Embed Size (px)
Citation preview
Electroforesis en gel de
poliacrilamida y
electrotransferencia
INDICE
ELECTROFORESIS
Fundamento y características
Tipos de electroforesis: libre y de zona
Electroforesis en papel, acetato de celulosa
Electroforesis en geles
ELECTROTRANSFERENCIA
La electroforesis es el movimiento de partículas omoléculas cargadas eléctricamente bajo la influencia de uncampo eléctrico en un medio conductor. Este medio sueleser un tampón acuoso llamado electrolito o “runnig buffer”.
El propósito puede ser:
Analítico. Identificación y caracterización física de loscomponentes de una muestra.
Preparativo. Separación preparativa de componentesde una muestra.
ELECTROFORESIS
Movimiento de moléculas en la electroforesis
Las moléculas siempre se mueven hacia el electrodo de polaridad
opuesta a su carga neta.
(los cationes se mueven hacia el cátodo y los aniones hacia el ánodo)
cátodo
ánodo
–
– –
–
+
–
–++
(–)
(+)
Movimiento de moléculas en la electroforesis
Composición del solvente Presencia de detergentes
Temperatura
Fuerza iónica La estabilidad de los ácidos nucleicos
depende de los iones Na+
Las proteínas se agregan a bajas fuerzas iónicas
Factores que influyen en el movimiento de moléculas cargadas bajo la acción de un campo
eléctrico en solución
La velocidad de migración es proporcional al producto de su carga efectiva (Q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (F) relativo a la talla y forma de la molécula.
Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración.
Velocidad y movilidad de las moléculas en una electroforesis
V =EQ
F
V, velocidad (m/s)E, intensidad campo eléctrico (V x m)Q, carga neta (C )F, coeficiente de fricción (C x V/s)
La movilidad electroforética, U, parámetro que determina el comportamiento de una molécula en un campo eléctrico. Es la velocidad de migración por unidad de campo. Caso particular de la velocidad de migración de un ión cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cm. Signo igual carga partícula. Depende de carga, forma y tamaño.
Movilidad electroforética
V, velocidad (m/s)E, intensidad campo eléctrico (V x m)Q, carga neta (C )F, coeficiente de fricción (C x V/s)
Movilidad = V = Q
E F=
Invención
El primer aparato sofisticado de electroforesis fue desarrollado por Tiselius en 1937 (Premio Nobel de Química en 1948)
Desarrolló la “moving boundary”, que se convertiría en la electroforesis zonal y la utilizó para separar proteínas del suero.
Desarrollo
La electroforesis se desarrollo completamente de los años 40s a los 50s.
Se utilizó para separar moléculas que van desde las proteínas, aminoácidos y hasta iones inorgánicos.
Aplicaciones
Bioquímica Química clínica, forense, de alimentos Toxicología Farmacia, farmacología Enzimología, inmunología Microbiología, Botánica, citología, Biología Molecular, etc.
Tipos de electroforesis
Electroforesis libre
Electroforesis de zona
Medios no restrictivos Medios restrictivos
PapelAcetato de celulosa
Gel de almidónGel de agarosa
Gel de poliacrilamidaGel de agarosa +
poliacrilamida
separación principalmente por carga
Separación por carga, tamaño y forma
Equipo electroforesis
Fuente tensión (o de alimentación)
Cubeta
Soporte
Tampón
Factores que afectan a la electroforesis
Campo eléctrico. Depende de: Diferencia de potencial Intensidad Resistencia (depende de soporte,
dimensiones y concentración de tampón) Temperatura
Muestra
Tampón
Soporte
Fue el primer soporte usado en las
técnicas de electroforesis
desarrolladas para separar
compuestos (Tiselius, 1937).
Es fácil de usar porque no se
requiere preparación de la matriz.
Es limitada su capacidad resolutiva.
Electroforesis en papel
En 1957, Kohn usó
acetato de celulosa
como medio de
soporte.
Bajo poder de
adsorción
Las tiras se pueden
transparentar y
guardar
Electroforesis en acetato de celulosa
Electroforesis en gel de agarosa
Principal aplicación: separación de ácidos nucléicos
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Químicamente inertes
Transparentes (cuantificación por densitometría)
Estables en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica.
Resistentes a agentes desnaturalizantes.
Son mecánicamente estables.
Los geles de poliacrilamida se forman por la
polimerización de la acrilamida por acción de un
agente formador de enlaces cruzados (“cross-
linking”), la bis-acrilamida.
H2C=CH-CO-NH2 + (CH2=CH-CO-NH-) 2CH2 gel de poliacrilamidaacrilamida bis-acrilamida
Gel de poliacrilamida
La reacción se desencadena por la presencia de un iniciador y
se continua con ayuda de un catalizador.
El iniciador es el ion persulfato (S2O8-) que se añade en forma de
persulfato amónico (APS).
Como catalizador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'-tetrametilendiamina).
Gel de poliacrilamida
Estructura de la poliacrilamida
En el gel se definen dos parámetros:
Reticulado (% T) que es la concentración total de monómeros.
Dureza (% C) que viene dada por la relación de la cantidad debisacrilamida al total de monómeros
Electroforesis en gel de poliacrilamida
La porosidad del gel la determina las proporciones relativas depoliacrilamida y bis-acrilamida
Es menor el poro cuanta más bisacrilamida vs. acrilamida seuse.
El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina elrango de separación del gel.
Los geles se denominan en función del % deacrilamida/bisacrilamida que contienen.
La mayoría de las proteínas se separan bien en el rango 5 a15%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es mejorpara separar proteínas de gran tamaño.
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Electroforesis en gel de poliacrilamida (condiciones no desnaturalizantes sistema tampón continuo).
ELECTROFORESIS NATIVA
Modalidad más sencilla con gel de concentración uniformey un único tampón.
Las muestras se aplican en un extremo del gel, así pues, teniendo en cuenta que muchas proteínas tienen puntosisoeléctricos entre 4 y 7 se utilizan tampones débilmente básicos en los que estarán cargadas negativamente. Porello el ánodo se coloca en la parte inferior
No se altera la conformación nativa de las proteínas por lo que finalizada la electroforesis puede estudiarse la funcionalidad de las proteínas separadas.
Electroforesis en gel de poliacrilamida (condiciones no desnaturalizantes sistema tampón discontinuo). Método
de Laemmli
El tampón de electroforesis es diferente del que impregna el gel. El gelno es homogéneo y consta de gel concentrador y separador
Tinción del gel
Tinción azul Coomasie. Sensibilidad 0.1- 0.5 µg proteína/banda
Electroforesis desnaturalizante
Somete a las proteínas a migración asegurando su desnaturalización completa (pérdida de la estructura tridimensional).
La migración es proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no a su forma.
El agente desnaturalizante más empleado es el detergente dodecilsulfato de sodio o SDS.
PAGE-SDS
Su nombre significa Electroforesis en geles de poliacrilamida que se realiza en presencia de SDS (“SDS-polyacrilamide gel electrophoresis”).
PAGE-SDS es la electroforesis de proteínas más ampliamente usada.
Descrita por Laemmli (1970, Nature, 277:680)
Las muestras se desnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes:
Agente reductor (β-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT))
Detergente (SDS)
Tratamiento de las muestras para PAGE-SDS
SDS
Dodecilsulfato de sodio, lauril-sulfato de sodio.
Detergente aniónico
Desnaturalizante
Se une a las cadenas polipeptídicas con una relación de 1.4 g de SDS por g de proteína, aproximadamente una molécula de SDS por cada dos aminoácidos de la cadena.
La unión masiva de moléculas de SDS bloquea la carga propia de la molécula de proteína
Le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a su masa.
Todas las proteínas acomplejadas con SDS viajan hacia el ánodo.
SDS
Agente reductor
Agente reductor
PAGE-SDS determinación de pesos moleculares
La separación de loscomplejos SDS-proteína Esproporcional sólo a la masade la proteína pues todastienen la misma carga porunidad de masa.
Se puede determinar el pesomolecular aparente decualquier proteína porcomparación con un patrónde proteínas de pesosmoleculares conocidos.
PROTEINA PESO MOLECULAR
ALBUMINA BOVINA SERICA 66000
OVOALBUMINA DE HUEVO DE POLLO 45000
GLIDERALDEHIDO 3‐FOSFATO DESHIDROGENASA DE MUSCULO DE CONEJO
36000
ANHIDRASA CARBÓNICA DE ERITROCITO BOVINO 29000
TRIPSINOGENO DE PANCREAS BOVINO 24000
INHIBIDOR DE TRIPSINA DE SOJA 20000
LACTOALBUMINA BOVINA DE LECHE 14200
APROTININA DE PULMON BOVINO 6500
MARCADORES PESO MOLECULAR PARA ELECTROFORESISSIGMA LOW (M3913)
Montaje de Geles, Carga de Muestras y Evolución Electrofores
Resultado esperado tras la electroforesis ytinción
Estándar
Electroforesis bidimensional
Transferencia proteínas separadas en el gel a un filtro (blot)
1º-Tinción 2º- Recortar banda
3º- Secuenciar N-terminal
Transferencia por capilaridad
Electrotransferencia
Electrotransferencia
Electrotransferencia: etapas Laboratorio
Secuenciación N-terminal de la FNR
Secuenciación del N-terminal
Membrana PVDF
Western blot
Fronteras iniciales
Ánodo
Amortiguador
Límite o frontera descendente
Moléculas de proteína
Límite o frontera ascendente
Cátodo+ –
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Electroforesis nativas y desnaturalizantes
