MANUAL DE PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS INTEGRA …heloise.dhs/TH058/Manual POPs_agua_LABEAM.pdf · MANUAL DE PROCEDIMENTOS ... DQO – demanda química de oxigênio COD ... de 70%

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

DEPARTAMENTO DE HIDRÁULICA E SANEAMENTO – DHS

LABORATÓRIO DE ENGENHARIA AMBIENTAL BORSARI NETO

Elaboração e Organização: Carla Cristina Bem e Luiz Fernando Dombroski

Curitiba

2010

MANUAL DE PROCEDIMENTOS

LABORATORIAIS INTEGRA-CLIMASUL

APLICADO AO MONITORAMENTO DE

PARÂMETROS ASSOCIADOS À QUALIDADE

DA ÁGUA EM CORPOS AQUÁTICOS

ÍNDICE

CAPÍTULO 1 - Monitoramento de qualidade da água em corpos aquáticos...........4

CAPÍTULO 2 - Parâmetros de interesse na gestão e monitoramento de qualidade

da água em corpos aquáticos..................................................................................6

CAPÍTULO 3 - Procedimentos para amostragem em campo, conservação e

armazenamento de amostras de água associadas ao monitoramento de qualidade

da água em corpos aquáticos................................................................................12

CAPÍTULO 4 – Considerações gerais sobre coleta, preservação de amostras e

medidas de segurança em laboratório...................................................................15

CAPÍTULO 5 - Procedimentos para limpeza e descontaminação de frascos,

vidrarias e materiais de uso geral utilizados nos ensaios laboratoriais.................20

CAPÍTULO 6 - Procedimentos para amostragem em campo, conservação e

armazenamento de amostras de água associadas ao monitoramento de qualidade

da água em corpos aquáticos................................................................................25

POP 01 - Oxigênio dissolvido.................................................................................30 POP 02 - DBO5.......................................................................................................38 POP 03 - DQO........................................................................................................47 POP 04 - Carbono orgânico dissolvido..................................................................48 POP 05 - Série de sólidos......................................................................................51 POP 06 - UV-Vis.....................................................................................................56 POP 07 a POP 11 - Série de nitrogênio.................................................................58 POP 12 e POP 13 - Série de fósforo......................................................................79 POP 14 - Clorofila-a...............................................................................................90 POP 15 - Metais pesados (Cd, Cr, Cu, Ni, Zn, Pb)................................................93 POP 16 - Alcalinidade total.....................................................................................99 POP 17 - Fluorescência molecular.......................................................................103 POP 18 - Coliformes totais e fecais......................................................................105

LISTA DE SÍMBOLOS

PEAD – polietileno de alta densidade

PP - polipropileno

OD – oxigênio dissolvido

DBO5 – demanda biológica de oxigênio (5 dias de incubação)

DQO – demanda química de oxigênio

COD – carbono orgânico dissolvido

CT – carbono total

CI – carbono inorgânico

UV-Vis – região ultravioleta - visível do espectro eletromagnético

IF – intensidade de fluorescência

N-NO2- – nitrogênio na forma de nitrito

N-NO3- – nitrogênio na forma de nitrato

N-NH3 – nitrogênio amoniacal total

NH4+ – íon amônio (amônia ionizada)

NH3 – amônia não ionizada

NT – nitrogênio total

NOrgT – nitrogênio orgânico total

NINORG – nitrogênio inorgânico total

PT – fósforo total

PTD – fósforo total dissolvido

PTP – fósforo total particulado

PO43- - ortofosfato / fosfato reativo solúvel

POrgD – fósforo orgânico dissolvido

ST – sólidos totais

SF – sólidos totais fixos

SV – sólidos totais voláteis

SST – sólidos suspensos totais

SSF – sólidos suspensos fixos

SSV – sólidos suspensos voláteis

SDT – sólidos dissolvidos totais

– comprimento de onda e – variação do comprimento de onda

4

_____________________________________________________________

Capítulo 1 – Monitoramento de

qualidade das águas em corpos aquáticos ______________________________________________________________

O monitoramento da qualidade ambiental surgiu da necessidade de

mensurar a interferência ou nível de degradação causada por agentes de

natureza antropogênica no ambiente ao longo do tempo (variações temporais) ou

do espaço (variações espaciais), por meio da análise, experimentos e

interpretação de parâmetros físicos, químicos e biológicos.

A freqüência do monitoramento deve ser de acordo com a resposta

requerida e da infraestrutura disponível para realizá-lo. O uso do monitoramento

da qualidade de corpos aquáticos pode ser realizado e aplicado como:

Instrumento de comando e controle e;

Instrumento de gestão do recurso.

O monitoramento de comando e controle consiste em analisar pontos

estratégicos onde possam estar ocorrendo violações nos padrões de qualidade

ambiental estabelecidos por legislação, sendo utilizados, principalmente, pelos

órgãos que possuem poder fiscalizador.

Quando se pretende obter dados de qualidade para dar suporte ao sistema

de gestão, o monitoramento deve ser realizado ao longo de tempo, permitindo

observar as variações temporais da qualidade e, ao longo do espaço,

possibilitando observar plumas de poluição, desde sua origem, dispersão e/ou

degradação completa. Este foco permite a indagação de inúmeras questões

voltadas aos resultados obtidos frente ao monitoramento de parâmetros da

qualidade da água.

Além da importância em se estabelecer uma frequência no monitoramento,

que seja adequada à informação a ser obtida, é fundamental que os dados

produzidos sejam de uma confiabilidade inquestionável (validação dos

procedimentos analíticos) e possam garantir uma verdadeira imagem fotográfica

5

momentânea do que estava ocorrendo no ambiente durante uma determinada

amostragem.

Em relação à qualidade da água, a questão da consistência dos dados de

qualidade e quantidade de água é de grande relevância na gestão dos recursos

hídricos, por estes serem a base principal para a busca pelas ferramentas

necessárias no suporte de tomada de decisão.

Esta confiabilidade dos dados coletados em campo é obtida por meio de

análises físico-químicas realizadas com procedimentos analíticos adequados e

executados com rigor, além da utilização de sensores calibrados, de modo a

produzir resultados que representem com precisão e exatidão as concentrações

existentes na amostra.

A validação dos dados evita que erros sejam propagados e venham a

produzir outros, como no caso da modelagem matemática de cenários futuros,

calibrados com valores de concentrações que possuem distorções devido a

determinação analítica inadequada ou execução do procedimento.

Por fim, é importante notar que esta pequena introdução é um comunicado

de grande importância deste manual, ao analista que venha a desempenhar o

papel fundamental de comunicar aos demais envolvidos do projeto de pesquisa

que os dados obtidos em campo e em laboratório, são de alta qualidade e

veracidade frente ao ambiente aquático estudado.

6

______________________________________________________________

Capítulo 2 – Parâmetros de interesse na

gestão e monitoramento de qualidade da água em corpos aquáticos ______________________________________________________________

As variáveis monitoradas para avaliar a qualidade das águas podem ser

físicas, químicas e biológicas.

As variáveis físicas são:

(a) TEMPERATURA: descrita diretamente como a medida da intensidade de

calor. Em ambientes aquáticos é um parâmetro importante, pois influi em algumas

propriedades da água (densidade, viscosidade, oxigênio dissolvido), com reflexos

sobre a manutenção da vida aquática. A temperatura pode variar em função de

fontes naturais (energia solar, sazonalidade do meio) e fontes antropogênicas

(águas residuárias industriais; águas de resfriamento de máquinas e outros).

(b) TURBIDEZ: parâmetro de qualidade da água relacionado diretamente com

a presença de material em suspensão (sólidos suspensos) na água, como areia,

silte, argila, substâncias orgânicas finamente divididas, organismos microscópicos

e outras partículas.

(c) CONDUTIVIDADE ELÉTRICA: capacidade que a água possui de

conduzir corrente elétrica. Este parâmetro está relacionado com a presença de

íons dissolvidos na água, que são partículas carregadas eletricamente Quanto

maior a quantidade de íons dissolvidos, maior será a condutividade elétrica na

água. Para estudos em corpos aquáticos, os resultados são, normalmente,

mensurados em campo com o uso de sensores (condutivímetro), devidamente

calibrado. O valor se dá através da medida lida pelo sensor e a unidade

apresentada como S.cm-1 ou mS.cm-1.

As variáveis químicas são:

7

POTENCIAL HIDROGENIÔNICO (pH): o pH de uma solução é o logaritmo

decimal negativo da concentração de íons hidrônio (H3O+, em mol.L-1) e avalia o

caráter ácido ou básico da solução. O pH é normalmente determinado por

eletrometria, mas pode ser estimado por titulação ou por papel indicador. A

medição do pH por eletrometria baseia-se na determinação da atividade dos íons

hidrônio pela medição potenciométrica utilizando um eletrodo de vidro associado

a um eletrodo de referência.

ALCALINIDADE: causada por sais alcalinos, principalmente de sódio e cálcio;

mede a capacidade da água de neutralizar os ácidos; em teores elevados, pode

proporcionar sabor desagradável à água, tem influência nos processos de

tratamento da água.

OXIGÊNIO DISSOLVIDO: elemento principal no metabolismo dos

microorganismos aeróbios que habitam as águas naturais ou os reatores para

tratamento biológico de esgotos. A determinação da concentração de oxigênio

dissolvido em águas é também imprescindível para o desenvolvimento da análise

da demanda bioquímica de oxigênio (DBO) e é um dos parâmetros que indicam o

nível de degradação de ambientes aquáticos. Em corpos aquáticos, a

quantificação de OD pode ser feita com o uso de sensores ou por meio de

procedimentos analíticos em laboratório. A unidade de concentração é mg O2.L-1.

DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO: a Demanda Bioquímica de

Oxigênio (DBO) é um teste no qual procedimentos padronizados de laboratório

são usados para determinar a quantidade de oxigênio relativa em águas naturais,

efluentes domésticos e industriais que são consumidos no processo de

estabilização da matéria orgânica presente na amostra durante um período de

tempo, considerando somente a atividade microbiológica.

O teste de DBO é empregado para determinar os níveis de poluição, na

avaliação de cargas poluidoras ou eficiência de um determinado sistema de

tratamento. O teste de DBO mais difundido é o DBO520, no qual, as amostras são

incubadas por 5 dias a 20ºC, mas também há a DBOU (Demanda Bioquímica

Última de Oxigênio). Normalmente é realizado o teste de DBO520 devido ao menor

8

período de incubação e a degradação que ocorre neste tempo equivale a cerca

de 70% da concentração de matéria orgânica presente.

Os valores obtidos no teste de DBO com os obtidos nos testes de DQO

podem ser relacionados. Esta relação DQO/DBO indica a biodegrabilidade da

amostra. Quanto mais elevada for esta relação, menor é a fração biodegradável, e

quando menor a relação, maior a atividade de biodegradação da amostra. O valor

da DBO é expresso em mg O2.L-1.

DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO: a Demanda Química de Oxigênio

(DQO) é definida como a quantidade de oxigênio necessária para oxidar

quimicamente e completamente a matéria orgânica e inorgânica oxidável de uma

determinada amostra, sob condições de análise controladas. O parâmetro DQO é

largamente empregado na avaliação de qualidade das águas naturais e de águas

residuárias industriais e domésticas. Seu valor pode ser correlacionado com

outros parâmetros como, por exemplo, com a Demanda Bioquímica de Oxigênio

(DBO). O valor da concentração é expresso em mg O2.L-1.

SÉRIE DE SÓLIDOS: resíduos ou sólidos são todas as matérias suspensas ou

dissolvidas na água, provenientes de despejos domésticos ou industriais. Pode-se

interpretar o termo sólido a partir de uma definição operacional, como sendo a

matéria que permanece como resíduo após evaporação, secagem ou calcinação,

a uma determinada temperatura padrão e por um tempo fixo de um volume de

amostra conhecido. Os sólidos de uma água podem ser classificados de acordo

com o fluxograma disposto abaixo:

Sólidos Suspensos Totais (SST) Sólidos Dissolvidos Totais (SDT)

Sólidos Voláteis Totais (SVT) Sólidos Fixos Totais (SFT)

Sólidos Totais (ST)

Sólido

Suspensos

Voláteis

(SSV)

Sólido

Suspensos

Fixos

(SSF)

Sólido

Dissolvidos

Voláteis

(SDV)

Sólido

Dissolvidos

Fixos

(SDF)

9

De acordo com o tratamento térmico efetuado na amostra, pode-se, ainda,

fragmentar os sólidos em termos de “fixos” e “voláteis”, sendo que o primeiro é

aplicado ao resíduo total, em suspensão ou dissolvido, após aquecimento e

secagem por um período específico e a uma temperatura específica. A massa

perdida por ignição é chamada de “sólidos voláteis”; a determinação dessas

porções não permite distinguir com precisão a matéria orgânica e inorgânica, uma

vez que a perda por ignição não envolve apenas a matéria orgânica, podendo

ocorrer perdas (pequenas, considerando a temperatura utilizada) na

decomposição ou volatilização de sais minerais, por exemplo.

UV-Vis: a espectrofotometria na região UV-Vis do espectro eletromagnético é

uma das técnicas analíticas mais empregadas, em função de robustez, custo

relativamente baixo e grande número de aplicações desenvolvidas como

exemplo, na caracterização da matéria orgânica. O método consiste na leitura da

amostra a partir de varredura entre faixas de comprimento de onda na região do

UV-Vis, normalmente, entre os comprimentos de onda de 200 a 800nm, para

posterior tratamento dos dados. A resposta do sinal de absorvância será dada em

função dos constituintes orgânicos e/ou inorgânicos que compõe cada amostra,

cada qual com picos de intensidade de sinais em faixas distintas do espectro.

SÉRIE DE NITROGÊNIO: o nitrogênio (N) é um macronutriente essencial ao

metabolismo dos seres vivos pois, após o carbono é o elemento exigido em maior

quantidade pelas células vivas e ao contrário do fósforo (P), é abundante no

ambiente aquático (na grande maioria dos casos, visto que pode atuar também

como nutriente limitante). Sua importância se deve, principalmente, a sua

participação na formação de proteínas e, em baixas concentrações, atuando

como nutriente utilizado na produtividade primária, etapa metabólica dos

ambientes aquáticos. Em ambientes aquáticos, o nitrogênio encontra-se presente

em diferentes espécies: N2 (nitrogênio molecular), NO2- (nitrito), NO3

- (nitrato),

N2O (óxido nitroso), nitrogênio orgânico dissolvido, nitrogênio orgânico

particulado, NH4+ (íon amônio), NH3 (amônia), sendo a soma desses dois últimos

o nitrogênio amoniacal total. Dentre essas espécies, o nitrato e o íon amônio são

de grande importância para os ecossistemas aquáticos, por representarem a

principal fonte de nitrogênio para os produtores primários (Ex.: fitoplâncton).

10

O estado de oxidação dos compostos de nitrogênio em corpos aquáticos

pode indicar a idade e o grau de poluição. Isto significa dizer, por exemplo, que as

formas reduzidas apontam para um foco de poluição próximo, enquanto a

prevalência de NO2- (baixa concentração) e NO3

-, ao contrário, indica que a

influência de atividades antropogênicas, como os lançamentos de esgotos, se

encontram distante, considerando que os estados reduzidos ou oxidados são

função, principalmente, da concentração de oxigênio dissolvido na coluna d’água.

SÉRIE DE FÓSFORO: a grande importância do fósforo deve-se à participação

deste elemento em processos fundamentais do metabolismo dos seres vivos

como macronutriente. Entretanto, quando comparado a outros nutrientes é, em

geral, considerado limitante. Tal fato se deve a tendência de formar compostos

insolúveis associados a argilas, cátions, óxihidróxidos de ferro, material

particulado, os quais acabam incorporando e concentrando uma significativa

quantidade de fósforo nos sedimentos. Em águas naturais, é geralmente

encontrado na forma iônica ou complexado, como o fosfato, por ser a única forma

estável em solução aquosa. Sob esta forma, o fósforo pode ser encontrado como:

PO43-, HPO4

2-, H2PO4-, conhecidas como ortofosfato ou, também, fósforo reativo

solúvel. Estas por sua vez, representam a fração de maior biodisponibilidade e

rápida assimilação pelas algas e plantas aquáticas. As formas dissolvidas ou

particuladas estarão sempre combinadas ou complexadas a outros elementos, a

exemplo do ferro. Ainda, a presença de fósforo nos sedimentos envolve a

contribuição dos minerais do solo da bacia de drenagem ou deposição através da

coluna d’água por meio de processos físicos, químicos ou biológicos.

CLOROFILA-a: monitorada no laboratório como uma variável biológica, a

clorofila-a é um parâmetro de análise realizado normalmente em ambientes

lênticos, mas com possibilidade de casos de florações de algas em ambientes

lóticos. A clorofila-a é o pigmento fotossintetizante primário dos organismos que

produzem oxigênio estando presente em algas, organismos fotossintetizantes e

também em algumas bactérias, sendo o único pigmento que tem a capacidade de

converter energia luminosa em moléculas orgânicas.

O monitoramento da concentração de clorofila-a em sistemas aquáticos

permite avaliar quantitativamente a biomassa fitoplanctônica presente no

11

ambiente, resultado este que pode ser aplicado como indicador de condições

como, por exemplo, o grau de trofia.

METAIS PESADOS: a presença de metais pesados em ambientes aquáticos

se relaciona tanto com fontes naturais, a partir de processos físicos e químicos,

envolvendo, por exemplo, desgate (intemperismo) e lixiviação do material

contindo nos solos e rochas que compôe a bacia de drenagem de rios, lagos,

reservatórios. Neste caso, as concentrações avaliadas para metais são

relacionadas a níveis de “background”, encontrados a partir da ocorrência natural,

considerando a sua variabilidade e disponibilidade geológica entre diferentes

regiões. Por outro lado, atividades de origem antropogênica que repercutem no

impacto sobre a qualidade do ambiente (ar, água, solos e sedimentos,) resultam

em níveis elevados de metais pesados de alto caráter tóxico (ao considerar

valores guia de qualidade para cada metal) como: arsênio (As), mercúrio (Hg),

chumbo (Pb), cádmio (Cd), cromo (Cr), cobre (Cu), níquel (Ni) e zinco (Zn). Estes

metais aportam nos sistemas aquáticos a partir de uma variedade de fontes,

sendo transportados direta ou indiretamente, a exemplo do lançamento de águas

residuárias industriais (distintos ramos industriais) e por meio da deposição

atmosférica (precipitação dos metais, influência das chuvas e dos ventos no

transporte para outras regiões), além da importante contribuição da drenagem

urbana, a qual se caracteriza por níveis relativamente elevados para Cu, Pb e Zn.

No ambiente aquático, a especiação dos metais representa um importante

significado na avaliação da biodisponibilidade e toxicidade, com diferenças

significativas entre diferentes espécies. Neste caso se torna, por exemplo, uma

área específica no estudo das espécies para avaliação dos seus efeitos na biota

aquática. Um exemplo é a verificação das espécies de cromo, a partir do estado

de oxidação quando verificada as formas mais estáveis: Cr (III) e Cr (VI). O Cr (VI)

ou cromo hexavalente é descrito como a forma do elemento mais tóxica, com um

significante impacto em efeitos adversos sobre a qualidade do ambiente aquático.

Neste caso, a necessidade de valores guia de qualidade imposta para as

diferentes espécies é fundamental para obter um melhor entendimento do impacto

causado pelo metal. Outra questã fundamental é a tendência de acúmulo dos

metais em sedimentos de fundo, os quais influenciam diretamente e de forma

dinâmica na disponibilidade para a coluna da água.

12

______________________________________________________________

Capítulo 3 – Procedimentos para

amostragem em campo, conservação e armazenamento de amostras de água associadas ao monitoramento de qualidade da água em corpos aquáticos ______________________________________________________________

A coleta das amostras deve ser realizada de tal forma que seja garantida e

preservada a total integridade de suas características físico-químicas, inicialmente

presentes no ambiente possibilitando obter um “retrato do ponto de amostragem”.

Para tal, os procedimentos de coleta e armazenamento para posterior análise em

laboratório são específicos para cada parâmetro. Estes devem ser aplicados

como metodologia modelo para as linhas de pesquisa relacionadas ao trabalho de

campo, no estudo de ambientes aquáticos.

A Tabela 1 apresenta um resumo do procedimento para coleta

considerando: estocagem, período para realização do ensaio, procedimentos para

conservação (quando necessário), volume e fração da amostra utilizada na

determinação dos parâmetros associados ao monitoramento de qualidade da

água de corpos aquáticos.

Os procedimentos para preparo, limpeza e descontaminação dos frascos

para amostragem constam no Capítulo 4 - Procedimentos para limpeza e

descontaminação de frascos, vidrarias e materiais de uso geral utilizados

nos ensaios laboratoriais.

13

Tabela 1 – Procedimentos para coleta e armazenagem das amostras para análise em laboratório.

PARÂMETRO COLETA

(FRASCO)

PERÍODO MÁXIMO PARA ANÁLISE / CONSERVAÇÃO

FRAÇÃO DA

AMOSTRA

VOLUME

(ml)

OD Frasco Winkler Fixação em campo do OD Winkler e quantificação no laboratório (12h)

TOTAL 300

DBO5* PEAD, PP ou garrafa âmbar 24h

TOTAL

Calculado segundo as

diluições necessárias*.

DQO PEAD, PP ou garrafa âmbar 1 semana (4ºC), acidificar com 1ml

H2SO4 / L amostra TOTAL

10 (digestão fechada)# e 50

(digestão aberta)

COD PEAD, PP ou garrafa âmbar 24h para filtração (4ºC), acidificar com 0,1ml H2SO4 / 50ml amostra

DISSOLVIDA** 50

Alcalinidade PEAD, PP ou garrafa âmbar 24h (4ºC), s/ preservação TOTAL 100

Clorofila-a Garrafa âmbar 24h (4ºC), filtrar, no máximo, no dia

posterior a coleta de campo DISSOLVIDA 1000

N-NO2- PEAD, PP ou garrafa âmbar 24h (4ºC), s/ preservação DISSOLVIDA 30#

N-NH3 PEAD, PP ou garrafa âmbar 48h (4ºC), s/ preservação DISSOLVIDA 6#

N-NO3- PEAD, PP ou garrafa âmbar 7 dias (4ºC), s/ preservação DISSOLVIDA 50#

NT PEAD, PP ou garrafa âmbar 10 dias (4ºC), s/ preservação TOTAL 15#

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PARÂMETRO COLETA

(FRASCO)

PERÍODO MÁXIMO PARA ANÁLISE / CONSERVAÇÃO

FRAÇÃO DA

AMOSTRA

VOLUME

(ml)

NOrgT*** / NINORG**** - - - -

PO43- PEAD, PP ou garrafa âmbar 24h (4ºC), s/ preservação DISSOLVIDA 30#

PT, PTD PEAD, PP ou garrafa âmbar 7 dias (4ºC), acidificar com 0,1ml

H2SO4 / 50ml amostra TOTAL E DISSOLVIDA 15# cada fração

PTP***** - - - -

SDT, SST###

PEAD, PP ou garrafa âmbar 20 dias (4ºC), s/ preservação TOTAL E DISSOLVIDA 300#

SS PEAD, PP ou garrafa âmbar 20 dias (temperatura ambiente), s/

preservação TOTAL 1000

IF & UV-Vis PEAD, PP ou garrafa âmbar 24h para filtração (4ºC) Dissolvida 25

Metais traço (Cd, Cr, Cu, Ni, Zn e Pb)

PEAD, PP 48h para filtração (4ºC), acidificar

com 2ml HNO3 / L amostra DISSOLVIDA 100##

Metais traço (Cd, Cr, Cu, Ni, Zn e Pb)

PEAD, PP 48h para filtração (4ºC),

s/preservação PARTICULADA 300##

Coliformes totais e fecais#### Frascos de vidro (100ml) 24h, s/ preservação TOTAL 100

*Verificar o volume de amostra necessária. **Amostra filtrada por membrana de acetato de celulose Ø 0,45µm.

*** NOrgT é quantificado da seguinte forma: NORG = NT - ∑NINORG.

****NINORG é quantificado da seguinte forma: NINORG = (N-NO2 + N-NO3

- + N-NH3).

*****PTP é quantificado da seguinte forma: PTP = PT - PTD. #Volume para análise do parâmetro em triplicata.

##Volume para análise do parâmetro em duplicata.

###Considera a análise de sólidos fixos e voláteis de cada fração (suspensos e dissolvidos).

####Manter 1/5 do frasco livre de amostra.

Universidade Federal do Paraná – Departamento de Hidráulica e Saneamento

15

______________________________________________________________

Capítulo 4 – Considerações gerais sobre

coleta, preservação de amostras e medidas de segurança em laboratório ______________________________________________________________

O objetivo da amostragem é coletar pequenas porções de um determinado

material, para favorecer o transporte, porém, grandes o suficiente para atenderem

os propósitos da análise, ou seja, representar acuradamente o material

amostrado.

Os métodos de coleta de amostras devem ser realizados de acordo com o

material a ser analisado e com os propósitos da análise, seguindo-se metodologia

específica para cada parâmetro. Porém, algumas regras gerais podem ser

estabelecidas para a realização de um procedimento correto de amostragem.

1. Assegure-se de que todos os equipamentos estão limpos e em boa

qualidade de uso antes de usar;

2. Quando uma determinada substância preservativa for adicionada aos

recipientes de coleta, encher os mesmos sem pré-enxaguar com a amostra

e tomar cuidado para não extravasar no enchimento e não haver formação

de bolhas;

3. Todos os métodos de preservação podem ser inadequados tratando-se de

análises relacionadas com a fração particulada da amostra;

4. Depois de fechado o frasco de coleta, verificar a formação de bolhas por

inversão e leves batidas no frasco. Se houver bolhas de ar, o ideal é

descartar e coletar outra amostra, porém, isto não deve ser feito se ao frasco

tiver sido adicionado algum preservativo antes do enchimento com amostra;

5. Para coleta em rios, no caso de amostra simples, coletar preferencialmente

no meio da seção transversal a meia profundidade (para outros tipos de

coleta, estudar o método mais apropriado);


16

6. Evite áreas com muita turbulência, pois, pode haver muita perda de

constituintes voláteis e potencial presença de vapores tóxicos mais densos

que o ar;

7. Dependendo do tipo de análise a ser realizada, encha completamente o

recipiente de coleta (p/ a maioria das análises de compostos orgânicos) ou

deixe espaço para aeração, mistura e etc. (análises microbiológicas e

compostos inorgânicos);

8. Evite coletar água da superfície a menos que óleos e graxas sejam

desejáveis ou não interfiram na análise;

9. Exceto para a análise de compostos orgânicos voláteis, deixe um espaço

livre de aproximadamente 1% em todas as amostras para permitir expansão

térmica durante o transporte;

10. Identifique todas as amostras especificando inclusive características físicas e

químicas da água e também características climáticas que possam ser

correlacionas com as características da amostra (utilize caneta com tinta à

prova d’água);

11. Ao acidificar amostras tenha certeza de que a diluição proporcionada pela

acidificação é desprezível ou grande o suficiente para que um fator de

correção possa ser incorporado ao cálculo das concentrações (usar ácido

ultra puro para evitar contaminação);

Alguns fatores importantes que interferem nos resultados das análises são:

a presença de material em suspensão ou turbidez, o método escolhido para

remover a amostra do recipiente de coleta, e as mudanças físicas e químicas

ocorridas devido ao armazenamento ou aeração. Na análise de elementos traço,

procedimentos detalhados para o processamento das amostras são necessários,

especialmente para metais e compostos orgânicos. Deve-se definir e considerar

cuidadosamente no plano de amostragem as técnicas específicas de coleta para

tornar as amostras representativas. Para metais, frequentemente, é apropriado

coletar uma amostra filtrada e outra normal para diferenciar entre metal total,

dissolvido e metal particulado, presente na matriz. Deve-se estar atento para o

fato de que alguns metais podem ser parcialmente adsorvidos ao filtro.


17

Frequentemente, uma leve turbidez pode ser tolerada se a experiência

mostrar que esta não causará nenhuma interferência em testes gravimétricos ou

volumétricos e que sua influência em testes colorimétricos pode ser corrigida,

pois, é neste teste que se apresentam os maiores efeitos da interferência da

turbidez em amostras.

Frascos de coleta

O tipo de frasco de coleta a ser usado é de grande importância,

principalmente na determinação de elementos traço, por isso, certifique-se de que

todos os recipientes de coleta estão foram descontaminados seguindo

procedimento padrão. Em geral, utilizam-se frascos de plástico ou vidro, a escolha

depende do constituinte a ser analisado, por exemplo, sílica, sódio e boro podem

se desprender de frascos de vidro leve, mas não do plástico, e quantidades traço

de alguns pesticidas e metais podem ser adsorvidos nas paredes de frascos de

vidro. Portanto, frascos de vidro duro (pyrex ou equivalente) são preferíveis. Para

amostras contendo compostos orgânicos, não use frascos de plástico ou somente

aqueles feitos de polímeros fluorados como os de politetrafluoretileno (PTFE).

Sempre que possível, evite plásticos, devido ao seu potencial contaminante por

ésteres de ftalato. Use frascos de vidro para todas as análises de compostos

orgânicos como orgânicos voláteis, orgânicos semi-voláteis, pesticidas, PCBs e

óleos e graxas. Alguns compostos são sensíveis a luz (compostos contendo

bromo, alguns pesticidas, compostos aromáticos polinucleares, etc.), por isso,

utilize nestes casos, frascos de vidro âmbar para minimizar a fotodegradação.

Geralmente, as tampas de frascos de vidro são de plástico, o que pode, em

alguns casos, representar um problema. Não utilize tampas de plástico com forro

de papel. Use forros de PTFE ou lâmina, mas esteja ciente de que forros de metal

podem contaminar amostras para análise de metais e também podem reagir com

amostras ácidas ou alcalinas. Frascos de soro com borracha forrada com PTFE

ou septo de PTFE também podem ser utilizados.


18

Dicas de segurança

Devido à possibilidade de algum constituinte ser tóxico, deve-se ter muito

cuidado ao manusear as amostras, assim como em todo o processo das análises.

Substâncias tóxicas podem entrar em nosso corpo pela pele, pelos olhos e no

caso de vapores, a partir da respiração, podendo atingir os pulmões. A seguir,

apresenta-se alguns procedimentos de segurança:

1. Use luvas apropriadas ao tipo de método a ser desenvolvido;

2. Sempre use óculos de proteção;

3. Na presença de vapores tóxicos, faça a amostragem em locais bem

ventilados, ou utilize equipamento de respiração adequado;

4. Nunca se alimente dentro de um laboratório ou próximo às amostras e locais

de amostragem;

5. Sempre lave muito bem as mãos antes de se alimentar;

6. Não deixe as amostras próximas de locais com chamas ou muito quentes;

7. No caso de presença de compostos inflamáveis e necessidade de

refrigeração das amostras, utilize apenas refrigeradores especiais à prova de

explosões;

8. Colete as amostras de maneira segura, evitando acidentes;

9. Para coleta de substâncias radioativas, procedimentos de segurança

específicos devem ser adotados;

10. No caso de dúvida quanto ao nível de periculosidade, sempre consulte um

profissional de segurança ou higiene industrial.

Minimização dos resíduos

A minimização dos resíduos de laboratório, além de contribuir com o meio

ambiente, reduz os custos do laboratório. Por isso, algumas práticas devem ser

adotadas em todos os procedimentos de análises químicas. Algumas são:

1. Sempre que possível, compre e utilize quantidades menores de

substâncias químicas. Pode ser mais econômico comprar quantidades


19

maiores, porém, deve-se estar atento ao fato de que quantidades maiores

ficam mais sujeitas a ter o seu prazo de validade expirado antes do término

da substância, gerando maior quantidade de resíduo e maior custo para

disposição final e tratamento do mesmo;

2. Utilize primeiro os produtos que estão com seus prazos de validade mais

próximos do vencimento (mais velhos), ou se possível, adquira-os apenas

no momento da análise na quantidade ideal;

3. Produtos químicos vencidos e que não foram abertos, muitas vezes podem

retornar para o fornecedor para serem reciclados ou corretamente

dispostos;

4. De preferência para métodos de análise que utilizem menor quantidade de

reagente, e que estes não sejam perigosos;

5. Evite transformar resíduos não perigosos em perigosos através de mistura

quando descartados no mesmo local;

6. Transfira produtos que estão armazenados à muito tempo para locais onde

outras pessoas possam ter acesso e então utilizar (sempre com a

autorização do responsável pelo laboratório ou produtos).


20

______________________________________________________________

Capítulo 5 - Procedimentos para limpeza

e descontaminação de frascos, vidrarias e materiais de uso geral utilizados nos ensaios laboratoriais ______________________________________________________________

A inclusão deste capítulo no manual de procedimentos laboratoriais,

voltado às técnicas de limpeza e descontaminação do material utilizado nas

diversas metodologias analíticas, descritas na sequência, no Capítulo 6, é uma

etapa fundamental e de grande importância antes do início de uma metodologia e,

dessa forma, merece especial atenção.

Em muitas situações o procedimento de descontaminação ou a ausência

deste, pode gerar dúvidas preocupantes durante uma determinada análise. Fato

este, provocado pelo equívoco da separação do material, não verificação da

qualidade e validade dos reagentes analíticos, dentre outros.

Muitas vezes, a quantificação do parâmetro pode ser realizada em triplicata

e os valores responderem bem próximos com baixa variabilidade, entretanto para

todas as réplicas, existe a possibilidade de contaminação, originada, por exemplo,

da separação de vidrarias da mesma fonte (Ex.: vidrarias lavadas com detergente

Extran, contendo fosfato na composição, utilizadas para ensaios da série de

fósforo).

Por fim, o presente capítulo apresenta os passos a serem aplicados no

preparo de material para posterior análise dos parâmetros. Os procedimentos

para limpeza dos frascos de amostragem também são apresentados neste

capítulo.


21

1. PROCEDIMENTOS DE DESCONTAMINAÇÃO

1.1. Oxigênio Dissolvido (OD) e Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO)

Toda a vidraria utilizada na determinação de OD e DBO deve seguir os

passos abaixo:

- Limpeza com escovão para vidraria e detergente Extran. Enxágue diversas

vezes com água normal. Posteriormente, enxágue no mínimo 3 vezes com água

destilada e deionizada. Colocar vidraria para secar em estufa (40±5 ºC);

No caso dos frascos utilizados no preparo dos reagentes analíticos, seguir os

passos abaixo:

- Enxaguar diversas vezes com água normal. Emergir em banho de HCl 10% por

um período mínimo de 12h (ideal: 24h);

- Retirar do banho ácido e enxaguar no mínimo 3 vezes com água destilada e

deionizada. Colocar os frascos para secar em estufa (40±5 ºC);

1.2. Demanda Química de Oxigênio (DQO), Carbono Orgânico

(COT/COD), UV-Vis e Fluorescência (IF)

Toda a vidraria utilizada na quantificação de DQO (refluxo aberto ou refluxo

fechado) e frascos para preparo de reagentes devem seguir os passos abaixo:


vezes com água normal;

- Transferir o material para banho de HNO3 10% por um período mínino de 12h

(ideal: 24h);

- Retirar do banho ácido e enxaguar com água destilada (mínino de 3 vezes);

- Transferir o material para banho de HCl 10% por um período mínimo de 12h

(ideal: 24h);




22

1.3. Série de Sólidos

O preparo do material para sólidos não apresenta necessidades de

soluções ácidas para lavagem. É necessária apenas uma boa limpeza com

detergente Extran, para remoção do material residual, lavagem no mínimo 3

vezes com água destilada e deionizada e estufa para secar (40±5 ºC).

1.4. Série de Nitrogênio e Clorofila-a

Todo material aplicado aos ensaios laboratoriais da série de nitrogênio,

deve seguir os passos abaixo para descontaminação:



- Transferir o material para banho de HCl 10% por um período mínino de 12h

(ideal: 24h);



ATENÇÃO: nunca mantenha ou utilize material que foi imerso em banhos de HNO3 10% para

descontaminação nos ensaios da série de nitrogênio, devido à contaminação pelo ácido na

detecção das formas do elemento.

1.5. Série de Fósforo

Todo material aplicado aos ensaios laboratoriais da série de fósforo, deve

seguir os passos abaixo para descontaminação:

- Após utilizar o material ou para iniciar o ensaio da série de fósforo lavar o

material APENAS com água normal, enxaguando diversas vezes;


(ideal: 24h);

- Retirar do banho ácido e enxaguar com água destilada (mínino de 3 vezes).

Colocar os frascos para secar em estufa (40±5 ºC);


23

ATENÇÃO: no caso da série de fósforo, se possível, é preferível manter o material separado para

evitar a utilização de vidrarias, frascos, dentre outros que tenham sido lavados com detergente

Extran, visto que é muito utilizado no laboratório. A determinação de fósforo acaba sendo muito

sensível a pequenas contaminações causadas geralmente pela limpeza com detergente. Fato

este, devido às baixas concentrações, quantificadas na maioria dos casos.

1.6. Metais pesados

Todo material aplicado aos ensaios laboratoriais de metais pesados, deve

seguir os passos abaixo para descontaminação:




(ideal: 24h);

- Retirar do banho ácido e enxaguar com água destilada (mínino de 3 vezes);

- Transferir o material para banho de HCl 10% por um período mínimo de 12h

(ideal: 24h);

- Retirar do banho ácido e enxaguar no mínimo 3 vezes com água mili-Q (ultra-

pura);

- Para secar o material preparado para análise de metais pesados, não manter o

material exposto ao ar ou estufa de modo a evitar contaminação. Coloque o

material em bandejas e cubra, por exemplo, com papel filme;

ATENÇÃO: durante o manuseio do material e durante o procedimento, utilize de preferência luvas isentas de talco em pó, devido à possibilidade de contaminação, principalmente, por zinco.


24

______________________________________________________________

Capítulo 6 - Procedimentos e métodos

analíticos para ensaios laboratoriais de parâmetros de qualidade da água ______________________________________________________________

O presente capítulo tem por objetivo, descrever passo a passo os materiais

e métodos analíticos envolvidos na quantificação e validação dos resultados

relacionados aos parâmetros de qualidade da água de corpos aquáticos (rios,

córregos, reservatórios, lagos e outros). Assim, de forma sucinta, cada método

apresenta os seguintes itens: descrição breve da metodologia, materiais

(equipamentos, vidrarias, reagentes analíticos) necessários, procedimentos para

calibração e padronização de métodos, procedimentos para tratamento e análise

da amostra, limites de detecção do método, referências e outros.

De grande importância e apresentado neste capítulo, é a redução do

volume de amostra necessário para as análises de diversos parâmetros,

considerando inclusive a quantificação em triplicata para uma melhor resposta e

confiabilidade da metodologia proposta pelo manual.

Por fim, os seguintes parâmetros são apresentados neste capítulo: OD,

DBO, DQO, UV-Vis, COD, série de sólidos, série de nitrogênio, série de

fósforo, clorofila-a, metais pesados (Cd, Cr, Cu, Ni, Zn e Pb), alcalinidade

total, intensidade de fluorescência molecular (IF) e coliformes (totais e

fecais).

É importante ressaltar que os métodos foram expostos da maneira mais

usualmente aplicada no laboratório de Engenharia Ambiental Borsari Neto nos

projetos que envolvem avaliação da qualidade da água em ambientes aquáticos.

Entretanto, todos os procedimentos analíticos podem ser novamente adaptados e

avaliados quanto à possibilidade de aplicação, dependendo da necessidade do

trabalho, linhas de pesquisa e/ou projetos.


25

POP 01 – OXIGÊNIO DISSOLVIDO (OD)

1. MÉTODO WINKLER MODIFICADO PELA AZIDA SÓDICA

1.1. MÉTODO WINKLER MODIFICADO PELA AZIDA SÓDICA

Este método consiste em fixar o oxigênio dissolvido da amostra por meio

da adição das soluções de sulfato manganoso (MnSO4) e a solução álcali-iodeto-

azida, que contém hidróxido de sódio (NaOH), iodeto de sódio (NaI) e azida

sódica (NaN3).

A fixação do oxigênio dissolvido ocorre através da formação de óxido de

manganês, segundo a reação 1:

Mn (OH2) + ½O2 → MnO2 + H2O (1)

Nesta etapa ocorre uma intensa floculação da amostra e uma consequente

precipitação do material floculado. A solução de azida sódica é utilizada para a

remoção da interferência de nitritos, representada pelas reações 2 e 3:

NaN3 + H+ → HN3 + Na+ (2)

HN3 + NO2− + H+ → N2 + N2O + H2O (3)

A segunda fase é a liberação de iodo, que ocorre após a adição de ácido

sulfúrico concentrado (H2SO4), provocando a ruptura dos flocos e o

desenvolvimento de uma coloração amarelada, cuja intensidade é proporcional à

concentração de oxigênio dissolvido presente inicialmente na amostra. A reação 4

expressa o procedimento citado acima:

MnO2 + 2I- + 4H+ → Mn+2 + I2 + 2H2O (4)

Note-se que o íon iodeto é oxidado a iodo molecular em proporção

estequiométrica a quantidade de óxido de manganês que, por sua vez, é

proporcional à concentração de oxigênio dissolvido na amostra, conforme

mostrado na reação de fixação (1).

A fase final da análise é a titulação do iodo liberado com solução

padronizada de tiossulfato de sódio (iodometria), representado pela reação 5.

2Na2S2O3 + I2 → Na2S4O6 + 2NaI + 10H2O (5)


26

O indicador desta reação é uma solução de amido (0,5% - 2,5%), com

ponto de viragem da titulação do azul para incolor.

Os resultados para a concentração de OD presente na amostra são

expressos na unidade de mg O2.L-1.

1.2. EQUIPAMENTOS, VIDRARIAS E REAGENTES

Equipamentos

Não necessita.

Vidrarias

Frascos de DBO winkler de 300ml

Pipetas volumétricas

Béckeres

Erlenmeyer

Bureta de 50ml

Reagentes analíticos

Solução de Sulfato Manganoso (MnSO4): dissolver 480g de

MnSO4.4H2O, ou 400g MnSO4.2H2O ou 364g de MnSO4.H2O em,

aproximadamente, 800ml de água destilada e deionizada, filtrar em papel

filtro Watman nº 40 e diluir em balão volumétrico de 1000ml.

* Estocar em frascos tipo âmbar ou frascos de vidro, em temperatura ambiente.

* Estável por 1 ano (mínimo).

Solução de Alcali-Iodeto-Azida: dissolver em, aproximadamente, 400ml

de água destilada e deionizada e seguindo a ordem:

- 250g de hidróxido de sódio (NaOH p.a); adicione lentamente devido

à elevada quantidade de NaOH (reação ↑ exotérmica).

- 67,5g de iodeto de sódio (NaI p.a);

Diluir para 500ml em balão volumétrico. Em seguida, transferir 5g de azida

sódica (NaN3 p.a), previamente dissolvida em 20ml de água destilada,

perfazendo um volume final de 520ml.

* Estocar em frascos tipo âmbar, em temperatura ambiente.



27

Ácido Sulfúrico concentrado (p.a);

Solução de Dicromato de Potássio (K2Cr2O7) 0,004167 mol.L-1: dissolver

1,226g de dicromato de potássio p.a (K2Cr2O7), previamente seco em

estufa a temperatura de 100ºC por 2h, em 800ml de água destilada.

Transferir para um balão volumétrico de 1000ml, aferindo o volume total

com água destilada.

* Estocar em frascos tipo âmbar, em temperatura ambiente.


Solução indicadora de Amido 1%: adicionar em um bécker, 100ml de

água destilada e 1g de amido solúvel (p.a). Levar a mistura para

aquecimento e agitação simultaneamente até a temperatura atingir valores

entre 60 e 70ºC (controle através de um termômetro graduado). Na

sequência, mantenha por, aproximadamente, 15min a solução de amido

nesta faixa de temperatura, sob agitação. Por fim, transfira a solução já

dissolvida ou o sobrenadante para um frasco de reagente.

* Mantenha o frasco em ambiente refrigerado (< 4ºC) para preservação

* Estável por 6 meses (mínimo).

Solução Padrão de Tiossulfato de Sódio (Na2S2O3.5H2O) 0,025 mol.L-1:

dissolver 6,205g de tiossulfato de sódio pentahidratado, juntamente com

1,5ml de hidróxido de sódio 6 mol.L-1 (ou 0,4g de NaOH p.a), em

aproximadamente 800mL de água destilada. Transferir para um balão

volumétrico de 1000ml, aferindo o volume total com água destilada.

* Estocar em frascos tipo âmbar ou frascos de vidro, em temperatura ambiente.

* A utilização da solução é dependente de sua padronização diária (hora do uso) para cálculo

da concentração real.

Padronização: dissolver aproximadamente 2g de iodeto de potássio (KI p.a) em

100ml de água deionizada e destilada em um erlenmeyer de 250ml. Adicionar

10ml de solução H2SO4 1:9 (1ml de H2SO4 e 9ml de água deionizada).

Acrescentar 20ml da solução de dicromato de potássio 0,004167 mol.L-1. Deixar a

solução no escuro por 5min. Em seguida, aferir para 200ml com água destilada.

Titular a solução com o tiossulfato de sódio 0,025 mol.L-1 até a coloração amarelo-

palha, acrescentar então 5 gotas do indicador amido 1% e prosseguir a titulação


28

até o ponto de viragem do azul para o incolor. Calcular a concentração real

(mol.L-1) do tiossulfato segundo a equação 1:

)(2

)(1*)()(

322

722722322

OSNav

OCrKvOCrKMOSNaM

(1)

em que:

M (K2Cr2O7) = molaridade da solução de dicromato de potássio (mol.L-1).

v1 (K2Cr2O7) = volume da solução de dicromato de potássio (mL).

v2 (Na2S2O3) = volume da solução de tiossulfato gasto na titulação (mL).

1.3. PROCEDIMENTO ANALÍTICO (Amostra)

1. Transferir a amostra para o frasco Winkler, evitando agitar a amostra e a

formação de bolhas;

2. Adicionar 1ml de sulfato manganoso;

3. Adicionar 1ml de solução alcalina de iodeto azida;

4. Feche o frasco, misture por inversão no mínimo 10 vezes:

Havendo a formação de uma suspensão leitosa, não há oxigênio

dissolvido para ser determinado na amostra;

Havendo a formação de um precipitado de cor marrom, dar

continuidade a análise (ver tópico 5).

* As etapas de 1 a 4 devem ser, preferencialmente, realizadas em campo com a amostragem

direta no frasco Winkler, evitando ao máximo a presença de bolhas.

5. Em laboratório, adicionar ao frasco 1ml de H2SO4 (manuseie

cuidadosamente, com o uso de EPIs – jaleco, luvas e óculos de proteção);

6. Fechar o frasco e misturar por inversão novamente até que o precipitado

seja totalmente dissolvido;

7. Transferir do frasco para um erlenmeyer, 100ml da amostra;

8. Titular com solução padronizada de tiossulfato de sódio 0,025 mol.L-1 (valor

teórico) até o aparecimento de uma coloração amarelo-palha;

9. Acrescentar então, de 3 a 5 gotas do indicador amido 1% e prosseguir a

titulação até o ponto de viragem da cor azul para incolor;

10. Anote o volume gasto na titulação (ml), correspondente a amostra;


29

1.4. CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO DE OD

fcVgLmgOD *2*)/( (2)

em que:

Vg = volume de tiossulfato de sódio gasto na titulação (mL).

fc= fator de correção do tiossulfato de sódio (Volume prático / Volume teórico).

1.5. LIMITE DE DETECÇÃO

Concentração de oxigênio dissolvido (mg O2.L-1):

Limite máximo: 7 a 9 mg OD.L-1

Limite mínimo: 2 mg OD.L-1

2. DESTINAÇÃO DO RESÍDUO GERADO

Depois de finalizada a etapa de titulação o resíduo gerado na leitura do

OD, pode ser descartado diretamente na pia sem necessidade de um pré-

tratamento.

3. REFERÊNCIA

STANDARD METHODS, methods 4500 - O C & 5210 B (Apha, 1998)


30

POP 02 – DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO (DBO5)

1. MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO

1.1. MÉTODO WINKLER MODIFICADO PELA AZIDA SÓDICA

O teste de DBO tem por objetivo, determinar a quantidade de oxigênio

consumido por microorganismos aeróbios presentes na amostra e assim,

relacionar com a quantidade de matéria orgânica de natureza biodegradável.

O método usualmente empregado para a determinação da DBO é o da

diluição, incubação por um período de 5 dias a 20ºC, com a determinação dos

níveis iniciais e finais da concentração de oxigênio através do método da azida

sódica modificada (POP-01).

1.1.1. EQUIPAMENTOS, VIDRARIAS E REAGENTES

Equipamentos

Garrafão para água de diluição (compatível com o volume necessário no

ensaio)

Incubadora termo-regulável (20±1ºC)

Vidrarias

Frascos de DBO de 300ml


Béckeres

Erlenmeyer

Bureta de 50ml

Reagentes analíticos - Soluções nutrientes

Solução Tampão de Fosfato: dissolver em aproximadamente 600ml de

água destilada:

- 8,5g de fosfato monobásico de potássio (KH2PO4 p.a);

- 21,75g de fosfato dibásico de potássio (K2HPO4 p.a);


31

- 33,4g de fosfato dibásico de sódio heptahidratado (Na2HPO4.7H2O

p.a);

- 1,7g de cloreto de amônio (NH4Cl p.a)

Transferir para um balão volumétrico de 1000ml e completar o volume com

água destilada.

* Estocar a solução em frasco tipo âmbar, em temperatura ambiente.


Solução de Sulfato de Magnésio (MgSO4): dissolver 22,5g de sulfato de

magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O p.a) em aproximadamente 800ml

de água, transferir para um balão volumétrico de 1000ml e completar o

volume com água destilada.



Solução de Cloreto de Cálcio (CaCl2): dissolver 27,5g de cloreto de

cálcio anidro (CaCl2 p.a) em aproximadamente 800ml de água, transferir

para um balão volumétrico de 1000ml e completar o volume com água

destilada.



Solução de Cloreto Férrico (FeCl3): dissolver 0,25g de cloreto férrico

hexahidratado (FeCl3.6H2O p.a) em aproximadamente 800ml de água,

transferir para um balão volumétrico de 1000ml e completar o volume.



Água de Diluição: adicionar a um garrafão previamente limpo e estéril

água destilada de acordo com a necessidade a ser empregada no teste;

manter o conteúdo desse garrafão em aeração por, no mínimo, 45 min e

máximo de 1h30min; deixar em repouso por aproximadamente 30min; na

sequência, adicionar 1ml de cada uma das soluções nutrientes para cada

litro de água de diluição utilizada.

Reagentes analíticos - Método Winkler modificado pela azida sódica (POP-01)


32

Os reagentes utilizados na etapa de quantificação do OD (inicial e final),

através da titulação iodométrica, seguem os mesmos procedimentos de preparo e

padronização descritos no POP-01 (procedimento para OD).

1.1.2. PROCEDIMENTO ANALÍTICO (Amostra)

1.1.2.1. Método Winkler sem semente

1. Regular o pH das amostras para 6,8 a 7,2 quando estiverem a temperatura

ambiente. Utilize para o ajuste soluções levemente ácidas ou básicas como

HCl 0,01 mol.L-1 ou NaOH 0,01 mol.L-1;

2. Adicionar ao frasco de DBO identificado, a amostra ou amostra mais a

alíquota da diluição. O Standard recomenda pelo menos 5 diluições. As

diluições devem ser decididas com base na concentração de DQO,

previamente quantificada (ver POP-03);

3. Anotar o nº e volume do frasco e a porcentagem da amostra adicionada em

uma ficha de controle padrão;

4. No caso de diluição da amostra, completar o volume do frasco com água de

diluição evitando a formação de bolhas e turbulências;

5. Preparar, considerando a necessidade de diluição, amostra em réplica de

modo que possibilite a medição do ODinicial e ODfinal;

5. Medir o ODinicial por meio do método modificado pela azida sódica (ver POP-

01);

6. Levar as amostras de DBO5 para a incubação (20±1ºC);

7. Após 5 dias determinar a concentração de ODfinal da amostra por meio do

método modificado pela azida sódica (ver POP-01);

1.1.2.2. Procedimento Winkler com semente

1. Regular o pH das amostras para 6,8 a 7,2 quando estiverem a temperatura

ambiente. Utilize para o ajuste soluções levemente ácidas ou básicas como

HCl 0,01 mol.L-1 ou NaOH 0,01 mol.L-1;


33

2. Anotar o nº e o volume do frasco ou porcentagem da amostra adicionada

em uma ficha de controle;

3. Adicionar o volume da amostra ao frasco de DBO preparado evitando a

formação de bolhas e turbulências;

4. Em um frasco em separado, incubar a semente, adicionando 2ml da

semente preparada, completando o volume com água de diluição;

5. Completar o volume do frasco com água de diluição evitando a formação

de bolhas e turbulências;

6. Medir o ODinicial por meio do método modificado pela azida sódica (ver

POP-01);

7. Levar as amostras de DBO5 para a incubação (20±1ºC);

8. Após 5 dias determinar a concentração de ODfinal da amostra por meio do

método modificado pela azida sódica (ver POP-01);

Preparo da semente

As sementes utilizadas no teste da DBO podem ser obtidas de amostras in

natura de esgotos, de amostras do próprio efluente coletadas após 3 a 8km a

jusante do ponto de despejo, de forma a obter microorganismos adaptados.

Também podem ser utilizados sólidos suspensos ou serem adquiridas sementes

comerciais para DBO.

CÁLCULO DA DBO SEM SEMENTE

( / ) I FOD ODDBO mg L

P

5

(3)

em que :

ODI = concentração de OD inicial (mg.L-1)

ODF = concentração de OD final (mg.L-1)

P = fração volumétrica da amostra utilizada (ml)

CÁLCULO DA DBO COM SEMENTE

( )*( / ) I F I FOD OD B B f

DBO mg LP

5 (4)

em que :


34

ODI = concentração de OD inicial (mg.L-1)

ODF = concentração de OD final (mg.L-1)

BI = concentração de OD no controle da semente inicial (mg.L-1)

BF = concentração de OD no controle da semente final (mg.L-1)

f = razão da semente diluída na amostra em relação à semente de controle

P = fração volumétrica da amostra utilizada (ml)

1.2. DESTINAÇÃO DO RESÍDUO GERADO

Depois de finalizada a etapa de titulação o resíduo gerado nas leituras de

DBO, pode ser descartado diretamente na pia sem necessidade de um pré-

tratamento.


Concentração de oxigênio dissolvido (mg.L-):

limite máximo – 7 a 9 mg OD.L-1

limite mínimo – 2 mg OD.L-1

1.4. MÉTODO RESPIROMÉTRICO / MANOMÉTRICO – OXITOP

Baseia-se numa amostra em uma garrafa âmbar sob quantidade suficiente

de microorganismos e nutrientes a temperatura controlada de 201ºC e que por

meio de agitação faz com que o O2 presente na câmara de ar se dissolva no

líquido. Os microorganismos respiram este oxigênio dissolvido na amostra

durante o processo de degradação da matéria orgânica, exalando CO2, que é

absorvido pelos grânulos de NaOH p.a contido em um reservatório de borracha,

produzindo uma diferença de pressão na garrafa, que é medida pelo sensor

Oxitop, cujo sistema realiza este leitura digital e conversão dos valores para mg

O2.L-1.


35


Equipamentos

Garrafas de DBO Oxitop

Bandeja de agitação magnética

Agitador magnético


Vidrarias


Frascos volumétricos padrão


NaOH (p.a) em pérolas;

Solução Tampão de Fosfato: dissolver em aproximadamente 600ml de

água destilada:

- 8,5g de fosfato monobásico de potássio (KH2PO4 p.a);

- 21,75g de fosfato dibásico de potássio (K2HPO4 p.a);

- 33,4g de fosfato dibásico de sódio heptahidratado (Na2HPO4.7H2O

p.a);

- 1,7g de cloreto de amônio (NH4Cl p.a)

Transferir para um balão volumétrico de 1000ml e completar o volume com

água destilada.



Solução de Sulfato de Magnésio (MgSO4): dissolver 22,5g de sulfato de

magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O p.a) em aproximadamente 800ml

de água, transferir para um balão volumétrico de 1000ml e completar o




Solução de Cloreto de Cálcio (CaCl2): dissolver 27,5g de cloreto de

cálcio anidro (CaCl2 p.a) em aproximadamente 800ml de água, transferir


36

para um balão volumétrico de 1000ml e completar o volume com água

destilada.



Solução de Cloreto Férrico (FeCl3): dissolver 0,25g de cloreto férrico

hexahidratado (FeCl3.6H2O p.a) em aproximadamente 800ml de água,

transferir para um balão volumétrico de 1000ml e completar o volume com

água destilada.



Solução de Cloreto de Amônio (NH4Cl): dissolver 38,2g de cloreto de

amônio (NH4Cl p.a) em aproximadamente 800ml de água, neutralize o pH

para 7,0 com KOH, transfira para um balão volumétrico de 1000ml e

completar o volume com água destilada.



1.2.2. PROCEDIMENTO ANALÍTICO OXITOP (Amostra)

1. Conhecer o valor da DQO da amostra ou a faixa de DBO esperada e de

acordo com estes valores observar na Tabela 2, o volume da amostra e

solução nutriente a ser transferido para a garrafa de Oxitop;

Tabela 2. Especificação dos valores de amostra e volume de solução nutriente utilizados

na quantificação de DBO, a partir do procedimento OXITOP segundo as faixas de DBO.

DBO ESPERADA (mg.L-1)

VOLUME DE AMOSTRA (ml)

VOLUME DE SOLUÇÃO NUTRIENTE (ml)

0 – 40 432 1,7 0 – 80 365 1,5 0 – 200 250 1,0 0 – 400 164 0,6 0 – 800 97 0,4

0 – 2000 43,5 0,2

2. Transferir o volume de amostra no frasco de DBO Oxitop;


37

3. Pipetar o volume da solução nutriente, que é composta por:

a. 6ml da solução de tampão fosfato;

b. 2ml da solução de sulfato de magnésio;

c. 2ml da solução de cloreto férrico;

d. 2ml da solução de cloreto de cálcio;

e. 2ml da solução de cloreto de amônio.

4. Colocar a barra magnética dentro da garrafa;

5. Adicionar de 2 a 4 pastilhas de NaOH (p.a) no reservatório de borracha;

6. Colocar o reservatório com cuidado na boca da garrafa;

7. Fechar a garrafa com o sensor e colocar sobre o sistema de agitação;

8. Ligar o sistema de agitação e verificar os agitadores;

9. Pressionar simultaneamente as teclas M e S até que apareça no visor do

sensor “00”;

1.2.2.1. CÁLCULO DA DBO OXITOP

A concentração final da DBO5 será dada após o término da análise no leitor

do sensor do Oxitop.

1.2.2.2. LIMITE DE DETECÇÃO

0 – 2000 mg O2.L-1

2. DESCARTE DO RESÍDUO GERADO

Depois de finalizada as leituras no equipamento OXITOP, o resíduo

(amostra e mistura de solução nutriente) pode ser descartado diretamente na pia

sem necessidade de um pré-tratamento.

3. REFERÊNCIA

STANDARD METHODS, methods 4500 - O C & 5210 B (Apha, 1998)


38

POP 03 – DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO (DQO)


1.1. MÉTODO DO REFLUXO ABERTO – TITULOMÉTRICO

A matéria orgânica / inorgânica é oxidada em meio ácido (H2SO4) por um

forte agente oxidante – dicromato de potássio (K2Cr2O7) em excesso, em um

condensador de refluxo do tipo Friedrichs. Toda reação é catalisada por sulfato de

prata (Ag2SO4) e intensa liberação de calor.

Após a digestão, o excesso de dicromato é titulado com solução de sulfato

ferroso amoniacal – SFA – (Fe (SO4)2(NH4)2), previamente padronizado, e assim

determina-se a quantidade de oxidante consumida na reação; tal quantidade será

expressa em termos equivalentes de oxigênio. O tempo ideal para a digestão é de

2 horas.


Equipamentos

Chapa de aquecimento contendo condensadores Friedrichs

Balança analítica (precisão ± 0,0001g)

Vidrarias

Balão de fundo chato de 500ml

Pérolas de vidro para controlar ebulição

Espátulas


Balões volumétricos

Dispenser

Proveta

Bureta de 50ml


39


Ácido Sulfúrico com Sulfato de Prata: adicionar lentamente e

cuidadosamente 10g de sulfato de prata (Ag2SO4 p.a) em 1000ml de ácido

sulfúrico concentrado (H2SO4 p.a). Deixar em repouso de um a dois dias

para a dissolução completa.



Solução de Dicromato de Potássio 0,04167 mol.L-1: dissolver 12,259g

de dicromato de potássio (K2Cr2O7 p.a), previamente seco a 150ºC por 2h,

em aproximadamente 800ml de água destilada, transferir para um balão

volumétrico de 1000ml e aferir com água destilada.


* Estável por 1 ano (mínimo) – padrão primário

Solução de Dicromato de Potássio 0,004167 mol.L-1: diluir 100ml da

solução de dicromato de potássio 0,25 mol.L-1 em um balão volumétrico de

1000ml, completar o volume com água destilada.


* Estável por 1 ano (mínimo) – padrão primário

Solução de Sulfato Ferroso Amoniacal (SFA) 0,25 mol.L-1: dissolver 98g

de SFA (p.a) em aproximadamente 800ml de água destilada, adicionar

lentamente 20ml de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4 p.a), aguardar

esfriar e transferir para um balão volumétrico de 1000ml, completar o


* Estocar a solução em frasco tipo âmbar ou frasco de vidro, em temperatura ambiente.

* Estabilidade do reagente é dependente da padronização diária (momento do uso).

Solução de indicador ferroína: dissolver 1,485g de 1,10 – fenantrolina

monohidratada (p.a) e 695mg de sulfato ferroso heptahidratado (p.a) em

100ml de água destilada.



Padronização - SFA:


40

1. Adicionar 10 ml de dicromato de potássio 0,04167 mol.L-1 em um

erlenmeyer;

2. Completar o volume do erlenmeyer para 100ml, com água destilada;

3. Adicionar, com um dispenser, 30ml de ácido sulfúrico;

4. Aguardar esfriar;

5. Adicionar de 3 a 6 gotas de indicador ferroína;

6. Titular com a solução de SFA 0,25 mol.L-1 até o ponto de viragem do

indicador (verde para marrom);

7. Calcular a Molaridade da solução de SFA:

2500,0*)(2

)(1)( 722

SFAv

OCrKvSFAM

em que:

M (SFA) = molaridade da solução de sulfato ferroso amoniacal (mol.L-1).

v1 (K2Cr2O7) = volume da solução de dicromato de potássio (mL).

v2 (SFA) = volume da solução de tiossulfato gasto na titulação (mL).

Solução de Sulfato Ferroso Amoniacal (SFA) 0,025 mol.L-1: diluir 100ml

da solução de SFA 0,25 mol.L-1 em um balão volumétrico de 1000ml e

completar o volume com água destilada. Padronizar da mesma forma

descrita para o SFA 0,25 mol.L-1, com uma alteração: utilizar a solução de

dicromato de potássio 0,004167 mol.L-1 no método descrito anteriormente.

Sulfato de Mercúrio (HgSO4 p.a)


1.1.2.1. Procedimento para DQO > 50 (mg.L-1)

1. Pesar em um balão de fundo chato 0,4g de sulfato de mercúrio;

2. Adicionar ao balão de fundo chato:

a. 20ml da amostra homogeneizada;

b. 10ml da solução 0,04167 mol.L-1 de dicromato de potássio;

c. 5ml de ácido sulfúrico p.a;

d. 3 a 4 pérolas de vidro;


41

e. 25ml de ácido sulfúrico p.a./sulfato de prata com o auxilio de um

dispenser;

3. Conectar o balão no condensador de refluxo;

4. Deixar em refluxo por 2h; desligar o condensador e deixar esfriar;

5. Adicionar 5 a 6 gotas de solução indicadora de ferroína no balão;

6. Titular a amostra com solução de SFA 0,25 mol.L-1 (padronizada) até

atingir o ponto de viragem do verde azulado para o marrom;

7. Anotar o volume gasto na titulação;

1.1.2.2. Procedimento para DQO < 50 (mg.L-1)

1. Pesar em um balão de fundo chato 0,4g de sulfato de mercúrio;

2. Adicionar ao balão de fundo chato:

a. 50ml da amostra já homogeneizada;

b. 25ml da solução 0,004167 mol.L-1 de dicromato de potássio;

c. 5ml de ácido sulfúrico p.a;

d. 3 a 4 pérolas de vidro;

e. 25ml de ácido sulfúrico p.a./sulfato de prata com o auxilio de um

dispenser;

3. Conectar o balão no condensador de refluxo;

4. Deixar em refluxo por 2h; desligar o condensador e deixar esfriar;

5. Adicionar 5 a 6 gotas de solução indicadora de ferroína no balão;

6. Titular a amostra com solução de SFA 0,025 mol.L-1 (padronizada) até

atingir o ponto de viragem do verde azulado para o marrom;

7. Anotar o volume gasto na titulação.

1.1.3. CÁLCULO DA DQO

V

fcVVLmgODQO ab 8000**1.0*)

)/( 2

(5)

em que :

Vb: volume gasto na titulação do branco (mL)

Va: volume gasto na titulação da amostra (mL)


42

V: volume da amostra (ml): 20 para DQO > 50 mg.L-1 e 50 para DQO < 50 mg.L-1.

fc: fator de correção do SFA

1.2. MÉTODO DO REFLUXO FECHADO – COLORIMÉTRICO

A matéria orgânica / inorgânica presente na amostra é oxidada por meio do

agente oxidante (K2Cr2O7). O método padrão emprega como reagentes: solução

padrão de hidrogenoftalato de potássio, solução catalítica ácida (Ag2SO4 em

H2SO4 concentrado) e solução digestora (composta de K2Cr2O7, HgSO4 e H2SO4

diluídos em água). O método consiste na redução do cromo (Cr6+ a Cr3+) e

subsequente análise através da modificação da coloração, em um

espectrofotômetro na região do visível. Este procedimento é usualmente

conduzido em um digestor a 150°C, por 2h e as leituras obtidas em

espectrofotômetro de luz visível. Para valores esperados de DQO menores que

90 mg.L-1, a amostra deve ser lida no comprimento de onda de 420nm, se a DQO

estiver entre 100 a 900 mg.L-1, a leitura deve ser realizada no comprimento de

onda de 600nm. Valores de concentração superiores a 900 mg.L-1 podem ser

obtidos através da diluição da amostra, previamente homogeneizada.


Equipamentos

Aparelho digestor - refluxo fechado

Espectrofotômetro UV-Vis


Micropipeta (100 - 1000µl)

Vidrarias

Pipetas graduadas e volumétricas

Frascos de vidro para digestão

Cubeta de vidro


Ácido sulfúrico (p.a);


43

Sulfato de mercúrio (p.a);

Ácido Sulfúrico com Sulfato de Prata (solução catalítica): adicionar 10g

de sulfato de prata (Ag2SO4 p.a) em 1000ml de ácido sulfúrico concentrado

(H2SO4 p.a). Deixar um dia para a dissolução total.



Solução digestora: dissolver 1,0216g de dicromato de potássio (K2Cr2O7

p.a), previamente seco a 150ºC por 2 horas, em aproximadamente 80ml de

água destilada, adicionar lentamente 16,7ml de ácido sulfúrico p.a. e 3,33g

de sulfato de mercúrio. Dissolver, aguardar esfriar e transferir para um

balão volumétrico de 100ml, aferindo com água destilada; O preparo desta

solução considera a leitura em = 600nm (DQO > 100 mg O2.L-1).

Para leitura em = 420nm (DQO < 90 mg O2.L-1), deve ser seguido

o mesmo procedimento de preparo, apenas alterando a quantidade de

dicromato de potássio para 0,1022g, considerando 100ml de solução final.



Hidrogenoftalato de Potássio (solução padrão para calibração):

dissolver 0,0425g de hidrogenoftalato de potássio (KHP), previamente seco

em estufa (110ºC) e dessecador, em água destilada e diluir para 100ml em

balão volumétrico.

* Armazenar em frasco âmbar e acondicionar em ambiente refrigerado (4ºC) para estabilidade

do reagente (1 mês).

* KHP = 1,176 mg O2 / mg e DQO teórica de 500 mg O2.L-1

.


1.2.2.1. Calibração do método

A calibração do método é realizada através de curva de calibração padrão,

descrito na seqüência:

1. A partir da solução padrão (KHP), preparar, em balões volumétricos de

50ml, a seguinte curva de calibração (volume final com água destilada):


44

Concentração DQO (mg.L-1) Volume (ml) 0 (branco) -

10 1 25 2,5 50 5

150 15 250 25

*Para uma melhor confiabilidade e verificação da linearidade da curva de calibração, esta pode ser preparada

em duplicata ou triplicata.

2. Posteriormente ao preparo das soluções padrões, conforme a tabela

acima, retirar, com auxílio de uma pipeta volumétrica, uma alíquota de 2ml de

cada padrão e reservar nos frascos para digestão;

3. Na sequência, adicionar cuidadosamente (reação exotérmica ↑ calor),

2ml da solução digestora e em seguida, 2ml da solução catalítica;

4. Fechar bem os frascos e misturar lentamente pela parede do mesmo, de

modo a favorecer a mistura dos reagentes adicionados (evitar misturar totalmente

por inversão, pois a presença de H2SO4 pode danificar as tampinhas, podendo

causar vazamento durante a digestão e também, cuidar com o aquecimento dos

frascos);

5. Realizar a digestão em aparelho digestor por um período de 2h e

temperatura de 150ºC;

6. Após completar a digestão, transferir os frascos para um suporte

específico e aguardar o resfriamento;

7. Realizar leitura no espectrofotômetro, ( = 600nm), sem especificação de

tempo máximo para leitura após a digestão;

NOTA: O procedimento descrito acima considera a calibração para leituras em

= 600nm. No caso de calibração para = 420nm os passos metodológicos são os

mesmos, havendo apenas a mudança da solução digestora (K2Cr2O7), (Ver item

1.2.1 – Reagentes).

8. Equação da reta, obtida com a plotagem do gráfico: absorbância (eixo y)

X concentração (eixo x);

9. Verificar coeficiente de linearidade: R > 0,990;

10. Realizar comparação com a curva analítica apresentada abaixo na

Figura 1.


45

0 50 100 150 200 2500,00

0,02

0,04

0,06

0,08 Exemplo 1 (10<DQO<250 mg.L

-1)

Exemplo 2 (10<DQO<150 mg.L-1)

Eq.Reta(2): Conc=(Abs+2,11083E-4)/2,8534E-4

R = 0,99953 / n = 4

Eq.Reta(1): Conc=(Abs-0,00173)/3,03109E-4

R = 0,99844 / n = 5

A

bso

rvâ

ncia

DQO (mg O2.L

-1)

Figura 1. Exemplo de curva analítica de KHP aplicada à calibração do método

colorimétrico para determinação da DQO ( = 600nm) em amostras de água e efluentes

líquidos.

1.2.2.2. Determinação da concentração em amostras de DQO > 100 mg.L-1

1. Homogeneizar bem a amostra presente no frasco de coleta;

2. Transferir 2ml de amostra para o frasco de digestão;


4. Transferir 2ml de amostra para o frasco de digestão (verificar a

necessidade de diluição);

5. Na sequência, adicionar, na ordem e cuidadosamente (reação

exotérmica ↑ calor), 2ml da solução digestora para leitura em = 600nm

(Ver item 1.2.1 – Reagentes) e 2ml da solução catalítica;

6. Realizar o mesmo procedimento para provas em branco, utilizando 2ml

de água destilada;

7. Fechar bem os frascos e misturar lentamente pela parede do mesmo,

de modo a favorecer a mistura dos reagentes adicionados (evitar

misturar totalmente por inversão, pois a presença de H2SO4 pode

danificar as tampinhas, podendo causar vazamento durante a digestão

e cuidar com o aquecimento dos frascos);


46





10. Realizar leitura no espectrofotômetro, ( = 600nm), sem especificação

de tempo máximo para leitura após a digestão;

1.2.2.3. Determinação da concentração em amostras de DQO < 90 mg.L-1


2. Transferir 2ml de amostra para o frasco de digestão;

3. Na sequência, adicionar, na ordem e cuidadosamente (reação

exotérmica ↑ calor), 2ml da solução digestora para leitura em = 420nm

(Ver item 1.2.1 – Reagentes) e 2ml da solução catalítica;

4. Realizar o mesmo procedimento para provas em branco, utilizando 2ml

de água destilada;

5. Fechar bem os frascos e misturar lentamente pela parede do mesmo,

de modo a favorecer a mistura dos reagentes adicionados (evitar

misturar totalmente por inversão, pois a presença de H2SO4 pode

danificar as tampinhas, podendo causar vazamento durante a digestão

e cuidar com o aquecimento dos frascos);





8. Realizar leitura no espectrofotômetro, ( = 420nm), sem especificação

de tempo máximo para leitura após a digestão;

1.2.3. CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO

Quantificação da concentração de DQO (mg O2.L-1) através da equação da

reta, obtida na curva analítica (calibração).


47

1.2.4. LIMITE DE DETECÇÃO

Para leituras no comprimento de onda 420 nm: 0 - 90 mg O2.L-1

Para leituras no comprimento de onda de 600 nm: 100 - 900 mg O2.L-1

2. REFERÊNCIA

Adaptação de STANDARD METHODS, method 5220 D (Apha, 1998)


Para ambos os métodos (1.1 – refluxo aberto e 1.2 – digestão fechada) o

resíduo gerado apresenta um alto caráter de toxicidade tendo na sua composição:

cromo hexavalente, Cr (VI) e trivalente, Cr (III), mercúrio (Hg2+) e prata (Ag2+) e

um meio fortemente acidificado. Dessa forma, o resíduo deve ser armazenado em

frasco plástico preferencialmente rígido (PEAD) e identificado, inclusive para

novas estocagens. A partir do acúmulo em excesso no laboratório é necessária

requerer junto à Prefeitura da Cidade Universitária uma solicitação para

encaminhamento ao aterro industrial Essencis.


48

POP 04 – CARBONO ORGÂNICO DISSOLVIDO (COD)


A quantificação de COD segue metodologia especificada pelo fabricante do

equipamento. De modo geral, o método consiste na combustão da amostra, sob

alta temperatura, e posterior quantificação através de detecção infravermelha não

dispersiva (NDIR) A determinação da concentração de carbono é realizada pela

combustão á alta temperatura


Equipamentos

Analisador de carbono orgânico (marca Shimadzu, modelo TOC V-CPH).

Membrana de acetato de celulose Ø 0,45m de porosidade

Bomba de vácuo


Frasco plástico (PEAD, PP) para amostra (50ml).

Vidrarias

Conjunto kitassato para filtração


Ácido clorídrico (HCl) 2 mol.L-1: prepare a solução diluindo uma parte de

HCl concentrado (12 M) em cinco partes de água deionizada.

Soluções Padrões para calibração:

Solução padrão para CT: pesar 0,2125g de biftalato hidrogênio de potássio,

previamente seco a 105-120ºC por 1h e resfriado em dessecador. Transferir para

um balão volumétrico de 100ml e dissolver em água deionizada. Aferir para

100ml. A concentração teórica desta solução é de 1000 mg C.L-1.

Solução padrão para CI: pesar 0,305g de bicarbonato de sódio (p.a), previamente

seco por 2 horas em um dessecador e 0,441g de carbonato de sódio,

previamente seco a 280-290ºC por 1h e resfriado em um dessecador. Transferir


49

para um balão volumétrico de 100ml e dissolver em água deionizada. Aferir para

100ml. A concentração teórica desta solução é de 1000 mg C.L-1.

2. PROCEDIMENTO ANALÍTICO

3.1. CALIBRAÇÃO DO MÉTODO

A partir das soluções padrões preparadas de CT e CI, o usuário deve

selecionar uma calibração padrão a partir do software do equipamento, visto que

este realiza automaticamente as diluições, especificando a concentração padrão

inicial (CT e CI de 100 mg C.L-1).

OBS: Não tendo o conhecimento desta etapa de utilização do TOC V-CPH

recorrer aos usuários capacitados para a realização da calibração do aparelho

2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE COD EM AMOSTRAS

1. Devido a não adequação deste equipamento com teores elevados de

cloretos nas amostras, este parâmetro deve ser cuidadosamente verificado da

sua presença na amostra, antes de iniciar a leitura;

2. Filtrar, aproximadamente, 50ml de amostra em membrana de acetato de

celulose Ø 0,45µm;

NOTA: a leitura do COD pode ser realizada imediatamente após a realização da

coleta, em um prazo de 2 dias, considerando a refrigeração da amostra (< 4 ºC),

ou você pode transferir a fração filtrada para esta análise para o frasco específico

e congelar para leitura posterior (6 meses).

3. Preparar o equipamento para procedimento de leitura de amostras

(Verificar POP TOC V-CPH);

4. Posteriormente, será solicitado o início das leituras de CT e CI;

5. Inserir o capilar do equipamento analisador de COT no frasco de

amostra e proceder à determinação;


50

3.3. CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO

O valor do COD (mg C.L-1) se dá automaticamente, através do software do

equipamento, o qual realiza a subtração do CI a partir do CT, para quantificação

da fração orgânica de carbono presente na amostra.


O limite de detecção, segundo o manual do aparelho (Shimadzu, 2003), é de

4 µg.L-1, sendo o valor de COD obtido pela subtração do carbono total (CT) pelo

carbono inorgânico (CI), com faixa de detecção igual a: < 25.000 mg.L-1 para CT e

30.000 mg.L-1 para CI.

4. REFERÊNCIA

TOC-VCPH SHIMADZU CORPORATION (2003)


51

POP 05 – SÉRIE DE SÓLIDOS

1. MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO – GRAVIMÉTRICO

O método gravimétrico baseia-se na diferença de peso. Dessa forma, a

determinação das várias formas de sólidos prende-se a diferença entre o peso

seco e úmido, em relação ao volume de amostra utilizado no ensaio.


Equipamentos e materiais

Bomba de Vácuo


Dessecador

Estufa (105 ± 5ºC)

Mufla (550 ± 5ºC)

Pinça simples metálica ou de madeira e espátula

Porta Filtro

Membrana de filtração de fibra de vidro

Vidrarias

Proveta graduada (50ml e 100ml)

Pipeta graduada e volumétrica

Cápsula de porcelana de 50ml de capacidade

Cápsula de porcelana de 100ml de capacidade

Cadinho de porcelana de 50ml de capacidade


Cone Imhoff


Não é utilizada nenhuma solução, apenas a amostra.


52

1.2. SÓLIDOS TOTAIS (ST)


(a) Preparo da Cápsula (NOTA: procedimento explicativo para 1 réplica)

1. Ligar a mufla a 550 ± 5ºC e a estufa a 105 ± 5ºC;

2. Colocar uma cápsula limpa na mufla para aferição por 1h e seguir os

passos abaixo na sequência:

a. Esfriar na estufa por 45min seguido de dessecador por 45min;

b. Pesar a cápsula e anotar o resultado em g (P0);

(b) Determinação de Sólidos Totais (ST)

1. Transferir para a cápsula, uma alíquota homogênea de volume adequado

de amostra, medido em proveta, e manter sob evaporação em banho-maria

até atingir secura completa (MANUSEAR A CÁPSULA SEMPRE COM O AUXÍLIO

DA PINÇA E NÃO DIRETAMENTE COM A MÃO);

2. Levar a cápsula com resíduo em estufa a 105 ± 5ºC por 45min;

3. Deixar a cápsula esfriar no dessecador por 45min;

4. Pesar a cápsula com resíduo e anotar o resultado em g (P1);

5. Expressar o resultado:

)(

000.000.1*01)/(

mLVamostra

PPLmgST

(6)

(c) Determinação de Sólidos Totais Fixos (STF)

1. Após anotar o valor do peso P1, transferir a cápsula para mufla a 550 ± 5ºC

por 1 hora e seguir os passos abaixo na sequência;

2. Esfriar na estufa a 105 ± 5ºC por 30min seguido de dessecador por 45min;

3. Pesar a cápsula e anotar o resultado em g (P2);


)(

000.000.1*02)/(

mLVamostra

PPLmgSTF

(7)


53

(d) Determinação de Sólidos Totais Voláteis (STV)

1. É obtido através do cálculo da diferença entre os Sólidos totais e os

Sólidos Totais Fixos;


STFSTLmgSTV )/( (8)

1.3. SÓLIDOS SUSPENSOS (SST)


(a) Preparo do Cadinho (NOTA: procedimento explicativo para 1 réplica)

1. Ligar a mufla a 550 ± 5ºC e a estufa a 105 ± 5ºC;

2. Colocar um cadinho limpo com a membrana de fibra de vidro na mufla para

aferição por 1h;

3. Deixar o cadinho esfriar na estufa por 45min seguido de dessecador por

1h;

4. Pesar o cadinho e anotar o resultado em g (P0);

(b) Determinação de Sólidos Suspensos Totais (SST)

1. Transferir o cadinho contendo o papel filtro de fibra de vidro para um porta

filtro adaptado ao kit kitassato para filtração (MANUSEAR A CÁPSULA SEMPRE

COM O AUXÍLIO DA PINÇA E NÃO DIRETAMENTE COM A MÃO);

2. Filtrar um volume de amostra entre 50 e 200ml (volumes utilizados

rotineiramente), com auxílio de uma proveta graduada, que favoreça a

quantificação de SST na amostra em questão;

3. Retirar o cadinho contendo o papel filtro fibra de vidro e o resíduo sólido

retido no mesmo do kit kitassato;

4. Levar o cadinho com resíduo, para estufa a 105 ± 5ºC por 1h;

5. Em seguida, aguardar esfriar no dessecador por 30min;

6. Pesar o cadinho com resíduo e anotar o resultado em g (P1);



54

)(

000.000.1*01)/(

mLVamostra

PPLmgSST

(9)

(c) Determinação de Sólidos Suspensos Fixos (SSF)

1. Após anotar o valor do peso P1, transferir o cadinho para mufla a 550 ±

5ºC por 1h;

2. Deixar a cadinho esfriar na estufa a 105 ± 5ºC por 30min seguido de

dessecado por 45min;

3. Pesar a cadinho e anotar o resultado em g (P2);


)(

000.000.1*02)/(

mLVamostra

PPLmgSSF

(10)

(d) Determinação de Sólidos Suspensos Voláteis (SSV)

1. É obtido pela diferença entre os sólidos suspensos totais e os sólidos

suspensos fixos;


SSFSSTLmgSSV )/( (11)

1.4. SÓLIDOS SEDIMENTÁVEIS (SS)


2. Homogeneizar vigorosamente a amostra;

3. Transferir a amostra para o cone de Imhoff até a marca de 1000ml;

4. Deixar em repouso por 45min;

5. Passar vagarosamente um bastão de vidro na parede interna do cone, ou

gira-lo suavemente entre as mãos;

6. Deixar em repouso por mais 15min;

7. Determinar o volume, em ml, ocupado pelos sólidos sedimentáveis;

8. Anotar o valor observado;

9. Expressar o resultado em ml.L-1 pela leitura direta no cone Imhoff;


55

2. REFERÊNCIAS

Adaptação de STANDARD METHODS, method 2540 B (Apha, 1998)

Adaptação de STANDARD METHODS, method 2540 E (Apha, 1998)

STANDARD METHODS, method 2540 F (Apha, 1998)


56

POP 06 – UV-Vis

1. MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO - ESPECTROFOTOMÉTRICO

Varredura espectrofotométrica na região do UV-Vis. Espécies atômicas ou

moleculares que absorvem energia na região do UV-Vis são detectadas através

do espectro de varredura.




Bomba de vácuo


Frasco plástico (PEAD, PP) para amostra (20ml)

Vidrarias

Cubeta de quartzo



Não há uso de soluções para o preparo e quantificação da amostra.


1. Filtrar aproximadamente 20ml de amostra em membrana de acetato de


2. Transferir a amostra (~ 4ml) para uma cubeta de quartzo;

3. Selecionar no espectrofotômetro UV-Vis a opção espectro e realizar uma

varredura na faixa de comprimentos de onda entre 200 e 700nm (Verificar

POP UV-Vis SHIMADZU);

4. Realizar a análise de UV-Vis para cada amostra;

5. Utilizar água destilada como prova em branco da análise;


57

200 250 300 3500,0

0,2

0,4

0,6

Absorv

ância

Comprimento de Onda (nm)

Amostra 1

Amostra 2

Amostra 3

Amostra 4

Amostra 5

Amostra 6

NOTA: a leitura no espectrofotômetro pode ser realizada imediatamente após a

realização da coleta, em um prazo de 2 dias, considerando a refrigeração da

amostra (< 4ºC), ou você pode transferir a fração filtrada para esta análise para o

frasco específico e congelar para leitura posterior (6 meses).

2. EXEMPLO GRÁFICO DO ESPECTRO UV-Vis DE VARREDURA PARA

AMOSTRAS DE ÁGUA

A Figura 2 exemplifica o espectro de varredura obtido após o tratamento

dos dados obtidos a partir do espectrofotômetro de UV-Vis. Este exemplo

considera os valores de absorvância entre os comprimentos de onda de 200 a

350nm.

Figura 2. Espectro de varredura na região do UV-Vis para seis amostras de águas

superficiais coletadas em diferentes pontos de amostragem na região do Alto Iguaçu.


58

POP 07 – SÉRIE DE NITROGÊNIO – NITRITO (N-NO2-)


1.1. MÉTODO DA SULFANILAMIDA / N-1-NAFTIL

A concentração de N-NO2- é determinada através da formação de um azo

corante, de coloração púrpura característica, em faixa de pH entre 2,0 e 2,5,

decorrente da complexação entre sulfanilamida e N-(1-naftil)-etilenodiamina,

conforme esquema abaixo:

Figura 3. Esquema explicativo das etapas de reação de Griess (1879), utilizada como

metodologia analítica na quantificação de N-Nitrito em amostras de água e de efluentes

líquidos.



Bomba de vácuo

Membranas de acetato de celulose (Ø 0,45µm)




59


Vidrarias

Balão volumétrico de 50ml


Pipetas volumétricas ou graduadas

Cubeta de vidro



Solução estoque padrão de N-NO2-: dissolver 0,308g de nitrito de sódio

(NaNO2 p.a) em água destilada. Aferir para 250ml com água destilada em

balão volumétrico.

* 1 ml = 250µg N ou 250 mg.L-1

* Estável por 6 meses após o preparo.

* Armazenar em frasco âmbar e acondicionar em ambiente refrigerado (4ºC)

Solução padrão para calibração de N-NO2-: diluir 0,2ml da solução

estoque padrão em água destilada. Aferir com água destilada para 100ml,

em balão volumétrico.

* 1ml = 0,5 µg N ou 0,5 mg.L-1

* Preparo deve ser realizado apenas para o uso imediato.

Solução reativa para N-NO2-: adicionar 25ml de ácido fosfórico (H3PO4

p.a) 85% em, aproximadamente, 200ml de água destilada. Adicionar 2,5g

de sulfanilamida (C6H8N2O2S p.a). Após dissolução total, adicionar 0,25g

de N-1-naftil etilenodiamina dihidroclórico (C12H4N2.2HCl p.a). Após

dissolução total, aferir com água destilada, para um volume final de 250ml


* Estável por 1 mês (mínimo).

* Acondicionamento em ambiente refrigerado (4ºC).


60




descrita na seqüência:

1. A partir da solução padrão para calibração (0,5 mg.L-1), preparar, em

balões volumétricos de 25ml, a seguinte curva de calibração (volume final com

água destilada):

Concentração N-NO2- (µg.L-1) Volume N-NO2

- (ml) 0 (branco) -

5 0,25 10 0,5 25 1,25 50 2,5

100 5 *Para uma melhor confiabilidade e verificação da linearidade da curva de calibração, esta pode ser preparada

em duplicata ou triplicata.



cada padrão e reservar em outro frasco;

3. Juntamente aos padrões, realizar prova em branco utilizando alíquotas

de 10ml de água destilada;

4. Adicionar 0,4ml da solução reativa para N-NO2- em cada alíquota

(padrão e branco), com auxílio de uma micropipeta e misturar por inversão;

5. Leitura em espectrofotômetro ( = 543 nm) entre 10min e tempo máximo

de 2h;

6. Equação da reta, obtida com a plotagem do gráfico: absorvância (eixo y)



8. Realizar comparação com a curva analítica apresentada na Figura 4a;

2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE N-NO2- EM AMOSTRAS


2. Transferir 50ml de amostra para o sistema de filtragem de vácuo;


61

3. Filtrar em membrana de acetato de celulose Ø 0,45µm;

4. A partir da fração dissolvida, retirar alíquotas de 10ml (triplicata) e

reservar em frascos secundários;

5. Juntamente as amostras, realizar prova em branco utilizando alíquotas


6. Adicionar 0,4ml da solução reativa para N-NO2- em cada alíquota e

misturar por inversão. Realizar o mesmo procedimento para o branco;

7. Realizar prova em branco, utilizando alíquotas de 10ml de água

destilada;

8. Leitura em espectrofotômetro ( = 543nm) entre 10min e tempo máximo

de 2 horas;

Figura 4. (a) Exemplo de curva analítica de NaNO2 aplicada à calibração do método

colorimétrico para determinação de N-Nitrito (N-NO2-) em amostras de água e efluentes

líquidos e (b) Exemplo comparativo de quatro calibrações preparadas em diferentes

períodos (jul/09 – fev/10) para análise de N-NO2-.


Quantificação da concentração de N-NO2- (mg.L-1 ou µg.L-1) através da

equação da reta, obtida na curva analítica (calibração).

0 20 40 60 80 1000,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Ab

so

rvâ

ncia

N-NO2- (g.L

-1)

Eq.Reta: Conc=(Abs+0,00514)/0,00305

R = 0,99866 / n = 10

0 20 40 60 80 1000,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35A

bsorv

ância

N-NO2- (g.L

-1)

Calibração 1 (R= 0,9986)




(a) (b)


62

2.4. LIMITE DE DECTEÇÃO

O método para quantificação de N-NO2- é aplicável para leitura na faixa de

concentração entre 5 e 1000 µg.L-1. Para concentrações superiores, sugere-se a

diluição da amostra e, posteriormente, quantificação através do fator de diluição

fdiluição utilizado.


O resíduo da análise de nitrito deve, primeiramente, ser neutralizado com

soluções de NaOH (0,01 – 1 mol.L-1) para posterior descarte na pia.

3. REFERÊNCIA

Adaptação de STANDARD METHODS, method 4500- NO2- B (Apha, 1998)


63

N

O O (-)

O

(-)

(+) Cd-Cu

N

O O (-) (-)

Cd0Cd

2+

POP 08 – SÉRIE DE NITROGÊNIO – NITRATO (N-NO3-)


1.1. MÉTODO DA COLUNA DE Cd-Cu

A concentração de N-NO3- é determinada, quantitativamente, através da

redução para N-NO2-, em presença de grânulos de cádmio (Cd). Posteriormente,

o N-NO2- é quantificado segundo o método da sulfanilamida / N-1-naftil (ver POP

nº. 07 / N-NO2-), como mostra o esquema abaixo:

Figura 5. Esquema explicativo das etapas da redução de N-Nitrato para N-Nitrito através

da coluna de Cd-Cu e reação de Griess (1879), utilizada como metodologia analítica na

quantificação de N-Nitrato em amostras de água e de efluentes líquidos.



Bomba de vácuo




Micropipeta (100 - 1000l)

Vidrarias



64


Pipetas volumétricas ou graduadas

Cubeta de vidro


Tubos de plástico para centrífuga, tipo Falcon (15ml)


Solução estoque padrão de N-NO3-: dissolver 0,18045g de nitrato de

potássio (KNO3 p.a), previamente seco em estufa (105ºC / 24h) em água

destilada. Aferir para 250ml com água destilada em balão volumétrico.

* 1ml = 100 µg N-NO3- ou 100 mg.L

-1.


* Armazenar em frasco âmbar e acondicionar em ambiente refrigerado (4ºC)

Solução intermediária padrão de N-NO3-: diluir 25ml da solução estoque

padrão em água destilada. Aferir com água destilada para 250ml, em balão

volumétrico.

* 1ml = 10µg N-NO3- ou 10 mg.L

-1


Solução de sulfato de cobre 2% (CuSO4): dissolver 10g de CuSO4 p.a

em aproximadamente 300ml de água destilada. Aferir com água destilada

para 500ml, em balão volumétrico.

* Armazenar em frasco âmbar e acondicionar em ambiente seco.

Solução estoque de NH4Cl – EDTA: dissolver 13g de cloreto de amônio

(NH4Cl p.a) e 1,7g de EDTA (p.a) em aproximadamente 800ml de água

destilada. Aferir com água destilada para 1000ml, em balão volumétrico.

* Verificar o pH da solução e, se necessário, ajustar para pH 8,5.

* Armazenar em frasco âmbar e acondicionar em ambiente refrigerado (4ºC).


Solução diluída de NH4Cl – EDTA: diluir 300ml da solução estoque de

NH4Cl – EDTA para 500ml (volume final), com água destilada, em balão

volumétrico. Solução estoque de NH4Cl – EDTA



Solução reativa para N-NO2-: ver POP-07, item 1 (N-NO2

-).


65





- Partindo-se da solução intermediária padrão preparar, em balões volumétricos

de 50ml, a seguinte curva de calibração (volume final com água destilada):

Concentração N-NO3- (µg.L-1) Volume N-NO3

- (ml) 0 (branco) -

50 0,25 100 0,5 300 1,5 500 2,5 800 4,0

*Para uma melhor confiabilidade e verificação da linearidade da curva de calibração, esta pode ser

preparada em duplicata ou triplicata.

NOTA: após adição do volume respectivo ao padrão apresentando na tabela

acima, adicionar, em cada padrão, 10ml da solução diluída de NH4Cl – EDTA e,

posteriormente, aferir com água destilada;

Após o preparo das soluções padrões e suas respectivas concentrações,

seguir para a próxima etapa: processo de ativação da coluna de Cd-Cu,

descrito na sequência:

1. Passar pela coluna de Cd-Cu uma alíquota de 20 – 25ml de solução de

sulfato de cobre 2%;

2. Na sequência, passar uma alíquota de 50ml da solução diluída de NH4Cl

– EDTA;

3. Após a solução de NH4Cl – EDTA, lavar a coluna com alíquotas de 25 ml

de água destilada;

4. Retirar uma alíquota de 5ml da coluna ( utilizar um tubo de centrífuga

aferido) e adicionar 0,4ml da solução reativa para N-NO2-. Verificar a presença ou

não da coloração púrpura (desenvolvimento da cor indica a presença de N-NO2-);

5. Na presença de cor, lavar a coluna novamente com alíquotas de 25ml de

água destilada e realizar novo teste para verificar a limpeza da coluna;


66

0 200 400 600 8000,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

Ab

so

rvâ

ncia

N-NO3- (g.L

-1)

Eq.Reta: Conc=(Abs-0,02655)/0,00234

R = 0,99959 / n = 10

0 200 400 600 8000,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Ab

so

rvâ

ncia

N-NO3- (g.L

-1)






(a) (b)

Após ativação da coluna de Cd-Cu, seguir as etapas para a calibração do

método, descrito na seqüência (considerando soluções padrões preparadas para

volume final de 50ml):

6. Passar o primeiro padrão pela coluna. Descartar, aproximadamente, os

primeiros 40ml da solução;

7. Coletar, em um tubo de centrífuga aferido (15ml), os próximos 5ml e

transferir para um frasco secundário;

8. Nesta alíquota de 5ml, adicionar 0,4ml da solução reativa para N-NO2-

dentro de no máximo 10min;


de 2h;

10. Realizar o mesmo procedimento para as próximas soluções padrões

preparadas;

11. Passar pela coluna de Cd-Cu provas em branco, seguindo o modo de

preparo para os padrões, porém, utilizando apenas água destilada;

12. Equação da reta, obtida com a plotagem do gráfico: absorvância (eixo

y) X concentração (eixo x);


14. Realizar comparação com a curva de analítica apresentada na Figura

6a;

Figura 6. (a) Exemplo de curva analítica de KNO3 aplicada à calibração do método

colorimétrico para determinação de N-Nitrato (N-NO3-) em amostras de água e efluentes

líquidos e (b) Exemplo comparativo de cinco calibrações preparadas em diferentes

períodos (jul/09 – fev/10) para análise de N-NO3-.


67

ATENÇÃO: a leitura das soluções padrões deve manter durante a passagem pela coluna de Cd-

Cu a mesma vazão (7 - 10 mL.min-1

), assim como as amostras a serem quantificadas

posteriormente. Isto se deve ao fato de vazões diferentes ocasionarem alterações na sensibilidade

da coluna, podendo ocasionar alterações na detecção de padrões e amostras.

- A verificação da sensibilidade da coluna de Cd-Cu pode ser realizada da seguinte

maneira: caso você tenha utilizado a mesma solução reativa para N-NO2-, tanto na

calibração de N-NO2- como de N-NO3

-, compare os resultados obtidos para a absorvância

do último padrão de N-NO2- e o primeiro padrão de N-NO3

- (dados a partir das tabelas de

calibração deste manual, indicam a mesma concentração para ambos).

- Considerando a absorvância de N-NO2- (último padrão) igual a 100%, verificar a relação

com o valor encontrado para N-NO3-. Considerando como exemplo, a calibração padrão

para N-NO2- e N-NO3

- presente neste manual, a partir dos dados de absorvância, verifica-

se uma sensibilidade de, aproximadamente 95%, ou seja, indica uma boa eficiência da

coluna de Cd-Cu na redução de N-NO3- para N-NO2

-.

2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE N-NO3- EM AMOSTRAS

1. Primeiramente, verificar ativação da coluna de Cd-Cu. Caso, anteriormente

à quantificação das amostras, tenha sido preparado uma calibração

padrão, a coluna não precisa ser ativada novamente;




5. A partir da fração dissolvida, transferir, com o auxílio de uma pipeta

volumétrica, 5ml da amostra (triplicata) para balão volumétrico de 50ml;

6. Adicionar 10ml da solução diluída de NH4Cl – EDTA;

7. Aferir o balão volumétrico com água destilada;

ATENÇÃO: seguindo este procedimento acima, você estará realizando uma diluição de 10 vezes

de sua amostra, a qual deve ser utilizada posteriormente para correção do valor encontrado

através da curva de calibração. Considerando que uma diluição de 10 vezes pode estourar a

calibração do método ou ficar abaixo da detecção do mesmo, verificar nova diluição para

quantificação de N-NO3-

na amostra, como os exemplos a seguir: 25ml de amostra + 10ml de

solução diluída de NH4Cl - EDTA para volume final de 50ml (diluição de 2 vezes); 1ml de amostra

+ 10ml de solução diluída de NH4Cl - EDTA para volume final de 50ml (diluição de 50 vezes).


68

8. Dando continuidade ao procedimento analítico, após diluição da amostra,

passar pela coluna de Cd-Cu;

9. Descartar, aproximadamente, os primeiros 40ml da amostra;



11. Nesta alíquota de 5ml, adicionar 0,4ml da solução reativa para N-NO2-;


de 2h;

13. O mesmo procedimento deve ser realizado para as réplicas da amostra e

para outras amostras;

14. Após a passagem da amostra, seguir o mesmo procedimento para

realização de testes em branco, utilizando água destilada;


Quantificação da concentração de N-NO3- (mg.L-1 ou µg.L-1) através da

equação da reta, obtida na curva analítica (calibração). É importante ressaltar que

o resultado analisado para N-NO2- deve ser descontando do valor obtido.


O método para quantificação de N-NO3- é aplicável para leitura na faixa de

concentração entre 10 e 1000 µg.L-1. Para concentrações superiores, sugere-se a

diluição da mesma e, posteriormente, quantificação através do fator de diluição

fdiluição utilizado.


Da mesma forma que apresentado na análise de nitrito, o resíduo da

análise de nitrato deve primeiramente ser neutralizado para descarte em pia.

3. REFERÊNCIA

Adaptação de STANDARD METHODS, method 4500- NO3

- E (Apha, 1998)


69

(+)

) N

H H

H

H + OCl- H2NCl + OH-

H2NCl + OH Na2[Fe(CN)5NO]·2H2O

Meio básico O NCl

Na2[Fe(CN)5NO]·2H2O

Meio básico

+ O NCl OH Na2[Fe(CN)5NO]·2H2O

Meio básico Ausência de luz

O N

OH

Azul de indofenol

POP 09 – SÉRIE DE NITROGÊNIO – NITROGÊNIO

AMONIACAL TOTAL (NH3 + NH4+)


1.1. MÉTODO MODIFICADO DO FENATO / AZUL DE INDOFENOL

A presença de um composto de intensa coloração azul-esverdeado

característica, azul de indofenol, é formada através da reação entre a

concentração de N-NH3 presente na amostra, hipoclorito de sódio e fenol em meio

básico, tendo o nitroprussiato de sódio como catalisador da reação, conforme

esquema abaixo:

Figura 7. Esquema explicativo das etapas de reação de Berthelot (1859), utilizada como

metodologia analítica na quantificação de N-Amoniacal em amostras de água e de

efluentes líquidos.



Bomba de vácuo



Espectrofotômetro UV-VIS



70

Papel parafilm®

Vidrarias


Balão volumétrico de 500 ml

Pipetas volumétricas e graduadas

Cubeta de vidro



Solução estoque padrão de NH4Cl: dissolver 0,3819g de cloreto de

amônio (NH4Cl p.a), previamente seco em estufa (100ºC/2h), em

aproximadamente 80ml de água destilada. Aferir com água destilada para

100ml, em balão volumétrico.


* Estável por 1 mês após o preparo.

* 1ml = 1mg N ou 1ml = 1,22 mg NH3.

Solução intermediária padrão de N-NH3: diluir 5ml da solução estoque

padrão em água destilada. Aferir com água destilada para 50ml (diluição de

10x), em balão volumétrico.

* Concentração final de 100 mg N.L-1

* Preparo deve ser realizado para uso imediato.

Solução de hipoclorito de sódio: solução comercial 2,5%.

Verificar reposição desta solução a cada 6 meses, devido à decomposição após abertura

do frasco.

* Transfira a solução para um frasco âmbar para acondicionamento em ambiente refrigerado

(4ºC).

Solução reativa 1 (Hipoclorito alcalino): adicionar 20ml de hipoclorito de

sódio 2,5% em 80ml de água destilada e deionizada. Na sequência,

adicionar 5g de NaOH p.a. Dissolver e aferir com água destilada para 100

ml, em balão volumétrico.

* Armazenar em frasco âmbar e acondicionar em ambiente refrigerado (<4ºC).



71

Solução reativa 2 (Fenol + Nitroprussiato de sódio): dissolver 10g de

fenol (p.a) e 0,1g de nitroprussiato de sódio (p.a) em, aproximadamente,

80ml de água destilada. Dissolver e aferir com água destilada para 100ml,




* ATENÇÃO: durante o preparo, utilize luvas e óculos de proteção e sempre que for manusear o

fenol (reagente ou solução para N-NH3), trabalhar SEMPRE em capela com ventilação / exaustão;

O fenol é altamente cancerígeno e todos os procedimentos de segurança devem ser adotados na

hora do uso.





1. Partindo-se da solução intermediária padrão preparar, em balões

volumétricos de 50ml, a seguinte curva de calibração (volume final com água

destilada):

Concentração N-NH3 (µg.L-1) Volume N-NH3 (ml)

0 (branco) - 200 0,1 400 0,2 800 0,4 1200 0,6 2000 1,0








4. Adicionar nesta ordem: 1ml da solução reativa 1 seguido de 1ml da

solução reativa 2;


72

0 300 600 900 1200 1500 1800 21000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Ab

so

rvâ

ncia

N-NH3 (g.L

-1)

Eq.Reta: Conc=(Abs-0,02894)/4,74999E-4

R = 0,99757 / n = 10

0 500 1000 1500 2000 25000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Ab

so

rvâ

ncia

N-NH3 (g.L

-1)

Calibração 1

Calibração 2

Calibração 3

Calibração 4

Calibração 5

(a) (b)

5. Fechar o frasco com papel Parafilm® e misturar por inversão;

6. Aguardar 10 minutos para desenvolvimento e estabilização da cor;

7. Leitura em espectrofotômetro ( = 630nm). Tempo máximo para leitura

de 24h;




10. Realizar comparação com a curva de analítica apresentada na Figura

8a;

Figura 8. (a) Exemplo de curva analítica de NH4Cl aplicada a calibração do método

colorimétrico para determinação de N-Amoniacal (N-NH3) em amostras de água e

efluentes líquidos e (b) Exemplo comparativo de cinco calibrações preparadas em

diferentes períodos (jul/09 – fev/10) para análise de N-NH3.

2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE N-NH3 / NH4+ EM

AMOSTRAS







73



6. Adicionar nesta ordem: 1ml da solução reativa 1 seguido de 1ml da

solução reativa 2, para cada alíquota (amostra ou branco);

7. Fechar o frasco com papel Parafilm® e misturar por inversão;

8. Aguardar 10min para desenvolvimento e estabilização da cor;


de 24h;

ATENÇÃO: o método do fenato para quantificação de N-NH3 acaba por gerar um resíduo

composto, principalmente, por fenol, devido à existência deste reagente nas etapas de reação do

método. Assim, todo e qualquer material líquido gerado por este método devem ser armazenados

em frascos próprios para o resíduo de fenol / N-NH3 (FRASCOS DE VIDRO PARA DESCARTE).


Quantificação da concentração de N-NH3 / NH4+ (mg.L-1 ou µg.L-1) através

da equação da reta, obtida na curva analítica (calibração).


O método para quantificação de N-NH3 /NH4+ é aplicável para leitura na

faixa de concentração entre 10 e 2000 µg.L-1. Para concentrações superiores,

sugere-se a diluição da mesma e, posteriormente, quantificação através do fator

de diluição fdiluição utilizado.


O método proposto no presente manual para análise de nitrogênio

amoniacal utiliza fenol nas etapas de quantificação da amostra. Dessa forma, o

resíduo gerado deve ser, exclusivamente, armazenado em frascos de vidro (≥

1litro). Quando houver um acúmulo excessivo em laboratório deve-se solicitar na

Prefeitura da Cidade Universitária um encaminhamento para transporte e

destinação final no aterro industrial da Essencis.


74

3. REFERÊNCIAS

WEATHERBURN. Phenol-hypochlorite reaction for determination of ammonia. Anal.

Chem, Vol.8, pp. 130-132, 1962.

Adaptação de STANDARD METHODS, method 4500-NH3 F (Apha, 1998)


75

N

O O (-)

O

(-)

(+) N

O O (-) (-)

Cd-Cu

Cd0Cd

2+

NT

K2S2O8 / NaOH

t = 30min T = 120ºC;

N

O O (-)

O

(-)

(+)

POP 10 – SÉRIE DE NITROGÊNIO – NITROGÊNIO TOTAL

(NT)


1.1. MÉTODO DA DIGESTÃO POR PERSULFATO DE POTÁSSIO

Quantificação de NT através de uma oxidação alcalina em autoclave (25min

/ 14kg.cm-1) na faixa de temperatura entre 110 - 125ºC, para conversão de todas

as formas de nitrogênio presentes a N-NO3- e posterior redução pela coluna de

Cd-Cu para detecção na forma de N-NO2-, a exemplo do esquema abaixo:

Figura 9. Esquema explicativo das etapas da oxidação por persulfato das formas de

nitrogênio a N-Nitrato, redução de N-Nitrato para N-Nitrito através da coluna de Cd-Cu e

reação de Griess (1879), utilizada como metodologia analítica na quantificação de N-

Total em amostras de água e de efluentes líquidos.


Equipamentos


Autoclave vertical



76

Vidrarias

Frascos para digestão



Tubos de plástico para centrífuga, tipo Falcon (15ml)


Cubeta de vidro


Solução digestora: dissolver 2,01g de persulfato de potássio (K2S2O8 p.a

< 0,001% N), em aproximadamente 80ml de água destilada. Adicionar

0,300g de hidróxido de sódio (NaOH p.a) e dissolver novamente. Aferir com

água destilada para 100ml, em balão volumétrico.


Solução tampão de borato: dissolver 30,9g de ácido bórico (H3BO3 p.a)

em, aproximadamente, 300ml em água destilada. Adicionar 4g de hidróxido

de sódio (NaOH p.a) e dissolver novamente. Aferir com água destilada para

500 mL em balão volumétrico.


Solução de sulfato de cobre 2%: ver POP-08, item 1 (N-NO3-).

Solução estoque de NH4Cl – EDTA: ver POP-08, item 1 (N-NO3-).

Solução diluída de NH4Cl – EDTA: ver POP-08, item 1 (N-NO3-).

Solução reativa para N-NO2-: ver POP-07, item 1 (N-NO2

-).



A calibração do método é mesma utilizada para a determinação do nitrato

(ver POP-08).

2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE N-TOTAL EM AMOSTRAS


77


2. Transferir com o auxílio de uma pipeta volumétrica, 5ml da amostra

para tubos de ensaio com rosca para uso na autoclave;

3. Adicionar ao volume de amostra, 2,5ml da solução digestora;

4. Fechar bem os tubos para digestão e misturar por inversão;

5. Manter na autoclave, por um período de 25min após atingir a

temperatura de 120ºC e pressão de 14 kg.cm-2. Neste momento, mudar

a chave seletora de máximo para médio e controlar a possibilidade de

aumento no manômetro de controle. Neste caso, mudar a chave para

mínimo;

6. Após o término da digestão e resfriamento da autoclave, retirar os tubos

e aguardar que atinjam a temperatura ambiente;

7. Após esfriar, adicionar 1ml da solução tampão de borato e misturar por

inversão;

8. Transferir o volume presente no tubo de ensaio para um balão

volumétrico de 50ml;

9. Adicionar 10ml da solução de NH4Cl-EDTA diluída;

10. Aferir o balão volumétrico com água destilada;

11. Passar a amostra pela coluna de Cd-Cu (ver etapa de ativação da

coluna de Cd-Cu);

12. Descartar, aproximadamente, os primeiros 40ml;



14. Nesta alíquota de 5ml, adicionar 0,4ml da solução reativa para N-NO2-;


de 2h;

O mesmo procedimento deve ser realizado para as réplicas da amostra e

para outras amostras. Após a passagem da amostra, seguir o mesmo

procedimento para realização das provas em branco, utilizando água destilada.

ATENÇÃO: seguindo este procedimento acima, descrito para NT, você estará fazendo uma

diluição de 10 vezes da amostra, ou seja, foram tomados 5ml iniciais da amostra, passado pela

digestão e antes de passar pela coluna de Cd-Cu foi diluída para 50ml. Para este exemplo, o valor


78

obtido para a absorbância deve ser corrigido com um fator de diluição de 10 vezes, de modo a se

obter o valor da concentração real.


Quantificação da concentração de NT (mg.L-1 ou µg.L-1) através da equação

da reta, obtida na curva de calibração para N-NO3-.


O método para quantificação de NT é aplicável para leitura de

concentrações < 2,9 mg.L-1. Concentrações superiores ao limite podem ser

obtidas através da diluição da amostra e, posteriormente, quantificação através do

fator de diluição fdiluição.

ATENÇÃO: para este método, se a concentração de NT for superior ao limite de detecção,

a diluição da amostra deve ser realizada na etapa 2 deste procedimento. Ao adicionar os 5ml da

amostra, uma diluição de 5x, por exemplo, pode ser preparada a partir de 1ml da amostra e 4ml de

água destilada e, em seguida adição da solução digestora (etapa 3). Ainda, a diluição pode ser

feita separadamente, em balão volumétrico, e posteriormente o volume de 5ml retirado e

transferido para o tubo de digestão. Assim, se houver uma diluição prévia a etapa de digestão,

esta deve ser acrescida a diluição de 10x, aplicada a este procedimento e descrita acima, ou seja,

ambos os fatores de diluição são multiplicados para que a nova diluição seja obtida.


Idem procedimento apresentado para nitrito e nitrato.

3. REFERÊNCIA

Adaptação de STANDARD METHODS, method 4500- N C (Apha, 1998)


79

POP 11 – SÉRIE DE NITROGÊNIO – NITROGÊNIO

ORGÂNICO TOTAL (NOrgT)


Aplicando as metodologias descritas para a série de nitrogênio até o

presente momento, quantificamos o N-Orgânico da seguinte forma:

NOrgT = NT - ∑NINORG (12)

em que:

∑NINORG = [N-NH3] + [N-NO2-] + [N-NO3

-]


80

POP 12 – SÉRIE DE FÓSFORO – ORTOFOSFATO (PO43-)


1.1. MÉTODO DO ÁCIDO ASCÓRBICO

A reação entre molibdato de amônio e antimônio tartarato de potássio em

meio ácido (H2SO4) com ortofosfato, formam o ácido fosfomolibdico, que em

presença de ácido ascórbico é reduzido para fosfomolibdato, composto de

coloração azul intensa característica.



Bomba de vácuo





Vidrarias




Erlenmeyer


Cubeta de vidro



Solução padrão para fosfato (50 mg.L-1): dissolver 0,02195g de fosfato

de potássio monobásico anidro (KH2PO4 p.a) em, aproximadamente, 80ml


81

de água destilada. Aferir com água destilada para 100ml, em balão

volumétrico.



* Concentração final de 50 mg P.L-1

Solução de ácido sulfúrico 2,5 mol.L-1: adicionar lentamente 70ml de

H2SO4 (p.a) em, aproximadamente, 400ml de água destilada. Aferir com

água destilada para 500ml, em balão volumétrico.

* Armazenar em frascos de vidro normal para reagente, em temperatura ambiente.


Solução de tartarato de antimônio e potássio: dissolver 0,6858g de

tartarato de antimônio e potássio (p.a) em, aproximadamente, 200ml de

água destilada. Aferir com água destilada para 250ml, em balão

volumétrico.



Solução de molibdato de amônio: dissolver 10g de molibdato de amônio

(p.a) em, aproximadamente, 200ml de água destilada. Aferir com água

destilada para 250ml, em balão volumétrico.



Solução de ácido ascórbico: dissolver 1,76g de ácido ascórbico (p.a) em,

aproximadamente, 80ml de água destilada. Aferir com água destilada para

100ml, em balão volumétrico.


* Estável por 1 semana (máximo).

Solução reativa combinada (Mix): adicionar com o auxílio de pipetas

volumétricas e/ou graduadas os seguintes reagentes, na ordem e

proporção de volume: 50ml de H2SO4 2,5 mol.L-1 + 5ml de tartarato de

antimônio e potássio + 15ml de molibdato de amônio + 30ml de ácido

ascórbico (volume final de 100ml).

* Antes de promover a misturar, aguardar os reagentes armazenados em refrigerador atingir a

temperatura ambiente.

* Estável por 4 horas após o preparo.


82

- A cada adição de um reagente, promover a homogeneização da solução.

- Ao final, na adição do ácido ascórbico, uma coloração amarelada bem clara

aparecerá, sendo um indicativo que os reagentes do Mix foram bem preparados,

sem influência de contaminação por fósforo no material utilizado.

- No caso da solução Mix ficar com coloração esverdeada e azulada, indica

contaminação por fósforo, embora possa ser utilizada devido à correção pelo

branco a ser realizado com água destilada;





1. A partir da solução padrão (50 mg P.L-1) preparar, em balões

volumétricos de 50ml, a seguinte curva de calibração (volume final com água

destilada):

Concentração P-PO4-3 (µg.L-1) Volume P-PO4

-3 (ml) 0 (branco) -

100 0,1 300 0,3 500 0,5 900 0,9 1500 1,5








4. Adicionar 2ml da solução reativa combinada (MIX) para ortofosfato em

cada alíquota;


83

0 200 400 600 800 10000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

A

bsorv

ância

P-PO4

3- g.L-1

)

Eq.Reta: Conc=(Abs+0,00509)/5,7998E-4

R = 0,99967 / n = 12

0 250 500 750 1000 1250 15000,0

0,3

0,6

0,9

P-PO4

3- g.L-1

)






Calibração 6 (R= 0,9968) A

bsorv

ância

(a) (b)

5. Fechar o frasco e misturar por inversão;

6. Aguardar 10min para o desenvolvimento e estabilidade da cor;


de 45min;




10. Realizar comparação com a curva analítica apresentada na Figura 10;

Figura 10. (a) Exemplo de curva analítica de KH2PO4 aplicada à calibração do método

colorimétrico para determinação de Ortofosfato (PO43-) em amostras de água e efluentes

líquidos e (b) Exemplo comparativo de seis calibrações preparadas em diferentes

períodos (jul/09 – fev/10) para análise de PO43-.

2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PO43- EM AMOSTRAS


2. Transferir 50ml de amostra para o sistema de filtragem a vácuo;







84

6. Adicionar 2ml da solução reativa combinada (Mix) em cada alíquota;




de 45min;


Quantificação da concentração de PO43- (mg.L-1 ou µg.L-1) através da

equação da reta, obtida na curva analítica (calibração).


O método para quantificação de ortofosfato (PO43-) é aplicável para

concentrações < 1500 µg.L-1 com valor mínimo detectável de 5 µg.L-1.


A composição do resíduo de fósforo / ortofosfato é fortemente ácida, devido

ao uso de H2SO4 como parcela na mistura do reativo indicador combinado. Dessa

forma, o descarte pode ser realizado na pia, logo após a correção do pH para a

faixa de neutralidade.

O mesmo procedimento deve ser adotado nas análises de PT e PDT,

apresentados no POP-13, na sequência.

3. REFERÊNCIAS

MURPHY, J.; RILEY, J.P. A Modified Single Solution Method for the Determination of

Phosphate in Natural Water. Anal.Chim.Acta, Vol. 27, pp. 31-36, 1962

STANDARD METHODS, method 4500 - P E (Apha, 1998)


85

POP 13 – SÉRIE DE FÓSFORO – FÓSFORO TOTAL (PT)


1.1. MÉTODO DA DIGESTÃO ALCALINA (K2S2O8 / NaOH) & MÉTODO DO

ÁCIDO ASCÓRBICO

Quantificação de PT através de digestão alcalina utilizando persulfato de

potássio em autoclave (125ºC / 14kg.cm-1 / 25min) para conversão de todas as

formas de fósforo presentes para ortofosfato (PO43-) e posterior quantificação

segundo o método do ácido ascórbico.



Bomba de vácuo e membranas de acetato de celulose (Ø 0,45µm)


Autoclave vertical



Vidrarias

Frascos para digestão (vidro)

Balão volumétrico de 100ml, 250ml e 500ml

Erlenmeyer


Cubeta de vidro


Solução digestora alcalina: dissolver 2,01g de persulfato de potássio

(K2S2O8 p.a < 0,001% N), em aproximadamente 80ml de água destilada

Adicionar 0,300g de hidróxido de sódio (NaOH p.a) e dissolver novamente.

Aferir com água destilada para 100ml, em balão volumétrico.



86

Solução reativa combinada (Mix): ver POP-12, item 1 (PO43-).

Solução padrão para fosfato (50 mg.L-1): ver POP-12, item 1 (PO43-).

Solução tampão de borato: dissolver 30,9g de ácido bórico (H3BO3 p.a)

em, aproximadamente, 300ml em água destilada. Adicionar 4g de hidróxido

de sódio (NaOH p.a) e dissolver novamente. Aferir com água destilada para

500 mL em balão volumétrico.






1. A partir da solução padrão (50 mg P.L-1) (ver POP-12, item 1) preparar,

em balões volumétricos de 50ml a seguinte curva de calibração (volume final com

água destilada):

Concentração P-PO4-3 (µg.L-1) Volume P-PO4

-3 (ml) 0 (branco) -

100 0,1 300 0,3 500 0,5 900 0,9 1500 1,5



2. A partir das soluções padrões preparadas, retirar com o auxílio de uma

pipeta volumétrica, alíquotas de 5ml e transferir para os tubos de ensaio com

rosca para uso em autoclave;



4. Adicionar a cada tubo, 2,5ml da solução digestora alcalina;

5. Fechar bem os tubos para digestão e misturar por inversão no mínimo

duas vezes;


87

0 50 100 150 200 250 3000,00

0,06

0,12

0,18

Eq.Reta: Conc=(Abs+0,00166)/5,61129E-4

R = 0,99982 / n = 10

Absorv

ância

P-PO4

3- g.L-1

)

0 250 500 750 1000 1250 15000,0

0,3

0,6

0,9

Calibração PO4

3- (0 - 1500 g.L

-1)

Calibração PT- digestão (0 - 300 g.L

-1)

P-PO4

3- g.L-1

)

Absorv

ância

Padrão P5 (PT) diluído 5 vezes após digestão / tamponamento.

Comparativo com o padrão P2 de PO4

3-


temperatura de 120ºC e pressão de 14 kg.cm-2. Neste momento, mudar a chave

seletora de máximo para médio e controlar a possibilidade de aumento no

manômetro de controle. Neste caso, mudar a chave para mínimo;




inversão.

9. Transferir a solução para um balão volumétrico de 25ml e aferir com

água destilada;

10. Retirar uma alíquota de 10ml e reservar em outro frasco;

11. Adicionar a esta alíquota 2ml da solução reativa combinada (Mix).

Repetir o mesmo procedimento para os demais padrões e réplicas;




de 45min;

15. Equação da reta obtida com a plotagem do gráfico: absorbância (eixo y)



17. Realizar comparação com a curva analítica apresentada na Figura 11a:

Figura 11. (a) Exemplo de curva analítica de KH2PO4 aplicada à calibração do método de

digestão / colorimétrico para determinação de Fosfato Total (PT) em amostras de água e

(a) (b)


88

de efluentes líquidos e (b) Exemplo comparativo entre a calibração para PO43-, com

ausência da etapa de digestão, e calibração para PT com presença da etapa de digestão /

neutralização.

ATENÇÃO: verifique a seguinte etapa da metodologia: ao adicionar 5ml do padrão para digestão

e após a neutralização, ter aferido para 25ml, você realizou uma diluição de 5 vezes, ou seja, o

padrão deve estar, teoricamente, 5 vezes mais diluído que o valor encontrado para a curva de

calibração de Ortofosfato (POP nº. 12). Um exemplo pode ser observado na Figura 11b.

2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PT EM AMOSTRAS


2. Com o auxílio de uma pipeta volumétrica, transferir 5ml da amostra para

tubos de ensaio com rosca, para digestão;



4. Adicionar a cada tubo, 2,5ml da solução digestora alcalina;

5. Fechar bem os tubos para digestão e misturar por inversão;


temperatura de 120ºC e pressão de 14 kg.cm-2. Neste momento, mudar

a chave seletora de máximo para médio e controlar a possibilidade de

aumento no manômetro de controle. Neste caso, mudar a chave para

mínimo;




inversão;

9. No mesmo frasco, adicionar 1,5ml de água destilada e misturar por

inversão;

ATENÇÃO: verifique a seguinte etapa da metodologia: ao adicionar 5ml do padrão para digestão

e após a adição dos reagentes seguintes (solução digestora, solução tampão e água), a amostra

foi diluída, neste caso, 2x, fator este que deve ser utilizado na correção da concentração de PT

quantificada.

10. Adicionar a esta alíquota 2ml da solução reativa combinada (Mix).

Repetir o mesmo procedimento para as demais amostras e réplicas;



89



de 45min;


Quantificação da concentração de PT (mg.L-1 ou µg.L-1) através da equação

da reta, obtida na curva analítica (calibração) para PT.


O método para quantificação de PT está relacionado com o método

utilizado na quantificação de ortofosfato (PO43-). Assim, segue a faixa de leitura

descrita para ortofosfato: quantificação para concentrações < 1500 µg.L-1 com

valor mínimo detectável de 5 µg.L-1.

3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FÓSFORO TOTAL

DISSOLVIDO (PTD) EM AMOSTRAS

A quantificação de fosfato total na fração dissolvida (PTD) pode ser

realizada seguindo a metodologia descrita para fosfato total (PT). Entretanto, a

única diferença é uma etapa adicional de pré tratamento da amostra:

A amostra deve, primeiramente, ser filtrada em membrana de acetato de

celulose Ø 0,45µm para obtenção da fração dissolvida e, na sequência, seguir o

método da digestão alcalina (fechada).

4. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FÓSFORO TOTAL

PARTICULADO (PTP) EM AMOSTRAS

4.1. MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO


90

A quantificação da concentração de fosfato total, presente na fração

particulada (PTP) pode ser obtida a partir da subtração da concentração de fosfato

total dissolvido (PTD) pela concentração encontrada para fosfato total (PT):

PTP = PT – PTD (13)

5. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FÓSFORO ORGÂNICO

DISSOLVIDO / SOLÚVEL (POrgD) EM AMOSTRAS

5.1. MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO

A quantificação da concentração do fósforo orgânico dissolvido (PORG),

presente na amostra pode ser obtida a partir da subtração da concentração de

ortofosfato (PO43-), POP Nº. 12 pelo resultado encontrado para a concentração de

fosfato total dissolvido (PTD):

POrgD = PTD – PO4-3 (14)

6. REFERÊNCIAS

MURPHY, J.; RILEY, J.P. A Modified Single Solution Method for the Determination of

Phosphate in Natural Water. Anal.Chim.Acta, Vol. 27, pp. 31-36, 1962

STANDARD METHODS, method 4500 - P E (Apha, 1998)


91

POP 14 – CLOROFILA-a (CLa)


1.1. MÉTODO DA EXTRAÇÃO COM ACETONA 90%

Quantificação de clorofila-a por meio da extração com acetona 90% e

determinação da concentração pela absorvância medida em espectrofotômetro

UV-Vis.



Bomba de vácuo

Membranas de fibra de vidro (Ø 0,45µm)


Tubos para centrífuga graduados com tampa

Gral e pistilo de porcelana

Micropipeta (100 – 1000l)

Centrífuga


Vidrarias


Cubeta de vidro


Solução saturada de carbonato de magnésio: adicione 1,0g de

carbonato de magnésio e dissolva em 100ml de água destilada.

* Armazenar em frasco âmbar e acondicionar a temperatura ambiente.



92

Solução de acetona 9:1: misture 90 partes de solução de acetona

(CH3(CO)CH3) com 10 partes de solução saturada de carbonato de

magnésio.



Solução de HCl 0,1 mol.L-1: adicionar 8,5ml de ácido clorídrico (HCl

p.a) em, aproximadamente, 800ml de água destilada. Aferir para 1000ml





2.1. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CLa EM AMOSTRAS

1. Homogeneizar bem a amostra presente no frasco de coleta, pelo

menos 10 vezes, fazendo movimento em forma de 8;

2. Após homogeneização da amostra, filtrar em membrana de fibra

de vidro até a saturação da membrana e anotar o volume filtrado;

3. Retirar o filtro e armazená-lo em envelope de papel laminado

identificado. A membrana pode ser congelada por um período de

até 60 dias. A análise para determinação pode ser prosseguida

após a filtração ou posteriormente ao descongelamento da

membrana;

4. Na sequência, a membrana dever ser colocada em um tubo de

centrífuga graduado e, com auxílio de um bastão de vidro,

macere o filtro até que a membrana se desmanche por completo,

adicionando aos poucos os 10ml da solução saturada de acetona;

5. Centrifugar a 4000rpm por 10min. Envolver os tubos, com papel

laminado identificado (ausência de luminosidade) e manter as

amostras armazenadas sob refrigeração (4ºC) por um período de

24h;


93

6. Após este período proceder à leitura do sobrenadante em

espectrofotômetro UV-Vis, de acordo com a seguinte ordem:

LEITURA 1: com a amostra simples, no comprimento de onda

de 664nm e 750nm, para eliminar a interferência de outros

compostos;

LEITURA 2: adicionar na mesma amostra, diretamente na

cubeta, 300l (6 gotas) de HCl 0,1 mol.L-1. Tampar a cubeta e

misturar por inversão (1 vez). Após 3min da adição do HCl,

realizar novamente a leitura para os comprimentos de onda de

665nm e 750nm;


Os valores das concentrações de clorofila-a são obtidos por meio da

seguinte equação:

3 26,7 [664 665 ] 1( / )

2

b ax xVCLa mg m

V xL

(15)

em que:

664b: subtração do sinal obtido em 664nm e 750nm

665a: subtração do sinal obtido em 665nm e 750nm (densidade óptica

após a acidificação)

V1: volume do extrato (acetona, 10ml)

V2: volume filtrado da amostra (L)

L: caminho ótico da cubeta (1cm)

3. REFERÊNCIA

Adaptado de STANDARD METHODS (Apha, 1998)


94

POP 15 – METAIS PESADOS (Cd, Cr, Cu, Ni, Zn, Pb)


1.1. ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA DE CHAMA (EAA-

Chama) / PRÉ CONCENTRAÇÃO DA AMOSTRA (10x)



Espectrômetro de absorção atômica de chama (EAA-Chama)



Frasco plástico (PEAD, PP) para soluções padrões (50ml) e tubos de

centrífuga Falcon (15ml) para as amostras

Bomba de vácuo


Chapa de aquecimento

Água ultra pura (mili-Q)

Vidrarias

Balões volumétricos de 100ml

Becker de 50ml


Erlenmeyers de 50ml


Ácido Nítrico concentrado 65% ultra puro (HNO3 p.a 65%)

H2O2 30%

Ácido Nítrico 1:1: adicione, lentamente, 500ml de ácido nítrico

concentrado (HNO3 p.a 65%), com auxílio de pipetas volumétricas de

100ml em 500ml de água destilada e deionizada.

*Armazenar em frasco âmbar e acondicionar a temperatura ambiente.


95


Ácido Clorídrico 1:1: adicione, lentamente, 500ml de ácido clorídrico

concentrado (HCl p.a), com auxílio de pipetas volumétrica de 100ml em

500ml de água destilada e deionizada.

*Armazenar em frasco âmbar e acondicionar a temperatura ambiente.




Cada metal a ser quantificado no espectrômetro de absorção atômica

necessita de soluções padrões, preparadas em uma determinada faixa de

concentração do metal para que, antes da leitura das amostras, o equipamento

seja devidamente calibrado e retorne uma resposta adequada frente à

sensibilidade do aparelho para o determinado metal a ser analisado.

Na sequência, são apresentados os procedimentos para o preparo das

soluções padrões para os metais Cd, Cr, Cu, Ni, Zn e Pb.

2.1.1. PREPARO DAS SOLUÇÕES PADRÕES DE METAIS

Os padrões de metais consistem na preparação de cinco soluções de

concentração conhecida, sendo que para cada uma todos os metais (Cd, Cr,

Cu, Ni, Zn e Pb) estão presentes. Por exemplo: o padrão 1 deve conter

igualmente 1 mg.L-1 para Cd, Cr, Cu, Ni, Zn e 2 mg.L-1 para Pb. Retomando, é

necessário adicionar igualmente o mesmo volume para cada metal, ou seja,

6ml totalizando 36ml de solução padrão. Para tal, se deve calcular a

concentração de cada metal que seja 6 vezes superior a concentração final,

visto que, considerando os 6 metais em análise estes devem ser diluídos por

igual. Na Tabela 2 são apresentados os cálculos e procedimento para o

preparo das soluções padrões:


96

Tabela 2 – Procedimento para o preparo das soluções padrões dos metais Cd, Cu, Cr, Ni, Zn e Pb, utilizados na etapa de calibração.

METAL Padrão

estoque* (mg.L

-1)

P.I. (mg.L

-1)

P.I. (preparo)

Pd-5*** (mg.L

-1)

Pd-5 (preparo)

Pd-1 (mg.L

-1)

Pd-1 (preparo)****

Pd-2 (mg.L

-1)

Pd-2 (preparo)

Pd-3 (mg.L

-1)

Pd-3 (preparo)

Pd-4 (mg.L

-1)

Pd-4 (preparo)

Cd 1000 30

3ml padrão estoque +

97ml HNO3 (2%)** →

100ml (balão

volumétrico)

5 6ml P.I 1 1,2ml P.I. + 4,8ml HNO3

(2%) 2

2,4ml P.I. + 3,6ml HNO3

(2%)

3

3,6ml P.I. + 2,4ml HNO3

(2%)

4

4,8ml P.I. + 1,2ml HNO3 (2%)

Cu 1000 30 5 6ml P.I 1 1,2ml P.I. + 4,8ml HNO3

(2%) 2

2,4ml P.I. + 3,6ml HNO3 (2%)

3

3,6ml P.I. + 2,4ml HNO3 (2%)

4

4,8ml P.I. + 1,2ml HNO3 (2%)

Cr 1000 30 5 6ml P.I 1 1,2ml PI +

4,8ml HNO3 (2%)

2

2,4ml P.I. + 3,6ml HNO3

(2%)

3

3,6ml P.I. + 2,4ml HNO3 (2%)

4

4,8ml P.I. + 1,2ml HNO3 (2%)

Ni 1000 30 5 6ml P.I 1 1,2ml P.I. + 4,8ml HNO3

(2%) 2

2,4ml P.I. + 3,6ml HNO3 (2%)

3

3,6ml P.I. + 2,4ml HNO3 (2%)

4

4,8ml P.I. + 1,2ml HNO3 (2%)

Zn 1000 30 5 6ml P.I 1 1,2ml P.I. + 4,8ml HNO3

(2%) 2

2,4ml P.I. + 3,6ml HNO3 (2%)

3

3,6ml P.I. + 2,4ml HNO3 (2%)

4

4,8ml P.I. + 1,2ml HNO3 (2%)

Pb 1000 60

6ml padrão estoque +

97ml HNO3

(2%) → 100ml (balão

volumétrico)

10 6ml P.I 2 1,2ml P.I. + 4,8ml HNO3

(2%) 4

2,4ml P.I. + 3,6ml HNO3

(2%)

6

3,6ml P.I. + 2,4ml HNO3 (2%)

8

4,8ml P.I. + 1,2ml HNO3

(2%)

Volume final (ml)#

36

36

36

36

36


97

*Padrão certificado, de concentração conhecida. **HNO3 (2%): diluir, em balão volumétrico, 20ml de HNO3 65% em 980ml de água ultra pura. ***Pd: identificação dos padrões na tabela – Pd-5 (padrão 5), Pd-1 (padrão 1)... ****Os padrões Pd-1, Pd-2, Pd-3 e Pd-4 são preparados a partir de diluições de volumes conhecidos dos padrões intermediários (PI) em HNO3 (2%) para um volume final de 6ml . #Representa a soma do volume de solução adicionado para cada metal (6+6+6+6+6+6)ml.

2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE METAIS PESADOS NA

FRAÇÃO DISSOLVIDA - Pré concentração 10x

1. Homogeneizar bem o frasco contendo a amostra preservada com HNO3;



4. Transferir 50ml da amostra (dissolvida) com o auxílio de uma pipeta

volumétrica para o erlenmeyer (realizar o procedimento em duplicata ou

triplicata);

5. Adicionar 3ml de ácido nítrico concentrado (HNO3 p.a 65%);

6. Manter os erlenmeyers contendo as amostras em uma chapa de aquecimento

a uma temperatura entre 110 e 130ºC;

7. Manter evaporando a solução até volume inferior a 5ml. Evitar que a solução

evapore completamente;

8. Retirar da chapa e aguardar esfriar. (Mantenha os frascos sempre cobertos

de modo a evitar contaminação);

9. Transferir as amostras para tubos de centrífuga de 15ml e aferir o volume

para 5ml com água ultra pura;

10. Acondicionar em refrigerador (<4ºC) até o momento da leitura;

11. Realizar a quantificação em espectrômetro de absorção atômica de chama;

12. Caso o tempo para leitura seja superior a 30 dias, mantenha as amostras em

congelador;

2.3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE METAIS PESADOS NA

FRAÇÃO PARTICULADA - Pré concentração 15x

1. Homogeneizar bem o frasco contendo a amostra preservada com HNO3;



98

3. Filtrar em membrana de acetato de celulose Ø 0,45µm. Para cada membrana

utilizada, anotar o valor do seu respectivo peso (P1) e ponto ou réplica

correspondente;

4. Manter as membranas em ambiente livre de contaminação por metais

(temperatura ambiente) para secagem até peso constante (24h);

5. Realizar uma nova verificação do peso e anotar o valor observado (P2);

6. Em erlenmeyers de 50ml, colocar as membranas, seguido de 10ml de HNO3

1:1;

7. Juntamente, realizar brancos analíticos apenas com 5ml de água ultra pura e

10ml de HNO3 1:1 e seguir todos os passos seguintes das amostras;

8. Manter em chapa de aquecimento por um período de 45min, após atingir a


9. Retirar da chapa e aguardar o resfriamento dos frascos, mantendo-os na

capela de exaustão;

10. Adicionar 5ml de HNO3 concentrado (65% p.a) e retornar os frascos para a

chapa de aquecimento, na temperatura de 150ºC, por 2h ou redução do

volume próximo de 3ml;

11. Retirar da chapa e aguardar que os frascos atinjam a temperatura ambiente;

12. Adicionar 2ml de H2O2 (30%) e, novamente, manter sob aquecimento (150ºC);

13. Aguardar a completa efervescência da amostra. Se necessário adicionar

alíquotas de 5ml de água ultra pura, evitando a evaporação total da mesma;

14. Retirar da chapa e aguardar que os frascos atinjam a temperatura ambiente.

Na sequência, adicionar 10ml de HCl 1:1 e retornar para a chapa, mantendo a

uma temperatura de 180ºC por um período de 1h;

15. Verificar um volume aproximado, abaixo de 5ml e retirar os mesmos da

chapa. Manter na capela de exaustão até que atinjam a temperatura

ambiente;

16. Transferir a amostra para o tubo de centrífuga, aferindo com água ultra pura

no volume de 10ml;

17. Centrifugar as amostras para remoção de particulados residuais do

sobrenadante;

18. Acondicionar em refrigerador (<4ºC) até o momento da leitura;

19. Realizar a quantificação em espectrômetro de absorção atômica de chama;


99

20. Caso o tempo para leitura seja superior a 30 dias, mantenha as amostras em

congelador;


Os resultados da concentração (g.mL-1 ou mg.L-1) são calculados

diretamente pelo software do equipamento, uma vez que antes da leitura das

amostras para cada metal é necessário a calibração com as soluções padrões para

ver a resposta e sensibilidade do aparelho. Ainda, seguindo este procedimento, os

resultados devem ser corrigidos, visto que a amostra foi concentrada 10x (fração

dissolvida) e 15x (fração particulada) para quantificação. Para as amostras da fração

particulada, os resultados também podem ser obtidos em peso seco (ex.: g.g-1)

visto que a quantidade de sólidos pode ser determinada pela diferença do peso da

membrana (g) antes e após a filtração e o respectivo volume filtrado (ml).


Os valores de limite de detecção devem ser obtidos juntamente com a leitura

das amostras. Para tal, você deve separar para cada metal, oito alíquotas de água

mili-Q para serem lidas antes das amostras. O cálculo é feito segundo a fórmula: LD

= k.sb/m onde k é o fator de confiança superior (2 ou 3, sendo que o primeiro

apresenta um nível de 92,1% de confiança e o segundo 98%) ao desvio padrão (sb)

das oito réplicas de água mili-Q e a variável m responde quanto à sensibilidade da

calibração (inclinação da curva de calibração para cada metal).


Para metais, o resíduo necessita de um ajuste de pH prévio, visto que o

procedimento de análise adotado neste manual, tem na etapa ou alíquota final um

meio extremamente ácido, na presença de HNO3. Após a correção do pH, o resíduo

pode ser descartado pela pia. A concentração de metais, inicialmente, não é

considerada, embora, apresente valores inicialmente baixos.


100

4. REFERÊNCIAS

Method 3050B. Acid Digestion of Sediments, Sludges and Soils. EPA, revision 2, 1996

STANDARD METHODS (Apha, 1998)


101

POP 16 – ALCALINIDADE TOTAL


1.1. MÉTODO TITULOMÉTRICO

A amostra é titulada com ácido padrão a um pH específico, determinando-se o ponto

final pelo ponto de viragem do indicador aplicado na titulação.


Equipamentos


Agitador magnético

Vidrarias

Erlenmeyer

Bureta



Solução indicadora de metilorange: dissolver 0,2g de metilorange

C14H14N3SO3Na (p.a), em água quente e após esfriamento, filtrar se

necessário. Aferir com água destilada / deionizada para 100ml em balão

volumétrico.



Solução indicadora de fenolftaleína: dissolver 1,0g de fenolftaleína

C6H4COO.C(C6H4OH)2, p.a., em 60 mL de álcool etílico p.a (C2H5OH). Aferir

com água destilada / deionizada para 100 ml em balão volumétrico.




102

Solução de carbonato de sódio 0,1N: pesar 5,3g de carbonato de sódio,

Na2CO3 (p.a), previamente seco em estufa a 200ºC por 1 hora. Dissolver em

água destilada, transferir para um balão volumétrico e aferir para 1000ml.



Diluição da solução de Na2CO3 0,1N para 0,02N: transferir 200ml da

solução de carbonato de sódio 0,1N para um balão volumétrico de 1000 ml e

aferir com água destilada.



Solução de ácido sulfúrico 0,1N: adicionar aproximadamente 500ml de

água destilada em um balão volumétrico de 1000ml. Com o auxílio de uma

pipeta, transferir, lentamente, 2,8ml de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4

p.a) para o balão volumétrico aferindo-o posteriormente com água destilada.



Diluição da solução de H2SO4 0,1N para 0,02N: transferir 200ml da solução

de ácido sulfúrico 0,1N para um balão volumétrico de 1000ml e aferir com

água destilada.



Solução de tiossulfato de sódio: dissolver 0,35g de tiossulfato de sódio

pentahidratado, Na2S2O3.5H2O (p.a) em água destilada e aferir para 100ml

em balão volumétrico. Adicionar 1ml desta solução para complexar 2 mg.L-1

de Cloro.

Padronização da solução de H2SO4 0,02N: transferir com auxílio de uma

pipeta volumétrica, 10ml da solução de carbonato de sódio 0,02N para um

elernmeyer. Preparar uma bureta com o agente titulante de ácido sulfúrico

0,02N. Adicionar 4 gotas da solução indicadora de metilorange no elernmeyer

que contém carbonato de sódio e agitar até notar a viragem do indicador

metilorange de amarelo para laranja. Anotar o volume gasto na titulação do

ácido sulfúrico e calcular o fator de correção:


103

VtFc=

Vg (16)

em que:

Vt = volume teórico (mL)

Vg = volume gasto na titulação (mL)

2. PROCEDIMENTO ANALÍTICO (amostra)

2.1. DETERMINAÇÃO DA ALCALINIDADE

1. Preencher a bureta com a solução de ácido sulfúrico 0,02N;

2. Colocar 100ml da amostra com pipeta volumétrica em um erlenmeyer e

adicionar de 4 a 5 gostas de solução indicadora de fenolftaleína;

NOTA 1: Não filtrar, diluir ou concentrar, ou alterar a amostra;

NOTA 2: Caso a amostra seja clorada, adicionar algumas gotas de tiossulfato de

sódio;

NOTA 3: A amostra deverá ficar com a coloração rósea após a adição da

fenolftaleína, caso tenha um pH > 8,3 e ficará incolor quando o pH for < 8,3. Para

este último caso não existe alcalinidade à fenolftaleína;

3. Obtendo uma coloração rósea, titular até ficar incolor e anotar o volume

gasto do agente titulante (H2SO4);

4. Adicionar de 4 a 5 gotas da solução de metilorange;

NOTA 4: Caso a amostra tenha um pH > 4,4 ficará com uma coloração amarela e

quando o pH for < 4,4 ficará com uma coloração laranja. Neste último caso, não

existe alcalinidade á metilorange;

5. Obtendo uma coloração amarela, acertar o menisco da bureta, anotar o

ponto de partida da titulação, adicionar o ácido gota a gota agitando a

amostra até o ponto de viragem (coloração laranja) e anotar o volume

do agente titulante (H2SO4) gasto;

6. Anotar o volume total do ácido gasto na titulação (AlcFenolftaleína +

AlcMetilorange);



104

Alcalinidade à fenolftaleína:

3( / ) 10Alcalinidade mg LCaCO Vg fc (17)

em que:

Vg: volume (ml) de H2SO4 0,02N gasto com a amostra

Fc: fator de correção do H2SO4 0,02N

Alcalinidade total:

3( / ) 10Alcalinidade mg LCaCO Vg fc (18)

em que:

Vg: volume (ml) de H2SO4 0,02N gasto com a amostra

Fc: fator de correção do H2SO4 0,02N

Alcalinidade á metilorange:

Alcalinidade à metilorange (mg/L de CaCO3) = alcalinidade total – alcalinidade à

fenolftaleína

3. REFERÊNCIA

STANDARD METHODS (Apha, 1998)


105

POP 17 – FLUORESCÊNCIA MOLECULAR (IF)

1. MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO - ESPECTROFLUORÍMETRO

Varredura espectroscópica de fluorescência molecular. Excitação de espécies

atômicas ou moleculares presentes no analito, através de radiações

eletromagnéticas localizadas na região do UV e/ou visível e posterior espectro de

radiações emitidas (quando as espécies retornam ao estado fundamental) em

comprimentos de onda superiores ao valor estabelecido para excitação.


Equipamentos

Espectrofluorímetro

Bomba de vácuo


Vidrarias

Cubeta de quartzo multifacetada


Frasco plástico (PEAD, PP) para amostra (20ml)


Não há uso de soluções para o preparo e quantificação da amostra.


1. Filtrar aproximadamente 20ml de amostra em membrana de acetato de


2. Transferir a amostra (3ml) para uma cubeta de quartzo multifacetada;

3. Selecionar no espectrofluorímetro a opção desejada: modalidade emissão

(varredura entre 300 e 700nm e comprimento de onda de excitação (Exc) de


106

350 400 450 500 550 6000

10

20

30

40

50 Amostra 1

Amostra 2

Amostra 3

Amostra 4

Amostra 5

Amostra 6

Comprimento de onda (nm)

IF_

31

4/m

g C

.L-1

400 450 500 550 6000

10

20

30

Amostra 1

Amostra 2

Amostra 3

Amostra 4

Amostra 5

Amostra 6

IF_

37

0/m

g C

.L-1

Comprimento de onda (nm)

300 350 400 450 5000

2

4

6

8

Amostra 1

Amostra 2

Amostra 3

Amostra 4

IF_

Sin

c/m

g C

.L-1

Comprimento de onda_emissão (nm)

( 18nm)

(a)

(b)

(c)

314nm e 370nm e modalidade sincronizada (varredura entre 250 e 700nm

com 18nm);

4. Realizar a varredura de fluorescência desejada para cada amostra;

5. Utilizar água mili-Q como prova em branco da análise;

NOTA: a leitura no espectrofluorímetro pode ser realizada imediatamente após a

realização da coleta, em um prazo de 2 dias, considerando a refrigeração da

amostra (< 4ºC), ou você pode transferir a fração filtrada para esta análise para o

frasco específico e congelar para leitura posterior (6 meses);

2. EXEMPLO GRÁFICO DO ESPECTRO DE FLUORESCÊNCIA MOLECULAR

PARA AMOSTRAS DE ÁGUA

Figura 12.

Exemplos gráficos de espectros de varredura de intensidade de fluorescência molecular: (a)

IF (excitação 314nm) (b) IF (excitação 370nm) e (c) IF (sincronizado).


107

POP 18 – COLIFORMES TOTAIS E FECAIS

1. MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO – CARTELA COLILERT

O método Colilert consiste na quantificação dos coliformes totais e fecais

presentes em uma dada amostra, através da mistura entre a amostra e o reagente

colilert patenteado, com posterior transferência da solução para uma cartela estéril

(100ml), a qual é selada e mantida incubada a 35±2ºC durante 24h (1º leitura) e 48h

(2º leitura-confirmação). Os resultados são obtidos pela relação de valores positivos

entre os quadrados maiores e menores da cartela, com àqueles verificados na

tabela padrão para o teste colilert.


Equipamentos

Seladora para cartelas colilert

Autoclave vertical

Câmara escura equipada de radiação UV


Vidrarias

Balão de fundo chato (esterilizado*)

Proveta 100ml (esterilizado*)

* 15 minutos em autoclave, frascos totalmente vedados com tampões (preparados

com gases), papel alumínio e papel kraft (camada dupla)

Reagentes

Reagente específico colilert


Primeiramente, é importante avaliar a faixa possível de quantificação para a

análise de coliformes na amostra de interesse, de modo a verificar se existirá ou não


108

a necessidade de diluição da mesma. O método utiliza 100ml de amostra, mas em

muitos casos volumes menores são utilizados, devido à grande quantidade de

coliformes presentes. Para estes casos, volumes de 1ml ou 0,1ml da amostra, por

exemplo, são transferidos para 100ml de água destilada, previamente esterilizada, e

o fator de diluição anotado para correção do resultado final. Dessa forma, seguir as

etapas abaixo:

1. Após coleta da amostra, transferir 100ml desta para um balão de fundo chato

estéril ou o volume correspondente para a diluição pretendida, de modo que o

volume final seja de 100ml;

2. Em cada amostra, adicionar uma cartela do reagente colilert e agitar até

dissolução completa;

3. Transferir os 100ml para uma cartela colilert estéril, colocar sobre o suporte

da seladora e selar a mesma;

4. Manter a cartela em incubadora termo-regulável a 35±2ºC;

5. Após 24h na incubadora, anotar os valores positivos nos quadrados grandes

(49 espaços) e pequenos (48 espaços). Os valores positivos são aqueles nos

quais uma coloração amarela forte se desenvolveu;

6. O mesmo procedimento deve ser realizado observando-se as cartelas em

uma câmara escura equipada de luz UV, de modo que, para este caso, os

quadrados grandes e pequenos a serem anotados são aqueles que

desenvolverem uma luminescência azul característica;

7. Os valores anotados pelo item 5 são referentes aos coliformes totais e os

resultados do item 6, os coliformes fecais;

8. Repetir o procedimento dos itens 6 e 7 após 48h para confirmação dos

resultados;

2.1. CÁLCULO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP/100ml)

Os resultados são obtidos a partir da cartela padrão do método que

correlaciona os valores observados nos quadrados grandes com aqueles

observados nos quadrados pequenos.


109

Por exemplo, em uma análise que utilizou 100ml da amostra foram

observados 10 quadrados positivos grandes com 15 quadrados positivos pequenos

para coliformes totais e 5 quadrados positivos grandes com 3 quadrados positivos

pequenos para coliformes fecais. Pela tabela, os valores observados são

respectivamente 28 NMP/100ml e 8,2 NMP/100ml. Caso um volume de apenas

0,1ml de amostra tenha sido utilizado e as mesmas observações obtidas, estes

valores acima devem ser multiplicados pelo fator de diluição de 1000x,

correspondendo a 28 000 NMP/100ml para coliformes totais e 8 200 NMP/100ml

para coliformes fecais.

3. REFERÊNCIA

Colilert IDEXX Quanti Tray/200

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MANUAL DE PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS INTEGRA …heloise.dhs/TH058/Manual POPs_agua_LABEAM.pdf · MANUAL DE PROCEDIMENTOS ... DQO – demanda química de oxigênio COD ... de 70%