiddelbart efter kommerciel flysprøjtning af et skovområde i Québec med B. thuringiensis var. kurstaki fandt man 7 x 105 CFU per cm2 skovbund (Cardinal and Marotte, 1987). Ved vore feltforsøg med samme bakterie-type indeholdt sprøjtevæsken 6.5 x 107 CFU per ml, og de højeste antal genfundne bakterier på blade og i jord lige efter sprøjtning var henholdsvis 107 og 104 per gram (Pedersen et al., 1995).

Reel dosis Det skal her understreges, at selv om en sporedensitet på 107 per ml ikke har nogen effekt in vitro er det ikke ensbetydende med, at en langt lavere spo-redensitet pr. gram jord nødvendigvis ikke har aktivitet. Dette skyldes, at vi ikke har et kendskab til sporer og krystallers fordeling i jorden. Hvis f.eks B. thuringiensis primært findes i jordens vandhinder, så vil der i en jord med lavt vandindhold sandsynligvis være høje densiteter af B. thuringiensis i de vandhinder, hvor bakterien findes. Som en konsekvens heraf vil effekten på nematoder in vivo kun kunne bestemmes eksperimentelt. Sådanne undersøgelser er ikke øjensynligt ikke blevet gennemført.

2.2.2 Nematoder og aktinomyceter.Vi har ikke fundet litteratur, der belyser interaktioner imellem aktinomyceter og nematoder, og dermed naturligvis heller ikke angående S. griseoviridis.

45

3 Diskussion og konklusioner.

3.1 Regnorme

VidengrundlagMikrorganismer kan påvirke regnorme på to vidt forskellige måder, dels direkte ved at forårsage sygdom, dels indirekte ved at påvirke faktorer der har betydning for regnormenes livsprocesser.

Med hensyn til B. thuringiensis findes der i litteraturen indikationer for, at nogle stammer kan være direkte patogene overfor regnorme, og at nogle stammer af B. thuringiensis kan påvirke regnorme indirekte. Med hensyn til streptomyceten S. griseoviridis findes der ingen litteratur, der beskæftiger sig med effekter på invertebrater. Med udgangspunkt i den tilgængelige begrænsede viden om andre streptomyceter, forekommer det dog usandsyn-ligt, at denne art er direkte patogen overfor regnorme, hvilket betyder, at eventuelle effekter på regnorme må være af en indirekte karakter.

Litteraturgennemgangen gør det endvidere klart, at såvel den generelle viden om mikroorganismers sygdomsfrembringende evne overfor regnorme, som den mere specifikke viden om enkelte mikroorganismers sygdomsfrembrin-gende egenskaber, er fragmentarisk og utilstrækkelig til at danne et fast videnskabeligt fundament for risikoanalyse. Som en konsekvens af dette findes der ikke standardiserede eksperimentelle koncepter til undersøgelse af mikroorganismers direkte sygdomsfrembringende evne overfor regnorme. Det samme gør sig gældende for eventuelle indirekte effekter på regnorme.

Den tilgængelige viden om B. thuringiensis og S. griseoviridis effekter på regnorme er således utilstrækkelig til at danne et kvalificeret grundlag for vurdering af hvorvidt disse organismer påvirker regnorme under realistiske omstændigheder.

Anbefalinger Med udgangspunkt i ovenstående finder vi det fornuftigt, at der i forbindelse med konkret risikoanalyse af et specifikt mikrobiologisk plante-beskyttelsesmiddel, foreligger undersøgelser der belyser midlets direkte effekt på regnorme. Disse oplysninger er specielt vigtige hvis: a) midlet skal anvendes i miljøet (udendørs), og under omstændigheder hvor det må forventes, at det kan komme til at påvirke regnormepopulationer og b) kend-skab til midlets generelle egenskaber og specielt dets virkningsmekanismer ikke gør en eventuel effekt på regnorme usandsynlig.

Undersøgelserne bør gennemføres på en sådan måde, at de initielt belyser midlets patogene egenskaber overfor regnorme, og dernæst dets invasive egenskaber.

Der bør endvidere foreligge oplysninger om midlets eventuelle indirekte effekter på regnorme i de ovenfor anførte omstændigheder.

Patogenecitet Med hensyn til sygdomsfrembringende egenskaber, da bør det initielt undersøges hvorvidt mikroorganismen er patogen overfor regnorme; dvs, at der skal gennemføres undersøgelser, der påviser hvorvidt mikroorganismen ved en direkte kontakt med regnormen medfører en etablering af en blivende population i coelomvæsken (Dales og Kalaç, 1992), og dermed påvirker

46

regnormes levetid, vækst og/eller fekunditet. I de tilfælde hvor mikroorganismen udviser patogene egenskaber overfor regnorme bør disse undersøgelser suppleres med undersøgelser, der belyser mikroorganismens invasive egenskaber.

Sådanne undersøgelser gennemføres indledningsvist mest enkelt ved hjælp af injektionsteknikken (se bilag 1), hvor definerede (med hensyn til antal, vækstfase og/eller stadium i livscyklus) doser injiceres i regnormen. Det skal belyses hvorvidt mikroorganismen etableres i coelomvæsken, men det vil være hensigtsmæssigt også at bestemme letalitet og f.eks. vækst og reproduktion ved ikke letale doser.

Invasibilitet Hvis disse indledende undersøgelser viser, at mikroorganismen har patogene egenskaber bør dens invasive egenskaber som sagt også undersøges. Til dette formål synes en metode hvor mikroorganismen tilføres fødekilden optimal (se bilag 1). Det bør undersøges hvorvidt mikroorganismen kan detekteres i coelomvæsken, og hvorvidt der er effekter på regnormene. Det vil endvidere være hensigtsmæssigt at inkludere undersøgelser af mikroorga-nismens skæbne i fordøjelsessystemet. I denne forbindelse bør der også indgå undersøgelser af sub-letale doser.

Indirekte effekter Med hensyn til indirekte effekter på regnorme ved anvendelse af mikrobiolo-giske plantebeskyttelsesmidler bør det initielt undersøges, hvorvidt mikroorganismen ved tilsætning af en høj koncentration ("worst-case-sce-nario") til et "regnorme-dyrknings-system" (se bilag 1) påvirker regnorme-nes overlevelse, vækst og/eller fekunditet.

Valg af regnorme Ved undersøgelserne bør der anvendes regnorme, der er almindeligt

forekommende i Danmark. Da de fleste, i denne forbindelse relevante, anvendelser sandsynligvis vil være knyttet til det dyrkede landskab vil det være naturligt at vælge blandt de endogæiske arter, og blandt dem vil den almindeligt forekommende A. caliginosa være et naturligt valg. Da mange mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler vil blive udsprøjtet på plantedele og jordens overflade vil de epigæiske og anecike arter muligvis blive mere udsat for en påvirkning end de endogæiske, og derfor vil det også være for-nuftigt at vælge en art blandt disse to grupper; en art det vil være relativt nemt at holde i laboratoriet, og som er en overgangsform imellem anecike og epigæiske, og som samtidigt er almindeligt forekommende er L. rubellus.

Generelle kriterier Vi finder det ikke muligt, med udgangspunkt i den tilgængelige viden som er opsummeret i denne rapport, at formulere generelle kriterier, som resul-taterne af disse undersøgelser skal opfylde for at det specifikke mikrobiolo-giske plantebeskyttelsesmiddel kan godkendes.

Fremtidige perspektiver Med en passende generelt rettet forskningsindsats, angående mikroorga-nismers effekter på regnorme, vil det være muligt at definere mere spe-cifikke og dermed anvendelige anbefalinger angående undersøgelses meto-der og det vil være muligt, med et sådant udgangspunkt, at formulere generelle kriterier for godkendelse af mikrobiologiske plantebeskyttel-sesmidler.

3.2 NematoderVidengrundlag Den tilgængelige viden angående mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidlers

effekt overfor nematoder er, ligesom for regnorme, særdeles begrænset. Der findes ingen data vedrørende effekter ved anvendelse af S. griseoviridis på

45

nematoder, derimod findes der beskrivelser af direkte effekter af B. thuringiensis på nematoder. Disse effekter synes enten at være en uspecifik effekt forårsaget af vegetative celler af B. thuringiensis eller mere specifikke effekter forårsaget af -endotoxiner. Effekterne er varierende imellem forskellige stammer af B. thuringiensis.

Anbefalinger Det betyder, at det heller ikke med hensyn til nematoder er muligt at formulere specifikke anbefalinger for godkendelse af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Derimod finder vi det muligt at skitsere et test-system, som vil kunne anvendes til identifikation af effekter overfor nematoder ved anvendelse af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Det er vores vurdering at et sådant system ikke bør anvendes i den rutine-mæssige risikoanalyse, men i tilfælde, hvor det vurderes at nematoder er en væsentlig ikke-mål gruppe af invertebrater; f.eks. græs-arealer.

Testsystem Da nematoder er en særdeles varieret gruppe både med hensyn til systematik og med hensyn til biologi, finder vi det hensigtsmæssigt, som et udgangspunkt for risikoanalyse, at der udvikles et generelt screeningssystem for eventuelle effekter forårsaget af mikrobiologiske plantebeskyt-telsesmidler.

Et sådant screeningssystem kunne bestå af små jordcylindre indsamlet på en given naturlig lokalitet. Disse cylindre kunne så "behandles" med et givent bekæmpelsesmiddel. Herefter kunne nematoderne uddrives, tælles og henføres til systematiske eller biologiske hovedgrupper. Dette ville give mulighed for at vurdere hvorvidt nematoder generelt eller blot en hovedgruppe af nematoder kunne påvirkes af bekæmpelsesmidlet.

I tilfælde hvor screeningssystemet sandsynliggør en effekt vil det være rimeligt at analysere sammenhængen nærmere i bioassay med en eller flere relevante nematod-arter, som kan dyrkes i laboratoriet.

Det vil, på grund af nematodernes størrelse, ikke være muligt at adskille mikroorganismernes direkte patogene- og invasive-egenskaber.

46

Referencer

Addison, J.A. (1993): Persistence and nontarget effects of Bacillus thurin-giensis in soil: a review. Canadian Journal of Forest Research 23: 2329-2342.

Andersen, C. (1983): Nitrogen turnover by earthworms in arable plots treated with farmyard manure and slurry. I Satchell, J. (ed.) "Earthworm Ecology", Chapman and Hall: 139-150.

Andersen, C. (1987): Investigations of the ecology of earthworms (Lum-bricidae) in arable soil. Statens Planteavlsforsøg, Beretning nr. S 1871: 1-195.

Atlavinyté, O., Galvelis, A., Daciulyté, J. & Lugaukas, A. (1982): Effects of entobacterin on earthworm activity. Pedobiologia 23: 372-379.

Benz, G. & Altwegg, A. (1975): Safety of Bacillus thuringiensis for earthworms. Journal of Invertebrate Pathology 26: 125-126.

Bone, L.W., Bottjer, K.P., & Gill, S.S. (1986): Trichostrongylus colubri-formis: Isolation and characterization of ovicidal activity from Bacillus thuringiensis israelensis. Experimental Parasitology 62: 247-253.

Bone, L.W., Bottjer, K.P., & Gill, S.S. (1987): Alteration of Trichostron-gylus colubriformis egg permeability by Bacillus thuringiensis israelensis toxin. The Journal of Parasitology 73: 295-299.

Bone, L.W. (1989): Activity of commercial Bacillus thuringiensis prepara-tions against Trichostrongylus colubriformis and Nippostrongylus brasilien-sis. Journal of Invertebrate Pathology 53: 276-277.

Borgonie, G., van Driessche, R., Leyns, F., Arnaut, G., de Waele, D., & Coomans, A. (1995): Germination of Bacillus thuringiensis spores in bacteriaophagous nematodes (Nematoda: Rhabditida). Journal of Inverte-brate Pathology 65: 61-67.

Bornebusch, C.H. (1928): De danske Regnorme. Flora og Fauna 3: 65-92.

Bornebusch, C.H. (1930): The Fauna of Forest Soil. Forstlige Forsøgs-væsen, Danmark, 11: 1-224.

Bottjer, K.P., Bone, L.W., & Gill, S.S. (1985): Nematoda: Susceptibility of the egg to Bacillus thuringiensis toxins. Experimental Parasitology 60: 239-244.

Bouché, M.B. (1972): Lombriciens de France. Ecologie et Systématique. Institut National de la Recherche Agronomique, Paris. 1-671.

Brown, G.G. (1995): How do earthworms affect microfloral and faunal community diversity ? Plant and Soil 170: 209-231.

45

Brüsewitz, G. (1959): Untersuchungen über den Einfluss des Regenwurms auf Zahl und Leistungen von Mikroorganismen im Boden. Archives für Mikrobiologie 33: 52-82.

Cameron, G.R. (1932): Inflammation in earthworms. Journal of Pathogen Bacteria 35: 933-972.

Cardinal, P. A. & Marotte, P.-M. (1987): Persistance des spores de Bacillus thuringiensis dans le sol forestier suite aux pulvérisations aériennes contre la tordeuse des bourgeons de l´épinette au Québec en 1984. Gouvernement du Québec, Ministère de l´Energie et des Ressources, Direction de la Conservation, Québec.

Christensen, O.M. & Mather, J.G. (1994): Earthworms as ecotoxocological testorganisms. Bekæmpelsesmidddelforskning fra Miljøstyrelsen 5.

Clausen, M.W. (1993): Regnorme. Danmarks Fauna 84, Dansk Natur-historisk Forening: 1-176.

Clegg, C.D., Anderson, J.M., Lappin-Scott, H.M., VanElsas, J.D. & Jolly, J.M. (1995): Interaction of a genetically modified Pseudomonas fluorescens with the soil-feeding earthworm Octolasion cyaneum (Lumbricidae). Soil Biology and Biochemistry 27: 1423-1429.

Contreras, E. (1980): Studies on the intestinal actinomycete flora of Eisenia lucens. Pedobiologia 20: 411-416.

Çotyk A. og Dales, R.P. (1984): The effect of the coelomic fluid of the earthworm Eisenia foetida Sav. on certain bacteria and the role of the coelomocytes in internal defence. Comparative Biochemistry and Physio-logy 78A: 271-275.

Çotyk, A. & Kalaç, Y. (1990): Response of the earthworm Dendrobaena venata to bacterial infection. I Lésel, R. (ed.): Microbiology in poecilot-herms, Elsevier Science Publishers: 245-248.

Dales, R.P. & Kalaç, Y. (1992): Phagocytic defence by the earthworm Eisenia foetida against certain pathogenic bacteria. Comparative Bi-ochemistry and Physiology 101A: 487-490.

Daniel, O. & Anderson, J.M. (1992): Microbial biomass and activity in contrasting soil materials after passage through the gut of the earthworm Lumbricus rubellus Hoffmeister. Soil Biology and Biochemistry 24, 465-470.

Darwin, C. (1881): The formation of vegetable mould through the action of worms, with observations of their habits, Murray, London: 1-326.

Dash, M.C., Mishra, P.C. & Behera, N. (1979): Fungal feeding by a tropical earthworm. Tropical Ecology 20: 9-12.

Day, G.M. (1950): The influence of earthworms on soil micro-organisms. Soil Science 69: 175-184.

Devliegher, W. & Verstraete, W. (1995): Lumbricus terrestris in a soil core experiment: Nutrient-enrichment processes (NEP) and gut-associated

46

processes (GAP) and theier effect on microbial biomass and microbial activity. Soil Biology and Biochemistry 27: 1573-1580.

Domsch, K.H. & Banse H-J. (1972): Mykologische Untersuchungen an Regenwurmexkrementen. Soil Biology and Biochemistry 4: 31-38.

Doube, B., Stephens, P.M., Davoren, C.W. & Ryder, M.H. (1994): Interactions between earthworms, beneficial soil microorganisms and root pathogens. Applied Soil Ecology 1: 3-10.

Ellar, D.J (1990):Pathogenicity determinants of entomopathogenic bacteria. Proceedings and abstracts, Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control, Adelaide, Australia: 298-302.

Edwards, C.A. & Lofty, J.R. (1977): Biology of Earthworms, Chapman and Hall: 1-333.

Edwards, C.A. & Fletcher, K.E. (1988): Interactions between Earthworms and Microorganisms in Organic-matter Breakdown. Agriculture, Ecosystems and Environment 24: 235-247.

Edwards, D.L., Payne, J., & Soares, GG. (1990): Novel isolates of Bacillus thuringiensis having activity against nematodes. United States Patent no 4948734. 5 pp.

Fischer, K., Hahn, D., Amann, R.I., Daniel, O. & Zeyer, J. (1995): In situ analysis of the bacterial community in the gut of the earthworm Lumbricus terrestris L. by whole-cell hybridization. Canadian Journal of Microbiology 41: 666-673.

Gjelstrup, P. & Hendriksen, N.B. (1991): Histiostoma murchiei Hughes and Jackson (Anoetidae) as a parasite in the cocoons of some Danish earthworms. I Schuster, R. & Murphy, P.W. (eds.): The Acari, Repro-duction, development and life history strategies, Chapman and Hall: 441-445.

Griffiths, B.S. (1994): Microbial-feeding nematodes and protozoa in soil: Their effects on microbial activity and nitrogen mineralization in decom-position hotspots and the rhizosphere. Plant and Soil 164: 25-33.

Hansen, B.M., Damgaard, P.H., Eilenberg, J. & Pedersen, J.C. (1996): Bacillus thuringiensis. Ecology and Environmental Effects of its Use for Microbial Pest Control. Miljøprojekt nr. 316, Miljøstyrelsen, Energi- og Miljø Ministeriet.

Heimpel, A.M. (1966): A Crystalliferous Bacterium Associated with a "Blister Disease" in the Earthworm, Eisenia foetida (Savigny). Journal of Invertebrate Pathology 8: 295-298.

Heijnen, C.E. & Marinissen, J.C.Y. (1995): Survival of bacteria introduced into soil by means of transport by Lumbricus rubellus. Biology and Fertility of Soils 20: 63-69.

Hendriksen, N.B. (1991): Consumption and utilization of dung by detriti-vorous and geophagous earthworms in a Danish pasture. Pedobiologia 35: 65-70.

45

Hendriksen, N.B. (1995): Effects of detritivore earthworms on dispersal and survival of the bacterium Aeromonas hydrophila. Acta Zoologica Fennica 196: 115-119.

Hendriksen, N.B. (1996): Earthworm effects on respiratory activity in a dung-soil-system. Soil Biology and Biochemistry: In press.

Henschke, R.B. & Schmidt, F.R.J. (1989): Fate and dispersal of recombinant bacteria in a soil microcosm containing the earthworm Lumbricus terrestris. Biology and Fertility of Soils 8: 374-376.

Holter, P. (1979): Effect of dung-beetles (Aphodius spp.) and earthworms on the disapearance of cattle dung. Oikos 32: 393-402.

Holter, P. (1983): Effect of earthworms on the disappearance of cattle droppings. I Satchell, J.E. (ed.): Earthworm Ecology, Chapman and Hall: 49-57.

Ignoffo, C.M. & Dropkin, V.H. (1977): Deleterious effects of the ther-mostable toxin of Bacillus thuringiensis on species of soil-inhabiting, myceliophagus, and plant.parasitic nematodes. Journal of the Kansas Entomological Society 50: 394-398.

Jolly, J.M., Lappin-Scott, H.M., Anderson, J.M. & Clegg, C.D. (1993): Scanning Electron Microscopy of the Gut Microflora of Two Earthworms: Lumbricus terrestris and Octolasion cyaneum: Microbial Ecology 26: 235-245.

Korn-Wendisch, F. & Kutzner, H.J. (1992): The Family Streptomycetaceae. I Balows, A., Trüper, H.G., Dworkin, M., Harder, W. & Schleifer, K-H. (eds.): The Prokaryotes, Springer-Verlag: 921-995.

Kristufek, V., Pizl, V. & Szabo, I.M. (1990): Composition of the intestinal Streptomycete community of earthworms (Lumbricidae). I Lésel, R. (ed.): Microbiology in poecilotherms: 137-140.

Kristufek, V., Ravasz, K. & Pizl, V. (1993): Actinomycete communities in earthworm guts and surrounding soil. Pedobiologia 37: 379-384.

Larink, O. & Kula, H. (1995): Sublethal toxicity tests with earthworms (Annelida: Oligochaeta): I Kula, H., Heimbach, U. & Løkke, H. (eds.): Secofase, Third Technical Report: 45-61.

Lee, K.E. (1985): Earthworms, Their Ecology and Relationships with Soils and Land Use, Academic Press. 1-411.

Leyns, F., Borgonie, G., Arnaut, & de Waele, D. (1995): Nematicidal activity of Bacillus thuringiensis isolates. Fundam. Appl. Nematol. 18: 211-218.

Lisansky, S.G., Quinlan, R. & Tassoni, G. (1993): The Bacillus thuringi-ensis production handbook. Laboratory methods, manufacturing, formula-tion, quality control, registration. CPL Scientific Limited.

Lübeck, M. (1994): Toksiske metabolitter fra udvalgte mikroorganismer. Arbejdsrapport nr. 18, Miljøstyrelsen, Energi- og Miljø Ministeriet.

46

Marialegeti, K. (1979): On the community-structure of the gut-microbiota of Eisenia lucens (Annelida, Oligochaeta). Pedobiologia 19, 213-220.

Martin, M.M. (1983): Cellulose digestion in insects. Comparative Bi-ochemistry and Physiology 75A: 313-324.

Meadows, J., Gill, S.S., & Bone, L.W. (1990): Bacillus thuringiensis strains affect population growth of the free-living nematode Turbatrix aceti. Invertebrate Reproduction and Development 17: 73-76

Müller, P.E. (1878): Studier over Skovjord. 1. Om Bøgemuld og Bøgemor på Sand og Ler. Tidsskrift for Skovbrug 3: 1-124.

Narva, K.E., Payne, J.M., Schwab, G.E., Hichle, L.A., Galasan, T., & Sick, A.J. (1991): Novel Bacillus thuringiensis microbes active against nematodes, and genes encoding novel nematode-active toxins cloned from Bacillus thuringiensis isolates. European Patent Application number 91305047.2, 47 pp.

Nicholas, W.L. (1975): The biology of free-living nematodes, Clarendon Press: 1-219.

Nielsen, C.O. (1949): Studies on the soil microfauna II. Natura Jutlandica 2: 1-131.

Parle, J.N. (1963): Micro-organisms in the intestines of earthworms. Journal of General Microbiology 31: 1-11.

Pedersen, J.C. & Hendriksen, N.B. (1993): Effect of passage through the intestinasl tract of detritivore earthworms (Lumbricus spp.) on the number of selected Gram-negative and total bacteria. Biology and Fertility of Soils 16: 227-232.

Pedersen, J.C., Damgaard, P.H., Eilenberg, J., & Hansen, B.M. (1995): Dispersal of Bacillus thuringiensis var. kurstaki in and experimental cabbage field. Canadian Journal of Microbiology 41: 118-125.

Petersen, A. (1995): Konjugation og regnorme: Speciale, Københavns Universitet.

Prasad, S.S.S.V., Tilak, K.V.B.R., & Gollakota, K.G. (1972): Role of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis on the larval surviability and egg hatching of Meloidogyne spp., the causative agent of root knot disease. Journal of Invertebrate Pathology 20: 377-378.

Rao, B.R., Sagar, I.K. & Bhat, J.V. (1983): Enterobacter aerogenes infection of Hoplochaetella suctoria. I Satchell, J.E. (ed.): Earthworm Ecology, Chapman and Hall: 383-391.

Ravasz, K. & Tóth, L. (1990): Studies on the gut actinomycete population of Eisenia fetida (Savigny)(Oligochaeta: Lumbricidae): I Lésel, R. (ed.): Microbiology in poecilotherms: 141-144.

Roch, P. (1980): Analyses in vitro du rôle des leucocytes au cours des résponses immunitaires chez un invertébré le lombrcien Eisenia fetida andrei. Thèse l'Université de Bordeaux I, 648: 1-156.

45

Satchell, J.E. (1983): Earthworm microbiology. I Satchell, J.E. (ed.): Earthworm Ecology, Chapman and Hall: 351-364.

Scheu, S. (1987): Microbial activity and nutrient dynamics in earthworm casts (Lumbricidae): Biology and Fertility of Soils 5: 230-234.

Scheu, S. (1991): Mucus excretion and carbon turnover of endogeic earthworms: Biology and Fertility of Soils 12: 217-220.

Smirnoff, W.A. & Heimpel, A.M. (1961): Notes on the pathogenicity of Bacillus thuringiensis Berliner for the earthworm Lumbricus terrestris Linnaeus: Journal of Insect Pathology 3: 403-408.

Tanada, Y. & Kaya, H.K. (1993): Insect pathology, Academic Press: 1-666.

Thorpe, I.S., Killham, K., Prosser, J.I. & Glover, C.A. (1993): Novel method for the study of the population dynamics of a genetically modified microorganism in the gut of the earthworm Lumbricus terrestris: Biology and fertility of Soils 15: 55-59.

Vakili, N.G. (1993): Exophiala jeanselmei, a pathogen of earthworm species. Journal of Medical and Veterinary Mycology 31: 343-346.

Valembois, P., Roch, P. & Lassègues, M. (1986): Antibacterial Molecules in Annelids: I Brehélin, M.: Immunity in invertebrates, Springer-Verlag: 74-93.

Vinceslas-Akpa, M. & Loquet, M. (1995): Observation in situ de la microflore liée au tube digestif de Eisenia fetida andrei (Lumbricidae). European Journal of Soil Biology 31: 101-110.

Wharton, D.A. & Bone, L.W. (1989): Bacillus thuringiensis israelensis toxin affects egg-shell ultrastructure of Trichostrongylus colubriformis (Nematoda). Invertebrate Reproduction and Development 15: 155-158.

Winding, A., Rønn, R. & Hendriksen, N.B. (1996): Bacteria and protozoa in soil as affected by earthworms: Biology and Fertility of Soils (Accepteret for publikation).

Zachmann, J.E. & Molina, J.A.E. (1993): Presence of culturable bacteria in cocoons of the earthworm Eisenia fetida: Applied and Environmental Microbiology 59: 1904-1910.

Zhang, B.G., Rouland, C., Lattaud, C. & Lavelle, P. (1993): Activity and origin of digestive enzymes in gut of the tropical earthworm Pontoscolex corethrurus. European Journal of Soil Biology 29: 7-11.

46

Bilag 1

Metoder til undersøgelse af mikroorganismers effekt på regnorme.

I det følgende vil der blive givet en kort beskrivelse af metoder, der har været eller vil kunne benyttes til at studere mikroorganismers effekt på regnorme.

Metoder med direkte kontakt imellem regnorme og mikroorganisme.

1. Injektion i coelomet.

Direkte injektion i coelomvæsken af en lille mængde væske indeholdende mikroorganismen er en metode der er blevet anvendt i en række undersø-gelser af bakteriers patogenecitet (Valembois et al., 1982; Çotyk og Kataç, 1990).

Proceduren kan principielt udføres på alle regnorme, men det er nok nemmest på de lidt større arter. Alle mikroorganismer, der kan dyrkes i kultur, kan principielt benyttes.

2. Injektion i svælget.

En metode til indførsel af bakterier i svælget på O. tyrtaeum og L. festivus er beskrevet (Thorpe et al., 1993; Petersen, 1995).

Proceduren kan principielt udføres på alle regnorme, men det er sandsyn-ligvis vanskeligt at benytte metoden på små arter eller individer. Alle mikroorganismer, der kan dyrkes i kultur, kan principielt benyttes

3. Pensling af overfladen.

Rao et al. (1983) benyttede en steril svaber til at pensle regnormes overflade med en suspension af bakterier. Kan udføres på alle regnorme. Alle mikroorganismer der kan dyrkes i kultur kan principielt benyttes; det vil være vanskeligt at give en præcis definition af dosis.

Disse tre metoder, hvor regnormens død primært har været målepunktet, kan også benyttes ved undersøgelser med andre mål, hvis regnormene efter applikationen af mikroorganismen placeres under omstændighder, hvor de kan udvise normal aktivitet.

45

Metoder hvor mikroorganismer tilføres regnormes føde-kilde.

1. Fødekilden lægges på jordoverfladen.

Regnorme holdes i spande med en defineret sigtet jord, en knust fødekilde (kogødning) lægges på overfladen. Mikroorganismerne blandes i fødekilden (Pedersen og Hendriksen, 1993; Hendriksen, 1995).

Er primært velegnet til epigæiske og anecike regnorme, især vil de mindre arter være velegnede. Alle mikroorganismer, der kan dyrkes i kultur, kan principielt benyttes; det er nødvendigt at kende mikroorganismens "skæbne" i fødekilden og muligvis jorden for at kunne definere dosis.

2. Fødekilden tilføres jorden.

Regnorme holdes i spande med en defineret sigtet jord. Fødekilden, der består af et findelt organisk materiale (kogødning, hø), blandes ned i jorden. Mikroorganismen til-sættes fødekilden før nedblanding (Baseret på Larink og Kula (1995), Winding (upubl).

Er primært velegnet til endogæiske arter. Alle dyrkbare mikroorganismer kan benyttes; det er nødvendigt at kende mikroorganismens skæbne i fødekilde og jord for at definere dosis.

Begge metoder kan benyttes til studie af f.eks. regnormes vækst og repro-duktion.

Metoder hvor mikroorganismen tilføres mediet hvori regnorme dyrkes.

1. Test i "kunstig" jord.

Regnorme holdes i en kunstig jord (OECD-guideline no. 207) Mikroor-ganismer kan homogent tilføjes jorden.

Er sandsynligvis primært velegnet for E. foetida, men andre epigæiske arter kan muligvis anvendes. Alle dyrkbare mikroorganismer kan anvendes; det er nødvendigt at kende mikroorganismens skæbne i jorden for at definere dosis.

2. Mikroorganismen tilføres jorden.

De to metoder beskrevet tidligere, hvor mikroorganismen tilføjes fødekilden kan også gennemføres med organismen tilført jorden.

46

Bilag 2

Effekten af udvalgte Bacillus thuringiensis stammer på nematoden Panagrellus redivivus i et simpelt testsystem.

Baggrund

På basis af DNA sekvenser for gener (Narva et al., 1991), som koder for nematicidale proteiner, fik vi fremstillet en række primersæt med henblik på diagnosticering af nematicidale egenskaber ved hjælp af PCR. Vi fandt ved PCR screening af en samling af B. thuringiensis/B. cereus fra jord, at omkring 50% af isolaterne var positive for et af de nematicidale gener. Med basis i denne observation indarbejdede vi et bioassay med henblik på testning af B. thuringiensis effekter på den fritlevende nematod Panagrellus redivivus, som kan dyrkes sterilt på kunstigt substrat.

Metoder

Panagrellus redivivus. En steril kultur af P. redivivus blev stillet til rådighed af Jørgen Grønvold, KVL. P. redivivus tilhører en slægt, som kan findes i medier, hvor der sker fermentative forandringer under produktion af syre (Goodey, 1963). Dyrkningsmediet indeholder 4 gram Bacto-Soytone og 2,3 gram Bacto-Liver, som suspenderes i 100 ml sterilt vand. Af denne suspension overføres 10-15 ml til sterile 100 ml bluecap flasker. Der auto-klaveres 7 min i Certoklave (Certoclave muliggør reducering af opholdstid ved høje temperaturer). Mediet opbevares i køleskab. Nematodkulturen opretholdes ved overførsel hver 2.-6. uge af ca 1 ml gammel kultur til nyt medie, og der inkuberes mørkt ved stuetemperatur. Langtidsopbevaring af nematodkultur kan ske ved 4-15C. Nematoderne klargøres til bioassay ved en række trin, hvor der anvendes sterile glasvarer, filtre og PBS (per liter:8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4,0.24 g KH2PO4, pH 7.0, autoklaveres 20 min.).

Ved hjælp af henstand/dekantering og filtreringer er det muligt at opnå en stort set homogen population af voksne nematoder: En ca. to uger gammel kultur fortyndes 5 gange med PBS, omrystes og henstår 5 min indtil de største nematoder er søgt til bunden, hvorefter så meget som muligt af væsken hældes bort. Denne fortynding-henstand-dekantering gentages yderligere mindst to gange. Et filter med netstørrelse på 0.04 mm anbringes i bægerglas, og nematodkulturen hældes i filtret, hvorved små nematoder og æg passerer filtret, mens store nematoder tilbageholdes. De tilbageholdte nematoder skylles 2-3 gange med PBS i filteret. Med pipette overføres nematoderne til et 0,2 mm filter i et bægerglas. Levende nematoder søger gennem filteret, mens døde nematoder forbliver inde i filtret. Filtreringen

45

gentages. Nematoddensiteten bestemmes ved hjælp af stereolup. Der tilstræbes en densitet på 10 nematoder pr 50 l PBS.

B. thuringiensis krystal-spore preparation. Bakterierne, som er angivet i Tabel 1, blev udpladet på T3 plader (Travers et al., 1987), inkuberet ved 30C i 3-4 døgn indtil sporulering og krystalproduktion. Med steril podenål afskrabes bakterier, som overføres og resuspenderes i Eppendorf rør med 1 ml PBS med 1 mM dithiothreitol (DTT). Bakterier centrifugeres ned, supernatant fjernes og pellet resuspenderes i PBS med 1 mM DTT. Bakteriesuspensionernes densitet bestemmes ved tælling i et Bürker-Türk tællekammer (dybde 0,01 mm), hvorefter bakteriedensiteten indstilles til 109/ml i alle preparationerne.

Bioassay. Den oprensede nematodfraktion tilsættes teracyclin og chlor-amphenicol, begge til en koncentration på 45 g/ml. Under konstant omrystning udtages 50 l oprensede nematoder, som overføres til brøndene i 96-huls mikrotiter plader. For hver bakterie anvendes tre brønde. Antal levende/døde nematoder optælles før tilsætning af bakterier. Til hver brønd blev tilsat 25 l bakteriesuspension, hvorved der opnås en densitet på 3,3x108/ml, og antibiotika koncentrationen er nu 30 g/ml. Som kontrol til-sættes 25 l PBS med 1 mM DTT til 3x3 brønde med nematoder. Antal levende/døde nematoder blev optalt efter 24, 48, 72, 96 og 168 timer.

Resultater og diskussion

Klargøring af nematoder. Ved et kvantitativt assay med dyrkede nemato-der er der umiddelbart to praktiske problemer. For det første er det nød-vendigt, at kun relativt få nematoder inkuberes i hver brønd, eftersom deres bevægelsesaktivitet vanskeliggør optælling. For det andet er det nødvendigt at fraktionere nematodpopulationen. I de indledende forsøg, hvor vi anvend-te ufraktioneret kultur, viste det sig, at vi med tiden så flere og flere levende nematoder. Dette skyldes, at nematoder, som var meget små, ikke blev talt med ved forsøgsstart, men først senere efter vækst. Dette forhold nødvendig-gjorde, at forsøgene gennemførtes med store nematoder.

Vi valgte at anvende de voksne nematoder, dels fordi de er størst, men også fordi de bevæger sig relativt langsommere end larvestadierne. Ved den beskrevne fraktioneringsprocedure opnåede vi ved gentagen fortynding og dekantering, at æg og hovedparten af de døde nematoder blev fjernet. Ved filtrering gennem et 0,02 mm filter blev stort set alle små nematodstadier fjernet, og ved den afsluttende filtrering gennem et 0,2 mm filter blev næsten alle de resterende døde nematoder fjernet.

46

Tabel 1Bacillus isolater anvendt ved nematod bioassay

B. thuringiensis DMU no. Beskrivelse

334363839113114115116117118119120121122123124125193194195196198a198b199200202204208211212213214215216222223229231242243312313326328331346

kurstaki HD-73tenebrionis NB-125israelensisdansk bladisolat, DMU 1992roskildiensis H 45PS 17, Mycogen1

PS 32 F2, doPS 63 B, doPS 52 A1, doPS 69 D1, doPS 80 JJ1, doPS 158 D5, doPS 167 P, doPS 169 E, doPS 177 F1, doPS 177, doPS 204 G4, doPS 204 G6, dodansk jordisolat med Bt/Bc morfologi2, DMU 19933

do3

do3

do3

dodododo3

dododo3

do3

do3

dodo3

do3

do3

do3

do3

dodo3

do3

do3

DBt 243, dansk kålbladsisolat, KVLDBt 244, doDBt 247, doDBt 249, doDBt 227, doDBt 350, do

1: Patentbeskyttede stammer med aktivitet over for nematoder (Edwards et al., 1990; Narva et al., 1991)2: Bt/Bc morfologi: Der er ikke analyseret for -endotoxin produktion, hvorfor der ikke kan skelnes mellem B. thuringiensis og B. cereus3: PCR analyser viser samme nematicidale gen som den patenterede B. thuringiensis no 114.

Effekt på P. redivivus. Ved indledende forsøg uden anvendelse af antibi-otika eller med 15 g/ml tetracyclin og chloramphenicol fandt vi, at alle B. thuringiensis isolaterne var letale over for P. redivivus. I begge situationer var det tydeligt at der skete mikrobiel vækst. Med 30 g/ml af de to antibiotika blev der ikke observeret synlig bakterievækst i syv døgn, og effekten på nematoderne var nu afhængig af B. thuringiensis isolatet, sandsynligvis mere præcist den producerede protein krystal. Dette forhold tyder på, at alle vegetativt voksende B. thuringiensis isolater er toksiske overfor P. redivivus, og at krystal toksinerne på den anden side ikke virker generelt. Effekten af de 47 B. thuringiensis isolater på P. redivivus fremgår af diagrammerne i Fig 1, A-F, hvor de fyldte søjler repræsenterer levende nematoder, mens de døde er repræsenteret ved tomme søjler. I Fig 2 A-J er vist udvalgte bakteriers effekt på P. redivivus som funktion af tiden.

45

De tre første B. thuringiensis isolater i Fig 1 repræsenterer de tre mest kommercielt anvendte B. thuringiensis med aktivitet over for henholdsvis sommerfugle (nr. 3), biller (nr. 34) og myg (nr.36). De to næste (38, 39) er danske bladisolater med ukendt aktivitet. De tretten næste (113-125) er patenterede B. thuringiensis isolater med nematicidal aktivitet. De følgende 23 isolater (193-243) er isoleret fra jord udelukkende på basis af koloni-morfologi. Seksten ef disse isolater er ved hjælp af PCR fundet at indeholde det samme nematicidale gen som den patenterede B. thuringiensis nr 114 (resultat er ikke vist). De sidste seks isolater (312-346), som ikke har kendte aktiviteter, er fundet på kålblade.

Allerede efter 24 timer (Fig 1B og Fig 2F) er det klart, at isolat 118 har høj letal aktivitet over for P. redivivus, men også isolaterne 113 (Fig 2E), 120 og 124 har resulteret i stor andel af døde nematoder. Efter 72 timer ses i Fig 1D, at ud over 113, 118, 120 og 124 har også 116, 121, 122, 123, og 125 aktivitet over for P. redivivus. De nematicidale isolater 114, 115, 117 og 119 (Fig 2G) virker ikke toksisk over for P. redivivus. Det samme gør sig gældende for de øvrige isolater i undersøgelsen. Det skal bemærkes, at det patenterede isolat 114 ikke har effekt på P. redivivus, hvilket også er tilfældet for jordisolaterne, som indeholder samme gen som isolat 114. Aflæsningerne efter 96 og 168 timer bærer præg af begyndende uspecificitet, hvilket sandsynligvis skyldes uspecifikke dødsfald grundet alderdom, for stor tæthed af nematoder samt begyndende inaktivering af antibiotika, med sporespiring og vegetativ B. thuringiensis vækst som følge. Dette er illustreret i Fig 2I med isolat 222 og i Fig 2J som er en kontrol uden bakterier. Begge inkubationer indeholdt 29 nematoder, og i begge tilfælde ses begyndende dødsfald blandt nematoderne i slutningen af undersøgelsesperioden, men denne tendens er stærkere når nematoderne har været inkuberet sammen med bakterie-sporer. I Fig 1F ses, at i de to kontrol-inkubationer (c2 og c3), hver med kun 4 nematoder, har alle nematoder overlevet

46

45

46

45

46

Resumé

Med henblik på hurtigt at kunne afgøre om et givet Bacillus thuringiensis isolat er toksisk over for nematoden Panagrellus redivivus har vi indarbejdet et simpelt in vitro bioassay. For at simplificere optælling af levende og døde nematoder foretages en fraktionering af nematodkulturen, som anvendes. Ved hjælp af dekanteringer og filtreringer er det muligt at opnå en fraktion, som næsten udelukkende indeholder de største nematoder, mens diverse lar-vestadier, æg og døde nematoder er fjernet

Alle 47 undersøgte B. thuringiensis isolater er i den vegetative vækstform toksiske over for den fritlevende nematod Panagrellus redivivus. Hvis vegetativ bakterievækst forhindres med antibiotika, udviser kun et mindre antal af de undersøgte isolater toksiske effekter over for nematoden. Ingen af de kommercielt anvendte isolater på spore-krystal-form viste aktivitet over for P. redivivus, hvilket også var tilfældet med de danske jord- og blad isolater.

Referencer

Edwards, D.L., Payne, J., and Soares, GG., 1990. Novel isolates of Bacillus thuringiensis having activity against nematodes. United States Patent no 4948734. 5 pp.

Goodey, T., 1963. Soil and Freshwater Nematodes. Methuen & Co, London. 544 pp.

Narva, K.E., Payne, J.M., Schwab, G.E., Hichle, L.A., Galasan, T., and Sick, A.J., 1991. Novel Bacillus thuringiensis microbes active against nematodes, and genes encoding novel nematode-active toxins cloned from Bacillus thuringiensis isolates. European Patent Application number 91305047.2, 47 pp.

Travers, R.S., Martin, P.A.W., and Reichelderfer, C.F., 1987. Selective process for efficient isolation of soil Bacillus spp. Applied and Environ-mental Microbiology 53: 1263-1266.

45

Bilag 3

Detektion af Streptomyces griseoviridisBaggrund

Ved undersøgelse af effekter ved brug af mikrobiologiske bekæmpelses-midler er det nødvendigt at kunne genkende og detektere organismerne efter udsættelse. S. griseoviridis udgør den aktive mikrobielle komponent i det svampeantagoniske plantebeskyttelsesmiddel “Mycostop”. Taksonomisk placeres S. griseoviridis inden for streptomyceterne i gruppe 17 (S. griseo-viridis gruppen) (Williams et al., 1983). Ud over S. griseoviridis indeholder denne gruppe fem andre arter af streptomyceter. Ifølge Williams et al. (1983) er dannelse af røde sporer karakteristiskt, men ikke unikt, for denne gruppe. Et andet karakteristika, som deles med gruppe 16, er evnen til at vokse på 0,01 % (w/v) natrium acid. Herudover forefindes i de forskellige streptomycet grupper et vist, dog varierende, niveau af rifampicin resistens. Ingen af disse karakteristika er imidlertid unike, og den røde sporefarve optræder først efter 3 ugers inkubering. Ud over fænotypiske karakteristika er der også mulighed for at anvende genetiske karakteristika. Eftersom der stort set ikke foreligger genetiske data og DNA sekvenser for S. griseoviridis er det oplagt at undersøge mulighederne for at anvende en DNA karakteriserings metode som “random amplified polymorphic DNA” (RAPD) eller forsøge at anvende de generelle data som forefindes ved-rørende sekvenserne af de ribosomale RNA gener. Der foreligger enkelte undersøgelser vedrørende streptomyceters ribosomale RNA sekvenser og mulighederne for at anvende disse som identifikationssystem for strepto-myceter. Stackebrandt et al. (1991) anvender syntetiske oligonukleotider som hybridiseringsprober og kan ud af 62 streptomycet isolater begrænse antal mulige S. griseoviridis kandidater til tre ved hjælp af to prober. Mehling et al. (1995) anvender en PCR baseret metode i kombination med “restriction fragment length polymorphism” (RFLP) til at kunne skelne 33 streptomyceter på 16S ribosomal DNA sekvensforskelle. Endelig er der mulighed for at anvende DNA spacer sekvensen mellem generne for 16S og 23S ribosomale RNA. Dette sekvensområde varierer med hensyn til antal basepar, og det har vist sig anvendeligt ved typning og identifikation af bakterier (Jensen et al., 1993; Gürtler and Stanisich, 1996).

Metoder

Bakteriestammer. Der er blevet anvendt en række forskellige streptomy-ceter repræsenterende forskellige grupper, jævnfør Williams et al. (1983). Herudover er der afprøvet Bacillus subtilis som repræsentant for en anden Gram-positiv bakterie. Bakterierne er angivet i Tabel 1. Da det endelige formål med at selektere for streptomyceter er at blive i stand til at genfinde udsatte S. griseoviridis i jord, er der også anvendt mikroorganismer ekstraheret fra jord i medieoptimeringsproceduren. Bakterier dyrkes ved 25C.

Substrat baseret selektion. Indledningsvis blev det undersøgt om det var muligt at anvende den røde sporefarve som selektivt kriterie på ISP4

46

substratet (Shirling and Gottlieb, 1966). Derefter blev der afprøvet tre forskellige streptomycet selektive substrater i forskellige kombinationer med rifampicin, natrium azid og Delvocid (natamycin-lactose, 1:1) med henblik på at optimere det selektive pres for S. griseoviridis. De tre substrater som blev afprøvet var: Starch-casein-KNO3 (sta-cas),Glycerol-arginin (gly-arg) og raffinose-histidin (raf-his) (Korn-Wendisch and Kutzner,1992). I en række efterfølgende forsøg blev der optimeret for følgende parametre:

-Bakterier (jvf tabel 1) og jordmikroorganismer-sat-cas og gly-arg substraterne-0, 25 og 50 g/ml rifampicin-0, 0.00125, 0.0025, 0.0050, 0.0075 og 0.01 % natrium-azid-0, 50 og 100 g/ml Delvocid

Tabel 1Anvendte bakterier

Bakterie1 Gruppe nr2 Samlings nr.

S. albidoflavusS. albusS. aureofaciensS. brasiliensisS. chromofuscusS. chryseusS. cyaneusS. daghestanicusS. diastaticusS. exfoliatusS. griseocarneusS. griseoflavusS. griseoruberS. griseoviridisS. griseoviridisS. lavendulaeS. lydicusS. murinusS. olivaceoviridisS. rocheiS. rosaS. roseoS. saraceticusS. spiralisS. ambofaciensB. subtilis

1A16142015171817195553721171761291720121717292023

DSM49455*-ATCC25422DSM40313*-ATCC25426 DSM40127*-ATCC25426DSM43159*-ATCC23727DSM40273*-ATCC23896DSM40420*-ATCC19829DSM40108*-ATCC14923DSM40149*-ATCC23620DSM40496*-ATCC3315DSM40060*-ATCC12627DSM40004*-ATCC12678DSM40456*-ATCC25456DSM40281*-ATCC23919DSM40229*-ATCC23920Mycostop, Kemira, FinlandDSM40069*-ATCC8664DSM40461*-ATCC25470DSM40091*-ATCC19788DSM40334*-ATCC23630DSM40231*-ATCC10739DSM40533-ATCC27426DSM40240-ATCC23975DSM40241-ATCC25496DSM43836*-ATCC25664DSM40053*-ATCC23877ATCC6051

1: S: Streptomyces, B: Bacillus2: Ifølge Williams et al. (1983)*: Type stammeDSM: Deutsche Sammlung von Mikroorrganismen und Zellkulturen GmbHATCC: American Type Culture Collection

Ekstraktion af DNA til PCR. Bakterier inokuleres på fast LB substrat (Sambrook et al., 1989) og inkuberes natten over ved 25C. Med en tandstik skrabes bakterier op fra LB substratet. Bakterierne resuspenderes i 200 l vand i Eppendorfrør og inkuberes i kogende vandbad i 10 min. Efter afkøling på is centrifugeres 15 000 x g i 10 min, og den DNA holdige supernatant overføres til nyt Eppendorfrør. Hvis der er mulighed for, at der kommer sporer med ved afskrabning af bakterier fra LB substratet, bør centrifugeringen og aftagning af supernatant gentages. DNA opløsning opbevares i køleskab

45

PCR med streptomycet DNA. Reaktionsblandingen for PCR indeholdt i 25 l: 10mMTris-HCl, pH 8.3; 2 mM MgCl2; 50 mM KCl; 0,2 mM af hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP; 0,05 g af hver af de to primere G1 og L1 (Jensen et al., 1993), 1 l DNA opløsning og 0,5 U Taq polymerase (Boeh-ringer-Mannheim). DNA´et blev amplificeret i løbet af 25 cycler, hver bestående af 1 min ved 94C, 1 min ved 55C og 2 min ved 72C. PCR produkter blev analyseret ved 1.5% agarose gel elektroforese.

Resultater og diskussion

Selektion baseret på sporefarve. Det viste sig ikke at være muligt at opnå den røde sporefarve på IPS4 substratet. Videre forsøg på at selektere på basis af sporefarve blev opgivet.

Substrat baseret selektion. I det første forsøg blev de tre selektive substrater sta-cas, gly-arg og raf-his afprøvet til dyrkning af streptomyceter. Raf-his substratet blev bortvalgt, da det resulterede i en alt for lav vækstha-stighed.

På basis af en lang række optimeringsforsøg blev den mest optimale mediekombination for semiselektiv dyrkning af S. griseoviridis baseret på gly-arg substratet med 50 g/ml Delvocid og 0.005 % natrium-azid. Samtidig ser denne mediekombination meget lovende ud til isolering af streptomyceter fra jord, idet der blev observeret kolonier med streptomycet lignende morfologier, og pladerne blev ikke overvokset af svampe. En måske lidt overraskende observation var, at den aktive komponent i Mycostop, S. griseoviridis, viste markant større væksthastighed end S. griseoviridis (DSM40229).

PCR analyse af streptomycet DNA. Ved indledende forsøg med dyrkning af streptomyceter på forskellige substrater forud for DNA preparering fandt vi, at streptomycet selektive substrater var uegnede, da bakterierne sporulerede på disse. LB substratet viste sig i højere grad at stimulere vegetativ vækst og resulterede i den bedste reproducerbarhed ved PCR. På basis af rapporten om, at det var muligt at differentiere mellem strep-tomyceter med en række oligonukleotider med homologi til de ribosomale RNA gener (Stackebrandt et al., 1991) forsøgte vi at anvende disse oligonukleotider som primere ved PCR analyser. Det lykkedes ikke at finde en primerkombination som resulterede i et specifict produkt for S. griseoviridis. Derimod lykkedes det at finde et specifikt PCR produkt ved anvendelse af de universelle G1 og L1 primere, som bindes i henholdvis 16S rRNA- og 23S rRNA genet, hvorved der opnås amplificering af spaceren mellem de to gener. Alle de analyserede streptomyceter (bortset fra Mycostop) viste et karakteristiskt 2-bånds mønster, som afhængig af streptomycet art havde varierende molekylvægt. Denne variation er dog næppe stor nok til at spacerens molekylvægt kan anvendes ved rutineiden-tifikation, men den variation, som findes vil efter en DNA sekvens analyse kunne anvendes til design af primere med henblik på PCR diagnostik. Mycostop, som indeholder S. griseoviridis, viste sig at resultere i et ekstra PCR bånd ud over det karakteristiske 2-båndsmønster med G1 og L1 primerne, hvilket ikke var tilfældet for S. griseoviridis typestammen DSM-40229. Med basis i disse observationer er der gode muligheder for at udvikle specifikke molekylære identifikations redskaber til streptomyceter. RAPD metoden skønnes ikke at være egnet til at skelne mellem Streptomyces arter, men vil sandsynligvis være velegnet til at skelne mellem isolater inden for de enkelte arter.

46

Referencer

Gürtler, V. And Stanisich, V.A., 1996. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region. Micro-biology 142:3-16.

Jensen, M.A., Webster, J.A., and Straus, N., 1993. Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms. Applied and Environmental Microbiology 59: 945-952.

Korn-Wendisch, F. and Kutzner, H.J., 1992. The family Streptomycetaceae. In: The Procaryotes. Second edition. Eds.: Balows, A., Trüper, H.G., Dworkin, M., Harder, W, and Schleifer, K.-H. Springer-Verlag. Vol I pp. 921-995.

Mehling, a., Wehmeier, U.F., and Piepersberg, W., 1995. Nucleotide sequences of streptomycete 16S ribosomal DNA: towards a specific identifi-cation system for streptomycetes using PCR. Microbiology 141: 2139-2147.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., 1989. Molecular Cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Shirling, E.B. and Gottlieb, D., 1966. Methods for characterization of Streptomyces species. International Journal of Systematic Bacteriology 16:313-340.

Stackebrandt, E., Witt, D., Kemmerling, C., Kroppenstedt, R., Liesack, W., 1991. Designation of streptomycete 16S and 23S rRNA-based target regions for oligonucleotide probes. Applied and Environmental Microbiology 57: 1468-1477.

Williams, S.T., Goodfellow, M., Alderson, G., Wellington, E.M.H., Sneath, P.H.A., and Sackin, M.J., 1983. Numerical analysis of Streptomyces and related genera. Journal of general Microbiology 129: 1743-1813.

45