MEMOIRE DE RECHERCHE POUR OBTENIR LE DIPLOME …biblio.univ-antananarivo.mg/pdfs/randrianady_sn_m2_02.pdfuniversite d’antananarivo @@@ faculte des sciences *** departement de biochimie

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

FACULTE DES SCIENCES

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DEPARTEMENT DE

BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

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MEMOIRE DE RECHERCHE POUR OBTENIR LE

DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES DE BIOCHIMIE OPTION : BIOTECHNOLOGIE-MICROBIOLOGIE

APPLICATION DES PROPRIETES ANTIMICROBIENNES DE L'HUILE

ESSENTIELLE EXTRAITE DE LA PLANTE Cinnamosma fragans (Mandravasarotra-II) DANS L’ELEVAGE LARVAIRE DE CREVETTES :

Panaeus monodon

Présenté par : RANDRIANADY Ermann Tony

Maître ès-Sciences soutenu le 08 novembre 2002 devant le jury composé de : Présidente : Professeur RALAMBORANTO Laurence Rapporteur : Professeur RAHERIMANDIMBY Marson Examinateurs : Professeur ANDRIANARISOA Blandine Docteur RAMAMONJISOA Daniel

Psaume 31: 15-16 « Mais moi, ô Eternel, je me confie en toi. Je dis: "C'est toi qui es mon Dieu !", mes

destinées sont dans ta main »

Je dédie ce mémoire à : Mes parents, Pour qu’ils trouvent ici l’expression de ma reconnaissance et de mon profond respect pour les sacrifices, les soutiens moraux et matériels qu’ils n’ont cessé de me montrer tout au long de mes études. Que cet ouvrage et ma réussite soient le couronnement de leurs efforts. Mes frères et sœurs, Pour qu’ils sachent qu’à cœur vaillant, rien n’est impossible. Je leur souhaite succès, réussite et plénitude dans tout ce qu’ils entreprendront. La famille Mohamed A et Jeannette, En témoignage de ma gratitude pour les aides inoubliables que vous m’avez toujours accordées dans tous les moments difficiles de mes études. Toute ma promotion de la Faculté de Sciences, En souvenir des tendres et dures années que nous sommes passées ensemble. Que Dieu de la paix vous rende en centuple tous les biens que vous

avez fait pour moi.

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REMERCIEMENTS Avant d’entamer ce travail, il m’est agréable d’exprimer ma gratitude à : -Madame RALAMBORANTO Laurence, professeur Titulaire à la Faculté des Sciences d’Antananarivo de m’avoir fait le grand honneur d’accepter de présider le jury de ce mémoire, veuillez trouver ici le témoin de mon profond respect pour la bienveillance dont vous avez fait preuve à mon égard.

-Madame ANDRIANARISOA Blandine, professeur Titulaire à la Faculté des sciences de l’Université d’Antananarivo -Monsieur, RAMAMONJISOA Daniel, Maître de conférence à la Faculté des sciences de l’université d’Antananarivo. qui malgré leurs lourdes tâches, ont pu se rendre disponible afin de faire partie du jury. Je suis également très reconnaissant à Monsieur RAHERIMANDIMBY Marson, professeur à la Faculté des Sciences d’Antananarivo, qui a bien voulu accepter de m’encadrer et qui n’a ménagé ni son temps, ni sa patience, ni ses conseils durant la réalisation de ce mémoire. Qu’il soit assuré de mon entière reconnaissance. Mes vifs remerciements aussi à Monsieur RANDRIANASOLONJANAHARY Henri, Directeur du CDCC, Gérant de la société NATURALLIA de Madagascar, de m’avoir confié ce thème de recherche et pour ses précieuses aides. Comme ce présent travail a été réalisé dans le laboratoire de Pathologie de crevettes du Centre de Développement de la Culture de Crevettes Antsahanibingo-Mahajanga, il m’est donc impossible de ne pas remercier le responsable de ce laboratoire. Ainsi, mes sincères remerciements à Madame Juliette RASOARINORO, pour sa franche et efficace collaboration, ainsi que pour sa contribution dans la réalisation technique et matérielle de ce mémoire, grâce à notre prière et votre encouragement, ce travail a pu aboutir. Finalement, je rends hommage à tous ceux qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce mémoire.

TABLE DE MATIERES I-INTRODUCTION GENERALE............................……....……………………… II-RESUME BIBLIOGRAPHIQUE II-1) La crevetticulture..........................................................……………………… II-1-1) Résumé des principales activités rencontrées dans la crevetticulture a) Ecloserie.........................................................................…...……

b)Bassin.......................................................................................…. II-1-2) Rappel de la biologie de crevettes Panaeus monodon....................… II-2) Généralités sur les huiles essentielles...........................................................…. II-2-1) Historique...................................................................................….. II-2-2) Définition.....................................................................................…. II-2-3) Répartition et localisation chez la plante.......................................…. II-2-4) Fonctions des huiles essentielles chez la plante.........................…...... II-2-5) Caractéristiques.............................................................................… II-2-6) Composition chimique...................................................................… II-2-7) Propriétés pharmacologiques.......................................................….. II-2-8) Utilisations des huiles essentielles...................................................... II-2-9) Conservation...........................................................................…..… II-3) Vibrionaceae.............................................................................................…... II-3-1) Définition..................................................................................…… II-3-2) Morphologie et structure..............................................................…. II-3-3) Classification...............................................................................…. II-3-4) Culture et croissance.................................................................…… II-4) Description botanique et utilisation empirique de la plante C. fragans.........….. II-4-1) Systématique botanique............................................................……. II-4-2) Description botanique.................................................................….. II-4-3) Répartition géographique..............................................................… II-4-4) Données ethnobotaniques..........................................................…... III-MATERIELS ET METHODES III-1) Recherche de la population microbienne présente dans l’échantillon (larves,

post-larves, eau d’élevage)..................................................................…. III-1-1) Isolement des colonies microbiennes.........................................…… III-1-1-1) Préparation des suspensions mères................................…. III-1-1-2) Ensemencement bactérien.............................................…. III-1-1-3) Purification des colonies isolées................................…..... III-1-1-4) Conservation..............................................................…... III-1-2) Identification microbienne..........................................................….. III-1-2-1) Etude des caractères culturaux...................................…... A) Sur milieu solide.................................….......................… B) Sur milieu liquide......................................................….... III-1-2-2) Etude des caractères morphologiques d’une cellule............ A) Examen à l’état frais......................................................... B) Examen après coloration Gram......................................…

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III-1-2-3) Etude des caractères biologiques...................................….……………... Type respiratoire.........................................……..........……. III-1-2-4) Etude des caractères biochimiques et physiologiques......... A) Tolérance à la salinité du milieu..............…....................... B) Recherche de catalases.................................................…. C) Recherche d’oxydases...................................................… D) Recherche d’indoles et de l’uréase................................…. E) Test au milieu Hajna-Kligler.............................................. F) Test à l’API 20 NE.......................................................…. III-2) Recherche de la population microbienne impliquée dans la mort de larves et de post-larves.........................................................................................…..........… III-3) Etudes physique, chimique, microbiologique et biologique de huile essentielle III-3-1) Extraction...................................................................................… III-3-2) Etudes physique et organoleptiques...................…...................…… III-3-3) Etude chimique.........................................................................…... III-3-4) Etude microbiologique ..............................................................….. A) Détermination de CMI, CMB et la concentration en huile essentielle utilisable dans le traitement de maladie en larviculture de crevettes........... B) Comparaison de l’action inhibitrice de l’huile essentielle et celle de l’antibiotique Elvagine......................................................................................... C) Comparaison de l’action inhibitrice de l’huile essentielle et celle des autres antibiotiques utilisés dans le traitement de larves et post-larves de crevettes (oxytetracycline, terramycine).......................................………................. D) Test du pouvoir antimicrobien de l’odeur de l’huile essentielle..… E) Comparaison de l’effet antimicrobien de l’huile essentielle et celui des autres huiles essentielles extraites de Eucalyptus citrodora, Citrus simensis....... III-3-5) Etude biologique : Toxicité de l’huile essentielle vis à vis de larves et post-larves de crevettes...................................................................................…. IV-RESULTATS IV-1) Isolement............................................................................................……… IV-1-1) Préparation de la suspension mère...............................................…. IV-1-2) Ensemencement bactérien.........................................................…... IV-1-3) Purification des colonies..............................................................… IV-1-4) Conservation.............................................................................….. IV-2) Identification.................................... .......................................................….. IV-2-1) Caractères culturaux...................................................................…. IV-2-2) Caractères morphologiques..........................................................… IV-2-3) Caractères biologiques................................................................…. IV-2-4) Caractères biochimiques et physiologiques....................................... IV-2-5) Noms de genres et d’espèces des bactéries isolées............................IV-3) Recherche de la population impliquée dans la mort de larves et post-larves de crevettes ...........................................................................................................…..

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IV-3-1) Expériences avec les larves.........................................................…. IV-3-2) Expériences avec les post-larves.................................................…. IV-4) Etudes physique, chimique, microbiologoque et biologique de l’HE........……

IV-4-1) Etude physique..................................….....................................…. IV-4-2) Etude chimique..........................................................….............…. IV-4-3) Etude microbiologique....................................….......................….. A) Détermination de CMI, CMB................................................…... B) Détermination de la concentration en HE utilisable in vivo........... C) Action antimicrobienne de l’HE et de l’Elvagine........................... D) Action antimicrobienne de l’HE, Elvagine, OTC, Terramycine...... E) Test du pouvoir antimicrobien de l’odeur de l’HE……………….. F) Effet antimicrobien de l’HE de C.fragans, E.citrodora, C.simensis… IV-4-4) Etude biologique : Test de toxicité............................................…... V- DISCUSSION.....................................…............................................……….... VI- CONCLUSION GENERALE.........................……..................................……. BIBLIOGRAPHIE ....................................................…...............................……. ANNEXES

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LISTE DES ABREVIATIONS A : Absorbance API : Analytical Profil Index CDCC : Centre de Développement de la Culture de Crevettes CMB : Concentration Minimale Bactéricide CMI : Concentration Minimale Inhibitrice °C : degré celcus CPG : Chromatographie en Phase Gageuse DL : Dose Létale DO : Densité Optique EDTA : Ethyle Diamine Tetra-acétique Acide Ex : Exemple. g : gramme h : heure HE : huile essentielle JICA : Japan International Cooperation Agency kg : kilogramme l : litre m : mètre m/m : masse sur masse mm : millimètre mn : minute ml : millilitre NE : Non Entérique nm : nanomètre OTC : Oxytétracycline PL : Post-Larve ppm : partie par million s : seconde SARL : Société à Responsabilité Limitée TCBS : Thiosulfate Citrate Bile Saccharose TSA : Trypticase Soy Agar u.f.c : unity forming colonie U.V. : Ultra Violet µl : microlitre > : Supérieur à

LISTE DES FIGURES ET SCHEMAS

Figure 1- Schéma de la plante Cinnamosma fragans…………………………………Figure 2- Alambic pour la distillation des huiles essentielles……………..……..……. Figure 3- Histogramme de taux de survie de larves de crevettes................................. Figure 4- Histogramme de taux de survie de post-larves de crevettes.........................

Détermination de CMI et CMB Figure 5- Courbes de croissance de Vibrio damsela............................................…… Figure 6- Courbes de croissance de Vibrio anguillarum-like...................................... Figure 7- Courbes de croissance de Vibrio sp3......................................................….. Figure 8- Courbes de croissance de Vibrio sp1...................................................….… Figure 9- Courbes de croissance du mélange de population de Vibrionaceae.…..........

Comparaison de l’effet de l’HE et celui de l’Elvagine Figure 10- Courbes de croissance de Vibrio damsela............................................….. Figure 11- Courbes de croissance de Vibrio anguillarum-like...............................…. Figure 12- Courbes de croissance de Vibrio sp3.....................................................…. Figure 13- Courbes de croissance de Vibrio sp1....................................................…. Figure 14- Courbes de croissance du mélange de population de Vibrionaceae......…... Figure 15- Photos du test de sensibilité du mélange de population de Vibrio vis à vis de l’HE, Elvagine, Terramycine, OTC............………........................................... Figure 16- Photo du test de sensibilité de la population de Vibrio vis à vis des HE extraites de C. fragans, E. citrodora, C. simensis..................................................…. Figure 17- Courbe représentative de la toxicité aiguë de chaque stade larvaire............

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Tableau I Tableau II Tableau III Tableau IV Tableau V Tableau VI Tableau VII Tableau VIII Tableau IX Tableau X Tableau XI Tableau XII Tableau XIII Tableau XIV Tableau XV Tableau XVI Tableau XVII Tableau XVIII Tableau XIX Tableau XX Tableau XXI Tableau XXII Tableau XXIII Tableau XXIV Tableau XXV Tableau XXVI Tableau XXVII Tableau XXVIIITableau XXIX Tableau XXX

LISTE DES TABLEAUX Tableau récapitulatif du principe d’identification microbienne à partir du test API 20NE……………………………………………………… Résultats de l’ensemencement issus de la suspension diluée à 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 et 10-5…………………………………. Noms provisoires des colonies issues de la suspension diluée à 10-4 et 10-5………………………………………...…………. Caractéristiques des colonies bactériennes isolées............................….Caractères culturaux sur milieu liquide............................................….. Caractéristiques d’une cellule vivante….....................................….…..Coloration GRAM...................................................................………. Tolérance en NaCl..........................................…....................…..…… Test biochimiques : catalase, oxydase, uréase, indole, Hajna-kliger…... Test biochimiques et anaboliques : API 20 NE..................................... Nom de genre et d’espèce des souches isolées........................….......... Détermination des populations microbienne impliquées dans la mort de larves ou post-larves : Expériences avec les larves Eau d’élevage ajoutée de Vibrio splendidus-II.................….....……….Eau d’élevage ajoutée de Vibrio sp1.........................................………. Eau d’élevage ajoutée de Vibrio anguillarum-like........................ …… Eau d’élevage ajoutée de Vibrio damsela......................…...…........…. Eau d’élevage ajoutée de Vibrio sp2......................................….…..…. Eau d’élevage ajoutée de Vibrio sp3............................................…….. Expériences avec les post-larves Eau d’élevage ajoutée de Vibrio splendidus-II........…………………...Eau d’élevage ajoutée de Vibrio sp1........................…………………... Eau d’élevage ajoutée de Vibrio anguillarum-like..…………………… Eau d’élevage ajoutée de Vibrio damsela.............…............…………. Eau d’élevage ajoutée de Vibrio sp2.....................…..............………... Eau d’élevage ajoutée de Vibrio sp3....................................….….…… Rendement de l’extraction de l’HE C. fragans..............................…… Caractères organoléptiques de l’HE........................................…..…… Miscibilité de l’HE avec l’eau de mer............................................…… Effet antimicrobien de l’HE, Elvagine, Terramycine, OTC.............…... Test de toxicité aiguë de PL.............................................….....……… Détermination de DL100, DL50, DL0 de PL........….....................……

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Toxicité aiguë de larves (nauplii, zoé, mysis)................……………….

RESUME

L’application d’un agent antimicrobien in vivo nécessite toujours la détermination in vitro des différentes concentrations limites et la recherche des différentes propriétés physiques, chimiques et pharmacologiques. Nous avons étudié l’utilisation d’un nouvel agent antibactérien, l’huile essentielle extraite de la plante Cinnamosma fragans. Il nous a fallu isoler puis identifier les Vibrio dominants dans le site d’aquaculture où nous avons mené l’étude. Six types de Vibrio ont été isolés dont 3 identifiés : Vibrio damsela, Vibrio anguillarum-like et Vibrio splendidus-II. Les 3 restants ont été nommés Vibrio sp1 , Vibrio sp2 et Vibrio sp3. Tous les Vibrio ne sont pas pathogènes pour les crevettes : ils peuvent être classés suivant l’importance du taux de mortalité qu’ils engendrent; le plus dangereux est Vibrio damsela suivi par Vibrio anguillarum-like, Vibrio sp1 , Vibrio sp3 , Vibrio splendidus-II et enfin Vibrio sp2 . La recherche du pouvoir antimicrobien de l’huile essentielle se fait par la méthode turbidimétrique. La concentration minimale inhibitrice bactériostatique (CMI) et la concentration minimale bactéricide (CMB) ont été déterminées. Les Vibrio les plus pathogènes ont une CMI de 1,66µl/ml et une CMB de 3,33µl/ml. Pour les autres Vibrio, la concentration 1,66µl/ml constitue déjà une CMB. La conversion de ces concentrations trouvées in vitro en concentration utilisable in vivo donne la valeur 4ppm comme quantité d’huile essentielle de Cinnamosma fragans convenable pour le traitement de la maladie vibriosis rencontrée dans l’élevage larvaire. La comparaison des effets de cette huile essentielle avec ceux de l’Elvagine (antibiotique utilisé au centre CDCC) a confirmé son efficacité : elle a une action persistante par rapport à l’Elvagine. L’action est en général bactériostatique pendant le premier jour de contact avec les microbes et devient bactéricide dans les jours suivants, alors que celle de l’Elvagine est tout de suite bactéricide mais une reprise de croissance est observée à partir du 2ème ou 3ème jour. L’odeur de l’huile essentielle inhibe la croissance des Vibrionaceae. La ténacité de cette odeur dure environ 3h 30mn. Par rapport aux autres huiles essentielles extraites de plantes locales (Eucalyptus citrodora, Citrus simensis), l’activité antimicrobienne est comparable à celle de C. simensis, mais plus importante que celle de l’E. citrodora. Le choix de cette huile essentielle repose alors sur l’importance du rendement qui est 1,25% en 2,5h d’extraction et sur l’abondance de la plante C. fragans dans la région où la crevetticulture a connu un essors considérable (Nord-Ouest de Madagascar). La toxicité aiguë de l’huile essentielle varie en fonction du stade larvaire ou post-larvaire allant de 0,6ml/l pour les nauplii, 0,8ml/l pour les zoés, 1ml/l pour les mysis et 2ml/l pour les post-larves. La miscibilité de l’huile essentielle à l’eau de mer se caractérise par la formation d’une solution limpide opalescente avec de fines gouttelettes dans tout le volume. Cette miscibilité est parfaite en mélangeant l’huile essentielle avec du tween-80 à raison de 10%.

Mots clés: Activité antimicrobienne, Huile essentielle, Crevetticulture, Vibriosis, Cinnamosma fragan

I

INTRODUCTION

Introduction générale

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I –Introduction générale

Les crevettes sont classées parmi les produits de luxe sur le marché mondial. Leur exploitation contribue considérablement au développement économique des pays producteurs. Madagascar se procure par l’aquaculture crevettière les 15% des recettes des produits exportés. (33) Au milieu de la décennie 1990, la pêche crevettière a atteint d’après les résultats officiels, son niveau maximum de production. Cela est certainement dû au le fait que les produits de mer constituent une grande partie de l’alimentation humaine. La délimitation de la zone de pêche nationale a entraîné la surexploitation. En effet, depuis quelques années, la production de la pêche crevettière située sur la côte Ouest de Madagascar est proche du maximum admissible sans endommager le stock naturel. L’expansion de ce secteur d'activité ne pourra donc se faire que par l’intermédiaire de l'aquaculture (8). C'est ainsi que le Centre du Développement de la Culture de Crevettes a été créé en juillet 1996. Et en avril 1998, un programme de collaboration intitulé « Projet de Développement de l'Aquaculture dans la Région Côtière Nord-Ouest de Madagascar » a été conclu entre le gouvernement malagasy et l'agence japonaise de coopération internationale (JICA) pour promouvoir l'aquaculture artisanale et à petite échelle(33). Le centre dispose d’une écloserie qui a pour objectif de déterminer la meilleure approche méthodologique et les normes biotechniques d’élevage de crevettes Panaeus monodon. Le but est de produire des post-larves saines, prêtes à l’élevage sur bassin. Des expérimentations visant à maximiser le taux de survie des post-larves sont effectuées au sein du centre depuis 1998. Ces expérimentations ont permis de conclure que l’utilisation de l’EDTA (chélateur de métaux lourds), de substances antimicrobiennes qui sont des antibiotiques (OTC, Elvagine) et des agents désinfectants (formol) ont donné comme résultats des taux de survie de 20 à 30% alors que dans le cas où l’on n’utiliserait pas ces produits, le taux de survie est de 0 à 4% (32)(34). Les résultats des expérimentations nous amènent à penser à l’existence de développements microbiens sous certaines conditions dans l’eau d’élevage de ces crevettes et ce seraient ces proliférations microbiennes que les post-larves ne supportent pas, se traduisant par une augmentation de leur taux de mortalité.

Les phénomènes ne sont pas nouveaux dans le domaine de la crevetticulture. Plusieurs recherches sur la maladie d’origine microbienne ont été déjà effectuées dans plusieurs sites de culture de crevettes du monde entier et une écloserie inclut toujours un laboratoire de pathologie. Aujourd’hui, les scientifiques admettent que les bactéries responsables de la maladie de crevettes proviennent dans la plupart des cas de la famille des Vibrionaceae (64), (47), (48), (49), (18). La microbiologie des crevettes se ramène donc à celle des Vibrionaceae. Ce thème de recherche est le fruit de la collaboration avec la société Naturallia Madagascar dont l’une des activités principales est la production d’huiles essentielles provenant des plantes aromatiques malgaches. L’objectif de ce mémoire consiste à apporter des traitements aux eaux d’élevage de crevettes par l’utilisation de l’huile essentielle extraite d’une plante locale Cinnamosma fragans. Nous avons exploité les propriétés antimicrobiennes de cette huile essentielle pour protéger les larves et post-larves de crevette contre les infections dues aux Vibrio sp. Il s’agit de dégager un mode de prescription adéquat pour l’utilisation de cette huile essentielle dans le traitement des crevettes.

Introduction générale

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Seront présentées successivement dans ce mémoire : - Une première partie qui est un rappel bibliographique sur la crevetticulture, sur les huiles essentielles, sur les Vibrionaceae et une description botanique avec les utilisations empiriques de la plante Cinnamosma fragans. - La deuxième partie porte sur l’étude microbiologique des crevettes et les effets de chaque type de microbe isolé sur la survie des larves et des post- larves de crevettes. - La dernière partie rapporte l’étude des différentes activités antimicrobiennes et sur la toxicité de l’huile essentielle de Cinnamosma fragans.

II

RESUME BIBLIOGRAPHIQUE

Résumé bibliographique

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II- Résumé biliographique

II-1) La Crevetticulture Les crevettes sont des produits très recherchés sur les marchés internationaux, donc d’un très grand intérêt économique. L’exploitation se fait par pêche, conduisant à la recherche permanente de nouveaux fond toujours plus lointains et plus profonds. Du fait de la complexité de la croissance, de la durée nécessaire pour atteindre la première maturité sexuelle et de la brièveté de leur vie, les crevettes sont sensibles à la surexploitation. Sous peine d’une disparition irréversible des ressources et face à la forte demande mondiale en crevettes, des expériences de transplantation ont été entamées, c’est à dire qu’une espèce est introduite dans une région qui lui est naturellement étrangère comme si le cycle biologique de crevettes était reconstitué dans un milieu artificiel. Le but est d’abord de produire des larves dont la perte en milieu naturel est considérable puis de procéder à l’engraissement intensif de ces larves jusqu’au stade adulte commercialisable. L’aquaculture permet ainsi d’atteindre une exploitation comparable à celle des végétaux et animaux terrestres. II-1-1) Résumé des principales activités rencontrées dans la crevetticulture a) L’écloserie (10)

L’écloserie assure la production de post-larves saines, prêtes à être transférées dans les bassins de prégrossisssement et de grossissement. a-1) Réseau de fluides L’écloserie utilise de l’eau douce, de l’eau de mer et de l’air. L’eau douce sert au nettoyage des équipements et au rinçage de tout le petit matériel. Elle sert aussi à baisser la salinité de l’eau de mer (cas de nurseries). L’eau de mer est utilisée après filtration sur sable à faible granulation, puis utilisant un filtre à cartouche CUNO de 5 à 0,3µm. Ainsi traitée, elle sert à alimenter toutes les unités. L’air permet d’ajuster la concentration en oxygène dans les bacs d’élevage. a-2) Unité de maturation Cette unité assure le stockage de géniteurs dans le bac de maturation. Elle a pour objet de fournir aux géniteurs les conditions propices pour le développement des gonades en vue d’obtenir une meilleure reproduction et des œufs bien fécondés. a-3) Unité pondoir C’est l’unité de production d’œufs. Les femelles dont les gonades sont jugées matures y seront transférées. a-4) Unité éclosoir C’est là que se déroule l’éclosion des œufs de crevettes pour donner des larves nauplii. Elle se trouve généralement dans le même local que le pondoir. Le but est d’établir des bonnes conditions pour l’éclosion des œufs afin de séparer définitivement les bons des mauvais œufs. a-5) Unité élevage larvaire Cette unité assure le bon déroulement du développement des différents stades larvaires allant du nauplii au post-larve. Elle constitue l’étape la plus importante et la plus délicate dans le cycle d’élevage en écloserie. Cette phase d’élevage se déroule pendant 12 à 15 jours dans les bacs d’élevage.


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a-6) Unité nurserie Cette unité termine les différentes étapes d’élevage en écloserie. Elle assure la

croissance des post-larves P5 (une post-larve de 5 jours, âge compté à partir du dernier stade de mysis) jusqu’à P12 où elles seront ensemencées dans les bassins de prégrossissemnt ou directement dans le bassin de grossissement. Quelquefois, les post-larves doivent y rester jusqu’à P20 - P30 lorsque c’est nécessaire notamment en saison froide. a-7) Unité production d’artémia Elle assure l’éclosion des cistes d’Artémia pour donner des nauplii qui constituent l’aliment frais des larves à partir du stade zoé. La qualité et la quantité des nauplii obtenus sont déterminantes pour la réussite de l’élevage larvaire. a-8) Unité production d’algue unicellulaire Elle assure l’entretien et la multiplication des souches de phytoplancton. Aujourd’hui, les espèces cultivées pour l’élevage larvaire sont : Chaetoceros gracilis, Platymonas suesica, Isochryis sp et Thalassiosira pseudonana. Un mois avant la date de ponte, l’unité doit démarrer la production pour arriver au moins aux volumes de 150 à 200 litres dès l’apparition des premières zoés-1 en élevage larvaire. a-9) Unité pathologie Elle assure l’autocontrôle dans l’écloserie. Elle a pour tâche de vérifier l’état de santé des géniteurs, larves et post-larves dans l’écloserie. Elle est équipée d’un laboratoire d’analyse de crevettes, d’eau, de bactéries, de différents paramètres physico-chimiques. Cette unité est opérationnelle pour toutes les autres unités. b) Les bassins (35) b-1) Prégrossissement. Cette étape inclut la production de juvéniles. Les post- larves sont élevées dans le bassin de prégrossissement jusqu’à ce qu’elles acquièrent environ un poids de 2g. Cette phase dure 30 à 50 jours. b-2) Grossissement. C’est la dernière étape du cycle de vie des crevettes dans son milieu de culture artificiel. Les crevettes sont élevées jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade adulte commercialisable. Les différentes activités rencontrées sont : le suivi des paramètres physico-chimiques (pH, O2 dissout, NH4

+,...), la distribution d’aliment, le changement d’eau et l’échantillonnage (suivi de biomasse) II-1-2) Rappel de la biologie de crevettes Panaeus monodon : Les raisons du choix de Panaeus monodon ou “giant tiger” reposent sur le fait que cette crevette s’adapte bien au climat tropical chaud, se traduisant par une croissance rapide pouvant satisfaire la forte demande mondiale.


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a) Classification (30)

Règne........................: Animal Embranchement.........: Arthropodes Sous-embranchement : Mandibulates Classe....................... : Crustacés Sous-classe ...............: Malacostracés Super-ordre................: Eucarides Ordre.........................: Décapodes Famille.......................: Penaeidae genre..........................: Panaeus espèce........................ : monodon a) Biologie Les adultes vivent en mer dans les zones profondes de 20 à 70m. La reproduction dépend surtout de la saison, des conditions climatiques (salinité et température) et également des cycles lunaires. Après l’éclosion des œufs, ( >1.000.000 par femelle) les larves ont une période planctonique. Au cours de 2 à 3 semaines de l’éclosion, les larves passent par différents stades larvaires (nauplii, zoé, mysis) et se terminent par le stade post-larve. Les post-larves vont remonter dans les estuaires, mangroves où elles restent 4 ou 5 mois. Elles se nourrissent de petits crustacés, de moules de vers et de détritus. Devenues sub-adultes, les crevettes retournent en mer profonde pour recommencer un nouveau cycle de reproduction. (9) II-2) Généralités sur les huiles essentielles II-2-1) Historique (70) Les intérêts des huiles essentielles sont connus depuis la haute antiquité : - les Egyptiens préparaient l’essence de cèdre par distillation sèche 4000ans avant Jésus Christ, ils pratiquaient aussi la momification à l’aide des essences aromatiques dont ils avaient remarqué les propriétés antiseptiques. - 2000ans avant Jésus Christ, un chinois découvrait l’hydrodistillation qui est la technique d’extraction la plus répandue. - Au XIIIè siècle, le romarin est utilisé dans plusieurs traitements médicaux (stimulant digestif, surmenage, maladie intestinale) - En cosmétique et parfumerie, en 1754, la découverte de l’eau de Cologne par un italien marque la naissance d’une véritable industrie de parfums. II-2-2) Définition

Les huiles essentielles sont "des produits de composition généralement assez complexe qui renferme les principes volatiles contenus dans les végétaux"(définition Pharmacopée) (6).

Sous le nom d’huile essentielle, communément appelée essence , on désigne les principes huileux, lipophiles et odoriférants sécrétés dans diverses parties d’une plante. Seules sont volatiles les huiles essentielles qui s’opposent par ce caractère aux huiles fixes et aux graisses dont elles diffèrent de plus par leur composition chimique et par leur caractéristique physique. (60)

Communément et improprement appelées essences , les huiles essentielles sont des


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produits généralement odorants, obtenus soit par entraînement à la vapeur d’eau des végétaux ou de parties de végétaux, soit par expression de péricarpe frais. (14) On note que le nom “essence” est également donné à des produits odorants qui ne préexistent pas dans le végétal mais qui sont issus d’une réaction enzymatique sur un substrat, réaction qui ne peut intervenir qu’après une altération des tissus. C’est en particulier le cas de disulfure de diallyle provenant de la décomposition de l’alliine (Sulfoxyde de S-allyle). (14) II-2-3) Répartition et localisation chez la plante Les huiles essentielles sont presque exclusives de l’embranchement des Spermaphytes. Les genres capables d’élaborer ces principes volatiles sont en général regroupés dans un nombre assez restreint de familles d’Angiosperme appartenant aux ordres des Magnoliales, des Laurales, des Lamiales, des Rutales, des Astérales...(14) Ces huiles essentielles sont synthétisées au sein du cytoplasme de certaines cellules sécrétrices (70) et ceci grâce à l’énergie solaire. (74). Elles peuvent être retrouvées dans tous les organes végétatifs comme dans les organes reproducteurs de la plante : fleurs (rose, bergamotier...), feuilles (citronnelle, laurier...), rhizomes (gingembre...), du bois (santal), des écorces (cannelier), des fruits ou des graines (muscadier), moins fréquentes dans les racines (vétiver). (14) Les huiles essentielles se séparent de leurs cellules sécrétrices par synérèse, sous forme de petites gouttelettes qui confluent ensuite en plages plus ou moins étendues. Leur synthèse et leur accumulation s’effectuent : - soit au sein de cellules sécrétrices, incluses dans l’épiderme (lauracées, zingibéracées), ou à l’extrémité des poils (labiées). - soit dans les poches sécrétrices schizogènes (myrtacées) ou schizoligènes (rutacées, bursenacées), formées par des cellules modifiées. - soit dans les canaux sécréteurs obtenus par allongement des poches sécrétrices (térébinthacées, ombellifères). (11)(14) II-2-4) Fonctions des huiles essentielles chez la plante On considère en général qu’il s’agit de produits de déchets du métabolisme. Toutefois, leur grande volatilité et la puissance de l’odeur font qu’elles servent de moyen de communication pour la plante : elles attirent les agents pollinisateurs, par contre elles repoussent les prédateurs (insectes, rongeurs, micro-organismes, champignons). Souvent, elles favorisent la conservation de l’humidité pour les plantes désertiques, grâce à la formation d’une couche de vapeurs aromatiques protectrices autour d’elles. Parfois, elles semblent avoir une action télétoxique sur les germinations, ces actions sont facilitées par la localisation périphérique des éléments sécréteurs. (14) II-2-5) Caractéristiques

Les huiles essentielles contiennent les principes odorants responsables de l’arôme caractéristique de chaque plante. Elles sont généralement liquides, faiblement colorées, de densité inférieure à celle de l’eau de 0,759 à 1,096 à l’exception de quelques essences telle que celles de la cannelle et du girofle. Ces substances sont solubles dans les solvants organiques tels que l’alcool, l’éther, les huiles fixes, mais insolubles dans l’eau à laquelle toutefois elles


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communiquent leur odeur, ce qui signifie que l’eau dissout une certaine quantité d’essence et qu’elle en garde souvenir. Les huiles essentielles dissolvent la graisse, l’iode, le soufre, le phosphore , réduisent certains sels. Le point d’ébullition varie de 160 à 240°. Elles sont dextrogyres ou lévogyres, rarement inactives sur la lumière polarisée. Elles se différencient par des autres huiles par leur volatilité et entre elles par : • leurs propriétés organoleptiques : aspect, couleur, saveur, odeur. • leurs propriétés physiques : densité, indice de réfraction, pouvoir rotatoire, solubilité. • leurs propriétés chimiques : composition chimique, indice d’acide, d’ester, d’alcool,

de phénol, de composés carbonylés. (71)(70) II-2-6) Constitution chimique (70)(14) Une huile essentielle a une constitution fort complexe et variable. Malgré la diversité apparente dans les structures des composants d’une huile essentielle, ceux-ci peuvent être globalement rangés dans les trois catégories suivantes :

a) Composition a-1) Les composés terpéniques Ce sont de monoterpénoides et de sesquiterpénoides, c’est à dire des composés à 10 et 15 atomes de carbones présents sous forme d’hydrocarbures et de dérivés oxygénés. a-2) Les composés phénylpropanes et phénoliques a-3) Divers Dans cette catégorie, on peut ranger : - les cétones aliphatiques (éthylamylcétone, méthyl-2-heptanone) - les coumarines. - les acides volatiles.

b) Teneur en huile essentielle Quantitativement, les teneurs en huile essentielle sont très faibles, souvent inférieur à 1%, des teneurs fortes comme celle du bouton floral du giroflier (15%) sont exceptionnelles.

Il est important de souligner que la teneur et la composition chimique d’une huile essentielle est variable car elle dépend de plusieurs facteurs qui sont les suivants : - âge de la plante - l’organe du végétal d’où l’on extrait l’essence - facteurs écologiques - facteur climatique - effets de stockage (exposition à la lumière, à l’air, à une température trop élevée)

II-2-7) Propriétés pharmacologiques

L’activité d’une huile essentielle et celle de la plante dont elle est issue n’est forcement pas le même. Une telle superposition n’est que rarement possible, ainsi l’huile essentielle de romarin est antibactérienne alors que l’infusé de la même espèce est traditionnellement utilisé pour le traitement symptomatique de troubles digestifs divers sur la base de propriétés antispasmodique et cholérétique, liées à la présence de composés phénoliques. Remarquons ensuite que si l’on peut étudier et décrire les effets biologiques et/ou pharmacologiques d’un monoterpène ou d’un sesquiterpène ou d’un alkyl benzène, il est difficile de parler de pharmacologie, de pharmacocinétique ou de métabolisme d’une huile essentielle, c’est à dire d’un mélange. Quelques propriétés fondamentales peuvent cependant être dégagées :


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a) Propriétés spasmolytiques et sédatives Les huiles essentielles de menthe, de verveine, etc sont réputées efficaces pour diminuer les spasmes gastro-intestinaux. Elles stimulent la sécrétion gastrique, améliorent certaines insomnies et troubles psychosomatiques divers. Les huiles essentielles extraites de basilic, d’angélique, de camomille, de girofle, de mélisse, de menthe et de thym exercent aussi une activité spasmolytique marquée sur l’iléon isolé de cobaye, dans une moindre mesure sur la trachée du même animal. (16)

b) Propriétés irritantes L’essence de térébenthine provoque une augmentation de la microcirculation, une rubéfaction importante, une légère action anesthésique locale; celles d’eucalyptus, de pin, de niaouli stimulent le mouvement de l’épithélium cilié au niveau de l’arbre bronchique. Les crèmes ou les pommades à base d’huile essentielle servent à soulager les entorses et claquages. (16)

c) Pouvoir antimicrobien Ce pouvoir s’exerce à l’encontre des bactéries pathogènes variées, y compris des souches habituellement antibiorésistantes. Certaines huiles essentielles sont également actives sur des champignons responsables de mycoses et sur des levures (Candida). Les doses actives sont en général faibles et celles qui sont déterminées par une expérimentation in vitro sont directement transposables pour une utilisation par voie externe ou à fortiori comme conservateur : sarriette, cannelle, thym, girofle, lavande, eucalyptus sont au nombre des huiles essentielles les plus antiseptiques. Des composés comme le linalol, le citral, le géraniol, ou le thymol sont respectivement plus antiseptiques que le phénol. (16) Ce pouvoir antimicrobien est limité et que les huiles essentielles doivent à leurs composés phénoliques et terpéniques et aussi dans une plus faible mesure à leur alcools et aldéhydes. Notons que toutes ces essences sont de plus en plus remplacées par leurs principes actifs : l’eucalyptol pour l’essence d’eucalyptus (antiseptique de voie respiratoire), l’eugenol pour le girofle (désinfectant et cautérisant en chirurgie dentaire), le goménol de l’essence de niaouli (traitement de plaies, de brûlures), le thymol de l’essence de thym (désinfection de voies urinaires). L’action du phénol est atténuée en milieu alcalin et en présence de matières organiques. (44)(29) L’essence naturelle totale se montre plus active que son constituant principal. Par ailleurs les constituants moindres en pourcentage sont plus actifs que le constituant principal : c’est à dire qu’on doit y avoir un effet de synergie, ainsi dès 1904 Cuthberg Hall démontrait que les propriétés antiseptiques de l’essence d’eucalyptus étaient beaucoup plus puissants que celles de son constituant principal. (71)

d) Toxicité En règle générale, les huiles essentielles ont une toxicité aiguë par voie orale faible ou très faible. La majorité de celles qui sont couramment utilisées ont une DL50 comprise entre 2 et 5g/kg (anis, eucalyptus, girofle, etc...), les plus toxiques sont celles de boldo (0,13g/kg), de thuya (0,83g/kg), ainsi que l’essence de moutarde (0,34g/kg). Les observations cliniques chez l’homme montrent que des intoxications 1,47g/kg a jadis été responsables de nombreux accidents (convulsions épileptiformes) au moins chez le jeune enfant. L’utilisation des huiles essentielles dans plusieurs domaines peut entraîner les différents genres de toxicité suivantes : toxicité chronique (aromathérapie, arôme alimentaire); toxicité dermique (parfumerie); cancérogénicité (par la présence d’allyle et de propénylphenol). (16)


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II-2-8) Utilisations des huiles essentielles Les principaux aspects de l’utilisation de ces huiles essentielles se trouvent actuellement dans les secteurs suivants :

a) En alimentation Elles jouent les rôles de condiments (poivre, gingembre...), de digestifs (anis...) d’aromatisants (menthe, thym...) ou d’antioxydants. (70) (16)

b) En pharmacie On parle d’aromathérapie pour la médecine qui exploite les propriétés des huiles

essentielles pour le traitement des différentes maladies. Les raisons d’utilisation de ces huiles essentielles en médecine reposent sur les propriétés suivantes :

∗ action antibactérienne, antifongique, antivirale, ∗ action vermifuge ∗ action emménagogue ∗ action antispasmodique et anti-inflammatoire ∗ action stimulante

(70)(11)(14)(45)(13)(20)(16) c) En parfumerie

C’est le débouché principal des huiles essentielles. Les industries de la parfumerie les utilisent comme matière première. (16)(70) II-2-9) Conservation La relative instabilité des molécules constitutives des huiles essentielles rend leur conservation difficile. Les possibilités de dégradation sont nombreuses, facilement objectivées par la mesure des indices (peroxyde, réfraction…), par la détermination des caractères physiques (viscosité, miscibilité à l’alcool, pouvoir rotatoire) et/ou par l’analyse en CPG. Les risques sont multiples : photoisomérisation, photocyclisation, coupure oxydative de propénylphénols, péroxydation de carbures et décomposition en cétone et alcool (limonènes) Ces dégradations pouvant modifier les propriétés et/ou mettre en cause l’innocuité du produit. Il convient alors de les éviter par : utilisation de flacon propre et sec; en aluminium, en acier inoxydable ou en verre teinté antiactinique; presque entièrement rempli et fermé de façon étanche (l’espace libre étant rempli d’azote ou d’un autre gaz inerte); stockage à l’abri de la chaleur et de la lumière. AFNOR NFT 75-001-[1996].(16) II-3) Vibrionaceae Les bactéries sont des agents pathogènes importants pour les crevettes, celles rencontrées dans la plupart des sérieuses maladies de crevettes sont toujours issues de la famille Vibrionaceae et ces maladies sont appelées Vibriosis. L’infection peut être chronique, subaiguë ou aiguë. La virulence varie suivant les espèces. Toutes les espèces de crevettes peuvent être atteintes et cette infection est souvent associée à un très fort taux de mortalité qui peut aller jusqu’à 100%.(38)(47)(27)(42) D’après les études sur les Vibrio faites jusqu’aujourd’hui, les espèces de Vibrio ne sont pas toutes pathogènes pour les crevettes, mais seulement quelques espèces dont :


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V. anguillarum, V. alginolyticus, V. cholerae biotype albensis, V. harveyi V. cholerae non-01, V. damsela, V. fischeri, V. fluvialis, V. parahaemolyticus, V. vulnificus. (64)(24)(65)(38) II-3-1) Définition Le nom Vibrio est utilisé dès le 17ème siècle pour décrire les bactéries mobiles, de forme incurvée ou spiralée. La famille Vibrionaceae a été créée en 1965, les critères ont été basés sur des similitudes morphologiques et physiologiques avec le Vibrio cholerae qui était choisi comme espèce-type. Ce sont des bacilles à gram-négatif, mobiles ou immobiles, aéro-anaérobies facultatifs, croissent sur milieu ordinaire, réduisent le nitrate en nitrite, oxydase positive, dégradent les glucides par métabolisme fermentatif. Cette définition permet de distinguer les Vibrionaceae des Entérobactériaceae qui ont une réaction oxydase négative, et des Pseudomonaceae qui sont aérobies stricts et qui dégradent les glucides par un métabolisme oxydatif. Les Vibrionaceae vivent dans l’eau et quelques espèces peuvent être rencontrées chez l’homme ou les animaux à sang froid. (72) II-3-2) Morphologie et Structure Les Vibrionaceae sont des bacilles droits (Aeromonas), incurvés ou en virgules (Vibrio), cet aspect en virgule peut disparaître au cours de repiquages, l’aspect incurvé peut rencontrer chez Photobacterium. Ces bacilles ont des diamètres autour de 0,5µm, une longueur variable en milieu gélosé et elles sont asporulées. La culture âgée présente un polimorphisme : il est fréquent d’observer à côté des formes longues (4 à 5µm) des formes coccobacilaires trapues (1 à 1,5µm), déplacement en bancs, quelques espèces peuvent être capsulées (Ex : Vibrio parahaemolyticus). De rares espèces (Ex : Aeromonas salmonicida) sont toujours immobiles, toutes les autres sont mobiles grâce à une ciliature polaire ou mixte. La ciliature mixte est constituée par des fins filaments latéraux (15nm de diamètre, 1µm d’amplitude, nombre variable) et des filaments polaires (25 à 30nm de diamètre, 2 à 4µm d’amplitude). Ex : Vibrio alginolyticus (72)(29) II-3-3) Classification a) Taxonomie biologique D’après les ressemblances morphologiques et physiologiques, on a la classification suivante : (40) Embranchement..............SCHIZOMYCETES Sous-embranchement..... EUBACTERIA Classe.............................EUBACTERIA ASPORULEES Ordre..............................SPIRILALLES Famille............................VIBRIONACEAE Au 19ème siècle le genre Spirillum a été introduit dans la famille à cause de leurs caractères morphologiques. A la moitié du 20ème siècle, d’autres espèces d’eau douce et marine sont appelées Vibrio des eaux. Quatre genres de bactérie sont rassemblés dans cette famille : Vibrio (genre-type), Photobacterium, Plesiomonas et Aeromonas.(72)


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b) Taxonomie moléculaire Dans cette famille, les ressemblances morphologiques et biochimiques des genres ne présupposent pas l’existence de similitude moléculaire, G+C% est de 38 à 51% pour les Vibrio, pourcentage superposées à celui des Photobactérium 40 à 44%, et de Plesiomonas 51%, celui d’Aeromonas est sensiblement plus élevées 57 à 65 %. (72) II-2-4) Culture et croissance Les Vibrionaceae poussent sur un milieu ordinaire sans exigence nutritive particulière à la température de 20 à 30°C pour les saprophytes (les Vibrio des eaux, parasites de poissons), de 30 à 37°C pour les pathogènes (V.cholerae, V.parahaemolyticus, V.vulnificus...). Toutes les espèces poussent à 30°C, à un pH alcaline de 7 à 9. Sur le milieu gélosé, on obtient après 18h d’ incubation, des colonies lisses de 1,5 à 2mm de diamètre, rondes à bords nets, plates brillantes ou translucides (Vibrio cholerae), bombées et opaques (Aeromonas). En milieu liquide, la croissance est très rapide et donne des troubles homogènes et des ondes moirées. On peut parfois noter en culture non agitée, la présence d’un fin voile en surface (Vibrio) ou d’une collerette (Aeromonas). (72)(29) II-4) Description botanique et utilisations empiriques de la plante Cinnamosma fragans

Cinnamosma fragans est particulièrement choisie dans le cadre de ce mémoire par son abondance dans la région Nord-Ouest de Madagascar (région où la crevetticulture se développe le plus en ce moment à Madagascar), par son endémicité et pour ses nombreuses utilisations empiriques dans la médecine traditionnelle malgache. II-4-1) Systématique botanique (54)

Le genre Cinnamosma est le seul représentant de la famille Canellaceae à Madagascar, famille constituée par quatre genres : - Winterana et Cinnamodendron, d’Amérique. - Warburgia, d'Afrique occidentale - Cinnamosma, endémique et unique à Madagascar. Le genre Cinnamosma de Madagascar comprend trois espèces très affines : - C. madagascariensis (forêts montagneuses du versant Est). - C. macrocarpa (Est). - C. fragans (Nord-Ouest). Classification : Règne....................VEGETAL Embranchement....MONOCOTYLEDONE. Sous/Classe...........LILIIDAE

Famille.................. CANELLACEAE Genre....................Cinnamosma espèce...................fragans


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II-4-2) Description botanique Cinnamosma fragans est un arbuste ou petit arbre toujours vert, très aromatique; feuilles et fruits à saveur pimenté brûlante; rameaux cylindriques un peu anguleux sur les tiges les plus jeunes; feuilles jeunes ponctuées-translucides, opaques, coriaces et d’un vert sombre lors qu’elles sont adultes; pétiole court (3-8mm de diamètre); limbe étroitement oblong-lancéolé ou lancéolé-linéaire, de grandeur très variable souvent sur un même rameau; nervures latérales peu nombreuses, distantes, anciennes. Les fleurs sont sessiles ou subsessiles, axillaires, presque toujours solitaires, accompagnées à la base de 3-7 bractées densément imbriquées en spirales. La corolle est tubuleuse à tube plus long que les lobes; lobes 4, 5 et même 6, arrondis au sommet, réfléchis à l’anthèse. L’androcée un peu plus long que celui de la corolle : anthères linéaires en nombre variable (7 à 10). Pistil de 4mm; contracté à la base atténué en style épais et court, creux, arrondi au sommet, avec autant de plages; 4-5 placentas, multiovulés. Baie lisse, de forme et de grandeur très variable. Le pédicelle aussi épais que long, ovoïde (4-3mm), obovale (6-6,7 x 3-4,5cm), irrégulièrement déhiscent à la fin en deux valves. Les graines varient de 15 à 25 par fruit, d’un fauve clair, fortement ridées-ruminées, irrégulièrement subréniformes, courbées et comprimées (17 x 11mm); floraison entre Septembre et Novembre; fruit en saison des pluies (Décembre-Mai). (54) ( Figure-1, page 13). II-4-3) Répartition géographique Cinnamosma fragans se trouve dans la forêt tropophylles, mais souvent au bord des eaux, dans les gorges ou parmi des rocailles ombragées, sur terrains calcaires ou siliceux, entre 0 et 60m d’altitude. Ouest : - Secteur Nord : presqu’île du cap d’Ambre près de la baie de Diégo-Suarez, spécimens très semblables, parts évidentes d’une même récolte, type du genre et de l’espèce. - Secteur Ambongo-Boina : Masiakampy, bassin moyen du Bemarivo, Boina, sans autre précision; Firingalava, entre Maevatanana et Andriba. - Secteur du Menabe : environ de Besalampy, bassin du Maningoza, Folakary, bassin de Manambolo. (54) II-4-4) Données ethnobotaniques Nom : - Sakalava : Motrebetiniaina (grand feu dans les entrailles). - Haut plateau : Mandravasarotra. (54) Cette plante est Utilisée pour pouvoir mystique et pour diverses maladies, à savoir :

Coqueluche (maladie de l’appareil respiratoire); Syphilis (maladie vénérienne); Stomachite (maladie de l’appareil digestif); Taenifuge (parasite intestinale, partie utilisée: écorce); Bilieuse (maladie du foie, partie utilisée: feuille); Diurétique (maladie de l’appareil urinaire, partie utilisée: feuille). Le goût brûlant conduit la médecine traditionnelle malgache à le faire boire à la femme qui vient d’accoucher pour éviter la tranchée utérine. Le bois est utilisé en construction, le tronc peut avoir 7 à 10cm de diamètre. (58) (55)(12)


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Le baume fabriqué à partir de l’huile essentielle extraite de la plante a des propriétés antivirale, neurotonique, décontractant musculaire. Il sert à traiter la sinusite, la fatigue, le rhumatisme et l’insomnie. (Source : Société Naturallia)

III

MATERIELS & METHODES

Matériels et méthodes

III – Matériels et méthodes

III-1) Recherche des différentes populations microbiennes présentes dans les échantillons (Larves, Post-Larves, Eau d’élevage). III-1-1) Isolement des colonies microbiennes a) But Le but est d’obtenir une colonie isolée et pure à partir d’un mélange de population bactérienne. Une colonie pure est constituée par un ensemble de bactéries appartenant à la même espèce. b) Principe Le principe se base sur le fait qu’une cellule donne naissance à une colonie après plusieurs divisions par scissiparité. Un prélèvement issu de l’échantillon mère est ensemencé dans un milieu électif et une colonie plus ou moins isolée de cette première culture est ensuite piquée puis réensemencée, et cela se répète jusqu’à ce qu’on ait des colonies pures et isolées. C’est la technique du repiquage successif des colonies bactériennes. c) Matériels et méthodes - Autoclave (marque ALP co.ltd ) - Stérilisateur à air chaud (type SP-650 Advantec co.ltd ) - Etuve bactériologique MEMMERT BE type 500 - Bec bunsen - Anse d’ensemencement - Tubes à essai - Boites de pétri - Alcool à 70% - Nacl 2,5% Toutes les manipulations sont réalisées dans les conditions aseptiques : dans le rayon de 15 cm autour du bec bunsen, l’ouverture du tube ou autre récipient doit être tournée toujours vers la flamme, le lieu de travail ainsi que les mains du manipulateur sont lavées avec du savon puis vaporisé avec de l’alcool 70%. III-1-1-1) Préparation de la suspension mère A) Préparation de l’échantillon Le but est de préparer les échantillons à analyser pour pouvoir extraire séparément les bactéries à l’intérieur des larves et des post-larves et celles de l’eau d’élevage. a) Matériels - Larves (nauplii, zoé, mysis) et post- larves (âge variable) - Eau de mer dans laquelle ont été élevés les animaux - Broyeur en tube de verre (marque Radnoti) - Chlorure de benzalconium à 0,1% b) Méthodes Les échantillons (larves et post-larves) sont placés dans des broyeurs en tubes stériles. Pour différencier les microbes adhérents aux échantillons à ceux de l’eau d’élevage, les surfaces extérieures de ces échantillons sont désinfectées par rinçage avec de la solution saline de chlorure de benzalconium à 0,1%. (5). Avant le broyage, les mains du manipulateur sont lavées avec de l’alcool 70%.


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Le broyât obtenu est ajouté de 5ml de Nacl 2,5% stérile, concentration tolérée par toutes les bactéries halophiles (24), c’est la suspension mère. B) Dilution de la suspension mère a) But Le but est de diminuer au maximum le nombre des micro-organismes présents dans la suspension mère, ceci pour maximiser la chance d’obtenir des colonies isolées après la culture. b) Principe Une solution diluée au 1/x signifie que 1cm3 du produit initial sera placé dans x-1cm3 de diluant (exemple pour diluer au 1/10 : 1cm3 dans 9cm3 ). La solution finale est telle que les concentrations sont divisées par x ( par exemple 10 ici ) par rapport au produit initial. (22) c) Matériels et méthodes - La suspension mère issue de broyats des larves et des post-larves. - L’eau de mer dans la quelle ont été élevées les larves et les post-larves de crevettes. On pratique la dilution en cascade jusqu’à 10-5 ; 4,5ml de Nacl 2,5% sont mis dans chaque tube et à partir de la solution mère, le prélèvement est de 0,5ml à chaque étape de dilution. III-1-1-2) Ensemencement bactérien A) Préparation des milieux de cultures : a) But Le but est d’isoler seulement le genre Vibrio parmi les différents genres qui pourraient exister dans la suspension mère. b) Principe Le principe consiste à utiliser un milieu sélectif pour le genre Vibrio. • Milieu TCBS agar, sélectif pour les Vibrio sp. • Milieu TSA (ajouté de Nacl), utilisé comme milieu d’isolement et de purification. On a utilisé comme milieu sélectif le TCBS ou milieu de Nakanishi et Kobayashi. Ce milieu permet la croissance rapide de Vibrio pendant une période de 15 à 24h, 30 à 37°C sous forme de colonie jaune ou verte. La plupart des autres microorganismes sont inhibés (au moins pendant 24h). Cependant, certains Pseudomonas, Proteus, et Streptocoques fécaux peuvent se développer en donnant des minuscules colonies. L’isolement se fait après 18h d’incubation. (29)(24) b) Matériels et méthodes - Milieu TCBS dont la composition est donnée dans l’annexe-I - Balance de précision - Fiole stérile - Eprouvette stérile - Eau bouillie Le TCBS est utilisé à raison de 88g/l, le mode de stérilisation du milieu est la chaleur humide par ébullition dans l’eau. Le mode opératoire est donné à l’annexe-III. Les milieux ainsi préparés sont étuvés pendant 24h pour vérifier leur stérilité. Si les milieux ne sont pas contaminés, on les garde à +4°C pour éviter le dessèchement. B) Ensemencement L’ensemencement consiste à porter les bactéries dans un milieu de culture


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a) Principe La technique d’ensemencement en nappe ou par étalement sur boite de pétri a été utilisée pour la mise en culture des extraits de chaque dilution. Il s’agit de déposer à la surface de la gélose quelques gouttes du liquide à ensemencer puis étaler ce dépôt de façon régulière à l’aide d’une pipette râteau. b) Matériels et méthodes - Pipettes de 1ml, stériles - Pipettes râteau (jetables) Des aliquotes de la suspension diluée au 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 et 10-5 de chaque échantillon ( larves, post-larves, eau d’élevage ) sont déposés à la surface de la gélose, à raison de 1ml pour chacune de boite de pétri. L’incubation se fait à la température ambiante (30°C) sous hotte pendant 24h. III-1-1-3) Purification des colonies isolées : a) Principe Après l’incubation du prélèvement de la suspension mère, ce sont les colonies les plus abondantes que l’on a retenu pour être purifiées, car les bactéries pathogènes de crevettes se trouvent toujours dominantes après ensemencement. (65) Une colonie plus ou moins isolée est piquée et réensemencée dans un autre milieu suivant l’une des méthodes suivantes : 1- épuisement de la semence par la méthode de strie en zigzag suivant la technique de quadrant et quadrillage. (19)(40) 2- dilution en cascade dans une solution physiologique stérile puis ensemencement en nappe de la suspension diluée. (66)(22) b) Méthodes La méthode de quadrant consiste à charger une seule fois l’anse et on fait quatre zigzags dont chacun part de la périphérie vers le centre de la boite. Le quadrillage est une technique dont l’ensemencement se fait parallèlement suivant l’horizontale, puis sans charger l’anse, suivant la verticale. L’ensemencement par étalement se fait en déposant 0,5ml de la suspension bactérienne diluée au 10-3, 10-4, 10-5 (pour chaque échantillon) sur la surface de gélose dans les boites de pétri. L’incubation est faite à la température ambiante, soit 30°C, sous hotte, pendant 24h. III-1-1-4) Conservation La conservation consiste à garder les souches pures isolées sous des conditions qui ralentissent leur métabolisme ou arrêtent même leur croissance. a) Principe Il existe plusieurs techniques de conservation entre autres on a : - La lyophilisation qui permet la conservation de souches pendant plusieurs années. - Le stockage des bactéries sur un milieu bien choisi ( Ex : tourbe stérilisée). - Le repiquage successif sur un milieu neuf et conservation à 4°C. b) Matériels et méthodes - Souches microbiennes - Réfrigérateur


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La méthode utilisée est le “ repiquage successif sur un milieu neuf ” car cela permet d’avoir des souches disponibles en permanence et la réactivation est facile. (61)(62) b-1) Préparation du milieu gélose-pente pour la conservation On utilise le TCBS. Le mode opératoire ressemble à celui décrit à l’annexe - II, seules les boites de pétri sont remplacées par des tubes à vis stériles lesquels sont laissés refroidir en position inclinée. L’avantage est tout simplement pour avoir une plus grande surface de culture. b-2) Ensemencement L’inoculum est placé à 1cm du fond du tube et l’ensemencement se fait par stries parallèles serrées du fond vers l’ouverture du tube. L’incubation est réalisée à la température ambiante 30°C, sous hotte, durant 24h. III-1-2) Identification microbienne (pour chaque colonie isolée) a) But Dégager la position taxinomique des bactéries étudiées et leur attribuer par la suite un nom de genre et un nom d’espèce. b) Principe Le principe se base sur la détermination des caractères morphologiques, culturaux, biologiques, biochimiques et physiologiques. c)Matériels et méthode Comme il s’agit d’étude de microorganisme, on se servira pendant toutes les manipulations du microscope optique.

III-1-2-1) Etude des caractères culturaux A) Sur milieu solide a) Principe Un groupe des bactéries donné développe sur la surface d’une gélose des colonies caractéristiques de son espèce. b) Méthodes L’ensemencement se fait sur TCBS en boite de pétri, par la méthode de culture par étalement à partir d’un prélèvement de 0,1ml provenant de la suspension diluée au 10-4, 10-5, par cascade. L’incubation est faite à la température ambiante 30°C, pendant 24h. L’observation des différentes caractéristiques d’une colonie est réalisée à l’aide d’une loupe binoculaire. B) Sur milieu liquide a) Principe Les Vibrio de crevettes sont des bactéries des eaux de mer, mobiles. Elles poussent sur un milieu ordinaire (72)(24). Il est intéressant de déterminer leurs caractéristiques en milieu liquide. b) Méthodes On utilise l’eau peptonée salée alcaline dont la composition est donnée dans l’annexe-I. L’ensemencement se fait à l’aide d’une anse de platine à partir d’une colonie. L’incubation est réalisée à la température ambiante, sous hotte, pendant 24h. L’observation des cultures est faite à l’œil nu.


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III-1-2-2) Caractères morphologiques d'une cellule.

A) Examen à l'état frais a) But Il s’agit d’observer les bactéries vivantes en absence de toute fixation. Cette méthode permet de connaître : la morphologie, le mode de regroupement, la mobilité et éventuellement le mode de reproduction. b) Méthodes b-1) Prélèvement Les bactéries peuvent être prélevées soit à partir des cultures en milieu liquide avec une pipette pasteur, soit à l’aide de l’anse de platine à partir d’une colonie d’un milieu solide. Le prélèvement est ensuite déposé sur une lame bien propre que l’on recouvre d’une lamelle. On ajoute une goutte de Nacl 2,5% s’il s’agit d’un prélèvement solide. b-2) Lutage Cette étape consiste à border la lame d’une paraffine solide, ce qui permet d’éviter la dessiccation rapide de la préparation, de protéger la manipulation des contaminants par du matériel virulent, de maintenir la lamelle sur la lame.

B) Examen après coloration : Coloration GRAM a) But Le but est d’attribuer aux bactéries étudiées le critère gram-négatif ou gram-positif, essentiel pour la classification des bactéries. b) Principe (40) Les facteurs qui interviennent dans la coloration de Gram sont : - La différence de composition chimique des parois bactériennes. - Les liaisons ioniques entre les groupements basiques du colorant et les groupements acides de la cellule. - La différence de perméabilité des parois à l’alcool. Toutes les bactéries se colorent en violet par le violet de gentiane, mais par la suite d’un traitement à l’éthanol 95%, certaines bactéries se décolorent car elles ont des lipides membranaires importants mais de minces couches glucopeptidiques. Cette structure confère à la membrane la propriété d’être incapable de retenir le colorant gentiane sous l’action de l’éthanol, elles sont dites gram négatifs et on les recolore en rose par la solution de saffranine. Par contre les bactéries gram positifs ne se décolorent pas, elles ont une membrane cellulaire riche en glucopeptide mais pauvre en lipide, qui retient bien le colorant gentiane et elles restent violette même après l’action de l’éthanol. c) Matériels et méthodes (66)(73) - Solution de teinture de Gram-I (Solution violet-crystal) - Gram-II (Solution de Lugol) - Gram-III (Solution saffranine) - Alcool à 95% - Huile d’immersion (Nikon) pour l’observation microscopique La coloration Gram dont le mode opératoire est donné à l’annexe-IV, se fait en quatre temps : 1- Coloration avec la solution violet de gentiane. 2- Mordançage avec la solution de lugol pour renforcer l’action de gentiane 3- Décoloration par l’alcool 4- Recoloration à la solution de saffranine


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III-1-2-3) Etude des caractères biologiques

A) Type respiratoire a) But Il consiste à déterminer le caractère aérobie, anaérobie ou aéro-anaérobie des souches b) Principe Les bactéries aérobies poussent sur la surface d’une gélose grâce à leur faculté de se servir de l’oxygène comme accepteur final d’électron dans la chaîne respiratoire. La respiration est dite anaérobie lorsque l’accepteur est un autre composé minéral autre que l’oxygène tel que le nitrate (NO3 ), elles poussent alors dans la profondeur ou à l’intérieur de la gélose. c) Méthodes La détermination du type respiratoire se fait sur un milieu Coeur-Cervelle qui est un milieu utilisé pour l’isolement des bactéries exigeantes, certains champignons pathogènes, ainsi que la plupart des bactéries aérobies et anaérobies. (52) Après incubation on peut reconnaître quatre types de respiration : - les germes aérobies stricts qui croissent seulement sur la surface de la gélose. - les germes anaérobies stricts qui se développent uniquement dans la zone profonde. - les germes aéro-anaérobies facultatifs poussent sur toute la hauteur du tube. - les germes micro-aérophiles forment leurs colonies dans la partie supérieure, près de la surface de la gélose. Ce milieu est utilisé à raison de 52g/l d’eau distillée. La stérilisation se fait à l’autoclave à 121°C pendant 15mn. Le milieu est ensuite distribué dans des tubes à essai stériles refroidis jusqu’à 45°C. L’ensemencement se fait à l’aide d’une pipette pasteur stérile plongée au fond du tube et remontée à la suite en décrivant une spirale de façon à ensemencer uniformément le milieu sur toute sa hauteur. Après refroidissement et solidification, le milieu est mis à incuber à 30°C pendant 24h. III-1-2-4) Etude des caractères biochimiques et physiologiques

A) Tolérance de la salinité du milieu a) But La recherche de la tolérance en salinité est un critère important dans la détermination des espèces de Vibrio. b) Principe On recherche la concentration en NaCl (chlorure de sodium) permettant la croissance optimale, par la détermination de la précocité d’apparition de colonies. (72) c) Matériels et méthode On utilise la gélose nutritive salée sur boite de pétri, les concentrations en Nacl utilisées sont 0%, 3% et enfin 8%.(24) L’ensemencement se fait par zigzag suivant la méthode de quadrant. L’incubation est faite à 30°C et on note pour chaque espèce le temps d’apparition des premières colonies.

B) Recherche de Catalase a) Principe La catalase permet la dégradation de l’eau oxygénée (H2O2) qui résulte de l’oxydation par l’oxygène de l’air des protons (et électrons) issus des voies d’oxydation directe. L’importance de cette enzyme repose sur le fait qu’elle empêche l’accumulation


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de l’eau oxygénée dont l’action serait létale pour la cellule bactérienne. Un dégagement gazeux abondant sous forme des mousses ou des bulles traduit la décomposition de l’eau oxygénée sous l’action de catalase. (29)(2) 2H2O2 → 2H2O + O2 b) Méthode La catalase est mise en évidence par contact de la culture avec une solution fraîche d’eau oxygénée à 10 volumes. Une goutte d’eau oxygénée est placée sur une lame et un peu de culture d’un milieu solide y est repartie.(2)(29)

C) Recherche d’Oxydase a) Principe Les oxydases interviennent à la fin des étapes de déshydrogénation et des chaînes de cytochromes. Elles catalysent le transfert d’hydrogène sur l’oxygène moléculaire. Il en existe plusieurs types, elles sont mises en évidence par leur propriété de catalyser la réaction d’oxydation d’un substrat organique par l’oxygène de l’air. On entend le plus souvent sous le terme imprécis d’oxydase, la recherche de la phénylène-diamine-oxydase qui agissant sur un substrat appelé oxalate de N-diméthyl paraphénilène diamine (incolore sous forme réduite) entraîne la formation d’une semi-quinone rouge violette, cette dernière très instable s’oxyde rapidement en donnant des composés noirâtres. On peut aussi utiliser comme substrat le chlorhydrate de tetraméthyl paraphénilène diamine qui donne une coloration pourpre. (39)(52)(29) Cytochrome oxydase AH + O2 -----------------------> A + 2H2O Substrat Oxygène Substrat oxydé Eau b) Méthode On utilise le disque “OX” imprégné d’oxalate de dimethyl-paraphénilène-diamine à 1%. Une goutte d’eau distillée stérile est placée à l’aide d’une pipette pasteur sur le disque, puis des bactéries en phase exponentielle (24h d’incubation) prélevées à partir d’une colonie bien isolée sont suspendues sur cette goutte d’eau.

D) Recherche d'Indole et de l’Uréase sur le milieu Urée-Indole a) Principe Le milieu Urée-Indole permet à la fois la recherche des souches qui ont l’enzyme: - L’uréase a un rôle dans le métabolisme azoté c’est à dire qu'elle assure la transformation de l’urée en ammoniac et en carbonate d’ammonium. Cette réaction se traduit par une alcalinisation du milieu, décelable par un indicateur coloré, le changement de la couleur brun du milieu en rouge cerise signale la présence de l’uréase. (29)(23) CO(NH2)2 + H2O → 2NH3 + CO2 CO2 + 2NH3 + H2O → CO3(NH4)2 - La tryptophanase intervient dans le métabolisme des acides aminés : elle est responsable de la dégradation du tryptophane en indole (benzopyrrole) et en acide pyruvique. Cette transformation en indole est détectée par addition de quelques gouttes de réactif de Kovacs dans le milieu : l’apparition d’anneaux rouges qui remontent en surface indique la présence des indoles. (52)(29)


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b) Méthode

Le milieu Indole-Urée est un milieu liquide dont la composition est donnée à l’annexe-I. Dans des tubes stériles, on met à l’aide d’une micro-pipette 400µl de ce milieu pour inoculer les prélèvements issus de chaque type de bactéries. L’incubation à la température ambiante 30°C pendant 24h.

E) Test au milieu HAJNA-KLIGLER a) Principe (46)(57) Le milieu Hajna-Kligler est un milieu solide utilisé sous forme de gélose pente, il permet d’étudier quatre réactions en même temps : La fermentation du glucose : Ce métabolisme glucidique conduit à la formation

d’acide qui abaissera le pH et entraînera le virage de l’indicateur coloré du rose au jaune au fond du tube. La production de gaz : Selon la glycolyse ou la voie d’Embden, Meyerhof, Parnas, et

le cycle de Krebs, la production de gaz atteste l’existence et l’intervention d’une enzyme Hydrogène-lyase assurant la production d’hydrogène libre dans la fermentation d’acide mixte de certains micro-organismes. Ce dégagement gageux (CO2, H2 ) se traduit par l’apparition soit de bulles, soit d’une poche gazeuse qui décollera complètement le milieu du fond du tube. L’utilisation du lactose : la bactérie qui acidifie le milieu lactose possède deux

enzymes : la lactose perméase qui permet la pénétration du lactose dans la cellule et la β-galactosidase, une endoenzyme qui assure la coupure de la molécule de lactose en glucose et en galactose. Le métabolisation du lactose sur ce milieu conduit au changement de la coloration dans la partie supérieure du tube, du rose au jaune. Cette bactérie peut être lactose perméase négative mais β-galactosidase positive, dans ce cas il n’y a pas virage du milieu. Pour confirmer la présence ou l’absence de l’enzyme β- galactosidase, le test à l’ONPG (orthonitrophényl D-galacto-pyranoside) est nécessaire. L’ONPG qui est incolore libère, par hydrolyse, un composé coloré en jaune citron (l’orthonitrophénol). La production de sulfure d’hydrogène (H2S) : par leur enzyme thiosulfate réductase,

les micro-organismes anaérobies réduisent le thiosulfate en sulfure d’hydrogène qui entraîne un noircissement de la partie superficielle de la gélose. Ce sulfure d’hydrogène est donneur d’électron pour les bactéries.

a) Méthode Le milieu Hajna-Kligler est utilisé à raison de 53,5g par litre, la stérilisation se fait à l’autoclave à 121°C pendant 15mn. Une culture fraîche de 18 à 24h est ensemencée par piqûre centrale, dans le culot et par stries serrées parallèles sur la surface de la gélose inclinée. Elle est incubée à la température ambiante (30°C) sous hotte. La lecture est effectuée au-delà de 24h. (46)


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F) Test à l’API 20 NE a) But L’API 20 NE est un système d’identification des bactéries non entériques (bactéries n’appartenant pas à la famille Enterobactériaceae) y compris le genre Vibrio. b) Principe (66) Avant d’entamer le test API 20 NE, il faut vérifier si les bactéries à étudier appartiennent à celles non entériques qui sont caractérisées par la réaction d’oxydase positive. Ce système comporte 20 microtubes pour 20 tests individuels; 8 tests biochimiques et 12 tests anaboliques. La détermination des résultats de réaction se fait suivant le tableau suivant : Tableau I : Tableau récapitulatif de la principe d’identification microbienne à

partir du test API 20 NE Substrats Réactifs Réaction/enzyme Positif Négatif

Nitrate (NO3)

NIT1 et NIT2 Réduction nitrate en nitrite

rose-rouge clair

Poudre de Zinc Réduction du nitrate en gaz N2

clair rose

L-Tryptophane (TRP)

réactif James Production d’indole rose

clair (faible couleur vert- jaune)

glucose (GLU) Acidification jaune bleu-vert Hydrochlorure L-Arginine (ADH)

Dehydrase de l’arginine

orange, rose, rouge

jaune

Urée (URE)

Uréase orange, rose, rouge

jaune

Esculine (ESC) β-glucosidase gris, brun, noir

jaune

Gélatine (GEL) Protéase solution de pigment noir

inchangé

p-nitrophényl-β-D-galactopiranoside (PNPG)

β-galactosidase jaune clair

Glucose (GLU) L-arabinose (ARA) D-mannose (MNE) D-mannitol (MAN) N-acétyl-D-glucosamine (NAG) Maltose (MAL) Gluconate de potassium (GNT) n-Acide-caprique (CAP) Acide adipique (ADI) Acide malique (MLT) Citrate de sodium (CIT) Acétate de phényl (PAC)

Anabolisme Anabolisme Anabolisme Anabolisme Anabolisme Anabolisme Anabolisme Anabolisme Anabolisme Anabolisme Anabolisme Anabolisme

trouble trouble trouble trouble trouble trouble trouble trouble trouble trouble trouble trouble

clair clair clair clair clair clair clair clair clair clair clair clair

Chaque résultat obtenu du microtube est enregistré dans un carnet de “score” de


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l’API 20 NE, comme il est indiqué dans l’exemple suivant :

Les bactéries n’appartenant pas à la famille Enterobactériaceae peuvent être facilement identifiées sur le répertoire de classement du profil de l’API 20 NE. c) Matériels et méthodes - Plaquette de test Api 20 NE - Plaquette d’incubation - Milieu AUX - Réactif NIT1 et NIT2 - Poudre de Zinc - Réactif de James - Paraffine liquide Les bactéries à examiner sont appliquées sur chaque microtube, puis la plaquette de test incubée pendant 24h à une température d’eau appropriée à l’élevage de crevettes (25 à 30°C). La procédure expérimentale est donnée à l’annexe-V. III-2) Recherche de la population microbienne impliquée dans la mort de larves et de post-larves

a) But Le but consiste à rechercher in vitro les espèces de Vibrio dont la présence ou la prolifération dans le milieu d’élevage engendre une mortalité importante. b) Principe Toutes les conditions et paramètres d’élevage utilisés en écloserie sont reproduits à l’échelle du laboratoire, mais les crevettes sont élevées dans un milieu ne contenant que la bactérie recherchée. La virulence [le degré de pathogénicité d’un germe infectieux (29)] est évaluée par la détermination du taux de mortalité. (65) c) Matériels et méthodes - Larves (Zoé, Mysis), Post-Larves (PL) en bonne santé - Suspension microbienne - Eau de mer stérilisée à l’autoclave pour l’élevage - Alimentation (Kyowa, algue, artémia) - EDTA pour le traitement - Bêcher de 1000ml stérile - Aérateur - Thermostat pour le réglage de la température. On utilise 100 Larves ou PL par bêcher, et les expériences pour chaque type de Vibrio sont répétées trois fois pour confirmer les résultats. La durée d’une expérience est de 5 jours. La quantité et la concentration des Vibrio administrés sont égales pour chaque type de Vibrio, soit 5ml de suspension bactérienne à une DO=2. Chaque expérience est accompagnée d’une expérience témoin qui consiste à élever les Larves ou PL dans de l’eau d’élevage, sans aucune addition de bactéries. Le diagnostic de détection de signe de maladie (mesure de l’échantillon, observation des signes extérieurs : surface du corps, œils, appendices, couleur des excréments) et le suivi du nombre de morts se font tous les jours, un échantillon de Larves ou PL mort fait toujours l’objet d’une observation microscopique. III-3) Etude physique, chimique, microbiologique et biologique de l’huile essentielle extraite de la plante Cinnamosma fragans III-3-1) Extraction


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a) Principe

L'extraction est basée sur le principe de la distillation. Elle consiste à porter à l'ébullition un mélange liquide-liquide ou mélange liquide-vapeur, à condenser la vapeur émise, à laisser se décanter le mélange non miscible et à récupérer l'huile essentielle. (17) b)Matériels et méthodes.

Plusieurs techniques sont utilisées pour extraire ces substances huileuses, à partir de la plante, à savoir : - La distillation à la vapeur d'eau ou l'hydrodiffusion consiste à pulvériser de la vapeur d'eau dans la cuve d'extraction. La vapeur s'achemine en traversant le matériel végétal, pénètre les tissus et évapore toutes les substances volatiles. (7)(21) - La technique utilisée en laboratoire pour l'extraction de l'huile essentielle est l’hydrodistillation qui consiste à utiliser l'eau comme solvant d'extraction. Le matériel végétal est immergé directement dans l'eau portée à l’ébullition. Les substances volatiles sont entraînées par la vapeur d'eau et recueillies après condensation et décantation du mélange vapeur-huile. (6)(15)(61)

Matériel végétal : Feuilles fraîches de Cinnamosma fragans. Matériel d’extraction : (figure-1)

C’est un unité fixe d’extraction à la vapeur, il s’agit d’un alambic constitué : -d’un grand récipient dans le quel est immergé dans l’eau le matériel végétal -d’un réfrigérant qui sert à condenser la vapeur du mélange eau-substance

volatile -d’un deuxième récipient servant à séparer l'huile et l'eau

Figure-1: Alambic pour la distillation des huiles essentielles


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III-3-2) Etudes physiques et organoleptiques A) Caractéristiques organoleptiques

Les caractéristiques organoleptiques jouent une grande importance pour différencier les huiles essentielles. Elles comprennent les points suivants: l'aspect, la couleur, le goût, le toucher, l’odeur et sa ténacité.

a) Méthode La méthode consiste à utiliser les différents organes de sens humains, qui sont;

les yeux pour l’aspect et la couleur, le nez pour l’odeur, la langue pour le goût et enfin le doigt pour le toucher. - Le milieu de travail doit être : calme, inodore pour ne pas perturber le testeur. - Pour connaître la ténacité et l’odeur, on utilise des touches qui sont des bandelettes des papiers blancs de bonne qualité, tout à fait inodores (1x 20)cm. Elles sont pliées dans le sens de la longueur pour qu’elles soient plus rigides, l’un des bouts trempé dans l’HE et l’autre sert à noter la date et l’heure. Les touches sont ensuite suspendues séparément sur un support. Le test avec l’organe olfactif se fait d’heure en heure ou toutes les 2h, puis à intervalle de temps de plus en plus long.(31)(56) - Pour la couleur, le goût et le toucher, le test est répété trois fois et espacé d’un intervalle de temps au moins une heure, ceci pour assurer la fiabilité des résultats et pour éviter la saturation de l’organe de sens. (60) B) Caractéristiques physiques B-1) Evaluation de la miscibilité de l’HE avec l’eau de mer a) Définition Une Huile Essentielle est dite miscible avec V volumes et plus d’eau, à la température 30°C (température de l’eau d’élevage de crevettes), lorsque le mélange d’un volume de l’HE considéré avec V volumes d’eau est limpide. b) Mode opératoire On introduit dans un tube à essai, parfaitement propre et sec, un volume d’essence exactement mesuré ( 1ml ). Ensuite, le tube avec son contenu est placé dans un dispositif maintenu à une température de 30°C. De l’eau de mer, préalablement amenée à la température 30°C est ensuite ajoutée par fraction de 0,1ml à l’aide d’une pipette graduée. Le tube est agité après chaque addition, et on note le volume avec lequel on obtient un mélange complètement limpide. L’addition de l’eau de mer est poursuivie par fraction de 0,1ml jusqu’à un volume total de 20ml, en n’oubliant pas d’agiter après chaque addition. S’il se produit un trouble ou une opalescence avant l’addition complète, on note également le volume qui a provoqué ces changements et éventuellement le volume avec lequel ils disparaissent.(1)(60)


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III-3-3) Etude chimique

a) Indice d'Acide (IA)

a-1) Principe L'Indice d'acide indique les excès des acides libres présents dans l'huile

essentielle. En principe, c'est le dosage des acides libres par une solution éthanolique d'hydroxyde de potassium titré. (68)(1) La formule permettant de déterminer l'IA est :

V : Volume de la solution éthanolique de KOH(ml) m : Masse d'huile essentielle utilisée (g) a-2) Méthode L'Indice d'acide est obtenu par dosage volumétrique : pour une prise d'essai de 1,0g d'huile essentielle, on ajoute 5ml d'éthanol 95% préalablement neutralisées avec la solution de KOH à 0,1mol/l et cinq gouttes de phénolphtaléine.

Le mélange est titré avec la solution d’hydroxyde de potassium à 0,1mol/l jusqu’au virage de l’indicateur (coloration rose de la phénolphtaléine persistant durant au moins 10s). Notons que deux essais étaient effectués. III-3-4) Etude microbiologique Du fait de leur système immunitaire incomplet au stade larvaire, les crevettes sont très sensibles à la prolifération microbienne (69). De nombreux agents chimiques et antibiotiques ont été déjà utilisés pour traiter les crevettes contre la maladie vibriosis à savoir : la furazolidone (NF-180), l’erytromicine, la terramycine, le chloramphénicol, et l’oxytetracycline. Dans cette étude, l’antibiotique est remplacé par l’HE de C. fragans. Il faut alors déterminer in vitro la sensibilité de la bactérie vis à vis de cette HE, c’est à dire, qu’on recherche les concentrations permettant d’inhiber ou de tuer les bactéries. A) Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) bactériostatique, la

Concentration Minimale Bactéricide (CMB) et la concentration en HE convenable pour le traitement de larves et post-larves de crevettes

a) Définition des points limites Par analogie avec la définition des points limites utilisés en antibiogramme, l’antibiotique est remplacé par l’huile essentielle :

La CMI est la plus faible concentration d’HE inhibant toute croissance visible après un temps d’incubation de 18 à 24 h, dans l’antibiogramme, la CMI est le point limite universellement utilisé pour caractériser l’activité d’un antibiotique. (67)

La CMB est la concentration d’HE permettant d’obtenir, après 18h de contact, un taux de survivants inférieurs ou égal à 0, 01% de l’inoculum initial (soit 1 bactérie pour 10.000 ensemencées). (67)

5,61x V IA = ----------- m


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b) Principe L’aromatogramme (équivalant à l’antibiogramme) utilisé est celui en milieu liquide. C’est la technique la plus fiable, puisque la répartition homogène des produits huileux antiseptiques insolubles, permet un contact intime entre les éléments de même grandeur, particule d’essence et germe microbien. (11) La turbidimétrie est basée sur la mesure de la transmission de la lumière à travers la suspension cellulaire. En effet il y a proportionnalité dans une certaine mesure entre l’absorbance (ou densité optique) d’une suspension et la biomasse présente dans la suspension. La mesure est faite à l’aide d’un spectrophotomètre dont la longueur d’onde λ est ajustée à 600nm. (29) La construction des courbes de croissances in vitro en présence de concentrations croissantes en agent antimicrobien permet de définir les concentrations limites. La CMI correspond à la concentration pour laquelle on n’observe pas de croissance visible. La CMB correspond à la concentration minimale permettant de tuer tous les micro-organismes. (29)(3) Le problème de la solubilité de l’huile essentielle nécessite l’utilisation d’un agent émulsionnant remplissant les critères suivants : - inerte bactériologiquement. - n’avoir aucune action synergique et antiseptique pour l’essence. - fiable chimiquement, c’est à dire qu’il ne doit pas entrer en interaction avec les constituants de l’essence à tester. Le Tween-80, une substance synthétique soluble à la fois dans l’huile et dans l’eau répondant bien à ces critères (40)(28)(25), le Tween-80 a été utilisé comme agent émulsionnant pour l’ensemble des travaux. Le Tween assure la solubilisation de l’HE dans le milieu de culture liquide. Pour la détermination de la concentration en HE utilisable in vivo, équivalente à celle trouvée in vitro, on appliquera la règle suivante : “il faut utiliser une concentration supérieure à la CMI pour assurer le contact des bactéries au foyer infectieux” (26). En général, la concentration en HE trouvée in vitro est directement applicable in vivo (16) c) Matériels et méthodes - Spectrophotomètre (Hach DR/2010) - Milieu liquide : Eau peptonée salée alcaline ajoutée des extraits de levures pour les besoins vitaminiques et de saccharoses qui sont des substrats essentiels pour les Vibrio qui fermentent le sucre. La stérilisation se fait à l’autoclave à 121°C pendant 15mn. - Souche en phase exponentielle sur un milieu liquide et en milieu solide (ayant cultivé pendant 24h) - Solution mère : huile essentielle 90% + Tween-80 10% (11) A partir de cette partie, nous avons limité l’étude de l’huile essentielle sur les quatre espèces de Vibrio qui créent le plus de mortalité de larves et de post-larves, et sur un mélange de toute la population bactérienne isolée. Pour uniformiser la concentration en micro-organisme de chaque échantillon de Vibrio, les densités optiques de souches en milieu liquide de chaque échantillon sont ajustées à 0,86 par ajout de NaCl 2,5% stérile ou par ensemencement à l’aide d’une anse à partir d’un prélèvement provenant du milieu solide. Dans chaque tube contenant 15ml de milieu neuf et d’HE; 0µl, 25µl, 50µl, 75µl et 100µl, est ensemencé 1ml de la souche, ceci pour chaque échantillon de Vibrio. L’incubation est faite à la température ambiante (30°C), sous hotte. Il est important d’agiter la préparation de temps en temps pour bien mélanger le système


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HE-Tween-Milieu et pour éviter la sédimentation des cellules. Le suivi de la croissance de chaque type de Vibrio se fait par la mesure de la DO suivant le temps.

B) Comparaison de l’action inhibitrice de l’HE de Cinnamosma fragans et celle de l’antibiotique Elvagine

L’Elvagine est l’antibiotique utilisé par le centre (CDCC) pour protéger les post-larves de crevettes contre les différentes infections microbiennes. a)Principe La dilution en milieu liquide a été effectuée. La méthode turbidimétrie permet ensuite de déterminer la DO puis de construire la courbe de croissance de bactéries dans les deux types de milieux, l’un contenant de l’HE, l’autre de l’antibiotique. b) Méthode Pour chaque échantillon de Vibrio, on ensemence dans un tube contenant 15ml de milieu neuf et de l’HE à la valeur de la CMB (valeur trouvée par les expériences ci-dessus), 1ml de la souche. L’incubation est faite à la température ambiante sous hotte. La préparation est la même pour l’antibiotique Elvagine. La DO à λ = 600nm est mesurée. C) Comparaison de l’effet antimicrobien de l’HE et celui des antibiotiques Elvagine, Oxytetracycline et Terramycine. b) Principe L’aromatogramme par diffusion sur gélose permet d’évaluer facilement l’effet inhibiteur de ces substances par comparaison des zones d’inhibitions obtenues. Pour cela, on dispose les deux techniques suivantes : - La méthode des disques : Le disque de papier filtre imprégné d’une quantité connue de la substance à tester est déposé à la surface d’une gélose préalablement ensemencée. (26)(7)(11) - La méthode des puits : consiste à déposer la substance à tester dans un petit puits creusé sur la gélose d’une boite de pétri. L’HE est dans ce cas en contact direct avec la gélose ensemencée. (26)(7)(11) c) Matériels et méthodes - Le milieu Mueller-Hinton (cf. Annexe-I) - La souche est constituée par le mélange des populations de Vibrio isolées et ayant été cultivé pendant 24h sur un milieu liquide (Eau peptonée salée alcaline) - HE 90% + Tween 10% - disque de papier filtre de 6mm de diamètre c-1) Méthode des disques Le milieu Mueller-Hinton est utilisé à raison de 38g/l. La stérilisation se fait à l’autoclave à 121°C pendant 15mn, puis le milieu est réparti dans des boites de pétri refroidies ensuite sous la hotte aspiratrice. L’ensemencement se fait par inondation avec 1ml de la suspension-mère. L’excès de fluide est éliminé par aspiration. Après quelques minutes, le disque imbibé de 10µl de l’HE est appliqué sur le milieu. La fixation du disque sur la surface du milieu est assurée par une légère pression sur ce dernier. La culture est ensuite incubée à la température ambiante (30°C), sous hotte, pendant 18 à 24h. c-2) Méthode des puits L’inoculation du milieu se fait de la même manière que celle des disques, cette fois-ci on creuse les puits en quatre points opposés distants de quelques centimètres de la paroi de la boite. Un volume de 10µl de HE est introduit dans chaque puits. L’incubation est faite à 30°C pendant 18 à 24h.


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D) Test du pouvoir antimicrobien de l’odeur de l’HE.

b) Principe Le principe se base sur le fait que l’HE est volatile c’est à dire qu’elle s’évapore au contact de l’air, et diffuse ainsi son arôme. L’HE a alors des vertus antiseptiques qui purifie l’air en détruisant les microbes. (41) Deux gélose-pentes ensemencées par le mélange de la population de Vibrio sont incubées dans deux environnements différents : l’un dans un environnement où règne l’odeur de l’HE, l’autre dans un endroit où il n’y a aucune odeur de l’HE. L’appréciation de la croissance de Vibrio dans chaque cas permettra d’obtenir une donnée qualitative sur l’action antibactérienne de l’odeur de l’HE étudiée. c) Matériels et méthodes - Deux gélose-pentes de TCBS - La souche fraîche constituée par le mélange des population de Vibrio isolées (ayant été cultivées dans un milieu liquide pendant 24h) - Deux erlens de 500ml stérilisés dans le stérilisateur, ouvertures fermées par des papiers aluminium - Huile essentielle L’ensemencement se fait sur gélose pente (TCBS) par zigzag très serré à partir du fond du tube. L’un des tubes est placé dans un erlen où l’on a mis préalablement 5ml de l’HE, l’autre tube est placé dans le deuxième erlen où il n’y a que de l’air pur. Chaque erlen est fermé à l’aide de papier d’aluminium puis incubé sous hotte pendant 48h à la température ambiante 30°C. E) Comparaison de l’activité antimicrobienne de l’HE de Cinnamosma fragans et celles extraites de Citrus simensis, Eucalyptus citrodora. Citrus simensis, et Eucalyptus citrodora sont des végétaux aromatiques qui poussent bien dans la région Nord-Ouest. Comme la plante Cinnamosma fragans, il est alors intéressant de comparer l’activité antimicrobienne des HE extraites de ces plantes. b) Principe L’aromatogramme par la méthode des disques permet de comparer facilement le diamètre de la zone d’inhibition développée par ces HE. Plus le diamètre est grand, plus l’HE a une action inhibitrice importante et inversement. c) Matériels et méthodes - Milieu Mueller-Hinton - La souche est constituée par le mélange de la population des Vibrio, précultivée pendant 24h. - HE 90% + Tween 10% La préparation est le même que celle décrite dans les expériences précédentes. Le disque de papier filtre imprégné de 10µl de HE est posé sur la gélose en appliquant une petite pression pour assurer le contact avec le milieu. L’incubation est réalisée à la température ambiante, pendant 18 à 24h. III-3-5) Etude biologique : Evaluation de la toxicité de l’HE.


30

Ce test permet de déterminer les effets des différentes concentrations de l’HE sur les larves et les post-larves de crevettes. En général, les grandeurs qui caractérisent la toxicité d’une substance donnée sont les suivantes : - La toxicité aiguë qui est la dose permettant de tuer immédiatement les animaux. - La DL100 est la dose qui tue 100% des animaux, DL50 est la dose qui tue 50% des animaux et la DL0 est la plus grande dose ne pouvant provoquer aucun effet sur les animaux.(18) a-1) Principe

Le principe consiste à provoquer la mortalité des animaux par administration en une seule fois de doses décroissantes de l’huile essentielle dans des conditions expérimentales bien définies. L’HE est mélangée au Tween-80. Comme le nombre de morts est croissant au fur et à mesure que la dose augmente, la DL50 peut être calculée par la formule de Berhens et Karber :

a : différence entre deux doses successives. b : moyenne du nombre de morts pour deux doses successives. m : nombre des animaux utilisés pour l’expérience. a-2) Matériels et méthodes

a-2-1) Matériels - Larves (nauplii, zoés, mysis), post-larves en bonne santé (PL5 à PL10) - Eau de mer filtrée par sable, puis par filtre à cartouches de 0,5 microns, passée par la suite dans une chambre à U.V et enfin filtrée de nouveau avec un filtre à cartouches de 0,3 microns (disponible à l’écloserie) - Aliments (Kyowa-250 et 400, Artemia) - Aérateur; modèle APN-057R. - Thermomètre. - TetraTest pH. - Bac de 10l - Huile essentielle. - Tween 80. a-2-2) Méthode - L’huile essentielle est mélangée au Tween 80, soit 90%HE + 10%Tween 80. - Les larves et PL sont placées dans des bacs de 10l - Les conditions et les paramètres physico-chimiques pratiquées dans l’élevage larvaire sont reproduites au laboratoire :

• Eau de mer. • Aération. • Température : 29 à 31°C. • pH basique : 8 à 8.7. • Salinité : 28 à 35%

Σ(a x b) DL50 (ml/l) = DL100 - --------

m


31

- Pour la détermination de la toxicité aiguë, trois expériences dont chacune est composée de trois bacs de 10l contenant 70, 140 et 300 PL, sont réalisées. Pour la première expérience, on a utilisé 20ml d’HE, la deuxième 15ml et la troisième 10m1. - Six lots de 100PL sont utilisés pour la détermination de DL50, DL100, DL0. A chaque lot de PL correspond une concentration définie d’HE. La durée des expériences est de 24h. On ne fait aucun changement d’eau durant ce temps pour éviter la perte d’HE, ce qui pourrait modifier le résultat. - Dans un bac de 10l, on détermine aussi la toxicité aiguë des différents stades larvaires, en utilisant 140 individus de nauplii, zoés et mysis, avec de l’HE 10ml, 8ml, 6ml et 4ml pour chaque stade. - L’heure d’administration de l’HE est notée. - Les symptômes de toxicité sont observés durant le test, de même que le nombre de morts. - Les animaux morts font l’objet d’une observation microscopique.

IV

RESULTATS

IV-Résultats

IV-1) Isolement des colonies bactériennes IV-1-1) Les suspensions mères Echantillon obtenu après broyage : - 5ml de suspension obtenue à partir du broyât de larves et de post-larves, soit (S1) - 5ml d’eau de mer dans la quelle les crevettes ont été élevées, soit (S2) IV-1-2) Ensemencement bactérien a) Vérification de la stérilité de milieux TCBS préparés. Après 24 d’incubation à la température ambiante, aucune croissance microbienne n’a été détectée sur la surface de la gélose. Les milieux ainsi préparés sont donc utilisables pour la suite de l’étude. b) Résultats de l’ensemencement après 24h de culture. Le tableau suivant donne les résultats obtenus issus de la solution diluée à 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 et à 10-5. Tableau II : Résultats issus de la suspension diluée à 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 et 10-5.

Dilution Echantillon (S1) Echantillon (S2) 10-1, 10-2, 10-3 Colonies très denses,

difficiles à distinguer Colonies très denses, difficiles à distinguer

10-4 Les colonies commencent à se distinguer

Les colonies commencent à se distinguer

10-5 Colonies biens isolées Colonies biens isolées

D’après leur couleur, leur taille et leur consistance, un nom est attribué provisoirement aux colonies les plus abondantes issues de la suspension diluée à 10-4

et à 10-5. Ces noms provisoires sont résumés dans le tableau ci-dessous : Tableau III : Noms provisoires des colonies issues de la suspension diluée à 10-4 et 10-5 Echantillon (S1) Echantillon (S2) Couleur Noms provisoires Couleur Noms provisoires Vert foncé graisseux Vert jaune graisseux Vert Blanc

Vfg Vjg VB

Vert foncé petite Jaune Blanc

vf JB

IV-1-3) Purification des colonies - Quadrant et quadrillage : on n’a pas obtenu beaucoup de colonies bien isolées pour S1 et S2 - Par étalement de la suspension microbienne diluée à 10-3, 10-4 et 10-5, nous avons obtenu beaucoup de colonies pour S1 et S2. IV-1-4) Conservation Des jeunes colonies de 24h de culture sont conservées à 4 °C au réfrigérateur. IV-2) Identification bactérienne IV-2-1) Etude des caractères culturaux a) Sur milieu solide L’observation des colonies faite sous la loupe binoculaire après 24h de culture ont donné les résultats sur le tableau suivants :

Résultats

33

Tableau IV : Caractéristiques des colonies isolées

Caractéristiques

Vfg VB JV vjg vf JB

Taille 1 à 2mm 1 à 2mm 1 à 2mm 2-2,5mm 0,5-1mm 1 à 2mm Forme arrondie arrondie arrondie arrondie arrondie arrondie Bord lisse lisse lisse lisse onduleux lisse Relief légèrement

bombé au centre

bombé sémi-bombé

bombé au centre

bombé bombé

Caractère optique

sémi-translucide

sémi-translucide

sémi-translucide

opaque centre opaque, bord translucide

centre opaque

Surface lisse lisse lisse lisse lisse lisse Consistance grasse crémeuse crémeuse grasse sèche grasse Couleur vert foncé centre

jaunâtre, périphérie verte

jaune au centre, périphérie verdâtre

vert jaune

verte jaune, centre blanchâtre

Croissance rapide faible rapide assez rapide

assez rapide

très vite

La notion de croissance rapide ou faible se base ici sur la précocité d’apparition des colonies et la durée que met le Vibrio en question pour atteindre la taille 1mm ou 2mm (diamètre d’une colonie âgée de 24h de culture)

b) Sur milieu liquide

Les résultats des observations macroscopiques de la culture après 24h d’incubation sont portés sur le tableau suivant : Tableau V : Caractéristiques culturaux sur milieu liquide

Colonie Vfg VB JV vjg vf JB

Observations

Trouble, de fins voiles à la surface

trouble, de fins voiles à la surface.

trouble, présence de fins voiles à la surface

trouble, dépôts blancs sur le fond du tube.

trouble, présence de voiles.

trouble, des voiles flottent à la surface.

On note chez toutes les espèces la présence de troubles et de fins voiles qui flottent à la surface

Résultats

34

IV-2-2) Caractères morphologiques d’une cellule a) Examen à l’état frais Les résultats sont résumés sur le tableau VI : Tableau VI : Caractéristiques d’une cellule vivante Caractéristiques

Vfg VB JV vjg vf JB

Forme allongée allongée allongée en virgule

onduleuse

allongée

groupe- ment

isolé isolé, ou groupé en grappe

isolé isolé isolé isolé

mobilité mobile mobile mobile mobile mobile mobile dans un sens

b) Examen après coloration Gram Les observations sont effectuées avec l’objectif x 100, avec immersion d’huile, le tableau ci-dessous résume les résultats obtenus. Tableau VII : Résultats de la coloration Gram

Vfg VB JV vjg vf JB

Couleur après coloration

rose rose rose rose rose rose

Gram - - - - - - IV-2-3) Etude des caractères biologiques Type respiratoire L’observation après 24h de culture montre une croissance qui se fait dans la zone de 1cm de la partie supérieure et sur la partie superficielle du tube, pareil pour les six types de bactérie isolés. Elles sont donc toutes des bactéries aéro- anaérobies. IV-2-4) Caractères biochimiques et physiologiques

a) Tolérance à la solution NaCl : Les résultats des observations faites après 24h de culture sont portés sur le tableau suivant

Tableau VIII: Tolérance à la solution NaCl

Nacl Vfg VB JV vjg vf JB 0% - - - - - - 3% + + + + + + 8% - + - - - + + : croissance rapide

- : absence de croissance En bref, aucune de ces bactéries ne pousse à 0% de NaCl, et seules VB et JB croissent à 8%. Toutes les espèces croissent à 3% de NaCl.

Résultats

35

b) Recherche des différents équipements enzymatiques

Les observations après 24h de culture ont donné les résultats dans le tableau suivants Tableau IX : Résultats de tests biochimiques

Vfg VB JV vjg vf JB Catalase + + + + + + Oxydase + + + + + + Indole-Urée Indole

-

-

-

-

-

-

Uréase + + + + + + Hajna-kliger Glucose

+

+

+

+

+

+

Lactose - - - - + + H2S - - - - - - Gaz - - - + + +

+ : Réaction positive + : Réaction très faible, tardivement - : Réaction négative D’après ces résultats, toutes les espèces possèdent les enzymes catalase, oxydase, tryptophanase, uréase et utilisent le glucose par le métabolisme fermentatif. c) Résultats des tests API 20 NE : Les observations après 24h de culture ont donné les résultats ci-dessous : Tableau X : Tests API 20 NE Substrats Vfg VB JV vjg vf JB

NO3 + - + + + + TRP - - - - - - GLU + + + + + + ADH + + + + + + URE + + - + + + ESC + + - - - + GEL + + + - + +

PNPG + - + - - - GLU - + - - + - ARA - - - - - - MNE - + - + + - MAN + + + - + + NAG - - + + + - MAL + + - + + + GNT - - - - + + CAP - - - - - - ADI - - - - - - MLT - - + - + + CIT - - + - - - PAC + + - - - -

+ : Réaction positive + : Réaction tardive et faiblement positive

Résultats

36

- : Réaction négative

Ces tests permettent de confirmer que toutes les espèces sont indole négative, glucose positive et de savoir en plus qu’elles sont arginine (ADH) positive et ne peuvent pas métaboliser l’arabinose (ARA), l’acide caprique (CAP) et l’acide adipique (ADI) IV-2-5) Résultats de l’identification bactérienne Les noms de genre et d’espèce trouvés sont donnés dans le tableau suivant : Tableau XI : Nom de genre et d’espèce des souches isolées

Noms provisoires Nom de genre et d’espèce Vfg Vibrio splendidus-II VB Vibrio sp1 JV Vibrio anguillarum-like vjg Vibrio damsela vf Vibrio sp2 JB Vibrio sp3

La dénomination Vibrio sp indique un Vibrio dont le nom d’espèce n’est pas identifié. Les références utilisées pour la dénomination de ces bactéries sont : - Alsina M., Blanch R. A. Journal of Applied Microbiology 1994. (4) - Donald V., Lightner Ph D. A handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for diseases of cultured Penaeid shrimp. (24) IV-3) Recherche de la population microbienne impliquée dans la mort de larves et post-larves de crevettes IV-3-1) Tests avec les larves Zoé + Mysis Les résultats des tests sont donnés dans les tableaux XI à XVI Tableau XII : Eau d’élevage avec V. splendidus-II 1èr jour 5ème jour Taux de Taux

de nombre de

larves nombre de

larves mortalité

% survie

% 1ère expérience Témoin

V. splend. 100 100

78 62

22 38

78 62

2ème expérience Témoin V. splend.

100 100

73 45

27 55

73 45


100 100

80 60

20 40

80 60

Moyenne arithmétique :

Témoin V. splend.

23 44,3

77 55,7

La présence de Vibrio splendidus-II dans l’eau d’élevage donne une moyenne du

taux de mortalité (44,3%), inférieur à celui du taux de survie (55,7%). On peut en

Résultats

37

conclure que les larves supportent encore la présence de ce type de Vibrio dans leur milieu.

Tableau XIII : Eau d’élevage avec Vibrio sp1 1èr jour 5ème jour Taux de Taux

de nombre de

larves nombre de

larves mortalité

% survie


Vibrio sp1 100 100

80 54

20 46

80 54

2ème expérience Témoin Vibrio sp1

100 100

85 45

15 55

85 45


100 100

76 36

24 64

76 36


Témoin Vibrio sp1

19,7 55

80,3 45

Vibrio sp1 crée un taux de mortalité de larves (55%), supérieur à leur taux de survie (45%), ce Vibrio est pathogène pour les larves de crevettes. Tableau XIV : Eau d’élevage avec V.anguillarum-like 1èr jour 5ème jour Taux de Taux

de nombre de

larves nombre de

larves mortalité

% survie


V. anguill. 100 100

78 59

22 41

78 59

2ème expérience Témoin V. anguill.

100 100

76 46

24 54

76 46


100 100

81 42

19 58

81 42


Témoin V. anguill.

21,7 51

78,3 49

Le taux de mortalité (51%) est ici, sensiblement égal à celui de survie de larves

(49%). La pathogénicité de Vibrio anguillarum-like moins important par rapport à Vibrio spi

Tableau XV : Eau d’élevage avec V. damsela 1èr jour 5ème jour Taux de Taux

de nombre de

larves nombre de

larves mortalité

% survie


V. damsela 100 100

73 41

27 59

73 41

2ème expérience Témoin V. damsela

100 100

72 26

28 74

72 26


100 100

82 34

18 66

82 34

Moyenne Témoin 24,3 75,7

Résultats

38

Arithmétique : V. damsela 66,3 33,7

Le taux de mortalité de larves obtenu avec Vibrio damsela est deux fois supérieur au taux de mortalité, soit 66,3% contre 33,7%. Ce Vibrio est alors plus pathogène pour les larves de crevettes. Tableau XVI : Eau d’élevage avec Vibrio sp2

1èr jour 5ème jour Taux de Taux de

nombre de larves

nombre de larves

mortalité %

survie %

1ère expérience Témoin Vibrio sp2

100 100

75 83

25 17

75 83


100 100

83 72

17 28

83 72


100 100

78 69

22 31

78 69

Moyenne Arithmétique :

Témoin Vibrio sp2

21,3 25,3

78,7 74,7

Le taux de mortalité 25,3% est largement inférieur au taux de survie 74,7%. Les

larves tolèrent alors la présence de ce Vibrio dans leur milieu. Tableau XVII : Eau d’élevage avec Vibrio sp3

1èr jour 5ème jour Taux de Taux de

nombre de larves

nombre de larves

mortalité %

survie %


100 100

78 59

22 41

78 59


100 100

76 46

24 54

76 46


100 100

82 53

18 47

82 53

Moyenne Arithmétique :

Témoin Vibrio sp3

21,3 47,3

78,7 52,7

Le taux de mortalité est inférieur à celui de survie, Vibrio sp3 a à peu près le

même effet que Vibrio splendidus-II. La variation du taux de survie de larves dans l’eau d’élevage où l’on a

administré le Vibrio étudié est donnée sur la figure suivante :

Résultats

39

Figure-3 : Histogramme de taux de survie de Larves (Zoé + Mysis) D’après le pourcentage en taux de survie, on peut classer comme suit les Vibrio suivant leur virulence vis à vis de larves de crevettes : V. damsela > Vibrio sp1 > V. anguillarum-like > Vibrio sp3 > V. splendidus-II > Vibrio sp2 . IV-3-2) Tests avec les post-larves Les résultats de tests sont donnés dans les tableaux XVIII à XXIII Tableau XVIII : Eau d’élevage avec V. splendidus-II 1èr jour 5ème jour Taux de Taux de nombre de

post-larves nombre de post-larves

mortalité %

survie %

1ère expérience Témoin V. splend.

100 100

78 82

22 18

78 82


100 100

97 68

3 32

97 68


100 100

90 80

10 20

90 80


Témoin V. splend.

11,7 32,3

88,3 76,7

Le taux de survie 76,7% est deux fois supérieur au taux de mortalité 32,3%

Effet des différents Vibrio sur les Larves

0

20

40

60

80

100

120

Témoin V sp2 V splend V sp3 V anguill V sp1 V dams

Survie (%)

Résultats

40

Tableau XIX : Eau d’élevage avec Vibrio sp1 1èr jour 5ème jour Taux de Taux

de nombre de


mortalité %

survie %


100 100

97 21

3 79

97 21


100 100

81 86

19 14

81 86


100 100

90 90

10 10

90 90


Témoin Vibrio sp1

10,7 34,3

89,3 65,7

Les post-larves montrent une tolérance assez importante avec un taux de survie 65,7% par rapport au tau de mortalité 34,3%. Tableau XX : Eau d’élevage avec V. anguillarum-like 1èr jour 5ème jour Taux de Taux

de nombre de


mortalité %

survie %

1ère expérience Témoin V. anguill.

100 100

78 78

22 22

78 78


100 100

81 60

19 40

81 60


100 100

90 50

10 50

90 50


Témoin V. anguill.

17 37,3

83 62,7

Le taux de survie diminue par rapport aux deux expériences précédentes, mais

reste encore supérieur au taux de mortalité. Tableau XXI : Eau d’élevage avec V. damsela 1èr jour 5ème jour Taux de Taux

de nombre de


mortalité %

survie %

1ère expérience Témoin V. damsela

100 100

81 50

19 50

81 50


100 100

90 53

10 47

90 53


100 100

93 70

7 30

93 70


Témoin V. damsela

12 42,3

88 57,7

Résultats

41

Pour Vibrio damsela, on assiste à une augmentation du taux de mortalité (42,3%) mais le taux de survie se trouve encore à une valeur supérieure (57,7%). Tableau XXII : Eau d’élevage avec Vibrio sp2 1èr jour 5ème jour Taux de Taux

de nombre de


mortalité %

survie %


100 100

81 90

19 10

81 90


100 100

93 83

7 17

93 83


100 100

78 90

22 10

78 90


Témoin Vibrio sp2

16 12,3

84 87,7

Le taux de mortalité (12,3%) est largement inférieur à celui de survie (87,7%), ceci confirme la tolérance plus importante développée par les post-larves face à l’infection de ce Vibrio. Tableau XXIII : Eau d’élevage avec Vibrio sp3 1èr jour 5ème jour Taux de Taux

de nombre de


mortalité %

survie %


100 100

81 71

19 29

81 71


100 100

90 44

10 56

90 44


100 100

93 80

7 20

93 80


Témoin Vibrio sp3

12 35

88 65

On note encore la tolérance de post-larves avec un taux de survie 65% contre un

taux de mortalité 35%

Résultats

42

La variation du taux de survie de post-larves élevées dans de l’eau où l’on a administré les Vibrio étudiés est représentée par la figure ci-dessous :

Figure-4 : Histogramme de taux de survie de PL Les espèces de Vibrio peuvent donc être rangées comme suit, selon leur virulence vis à vis des PL de crevettes : V. damsela > V. anguillarum-like > Vibrio sp3 > Vibrio sp1 > V. splendidus-II > Vibrio sp2. En conclusion, pour les expériences avec les larves et celles avec les post-larves, Vibrio damsela engendrent toujours le plus de mortalité, suivi par Vibrio anguillarum-like, Vibrio sp3 et Vibrio sp1. Dans les deux cas (larves et post-larves), les Vibrio dont les colonies se colorent en vert (V. damsela, Vibrio sp1) semblent plus pathogènes que ceux dont les colonies se colorent en jaune (V. anguillarum-like et Vibrio sp3). La comparaison des taux de mortalité de larves et post-larves montre que les post-larves sont plus résistantes face à l’infection de ces Vibrio par rapport aux larves (Zoé, Mysis) : on a par exemple un taux de survie de 57,7% pour les PL avec V. damsela alors que le taux de survie n’est que de 33,7% chez les larves pour ce même Vibrio. Examen microscopique de larves et PL mortes Dans la plupart des cas, les échantillons observés présentent toujours une coloration noirâtre ou rougeâtre. Des symptomes de la nécrosie apparaissent sur les appendices (pourrissement de pattes à partir de l’exopodite)

Effet des différents Vibrio sur les PL

0

20

40

60

80

100

120

V sp2 Témoin V splend V sp1 V sp3 V anguill V dams

Survie (%)

Résultats

43

IV-4) Etudes physique, chimique, microbiologique et biologique de l’huile essentielle de Cinnamosma fragans IV-4-1) Etude physique a) Extraction Les résultats d’extraction obtenus après 2,5h sont présentés sur le tableau XXIV Tableau XXIV : Rendement d’extraction d'HE de Cinnamosma fragans Partie extraite

Etat du matériel

Charge des matériels

(kg)

Durée d'extraction

(h)

Rendement %

masse /masse Feuille Frais 80 2,5 1,25

b) Caractéristiques physiques et organoleptiques

Elles sont consignées dans les deux tableaux ci-dessous

b-1) Tableau XXV : Caractéristiques organoleptiques Aspect Liquide Couleur Jaune clair Odeur épicée, piquante, étouffante à

forte dose Ténacité Odeur puissante dans les 2

premières heures, puis devenue faible en 3ème heure, disparition totale de l’odeur à partir de la 4ème heure.

Goût Brûlant, pimenté Toucher Huileux

b-2) Tableau XXVI : Miscibilité de l’HE avec l’eau de mer

Volume de l’eau Résultats de mer ajouté

(ml) Huile essentielle Huile essentielle +Tween

0,2

0,4

1,4 3 4 4 3 3

-Solution limpide avec émulsion. -Solution opalescente, homogène. -Persistance de l’opalescence, gouttelettes plus fines. -Formation d’un léger trouble, émulsions plus denses. -Solution opalescente, avec de grosses émulsions. - Légèrement opalescente. - Opalescente, visqueuse. -Solution opalescente, visqueuse.

-Formation de solution homogène, blanc laiteux, qui colore en blanc la paroi du tube, absence d’émulsion ni de gouttelettes, présence de mousses à la partie superficielle. -Solution toujours laiteuse mais ne colore plus la paroi du tube, les mousses diminuent.

Résultats

44

D’une manière générale, l’HE étudiée présente une grande miscibilité avec l’eau de mer. L’HE ajoutée de Tween 80 est devenue soluble dans l’eau de mer. IV-4-2) Etude chimique

a) Résultats de l’Indice d’Acide

La moyenne arithmétique des deux déterminations effectuées donne comme

indice d’acide 1,04. L’indice d’acide permet de vérifier la qualité de l’HE car sa variation indiquera une dégradation au niveau de ses molécules constitutives. IV-4-3) Etudes microbiologiques A) Détermination de CMI et CMB pour chaque Vibrio isolé

Les figures n°5 à 9 nous montrent les cinétiques de croissance de Vibrio étudiés dans un milieu contenant de différentes concentrations en huile essentielle :

Figure-5 : Courbes de croissance de Vibrio damsela en présence des différentes

concentrations en huile essentielle La cinétique de croissance avec 25µl d’HE dont l’allure est stationnaire démontre une activité bactériostatique c’est à dire absence de croissance bactérienne suivie de la mort bactérienne. La concentration en HE 25µl est donc la CMI. A partir de la concentration 50µl, l’HE est bactéricide car l’allure générale de la courbe décroît, c’est à dire qu’il n’y a pas de croissance microbienne mais plutôt une mort microbienne, c’est la concentration minimale bactéricide CMB.

-1

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0

0,2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95

temps(h)

ln A

bsor

banc

e à

600n

m

0µl25µl50µl75µl100µl

Résultats

45

Figure-6 : Courbes de croissance de Vibrio anguillarum-like en présence des différentes concentrations en huile essentielle La concentration 25µl qui donne une courbe à allure stationnaire représente la CMI et la concentration 50µl qui est la plus petite dose donnant une courbe décroissante est la CMB.

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90

temps(h)

ln A

bsor

banc

e à

600n

m


Résultats

46

Figure-7 : Courbes de croissance de Vibrio sp3 en présence de différentes doses d’huile

essentielle La cinétique de croissance avec 25µl et celle avec 50µl montrent toutes les deux l’allure stationnaire, on a retenu comme CMI la concentration 25µl car c’est la plus petite concentration qui inhibe la croissance microbienne.

Figure-8 : Courbes de croissance de Vibrio sp1 en présence de différentes doses d’huile essentielle

La culture dans le tube témoin (0µl) présente une croissance faible, plus ou

moins stationnaire, on note que ce mode de croissance de Vibrio sp1 a été déjà observé en milieu solide. A partir de la concentration 25µl, la décroissance se fait par palier successif, on a donc comme CMB la concentration 25µl.

-0,3-0,25-0,2

-0,15-0,1

-0,050

0,050,1

0,150,2

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84

temps(h)

ln A

bsor

banc

e à

600n

m


-1

-0,9

-0,8

-0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

3 7 11 15 23 27 31 35 39 43 47 51 55 59 63 67 71 75 79 83 87

temps(h)

ln A

bsor

banc

e à

600n

m


Résultats

47

Figure-9 : Courbes de croissance du mélange de population bactérienne en présence de différentes doses d’huile essentielle La cinétique de croissance avec 25µl et celle avec 50µl montrent toutes les deux l’allure décroissante, la CMB est toujours représentée par la plus petite concentration qui est le 25µl. En résumé, pour les Vibrio les plus dangereux pour les larves et les PL sont V. damsela, V. anguillarum, Vibrio sp3 , la CMI est de 25µl et la CMB de 50µl. Pour Vibrio sp1 qui est moins dangereux, la concentration 25µl correspond déjà à la CMB. B) Détermination de la concentration en HE utilisable in vivo Les CMI et les CMB sont trouvées in vitro. Leur application in vivo (dans l’eau d’élevage de crevette) nécessite d’abord la considération de la règle suivante : “il faut utiliser une concentration supérieure à la CMI pour assurer le contact des bactéries au foyer infectieux” (26) La concentration bactéricide CMB 50µl dans 15ml de milieu de culture liquide est donc préférable pour l’utilisation in vivo. En plus, il faut tenir compte de la DO à 600nm de l’eau d’élevage car il est évident que le nombre de bactéries présent dans 15ml d’eau d’élevage (DO = 0,001) est largement inférieur à celui présent dans 15ml de milieu de culture (DO = 0,86) La détermination de la concentration en HE utilisable dans l’élevage larvaire à partir de cette concentration en HE trouvée in vitro nécessite alors l’établissement des quelques règles de trois suivantes 50µl d’HE dans 15ml de milieu de culture liquide à DO initiale 0,86 x ←⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ DO de l’eau d’élevage : 0,001 ⇒ x = 0,058µl d’HE dans 15ml et à DO = 0,001 y ←⎯ dans 1000ml (1litre) à DO = 0,001 ⇒ y = 3,87µl d’HE dans 1litre d’eau d’élevage à DO = 0,001 z ←⎯ dans 1000litres (1tonne) d’eau d’élevage à DO = 0,001 ⇒ z = 3876µl d’HE dans 1tonne d’eau d’élevage

Soit : 3,8ml d’HE/tonne d’eau d’élevage arrondie à 4ppm

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90

temps(h)

ln A

bsor

banc

e à

600n

m


Résultats

48

C) Comparaison de l’action antimicrobienne de l’HE et celle de l’Elvagine Les résultats sont montrés par les cinq cinétiques suivantes (figure n°10 à 14) :

Figure-10 : Courbes de croissance de V. damsela Concentration en HE : 50µl

Concentration de l’Elvagine : 50µl L’effet de l’HE est bactériostatique pendant les deux premiers jours (48h) Après l’effet est devenu bactéricide. L’antibiotique inhibe la croissance dans les deux premiers jours mais une reprise de la croissance est constatée par la suite.

Figure-11 : Courbes de croissance de V. anguillarum-like Concentration en HE : 50µl Concentration de l’Elvagine : 50µl

L’HE inhibe la croissance durant les deux premiers jours, ensuite elle devient bactéricide. L’effet de l’antibiotique est bactéricide pendant les deux premiers jours. La reprise de croissance est aussi observée pour le jour suivant.

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90

temps(h)

ln A

bsor

banc

e à

600n

m

ElvagineHuile E

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90

temps(h)

ln A

bsor

banc

e à

600n

m

ElvagineHuile E

Résultats

49

Figure-12 : Courbes de croissance de Vibrio sp3 Concentration en HE : 50µl Concentration de l’Elvagine : 50µl

Pour l’HE, la courbe est stationnaire pendant 48h, puis devenue décroissante pour les jours qui suivent, celle de l’antibiotique décroît dans 30h, puis une reprise de la croissance microbienne au-delà de cette date.

Figure-13 : Courbes de croissance de Vibrio sp3 Concentratin en HE : 50µl Concentration de l’Elvagine : 50µl Après la phase de décroissance à 36h, les bactéries reprennent leur croissance en présence de l’antibiotique alors que l’effet bactéricide continue pour l’HE.

-0,35

-0,3

-0,25

-0,2

-0,15

-0,1

-0,05

0

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84

temps(h)

ln A

bsor

banc

e à

600n

m

Elvagine

Huile E

-0,8-0,7-0,6-0,5-0,4-0,3-0,2-0,1

0

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90

temps(h)

ln A

bsor

banc

e à

600n

m

Elvagine

Huile E

Résultats

50

Figure-14 : Courbes de croissance du mélange de population de Vibrio Concentration en HE : 50µl Concentration de l’Elvagine : 50µl

L’effet bactéricide de l’HE apparaît à partir de la 36ème heure, la courbe représentative de l’action de l’antibiotique présente toujours la phase de décroissance jusqu’à 48h (effet bactéricide). Au-delà de ce temps, les Vibrio reprennent leur croissance. La présence de l’HE dans le milieu de culture inhibe la croissance des Vibrio par effet bactériostatique suivi d’une action bactéricide. Pour l’antibiotique Elvagine, l’action est d’abord bactéricide mais cela s’atténue après 24 à 48h, les Vibrio reprennent par conséquent leur croissance.

D) Comparaison de l’effet antimicrobien de l’HE, de l’Elvagine, de la Terramycine et

de l’Oxytetracycline (OTC) La méthode des puits et celle des disques donnent les mêmes résultats (photos n°1 et 2 à la page 51) Les résultats obtenus sont portées sur le tableau suivant :

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90

temps(h)

ln A

bsor

banc

e à

600n

m

ElvagineHuile E

Résultats

51

Tableau XXVII : Effets antimicrobiens de l’HE, Elvagine, Terramycine, OTC Observation de la zone d’inhibition

Huile Essentielle de

C. fragans

Elvagine

Terramycine

OTC

Après 24h

dzi : 16mm inhibition de toute croissance




Après 48h

des tâches blanches de colonies commencent à envahir la zone à partir de la périphérie

de petites colonies commencent à envahir toute la zone d’inhibition

des tâches blanches des colonies commencent à envahir la zone à partir de la périphérie

des tâches blanches des colonies commencent à envahir la zone à partir de la périphérie

Après 72h

envahissement à environ 80% de la zone par des colonies blanchâtres, aucune colonie ne pousse encore sur la partie centrale.

envahissement total de la zone par des colonies blanchâtres

envahissement à 90% environ de la zone par des colonies blanchâtres

envahissement à environ 90% de la zone par des colonies blanchâtres

dzi : Diamètre de la zone d’inhibition. Ces résultats démontrent que, même si l’HE a un diamètre d’inhibition plus faible son action est plus persistante par rapport aux antibiotiques testés, car même après 72h la zone d’inhibition n’est pas totalement envahie par les colonies microbiennes. E) Test du pouvoir antimicrobien de l’odeur de l’HE Après 48h de culture, aucune croissance microbienne n’est observée dans le tube placé dans l’erlen où l’on a mis de l’HE. Par contre dans l’erlen où il n’y a pas de l’HE, les colonies microbiennes se développent énormément. On en conclut que l’odeur de l’HE utilisée inhibe la croissance des Vibrionaceae. F) Comparaison de l’activité antimicrobienne de l’HE de Cinnamosma fragans, Citrus simensis, Eucalyptus citrodora La comparaison des diamètres de la zone d’inhibition donne les résultats suivants : (photo n°3 à la page 51) C. fragans : 16mm C. simensis : 17mm E. citrodora : 12mm

Les résultats indiquent que l’activité antimicrobienne de l’HE de C.fragans peut être comparée avec celle de C. simensis, mais plus importante par rapport à celle de l’E. citrodora. Cette activité peut être classée parmi les meilleures pour les plantes autochtones dans cette région Nord-Ouest.

Résultats

52

1 - Test de sensibilité des Vibrionaceae (Méthode des puits)

Terr : terramycine ; OTC : oxytetracycline ; Elv : elvagine ; HE : huile essentielle

2 - Test de sensibilité des Vibrionaceae (Méthode des disques)

Terr : terramycine ; OTC : oxytetracycline ; Elv : elvagine ; HE : huile essentielle

3 - Test de sensibilité des Vibrionaceae vis à vis des différentes huiles essentielles

cf : C.fragans ; Euc : E.citrodora ; org : Orange C.simensis

Résultats

53

IV-4-4) Etudes biologiques

a) tests de toxicité

Les résultats des tests de toxicité aiguë sont portés sur le tableau ci-dessous : a-1) Tableau XXVIII : Test de toxicité aiguë

Concentration de l’HE utilisée (ml/l)

Nombre de PL initial

Volume d’eau (l)

Nombre de morts

Taux de mortalité

(%)

1ère expérience 2 70 10 70 100 2 140 10 140 100 2 300 10 300 100

2ème expérience 1,5 70 10 70 100 1,5 140 10 140 100 1,5 300 10 30 100

3ème expérience 1 70 10 60 85,7 1 140 10 100 71,4 1 300 10 240 80

Les symptômes suivants ont été observés pour les trois expériences :

Une perte des réflexes, puis les animaux se sont mis à l’envers et cela, suivi d’une immobilisation totale. Le décès de toutes les PL est noté après 10mn dans le cas où la concentration en HE a été de 2ml/l (1èreexpérience) Pour la deuxième expérience dont la concentration en HE a été de 1,5ml/l, le taux de mortalité 100% n’a été atteint qu’après 12h. Dans la troisième expérience, le taux de mortalité 100% n’a pu être obtenu même après 24h de suivi. La toxicité aiguë de l’HE de Cinnamosma fragans vis à vis de PL est donc obtenue pour une concentration d’huile essentielle égale à 20ml /10l, soit 2ml/l Observations microscopiques Ces observations ont été effectuées sur quelques PL mortes issues des expériences-1, 2 et 3 : - Arrêt total du mouvement péristaltique du tube digestif, - Les organes viscéraux sont devenus atrophiés, - La partie ventrale postérieure s’est rougie.

Les doses caractéristiques sont données sur le tableau suivant :

Résultats

54

a-2) Tableau XXIX : Détermination de DL100, DL50, DL0

Lots

Concentration en HE

(HEml/l)

Nombre initial de PL

Volume d’eau (l)

Nombre de mort

Taux de mortalité

(%) 1 1,5 100 10 100 100 2 1,2 100 10 80 80 3 1 100 10 70 70 4 0,8 100 10 50 50 5 0,6 100 10 10 10 6 0,3 100 10 0 0

(1,5+6+12+15+24) DL50 = 1,5 - -------------------------- où m = 100 100

Le tableau ci-dessous représente les résultats de tests de toxicité aiguë pour chaque stade larvaire : a-3) Tableau XXX : Toxicité aiguë de chaque stade larvaire Nauplii Zoé Mysis Toxicité aiguë

HEml/l

0,6

0,8 1

Observations

mort de tous les Nauplii après 10mn

mort de tous les Zoé après 10mn

mort de tous les Mysis après 10mn

La valeur de la toxicité aiguë augmente à raison de 0,2ml/l au fur et à mesure

que les larves passent à un stade supérieur.

DL100 = 1,5ml d’HE/l

DL0 = 0,3ml d’HE/l

DL50 = 0,915ml d’HE/l

Résultats

55

La variation de la toxicité aiguë de l’HE vis à vis de différents stades larvaires est donnée par la figure ci-dessous :

Figure-17 : Courbe représentative de la toxicité aiguë de chaque stade larvaire

La courbe croit suivant l’âge des larves. La tolérance des larves de crevettes à cette HE augmente au fur et à mesure qu’elles grandissent. Les post-larves de crevettes sont de plus en plus tolérantes à cette HE car la variation de la valeur de toxicité est assez importante entre le stade mysis et le stade post-larve, par contre cette variation est faible du stade nauplii au stade mysis.

.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Nauplii Zoé Mysis Post-larve

ml/l toxicité aiguë

55

V DISCUSSION

V- Discussion

Nous apportons dans cette partie discussion quelques explications concernant sur les méthodes utilisées et sur les résultats que nous avons obtenus. Les bactéries infectent aussi bien les larves que les post-larves de crevettes. Pour extraire les bactéries, nous avons broyé ensemble les larves et post-larves. L’isolement, la purification et l’identification ont été réalisées par la suite. Du fait de leur mobilité, l’obtention de colonies pures des Vibrio par la méthode de quadrant et quadrillage est assez difficile. Aussi la méthode de dilution en cascade a été utilisée. Les résultats de l’étude, de l’examen macroscopique de colonies (IV-2-1) jusqu’au test sur le milieu Hajna-Kligler (IV-2-4) confirment l’appartenance de ces bactéries isolées au genre Vibrio, les critères d’identification étant : croissance sur TCBS dans 18 à 24h de culture, bacille incurvé, Gram négative, oxydase positive, catalase positive, mobile, aéro-anaérobie, nitrate réductase positive et fermentation de glucose positive. (72)(29) Les colonies de couleur verte sur TCBS sont sucrose négative, celles de colonies jaunes sont sucrose positive.(43) Le saccharose contenu dans la solution TCBS subit une fermentation par les Vibrio jaunes. Comme notre laboratoire ne dispose pas la liste complète de référence utilisée pour l’identification de bactérie à partir du test API 20 NE, nous avons utilisé par conséquent la liste établie par Alsina M. et Blanch en 1994 dans “Journal of Applied Bacteriology”. Cette liste de référence se base sur 28 tests biochimiques et physiologiques pour identifier une espèce de Vibrio (Annexe-VII) : elle affirme aussi que la vérification de 10 tests entre ces 28 suffirait pour identifier une espèce. Nous avons alors adopté cette dernière condition pour identifier les Vibrio isolés. Ainsi, les conditions vérifiées pour les Vibrio identifiés sont : V. damsela : Arginine (+), absence de croissance à 0% de Nacl, indole (-), mannitol (-), PNPG (-), gélatine (-), mannose (+), urée (+), arabinose (-), citrate (-), lactose (-), esculine (-), D-glucosamine (+), sucrose (-). V. anguillarum-like : Arginine (+), absence de croissance à 0% de Nacl,indole(-) mannitol (+), oxydase (+), arabinose (-), gélatine (+), D-glucosamine (+), sucrose (+), PNPG (+), glucose gaz (-), citrate (+), esculine (-), lactose (-), mannose (-) V. splendidus-II : Arginine (+), absence de croissance à 0% de Nacl, indole (-), gélatine (+), arabinose (-), oxydase (+), sucrose (-), mannose (-), glucose gaz (-), lactose (+), D-glucosamine (-), citrate (-), esculine (+). Parmi les Vibrio identifiés, V. damsela et V. anguillarum-like sont les plus dangereux pour les larves et post-larves de crevette. Les larves sont les plus vulnérables. Ces deux Vibrio sont déjà rencontrés dans certaine région d’Asie et causent une mortalité de 70 à 80% et ce sont aussi les larves qui sont les plus sensibles. (64) Comme ces Vibrio identifiés sont tous issus de larves et post-larves, eau d’élevage mais à effectif assez faible ; après les avoir multiplié par culture en milieu liquide approprié et les avoir administré de nouveau dans l’eau d’élevage de crevettes, certains entraînent une mortalité importante de crevettes. Il existe alors un certain nombre de bactéries suffisant pour provoquer la mortalité de larves ou post-larves de crevettes, ce nombre est très variable selon l’espèce mais en général assez élevé, de 1.106 à 3.109 ufc/ml sont des nombres critiques pour la mortalité de larves et post-larves. (38)(43) En élevage larvaire de crevettes, sous certaines conditions, les bactéries

Discussion

57

prolifèrent spontanément et cela peut créer, s’il s’agit d’un organisme pathogène, la mortalité inattendue de larves ou post-larves. On peut schématiser comme suit les différents facteurs qui influencent le nombre de micro-organisme dans l’eau d’élevage de crevettes : Eau de mer filtres Flore initiale de crevettes dans l’eau d’élevage Disparition de microorganismes Apport de microorganismes Antagonisme microbien Matériels (bac, filtre, etc... ) Traitement par des agents Insectes (mouche, ... ) Antimicrobiens ; antibiotique, Air (poussière, ... ) antiseptiques Homme(mains,

chaussures...) (benzalconium, formol ..) Bactéries volontairement

ajoutées Changement d’eau (cas de Probiontique)

Flore de crevettes transformées A ce schéma récapitulatif de l’origine de micro-organismes de crevettes doit être ajouté les différents facteurs qui favorisent la croissance de micro-organisme : - La salinité entre 25 à 30‰ - La température aux alentours de 30°C - Le pH basique 8 à 9 Il faut noter que ces conditions physico-chimiques sont optimales pour la bonne croissance des larves et post-larves de crevettes. - Les restes d’aliments de crevettes lesquels sont composés par des protéines 35 à 50%, des complexes minéraux-vitaminiques, de l’acide gras, de l’amidon et de fibres de cellulose constituent de véritables substrats pour les métabolismes bactériens, en particulier pour les Vibrionaceae dont les conditions optimales de croissance sont : pH 8 à 8,6; température 20 à 30°C pour les saprophytes, 30 à 37°C pour les Vibrio pathogènes; salinité 25‰. L’indice d’acide 1,04 est assez élevé par rapport aux indices d’acide des autres huiles essentielles telles que ceux de Rosmarinus officinalis « romarin » (IA : 1,8), Cinnamomum camphora « camphrier » (IA : 0,56), Helicrysum gymnocephalum « hélichryse » (IA : 0,625) (57) La valeur de l’IA signale la présence assez importante des acides libres dans l’huile essentielle de Cinnamosma fragans. La dose 4ppm ne modifie pas considérablement le pH de l’eau d’élevage mais un changement d’eau est nécessaire avant chaque ajout d’huile essentielle pour éviter de ne pas cumuler la concentration en huile essentielle dans l’eau. L’allure de la courbe bactéricide se fait par palier. Cette croissance de bactéries viables par palier décroissant est aussi observée dans le cas de l’antibiotique en général. Les bactéries survivent seulement par le fait du hasard, elles échappent provisoirement à

la destruction mais leur nombre peut diminuer si le contact avec l’agent antimicrobien se prolonge. (67)

Discussion

58

Une autre explication possible est la grande variabilité des compositions chimiques de l’HE, car la CMB doit être facile à déterminer pour de composés chimiques bien définis, mais devient très aléatoire lorsqu’il s’agit de composés extrêmement complexes tels que les HE (11) d’où on n’obtiendra pas de courbes à décroissance linéaire. Les résultats de l’analyse des compositions chimiques faites par le laboratoire de l’IAA/ESSA.Université d’Antananarivo (Annexe-VII), l’HE de Cinnamosma fragans a comme constituants principaux des sesquiterpenoïdes (β-cariophyllène) et des oxydes monoterpeniques (1,8 Cinéole et β-phellandrene). Ces constituants confèrent à cette HE sa propriété bactériostatique. (44) Les constituants moindres en pourcentage sont constitués par des hydrocarbures monoterpeniques (α-pinène, β- pinène, sabinène, para-cymène, limonène, terpinolène, myrcène) qui ont aussi une activité bactériostatique. (44) Les alcools monoterpéniques (α-terpinéol) qui sont aussi des constituants faibles en pourcentage ont une action bactéricide et fongicide. (50) L’HE utilisée est bactériostatique à faible concentration (1,66µl/ml) car les constituants principaux qui possèdent des activités bactériostatiques prédominent. L’activité bactéricide de l’HE ne commence alors qu’à partir de 3,33µl/ml de concentration. En général, l’essence naturelle totale se montre plus active que son constituant principal. Par ailleurs, les constituants moindres en pourcentage sont plus actifs que le constituant principal, il doit y avoir un effet de synergie. (71) La concentration en HE utilisable in vivo, équivalente de celle trouvée in vitro est de 4ppm, elle permet de tuer ou au moins d’inhiber la croissance microbienne pendant 3 à 4 jours. Cette valeur ne tient pas compte de la toxicité de l’HE vis à vis de l’animal étudié. Il est donc important de comparer cette valeur in vitro avec les valeurs trouvées in vivo à partir de l’expérience faite directement dans le bac d’élevage larvaire de crevettes. L’étude in vivo dont le principe consiste à déterminer la concentration en HE avec laquelle on obtient le meilleur taux de survie, donne les valeurs suivantes : 1ppm pour le stade zoé avec un taux de survie de 80%, 2ppm où le taux de survie est de 80,66% pour le stade mysis et 6ppm où le taux de survie est de 79% pour les post-larves (63). Comparées à ces valeurs obtenues in vivo, les concentrations que nous avons trouvées in vitro ne s’éloignent pas de ces valeurs, et permettent en plus de les corriger à savoir : la concentration en HE 6ml/tonne peut être réduite jusqu’à 4ml d’HE/tonne (4ppm), concentration suffisante pour tuer ou inhiber la croissance des micro-organismes. Dans le cas de l’HE, la concentration trouvée in vitro est transposable directement in vivo du fait que les HE agissent à des doses assez faibles. (16) Les résultats du test de toxicité démontrent que pour une concentration donnée d’HE, le nombre de PL n’influence pas la mortalité. La chance de survie d’une PL face à de tels tests dépend beaucoup de son état de santé initial. Vu leur abondance et leur taille très petite, l’injection de l’HE dans chacun des animaux est impossible. L’expression de DL en ml/kg d’animal (16) pose alors un problème. Nous avons par conséquent exprimé en ml/ l d’eau d’élevage les différents types de DL, dans ce cas la mortalité des PL ne dépend pas de leur effectif (nombre ou poids), mais de la quantité en HE dans leur eau d’élevage. Il y a ainsi un seuil de concentration en HE que les PL ne tolèrent plus dans leur milieu de culture. En conclusion, les différents facteurs qui peuvent entraîner les morts des PL sont les suivants :

- Mauvais état de santé initial de PL.

Discussion

59

- Limite de la concentration tolérable en HE dépassée dans l’eau d’élevage. - Alimentation insuffisante ou en excès. - Mauvaises conditions physiques (aération, turbidité, température) et chimiques

(pH, salinité, taux d’ammoniaque, . . .)

59

VI CONCLUSION

Conclusion générale

60

VI-Conclusion générale

Ce travail de mémoire nous a permis de réaliser :

• L’identification de quelques espèces de Vibrio dominants dans l’élevage larvaire de crevettes au centre CDCC de Mahajanga. • La détermination de la population de Vibrio responsable de l’importante mortalité de larves et post-larves de crevettes. • La détermination des concentrations bactériostatiques et bactéricides de l’huile essentielle de Cinnamosma fragans dans l’élevage larvaire de crevettes. Les résultats autorisent à dégager l’indication suivante pour l’élevage larvaire de crevettes : l’augmentation du nombre de Vibrio à colonies vertes indique une probable apparition de maladie microbienne ce qui pourrait engendrer une mort massive de larves et post-larves. Un changement d’eau ou un traitement à l’aide d’un agent antimicrobien est alors nécessaire. L’huile essentielle de Cinnamosma fragans est un nouveau produit local prometteur pour ce traitement, ses avantages par rapport aux antibiotiques ou autres antiseptiques reposent sur les caractères suivants : - l’extraction est rapide et peut donner de meilleurs rendements (le rendement est de 1,25% pendant 2,5h d’extraction). - Les plantes utilisées sont des plantes locales. Elles poussent bien dans la région Nord-Ouest, région où la crevetticulture a connu des essors considérables. L’exploitation de cette HE permet par conséquent de diminuer l’importation de produits antibactériens chimiques.

- l’HE agit à faible dose (4ppm) par rapport aux antibiotiques (5 à 6ppm) pour le traitement de post-larves. - c’est un désinfectant atmosphérique grâce à sa volatilité, son odeur purifie l’atmosphère en détruisant les bactéries apportées par les poussières, l’air... - le mode d’action est persistant, bactériostatique puis bactéricide, ne laisse la reprise de croissance des Vibrio contrairement à celle de l’antibiotique testé (elvagine). - Aucune résistance microbienne n’est encore détectée jusqu’à aujourd ’hui dans le monde entier quant à l’utilisation pharmaceutique de l’huile essentielle (11). Notons que la pratique des antibiotiques tels que: la pénicilline, l’erythromycine, la kanamycine, l’oxytetracycline, la polymyxine, la streptomycine dans la crevetticulture a engendré des résistances microbiennes dans plusieurs sites du monde (64)(51). - L’HE de Cinnamosma fragans est miscible à l’eau de mer, mais cette miscibilité est meilleure en la mélangeant avec du tween à raison de 10%. - la dose 4ppm n’est pas toxique pour les larves et post-larves, mais un changement d’eau est nécessaire avant chaque ajout d’HE dans l’eau d’élevage pour ne pas cumuler la concentration en HE dans l’eau. - comme l’HE est un produit totalement naturel, son utilisation évite la pollution par les agents chimiques comme les antibiotiques synthétiques, le formol, etc..., emmenés par les eaux usées dans l’environnement de notre littoral.

Ainsi, les résultats de ce travail constitueront une base de donnée pour une éventuelle application de cette huile essentielle extraite de la plante malgache, endémique Cinnamosma fragans (Motrebetiniaina ou Mandravasarotra-II), dans l’élevage larvaire de crevettes Panaeus monodon à Madagascar. Les perspectives de la présente étude qui est axée sur la possibilité de l’emploi de l’huile essentielle de Cinnamosma fragans dans l’élevage larvaire de crevettes,

Conclusion générale

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seront la recherche de l’étendue ou la limite du spectre d’activité de cette huile essentielle sur la maladie de crevettes laquelle ne vient pas seulement de ces Vibrio isolés, mais aussi de plusieurs autres origines telles que :

- Les Vibrio reconnus universellement comme pathogènes pour les crevettes : V. alginolyticus, V. cholerae biotype albensis, V. harveyi, V. cholerae non-01, V. fischeri, V. fluvialis, V. parahaemolyticus, V. vulnificus. - Les autres bactéries : Aeromonas, Pseudomonas. - Certaines algues bleues. - Les champignons Phycomycètes comme les genres : Sirolpidium, Lagenidium Fusarium surtout Fusarium solani. - Les Protozoaires subdivisés en trois groupes : • Haplosporidies et Grégaires • Ciliés Flagellés et Amoebes parmi lesquels, on a les genres : Parauronema sp, Leptomonas sp, Paranophrys sp. • Protozoaires épicommensales : Zoothamnium sp, Epistylis sp, Vorticelle sp, Lagenophys sp. - Les Virus : BP (Baculovirus Panaei), MBV (Panaeus, monodon Baculovirus), PBV (Plebejus Baculovirus), BMNV (Baculoviral Midgut gland Necrosis), TCBV (Type C Baculovirus of Penaeus monodon), HB (Hemocyte infecting Baculovirus), IHHNV (Infection Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus), HPV (Hepatopancreatic Parvo-like Virus), LOPV ( Lymphoidal Organ Parvo-like Virus), LOVV (Lymphoidal Organ Vacuolezation Virus), REO3 (Reo-like Virus 3), REO4 (Reo-like Virus 4). (63) On n’a pas encore recensé de maladie virale dans la crevetticulture Malgache, par contre les maladies d’origine bactérienne, fongique, et celles dues aux protozoaires parasites sont fréquentes et méritent des études plus approfondies.

BIBLIOGRAPHIE

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ANNEXES

Annexe I

A-MILIEU DE CULTURE LIQUIDE Eau peptonée salée alcaline

Peptone.............................................10g Chlorure de sodium...........................25g Na2CO3.............................................0,8g Eau distillée....................................1000ml Stériliser à l’autoclave à 121°C, pendant 15nm, pH 8,6 à 25°C

Milieu de base utilisé pour la cinétique de croissance

Peptone..............................................10g Extrait de levure..................................3g Chlorure de sodium.............................25g Na2CO3..............................................0,8g Saccharose.........................................10g Eau distillée.....................................1000ml Stériliser à 121°C pendant 15mn, pH après stérilisation 7,4 à 25°C

B-MILIEU D’ISOLEMENT

TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Saccharose)

Peptone de caséine............................5g Peptone de viande.............................5g Extrait de levure................................5g Citrate de sodium.............................10g Thiosulfate de sodium..................... 10g Bile de boeuf désséchée.....................5g Cholate de sodium.............................3g Saccharose.......................................20g Chlorure de sodium..........................10g Citrate de fer (III)..............................1g Bleu de thymol..............................0,04g Bleu de Bromothymol...................0,04g Agar-agar........................................14g Eau distillée...............................1000ml

C-MILIEU D’IDENTIFICATION Milieu pour la recherche du type respiratoire : Gélose Viande Foie (gélose VF )

Base viande foie............................30g Glucose..........................................2g Agar...............................................6g Eau distillée.............................1000ml

Milieu Brain-Heart (cœur-cervelle)

Substrat nutritif ...................................................27,5g (extrait de cerveau, de cœur et de peptone) D(+)-Glucose...........................................................2g Chlorure de sodium................................................10g Hydrogénophosphate de di-sodium........................2,5g Agar-agar...............................................................15g Eau distillée......................................................1000ml pH : 7,4 + 2,2 à 25°C

Milieu utilisé pour l’identification biochimique et physiologique

Gélose nutritive salée

Peptone.......................................50g Extrait de viande..........................30g Chlorure de sodium............00g ou 30g ou 80g Agar-agar....................................15g Eau distillée.............................1000ml pH à 25°C après stérilisation : 8,5

Milieu Urée-Indole L-tryptophane.....................0,30g KH2PO4..............................0,10g K2HPO4..............................0,10g Nacl......................................0,5g Urée........................................2g Alcool à 95°C.........................1ml Rouge de phénol à 1%.......0,25ml Eau distillée........................100ml

Milieu Hajna-Kliger

Extrait de viande.......................3g Extrait de levure........................3g Peptone...................................20g Chlorure de sodium...................5g Citrate ferrique.......................0,3g Thiosulfate de sodium.............0,3g Lactose....................................10g Glucose.....................................1g Rouge de phénol...................0,05g Agar........................................12g pH : 7,4

D-MILIEU UTILISE POUR LE TEST D’AROMATOGRAMME Milieu Mueller-Hinton de tonicité normale dont la composition en gramme par litre d’eau distillée stérile est la suivante :

Infusion de viande de bœuf déshydratée.....300g Hydrolysat acide de caséine.......................17,5g Amidon de maïs...........................................1,5g Agar.............................................................10g Eau distillée..............................................1000g

Annexe II

Réactifs utilisés pour la coloration Gram Solution de violet de gentiane

Cristal de violet de gentiane..................10g Oxalate d’ammonium..............................4g Ethanol..............................................100ml Eau distillée stérile.............................400ml

Solution iodo-iodurée Iode........................................................1g Iodure de potassium................................2g Ethanol absolu.....................................25ml Eau distillée stérile.............................100ml

Solution alcoolique Ethanol................................................95ml Eau distillée stérile.................................5ml

Solution de saffranine 2,5% de saffranine dans l’éthanol.......10ml Eau distillée stérile..............................100ml

Réactif de Kovacs : utiliser pour la recherche d’Indole

(A) Diméthylamino-4 benzaldéhyde..........5g (B) Acide chlorhydrique.......................25ml (C) Méthyl-2 butanol-2.........................75ml Dissoudre A dans C, puis ajouter lentement B. Conserver le réactif dans un flacon de verre foncé, à l’obscurité. (52)

Réactif de Griess : réactif pour la recherche de Nitrite (52) Solution NIT1

Acide sulfanique.................0,8g Acide acétique 5M..........100ml

Solution NIT2 Alpha-naphtol.....................0,5g Acide acétique 5M...........100ml

Annexe III

Préparation de boites d’agar TCBS.

- Peser 22g du milieu en poudre et le mettre dans une fiole de 250 ml. - Mesurer 250ml d’eau distillée à l’aide d’une éprouvette et la verser dans la fiole. - Mélanger bien la préparation et la mettre dans l’eau bouillante jusqu’à dissolution complète de la poudre d’agar. - Après ébullition, refroidir le milieu sous l’eau de robinet jusqu’à ce qu’il atteigne 50°C en mélangeant délicatement pour éviter la formation de bulles. - Nettoyer la hotte aspiratrice à l’aide de l’alcool 70%. - Verser le milieu dans 10 boites de pétri stériles de façon à ce que l’épaisseur du milieu dans une boite soit 3mm environ. - Laisser le milieu se solidifier dans la hotte, boites de pétri semi-ouvertes pendant 30 à 60mn pour éviter la condensation des vapeurs d’eau à l’intérieur des boites. - Vérifier la présence ou non de contamination avant l’emploi.

Annexe IV

Teinture de Gram

Coloration - Mettre une toute petite goutte d’eau distillée stérile sur la lame. - Stériliser l’anse à la flamme du bec bunsen, prendre une petite portion d’une colonie bactérienne et le suspendre dans la goutte d’eau de la lame. - Laisser sécher le tout autour de la flamme. - Mettre la solution violet de gentiane sur les bactéries séchées, laisser agir pendant 1mn puis laver la préparation sous l’eau de robinet. - Eponger délicatement la lame avec du papier filtre Mordançage - Ajouter la solution de lugol sur les bactéries, laisser agir pendant 1mn puis rincer sous l’eau de robinet. Décoloration - Pour déteindre mettre la solution alcoolisée sur la préparation, laisser aller pendant 1mn, puis rincer sous l’eau de robinet. Récoloration - Ajouter la solution de saffranine sur les bactéries qui se teindront après 1mn, laver à l’eau de robinet, assécher délicatement la lame avec du papier filtre. - Observer le spécimen au microscope avec le grossissement fois 100 à immersion d’huile.

Annexe V

Procédure expérimentale de l’API 20 NE 1) Choix de bactéries à tester - L’API 20 NE n’est employé que pour l’identification des bactéries non entériques, alors, on procède tout d’abord au test d’oxydase qui donne comme résultat : positif pour les bactéries non entériques, mais négatif pour celles entériques. - Le résultat du test de l’oxydase est enregistré dans une case ‘’OX’’ du tableau de score. 2) Préparation de la plaquette de test - Verser environ 5ml d’eau dans le compartiment d’incubation dans le but de garder une condition d’humidité. - Mettre la plaquette de test API 20 NE sur le compartiment d’incubation. - Ecrire le note permettant de distinguer le microbe à étudier sur le côté du compartiment. 3) Réglage de la quantité des bactéries à examiner dans ce système - Prélever une ou quatre colonies du milieu d’isolement, et suspendre dans 2ml de solution salée à une concentration n°0,5 de Mac Foulant (une solution légèrement blanchâtre). 4) Inoculation dans la plaquette de test

- A l’aide d’une pipette pasteur stérile, appliquer la solution bactériologique dans les compartiments des microtubes, du NO3 au PNPG de la plaquette test. Durant l’application la pipette est liée au côté de la coupe, mais il ne faut pas inoculer la coupe. Eviter la formation des bulles au fond des microtubes.

- Décapsuler le milieu AUX, à l’aide d’une pipette pasteur, ajouter 4 ou 5 gouttes de la solution bactériologique à l’intérieur. Le bien mélanger.

- Appliquer le milieu AUX dans les microtubes, de GLU à PAC, remplir aussi les coupes sur une surface plane ou légèrement convexe et non concave.

- Ajouter de la paraffine liquide stérile dans les microtubes GLU, ADH, URE (sur la coupe).

- Couvrir la plaquette de test et mettre dans l’incubateur à 30°C pendant 24h. 5) Evaluation de chaque réaction 5-1) Tests biochimiques - Après incubation, ajouter une goutte de chaque réactif NIT1 et NIT2 dans la coupe NO3. L’apparition d’une coloration rouge après 5mn signifie que la réaction est positive - Si la réaction est négative, ajouter de la poudre de Zinc au microtube pour détecter les résidus de nitrates, le résultat est positif si aucune réaction ne survient après 5mn (le milieu reste clair), par contre si la couleur vire au rose ou au rouge, la réaction est négative parce que les résidus de nitrates sont réduits aux nitrites par la poudre de Zinc. - Ajouter une goutte de réactif de James dans la coupe de TRP. Une coloration immédiate en rose traduit une réaction positive. - Les réactions dans GLU, ADH, URE, ESC, GEL, PNPG ne nécessitent pas de réactif.

5-2) Tests anabolismes - Les coupes de couleur trouble traduisent une réaction positive, si une faible croissance de bactéries est constatée, elle doit être enregistrée « + ». 6) Identification - noter les résultats sur les feuilles de scores, selon le tableau d’évaluation - Identifier le nom de genre et d’espèce de la bactérie sur la liste dans l’API index.

Annexe VI

a) Compositions chimiques de l’Huile Essentielle de Cinnamosma fragans Résultat d’analyse de l’IAA/ESSA de l’Université d’Antananarivo, exprimés en pourcentage relative.

Constituants Cinnamosma fragans (feuille) α-pinène 2.25 β-pinène 3.23 Sabinène 6.71 Myrcène 1.75 α- terpenéol 0.64 Limonène 2.33 1,8 Cinéol et β- phéllandrene 39.08 cis-β Ocimène 0.65 γ- terpinène 1.15 trans-β Ocimène 0.43 para- Cymène 0.34 Terpinolène 0.31 β-Caryophyllène 33.90 Source : Société Naturallia Madagascar b) Formules chimiques des quelques compositions

Annexe VII

Documents

MEMOIRE DE RECHERCHE POUR OBTENIR LE DIPLOME …biblio.univ-antananarivo.mg/pdfs/randrianady_sn_m2_02.pdfuniversite d’antananarivo @@@ faculte des sciences *** departement de biochimie