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2015
Ms. Romeu Moreira dos Santos
2017
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INTRODUÇÃO
SDS-PAGE
• SDS-PAGE = Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) com dodecil-sulfato de sódio (SDS).
• O SDS-PAGE consiste em um tipo de eletroforese realizada em condições
desnaturantes p/ a separação de proteínas.
• Presença de reagentes desnaturantes
• (beta-mercaptoetanol) que destrói as pontes dissulfeto
• SDS para conferir cargas negativas as proteínas
• separação eletroforética das cadeias polipeptídicas isoladas com base em
seu P.M. / tamanho
• Migração das proteínas é inversamente proporcional aos seus P.Ms
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INTRODUÇÃO
SDS-PAGE
• Essa técnica foi descrita por Laemmli (Laemmli (1970), Nature,
277, p. 680) quando a utilizou com a finalidade de determinar a
mobilidade das proteínas em gel de poliacrilamida submetido à
corrente elétrica.
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INTRODUÇÃO
SDS-PAGE
• Gel
• O gel (matriz) de poliacrilamida
• Composto por acrilamida e bis-acrilamida formando um
polímero reticulado.
• Possuem poros menores do que agarose, portanto, maior poder de
resolução.
• Pode separar bio-moléculas de DNA, RNA e Proteínas
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INTRODUÇÃO
SDS-PAGE
• SDS - dodecil-sulfato de sódio
• É um detergente que pode dissolver moléculas hidrofóbicas,
mas também possui uma carga negativa (sulfato) a ele
associada.
• Moléculas proteicas sob a ação do SDS são:
• Solubilizadas pelo detergente (estrutura primária)
• Adsorvidas com carga negativas
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INTRODUÇÃO
SDS-PAGE
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INTRODUÇÃO
SDS-PAGE
• Eletroforese de proteínas em SDS-PAGE - objetivo
• Caracterizar
• Quantificar
• Determinar a pureza da amostra
• Comparar proteínas de diferentes fontes
• O primeiro passo na técnica de Western blot
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Estudar as frações:
- gama-globulina precipitada- isotipo IgG purificado
Utilizando a técnica de SDS-PAGE
Objetivo da aula
SDS-PAGE
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O que fazer:
- Aplicar as amostras preparadas em cada poço;
- Deixar correr em uma voltagem de 100V por 40 min.;
- Retirar o gel do suporte com cuidado;
- Colocar no corante comassie blue por 5 min
- Colocar no descorante por 2 horas
- Analisar o gel
SDS-PAGE
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Gamaglobulina
IgG
SDS-PAGE
Soro
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SDS-PAGE
Estrutura das proteínas
IgG
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B-mercaptoetanol para desnaturação: quebra das pontes dissulfeto
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Eletroforese SDS-PAGE
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Soro total Gama
globulina
IgG
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Cadeia H de
IgG
50 kDa
Cadeia L de
IgG
25 kDa
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