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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYT- SECRITARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –FONACYT- FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA, USAC
INFORME FINAL
“ESTUDIO GENETICO Y FENETICO DE POBLACIONES DE Triatoma dimidiata (Latreille) DE CENTRO AMERICA, UTILIZANDO LAS TECNICAS
DE ESPACIADORES INTERNOS TRANSCRITOS DEL ADNribosomal Y MORFOMETRIA”
PROYECTO FODECYT No. 008-2006
MARIANELA MENES HERNANDEZ Investigador Principal
Guatemala 22 de octubre de 2007
1
EQUIPO DE TRABAJO
MARIANELA MENES HERNÁNDEZ Investigadora Principal
BARBARA BEATRIZ MOGUEL
Investigadora Asociada
ELIZABETH SOLORZANO Auxiliar de Investigación
MAURICIO JOSÉ GARCIA
Auxiliar de Investigación
MARÍA CARLOTA MONROY Investigadora Asociada
2
Resumen Triatoma dimidiata, ha mostrado ser una especie con una gran variabilidad
en diferentes aspectos tales como tamaño, coloración, forma, comportamiento
intradomiciliar, entre otros (Bustamante 2004; Calderón 2004; Ladaverde 2004),
lo cual sugieren que se podría tratar de un complejo de especies. En el presente
estudio se utilizó la Morfometría, como marcador fenético, para diferenciar
poblaciones intraespecíficas. Se midieron las cabezas de individuos de 13
poblaciones procedentes de los diferentes países centroamericanos, provenientes
de tres ecotopos (doméstico, peridoméstico y silvestre). Los individuos más
típicos de cada población fueron seleccionados para los estudios moleculares, para
los cuales se utilizó el marcador molecular ITS (Espaciadores Internos
Transcritos); el cual fue probado por primera vez en el Laboratorio de
Entomología Aplicada y Parasitología –LENAP-, de la Facultad de Ciencias
Químicas y Farmacia, de la Universidad de San Carlos de Guatemala.
Los resultados mostraron la formación de bloques, en los cuales se pudo
observar una separación de poblaciones sobre la cadena volcánica y al sur de ésta,
lo cual podría estar relacionando la distribución de las poblaciones con la
formación geológica de Centro América. Los resultados muestran que existe
cierta migración entre algunas de las poblaciones, ya que presentan un traslape
que puede estar sugiriendo la presencia de híbridos. Se observó también una
separación de las poblaciones silvestres de Petén, con respecto a las poblaciones
restantes, lo que podría indicar que estas poblaciones se encuentran ya en un
avanzado proceso de especiación.
A través de la diferenciación poblacional de Triatoma dimidiata se pudo
inferir sobre su taxonomía molecular así como la asociación entre algunas
poblaciones de Centro América, datos que pueden ser de gran ayuda para brindar
soporte al programa de estrategias de control en el istmo centroamericano, para la
toma de decisiones en las Iniciativas de control de los vectores de la Enfermedad
de Chagas en Centro América (IPCA) (OPS 2003).
Palabras claves. Triatoma dimidiata, re-infestación, ITS, Morfometría
3
Abstract
Triatoma dimidiata has demonstrated to be a species with variability in
different aspects, such as size, color, shape, intradomestic behavior, among others;
(Bustamante 2004; Calderón 2004; Ladaverde 2004), this suggests that it could be
a species complex.
The morphometry has showen be a good fenetic marker for differentiating
intraspecific populations. Te heads of individuals from 13 populations located in
the different Central America countries belonging to tree escotops (intradomestics,
peri domestics and sylvan). The most typical individuals from each population
were selected for the molecular studies, for which Internal Transcribed Spacers
were used, standardized in LENAP (Laboratory of Applied Entomology and
Parasitology), Faculty of Chemistry science and Pharmacy of San Carlos
University.
The results showed the formation of two blocks, in which a separation
between populations to the north and to the south of the volcanic ridge could be
observed, this could be related to the populations distribution according to the
geological formation of the Central America bridge. The results shown that there
is a sort of migration among some populations, since there that the Petén
populations are more separately than the others populations, since there is an
overlap that suggest the presence of hybrid offspring. A separation between the
sylvan populations of Peten with respect to the rest could also a observed, which
indicators that these populations are now in an advanced stage along a speciation
process.
Trough population differentiation in T. dimidiata it could be inferred about
their molecular taxonomy as well as the association among some Central America
populations; these data may be great help to provide support to the control
strategies program in Central America, so that the correct decisions over Chagas
disease vector control initiatives may be made.
4
BIOGRAFIA DE LOS AUTORES Moguel Rodríguez, Bárbara Beatriz Bárbara Beatriz Moguel Rodríguez nació en la Ciudad de Guatemala el 5 de julio de 1978, obtuvo el titulo de Maestra de educación primaria urbana en el Colegio Bethania y el titulo de Licenciada en Biología en la Universidad de San Carlos de Guatemala. Durante su formación como bióloga optó por los cursos de formación profesional en estadística, morfometría y biología molecular. Ha pertenecido al Laboratorio de Entomología aplicada y Parasitología desde el año 2000, realizando las prácticas de EDC y EPS, la tesis de grado, auxiliar en diferentes investigaciones y en la actualidad es investigadora principal. Para su formación académica ha asistido a seminarios, cursos y congresos tanto nacionales como internacionales. Fue auxiliar de las cátedras de zoología de los invertebrados en la Escuela de Biología y bioestadística ambos en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala, además impartió la cátedra de Ciencias Naturales en el Instituto Experimental de la Asunción. Ha sido consultora para la Agencia de Cooperación Japonesa JICA, es coautor en dos publicaciones en revistas científicas de renombre internacional. En la actualidad imparte la cátedra de Bioestadística para estudiantes de Química Farmacéutica del cuarto semestre en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, y tiene a su cargo el proyecto de investigación FODECYT 101-2006. Menes Hernández, Marianela Marianela Menes Hernandez nació en la Ciudad de Guatemala el 18 de junio de 1977, obtuvo el titulo de Bachiller en ciencias y letrasa en el colegio Bethania y el Grado de Licenciatura en Biología en la Universidad de San Carlos de Guatemala. Ha sido coordinadora e investigadora principal de tres proyectos financiados por DIGI y CONCYT. Ha participado como auxiliar de diversas investigaciones formando parte del equipo del Laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología de la Escuela d Biologia de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Además trabajó en la sección de Entomología Médica del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social. A la fecha cuenta con dos publicaciones como coautora en revistas científicas internacionales en el tema de Chagas. Ha sido consultora para la Agencia de Cooperación Japonesa JICA. Ha obtenido los premios a la mejor investigación científica de la DIGI y una Beca otorgada por la Agencia Cooperancion Internacional Japonesa, que le permitió participar en el X curso internacional sobre enfermedades tropicales en Brasil. En la actualidad es coordinadora de un proyecto de investigción financiado por DIGI y es asesora de una tesis de licenciatura.
5
Solórzano Ortiz, Elizabeth Elizabeth Solórzano Ortiz nació en la Ciudad de Guatemala el 19 de febrero de 1983, obtuvo el titulo de Bachiller en Ciencias y Letras en el Colegio Liceo Francés, en el año 2000. Es estudiante con pensum cerrado de la carrera de Biología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Durante su desarrollo como estudiante, recibió cursos de Formación Profesional, seminarios y congresos en el área de Genética y Biología Molecular. Además de las distinciones académicas de Premio a la Mejor Estudiante de la carrera de Biología 2001-2002, Miembro del Cuadro de Honor del año 2001 de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Como estudiante participó como Miembro estudiantil del Jurado de Oposición para Profesores Titulares de la Escuela de Biología, 2004-2005, también fue Auxiliar de Cátedra del Curso de Bioquímica II, en la Escuela de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos, 2006; y auxiliar de investigación en el tema de dispersión de semillas, 2005. Actualmente participa como investigadora asociada en el proyecto FODECYT 101-2006. Es Miembro del Laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología - LENAP- y Secretaria de Organización de la Organización de Estudiantes de Biología.
García Recinos, Mauricio José Mauricio José García Recinos nació en la Ciudad de Guatemala el 12 de noviembre de 1981, obtuvo el titulo de Bachiller en Ciencias y Letras en el Colegio Mariano y Rafael Castillo Córdova. Actualmente es Pensum Cerrado de la Carrera de Biología, en la Escuela de Biología, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Ha recibido cursos de Formación Profesional, participado en seminarios y congresos en el área de Genética y Biología Molecular. Como Experiencia Laboral, ha sido: Ayudante de Cátedra del Curso de Biología General II, en la Escuela de Biología de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala, en el año 2004; Auxiliar de Investigación IV del proyecto de investigación ejecutado por el Museo de Historia Natural –MUSHNAT-, de la USAC, en el 2005; Auxiliar de Investigación del proyecto de investigación FODECYT 08/2006 en el cual se trabajaron técnicas genéticas y fenéticas; Participación en la investigación de campo DIGI 765/2007. Actualmente es Investigador Asociado del Laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología.
6
7
Agradecimientos
Los investigadores que participamos en esta investigación queremos agradecer
por el apoyo financiero a la Secretaria Nacional de Ciencia y Tecnología y al
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por su confianza en la investigación y
sobre todo en nuestro equipo.
Además, queremos agradecer a la red Netropica por ser la contrapartida en la
compra de material, reactivos para este proyecto y permitir la red de
investigadores en Centro América.
Al Laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología LENAP por su apoyo en
la realización del proyecto tanto en instalaciones, equipo y material como en
asesoria y orientación en especial a la PhD. Carlota Monroy, además agradecer al
equipo del Laboratorio por su apoyo en las giras de campo.
A la Escuela de Biología por permitir el uso de las instalaciones y la Facultad de
Farmacia por ser nuestro respaldo legal, en especial al PhD. Oscar Cobar.
También agradecer a los diferentes investigadores quienes nos enviaron los
especimenes desde para poder trabajar:
Kiota Ota, de El Salvador
Los doctores Ponce, de Honduras
Dra. Francisca Marín, De Nicaragua
Al Dr. Zeledón, INBIO de Costa Rica
Al Dr. Ásael Saldaña, de Panamá.
Y a las personas que consulten este documento y les sea de utilidad.
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TABLA DE CONTENIDOS AGRADECIMIENTOS 2 I PARTE I.1 INTRODUCCION 5 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA I.2.1 ANTECEDENTES 7 1.2.2 JUSTIFICACION 8 I.3 OBJETIVOS I.3.1 OBJETIVO GENERAL 10 I.3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 10 I.3.3 HIPOTESIS 10 I.4 METODOLOGIA I.4.1 VARIABLES I.4.1.1 VARIABLES DEPENDIENTES 11 I.4.1.2 VARIABLES INDEPENDIENTES 11 I.4.2 ESTRATEGIA METODOLOGICA 11 I.4.2.1 POBLACION Y MUESTRA 11 I.4.2.1.1 SELECCIÓN DE MATERIAL BIOLOGICO 11 I.4.2.1.2.COLECTA DEL MATERIAL BIOLOGICO 12 I.4.2.1.3 MANEJO DE COLECCIONES VIVAS 13 I.4.2.1.4 PROCESAMIENTO DE MATERIAL… 13 I.4.3 MORFOMETRIA 13 I.4.4 TECNICA ITS 15 1.4.5 TECNICA ESTADISTICA 22 I.4.5.1 ANALISIS MORFOMETRICOS 22 I.4.5.2 ANALISIS DE ITS 25 II PARTE II.1 MARCO TEORICO II.1.1 ENFERMEDAD DE CHAGAS 26 II.1.2 TRIATOMA DIMIDIATA 26 II.1.2.2 CONTROL 27 II.1.3.MORFOMETRIA 28 II.1.4 ADN RIBOSOMAL 29 III PARTE III.1 RESULTADOS III.1.1MORFOMETRIA TRADICIONAL 31 III.1.2 ITS 37 III.2 DISCUSION DE RESULTADOS III.2.1 SELECCIÓN DE LAS POBLACIONES 43 III.2.2 MORFOMETRIA 44 III.2.2.2SEGUNDO ESPACIO INTERNO TRANCRITO 47 III.2.2.5 MORFOMETRI E ITS2 49 IV PARTE IV.1 CONCLUSIONES 51 IV.2 RECOMENDACIONES 53 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 54 IV.4 ANEXOS 65
9
LISTA DE ILUSTRACIONES Figura 1: Puntos tomados en las cabezas de T. dimidiata Pág. 15
Figura 2 y 4 (Análisis Libre de Isometría y Libre de Alometría, respectivamente): Dendrograma construido a partir de un cluster jerárquico, utilizando la distancia euclidiana, basado en los promedios de los factores discriminantes producidos en un Análisis Discriminante sobre mediciones de las cabezas de los machos de Triatoma dimidiata.
Pág. 33 y 36
Figura 3 y 5 (Análisis Libre de Isometría y Libre de Alometría, respectivamente): Dendrograma construido a partir de un cluster jerárquico, utilizando la distancia euclidiana, basado en los promedios de los factores discriminantes producidos en un Análisis Discriminante sobre mediciones de las cabezas de las hembras de Triatoma dimidiata.
Pág. 34 y 36
Figura 6: las subunidades de la región transcrita del ADNr.
Pág. 37
Figura 7: Filograma de Máxima similitud construido a partir de un análisis de remuestreo (bootstraps) de las secuencias de 11 poblaciones.
Pág. 40
Figura 8: Filograma construido con base en el análisis de parsimonia, utilizando T. nitida como grupo externo.
Pág.40
Figura 9: Filograma construido con base en el análisis del vecino más cercanos (Maximun Likelihood), utilizando T. nitida como grupo externo.
Pág. 40
Fotografía de un gel de agarosa Pág.20
Gráfica 1: Diferencias morfométricas entre 13 poblaciones de Triatoma dimidiata. Gráfico de dispersión construido con base en los 2 primeros factores discriminantes obtenidos de un AD sobre los 10 primeros componentes principales obtenidos de un ACP sobre las 91 distancias calculadas en la cabeza de los machos.
Pág. 33
Esquema 1: Ejemplo de la secuencia obtenida del ITS2 del individuo de Lachúa.
Pág. 34
Mapa 1: distribución de las poblaciones según el patrón que se obtuvo en los filogramas, se marcaron en color azul las poblaciones de Petén; en Rojo las poblaciones de Izabal, Intibucá y Copán; y en verde las poblaciones de Quiché, Rio San Juan y Carazo (Nicaragua), Heredia (Costa Rica) y Veraguas (Panamá).
Pág. 41
Mapa 2: distribución de las mayores unidades rocosas, se localizaron las poblaciones estudiadas para observar la relación con el mismo. Las poblaciones fueron marcadas de la siguiente forma: Petén= azul; Izabal, Intibucá y Copán = Rojo; y Quiché, Carazo, Rio San Juan, Heredia y Veraguas = verde.
Pág. 42
10
I PARTE I.1 INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Chagas es endémica del continente americano y esta
considerada como una de las enfermedades parasitarias más serias en
Latinoamérica (Schofield, 2001), donde representa la cuarta causa de mortalidad,
con 24 millones de personas infectadas y más de 100 millones en riesgo
(Schofield, 2000; Dujardín, 20000). En la región mesoamericana, Guatemala
presenta los índices más alarmantes con 4 millones de personas en riesgo, una
seroprevalencia estimada en 730,000 casos y una incidencia anual de 28,387
nuevos casos en ausencia de estrategias de control adecuadas (OPS, 2000;
Monroy, 2003; Schofield, 2004).
A nivel de la Salud Pública, resulta poco factible tratar la Enfermedad de
Chagas por lo cual el control se enfoca principalmente en la interrupción de la
transmisión mediante la eliminación de las poblaciones de vectores domésticos
(WHO, 1991). Desde el año 1997 los países de Centro América (C.A) han unido
esfuerzos para el control del vector Triatoma dimidiata por medio del rociamiento
con insecticida en las viviendas (Ponce 1999), sin embargo, se han reportado
repetidamente procesos de re-infestación después del rociamiento (Nakagawa,
2003), los cuales han evidenciado la necesidad de realizar estudios más profundos
sobre la biología y comportamiento de esta especie.
T. dimidiata, ha mostrado ser una especie con una gran variabilidad en
diferentes aspectos tales como tamaño, coloración, forma, comportamiento
intradomiciliar, entre otros; (Bustamante 2004; Calderón 2004; Landaverde 2004),
los cuales sugieren que se podría tratar de un complejo de especies. La aplicación
de técnicas, tanto genéticas como fenéticas, pueden ayudar a dilucidar esta
situación.
Una técnica fenética de fácil aplicación, es la morfometría, la cual nos
permite visualizar las diferencias entre poblaciones y sirve a la vez como un
tamizaje para la selección de poblaciones e individuos de interés para
posteriormente aplicar técnicas moleculares, más específicas. En este caso, se
utilizó el ADN ribosomal, mediante el análisis de espaciadores internos transcritos
(ITS), ya que este marcador ha provisto buena detección de la variabilidad
11
genética entre poblaciones de T. dimidiata (Bargues et al., 2000; Marcilla et al.,
2001).
El objetivo del presente trabajo fue continuar con el estudio de poblaciones
de Triatoma dimidiata para comprender la diversidad y estructura de sus
poblaciones a lo largo del istmo de Centro América. La importancia del estudio
consistió en encontrar diferencias morfológicas ó genéticas, entre poblaciones con
importancia epidemiológica distintas, para que esta información pueda ser
utilizada en las estrategias de control de los vectores de la Enfermedad de Chagas
en la región (OPS, 2003).
12
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA I.2.1 ANTECEDENTES Desde 1984 la Escuela de Biología de la Facultad de Farmacia de la
Universidad de San Carlos de Guatemala, inició de forma independiente, trabajos
de investigación sobre los vectores de la enfermedad de Chagas (JICA, 1993). No
fue sino hasta 1993 que la Escuela de Biología con el apoyo de un grupo de
japoneses emprendió un estudio sistemático de los vectores y de los parásitos que
causan la enfermedad de Chagas. Desde 1999 la Dirección General de
Investigación así como la Organización Mundial de la Salud en el Programa TDR
(WHO, Programme for Research and Training in Tropical Disease), CONCYT y
NETROPICA han financiado proyectos relacionados con el estudio genético de
los vectores de la enfermedad de Chagas, estudios que permiten aclarar algunos
aspectos relacionados con el control y la re-infestación de estos vectores (WHO,
1998).
Durante los últimos cuatro años, el Laboratorio de Entomología Aplicada y
Parasitología- LENAP- ha realizado estudios genéticos de distintas poblaciones de
la especie Triatoma dimidiata, utilizando el método de RAPD (Random
Amplification of Polymorphic DNA) (Calderón, 2004). En otro estudio, se utilizó
la historia geológica de C.A. para comprender la distribución, variabilidad y
epidemiología de poblaciones de T. dimidiata utilizando dos diferentes técnicas:
morfometría y análisis de ADN. Por medio de análisis de RAPD-PCR se
determinó la distancia y el flujo genético entre las poblaciones estudiadas
(Landaverde 2004; Menes 2004). Los resultados obtenidos han permitido realizar
separaciones de algunas de las poblaciones pero la técnica utilizada no es
suficientemente sensible como para diferenciar subpoblaciones o determinar si se
trata de una especie nueva, por lo que se ha sugerido la utilización de otras
técnicas más sensibles que permitan una mejor diferenciación de las poblaciones
bajo estudio. Por ello, se seleccionaron los espaciadores intergénicos transcritos
(ITS, por sus siglas en inglés) que han servido para diferencias poblaciones de
otras especies (Rhodnius y otros triatominos, Anopheles, Trypanosoma). Pueden
incluso servir para diferenciar poblaciones locales porque adquieren patrones de
ITS únicos (Wesson et al, 1992; Wesson et al, 1992; Gernandt et al, 2001).
13
Otra técnica utilizada en los últimos años, en el LENAP, es la
Morfometría, una herramienta fenotípica que ha permitido la diferenciación entre
Tribus, complejos y poblaciones de la misma especie (Bustamante et al, 2004;
Calderón et al, 2005); y además analizar la influencia del origen geográfico y del
ecotopo (Menes 2004).
El LENAP cuenta en la actualidad no solo con una amplia colección de
Triatominos de las especies de mayor importancia en la región mesoamericana,
sino que también con convenios internacionales de trabajo en conjunto para el
control de los vectores de la Enfermedad de Chagas, por lo cual se está en la
posibilidad de implementar el análisis de ITS como una nueva técnica para el
estudio de poblaciones y especies de triatominos.
I.2.2 Justificación
La Enfermedad de Chagas representa la cuarta causa de mortalidad en
América Latina, con 24 millones de personas infectadas y más de 100 millones en
riesgo (Schofield 2000; Dujardín 20000). Desde el año 1997 los países de Centro
América (C.A) han unido esfuerzos para el control del vector Triatoma dimidiata
por medio del rociamiento con insecticida en las viviendas (Ponce 1999). Esta
especie es nativa de la región centroamericana y muestra una gran variación
morfológica y de conducta (Solis-Mena 2000; Monroy 2003). Algunas
poblaciones parecen ser más problemáticas para su control puesto que se han
observado procesos de reinfestación en las viviendas, los cuales se dan a los pocos
meses de haber realizado la aplicación del insecticida (Nakagawa 2003). La
medida utilizada por los Ministerios de Salud Pública de Centro América para el
control de la Enfermedad, se limita a la aplicación de insecticidas en las viviendas,
lo cual ha disminuido, “mas no eliminado”, los índices de infestación; además, no
se ha podido controlar los procesos de reinfestación de T. dimidiata a las
viviendas, y por ende la transmisión de Trypanosoma cruzi al ser humano.
Triatoma dimidiata presenta características por las cuales se deben
estudiar a profundidad sus poblaciones y sugerir alternativas de control. Es una
especie endémica para Mesoamérica (Jaramillo 2000; Usinger 1994); es el
14
principal vector de la Enfermedad de Chagas en Guatemala, El Salvador, Costa
Rica, Nicaragua y el segundo en Honduras (Monroy, 1992; Monroy, 2003; OPS,
2000); no es susceptible de erradicación por ocupar diversos ambientes tanto
silvestres como domésticos y peridomésticos (Calderon 2004; Pentana 1971;
Monroy 2003; Dumonteil 2004); muestra reinfestación de viviendas después del
rociamiento (Dumontiel 2004, Nakagawa 2003); tiene movilidad en migraciones
anuales (Pentana 1971; Monroy 2003) y existe flujo genético entre las poblaciones
(Calderon 2004). Por todas las características anteriores se requieren indicadores
de variabilidad, que ayuden a decidir qué poblaciones son las que necesitan
mayor atención.
Los análisis morfométricos aplicados a medidas de las cabezas de los
triatominos dan buena idea de las relaciones que existen entre las poblaciones, por
lo que se recomienda utilizar la variación fenotípica con métodos cuantitativos
como un procedimiento inicial. Además, es una técnica que ha sido utilizada por
varios años en el LENAP, proporcionando resultados que han brindado
sugerencias especificas para las estrategias de control y nuevos estudios
poblacionales en Triatoma dimidiata. Teniendo como base las conclusiones de los
trabajos previos realizados, en el presente estudio se llevó a cabo un
procedimiento inicial, utilizando la morfometría para observar la variación
fenotípica entre las poblaciones y como un tamizaje para seleccionar los
individuos más representativos de cada población, los cuales fueron utilizados
para la aplicación del marcador genético ITS.
15
I.3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 General:
Diferenciar genética y fenéticamente poblaciones de Triatoma dimidiata
provenientes de Centro América.
I.3.1.2 Específicos:
1. Analizar la variabilidad genética de especímenes de T. dimidiata colectados en
diferentes localidades de Centro américa por medio de la técnica de ITS.
2. Analizar la variabilidad fenotípica de poblaciones de T. dimidiata utilizado
técnicas de morfometría tradicional a medidas de las cabezas de especimenes
colectados en diferentes localidades de Centroamérica.
3. Comparar los resultados obtenidos por ambas técnicas.
4. Hacer una inferencia filogenética y re-plantear la posición taxonómica de las
poblaciones de T. dimidiata.
I.3.1.3 HIPÓTESIS La diferenciación morfométrica y genética de las poblaciones de Triatoma
dimidiata en Centro América, puede ayudar a esclarecer la posición taxonómica
de esta especie.
16
I.4 Metodología Se trabajó con especímenes de Triatoma dimidiata, provenientes de
diferentes localidades de Centro América. Los tamaños de muestra, ecotopo y
procedencia de los especimenes se muestran en la tabla 2. Los especimenes
domésticos de Guatemala y El Salvador pertenecen a la colección de referencia
del LENAP, mientras que el resto de especimenes domésticos y peridomésticos
provienen de intercambios con Laboratorios e instituciones centroamericanas. Los
especimenes silvestres fueron colectados por los investigadores entre abril y
agosto del 2006, con el apoyo de personal del Ministerio de Salud Pública y
Asistencia Social y pobladores de comunidades cercanas a los sitios de colecta.
I.4.1 Variables
I.4.1.1 Variables dependientes
Técnicas:
• Morfometría: es la descripción cuantitativa, análisis e interpretación de la
forma y la variación de esta en biología (Rohlf 1990)
• ITS2: El ITS2 tiene una longitud típica de 200 a 400 pares de bases y
puede ser amplificado por la Reacción en Cadena de la Polimerasa a partir
de una pequeña cantidad de ADN y posteriormente ser secuenciado.
(Young y Coleman, 2004).
I.4.1.2 Variables Independientes
Las popblaciones de Triatoma dimidiata con las que se trabajó
I.4.2 Estrategia metodológica
I.4.2.1 Población y muestra
I.4.2.1.1Selección de material Biológico:
Las poblaciones se seleccionaron con base en su importancia, geográfica o
epidemiológica, así como a la disponibilidad de especimenes con los que se
contaba. Los datos donde se identifica la procedencia, hábito, sexo y fecha de
colecta de los especimenes, se obtuvieron de la base de datos del Laboratorio de
Entomología Aplicada y Parasitología –LENAP, de la Escuela de Biología,
USAC-. Para la selección del material que sería utilizado, se realizó la búsqueda
de los especimenes en la colección y se verificó su estado.
17
I.4.2.1.2 Colecta del material biológico
De abril a agosto de 2007 fueron visitados el Sitio Arqueológico Yaxhá en
Petén, el Parque Nacional Laguna de Lachuá en Alta Verapaz y el municipio de
Morales en Izabal. En estos sitios se colectaron los especimenes silvestres que
fueron incluidos en el estudio. Las técnicas utilizadas para la colecta fueron la
búsqueda activa en cuevas y palmeras, y las trampas de luz para colectas
nocturnas en áreas semi abiertas silvestres.
Tabla 2. Tamaño y Procedencia de las muestras. Tamaño de muestra Morfometría
Tamaño de muestra ITS
País Depto. Localidad Ecotopo Mac
ho
Hem
bra
Est
and
ari-
zaci
ón
Secu
enci
a-ci
ón
Guatemala Jutiapa1 La Brea Domiciliar 15 13 10 4
Guatemala Quiché1
San Andrés Sajcabajá Domiciliar 15 14 10 3
Guatemala Petén1
Sitio Arqueológico
Yaxhá Silvestre, Chultún 9 10 10 3
Guatemala Petén1
Sitio Arqueológico
Yaxhá Silvestre, Palmera 0 0 10 3
Guatemala Petén1
Sitio Arqueológico
Yaxhá
Silvestre, (Trampa de
luz) 6 - 10 3 Guatemal
a Izabal1 Los Amates Silvestre, Palmera 11 9 10 3
Guatemala Coban Cachua
Vigilancia comunitaria - - 4 1
Nicaragua Masaya2 Domiciliar 14 12 10 -
Nicaragua Río San
Juan2 Domiciliar 15 15 10 2
Nicaragua Carazo2 Domiciliar 14 14 10 3
Honduras Intibucá3San Marcos
Sierra Domiciliar 15 15 10 3 Honduras Copán3 15 14 10 3
Costa Rica Heredia4
Cantones San Rafael y Santo
Domingo Peridomicili
ar 15 15 10 3
Panamá
Provincia de
Veraguas5 Santa Fe Domiciliar 15 13 10 3 El
Salvador Santa Ana1 Domiciliar 15 15 10 3 TOTAL 173 159 130 40
1 Colección de Referencia LENAP, Escuela de Biología, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC 2 Dra. Francisca Marín, Ministerio de Salud de Nicaragua 3 Dr. Carlos Ponce, Ministerio de Salud de Honduras 4 Dr. Rodrigo Zeledón, Universidad de Costa Rica/ INBIO 5 Instituto Conmemorativo Gorgos de Estudios de la Salud (ICGES), Panamá
18
I.4.2.1.3 Manejo de colecciones vivas de Triatominos (cultivos)
Para la técnica de Morfometría es necesario trabajar en base en un mismo
grupo etáreo y el tamaño de muestra requerido idealmente es de al menos 15
individuos de cada sexo, lo que en algunos casos es difícil alcanzar. Para poder
contar con el tamaño de muestra deseado o al menos con material suficiente, se
cuidaron las ninfas colectadas en el campo para que estas pudieran llegar al
estadio adulto. Los cultivos se mantuvieron en una incubadora con una
temperatura entre 22 y 24° C y se alimentaron una vez por semana, empleando
ratones.
I.4.2.1.4 Procesamiento de Material biológico (Preservación de
especimenes)
Los especimenes muertos procedentes de colectas de campo o cultivos,
fueron introducidos a la colección de referencia. Los especimenes fueron disectados
en busca de positividad para el parásito Trypanosoma cruzi, a cada uno se le asignó
un número de identificación, y se anotarón todos los datos de colecta en los
cuadernos correspondientes. Cada individuo fue introducido en un frasco con alcohol
glicerina al 5%, el cual se identificó con el mismo número asignado en los cuadernos.
I.4.3 Morfometría I.4.3.1 Selección del Tamaño de Muestra
La muestra se seleccionó a conveniencia, de acuerdo a los individuos que
estaban a disposición en el laboratorio. Se trabajó con adultos, debido a que el
análisis debe hacerse con base en un mismo grupo etáreo. Las hembras y machos
se trabajaron por separado ya que existe dimorfismo sexual. El tamaño de
muestra ideal para realizar los análisis morfométricos es de 15 individuos de cada
sexo; sin embargo, en algunas poblaciones el tamaño de muestra fue menor (ver
tabla 1), como en el caso de las poblaciones silvestres, ya que algunas son muy
difíciles de colectar. En muchos de los casos se colectaron más ninfas que adultos,
y no se logró que todas estas alcazaran el estadio adulto en el lapso de duración
del estudio. Se logró capturar un número muy reducido de chinches adultas en
chultunes y trampas de luz, y así mismo, pocos especimenes de palmeras
silvestres. Sin embargo, debido a la importancia de éstas en la dinámica
19
poblacional de la especie, fueron incluidas en el estudio. En el caso de los machos
se incluyeron en los análisis 3 poblaciones silvestres; sin embargo, este no fue el
caso para las hembras, en las que no se contó con un número adecuado de
individuos capturados con trampas de luz para poder analizarlas por medio de
morfomotría, debido a esto, en los análisis solamente se incluyeron las
poblaciones de chultunes de Petén y palmeras de Izabal. Los especimenes del
Parque Nacional Laguna de Lachuá, no fueron incluidos en ninguno de los casos
ya que el tamaño de muestra fue muy pequeño.
I.4.3.2 Montaje de las muestras
A cada insecto se le removió la cabeza con ayuda de pinzas de disección.
Las cabezas fueron montadas en alfileres, fijándolas sobre triángulos de acetato
con esmalte de uñas e identificándolas con sus datos correspondientes (Código,
sexo y procedencia) en un triángulo de papel.
I.4.3.3 Colecta de datos Morfométricos
Las imágenes de cada cabeza fueron captadas mediante una Cámara
Olympus OLY-750, conectada a un estereoscopo Olympus SZ-STS, con
magnificación 15X. Todas las imágenes se transfirieron a una computadora para
ser guardadas como un archivo de imagen (*.bmp), por medio del Software
FlyVIDEO2000 (Animation Technologies, Inc. 2001).
Se utilizó un juego principal de variables, el cual consistió en la obtención
de las coordenadas de 14 puntos homólogos tomados sobre la cabeza de cada
insecto (ver figura 1) con la ayuda del programa tpsDig® (Rohlf 2001). A partir
de las coordenadas se obtuvieron las 91 distancias posibles, utilizando el paquete
estadístico Tet_14 (Jean Pierre Dujardin).
20
Figura 1. Puntos tomados en las cabezas de T. dimidiata.
Tomado de Bustamante 2001b. I.4.4 Técnica de ITS
I.4.4.1 Selección del Tamaño de Muestra Se utilizaron las mismas poblaciones que en la técnica de Morfometría con
el fin de poder obtener resultados que fueran comparables. El tamaño de muestra
inicial para la técnica molecular fue de 10 individuos (5 hembras y 5 machos) de
cada población, los cuales se eligieron con base en los resultados de la
Morfometría, con el fin de obtener los individuos más característicos de cada
población. Los individuos seleccionados fueron aquellos que se encontraban más
cercanos al centroide en los resultados del AD. La Morfometría se utilizó como un
tamizaje, ya que la técnica de ITS es muy costosa por lo que se quería optimizar
los recursos obteniendo un tamaño de muestra final de tres individuos por
población, garantizando que estos fueran característicos de la misma. La técnica
de ITS ha reflejado ser lo suficientemente sensible al utilizar muestras pequeñas,
por lo que se estimó que tres individuos era un número adecuado para el análisis
(Marcilla et al. 2001, datos no publicados Dorn). El tamaño de muestra inicial fue
diminuyendo después de realizar las amplificaciones ya que no todas las muestras
de ADN, obtenidas de los individuos seleccionados, amplificaron; además de que
durante la secuenciación no todas las muestras que amplificaron presentaron
secuencias legibles. El tamaño de muestra final para todas las poblaciones fue de
tres individuos, a excepción de la población silvestre de Trampas de luz de Petén,
de la cual únicamente amplificó un individuo, el cual puede brindarnos cierta
información aunque no es lo ideal. En el caso de los especimenes del Parque
Nacional Laguna de Lachúa, estos no se incluyeron ya que ninguno amplificó.
21
I.4.4.2 Estandarización de la técnica
La primera parte del desarrollo de la técnica fue su estandarización en el
Laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología, para lo cual se utilizaron
tres poblaciones: LaBrea, Jutiapa, Guatemala (Esta población ha sido utilizada en
estudios previos con RAPD´s y ha presentado un alto porcentaje de amplificación,
por lo que se utilizó como un control positivo de amplificación); Intibucá,
Honduras y Santa Fe, Panamá. Las dos últimas poblaciones no habían sido
estudiadas en el LENAP y se incluyeron con el fin de saber si el ITS2 era un
marcador que permitía la amplificación de ADN de esta población.
I.4.4.3 Preparación de soluciones
Para realizar el proceso de extracción se elaboró un buffer de extracción de
ADN y soluciones de acetato de potasio y Tris - EDTA con ARNasa. El buffer se
elaboró a partir de soluciones de NaCl, EDTA y Tris- HCl, las cuales también
fueron preparadas. (ver anexo 1).
I.4.4.4 Extracción de ADN
El proceso de extracción que se realizó es el mismo que fue previamente
descrito por Dorn et al. (2003), con modificaciones descritas en Calderón et al.
(2004). A continuación se describe el procedimiento utilizado.
Se trabajó con individuos adultos de ambos sexos. A cada individuo se le
removieron dos patas.
-Las patas se extrajeron del espécimen con pinzas estériles (las pinzas se
flamearon con alcohol y un mechero, para cada muestra utilizada).
-Se realizó un lavado de las patas con 500 µl etanol y luego con agua.
-Las patas se colocaron en tubos de centrifuga de 1.5 ml, debidamente
identificados.
-Se agregaron 100µl del buffer de extracción.
-Se maceraron las muestras con pistilos estériles.
-Se centrifugaron momentáneamente los tubos para homogenizar todo al fondo.
-Se incubaron las muestras a 65° durante 15 -30 minutos.
-Se agregaron 14µl de K-Acetato 8M frío para una concentración final de 1M.
-Se mezclaron e incubaron en hielo durante 15 minutos.
-Se centrifugaron en frío 10 minutos a máxima velocidad (a 14,000rpm).
22
-Se alícuotaron 200µl de etanol frío al 95%.
-Se transfirió el sobrenadante para cada muestra al tubo con etanol frío al 95%.
-Se agitaron suavemente.
-Se incubaron en hielo 10 min., luego se centrifugó 20 min. en frío a máxima
velocidad. (14,000 rpm) Se descartó el sobrenadante.
-Se lavó el precipitado (hebras de ADN) en 100 µl etanol al 70 % y después en
etanol al 95%.
-Se dejó secar el precipitado por 12 horas.
-Se disolvió el precipitado en 50 µl de TE estéril con 1U ARNasa.
-Se guardaron las muestras a -70°C.
( Landaverde, 2004).
I.4.4.5 Instrumentos para Registro y Medición de las Observaciones
Para llevar un registro ordenado del proceso de amplificación y
corrimiento por electroforesis, se elaboraron hojas de registro en las cuales se
colocó el código de identificación de cada individuo (correspondiente al de la
colección de referencia del LENAP) y la población de la que procedía, además del
nombre de la persona que realizó el procedimiento con la fecha, hora y
observaciones correspondientes (ver anexo 2).
I.4.4.6 Amplificación de ADN
Para la preparación de la mezcla maestra para la amplificación, se utilizó el
procedimiento descrito en Marcilla et al. (2001), con las modificaciones descritas
en la tabla 2 para la estandarización de las condiciones en Laboratorio de
Entomología Aplicada y Parasitología (Bargues 2001, Calderón 2005, con
modificaciones sugeridas en Informe EPS Elizabeth Solórzano, 2007).
Tabla 3. Mezcla Maestra Estandarizada para el ITS2 en Triatoma dimidiata para el Laboratorio de Entomología Aplicada y Parásitología Reactivo Volumen para 1 reacción Agua ultrapura libre de ADNasas 16.6microlitros MgCl2 1 microlitros Termo buffer 2.5 microlitros Dntp´s 0.1 microlitros Cebador 0.1 microlitros (de c/u, P1 y P2) Taq Polimerasa Recombínate 0.2 microlitros
23
Las mezcla se realizó en una campana de flujo laminar tipo 2, para evitar
contaminaciones; posteriormente se alicuotó en unidades de 20.6 microlitros en
tubos PCR y luego a cada alícuota se le agregó 2 microlitros de ADN de las
muestras extraídas.
La Taq polimerasa se agregó previó al ADN y rápidamente se introdujeron
las muestras en el termociclador, este procedimiento imposibilita el
almacenamiento de las alícuotas debido a que una vez agregada la taq se inician
procesos de amplificación no específicos en bajas concentraciones.
En cada amplificación se preparó un control negativo, agregando 2
microlitros de agua a uno de los tubos.
El siguiente paso fue la amplificación, la cual se realizó en el
termociclador Gene Amp PCR Systems 2400, Applied Biosystems, utilizando los
siguientes ciclos, como fueron descritos en el protocolo de amplificación
elaborado por Marcilla et al. 2001 Mol Phylogenetics & Evol 18:136-142.
Ciclos de temperatura
94 °C 2 minutos 25 ciclos de: 94 °C – 30 segundos 58 °C – 30 segundos 72 °C – 30 segundos Y por ultimo 72 °C – 7 minutos I.4.4.7 Montaje y Corrimiento de Geles Preparación de los geles -Se mezclaba 1.5 g. de agarosa y 150 ml. de TBE (1% de agarosa) (ver anexo)
-luego se calentaba hasta que la agarosa se disolvía.
-Se dejaba enfriar a más o menos a 60º C, para poder verterla en el molde.
(Dorn, 2003)
Montaje de los Geles
-Se cubría el gel con una película fina de TBE 0.5X.
-luego se mezclaban 2µl de colorante con 10µl de cada muestra de ADN
amplificado, cada muestra era depositada en el pozo del gel correspondiente.
-Se corría el gel en la cámara de electroforesis, a 110 voltios por 1 hora.
24
-A continuación se colocaba el gel en un recipiente con bromuro de etidio a una
concentración de 10 mg/ml. de 20 a 30 minutos, para colorear las bandas.
-A dos pozos del principio y el final del gel se les colocaba el marcador
molecular; en este caso se utilizó el Hae III con Phi.
(Dorn, 2003)
Lectura y Fotografía Geles
-Se observaba si se habían obtenido las bandas de ADN de interés en los geles,
esto en un transiluminador a una longitud de onda de luz UV 256 nm.
-Se tomaba una fotografía digital que posteriormente era analizada en la
computadora.
Para el proceso de estandarización se llevaron a cabo pruebas que
permitieron comprobar el éxito de la extracción de ADN a partir del análisis de
electroforesis, una vez comprobada la presencia del producto, se procedió a
realizar las pruebas de amplificación. Las pruebas electroforéticas se
realizaron en geles de agarosa al 1%, con diferentes concentraciones de los
reactivos, hasta que se obtuvieron las bandas de ADN más claras. Los geles
fueron posteriormente revelados en un tránsiluminador a una longitud de onda de
luz UV de 256nm y se fotografiaron (ver fotografía) con una cámara digital. Las
imágenes fueron trasladadas a una computadora y luego se analizaron con el
paquete Gene Profiler, para comprobar que la banda obtenida presentaba el peso
molecular esperado al ser comparado con la regla molecular.
25
Fotografía de un gel de agarosa; Amplificación de ADN de 10 especímenes de la población de Intibucá, Honduras y 3 especímenes de la población de La Brea, Jutiapa, Guatemala.
Capturada por Solórzano y Moguel, 2006. En la fotografía se muestran las bandas obtenidas para algunos de los
individuos utilizados, las letras A pertenecen a la población de La Brea, Jutiapa,
Guatemala y las letras H pertenecen a los individuos de la población del Lodo
Negro, Intibucá, Honduras (los códigos presentados son los correspondientes a
cada individuo dentro de la colección de referencia del LENAP). La última banda
del gel pertenece al control negativo (agua más todos los productos de reacción
excepto el ADN), la primera fila de cada gel corresponde al marcador molecular
(en pares de bases, bp) y los números presentes en cada banda del marcador
corresponden a los pesos moleculares de las mismas. Las líneas procedentes del
marcador son las alineaciones hechas en el Programa Gene Profiler, esto, para
observar la correspondencia entre el peso molecular de las bandas obtenidas y las
de la regla molecular (en pares de bases), encontrándose las primeras en la región
intermedia entre las bandas de 1078 y 872 bp; aproximadamente entre la región
de 900 a 1000 bp la cual corresponde al ITS2 más las regiones colindantes, es
decir los genes 18s y 5.8s.
I.4.4.8 Amplificación de la Región de Interes ITS 2
Una vez obtenidos los productos de la extracción de ADN, se procedió a la
estandarización del protocolo de Amplificación del ITS-2 para Triatoma dimidiata
en el LENAP. Se calcularon las cantidades óptimas de cada uno de los reactivos
26
que se utilizaron en el proceso de amplificación; para lo anterior, se partió del
último protocolo para RAPD´s realizado en el laboratorio (Informe EDC,
Elizabeth Solórzano, 2004), en la cual se probaron diferentes cantidades de
DNTP´s, Cloruro de Magnesio, Taq – polimeraza y ADN. Partiendo de esa
información, fue necesario realizar el cálculo de la disolución de los cebadores del
ITS2, el P1 (“forward”) y el P2 (“reverse”), los cuales se denominan así debido a
que durante la amplificación cada cebador se coloca en dirección opuesta; en la
hebra no codificante se coloca el P1 o “forward”, que corre de 3´a 5´, el que se
coloca en la cadena codificante se denomina P2 o “reverse” y corre de 5´a 3´ o en
el sentido inverso al anterior.
I.4.4.9 Purificación
-Se añadieron 10 ml. de isopropanol al 100% a 15ml de buffer de unión.
-Se guardó a temperatura ambiente.
-Se añadieron 2.3mlo de isopropanol a 23 ml. de buffer de unión.
-Se guardó a temperatura ambiente.
Luego, se añdieron 32 ml. de etanol 98% a 8 ml. de buffer de lavado.
-guardando las muestras a temperatura ambiente.
Se procedió añadiendo 4 volumenes del bufer de unión con isopropanol a 1
volumen del producto de PCR.
-Se mezcló bien.
-Se añadió la muestra con el buffer apropiado a la columna giratoria.
-luego se centrifugó la columna a temperatura amiente a 1,00 rpm por 1 minuto.
-Se descarto el fluido.
-y se colocó de nuevo la columna en el tubo colector.
-Se añadieron 650 microlitros de buffer de lavado con etanol a la columna.
-Se centrifugó la columna a 10,000 rpm por gramo durante un minuto.
-Descartando el fluido del tubo colector y se colocó la columna en el tubo.
-Se centrifugó la columna a máxima velocidad a temperatura ambiente por 3
minutos para remover cualquier residuo del buffer de lavado y se descartó el tubo
colector.
-Luego se colocó la columna giratoria en un tubo de elusión
-Se añadieron 50 microlitros de buffer de elución (pH> 7.0) al centro de la
columna.
27
-Se incubo la columna en un cuarto a Temperatura ambiente por un minuto.
-y se centrifugó la columna a máxima velocidad por 2 minutos.
-El tubo de elusión contenía un producto de PCR purificado, se retiró y descartó la
columna.
-Se guardó el purificado a -20ºC
I.4.4.10 Secuenciación
Una vez realizada la purificación de los productos obtenidos del PCR se procedió
a realizar el envió de las muestras a la Estados Unidos donde se llevó a cabo el
proceso de secuenciación, esto debido a la carencia del equipo necesario para
realizar dicho proceso en Guatemala. El proceso de secuenciación se llevó a cabo
en la Universidad de Madison Wisconsin por el MsC. Sergio Melgar, quien
primero realizó una segunda purificación a las muestras y posteriormente realizó
la secuenciación en un secuenciador automático con la técnica de los
dideoxinucleotidos, también conocida como método de Sanger.
La secuencia de ITS2, con la cual se compararon las secuencias obtenidas es la
siguiente: TTAAAAATAAGAAATTATTTTTTAAAAATAATTTCTATAAATGTTATATATATATTTTATATATATATAT ATTGGAAATTTTCTGTTGTCCACATTTATTTGTTGGTACAACAGTATTTCTAAATACATGTTTCTTTTCT TTTGGCATAACTTATTTCTTGTATACTTGTTTGTAAATCTTAGTTTCAATATTAGAAATTTGTAACCTGG CTTATTGGTAATAAATCTCAAGTATAGTAGTGAAATGTTTATGACAGAAGAAAAATTTTTTCGCATCTAG GCATTGTCTGGGCGATTTTTTACTTCTTGTTGTATAAAGCAAGTGATCTACAATTCATTTACTTCGAGTT TACCAATTTTATTATATGTCTGTATTAAACTGCTTATGCAGTTCATGTACAGTAAATATAATTTCAGGTT TTTCAAGTTTTATATTGTGTCAACTATGTAAAATAAGTATGAAATACTGCAATAGAA
(GenBank)
I.4.5 La técnica estadística
I.4.5.1 Análisis estadísticos Morfometría
Se aplicaron técnicas de Morfometría Tradicional. Se realizaron dos tipos
de análisis; el primero fue el análisis libre de isometría con el cual se eliminaron
las diferencias de tamaño isométrico de los datos multivariados, dejando en sí la
geometría del individuo o su conformación. El segundo análisis fue el libre de
alometría, el cual permitió observar las diferencias en cuanto a forma de los
individuos, al eliminar el efecto del crecimiento o tamaño en los datos.
Para el análisis libre de isometría se utilizaron las 91 distancias obtenidas,
a partir de las cuales se obtuvieron variables de conformación o variables libres
de tamaño isométrico (logC) al transformar en logaritmo los valores de las
distancias que se midieron y restarles el valor de la variable de tamaño global,
28
denominada tamaño isométrico (promedio de todas las mediciones de cada
individuo). Las variables de conformación fueron sometidas a un análisis de
componentes principales (ACP), debido a que después de retirar el tamaño
isométrico se perdió un grado de libertad, ya que la suma de los valores de las
variables de conformación para un individuo siempre suma cero (Dujardin 2000).
Los primeros 10 componentes principales que contribuían con al menos el 85%
de la variación pasaron a denominarse componentes de conformación o variables
libres de isometría y se utilizaron como datos en un análisis discriminante. Los
individuos fueron proyectados en diagramas sobre los factores discriminantes para
examinar la diferenciación de los grupos.
Para el análisis libre de alometría (Dujardin 2000) se aplicó el método
propuesto por Klingenberg (1996) para la corrección del tamaño, el cual indica
que la eliminación del efecto del crecimiento implícito en los datos multivariados
(tamaño) se logra proyectando los puntos de datos sobre un espacio que es
ortogonal al vector de crecimiento. El vector de crecimiento será el primer
componente principal común (CPC1) derivado de un análisis de componentes
principales comunes (ACPC). El resto de componentes son considerados como
representaciones de aspectos significativos de la forma ó variables libres de
tamaño alométrico, y pueden ser utilizados como datos en un análisis
discriminante. Este análisis es más riguroso en cuanto al tamaño de muestra, ya
que se considera a cada grupo por separado y no se pueden utilizar más variables
que el número de individuos del grupo más pequeño. Ya que el grupo más
pequeño fue de 6 individuos (trampas de luz, Petén), se usaron para el análisis 5
variables que representaban la configuración general de la cabeza (Largo y
ancho). Las variables utilizadas se obtuvieron de las coordenadas x,y de los
puntos, utilizando el Teorema de Pitágoras y corresponden al largo total, distancia
entre los puntos medios 1-12 y 6-7; Post-ocular, distancia entre 1-2; largo
tubérculo antenífero, distancia entre 4-5; distancia externa entre los ojos, distancia
entre 3-10; y distancia interna entre los ojos, distancia entre13-14. (Ver figura 1).
Posteriormente las distancias se transformaron a logaritmos para poder ser
analizadas. Para poder aplicar este método al conjunto de variables seleccionadas,
fue necesario probar antes la compatibilidad de los datos con el modelo de un eje
alométrico común, es decir, el modelo de los componentes principales comunes
(Dujardin & Le Pont 2000) por medio de una prueba de Chi cuadrado (X2) de
29
bondad de ajuste. Muchas veces cuando se analizan poblaciones muy diferentes,
rara vez siguen el modelo requerido. En este caso, el conjunto de variables
seleccionado no siguió el modelo necesario, por lo que se probó un máximo de 5
combinaciones de 4 variables, los juegos que siguieron el modelo fueron elegidos
para el análisis. En el caso de los machos, el conjunto utilizado fue el de las
medidas Largo total, 1-2, 3-10, 13-14; y para las hembras Largo total, 13-14, 1-2
y 4-5 (Ver figura 1). Para estas variables, se obtuvieron cuatro componentes
principales comunes. El CPC1 fue eliminado por considerarse el vector del
crecimiento y los componentes 2, 3 y 4 fueron utilizados como variables libres
de alometría en un análisis discriminante.
Todos los análisis discriminante realizados se acompañaron de un test de
significancia que indica que tan separadas están las medias (centroides) de los
grupos después de la discriminación. El estadístico Wilks’ Lambda se utilizó para
probar la hipótesis que las medias de los grupos (centroides) son iguales. Lambda
tiene valores entre 0 y 1, valores pequeños indican fuertes diferencias entre
grupos, valores cercanos a 1, no hay diferencias (SPSS ® Base 10.0 Applications
Guide 1999). Los análisis también estuvieron acompañados del estadístico Kappa
(K), el cual proporciona una medición del acuerdo entre la clasificación original
de los insectos en grupos, y la reclasificación producida por el AD, es decir que
cuando un individuo o caso es asignado en categorías por distintos medios, el
investigador quiere saber si las asignaciones están completamente en acuerdo
entre sí, o sí las asignaciones no muestran acuerdo y parecen ser al azar. (SPSS
1999, Siegel & Castellan 1988). Kappa tiene valores entre 0 y 1. Valores entre 0 y
0.20 indican una concordancia leve (cercana al azar); entre 0.21 y 0.40, regular;
entre 0.41 y 0.60, moderada; entre 0.61 y 0.80, sustancial y mayor de 0.80, casi
perfecta (Landis y Koch 1977, citado en Pinto Soares et al 1999).
Los resultados de ambos análisis se proyectaron en gráficas de dispersión
construídas con base en los dos primeros factores discriminates, los cuales
contienen el mayor porcentaje de variación. Para permitir una mejor visualización
de los resultados, se construyeron dendrogramas a partir de los promedios de los
factores discriminantes obtenidos del AD utilizando las distancias euclidianas.
30
Los softwares utilizados para llevar a cabo la técnica de morfometría fueron:
• NTSYS pc 2.02 (Applied Bioestatistics Inc. 1998), para ACPC.
• SPSS 15.0 for Windows para ACP y AD.
• Tet_14, para determinar las distancias.
• Tpsdig.
• FlyVIDEO2000. LifeView.
I.4.5.2 Técnica Estadística ITS2
Las secuencias obtenidas se ordenaron y limpiaron utilizando el paquete de
computo Standen Package, el cual a su vez permitió obtener secuencias consenso
por individuo (obtenida de la comparación de dos lecturas del segmento de
interés, en direcciones opuestas, F en dirección 3´-5´y R en dirección 5´-3´) y
posteriormente una secuencia consenso por población o localidad, según fuera el
caso), obtenidas de la comparación de las secuencias de los individuos
provenientes del mismo lugar o de lugares cercanos. Luego se exportaron lo
archivos de las secuencias consenso en formato fasta, para luego realizar los
análisis de agrupamiento, y construir los dendogramas a partir de análisis de
máxima parsimonia y máxima similitud utilizando los paquetes estadísticos
Clustal X y Phyllip (Comunicación personal MsC. Sergio Melgar, Msc. Amilcar
Sánchez, Ing. Luis Montes y Licda. Claudia Calderón). Además a los árboles
construidos se les aplicó una técnica de remuestreo (bootstrapp) para darle un
soporte estadístico (Felstein, 1985; citado en Marcilla, et al 2001) a partir de 1000
replicas.
31
II PARTE II.1 MARCO TEORICO
II.1.1 Enfermedad de Chagas
En 1909 el médico brasileño Carlos Chagas, reconoció y describió la
tripanosomiasis americana (Monroy 2003; Argueta 1994). La cual con el tiempo
se fue reconociendo en varios países del continente americano.
Actualmente, la enfermedad de Chagas causada por el Trypanosoma cruzi,
es uno de los problemas de salud más importantes en América latina. Se estima
que entre 16 – 18 millones de personas en el hemisferio Oeste están infectados y
más de 90 millones en riesgo de adquirirla (Mark 1991; Matta 1994). La
migración de la enfermedad de Chagas hacia nuevas regiones geográficas, hace
que el número de personas en riesgo aumente, por ejemplo en Estados Unidos, se
estima que 100,000 personas están infectadas (Rocha 1994). Esta enfermedad está
relacionada al área rural y a la pobreza socioeconómica de los países
latinoamericanos (Tabaru 1999).
II.1.2 Triatoma dimidiata
II.1.2.1 Clasificación
La subfamilia de Triatominae (Hemiptera: Reduviidae) incluye 122
especies de insectos hematófagos, que se dividen en 5 tribus y 15 géneros. El
género más numeroso es Triatoma con 70 especies. Dentro del género Triatoma,
varios grupos de especies están asociados por sus características morfológicas y
ecológicas. Actualmente, casi todas las especies, son vectores potenciales de
Trypanosoma cruzi (Panzera 1997). Dentro de estas especies se encuentra el
principal vector en Guatemala y otros países de Centroamérica, Triatoma
dimidiata (Monroy 2003; Monroy 1998; Rodas 1995).
32
Tabla 1. Clasificación taxonómica de Triatoma dimidiata.
Clase Insecta
Orden Hemiptera
Suborden Gynocerata
Familia Reduviidae
Subfamilia Triatominae
Tribu Triatomini
Complejo Phyllosoma
Subgrupo Rubrofaciata
Género Triatoma
Especie Triatoma dimidiata
Tomado de Bustamante 2001b.
II.1.2.2 Control
En Guatemala, antes de 1995, no existían políticas de fumigación para
áreas endémicas de Chagas, únicamente las regiones que se traslapaban con
Malaria o Dengue eran fumigadas (Rodas 1995). Se iniciaron estudios de la
efectividad antitriatomínica de insecticidas órgano fosfatados, piretroides y
carbamatos, tanto en condiciones de campo como de laboratorio, los resultados
obtenidos contribuyeron a presentar una propuesta formal del control de los
vectores de la enfermedad de Chagas (Rodas 1995).
Estudios socio – culturales relacionados a la enfermedad de Chagas, han
permitido conocer los factores de riesgo que contribuyen con una alta
colonización de los vectores a las viviendas (Yamaguchi 1995). Con éste
conocimiento se ha trabajado en la búsqueda de vectores dentro de las casas
utilizando el método hombre/hora (Monroy 1998), la búsqueda es realizada por
técnicos expertos.
Se encontró una cercana relación, al comparar en número de triatominos
colectados por el método hombre/hora, con el número de manchas de excremento
de los vectores en un papel blanco colocado sobre las paredes, por una semana o
más (Monroy 1998).
Los esfuerzos de control han sido varios, desde educación, que incluye el
mejoramiento de las paredes con emplastos y pintura, rociamiento con insecticidas
efectivos, evaluaciones post mejora y rociamiento. Hasta estudios de las
poblaciones de los vectores colectados (tanto domésticos, como silvestres),
33
utilizando diferentes técnicas. Con el trabajo realizado durante años se ha
observado una disminución en el número de vectores dentro de las viviendas, en la
república Guatemalteca (Menes 2004; Díaz 2003; Monroy 2003; Monroy 1998).
En enero del 2000, el Ministerio de Salud en conjunto con la Cooperación
Internacional de Japón (JICA), iniciaron una operación de control de los vectores
de la enfermedad de Chagas en el oriente del país. Este programa tenía como
objetivo la eliminación de Rhodnius prolixus y la reducción de las poblaciones de
Triatoma dimidiata en cinco departamentos: Zacapa, Chiquimula, Jutiapa, Santa
Rosa y Jalapa. Se les dio entrenamiento a los técnicos del área de entomología de
estos departamentos por parte de expertos de la USAC, UVG y JICA, para
conseguir un control a largo plazo. (Nakagawa et al 2003)
II.1.3 Morfometría
La morfometría es la descripción cuantitativa, análisis e interpretación de
la forma y la variación de esta en biología (Rohlf 1990). La Morfometría se usa
en estudios taxonómicos, genéticos y ecológicos, ha sido utilizada en muchos
campos: citología, antropología, geología, paleobiología, nematología y
entomología. (Daly 1985; Rohlf 1990).
Tradicionalmente las variables usadas en los análisis morfométricos son
las coordenadas de los puntos o distancias entre puntos, procedimiento que se
facilita al contar con sistemas de captura y análisis de datos. Una meta de la
selección de variables en la Morfometría, es reducir el volumen de datos tanto
como sea posible, pero sin perder la habilidad de representar la forma de las
estructuras adecuadamente (Rohlf 1990). Se ha mostrado que la discriminación
entre grupos es mejor con el uso de distancias (Strauss & Bookstein, citados por
Rohlf 1990)
Hay varias estrategias para analizar datos. Una de estas es el uso de
métodos estadísticos multivariados convencionales para analizar juegos de
variables morfométricas. (Rohlf 1990). Estos métodos representan el medio más
común de análisis de los conjuntos de variables representando formas biológicas.
Podemos encontrar dos tipos de Morfometría, la Tradicional y la
Geométrica. La Morfometría Geométrica es una técnica que preserva la
información de la geometría del organismo, para esto no se utilizan distancias sino
coordenadas, las cuales se grafican en un espacio cartesiano el cual permite
34
visualizar diferencias de conformación entre grupos e individuos, variación
muestreal, y otros resultados en el espacio de los especimenes originales. Por
otra parte, la Morfometría Tradicional es una aplicación de métodos estadísticos
multivariados a colecciones arbitrarias de variables de tamaño o conformación. La
diferencia entre estos dos tipos, consiste en que en la Morfometría Tradicional se
definen las longitudes o mediciones con el fin de registrar aspectos biológicos
significativos del organismo, pero no se toman en cuenta las relaciones
geométricas entre estas mediciones (Jaramillo & Dujardin 2002).
En este estudio se utilizó Morfometría Tradicional o Multivariada. (Rohlf
& Marcus 1993).
II.1.4 ADN ribosomal
Los organismos eucariotas tienen el ARN ribosomal nuclear organizado en
agrupación que contienen las subunidades 18S, 5.8S y 28S. Los genes que
codifican para dichas subunidades son separados por dos espaciadores internos
transcritos (ITS): El ITS1 que se encuentra separando los genes de las
subunidades 18S y 5.8S, y el ITS2 separa los genes de las subunidades 5.8S y
28S. Estas agrupaciones de genes se encuentran en bloques repetitivos en todo el
genoma (Gomez- Zurita, et al 2000).
El ADN ribosomal (ARNr) ha sido utilizado para análisis filogenéticos
tanto de organismos cercana como lejanamente relacionados. Análisis
preliminares de ADNr en el complejo de Anopheles gambiae han logrado separar
las especies dentro de ese grupo. En insectos como en otros eucariotas, los genes
del ADNr están presentes en numerosas copias, y se encuentran arreglados como
unidades repetitivas unidas en uno o más bloques repetitivos de genes. Cada
unidad consiste de una región transcrita conservada, en donde se encuentran los
genes de las subunidades de los ribosomas, así como dos espaciadores internos
transcritos (ITS1 e ITS2) y un espaciador intergénico variable (IGS)(Beckingham,
1982)
El ITS2 ha sido utilizado como un marcador para resolver relaciones
supra-específicas, específicas, sub-específicas e incluso a nivel de poblaciones en
Triatominos, mostrando buenos resultados, por lo que se considera un buen
marcador para poblaciones de Triatominos de la región (Marcilla et. al 2000).
35
El ITS 2 presenta una longitud típica de 200 a 400 pares de bases y puede
ser amplificado por la Reacción en Cadena de la Polimerasa a partir de una
pequeña cantidad de ADN y posteriormente ser secuenciado. (Young y Coleman,
2004).
36
PARTE III III. RESULTADOS III.1 Morfometría Tradicional
III.1.1 Análisis Libres de Isometría
Los análisis libres de isometría fueron realizados utilizando las 91
distancias posibles entre los 14 puntos tomados sobre la cabeza de los individuos
de Triatoma dimidiata de diferentes poblaciones de Centroamérica. Se trabajó por
separado hembras y machos debido al dimorfismo sexual. Los resultados
obtenidos para los machos se muestran en la gráfica 1 y figura 2, mientras que los
resultados de las hembras se muestran en la gráfica 2 y la figura 3. La Tabla 4
muestra los valores, para machos y hembras, de los estadísticos Wilk`s Lambda y
Kappa con sus respectivas significancias (valor p), así como el porcentaje de
contribución de los 2 primeros factores discriminantes.
Tanto los machos como las hembras presentaron resultados similares en
los análisis. En las gráficas de dispersión (1 y 2) construidas con base en los dos
primeros factores discriminantes producidos en un AD sobre 10 componentes
principales obtenidos en un ACP (75% de la información para machos y 70% para
hembras) sobre las 91 distancias medidas, se puede observar la formación de dos
grupos. El primero está formado por las poblaciones domésticas de Jutiapa
(Guatemala), Santa Ana (El Salvador), Copán (Honduras), Masaya, Carazo y Río
San Juan (Nicaragua) y las poblaciones silvestres de Izabal y Petén (Guatemala);
el segundo está formado por las poblaciones domésticas de Quiché (Guatemala),
Intibucá (Honduras) y Santa Fe (Panamá) y la población peridoméstica de Heredia
(Costa Rica); está última muestra una leve tendencia a separarse del resto de su
grupo. Ambos grupos se encuentran claramente diferenciados sobre el primer
factor (80.8% de la información para machos y 75.1% para hembras), sin mostrar
ningún traslape entre ellos.
El estadístico Wilk´s Lambda (Tabla 4) presentó valores cercanos a 0
(0.012 para machos y 0.009 para hembras), con valores de p<0.05, lo cual indica
que existen diferencias significativas entre al menos uno de los grupos estudiados.
El estadístico Kappa (Tabla 4) presentó valores de 0.675 para hembras y 0.658
para machos con valores de p<0.05, lo cual indica que la reclasificación generada
por el análisis es sustancialmente diferente a una clasificación producida al azar,
37
es decir que existe una concordancia sustancial entre la clasificación original y la
reclasificación producida por el AD.
En las figuras 3 y 4 se muestran los dendrogramas construidos con base en
los promedios del total de factores discriminantes producidos en los análisis
(100% de la información), para machos y hembras respectivamente. Estas figuras
permiten visualizar de una forma más clara la relación entre las poblaciones. Se
puede observar que las poblaciones domésticas de Nicaragua, se agrupan dentro
del mismo bloque, mientras que en el caso de las poblaciones de Guatemala
(Jutiapa y Quiche) y Honduras (Copán e Intibucá), estás se separan a pesar de no
ser geográficamente distantes, aunque si presentan algunas diferencias en cuanto a
su entorno ecológico. Los resultados de los dendrogramas muestran que en el
primer grupo, tanto en hembras como en machos, las poblaciones silvestres de
Petén se separan del resto, lo cual ya ha sido mostrado en estudios previos.
En el caso de los machos, se puede observar que las poblaciones silvestres
de Petén se agrupan dentro de un mismo clado el cual se separa del resto de
poblaciones del grupo, mientras que la población silvestre de Izabal tiende a
agruparse con las poblaciones domésticas del resto del grupo.
Tanto en hembras como en machos hay algunas asociaciones en el primer
grupo que se mantienen, como en el caso de Masaya (Nicaragua) y La Brea
(Guatemala), La Primavera (El Salvador) y Carazo (Nicaragua) y Río San Juan
(Nicaragua) e Izabal (Guatemala). Únicamente la población de Copán mostró una
posición diferente, al agrupase en los machos con Masaya y La Brea y en las
hembras con Izabal y Río San Juan.
Tabla 4. Estadísticos Análisis Libre de Isometría a poblaciones de Triatoma dimidiata.
% var.
Fd 1 % var. Fd 2
Wilk`s Lambda (WL)
p (WL)
kappa (k)
p (k)
% de reclasificación
Machos 80.8% 7.7% 0.012 0.00 0.658 0.00 68.6 Hembras 75.1% 9.4% 0.009 0.00 0.675 0.00 70.3
38
Gráfica 1: Diferencias morfométricas entre 13 poblaciones de Triatoma dimidiata. Gráfico de dispersión construido en base a los 2 primeros factores discriminantes obtenidos de un AD sobre los 10 primeros componentes principales obtenidos de un ACP sobre las 91 distancias calculadas en la cabeza de los machos.
Figura 2: Dendrograma construido a partir de un cluster jerárquico, utilizando los promedios de los factores discriminantes producidos en un AD sobre medidas de la cabeza de los machos de Triatoma dimidiata.
39
Gráfica 2: Diferencias morfométricas entre 12 poblaciones de Triatoma dimidiata. Gráfico de dispersión construído en base a los 2 primeros factores discriminantes obtenidos de un AD sobre los 10 primeros componentes principales obtenidos de un ACP sobre las 91 distancias calculadas en la cabeza de las hembras.
Figura 3: Dendrograma construido a partir de un cluster jerárquico, utilizando la distancia euclidiana, basado en los promedios de los factores discriminantes producidos en un Análisis Discriminante sobre mediciones de las cabezas de las hembras de Triatoma dimidiata. .
40
III.1.2 Análisis Libre de Alometría Este tipo de análisis elimina el efecto del crecimiento sobre las variables
medidas, es decir, elimina el tamaño (representado como el componente principal
común 1-cpc 1-), dejando únicamente las variables de forma (Jaramillo &
Dujardin, 2002). El Análisis Discriminante se aplicó a los componentes
principales comunes 2, 3 y 4; y las gráficas de dispersión se construyeron en base
a los dos primeros factores discriminantes obtenidos ( 92.8 % para machos y 93
% para hembras).
Para llevar a cabo este análisis, se tuvo que probar el modelo de
componentes principales comunes, para lo que se eligieron 5 variables que
representaran el largo y ancho de la cabeza de los insectos. Sin embargo, ni
hembras ni machos siguieron el modelo a partir de esas variables, por lo que se
trabajó probando las diferentes combinaciones posibles de 4 variables. Las
combinaciones que siguieron el modelo (con un p≥0.05) se utilizaron en un
análisis de componentes principales comunes, y luego en el análisis discriminante
ya mencionado, sin embargo los valores fueron muy bajos por lo que no son tan
representativos. Los análisis libres de alometría se utilizan para estudios de
variación intraespecífica aplicados en un mismo contexto: misma especie, mismo
rango geográfico; pues se espera que los individuos tengan una misma manera de
crecer. Es posible que debido a que las poblaciones incluidas provienen de un
rango geográfico amplio, los análisis no hayan sido tan contundentes.
Los resultados de este análisis para machos y hembras se muestran en las
figuras 4 y 5 respectivamente. La significancia de los estadísticos se muestra en la
tabla 5. Los valores de Wilk`s Lambda muestran que existe al menos un grupo que
es diferente del resto (p<0.05), sin embrago los valores de Kappa son más bajos
con respecto a los obtenidos en los Análisis libres de Isometría (ver Tabla 3), con
0.418 para los machos y 0.309 para las hembras, indicando que la reclasificación
producida por el AD tiene una concordancia regular con la clasificación original.
Esto se evidencia en las figuras 4 y 5, donde se observa que a pesar que se siguen
diferenciado claramente los mismos dos grupos, las relaciones al interior de ellos
varían entre ambos sexos, y en el caso de las hembras de Petén, estas se separan
completamente de ambos grupos.
41
Tabla 5. Estadísticos Análisis Libre de Alometría poblaciones de Triatoma dimidiata.
% var. Fd 1
% var. Fd 2
Wilk`s Lambda (WL)
p (WL)
kappa (k)
p (k)
% de reclasificación
Machos 78.6% 14.2% 0.057 0.00 0.418 0.00 45.9 Hembras 71.2% 21.8% 0.142 0.00 0.309 0.00 36.7
Figura 4: Dendrograma construido a partir de un cluster jerárquico, utilizando la distancia euclidiana, basado en los promedios de los factores discriminantes producidos en un Análisis Discriminante sobre mediciones de las cabezas de los machos de Triatoma dimidiata.
Figura 5: Dendrograma construido a partir de un cluster jerárquico, utilizando la distancia euclidiana, basado en los promedios de los factores discriminantes producidos en un Análisis Discriminante sobre mediciones de las cabezas de las hembras de Triatoma dimidiata.
42
III.2 Resultados ITS
La historia evolutiva y el tiempo de divergencia del linaje en insectos
Triatominos están estimados por la inferencia de relojes moleculares del Segundo
Espacio Interno Transcrito (ITS2) del ANDribosomal nuclear de estos reduviidae
(Marcilla, et al. 2001).
El AND ribosomal extraído de las patas de individuos de Triatoma dimidiata
provenientes de diferentes poblaciones de Centroamérica, fue amplificado por
medio de PCR, utilizando cebadores de la región conservada entre los genes 5.8S
y 28S, ver figura No. 6) para producir clones enteros del ITS2. Los cebadores
usados para obtener los fragmentos de ADNr fueron:
ITS-2 forward 5’-CTAAGCGGTGGATCACTCGG-3’
ITS-2 reverse 5’-GCACTATCAAGCAACACGACTC-3’
Figura No.6: Se observan las subunidades de la región transcrita del ADNr.
(Tomado de Collins 1990)
III.2.1 Análisis de las secuencias
De las 14 poblaciones de Triatoma dimidiata estudiadas se obtuvieron 40
secuencias. Estas 40 secuencias fueron limpiadas y alineadas con el paquete para
análisis de secuenciación Staden package, con el cual se observó irregularidad en
algunas secuencias, las cuales fueron limpiadas manualmente, para obtener las
secuencias consenso de cada individuo.
El largo de las secuencias amplificadas con los cebadores ITS2F y ITS2R
fue de aproximadamente 926 pares de bases, de las cuales el fragmento de ITS2
por lo general tuvo un largo entre 476 y 477 pares de bases. Se observó el
microsatélite (AT)5 TTT (AT)7, de la posición 47 a la 73, igual al obtenido por
Bargues 2007 y Dorn 2007 (inéditos), ver esquema 1.
43
Esquema 1. Ejemplo de la secuencia obtenida del ITS2 del individuo de Lachúa, además se puede observar el microsatélite descrito en Bargues 2007 y Dorn 2007. TTAAAAATAAGAAATTATTTTTTTAAAATAATTTCTATAAATTTTATATATATATTTTATATATATATATATTGGAAATTTTCTGTTGNCCACATTTATTTGTNGG NACAACAGTATTTCTAAATACATGTTTCTTTTCTTTTGGCATATCTTATTTCTTGTATACTTGTTTGTAAATCTTAGTTTCAATATTGGAAATTTGTAACCTGGTTTATTGGTAATAAATCTCAAGTATAGTAGTGAAATGTTTATGACAGAAGAAAAATTTTTTCGCATCTAGGCATTGTCTGGGCGATTTTTTACTTCTTGTTGTATAAAGCAAGTGATCTACAATTCATTTACTTCGAGTTTACCAATTTTATTATATGTCTGTATTAAACTGCTTNNNCGGGGCNNANANNGAAAANANANTTCCGGGTTTTCCAGGTTTNNTNTGGGGCCACCNANGAAAAANANGNNNNAAATCCNNCANNNGAA
De acuerdo con la descripción de haplotipos1 de Bargues 2007 (inédito),
de las 14 poblaciones trabajadas se observan 6 haplotipos que coinciden
directamente y 3 que se refieren a poblaciones geográficamente cercanas a las que
fueron trabajadas en este estudio, ver tabla No. 6.
Tabla No. 6: Haplotipos propuestos por Bargues et al. 2007, para algunas de las
poblaciones que se trabajaron en este estudio.
País Localidades Localidad/
Bargues 2007
Haplotipo
Guatemala La Brea / Jutiapa Jutiapa/ Jutiapa T. dim H1
Guatemala Chultún, Yaxha,
Petén
Chultún, Yaxha,
Petén
T. dim H18
Guatemala Yaxhá, petén Yaxhá, petén T. dim25
Guatemala Yaxhá, petén Yaxhá, petén(2) T.dim28
Guatemala Yaxhá, petén Yaxhá, petén(3) T.dim28
Guatemala Yaxhá, petén Yaxhá, petén T.dim30
Guatemala San Andrés
Sajcabajá, Quiché
San Andrés
Sajcabajá, Quiché
T.dim H4
Panamá Veraguas Chiriquí T.dim H16
Panamá Veraguas Chiriquí T.dim H17
El resto de las poblaciones no han sido trabajados para eta nomenclatura
por lo que no tienen un haplotipo asignado.
1 Haplotipo se define como la constitución genética de un cromosoma individual (Wikkipedia). La terminología de haplotipo utilizada en este estudio corresponde a la nomenclatura de Haplotipo compuesto (CH), propuesta recientemente por Bargues et al. 2006.
44
III.2.2 Análisis filogenéticos
Se realizaron tres diferentes árboles de reconstrucciones filogenéticos, con
las secuencias obtenidas. Esto con el objetivo de evaluar las posibles relaciones
según el tipo de análisis aplicado.
En las figuras 7, 8 y 9 se muestran los filogramas construidos con base en
los análisis de las secuencias obtenidas utilizando los paquetes estadísticos Cluscal
W y PHYLML v2.4. De esta forma se visualizan las relaciones presentes entre
las poblaciones.
El primer filograna, figura 7, se construyo utilizando 11 de las 14
poblaciones, debido a que las secuencias de las poblaciones de El Salvador y
Lachúa no pudieron ser comparadas con el resto por las irregularidades en la
lectura de la secuenciación. Y las secuencias de las dos poblaciones de Nicaragua
resultaron idénticas por lo que se obtuvo una secuencia consenso de ambas
poblaciones. En esta figura se puede observar tres tendencias, las poblaciones
cercanas al atlántico, que para fines prácticos serán llamadas poblaciones con
tendencia geográfica hacia el norte de Centro América; en otra rama claramente
definida se agruparon las poblaciones de Petén, y las poblaciones con tendencia
geográfica hacia el sur de Centro América, quedaron en ramas cercanas, ver mapa
1.
La figura 8, fue construida a partir de una análisis de parsimonia
introduciendo como grupo externo a T. nitida (secuencia obtenida del GenBank).
Se observa el patrón de las tres poblaciones de Petén de separarse del resto. Sin
embargo, se da una nueva reorganización del árbol observando con mayor
claridad que la población de Nicaragua se relaciona más con las poblaciones del
Norte.
La figura 9, fue construida con base en el análisis del vecino mas cercano,
teniendo siempre como grupo externo a T. nitida. Se puede observar que la
población de Copan, Honduras se separa del resto de las poblaciones y las tres
poblaciones de Petén siguen formando un grupo.
45
Figura 7: Filograma de Máxima similitud construido a partir de un análisis de remuestreo
(bootstraps) de las secuencias de 11 poblaciones.
Figura 8: Filograma construido con base en el análisis de parsimonia, utilizando T. nitida
como grupo externo.
Figura 9: Filograma construido con base en el análisis del vecino más cercanos
(Maximun Likelihood), utilizando T. nitida como grupo externo.
III.2.3 Análisis de genética de poblaciones
Los análisis de filogenia muestran que muestras del mismo país pueden
formar diferentes agrupaciones. Pocos o un individuo muestreado puede
46
representar una fracción de la variabilidad genética total en poblaciones altamente
heterogéneas (Bargues et al 2007).
Como se observa en el mapa 1, se observa relación entre las agrupaciones
obtenidas en los filogramas y la distribución geográfica de las poblaciones. A
excepción de la población de Quiché las poblaciones geográficamente cercanas,
fueron agrupadas según los análisis filogenéticos aplicados a las secuencias.
Se colorearon las poblaciones para permitir una mejor visualización de su
ubicación geográfica y su relación con el mapa de las placas tectónicas, ya que
nuevos estudios están planteando la relación de la distribución de las poblaciones
de Triatoma dimidiata con la formación del Istmo Centro Americano (Dorn et al.,
2006).
Mapa 1: se observa la distribución de las poblaciones según el patrón que se obtuvo en los filogramas, se marcaron en color azul las poblaciones de Petén; en Rojo las poblaciones de Izabal, Intibucá y Copán; y en verde las poblaciones de Quiché, Rio San Juan y Carazo (Nicaragua), Heredia (Costa Rica) y Veraguas (Panamá)
Mapa tomado de Marshall 2006.
En el mapa 2, se trata de relacionar el mapa geológico de Centro América, según
la distribución de las mayores unidades de formaciones rocosas, con la
distribución de las poblaciones estudiadas, marcadas de nuevo con la misma gama
de colores, que en el mapa anterior, según la agrupación obtenida en los
filogramas.
47
Mapa 2: Basado en mapa geológico de América Central, que muestra la distribución de las mayores unidades rocosas, se localizaron las poblaciones estudiadas para observar la relación con el mismo. Las poblaciones fueron marcadas de la siguiente forma: Petén= azul; Izabal, Intibucá y Copán = Rojo; y Quiché, Carazo, Rio San Juan, Heredia y Veraguas = verde.
Tomado de Marshall 2006.
48
III.2 Discusión de resultados III.2.1 Selección de las poblaciones estudiadas
Triatoma dimidiata es una especie que presenta una amplia
distribución geográfica que va del sur de México, hasta Colombia, Perú y
Venezuela, pasando por toda Centro América (Zeledón 1981), el origen de estas
poblaciones parece ser el sur de México/Norte de Guatemala (Schofield, 2002).
La región Mesoamericana es la más afectada por esta especie, siendo el principal
vector de la enfermedad de Chagas en Guatemala, El Salvador, Nicaragua y Costa
Rica; el segundo en Honduras; y un vector secundario en México (Monroy, 1992;
Schofield, 1994). Schofield (2000) estimó una prevalencia de alrededor de 2.3
millones de personas infectadas en América Central y México, lo cual puede
indicar, según el modelo de Hayes & Schofield (1990) una incidencia que
sobrepase las 70,000 nuevas infecciones al año en ausencia de medidas de control.
El LENAP cuenta con una amplia colección de especimenes de Triatoma
dimidiata procedentes de diferentes países, los cuales se han obtenido por
intercambios y convenios con otras instituciones. Las poblaciones
centroamericanas, se seleccionaron de acuerdo con la disponibilidad de las
muestras y a su importancia epidemiológica y geográfica, tratando de incluir a la
vez, material que no hubiera sido previamente estudiado. En el caso de
Guatemala, la selección se basó en la importancia de las poblaciones: Jutiapa por
su importancia epidemiológica y grado de domesticación y Quiché por el proceso
de domesticación en que se encuentra (abundancia alta, colonización y pocos
casos positivos de la enfermedad), aunque aún se conserva principalmente
peridoméstica (Carlota Monroy, comunicación personal). Debido a la importancia
que están tomando últimamente las poblaciones silvestres debido a los continuos
procesos de reinfestación encontrados en Triatoma dimidiata, se incluyeron en el
estudio cuatro poblaciones (Chultunes, palmeras y Trampas de luz, Petén;
Palmeras, Izabal).
49
III.2.2 Morfometría.
Los estudios filogenéticos y poblacionales en triatominos se han venido
realizando desde hace varios años, aplicándose diversas técnicas, tanto genéticas
como fenéticas. Entre estas se encuentran PCR-RAPD, ITS-2, Electroforesis de
Isoenzimas, Patrones de sensilas antenales, Perfiles de Hidrocarburos Cuticulares
de las alas, Citometría, Morfometría, etc.; permitiéndonos ampliar los
conocimientos sobre este grupo (Calderón, 2002; Marcilla et al., 2000 y 2002;
Ordóñez, 2002; Panzera et al., 1997; Panzera et al., 2006; Panzera et al., 2007;
Dujardin et al., 1999a; Bustamante, 2001b; Bustamante et al., 2003; Calderón et
al., 2004; Schofield et al., 1999).
Dentro de las técnicas utilizadas, la Morfometría ha resultado ser una
técnica de fácil aplicación, utilizada para detectar diferenciación geográfica
intraespecie, así como para diferenciar poblaciones provenientes de distintos
hábitats (Schofield et al., 1996; Casini et al., 1995; Monroy et al., 2003b;
Bustamante et al., 2004; Dujardin et al., 1997 a y b; Dujardin, 1998; Galíndez et
al., 1997; Solís-Mena, 2000; Noireau et al., 1997; Borges et al., 2000).
Actualmente se ha sugerido su uso para guiar estudios moleculares, al detectar
poblaciones interesantes que pueden encontrarse en un proceso de especiación, así
como un tamizaje para seleccionar individuos típicos de una población y de esta
manera optimizar recursos en aquellas técnicas de alto costo que son sensibles a
tamaños de muestra relativamente pequeños.
III.2.2.1 Análisis Libres de Isometría y Alometría
En los análisis se trató de incluir poblaciones que representaran todo el
rango geográfico de distribución de la especie en mesoamérica, con el fin de
abarcar el máximo de variación posible. Los análisis libres de isometría
mostraron la formación de dos bloque o grupos bien diferenciados que no
mostraron ningún traslape entre sí. Las poblaciones provenientes de Nicaragua
(Carazo, Río San Juan y Masaya), se agruparon en un mismo bloque, mientras que
en el caso de Honduras (Copán e Intibucá) y Guatemala (Jutiapa y Quiché), las
poblaciones domésticas se separaron en los dos bloques, a pesar de no estar
geográficamente distantes. La mayor parte de las poblaciones incluidas en este
estudio no habían sido trabajadas anteriormente, mientras otras, como Jutiapa y
50
Quiché, han sido ampliamente estudiadas y se han reportado agrupadas dentro de
un mismo bloque (Bustamante et al., 2004; Menes, 2004).
La inclusión de nuevas poblaciones representando mejor el rango
geográfico podrían modificar las asociaciones previamente descritas y la
formación de los dos bloques que se observan podría estar más relacionada con el
origen de las poblaciones, siendo la meseta central el origen de las poblaciones de
Intibucá (Honduras), Quiché (Guatemala), Heredia (Costa Rica) y Santa Fe
(Panamá); mientras que las poblaciones restantes tendrían su origen en la parte sur
de la cordillera. Esto explicaría de cierto modo la formación, sin embargo aun
quedaría explicar la posición de las poblaciones silvestres de Guatemala.
La población de Petén ha sido ampliamente estudiada con diversas
técnicas genéticas y fenéticas, los resultados más recientes sugieren que se trata de
una especie críptica con un citotipo (Citotipo 2) exclusivamente restricto a ella
(Panzera et al., 2006), estos resultados son una confirmación a la técnica de
morfometría en la que ya se había sugerido que se trataba de una población con
características particulares de adaptación a su medio y que podía encontrarse en
un proceso de especiación (Bustamante et al., 2004; Menes, 2004). Sin
embargo, hasta el momento se habían incluido especimenes colectados en
chultunes, Trampas de luz y madrigueras, como un solo grupo; mientras que
datos de estudios moleculares indicaban que se podía estar hablando de dos o más
poblaciones en el mismo lugar (Bargues et al., 2007, datos no publicados). En este
caso, se incluyeron, en los machos, especimenes colectados con trampas de luz y
en chultunes (hoyos subterráneos utilizados por los mayas como alacenas),
considerándolos como poblaciones distintas, mostrando los resultados que ambas
poblaciones se separaban del resto de las poblaciones domésticas de su bloque y
que aunque tendían a agruparse juntas, presentaban diferencias que indican que
realmente se está hablando de dos poblaciones con características diferentes, las
cuales posiblemente se deban a las adaptaciones propias al hábitat donde se
desarrollan (espacios semiabiertos de bosque; oscuridad y sedentariedad). En las
hembras únicamente se incluyó la población colectada en chultunes, pero al igual
que en el caso de los machos, ésta se separo de las demás poblaciones del bloque.
51
En el caso de la población silvestre de Izabal, está se agrupó con las
poblaciones domésticas del resto de su bloque, aunque tanto en hembras como en
machos, mantuvo su relación con la población de Río San Juan (Nicaragua). Esta
asociación podría estar relacionada con características particulares de estas
poblaciones. La población de Izabal proviene de palmeras, sin embargo, estas
chinches vuelan hacia las viviendas donde han sido reportadas por los moradores,
a diferencia de las de Petén que son completamente selváticas. En el caso de Río
san Juan, se trata de un lugar que se caracteriza por conservarse aun como un sitio
silvestre en el que las chinches también llegan volando a las viviendas.
Con respecto al resto de poblaciones, no se logró encontrar un patrón de
diferenciación entre estas, lo cual podría estar indicando que se mantiene un cierto
flujo entre ellas que hace que permanezcan homogéneas (Calderón, 2002).
Trabajos realizados en el LENAP (datos no publicados) utilizando un rango
geográfico menor que el del presente estudio, han permitido observar diferencias
entre poblaciones geográficas y otros estudios han mostrado diferencias entre
poblaciones provenientes de distintos hábitats (Bustamante, 2001b; Monroy et al.,
2003b; Casini et al., 1995; Dujardin et al., 1997a y b), sin embargo al abarcar un
rango geográfico mayor y ampliar el número de poblaciones, las diferencias
disminuyen y las poblaciones tienden a agruparse, lo cual podría ser lo que se
observa en este caso (Menes, 2004). Aún así es importante mencionar la presencia
de algunas asociaciones que se mantuvieron tanto en machos como en hembras,
como el caso de Masaya (Nicaragua) y Jutiapa (Guatemala), el cual ya se había
reportado anteriormente en Menes, 2004; Santa Ana (El Salvador) y Carazo
(Nicaragua) y Río San Juan (Nicaragua) e Izabal, Guatemala.
Los especimenes utilizados en el estudio han sido identificados por medio
de claves como Triatoma dimidiata. Usinger en 1944, describió para esta especie
tres subespecies denominadas: macullipennis (para la forma mexicana), dimidiata
(para las formas centroamericanas) y capitata (para las formas colombianas). Esto
en base a que el tamaño de los insectos incrementaba gradualmente de norte a sur,
presentando los especimenes mexicanos una cabeza corta y ojos grandes, mientras
que capitata se caracterizaba por poseer una cabeza más alargada y ojos menores;
en Centroamérica se encontraban las formas intermedias. A pesar de estas
52
diferencias, Lent y Wygodzinsky (1979) recomendaron mantener todas las formas
conocidas dentro de una sola especie. En este caso únicamente se incluyeron
poblaciones que correspondería a la forma dimidiata dimidiata, por lo que al
interior del grupo pueden confundirse muchas de las relaciones, ya que no existió
ningún grupo externo que redujera el espacio morfométrico y disminuyera la
variación a un nivel más intraespecífico.
III.2.2.2 Segundo Espacio Interno Transcrito –ITS2-
La estructura genética de Triatoma dimidiata a través de su rango de
distribución ha sido analizado usando varias técnicas moleculares que incluyen,
secuenciación de regiones del genoma de T. dimidiata, citogenética y
determinación del contenido genético, por RAPD-PCR y estudios de isoenzimas.
Los resultados muestran diferencias en las frecuencias de alelos entre poblaciones
(Dorn et al., 2006).
Estudios en localidades especificas muestran la diversidad genética de esta
especie, como en el caso de Jutiapa donde T. dimidiata es casi exclusivamente
doméstica, RAPD-PCR reveló que poblaciones dentro de una casa y una localidad
fueron panmicticas2, con una baja distancia genética y una pequeña diferenciación
(Dorn et al., 2003). Debido a estas clara diversidad en la especie se estudiaron
poblaciones de diferentes localidades de Centro América, ya que las diferencias
encontradas tienen un efecto directo en su control (Dorn et al., 2006)
III.2.2.3 Análisis de secuencias
De acuerdo a la nomenclatura para haplotipos sugerida por Bargues 2007,
se observó que se obtuvieron 9 poblaciones con un haplotipo ya designado
(Bagues et al., 2007), de esta manera se confirma que en una sola localidad como
es el caso de Petén, T. dimidiata presenta diversidad genética en poblaciones
silvestres. Por lo que los estudios poblacionales en sub poblaciones silvestres de
Petén se tornan de suma importancia, ya que los procesos de especiación podrían
estar sugiriendo gran diversidad a niveles sub poblacionales muy elementales, que
pueden o no tener importancia epidemiológica. Para fines de control esta
2 Panmicticas: Forma de reproducción entre individuos pertenecientes a grupos cualquiera que da lugar a una distribución uniforme de los genes en el seno de una población. (Mata & Quevedo 1998)
53
especiación puede significar una amenaza, ya que estudios recientes sugieren el
origen de T. dimidiata en Petén (Dorn et al. 2006, Bargues et al. 2007), y debido
que la perdida de cobertura boscosa se esta dando desmesuradamente, la invasión
de estos vectores a las viviendas humanas puede ser un hecho.
III.2.2.4 Análisis filogenético y genética de poblaciones
Los árboles filogenéticos muestran tres agrupaciones, de las cuales dos se
mantienen y una varía según el análisis aplicado. El grupo de las tres poblaciones
de Petén, se mantiene y se observa mayor cercanía entre las poblaciones de trampa
de luz y chultun, lo que indica que si hay movilidad por búsqueda de alimento y
rituales de apareamiento de las chinches de chultunes. Mientras que las chinches
de palmeras han ampliado su dieta desde insectos hasta pequeños roedores que se
refugian en las brácteas de las palmeras (Monroy C, información directa no
publicada), sumado a los factores climáticos se forman un micro ambiente estable.
Aunque se observó diversidad dentro de estas poblaciones, siempre se
obtuvo una separación clara del resto de poblaciones, lo que una vez más respalda
los procesos de especiación.
El segundo grupo que se mantiene mas o menos constante, es el de la
población de palmeras, Izabal; Intibucá y Copan. A pesar que la población de
Izabal es silvestre se une a Intibucá, Honduras muy cercano, esto puede estar
sugiriendo procesos de migración ínter fronterizos debido a las condiciones
geológicas, ambientales, degradación del ambiente y migraciones humanas. Lo
cual indicaría el mismo caso para Copán. Sin embargo es importante realizar
estudios con mayor detalle en estas poblaciones ya que estos resultados, sugieren
esfuerzos de control inter países.
El tercer grupo que se observa es el esta formado por Quiché, Jutiapa, Panamá,
Costa Rica y Nicaragua, aunque la tendencia es que cada una de estas poblaciones
se mantiene en una rama separada, lo cual indica que a pesar que son poblaciones
cercanas y con alguna relación, se evidencia diversidad genética. Estas
poblaciones pertenecen a ambientes con historias geológicas, diversidad ambiental
y climas diferentes, por lo que es importante conocer un poco más las condiciones
físicas de los lugares de las cuales provienen los especimenes.
54
Se comparó con los mapas geológico y placas tectónicas, ya que por ser
una especie endémica, estudios recientes han encontrado una relación entre la
distribución de las poblaciones de T. dimididata y la historia Geológica (Dorn et
al., 2006, Dorn et al. 2007, Bargues et al. 2007). Por lo que es importante incluir
más poblaciones que sean representativas de cada bloque geológico en toda
Centro América y compararlas utilizando técnicas fenotípicas, genotípicas y
Sistemas de Información Geográfica.
Esta distribución geográfica revela una relación con la historia de
clasificación taxonómica de T. dimidiata. Esta clasificación se ha basado en
caracteres morfológicos y a variado a lo largo del tiempo, según el autor y los
caracteres de importancia, los resultados moleculares están respaldando que se
tiene un complejo de especies. Debido a esto, se sugiere que las poblaciones de
Izabal, Intibucá y Copán pertenecen a T. dimidiata maculipennis, las cuales son de
menos importancia epidemiológica, ya que no se consideran muy buenos vectores,
se debe tomar en cuenta que por su ubicación geográfica y bajos índices de
infección por Tripanosoma cruzi, Quiché es una población que debe someterse a
estudios con nuevos diseños y observar como se relaciona. Para las poblaciones
de Jutiapa, Nicaragua, Costa Rica y Panamá, se sugiere que pertenecen a T.
dimidiata, las cuales son de mayor importancia epidemiológica por su capacidad
de infección. Y las es posible que se este hablando de una nueva especie para la
región de petén y Yucatán.
III.2.2.5 Morfometría e ITS2
Se observa en ambas técnicas la separación de Petén por lo que se puede
respaldar la conclusión que se trate una especie nueva ya que son dos variantes las
que están describiendo a los individuos.
Aunque para seleccionara los individuos que se utilizarían en los análisis
de ITS, de observaron diferente agrupaciones para cada técnica. Se puede
observar la tendencia de Panamá, Costa Rica y Quiché a mantenerse cada uno en
una rama, aunque cercanos nunca siempre se separan, sin embargo en
Morfometría la población de Quiché se une a Intibucá y en ITS2 Izabal se une a
55
Intibucá, lo que requiere realizar un estudio mas detallado con más poblaciones de
esta localidad.
Las poblaciones de Carazo y Rio San Juan de Nicaragua fueron agrupadas
en una sola secuencia consenso, para ITS2, por tratarse de poblaciones con
secuencias idénticas, miestras que en morfometría se observan separadas en todos
los análisis aunque pertenecen a la misma agrupación nunca quedan tan cercanas,
lo que puede indicar que poblaciones genotípicamente idénticas, pueden tener
variaciones fenotípicas debidas a la influencia del medio, esto puede estar
sugiriendo plasticidad fenotípica3 para estas poblaciones (Moguel 2006).
La población de Masaya, Nicaragua no fue incluida en el estudio de ITS2,
debido a la limitante de reactivos, como ya se contaba con dos poblaciones de
Nicaragua se tuvo que sacrificar una. Y la población de Santa Ana, El Salvador,
no se incluyo en los análisis finales debido a irregularidades en las secuencias que
no permitieron su lectura. En morfometría no se incluyo la población de Izabal
palmeras en hembras, ni petén palmeras para ambos sexos, ya que no se llego al
número de individuos requeridos. Al incluir estas poblaciones podría ser posible
que los filogramas y dendrogramas tomen una nueva reagrupación.
Aunque se observaron estas diferencias se puede plantear que la población
de Petén se trata de una nueva sub especie, las poblaciones del sur son
poblaciones T. dimididata con importancia epidemiológica alta y las poblaciones
del norte pueden estarse tratando de T. simidiata maculipennis, con menor
importancia epidemiológica por ser una vector con poca capacidad de transmisión
e infección.
3 Se refiere a la capacidad de medir la influencia del ambiente sobre un individuo o población.
56
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES
1. Al analizar la variabilidad genotipica se obtuvieron las siguientes
concluiones:
a. Se deferenciaron 3 grupos, el primero constituido por las
poblaciones de Petén, el segundo por las poblaciones de Izabal,
Intibuca y Copam (Honduras) y el tercero formado por Quiché,
Panamá, Costa Rica y Nicaragua.
b. Se confirmó que en la localidad de Petén T dimidiata presenta
diversidad genética en poblaciones silvestres.
c. Existe una relación entre los resultados moleculares y la formación
geologica de Centro América, esto ya se ha obtervado en otros
estudios moleculares.
d. Los resultados moleculares respaldan que T. dimidiata se trata de
un complejo de especies.
2. Al analizar la variabilidad fenotipica se obtuvieron las siguientes
conclusiones:
a. Con análisis libre de isometría se detectaron 2 grupos bien
diferenciados que no mostrron traslape, las poblaciones de
Nicaragua en un grupo y Honduras y Guatemala en otro.
b. Se observó que la población de Petén se diferenció del resto de
poblaciones, además dentro del grupo de Petén se logró diferenciar
las poblaciones colectadas en Chultunes y trampas de luz, lo que
indica que realmente se está hablando de dos poblaciones con
características diferentes.
c. La población silvestre de Izabal se agrupo con las poblaciones
domésticas, aunque se mantuvo una mayor relación con la
población de Rio San Juan Nicaragua. En ambos casos las chinches
llegan a las viviendas cercanas de lugares silvestres.
d. Con el resto de las poblaciones no se observó una clara
diferenciación, lo que puede sugerir flujo entre ellas.
57
3. Al comparar los resultados de ambas tecnicas se observó:
a. La población de Petén sugiere que se puede tratar de una nueva
especie según ambas técnicas, y lo respaldan estudios recientes que
la proponen como una especie críptica con un citotipo (Citotipo 2),
exclusivamente restricto a ella.
b. Las poblaciones de Rio San Juan y Carazo resultaron ser idénticas
en la secuencia del ITS2, mientras que morfometría detecto
diferencias, lo que puede estar sugiriendo una plasticidad
fenotípica.
c. El respaldo de una técnica genética con una técnica fenotípica
permite respaldar los resultados obtenidos, y sugerir nuevos
estudios en poblaciones que no quedo clara su ubicación.
d. Ambas técnicas presentan limitantes, como lo son en la
morfometría el tamaño de muestra y en ITS la inversión
económica, pero al respaldar un con la otra se complementa.
4. La inferecia filogenética permitió detectar 3 grupos de importancia
taxonómica y de control, como lo son las poblaciones del norte de Centro
América, T. dimidiata maculipennis; las poblaciones del sur, T. dimidiata;
y las poblaciones de Petén como una nueva especie restringida a esta área.
58
IV.2 RECOMENDACIONES
1. Para las conclusiones del análisis de diferencias genotipicas se sugieres las
siguientes recomendaciones:
a. Es importante realizar estudios con mayor detalle en las
poblaciones de Cenroi América ya que estos resultados sugieren
esfuerzon de control inter países.
b. Las poblaciones estudiadas pertencen a ambientes con historias
geológicas, diversidad ambiental y climas diferentes por lo que es
importante concer un poco más las condiciones físicas de los
lugares de las cuales provienen los especímenes.
2. Para las conclusiones del análisis de diferencias fenotipicas se sugieren las
siguientes recomendaciones:
a. Estudiar con detalle las poblaciones de Petén ya que los datos estan
sugiriendo que en este sitio se encuentre el posible origen para esta
especie.
b. Es importante estudiar las poblaciones silvestres y su relación con
las viviendas humanas, ya que en este estudio se observó una
relación entre las pobalciones de este tipo.
c. Incluir en los estudios poblaciones silvestres de otros países para
poder observar el comportamiento de estas y compararlo con las
poblaciones silvestres de Guatemala.
3. Los resultados de ambas técnicas sugieren:
a. Es importante continuar utilizando más de una técnica en los
estudios poblacionales para obtener resultados más robustos.
b. Incluir grupos externos que permitan observar mejor las relaciones
a nivel intraespecie.
4. Para darle soporte a la inferencia filogenética planteada es importante
continuar con estudios de reclasificación taxonómica para esta especie, en
los que se apoyen técnicas fenotípicas y genotípicas, ya que es un aporte a
las estrategias de control de la región Centro Américana.
59
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Cruz (submitted for publication).
70
IV.4 ANEXOS
71
A continuación se presentan los anexos correspondientes a los que se hacen referencia en el texto. IV.4.1 Anexo# 1: Preparación de Reactivos.
Extracción de ADN: Preparación de Soluciones
NaCl 5M (15 ml)
4.38g de NaCl de peso formula 58.44 g/mol, se aforan en un balon de 15ml. El reactivo
se disuelve en el agua destilada esteril con ayuda de un mezclador , calor y un magneto.
EDTA 0.5M, pH 8 ( 50ml)
9.31 gramos de EDTA de peso formula 372.2g/mol, se aforan en un balon de 50 ml. El
reactivo se disuelve en una cantidad menor de agua destilada estéril, se mide el pH con
ayuda de un pHmetro y se lleva al pH buscado con ayuda de NaOH si la solución esta
muy acida o de HCl si esta muy básica, y se mezcla con ayuda de un mezclador y un
magneto, y por ultimo se afora al volumen deseado con agua destilada estéril.
Tris- HCl 1 M, pH 8 (50 ml)
7.9 gramos de Tris de peso formula 157g/mol, se aforan en un balon de 50 ml. El
reactivo es disuelto en una cantidad menor a la buscada de agua destilada esteril, se
mide el pH de la solución con un pHmetro y se lleva al pH buscado con HCl y con
ayuda de un mezclador magnético, luego la solución se lleva al volumen deseado con
agua destilada eteril.
SDS 10%
Se mezclan 10 gramos de dodecil sulfato de sodio con 100 ml de agua destilada esteril.
72
Buffer de Extracción. (Para obtener a concentración 10X)
Para la preparación del buffer de extracción se mezclan las siguiente soluciones en las
cantidades indicadas
Solución Para 100 ml deBuffer de
Extracción:
Solución stock
0.1 M NaCl 2 ml 5M NaCl
0.2 M sacarosa 6.9 g 342.3 g/mol
50 mM EDTA 10 ml 0.5 M EDTA pH 8
100 mM Tris-HCl, pH
8.0-9.0
10 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.0
0.05% SDS 500 µl 10% SDS
Usando agua estéril se afora la solución a 100 ml, luego es filtrada a través de un filtro
de 0.2 µm y se calienta a 65 ºC por 1 hora. Posteriormente se preparan alícuotas de 1
ml., que deben mantenerse a -20 ºC en condiciones estériles.
TBE al 5X. (1 litro)
• 54g TRIZMA Base
• 27.5g Ácido Bórico.
• 20ml de 0.5ml EDTA (pH 8.0)
• Agregar agua tridestilada para llegar a 1 litro.
• Mezclar bien y disolver todo el sólido en el líquido.
73
TE con 1 U de ARNasa
Para preparar una solución en la cuál se encuentre una unidad de ARNasa por cada 50
microlitros de TE; a partir de una solución de 3,050 unidades por mililitro es decir 3.05
U /ul se midieron 327.86 ul de ARNasa que debían mezclarse con 49672.14 ul de TE.
ETDA 0.5M (pH 8.0)
Para obtener una solución de 0.5M y pH 8.0 se necesita disolver 186.1g en 700 ml H2O.
Ajustar pH a 8.0 con 10M NaOH (~ 50ml). Agregar H2O aforando a 1 litro.
Bromuro de Etidio. (10mg/ml)
*Cuidado: El Bromuro de Etidio es un mutágeno y debe ser manejado con guantes
desechables.
Disolver 200mg de Bromuro de Etidio en 20ml de H2O. Mezclar bien y mantener a
4oC en oscuridad.
74
IV.4.2 Anexo # 2: Hoja para datos de Amplificación
No de corrida de PCR en el termociclador: -------------- Fecha:-------------------
Técnico:-------------------------------------- Taq utilizada:------------
Nombre del programa: ITS2 Cebador:------------------
Especie y Población:---------------------------------------- No de corrida:------------
Observaciones:
No de Muestra 1 2 3 4 5 6
dentificación del ADN
Cebador
No de Muestra 19 20 21 22 23 24
dentificación del ADN
Cebador
No de Muestra 7 8 9 10 11 12
dentificación del ADN
Cebador
No de Muestra 13 14 15 16 17 18
dentificación del ADN
Cebador
75
![INFORME FINAL FODECYT 41-2006 - glifos.concyt.gob.gtglifos.concyt.gob.gt/digital/fodecyt/fodecyt 2006.41.pdf · (Ganoderma lucidum), shiitake (Lentinula edodes), maitake y otros]](https://img.pdfslide.us/doc/110x75/5bdb33c509d3f2e0298b56b0/informe-final-fodecyt-41-2006-200641pdf-ganoderma-lucidum-shiitake-lentinula.jpg)
